JPH11266898A

JPH11266898A - 塩素イオン測定用試薬組成物

Info

Publication number: JPH11266898A
Application number: JP7767798A
Authority: JP
Inventors: Shinsuke Kimata; 木全　　伸介; Shigeki Asano; 茂樹浅野; Yoshihisa Kawamura; 川村　　良久
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 1998-03-25
Filing date: 1998-03-25
Publication date: 1999-10-05

Abstract

(57)【要約】【課題】追随酵素を使用することなく、十分な感度を有
し、かつ、測定精度が高い塩素イオン測定用試薬組成物
を提供する。【解決手段】（ａ）不活性化型α−アミラーゼ、（ｂ）
キレート剤および（ｃ）基質として、一般式（Ｉ）【化１】（式中Ｒ１およびＲ２はβ−ガラクトピラノシル基また
は水素原子のいずれかを示し、Ｒ３は２−クロロ−４−
ニトロフェノール基を示し、ｎは０〜２の整数を示
す。）で表されるマルトオリゴ糖誘導体を含有し、追随
酵素を含有しない塩素イオン測定用試薬組成物。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、α−アミラーゼ活
性を利用する塩素イオン測定用試薬組成物に関する。更
に詳しくは、液体、特に血液または尿中の塩素イオンの
測定用試薬組成物に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】血清中の塩素イオン量の測定は、低クロ
ール血症として、低張性脱水症、グルココルチコイド過
剰症、呼吸性アシドーシス等の疾患、高クロール血症と
しては、高張性脱水症、尿細管性アシドーシス、呼吸性
アルカローシス等の疾患の診断に用いられる。

【０００３】α−アミラーゼ活性を利用した塩素イオン
測定方法としては、非活性型α−アミラーゼ、カルシウ
ム錯体およびα−アミラーゼ測定試薬からなる測定方法
が公知である（特開昭63-126497 号公報) 。この方法で
は、カルシウム錯体を添加することや、一般的にα−ア
ミラーゼ測定試薬中に含まれる、α−グルコシダーゼ、
β−グルコシダーゼ等の追随酵素の影響で、マルトオリ
ゴ糖誘導体が分解されることにより、試薬ブランクの上
昇が著しく大きく、測定値の精度が悪いといった問題点
があった。

【０００４】一方、この問題点を解決した方法として、
基質として、４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マルトトリ
オシド、４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マルトテトラオ
シド等を用いる、追随酵素を用いない測定方法が、知ら
れている（特開平 4-94698号公報) 。しかし、この方法
では十分な感度が得られず、測定値の精度が悪いという
問題が依然として顕在し、実使用に耐えうるものではな
い。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記のよう
な問題を解決するものであり、精密性、定量性、正確性
に優れた塩素イオン測定用組成物を提供することにあ
る。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成するために鋭意検討したところ、基質として、一
般式（Ｉ）で示されるマルトオリゴ糖誘導体を使用する
ことにより、上記課題を解決し、本発明を完成した。

【０００７】すなわち、本発明は、（ａ）不活性化型α
−アミラーゼ、（ｂ）キレート剤、および（ｃ）基質と
して、一般式（Ｉ）

【０００８】

【化２】

【０００９】（式中、Ｒ１およびＲ２はβ−ガラクトピ
ラノシル基、または水素原子を示し、Ｒ３は２−クロロ
−４−ニトロフェノール基を示し、ｎは０〜２の整数を
示す。）で表されるマルトオリゴ糖誘導体を含有し、追
随酵素を含有しない塩素イオン測定用試薬組成物であ
る。

【００１０】

【発明の実施の態様】本発明の塩素イオン測定用試薬組
成物は、α−アミラーゼの活性化剤である塩素イオンに
より、α−アミラーゼが活性化されることを利用し、分
解された２−クロロ−４−ニトロフェノールを測定する
ことにより、試料中の塩素イオンの量を測定するもので
あり、その一実施様態としては、試料中の塩素イオンに
不活性化型α−アミラーゼ、キレート剤、基質として、
例えば、２−クロロ−４−ニトロフェニル−４−Ｏ−β
−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトシドを作用さ
せ、遊離する２−クロロ−４−ニトロフェノールを測定
し、試料中の塩素イオン量を知るものである。

