JPH11266888A - キシリトールの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 Ｄ−アラビトールを原料としてキシリトール
を製造する方法であって、かつ、プロセスが単純で、キ
シリトールを安定して高収率で製造する方法を提供す
る。 【解決手段】 グルコノバクタ−・オキシダンスまたは
アセトバクター・キシリナムに属し、Ｄ−アラビトール
デヒドロゲナーゼ活性およびＤ−キシルロースリダクタ
ーゼ（キシリトールデヒドロゲナーゼ）活性を有し、Ｄ
−アラビトールをキシリトールに変換する能力を持つ微
生物を、炭素源を含む反応液中でＤ−アラビトールに作
用させてキシリトールを生成せしめる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、キシリトールの製
造法に関する。キシリトールは、食品、医薬分野等で有
用である。

【０００２】

【従来の技術】天然に存在する糖アルコールであるキシ
リトールの需要は今後増加することが予想される。キシ
リトールは、蔗糖よりもカロリーが低く、蔗糖に匹敵す
る甘味を呈するため低カロリー甘味料として将来有望で
ある。加えて、抗う蝕性を有しており、虫歯予防甘味料
として利用されている。さらに、キシリトールは血糖値
を上昇させないため、糖尿病治療の際の輸液として利用
されている。

【０００３】現在、キシリトールは主として米国特許第
4,008,825号に記載されるようなＤ−キシロースの水素
添加により工業生産されている。原料となるＤ−キシロ
ースは、硬木、藁、とうもろこしの穂軸、オート麦の外
皮、その他キシランに富んだ植物材料を出発材料とし、
これを加水分解することによって得られる。

【０００４】しかし、植物材料を加水分解して得られる
Ｄ−キシロースは価格が高いという問題点がある。これ
は、生産コストが高いことによる。例えば、植物材料の
加水分解処理の収率が低いため、生成するＤ−キシリト
ールの純度は低くなる。このため、加水分解処理後に、
イオン交換処理をして加水分解に用いた酸および色素を
除去する。さらに、Ｄ−キシロースを結晶化して他のヘ
ミセルロース性糖類を除去する。食品に適するＤ−キシ
ロースを得るためにはさらなる精製が必要となる。これ
らイオン交換処理および結晶化処理が生産コストの上昇
につながる。

【０００５】この問題点を解決するため、出発材料の入
手が容易で、かつ生じる廃棄物の量が少ないキシリトー
ルの製造法が望まれている。例えば、他のペンチトール
を出発原料としてキシリトールを生産する方法が開発さ
れてきた。容易に手に入るペンチトールのひとつがＤ−
アラビトールであり、Ｄ−アラビトールは酵母を用いて
製造できる（Can.J.Microbiol.,31 (1985) 467-471、J.
Gen.Microbiol.,139 (1993) 1047-1054）。

【０００６】そこで、Ｄ−アラビトールを原料とするキ
シリトール生産法がいくつか開発されている。Applied
Microbiology., 18 (1969) 1031-1035には、デバリオミ
セス・ハンゼニイ（Debaryomyces hansenii） ATCC2012
1を用いて、発酵によりグルコースからＤ−アラビトー
ルを生産し、次に、アセトバクター・サブオキシダンス
（Acetobacter suboxydance suboxydans）を用いて同Ｄ
−アラビトールをＤ−キシルロースに変換し、さらにキ
ャンディダ・ギリエルモンディ・ヴァリ．ソヤ（Candid
a guilliermondii var. soya）を同Ｄ−キシルロースに
作用させキシリトールに変換する方法が報告されてい
る。

【０００７】また、ヨーロッパ特許出願公開第403392号
（出願人ロケッテ・フレレス（Roquette Freres））お
よび同第421882号（出願人ロケッテ・フレレス（Roquet
te Freres））には、耐浸透圧酵母を用いてＤ−アラビ
トールを発酵生産し、次にアセトバクター属細菌、グル
コノバクター属細菌またはクレブジエラ属細菌を用いて
同Ｄ−アラビトールをＤ−キシルロースに変換し、次い
で同キシルロースにグルコース（キシロース）イソメラ
ーゼを作用させてキシロースおよびキシルロース混合物
を生成し、さらに生成したキシロース／キシルロースに
水素添加してキシリトールに変換する方法が開示されて
いる。また、同キシロース／キシルロース混合物中のキ
シロースを予備濃縮し、これに水素添加してキシリトー
ルに変換する方法が開示されている。

【０００８】しかし、上記Ｄ−アラビトールを原料とす
るキシリトール生産法は、比較的高収率でキシリトール
を生成することができるが、多段階の反応ステップを必
要とするためにプロセスが煩雑なものとなるという欠点
があり、そのため経済的にも満足のいくものではなかっ
た。

【０００９】これらの問題点を解決するために、本発明
者らはＤ−アラビトールをキシリトールに直接変換する
能力を持つ微生物を見出し、該微生物をＤ−アラビトー
ルに作用させ、生成するキシリトールを採取することを
特徴とするキシリトールの製造法を開発した（特願平9-
285455号、特願平10-9598号）。この方法は、発酵法に
よって、Ｄ−アラビトールを簡単な一段階のプロセスで
効率よくキシリトールに変換できる優れた方法である
が、反応の安定性や、キシリトールの収率に改善の余地
があった。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】本発明が解決しようと
する課題は、Ｄ−アラビトールを原料としてキシリトー
ルを製造する方法であって、かつ、プロセスが単純で、
キシリトールを安定して高収率で製造する方法を提供す
ることにある。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明者らはＤ−アラビ
トールをキシリトールに直接変換する能力を持つ菌を解
析し、本変換反応においてはＤ−アラビトールデヒドロ
ゲナーゼ活性およびＤ−キシルロースリダクターゼ（キ
シリトールデヒドロゲナーゼ）活性が関与することを明
らかにした。そしてＤ−アラビトールからキシリトール
への変換反応の際に炭素源又はNADH（還元型ニコチンア
ミド・アデニン・ジヌクレオチド）を添加して反応を行
うことによって、安定して高収率でキシリトールが生産
できることを見出し、本発明を完成させた。

