JPH02276597A - 体液中のカルシウム測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は体液中のカルシウム測定方法に関する。

さらに詳しくは、α−アミラーゼがカルシウムによって
活性化されることを利用した体液中のカルシウム量の測
定方法に関する。

発明の背景 現在、病院の検査室において、種々の体液（血清、尿等
）中のカルシウム量が測定され、疾患の診断に用いられ
ている。

カルシウムは生体内での細胞機能や、血液の凝固機能に
重要な役割を果しているが、ヒト血漿中の量は非常に厳
密に調節されていると言われており、異常低値および高
値を知ることでの診断価値が高い。

例えば、低カルシウム血症としては、低タンパク血症、
低リン血症、腎炎、ネフローゼ、ビタミンＤ欠乏症、副
甲状腺機能低下症、クル病等の疾患、高カルシウム血症
としては、骨腫瘍、アジラン病、肺気腫、副甲状腺機能
亢進症、腎不全等の疾患の可能性があり、これらの診断
に用いることができる。

しかしながら、従来の方法では正確かつ簡便にカルシウ
ム量を測定することができなかった。

従来の技術およびその問題点 体液中のカルシウム測定法としては、以下の方法が知ら
れている。

（１）滴定法 （２）比色法 （３）原子吸光法 （４）突先分析法 （５）電極法 （θ）酵素法 （１）の滴定法は、シュウ酸塩やキレートを用いて、化
学的に滴定する方法であるが煩雑であることと、実施者
により測定値に差異が出るという欠点を有する。

（２）の比色法のうち、発色剤にｏ−ＣＰＣ（オルト−
クレゾールフタレインコンプレクソン）を用いる方法は
、８−ヒドロキシキノリンを添加し、Ｍｇ２〜オンの影
響を排除するもので、現在、病院検査室で最も汎用され
ている。

しかしながら、 １．８−ヒドロキシキノリンを加えてもなお数％程度の
Ｍｇ２〜オンの影響があること、２、温度、時間により
吸光度が変化すること、３、発色に至適ｐＨ範囲がある
こと、 ４、低濃度（カルシウム）で、測定値がマイナスになる
領域があること、 等の欠点を有しており、特に用手法で実施する場合に問
題が多い。

（３）の原子吸光法は、機器が高価であり、熟練を要す
るとともに、検体を希釈する必要がある。

（４）の炎色分析法も、検体の希釈が必要であるととも
に、特異性、再現性にも問題がある。

（５）の電極法は、機器が高価であるとともに、ｐＨの
影響を受け、また機器の保守が煩雑である。

（６）の酵素法には、ｌ）カルモジュリンを利用する方
法［特開昭８２−３８１９９号参照］　、ｉｆ）ホスホ
リパーゼＤ１コリンオキシダーゼを利用する方法がある
［特開昭６２−１９５２９７号参照］。

１）カルモジュリンを用いる方法は、特異性にはすぐれ
ているが、感度が良過ぎるため、検体の希釈（１００〜
１０００倍）が必要となる。

１１）ホスホリパーゼＤ１コリンオキシダーゼを用いる
方法は、特異性にすぐれ、また検体の希釈も不要である
が、反応に時間がかかるため、連続して測定できないと
いう欠点を有している。

以上のように、いずれの測定法も欠点を有しており、満
足のいく測定法というものはなかった。

問題点を解決するための手段 本発明者らは、正確かつ簡便に測定できる、酵素を用い
るカルシウムの定量法を見い出すべく鋭意検討を重ねた
結果、α−アミラーゼの活性がカルシウムの量に比例し
て高められることを見い出した。

種々の起源のα−アミラーゼはカルシウムと結合した活
性型として存在することが知られている（酵素ハンドブ
ック、田宮及び丸尾監修、朝食書店、４９３頁）。しか
しながら、その活性強度とカルシウムの濃度の間に直線
的な相関関係があることは全く知られておらず、これを
利用して体液中のカルシウムが測定できるということは
、今回本発明者らによって初めて見い出されたことであ
る。

しかしながら、検討を重ねるうちに、用いる基質の種類
によっては直線的な相関関係が得られなかったり、測定
範囲が狭かったりして実用に供せられない場合もあるこ
とが判明した。

そこで、本発明者らはさらに検討を加え、（１）カルシ
ウムに、より特異的なキレート剤の存在下に酵素反応を
行なうこと、および／または（２）基質として、その還
元末端グルコースに発色源基を有さないマルトオリゴ糖
類と、発色源基を有するマルトオリゴ糖類を組合せて用
いて酵素反応を行なうことにより、これらの欠点が解決
されることを見い出し、本発明を完成した。