【００１１】本発明で使用するα−アミラーゼとは、微
生物、植物、または動物のいずれの起源のものも用いる
ことができるが、好適には動物起源のものであり、たと
えば、ブタ膵由来のα−アミラーゼが例示される。しか
しながら、本発明に用いられるα−アミラーゼは脱塩さ
れて、不活性化型である必要がある。不活性化型α−ア
ミラーゼは、前述のように試料中の塩素イオンを得て、
活性化型α−アミラーゼとなり、α−アミラーゼの基質
と反応する。脱塩方法としては、透析、限外濾過、イオ
ン交換、カラム除去などの方法がある。不活性化型α−
アミラーゼの試薬組成中の濃度は、好ましくは０．５〜
１０００ＩＵ／ｍｌの範囲で用いられる。

【００１２】本発明のキレート剤とは、エチレンジアミ
ン四酢酸およびその塩、グリコールエーテルジアミン四
酢酸、１，２−ビス（ｏ−アミノフェノキシ）エタン四
酢酸、トランス−１，２−ジアミノシクロヘキサン四酢
酸等があげられる。キレート剤の塩素イオン測定試薬組
成中での役割としては、ブランク反応をおさえる、また
は測定対象外の類似共雑イオンをマスキングする等があ
げられる。その濃度は、０．０１〜１０ｍＭで好適に用
いられる。またこれらのキレート剤は複数組み合わせて
用いても良い。

【００１３】本発明の基質は、上記一般式（Ｉ）（式中
Ｒ１およびＲ２はβ−ガラクトピラノシル基、または水
素のいずれかを示し、Ｒ３は２−クロロ−４−ニトロフ
ェノール基を示し、ｎは０〜２の整数を示す。）に示さ
れるものである。その例として、２−クロロ−４−ニト
ロフェニル−α−マルトトリオシド、２−クロロ−４−
ニトロフェニル４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−
α−マルトシド等がある。特に、２−クロロ−４−ニト
ロフェニル４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−
マルトシドは、非還元末端が修飾されていることから、
内因性α−グルコシダーゼ等による基質分解によって生
じる試薬ブランクの上昇がない、α−アミラーゼの基質
親和性がより高いため、好感度であるといったメリット
があることから好適に用いられる。該基質の試薬組成中
での濃度は、０．１〜５０ｍＭで好適に用いられる。

【００１４】また、本発明の測定試薬組成物には、試薬
ブランクをおさえ、感度を調節し、定量性、定量域を向
上させ、管理血清等に含まれる試料中のマルトース等の
影響を回避する等の目的のため、必要により、マルトオ
リゴ糖、またはその還元末端グルコースに非発色源基が
結合したマルトオリゴ糖からなる群から選ばれるα−ア
ミラーゼの基質を競合させ、主反応基質に対する見かけ
の親和性を低下させることができる。ここで用いられる
マルトオリゴ糖としては、例えば、マルトース、マルト
ペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオー
スなどのグルコース数が２〜７のマルトオリゴ糖があげ
られる。還元末端グルコースに非発色源基が結合したマ
ルトオリゴ糖としては、例えば、２，４−ジクロロフェ
ニル−α−Ｄ−マルトトリオシド、２，４−ジクロロフ
ェニル−（αまたはβ）−Ｄ−マルトペンタオシド、
２，４−ジクロロフェニル−（αまたはβ）−Ｄ−マル
トトリオシドなどがあげられる。これらのマルトオリゴ
糖、またはその還元末端グルコースに非発色源基が結合
したマルトオリゴ糖を用いる濃度としては、試薬組成中
で１〜２５０ｍＭで好適に用いられる。

【００１５】本発明の試薬組成物の最終ｐＨは、５．５
〜７．５の範囲であり、より一層、α−アミラーゼの糖
分解反応速度そのものを制御し、測定範囲を広げること
が可能となる。一方、α−アミラーゼの安定した至適ｐ
Ｈは、中性付近であることより、本発明の試薬組成物を
ｐＨ６〜８の範囲で調製するのが好ましいと考えられる
が、同時に定量性等の性能を同時に得るには、最終ｐＨ
を調製する試薬をさらに処方し、第一試薬と第二試薬に
分け、それらが混合した状態で、反応至適ｐＨになるよ
うに処方することもできる。

【００１６】試薬ｐＨを保持する方法は公知の方法であ
れば、何ら限定されるものではないが、一般的には緩衝
剤が用いられる。用いる緩衝剤としては、例えば、グッ
ド緩衝剤、トリス緩衝剤、リン酸緩衝剤等があげられ
る。緩衝剤は１０〜５００ｍＭの濃度で好適に用いられ
る。