【００１２】すなわち本発明は、Ｄ−アラビトールをキ
シリトールに変換する能力を持つ微生物をＤ−アラビト
ールに作用させてキシリトールを生成せしめる反応にお
いて、該反応系に炭素源又はNADHを添加して反応を行う
ことを特徴とするキシリトールの製造法である。上記方
法として具体的には、前記微生物が菌体である場合には
反応系に炭素源を添加し、前記微生物が菌体処理物であ
る場合には反応系にNADHを添加する方法が挙げられる。

【００１３】前記微生物としては、Ｄ−アラビトールデ
ヒドロゲナーゼ活性およびＤ−キシルロースリダクター
ゼ（キシリトールデヒドロゲナーゼ）活性を有する微生
物が挙げられる。具体的には、炭素源を代謝してNADHを
生成する能力をさらに有する微生物、より具体的にはグ
ルコノバクター属またはアセトバクター属に属する微生
物等が、さらに具体的にはグルコノバクター・オキシダ
ンスまたはアセトバクター・キシリナム等が挙げられ
る。

【００１４】前記炭素源としては、糖、糖の誘導体、ア
ルコール類、アルデヒド類、有機酸類またはこれらの混
合物等が挙げられる。より具体的には、グルコース、フ
ルクトース、スクロース、ラクトース、ソルビトール、
グリセロール、グルコン酸、メタノール、エタノール、
プロパノール、イソプロピルアルコール、１，４−ブタ
ンジオール、２，３−ブタンジオール、ホルムアルデヒ
ド、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、イソブ
チルアルデヒド、グリセロアルデヒド、ギ酸、酢酸、ク
エン酸、フマル酸、リンゴ酸、またはこれらの混合物等
が挙げられる。

【００１５】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。

【００１６】＜１＞Ｄ−アラビトールをキシリトールに
変換する能力を持つ微生物 本発明に用いられる微生物は、Ｄ−アラビトールをキシ
リトールに変換する能力を持つ微生物である。以下、こ
のような能力を有する微生物を、本発明の微生物という
ことがある。本発明の微生物としては、以下で詳細に説
明するように、Ｄ−アラビトールをＤ−キシリトールに
酸化するＤ−アラビトールデヒドロゲナーゼ活性、およ
び、Ｄ−キシルロースをキシリトールに還元するＤ−キ
シルロースリダクターゼ（キシリトールデヒドロゲナー
ゼ）活性の両活性を有する微生物が挙げられる。さら
に、本発明の微生物は、適当な炭素源を代謝してNADHを
生成する能力を有する微生物であることが好ましい。

【００１７】Ｄ−アラビトールデヒドロゲナーゼ活性お
よびＤ−キシルロースリダクターゼ活性を有し、適当な
炭素源を代謝してNADHを生成する能力を有するする微生
物としては、具体的にはグルコノバクター属細菌および
アセトバクター属細菌が挙げられる。また、グルコノバ
クター属細菌としてはグルコノバクター・オキシダンス
(Gluconobacter oxydans)が、アセトバクター属細菌と
してはアセトバクター・キシリナム(Acetobacter xylin
um)が挙げられる。より具体的には、以下のような菌株
を挙げることができる。

【００１８】グルコノバクター・オキシダンス(Glucono
bacter oxydans) ATCC621 グルコノバクター・オキシダンス(Gluconobacter oxyda
ns) IAM 1839 グルコノバクター・オキシダンス(Gluconobacter oxyda
ns) IAM 1842 アセトバクター・キシリナム(Acetobacter xylinum) AT
CC14851 但し、本発明に用いられる微生物は上記の両酵素活性を
有する微生物であれば全てが使用可能であり、上記の微
生物に限定されるものではない。

【００１９】※ IAM 1839およびIAM 1842は、インシュ
ティチュート・オブ・モレキュラー・アンド・セルラー
・バイオサイエンス（旧インシュティチュート・オブ・
アプライド・マイクロバイオロジー）（Institute of M
olecular and Cellular Biosciences (Formerly, Insti
tute of Applied Microbiology)、住所：日本国東京都
文京区弥生一丁目東京大学( The university of Tokyo,
Yayoi 1-chome, Bunkyo-ku, Tokyo, Japan)）から何人
も入手可能である。

【００２０】本発明の微生物は、前記の微生物よりUV照
射、N−メチル−N−ニトロソグアニジン（NTG）処理、
エチルメタンスルホネート（EMS）処理、亜硝酸処理、
アクリジン処理等による変異株、あるいは細胞融合もし
くは遺伝子組換え法などの遺伝学的手法により誘導され
る遺伝子組換え株などいずれの株であっても良い。

【００２１】＜２＞Ｄ−アラビトールからキシリトール
への変換反応の反応経路の解明 （１）Ｄ−アラビトールからキシリトールへの変換反応
の経時的観察 本発明の微生物をＤ−アラビトールに作用させるとキシ
リトールが生成するが、本変換反応の効率を上げるため
に、キシリトールがどのような経路を経てＤ−アラビト
ールから生成するかを明らかにすることを試みた。

【００２２】グルコノバクター・オキシダンスATCC621
の菌体を用いて、実施例１に示すようにＤ−アラビトー
ルからキシリトールへの変換反応について詳細に検討し
た。反応を経時的に測定したところ、はじめにＤ−アラ
ビトールが速やかに消費され、それに伴ってＤ−キシル
ロースの生成が検出された。ついで、キシリトールの生
成が認められた。