キレート剤存在下でα−アミラーゼは酵素自身が有する
カルシウムの大部分を放出し、不活性型のα−アミラー
ゼに変化することは以前から知られている［Ｅｕｒ、Ｊ
、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　４１．１７１（１９７４）参照
のこと］が、キレート剤存在下で初めてカルシウムを定
量的に測定することができるようになったり、また測定
範囲が広がるという事実は、今回初めて見い出されたこ
とであり、また先の公知事実からはまったく予測されな
いことである。

さらに、（２）で示した２種類の基質を用いることによ
っても同様の効果が得られるという事実も今回初めて見
い出されたことであり、従来技術からは予測されないこ
とである。

発明の構成 従って、本発明は、検体に （１）α−アミラーゼとα−アミラーゼの基質を、カル
シウムにより特異的なキレート剤の存在下に作用させる
か、あるいは （ｉｉ）α−アミラーゼとα−アミラーゼの基質として （ａ）マルトオリゴ糖およびその還元末端グルコースに
非発色源基が結合したマルトオリゴ糖から選ばれる基質
と、 （ｂ）その還元末端グルコースに発色源基が結合したマ
ルトオリゴ糖およびその還元末端グルコースに発色源基
が結合し、かつ非還元末端グルコースに置換基が結合し
たマルトオリゴ糖から選ばれる基質を組合せて、 カルシウムにより特異的なキレート剤の不存在下に作用
させることを特徴とする検体中のカルシウム測定方法に
関する。

本発明に用いるα−アミラーゼは、微生物、植物または
動物のうちのいずれを起源とするものでもよいが、好ま
しくは動物起源のものであり、例えば市販のブタ膵由来
のα−アミラーゼが用いられる。α−アミラーゼは１０
００〜１００００００　Ｕ／Ω、より好ましくは５００
０〜５０００００Ｕ　／Ｒの濃度で用いられる。

本発明に用いるα−アミラーゼの基質としては、デンプ
ンおよびグリコーゲン等の多糖類およびマルトオリゴ糖
類が挙げられるが、測定の簡素化、測定時間の短縮化な
どの点からマルトオリゴ糖類が有利である。

そのようなマルトオリゴ糖類としては、（１）マルトオ
リゴ糖、例えばマルトヘプタオシド、マルトヘプタオシ
ド、（２）その還元末端グルコースに非発色源基が結合
したマルトオリゴ糖、例えば２．４−ジクロロフェニル
−α−Ｄ−マルトトリオシド、２．４−ジクロロフェニ
ル−（αまたはβ）−Ｄ−マルトペンタオシド、２．４
−ジクロロフェニル−（αまたはβ）−Ｄ−マルトヘプ
タオシド、（３）その還元末端グルコースに発色源基が
結合したマルトオリゴ糖、例えば４−ニトロフェニル−
α−Ｄ−マルトトリオシド、４−ニトロフェニル−（α
またはβ）−Ｄ−マルトペンタオシド、４−ニトロフェ
ニル−（αまたはβ）−Ｄ−マルトヘプタオシド、２−
クロロ−４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マルトトリオシ
ド、２−クロロ−４−ニトロフェニル−（αマタハβ）
−Ｄ−マルトペンタオシド、２−クロロ−４−二トロフ
ェニル−（αまたはβ）−Ｄ−マルトヘプタオシド、お
よび（４）その還元末端グルコースに゛発色源基が結合
し、かつその非還元末端グルコースに置換基、例えば環
状アセタールが結合したマルトオリゴ糖が挙げられる。

さらに、（５）　（ａ）前記したマルトオリゴ糖および
その還元末端グルコースに非発色源基が結合したマルゴ
オリゴ糖から選ばれる基質と、（ｂ）前記した、その還
元末端グルコースに発色源基が結合したマルゴオリゴ糖
およびその還元末端グルコースに発色源基が結合し、か
つ非還元末端グルコースに置換基が結合したマルトオリ
ゴ糖から選ばれる基質を組合せて用いることができる。

上記の（１）〜（４）で示される基質を単独で用いる場
合の好ましい濃度は、０．１〜５０　＋＋ｕａｏｌｅ／
、Ｑの範囲である。また（５）で示されるように組合せ
て用いる場合には、発色源基を有さないマルトオリゴ糖
と発色源基を有するマルトオリゴ糖は、それぞれ０．１
〜５０　ｍｏ＋ｏｌｅ／！Ｉの濃度で、１００：１〜１
：１の比で加えるのが好ましい。