【００１７】これら塩素イオンに対する広範囲の定量性
を得る方法としては、前述した（１）マルトオリゴ糖の
添加、（２）試薬ｐＨの調節などがあるが、これらを単
独あるいは組み合わせて用いることができる。

【００１８】さらに、本発明の測定用試薬組成物には、
測定する塩素イオンの定量性に影響を及ぼさない範囲
で、必要に応じて、防腐剤、界面活性剤等を使用するこ
ともできる。防腐剤としては、特に限定されないが、α
−アミラーゼの安定性に対する影響の少ない、アジ化ナ
トリウム、または、セフェム系、ペニシリン系、アミノ
グリコシド系、キノロン系等の抗生物質等が好適に用い
られ、これらを単独あるいは組み合わせて使用すること
ができる。界面活性剤としては、非イオン界面活性剤、
陽イオン界面活性剤、陰イオン界面活性剤などを単独あ
るいは組み合わせて使用することができる。また、２価
カチオン、例えば、カルシウム、マグネシウム、バリウ
ム、亜鉛等を０．０１〜２００ｍＭの濃度で添加するこ
とができる。また、必要に応じて、感度の向上を目的と
したニトロフェノール類の解離促進剤を使用することが
できる。ニトロフェノール類の解離促進剤としては、例
えば、α−、β−、γ−シクロデキストリン等があげら
れ、０．１〜２０ｍＭの濃度で添加することができる。

【００１９】本発明の試薬組成物は、酵素試液、基質試
液の２液に分けてもよい。酵素試液には、不活性型α−
アミラーゼおよびキレート剤を含み、基質試液には、上
記一般式（Ｉ）で示される基質およびキレート剤を含
む、組み合わせが好ましい。

【００２０】本発明では、不活性化型α−アミラーゼ
が、前述のように試料中の塩素イオンを得て、活性化型
α−アミラーゼとなり、α−アミラーゼの基質と反応す
ることを利用する。例えば、試料中の塩素イオンに不活
性化型α−アミラーゼ、キレート剤、基質として、２−
クロロ−４−ニトロフェニル−４−Ｏ−β−Ｄ−ガラク
トピラノシル−α−マルトシドを作用させることで、塩
素イオン量に依存して活性化されたα−アミラーゼの反
応により、２−クロロ−４−ニトロフェノールを生成す
る。２−クロロ−４−ニトロフェノールが、それ自体４
００ｎｍ付近に吸収があることから、遊離後、４００ｎ
ｍ付近の吸光度の変化を測定し、既知濃度の試料の吸光
度を対照に、試料中のカルシウムの濃度を求める。２−
クロロ−４−ニトロフェノールの測定方法としては、ア
ミラーゼの反応を連続的に追跡するレート法および一定
時間反応させた後、反応を止めて測定するエンドポイン
ト法のいずれもが使用されうる。

【００２１】従来から公知である基質、４−ニトロフェ
ニル−α−Ｄ−マルトトリオシド、４−ニトロフェニル
−α−Ｄ−マルトテトラオシド等を用いる追随酵素を用
いない測定方法に比べて、本発明では、高感度であるこ
とから、測定精度が向上し、さらにマルトオリゴ糖等に
よる妨害物質に対する影響を回避することが可能である
（比較例１参照）。

【００２２】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに詳細に説
明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものでな
い。実施例１下記の酵素試液および基質試液の両試液のｐＨを５．５
〜７．５の範囲で変えて、塩素イオン測定用試薬を調製
し、精製水、塩化ナトリウム１００ｍＭ標準液を試料と
した。試料５．８μｌに酵素試液１８０μｌ加え、５分
間予備加温した後、さらに、基質試液９０μｌを加え
て、反応を開始させ、該基質試液添加後、２分後から３
分間における１分あたりの吸光度変化を求め、塩素イオ
ン１００ｍＭの感度（mABS/min) を求めた。その結果を
図１に示す。