【００２３】Ｄ−アラビトールとキシリトールは互いに
２位の不斉炭素原子が反転したエピマーの関係にあり、
Ｄ−アラビトールまたはキシリトールの２位の水酸基が
脱水素されるとＤ−キシルロースを生じる。従って実施
例１の結果より、本発明におけるＤ−アラビトールから
キシリトールへの変換反応は、Ｄ−キシルロースを経由
する反応で、Ｄ−アラビトールの２位が脱水素されてＤ
−キシルロースを生成する反応と、Ｄ−キシルロースの
２位のケトン基が立体特異的に再び還元されてキシリト
ールを生成する反応の二段階の反応にて進行することが
予想された。この考えに基づき、本発明の微生物におけ
るＤ−アラビトールの酸化活性と、Ｄ−キシルロースの
還元活性の存在について検討した。

【００２４】（２）Ｄ−アラビトールデヒドロゲナーゼ
活性の検出 本発明の微生物によるＤ−アラビトールの酸化反応に関
与する酵素について検討を行った。糖アルコール類に作
用するデヒドロゲナーゼとしてはグルコノバクター・オ
キシダンスにマンニトールデヒドロゲナーゼ（Meth. En
zymol., 9(1966) 147）やソルボースデヒドロゲナーゼ
（ Agric. Biol. Chem., 31 (1967） 640）が、シュー
ドモナス属細菌にグルコースデヒドロゲナーゼ（ Agri
c. Biol. Chem., 44 (1980) 1505）等が存在することが
報告されている。膜結合型の各種デヒドロゲナーゼ活性
はフェリシアン酸カリウムを電子受容体とする方法にて
検出することが可能である。

【００２５】本発明の微生物にＤ−アラビトールデヒド
ロゲナーゼ活性が存在するかどうかについて、グルコノ
バクター・オキシダンスATCC621より調製した細胞破砕
液を用いて実施例２に示したように検討した。その結
果、フェリシアン酸カリウム法を電子受容体とする検出
法でＤ−アラビトールデヒドロゲナーゼ活性が検出され
た。

【００２６】さらに実施例３に示したように、グルコノ
バクター・オキシダンスATCC621より調製した細胞破砕
液をＤ−アラビトールに作用させたところ、Ｄ−アラビ
トールからのＤ−キシルロースの生成が確認できた。

【００２７】以上の結果より、本発明の微生物はＤ−ア
ラビトールデヒドロゲナーゼ活性を有し、Ｄ−アラビト
ールのＤ−キシルロースへの変換反応には本酵素活性が
関与していることが証明された。尚、本発明者らは、い
くつかの微生物がＤ−アラビトールをキシリトールに変
換する能力を持つことを見出している。これらの多く
は、Ｄ−アラビトールのＤ−キシルロースへの変換反応
に補酵素としてNADを利用しているが、グルコノバクタ
ー属またはアセトバクター属に属する細菌では、酸化型
キノンが補酵素として働いていることが示唆されてい
る。

【００２８】（３）Ｄ−キシルロースリダクターゼ（Ｄ
−キシリトールデヒドロゲナーゼ）活性の検出 次いで本発明の微生物によるＤ−キシルロースの還元反
応に関与する酵素について検討を行った。Ｄ−キシルロ
ースをキシリトールに還元するＤ−キシルロースリダク
ターゼ（Ｄ−キシリトールデヒドロゲナーゼ）活性は、
動物の肝臓（J.Biol. Chem., 225 (1957) 87）や微生物
（Biochem. Biophys. Acta. 48 (1961)26、Biochem. Bi
ophys.Res. Commun., 3 (1960) 554）等に広く存在する
ことが知られている。NAD(H)あるいはNADP(H)を補酵素
とするデヒドロゲナーゼの反応は可逆反応であるが、基
質の酸化還元に伴うNAD(H)またはNADP(H)の量の増減を3
40nmの吸光度の変化で測定し、活性を検出することが可
能である。

【００２９】本発明の微生物にＤ−キシルロースリダク
ターゼ活性が存在するかどうかについて、グルコノバク
ター・オキシダンスATCC621より調製した無細胞抽出液
を用いて実施例４に示したように検討した。その結果、
無細胞抽出液からNAD(H)を補酵素とするＤ−キシルロー
スリダクターゼ（キシリトールデヒドロゲナーゼ）活性
が検出された。

【００３０】さらに実施例５に示したように、グルコノ
バクター・オキシダンスATCC621より調製した無細胞抽
出液をＤ−キシルロースに作用させたところ、キシリト
ールの生成が確認できた。また、この反応では生成した
キシリトールの量は添加したNADHの量に比例していた。

【００３１】以上の結果より、本発明の微生物はNAD(H)
を補酵素とするＤ−キシルロースリダクターゼ（キシリ
トールデヒドロゲナーゼ）活性を持ち、Ｄ−アラビトー
ルの変換反応には本酵素活性が関与していることが証明
された。

【００３２】＜３＞炭素源の添加によるＤ−アラビトー
ルからキシリトールへの変換効率の向上 以上で説明したように、本発明の微生物よりＤ−アラビ
トールデヒドロゲナーゼ活性とＤ−キシルロースリダク
ターゼ（キシリトールデヒドロゲナーゼ）活性の存在が
確認されたことより、本発明の微生物をＤ−アラビトー
ルに作用させてキシリトールに変換させる反応において
は、Ｄ−アラビトールが酸化されてＤ−キシルロースに
変換される反応と、Ｄ−キシルロースが再び還元されて
キシリトールに変換される二段階の反応で進行すること
が明らかとなった。

【００３３】グルコノバクター・オキシダンスATCC621
をＤ−アラビトールに作用させてキシリトールに変換さ
せる反応では、実施例１に示したように比較的高い濃度
でキシリトールが生成蓄積するが、収率はまだ満足のい
くものではなかった。この反応を分析すると、一段階目
のＤ−アラビトールの酸化反応は良好に進行し、Ｄ−ア
ラビトールは完全に消費されたが、二段階目のＤ−キシ
ルロースの還元反応は完全には進行せず、Ｄ−キシルロ
ースが未反応で残り、反応時間を延ばしてもそれ以上は
反応が進行しなかった。したがって、キシリトールの収
率を向上させるためには、二段階目のＤ−キシルロース
の還元反応の効率を上げる必要があると考えられた。