組合わせて使用することにより、基質に対する競合性の
ため、検体中にカルシウムが存在しない場合の反応（も
ともと酵素自身がカルシウムを有するので、基質さえあ
れば検体中にカルシウムが存在しなくても酵素は活性化
され反応は進む。これをブランク反応という。）が抑制
され、測定が可能となったり、測定範囲が広くなるもの
と考えられる。

より好ましいα−アミラーゼの基質としては、前記（３
）または（５）で示される基質群であり、より具体的に
は４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マルトトリオシド、２
−クロロ−４−ニトロフェニル−β−Ｄ−マルトペンタ
オシド、またはマルトペンタオーズと２−クロロ−４−
ニトロフェニル−β−Ｄ−マルトペンタオシドの組合せ
、または２、４−ジクロロフェニル−β−Ｄ−マルトペ
ンタオシドと２−クロロ−４−ニトロフェニル−β−Ｄ
−マルトペンタオシドの組合せが挙げられる。

カルシウムに、より特異的なキレート剤としては、ゲル
コールエーテルジアミン四酢酸、１，２−ビス（Ｏ−ア
ミノフェノキシ）エタン四酢酸（以下、それぞれＧＥＤ
ＴＡＳＢＡＰＴＡと略記する。）等が挙げられる。これ
らのキレート剤は単独で、あるいは数種類を混合して用
いることができる。キレート剤は０．０５〜２０　＋＋
ｎ５ｏｌｅ／ｌの濃度で加えるのが好ましい。

キレート剤存在下では、酵素活性を増大させるカルシウ
ム（α−アミラーゼ中および検体中に存在する。）がキ
レート剤によって食われてしまうため、検体中のカルシ
ウム濃度が実際には高い場合であっても、酵素活性は低
く抑えられ、測定が可能となり、また測定範囲が広くな
ると考えられる。

キレート剤と結合するカルシウムと結合しないカルシウ
ムの間には平衡関係が成立しており、検体中のカルシウ
ム濃度に応じて酵素活性が低下し、へ 両者の間は直線関係となる。さらに好都合なことには、
カルシウムに、より特異的なキレート剤を用いるので検
体中に存在する他の金属イオン、とりわけマグネシウム
の影響を受けずに測定ができる点である。

なお、（５）で示されるように２種類の基質群を組合せ
た場合には、キレート剤の存在下あるいは不存在下のい
ずれでも十分に広い測定範囲を得ることが可能である。

本発明における検出系は、通常のα−アミラーゼ活性測
定法のそれが用いられる。例えば、α−アミラーゼの基
質として多糖類の一種であるデンプンを用いた場合には
、生成した還元糖量を公知の方法、例えばソモジー（Ｓ
ｏｍｏｇｙｌ　）法を用いて検量するか、またはプルス
ターチを用いて生成される色素によって検量することが
できる。

基質として前記のマルトオリゴ糖類のうち（１）を用い
た場合には、α−グルコシダーゼを共役させ、生成した
グルコースをグルコースオキシダーゼ／パーオキシダー
ゼ／色素系あるいはへキラキナーゼ／ホスフォグルコム
ターゼ／グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナー
ゼ／ＮＡＤＨ系へ導くことにより検出することができる
。また基質として上記のマルトオリゴ糖類のうち（２）
を用いた場合には、α−グルコシダーゼおよび／または
β−グルコシダーゼを共役させるか、または該酵素を共
役させることな（反応させ、生じた非発色源を発色系へ
導くことにより検量することができる。更に基質として
上記のマルトオリゴ糖類のうち（３）または（４）を用
いた場合には、α−グルコシダーゼおよび／またはβ−
グルコシダーゼを共役させるか、または該酵素を共、役
させることなく反応させ、生じた発色源、例えば４−ニ
トロフ工／−ｔＬ４タハ２−クロロ−４−ニトロフェノ
ールを直接比色することにより検量することができる。

（１）〜（４）のいずれの場合も基質として三炭糖を用
いた場合には共役酵素は不要であり、四炭糖から七炭糖
を用いた場合には該酵素が必要となる。

前記のマルトオリゴ糖類のうち、（５）で示されるよう
に２種類の基質を組合せて用いた場合には、α−グルコ
シダーゼおよび／またはβ−グルコシダーゼを共役させ
るか、または該酵素を共役させることなく反応させ、（
ｂ）群の基質より生じた発色源を直接比色することによ
り検量することができる。