【００２３】なお、測定装置は日立７１７０形自動分析
装置を使用し、測定波長は、主波長４０５ｎｍ、副波長
５４６ｎｍであり、温度３７℃で測定を実施した。

【００２４】（１）酵素試液グッド緩衝液ｐＨ５．５〜７．５１００ｍＭ不活性化型α−アミラーゼ（ブタ膵臓由来）１０ＩＵ／ｍｌＥＤＴＡ２００ｍＭポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル０．０５％ α−シクロデキストリン１．５ｍＭ（２）基質試液グッド緩衝液ｐＨ５．５〜７．５１００ｍＭＥＤＴＡ２００ｍＭポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル０．０５％２−クロロ−４−ニトロフェニル−４−Ｏ−β −Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトシド０．８ｍＭ

【００２５】実施例２下記の酵素試液および基質試液の両試液のｐＨを５．５
〜７．５の範囲で変えて、塩素イオン測定試薬を調製
し、精製水、塩化ナトリウム１００ｍＭ標準液を試料と
した。試料５．８μｌに酵素試液１８０μｌ加え、５分
間予備加温した後、さらに、基質試液９０μｌを加えて
反応を開始させ、該基質試液添加後、２分後からの３分
間における１分あたりの吸光度変化を求め、塩素イオン
１００ｍＭの感度（mABS/min) を求めた。その結果を図
１に示す。

【００２６】なお、測定装置は日立７１７０形自動分析
装置を使用し、測定波長は、主波長４０５ｎｍ、副波長
５４６ｎｍであり、温度３７℃で測定を実施した。

【００２７】（１）酵素試液グッド緩衝液ｐＨ５．５〜７．５１００ｍＭ不活性化型α−アミラーゼ（ブタ膵臓由来）１０ＩＵ／ｍｌＥＤＴＡ２００ｍＭポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル０．０５％ α−シクロデキストリン１．５ｍＭ（２）基質試液グッド緩衝液ｐＨ５．５〜７．５１００ｍＭＥＤＴＡ２００ｍＭポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル０．０５％２−クロロ−４−ニトロフェニル− α−マルトトリオシド０．８ｍＭ

【００２８】比較例１下記の酵素試液および基質試液の両試液のｐＨを５．５
〜７．５の範囲で変えて、塩素イオン測定試薬を調製
し、精製水、塩化ナトリウム１００ｍＭ標準液を試料と
した。試料５．８μｌに酵素試液１８０μｌ加え、５分
間予備加温した後、さらに基質試液９０μｌを加えて反
応を開始させ、該基質試液添加後、２分後からの３分間
における１分あたりの吸光度変化を求め、塩素イオン１
００ｍＭの感度（mABS/min) を求めた。その結果を図１
に示す。

【００２９】なお、測定装置は日立７１７０形自動分析
装置を使用し、測定波長は、主波長４０５ｎｍ、副波長
５４６ｎｍであり、温度３７℃で測定を実施した。

【００３０】（１）酵素試液グッド緩衝液ｐＨ５．５〜７．５１００ｍＭ不活性化型α−アミラーゼ（ブタ膵臓由来）１０ＩＵ／ｍｌＥＤＴＡ２００ｍＭポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル０．０５％ α−シクロデキストリン１．５ｍＭ（２）基質試液グッド緩衝液ｐＨ５．５〜７．５１００ｍＭＥＤＴＡ２００ｍＭポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル０．０５％４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マルトトリオシド０．８ｍＭ

【００３１】図１から明らかなように、比較例１に比
べ、実施例１、２の相対感度が、顕著に向上しているこ
とがわかる。

【００３２】実施例３下記の酵素試液および基質試液にマルトースを０〜１０
０ｍＭの範囲で濃度を変えて、塩素イオン測定試薬を調
製し、精製水、塩化ナトリウム１００ｍＭ標準液を試料
とした。試料５．８μｌに酵素試液１８０μｌ加え、５
分間予備加温した後、さらに基質試液９０μｌを加えて
反応を開始させ、該基質試液添加後、２分後からの３分
間における１分あたりの吸光度変化を求め、塩素イオン
１００ｍＭの感度（mABS/min) を求めた。その結果を図
２に示す。

【００３３】なお、測定装置は日立７１７０形自動分析
装置を使用し、測定波長は、主波長４０５ｎｍ、副波長
５４６ｎｍであり、温度３７℃で測定を実施した。

【００３４】（１）酵素試液グッド緩衝液ｐＨ６．０１００ｍＭ不活性化型α−アミラーゼ（ブタ膵臓由来）１０ＩＵ／ｍｌＥＤＴＡ２００ｍＭポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル０．０５％ α−シクロデキストリン１．５ｍＭマルトース０〜１００ｍＭ（２）基質試液グッド緩衝液ｐＨ６．０１００ｍＭＥＤＴＡ２００ｍＭポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル０．０５％マルトース０〜１００ｍＭ２−クロロ−４−ニトロフェニル−４−Ｏ−β −Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトシド０．８ｍＭ