【００３４】前記＜２＞（３）で明らかにしたように、
本発明の微生物のＤ−キシルロースの還元反応に関与す
るキシルロースリダクターゼは、NAD(H)を補酵素とし、
Ｄ−キシルロース還元のためにはＤ−キシルロースと等
モルのNADHを必要とする。これよりＤ−アラビトールか
らキシリトールへの変換反応においてＤ−キシルロース
が未反応で残る原因として、反応に必要なNADHの不足が
示唆された。

【００３５】NADHの不足が原因であれば、何らかの手段
でNADHを生成することにより、キシルロースの還元反応
を完全に進行させて反応収率を向上できると考えられ
た。NADH、NADPHは生体内で多種の酸化還元酵素の補酵
素として働いているため、菌の代謝を利用してNAD、NAD
PからNADH、NADPHを再生する方法がよく知られている。
NADH、NADPHを補酵素とする酸化還元酵素を有する微生
物を用いた還元反応は非常に多数の例が報告されてお
り、一例としてはパン酵母を用いた不斉還元反応による
(S)-2-ヒドロキシプロピルフェニルスルホンの生産（Ag
ric. Biol. Chem.,42 (1978) 451 )、サーモアンアエロ
ビウム・ブロッキ（Thermoanaerobium brockii）の休止
菌体を用いた不斎還元反応による(S)-3-ヒドロキシ吉草
酸の生産（Helv. Chim. Acta., 68 (1985) 958）などを
挙げることができる。これらの反応では、いずれも反応
の際に酸化される基質と共に適当な炭素源を添加するこ
とによって生産性を向上させている。

【００３６】従って、本発明の微生物によるＤ−アラビ
トールからのキシリトールの生産においても、微生物に
よって代謝される炭素源を添加すれば、添加した炭素源
の代謝に伴ってNADよりNADHが生成するため、二段階目
のキシルロース還元反応が良好に進行し、キシリトール
収率が向上することが予想される。

【００３７】この考えに基づいて実施例６に示すよう
に、グルコノバクター・オキシダンスATCC621を用いた
Ｄ−アラビトールの変換反応の際、グルコースおよびエ
タノールを添加して反応を行い、その添加効果について
検討を行った。その結果、実施例６に示したように顕著
な添加効果が認められ、炭素源無添加の場合にはＤ−キ
シルロースの一部が未反応で残りキシリトールの収率も
低いのに対して、炭素源を添加した場合にはＤ−キシル
ロースのキシリトールへの還元が良好に進行し、キシリ
トールの収率（対Ｄ−アラビトール収率）は最大98%に
達した。

【００３８】添加した炭素源が代謝される際にNADHが生
成しても、生成したNADHはすぐにＤ−キシルロースの還
元反応に用いられて消費されてしまうため生成したNADH
を直接定量するのは難しいが、実施例４および５で示し
たように、本発明の微生物によるＤ−アラビトールの変
換反応にはNADHを補酵素とするＤ−キシルロースリダク
ターゼ活性が関与していることと、キシリトール生成量
がNADHの量に依存することから判断すると、添加した炭
素源の代謝に伴ってNADよりNADHが生成していることが
推定された。

【００３９】以上のように本発明者らは、Ｄ−アラビト
ールをキシリトールに直接変換する能力を持つ菌を解析
し、本変換反応においてはＤ−アラビトールデヒドロゲ
ナーゼ活性およびＤ−キシルロースリダクターゼ（キシ
リトールデヒドロゲナーゼ）活性が関与することを明ら
かにした。そしてＤ−アラビトールからキシリトールへ
の変換反応の際に炭素源を添加して反応を行うことによ
り、安定して高収率でキシリトールが生産できることを
見出した。

【００４０】＜４＞本発明に係わる微生物の培養方法お
よび該微生物を用いるキシリトールの製造方法 以下、本発明に係わる微生物の培養方法および該微生物
をＤ−アラビトールに作用させてキシリトールを製造す
る方法について説明する。

【００４１】本発明に用いられる微生物を培養する培地
は格別の制限はなく、該微生物によって利用される通常
の炭素源、窒素源、リン源、無機イオン、更に必要なら
ば有機栄養源を含む通常の培地でよい。炭素源として
は、グルコース等の炭水化物、グリセロール等のアルコ
ール類、有機酸、等が使用される。窒素源としては、ア
ンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩、硝酸塩
その他が用いられる。リン源としてはリン酸のカリウム
塩、ナトリウム塩等が使用される。無機イオンとして
は、マグネシウムイオン、カリウムイオン、鉄イオン、
マンガンイオン、硫酸イオンその他が必要に応じ適宜使
用される。有機栄養源としては、ビタミン、アミノ酸等
及びこれらを含有するレバーエキス、酵母エキス、麦芽
エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカ
ー、カゼイン分解物、その他が適宜用いられる。

【００４２】また、Ｄ−アラビトールデヒドロゲナーゼ
またはＤ−キシルロースリダクターゼ（キシリトールデ
ヒドロゲナーゼ）の誘導剤として、Ｄ−キシロース、Ｄ
−キシルロース、Ｄ−アラビトール、Ｄ−ソルビトー
ル、Ｄ−マンニトール、キシリトールなどの糖類や糖ア
ルコールを培地に添加することによって、Ｄ−アラビト
ールをキシリトールに変換する反応に関与する酵素の活
性が向上する場合がある。

【００４３】培養条件にも格別の制限はなく、例えば、
好気的条件下pH5〜8及び温度25〜40℃の範囲内で、pH及
び温度を適当に制限しつつ12〜72時間程度培養を行なえ
ばよい。

【００４４】かくして培養された微生物を、Ｄ−アラビ
トールに接触反応させることにより、反応液中にキシリ
トールを生成することができる。本発明の方法において
前記「微生物」は、菌体そのものであってもよいし、Ｄ
−アラビトールをキシリトールに変換する能力を有する
限り菌体の処理物であってもよい。具体的には、菌体を
含む培養物、該培養物から分離・回収した菌体、該菌体
固定化処理物、アセトン処理または凍結乾燥等した菌
体、菌体破砕液、Ｄ−アラビトールデヒドロゲナーゼ及
びＤ−キシルロースリダクターゼを含む菌体破砕液の分
画物もしくは精製酵素画分、又はこれらの処理物の固定
化物等が挙げられる。

【００４５】Ｄ−アラビトール濃度に格別の制限はな
く、通常1〜50%(w/v)、好ましくは5〜40%(w/v)が好まし
い結果を与える。また反応の際、基質のＤ−アラビトー
ルを分割添加することにより収率が向上する場合があ
る。反応条件にも格別の制限はなく、通常は、好気的条
件下で、反応温度20〜60℃、望ましくは30〜40℃で、反
応pH3.0〜10.0望ましくはpH4.0〜7.0で好結果を与え
る。尚、反応液に炭酸カルシウムを例えば2%(w/v)とな
るように添加するなどして、反応時のpHの低下を防ぐ
と、キシリトールの収率を高めることができる場合があ
る。反応には、静置反応あるいは撹はん反応のいずれの
方法も採用し得る。反応時間は、使用する菌体の活性、
Ｄ−アラビトール濃度などの条件によって異なるが、1
〜100時間が望ましい。

【００４６】本発明においては、Ｄ−アラビトールから
キシリトールへの変換反応の効率を上げ、キシリトール
を高収率で蓄積させるために、反応の際に反応系に適当
な炭素源又はNADHを添加する。微生物として、炭素源を
代謝してNADHを生成する能力を有する微生物の菌体、特
に生菌体を用いる場合には、反応系に炭素源を添加する
ことによって、該炭素源の代謝に伴ってNADよりNADHを
生成させることができる。その結果、Ｄ−キシルロース
からキシリトールへの変換反応が円滑に進行する。ま
た、微生物として、菌体破砕液などの菌体処理物、特に
グルコノバクター属またはアセトバクター属に属する細
菌の菌体処理物を用いる場合には、前記反応系にNADHを
直接添加することによっても、Ｄ−キシルロースの還元
反応を効率的に進行させることができる。

【００４７】前記炭素源としては、代謝される際にNADH
の生成を伴う炭素源であれば特に制限はないが、糖、糖
の誘導体、アルコール類、アルデヒド類、および有機酸
類等が挙げられる。糖としてはグルコース、フルクトー
ス、スクロース、ラクトースが挙げられる。糖の誘導体
としてはソルビトール、マンニトール、グリセロール等
の糖アルコール、グルコン酸等のアルドン酸等が挙げら
れる。また、アルコール類としてはメタノール、エタノ
ール、プロパノール、イソプロピルアルコール、1,4−
ブタンジオール、2,3−ブタンジオールなどが、アルデ
ヒド類としてはホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、
プロピオンアルデヒド、イソブチルアルデヒド、グリセ
ロアルデヒドなどが、また有機酸類としてはギ酸、クエ
ン酸、フマル酸、リンゴ酸などが挙げられる。これらの
炭素源は、単独で使用してもよく、任意の２種または３
種以上の炭素源を混合物として使用してもよい。これら
炭素源の添加量は、使用する菌体の活性、Ｄ−アラビト
ール濃度などの条件によって異なるが、合計で0.2〜40%
(w/v)、好ましくは0.5〜20%(w/v)が好ましい結果を与え
る。これらの炭素源の添加時期は格別の制限はなく、反
応開始時から添加しても、反応途中で添加しても、また
分割添加してもよい。

【００４８】上記のようにして培養液中に生成したキシ
リトールは、常法に従って反応液より採取分離される。
具体的には、遠心分離、ろ過等により固形物を除去した
後、活性炭、イオン交換樹脂により脱色、脱塩し、その
溶液から結晶化する方法が採用できる。

【００４９】

【実施例】以下、実施例にて本発明をさらに具体的に説
明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではな
い。なお、本実施例において、Ｄ−アラビトール、Ｄ−
キシルロースおよびキシリトールは、高速液体クロマト
グラフィー（ＨＰＬＣ）により、下記の条件にて分析し
た。

【００５０】カラム：Shodex SC1211〔昭和電工社製
品〕 移動層：50% アセトニトリル／50% 50ppm Ca-EDTA水溶
液 流 速：0.8 ml/分 温 度：60℃ 検 出：RI検出器

【００５１】

【実施例１】グルコノバクター・オキシダンスATCC621
によるＤ−アラビトールからキシリトールへの変換反応
の経時変化 ポテトデキストロース（Difco社製品）2.4%(w/v)、酵母
エキス（Difco）3%、肉エキス（Difco）0.5%、グリセロ
ール1.5%を含む培地（pH 7.0）50mlを500ml坂口フラス
コに分注し、120℃、15分間加熱殺菌した。Ｄ−アラビ
トール溶液を120℃、15分間殺菌した後、上記培地に3.0
%となるように添加した。さらに炭酸カルシウム1gを200
℃、120分間乾熱滅菌して上記培地に添加した。この培
地にグルコノバクター・オキシダンスATCC621を接種
し、30℃で３日間振とう培養した。該培養液から遠心分
離により菌体を集め、生理食塩水で１回洗浄した。

【００５２】Ｄ−アラビトールを0.1Mリン酸緩衝溶液
（pH 6.0）に5%(w/v)となる様に溶解し、これに上記の
洗浄菌体を湿重量で約10%(w/v)となるように添加した。
この反応液10mlを試験管に入れ、30℃にて振とう反応を
行った。反応開始より6、12、24、48時間目に1mlずつサ
ンプリングした。遠心分離により菌体を除いた後、反応
産物をHPLCにて分析した。この結果を図１に示した。