【００３５】図２から明らかなように、マルトースの添
加により、目的に応じて感度を調節できることがわか
る。

【００３６】実施例４下記の酵素試液および基質試液に、マルトースを０〜１
００ｍＭの範囲で濃度を変えて、塩素イオン測定試薬を
調製し、塩化ナトリウム１００ｍＭ水溶液およびマルト
ース２ｇ／ｄｌの塩化ナトリウム１００ｍＭ水溶液を試
料とした。試料５．８μｌに酵素試液１８０μｌ加え、
５分間予備加温した後、さらに基質試液９０μｌを加え
て反応を開始させ、該基質試液添加後、２分後から３分
間における１分あたりの吸光度変化を求め、精製水およ
び塩素イオン１００ｍＭ標準液での２点検量線に基づ
き、試料中の塩素イオン量を求めた。その結果を表１に
示す。

【００３７】なお、測定装置は日立７１７０形自動分析
装置を使用し、測定波長は、主波長４０５ｎｍ、副波長
５４６ｎｍであり、温度３７℃で測定を実施した。

【００３８】（１）酵素試液グッド緩衝液ｐＨ６．０１００ｍＭ不活性化型α−アミラーゼ（ブタ膵臓由来）１０ＩＵ／ｍｌＥＤＴＡ２００ｍＭポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル０．０５％ α−シクロデキストリン１．５ｍＭマルトース０〜１００ｍＭ（２）基質試液グッド緩衝液ｐＨ６．０１００ｍＭＥＤＴＡ２００ｍＭポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル０．０５％マルトース０〜１００ｍＭ２−クロロ−４−ニトロフェニル−４−Ｏ−β −Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトシド０．８ｍＭ

【００３９】

【表１】

【００４０】表１から明らかなように、マルトースの添
加により、試料中の内因性マルトースの影響が軽減、回
避することができることがわかる。

【００４１】

【発明の効果】本発明の塩素イオン測定用組成物は、追
随酵素が不要であり、また、高感度であることから、精
密性、定量性、正確性に優れた塩素イオンの酵素的測定
用組成物を提供できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１、２および比較例１の試薬におけ
る、塩素イオン１００ｍＭの感度（mABS/min) を示す図
である。縦軸を実施例１の試薬（ｐＨ６．５）を１００
％としたときの相対感度(%) 、横軸をｐＨ値として示
す。

【図２】実施例３のマルトース濃度を変えて調製した
試薬における、塩素イオン１００ｍＭの感度（mABS/mi
n) を示す図である。縦軸にマルトース無添加時を１０
０％とした相対感度(%) 、横軸を添加マルトース濃度(g
/L) として示す。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】（ａ）不活性化型α−アミラーゼ、
（ｂ）キレート剤および（ｃ）基質として、一般式
（Ｉ）【化１】（式中Ｒ１およびＲ２はβ−ガラクトピラノシル基また
は水素原子のいずれかを示し、Ｒ３は２−クロロ−４−
ニトロフェノール基を示し、ｎは０〜２の整数を示
す。）で表されるマルトオリゴ糖誘導体を含有し、追随
酵素を含有しない塩素イオン測定用試薬組成物。
【請求項２】マルトオリゴ糖誘導体が、２−クロロ−
４−ニトロフェニル４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシ
ル−α−マルトシドである請求項１記載の塩素イオン測
定用試薬組成物。
【請求項３】マルトオリゴ糖誘導体が、２−クロロ−
４−ニトロフェニル−α−マルトシドである請求項１記
載の塩素イオン測定用試薬組成物。
【請求項４】さらに、マルトオリゴ糖またはその還元
末端グルコースに非発色基が結合したマルトオリゴ糖を
含有する請求項１記載の塩素イオン測定用試薬組成物。
【請求項５】マルトオリゴ糖がマルトース、マルトト
リオシドまたはα−シクロデキストリンである請求項４
記載の塩素イオン測定用試薬試薬組成物。
【請求項６】試薬組成物の最終ｐＨが、５．５〜７．
５に保持されている請求項１〜５記載の塩素イオン測定
用試薬組成物。