【００５３】図１に示したように、はじめにＤ−アラビ
トールが速やかに消費され、それに伴ってＤ−キシルロ
ースの生成が認められた。ついで、キシリトールの生成
が認められたが、キシリトールの生成は途中で停止し、
反応時間を延ばしてもそれ以上反応は進行しなかった。

【００５４】

【実施例２】グルコノバクター・オキシダンスATCC621
のアラビトールデヒドロゲナーゼ活性の検出 ポテトデキストロース（Difco製品）2.4%(w/v)、酵母エ
キス（Difco）3%、肉エキス（Difco）0.5%を含む培地
（pH 7.0）50mlを500ml坂口フラスコに分注し、120℃、
15分間加熱殺菌した。Ｄ−アラビトールを120℃、15分
間殺菌した後、上記培地に2.0%となるように添加した。
さらに炭酸カルシウム1gを200℃、120分間乾熱滅菌して
上記培地に添加した。この培地にグルコノバクター・オ
キシダンスATCC621を接種し、30℃で３日間振とう培養
した。該培養液から遠心分離により菌体を集め、生理食
塩水で１回洗浄した。

【００５５】培養液100mlより集菌した湿重量約1.0gの
培養菌体を0.1Mリン酸緩衝溶液（pH7.0）10mlに懸濁
し、４℃で20分間超音波破砕して細胞破砕液を調製し
た。タンパク質濃度はウシ血清アルブミン（Bovine Ser
um Alubmin）（SIGMA社製）を標準タンパク質として使
用し、バイオラッドプロテインアッセイ試薬（Bio-rad
protein assay reagent）（Bio-rad社製）を用いてブラ
ッドフォード（Bradford）法（Anal. Biochem.,72, 248
(1976))により定量した。

【００５６】飴山らの方法（Agric. Biol. Chem., 42
(1978) 2063）に従ってＤ−アラビトールデヒドロゲナ
ーゼ活性を測定した。10mMフェリシアン酸カリウム、10
0mM Ｄ−アラビトール、 100mM酢酸ナトリウム緩衝液
（pH 5.0）、および2μlの細胞破砕液を含む600μlの反
応液で、pH 5.0、25℃で30分反応を行った。300μlのデ
ュパノール試薬（5 g/L 硫酸鉄(III)・ｎ水和物、3 g/L
SDS、95 ml/L 85%リン酸）を添加して反応停止し、さら
に2100μlの蒸留水を加えて、室温で20分静置した後に6
60 nmにおける吸光度を測定し、フェロシアン酸カリウ
ムの生成を検出した。本反応条件にて１分間に1μmolの
Ｄ−アラビトールを酸化して1μmolのフェロシアン酸カ
リウムを生成する酵素活性を１ユニットと定めた。本方
法にてＤ−アラビトールデヒドロゲナーゼ活性を測定し
た結果、1.46ユニット/mgタンパク質の活性が検出され
た。

【００５７】

【実施例３】グルコノバクター・オキシダンスATCC621
の菌体より調製した細胞破砕液を用いたＤ−アラビトー
ルの酸化反応 実施例２と同様にグルコノバクター・オキシダンスATCC
621の菌体より調製した細胞破砕液を用いてＤ−アラビ
トールの酸化反応を行った。1%(w/v)Ｄ−アラビトー
ル、0.1M酢酸ナトリウム緩衝液（pH 5.0）および0.1ml
の細胞破砕液を含む1mlの反応液で、Ｄ−アラビトール
の酸化反応を行った。この反応液をpH 5.0、25℃で軽く
振盪しながら、24時間反応を行った。反応終了後、HPLC
にて分析したところＤ−アラビトールは完全に消費さ
れ、0.88%(w/v)のＤ−キシルロースと0.05%のキシリト
ールが生成蓄積した。

【００５８】

【実施例４】グルコノバクター・オキシダンスのＤ−キ
シルロースリダクターゼ活性の検出 実施例２と同様に調製した湿重量約1.0gのグルコノバク
ター・オキシダンスATCC621の培養菌体を0.1Mリン酸緩
衝溶液（pH 7.0）10mlに懸濁し、４℃で20分間超音波破
砕して細胞破砕液を調製した。破砕液を遠心分離（8000
rpm、10分間)して菌体残渣を除き、無細胞抽出液を調製
した。

【００５９】Kerstersらの方法（Meth. Enzymol., 9 (1
966) 170）に従ってNADHあるいはNADPHを補酵素とする
Ｄ−キシルロースリダクターゼ活性を、キシリトール生
成反応の逆反応であるキシリトール脱水素反応にて測定
した。2mM NADまたはNADP、100mM キシリトール、100mM
トリス−塩酸緩衝液（pH 8.0）、および50μlの無細胞
抽出液を含む1mlの反応液で、pH 8.0、30℃にて10分間
反応を行った。キュベット中で反応を行い、340nmの吸
光度変化を連続的に測定した。340nmの吸光度の増加に
よってNADHまたはNADPHの生成を検出した。酵素活性
は、本反応条件で１分間に1μmolのキシリトールを酸化
して1μmolのNADHまたNADPHを生成する活性を１ユニッ
トと定めた。

【００６０】その結果、NADを補酵素として添加した場
合に2.57ユニット/mgタンパク質の強い活性が検出され
た。一方、NADP(H)を添加した場合には活性が検出され
ず、NADPHは補酵素とならないことが明らかとなった。

【００６１】

【実施例５】グルコノバクター・オキシダンスATCC621
の菌体より調製した無細胞抽出液を用いたＤ−キシルロ
ースの還元反応 実施例４と同様にグルコノバクター・オキシダンスATCC
621の菌体より無細胞抽出液を調製した。この無細胞抽
出液を2Ｌの0.1Mリン酸バッファーに対して透析して低
分子化合物を除去した。この無細胞抽出液を用いてＤ−
キシルロースの還元反応を行った。

【００６２】1%(w/v)Ｄ−キシルロース、0.1M酢酸ナト
リウム緩衝液（pH 5.0）、表１に示した濃度の各補酵
素、および0.1mlの無細胞抽出液を含む1mlの反応液で、
Ｄ−キシルロースの還元反応を行った。この反応液をpH
5.0、30℃で軽く振盪しながら、24時間反応を行った。
反応終了後、遠心分離により菌体を除いた後、反応産物
をHPLCにて分析した。

【００６３】表１に示した結果のように、NADHを添加し
た場合にのみキシリトールの生成が検出された。キシリ
トール生成量は添加したNADHの量に依存しており、添加
したNADHとほぼ等モルのキシリトールが生成した。

【００６４】

【表１】 表１グルコノバクター・オキシダンスATCC621の菌体より調製した無細胞抽出液 を用いたＤ−キシルロースの還元反応により生成したキシリトールの量 ──────────────────────────────────── 添加した 添加濃度 生成キシリトール 生成キシリトール 補酵素 （mM） （%(w/v)） （mM） ──────────────────────────────────── 無添加 0 検出せず - NADH 5 0.07 4.6 NADH 10 0.15 9.9 NADH 15 0.21 13.8 ──────────────────────────────────── NADPH 5 検出せず - NAD 5 検出せず - NADP 5 検出せず - ────────────────────────────────────

【００６５】

【実施例６】グルコノバクター・オキシダンスATCC621
の菌体によるＤ−アラビトールからキシリトールへの変
換反応におけるグルコースおよびエタノールの添加効果 ポテトデキストロース（Difco社製品）2.4%(w/v)、酵母
エキス（Difco）3%、肉エキス（Difco）0.5%、グリセロ
ール1.5%を含む培地（pH 7.0）50mlを500ml坂口フラス
コに分注し、120℃、15分間加熱殺菌した。Ｄ−アラビ
トールを120℃、15分間殺菌した後、上記培地に3.0%と
なるように添加した。さらに炭酸カルシウム1gを200
℃、120分間乾熱滅菌して上記培地に添加した。この培
地にグルコノバクター・オキシダンスATCC621を接種
し、30℃で３日間振とう培養した。該培養液から遠心分
離により菌体を集め、生理食塩水で１回洗浄した。

【００６６】Ｄ−アラビトールを終濃度で5.24%(w/v)と
なるように0.1Mリン酸緩衝溶液（pH6.0）に溶解し、試
験管に10mlずつ分注した。この反応液に菌体を湿重量で
約10%(w/v)、また反応時のpHの低下を防ぐ目的で炭酸カ
ルシウムを2%(w/v)となるように添加し、30℃にて振と
う反応を行った。炭素源添加区では、反応開始時にグル
コース1%(w/v)、反応開始後６時間後にエタノールを5%
(v/v)添加して反応した。反応開始より6、24、48時間後
に1mlづつサンプリングし、遠心分離により菌体を除い
た後、反応産物をHPLCにて分析した。

【００６７】図２に示したように、グルコースおよびエ
タノールを添加した場合にはキシリトールの生成量が非
常に増大し、顕著な添加効果が認められた。炭素源無添
加の場合にもＤ−アラビトールはほぼ完全にＤ−キシル
ロースに酸化された。炭素源無添加の反応でも、炭酸カ
ルシウムを添加して反応時のpH低下を防いだことにより
キシリトールの収率がわずかに向上し、24時間の反応で
1.23%(w/v)のキシリトールが生成したが、Ｄ−キシルロ
ースの一部が未反応で残り、収率はそれ以上は上がらな
かった。それに対して、炭素源を添加した場合にはＤ−
キシルロースがほぼ完全にキシリトールへ還元され、24
時間の時点では5.24%(w/v)（対Ｄ−アラビトール収率98
%）の高収率でキシリトールが生成蓄積した。

【００６８】

【実施例７】グルコノバクター・オキシダンスATCC621
の菌体によるＤ−アラビトールからキシリトールへの変
換反応における糖および糖アルコールの添加効果 Ｄ−アラビトールを終濃度で5%(w/v) となるように0.1M
リン酸緩衝溶液（pH 6.0）に溶解し、試験管に5mlずつ
分注した。この反応液に実施例６と同様の方法にて調製
した菌体を湿重量で約10%(w/v)、炭酸カルシウムを2%(w
/v)となるように添加し、30℃にて振とう反応を行っ
た。反応６時間目に各種糖、糖アルコール類5%(w/v)を
表２に示すように添加して反応を行った。27時間反応
後、遠心分離により菌体を除いた後、HPLCにて生成した
キシリトールを定量した。表２に示したように、各種
糖、糖アルコール類の添加によってキシリトール生成量
の増加が認められた。

【００６９】

【表２】 表２キシリトール生成反応における 糖および糖アルコールの添加効果 ─────────────────────────── 添加炭素源 キシリトール生成量%(w/v) ─────────────────────────── 無添加 1.70 Ｄ−グルコース 4.50 Ｄ−フルクトース 2.81 Ｄ−ソルビトール 2.62 グリセロール 3.08 ───────────────────────────

【００７０】

【実施例８】グルコノバクター・オキシダンスATCC621
の菌体によるＤ−アラビトールからキシリトールへの変
換反応における有機酸またはアルコール類の添加効果 Ｄ−アラビトールを終濃度で5%(w/v) となるように0.1M
リン酸緩衝溶液（pH 6.0）に溶解し、試験管に5mlずつ
分注した。この反応液に実施例６と同様の方法にて調製
した菌体を湿重量で約10%(w/v)、炭酸カルシウムを2%(w
/v)となるように添加し、30℃にて振とう反応を行っ
た。反応６時間目および10時間目にギ酸、酢酸、グルコ
ン酸、クエン酸0.5%(w/v)またはメタノール、エタノー
ル、プロパノール1%(v/v)を添加して反応した。27時間
反応後、遠心分離により菌体を除いた後、HPLCにて生成
したキシリトールを定量した。表３に示したように各種
有機酸、アルコールの添加によってキシリトール生成量
の増加が認められた。

【００７１】

【表３】 表３キシリトール生成反応における有機酸 またはアルコール類の添加効果 ────────────────────────── 添加炭素源 キシリトール生成量(%(w/v)) ────────────────────────── 無添加 1.70 ギ酸 2.63 酢酸 2.43 グルコン酸 2.23 クエン酸 2.44 メタノール 1.90 エタノール 3.31 プロパノール 2.98 ──────────────────────────

【００７２】

【実施例９】アセトバクター・キシリナム ATCC14851の
菌体反応によるキシリトールの生産 ポテトデキストロース(Difco社製品)2.4%(w/v)、酵母エ
キス(Difco)3%、肉エキス(Difco)0.5%、グリセロール1.
5%を含む培地（pH 7.0）40mlを500ml坂口フラスコに分
注し、120℃、15分間加熱殺菌した。Ｄ−アラビトー
ル、キシリトール及びＤ−キシロースを含む溶液を120
℃、15分間殺菌した後、上記培地にそれぞれ2.0%、1.0
%、1.0%となるように添加した。さらに炭酸カルシウム1
gを200℃、120分間乾熱滅菌して上記培地に添加した。
この培地にアセトバクター・キシリナム ATCC14851を接
種し、30℃で３日間振とう培養した。該培養液から遠心
分離により菌体を集め、生理食塩水で１回洗浄した。

【００７３】Ｄ−アラビトールおよびＤ−グルコースを
終濃度でそれぞれ5%(w/v) 、1%となるように0.1Mリン酸
緩衝溶液（pH 6.0）に溶解し、試験管に5mlずつ分注し
た。この反応液に菌体を湿重量で約10%(w/v)、炭酸カル
シウムを2%(w/v)となるように添加し、30℃にて振とう
反応を行った。炭素源添加区では反応開始時にグルコー
ス1%(w/v)、反応開始後６時間目にエタノールを5%(v/v)
添加して反応を行った。反応開始より24時間後に反応終
了し、遠心分離により菌体を除いた後、HPLCにて反応産
物を分析した。炭素源無添加の場合にはＤ−キシルロー
スの一部が未反応で残り、キシリトール生成量は0.98%
(w/v)（対Ｄ−アラビトール収率20%）であったが、炭素
源を添加した場合には変換反応効率が向上し、2.57%(w/
v)（対Ｄ−アラビトール収率51%）の高収率でキシリト
ールが生成蓄積した。

【００７４】

【発明の効果】本発明により、Ｄ−アラビトールを原料
として、単純なプロセスでキシリトールを高収率で製造
することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 グルコノバクター・オキシダンスATCC621の
菌体反応によるＤ−アラビトールからキシリトールへの
変換反応の経時変化を示す図。

【図２】 グルコノバクター・オキシダンスATCC621の
菌体反応によるＤ−アラビトールからキシリトールへの
変換反応において、炭素源無添加の場合とグルコースお
よびエタノールを添加した場合の反応における経時変化
を示す図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 特願平10−9598 (32)優先日 平10(1998)１月21日 (33)優先権主張国 日本（ＪＰ） (72)発明者 三原 康博 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味の 素株式会社アミノサイエンス研究所内 (72)発明者 横関 健三 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味の 素株式会社アミノサイエンス研究所内

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 Ｄ−アラビトールをキシリトールに変換
   する能力を持つ微生物をＤ−アラビトールに作用させて
   キシリトールを生成せしめる反応において、該反応系に
   炭素源又はＮＡＤＨを添加して反応を行うことを特徴と
   するキシリトールの製造法。
2. 【請求項２】 前記微生物が菌体である場合には反応系
   に炭素源を添加し、前記微生物が菌体処理物である場合
   には反応系にＮＡＤＨを添加することを特徴とする請求
   項１記載の方法。
3. 【請求項３】 前記微生物が、Ｄ−アラビトールデヒド
   ロゲナーゼ活性およびＤ−キシルロースリダクターゼ
   （キシリトールデヒドロゲナーゼ）活性を有することを
   特徴とする請求項１の方法。
4. 【請求項４】 前記微生物が、炭素源を代謝してＮＡＤ
   Ｈを生成する能力を有する微生物である請求項１記載の
   方法。
5. 【請求項５】 前記微生物がグルコノバクター属または
   アセトバクター属に属する微生物である請求項１記載の
   方法。
6. 【請求項６】 グルコノバクター属またはアセトバクタ
   ー属に属する微生物がグルコノバクター・オキシダンス
   またはアセトバクター・キシリナムである請求項５記載
   の方法。
7. 【請求項７】 反応系に添加する炭素源が、糖、糖の誘
   導体、アルコール類、アルデヒド類、有機酸類またはこ
   れらの混合物から選ばれる請求項２記載の方法。
8. 【請求項８】 前記糖、糖の誘導体、アルコール類、ア
   ルデヒド類、有機酸類前記糖または糖の誘導体が、グル
   コース、フルクトース、スクロース、ラクトース、ソル
   ビトール、グリセロール、グルコン酸、メタノール、エ
   タノール、プロパノール、イソプロピルアルコール、
   １，４−ブタンジオール、２，３−ブタンジオール、ホ
   ルムアルデヒド、アセトアルデヒド、プロピオンアルデ
   ヒド、イソブチルアルデヒド、グリセロアルデヒド、ギ
   酸、酢酸、クエン酸、フマル酸、リンゴ酸、またはこれ
   らの混合物から選ばれることを特徴とする請求項７記載
   の方法。