本発明による測定は、ｐＨ５〜８を維持できるような緩
衝液中で行なわれる。そのような緩衝液はよく知られて
おり、例えばグツド緩衝液［例えば、Ｎ−２−ヒドロキ
シエチルピペラジン−Ｎ′−２−エタンスルホン酸（以
下、ＨＥＰＥＳと略記する。）、ピペラジン−Ｎ、Ｎ’
　−ビス（２−エタンスルホン酸）（以下、ＰＩ　ＰＥ
Ｓと略記する。’）　、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペ
ラジンーＮ′−２−ヒドロキシプロパン−３−スルホン
酸（以下、ＨＥＰＰＳＯと略記する。）等］、リン酸緩
衝液、トリス塩酸緩衝液等が挙げられる。緩衝液は１０
〜５００　ｎ＋ｍｏｌｅ／１の濃度で加えるのが好まし
い。

さらに本発明の測定系には、アルカリ金属のハロゲン化
物、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、臭化ナトリ
ウム、ヨウ化ナトリウムを１〜４００　ａ＋ｍｏｌｅ／
］の濃度で加えることが好ましい。

本発明の方法による測定は用手法はもちろんのこと、通
常の生化学検査用自動分析器によっても行なうことがで
きる。

実施例 以下の実施例により本発明を詳述するが、本発明はこれ
らの実施例により限定されるものではない。

実施例１：　［基質として発色源基を有するマルトオリ
ゴ糖と発色源基を有さないマルトオリゴ糖を組合わせて
用いたα−アミラーゼによるカルシウムの測定］ 以下の試薬を混合して試薬溶液を得た。

ブタ膵α−アミラーゼ ８ＱＱＱＵ　／Ω×１００μｇ α−グルコシダーゼ ２５００００Ｕ／Ｎ　Ｘ　１００μｇ β−グルコシダーゼ ２００００　Ｕ／Ｉ　Ｘ　１００μｇ ２．４−ジクロロフェニル−β−Ｄ−マルトペンタオシ
ド ２０　ａ＋ｍｏｌｅ／Ｎ　Ｘ　１００　ｕΩ２−クロロ
−４−ニトロフェニル−β−Ｄ−マルトペンタオシド ２　ａ＋ｍｏｌｅ／Ｎ　Ｘ　１００　ｔｔｌＰＩＰＥＳ
緩衝液（ｐＨ８，８） ５００　＋ｕｏｌｅ／Ｎ　Ｘ　１００　ｔｔ（１塩化ナ
トリウム ５００５ｔｏｌｅ／Ｉ　Ｘ　１００　ｔｔｎ精製水　　
　　　　　　　　　　　２８０μｇ計　　９８０μρ 上記で得られた試薬溶液に、カルシウム濃度０〜１０ｍ
ｇ／ｃｌＱ相当の酢酸カルシウム水溶液を２０μｇ添加
し、３７℃で反応させた後、４００ｎｉｌ（３７℃）で
の吸光度増加を経時的に測定し、各々の反応速度を出し
た。得られた検量線を第１図に示す。

図から分るように、検量線はカルシウム濃度７．５　ｍ
ｇ／　ｄρまで直線性を示した。

実施例２：　［基質として発色源基を有するマルトオリ
ゴ糖を用いた、キレート剤存在下におけるα−アミラー
ゼによるカルシウムの測定］以下の試薬を混合して試薬
溶液を得た。

ブタ膵α−アミラーゼ ８０００Ｕ＃　Ｘ　１００μｇ α−グルコシダーゼ ２５００００Ｕ／Ｎ　Ｘ　１００　ｔｉｎβ−グルコシ
ダーゼ ２００００　Ｕ／Ｎ　Ｘ　１００　！１１２−クロロー
４−ニトロフェニル−β−Ｄ−マルトペンタオシド ２　Ｏｎ＋ｍｏｌｅ／Ｒｘ　１００　ｔｔｌｌＡＰＴＡ ２０　　ｍｍｏｌｅ／Ｉ　Ｘ　１００　ｐｉミリン緩衝
液（ｐＨ６，５） ５００　　＋＋ｎｏｌｅ／Ｕ　　Ｘ１００　　μ、Ｑ塩
化ナトリウム ５００　ｍｍｏｌｅ／Ｎ　Ｘ　１００μｇ精製水　　　
　　　　　　　　　　２８０μｇ計　　　９８０μｇ 上記で得られた試薬溶液を用いて実施例１と同様にして
測定を行なった。得られた検量線を第２図に示す。

図から分るように、検量線はカルシウム濃度１０ｍｇ／
ｄ、Ｑまで直線性を示した。

実施例３：　［基質として発色源基を有するマルトオリ
ゴ糖と発色源基を有さないマルトオリゴ糖を組合わせて
用いた、キレート剤存在下におけるα−アミラーゼによ
るカルシウムの測定］以下の試薬を混合して試薬溶液を
得た。

ブタ膵α−アミラーゼ ８０００Ｕ／Ｎ　Ｘ　１００μｇ α−グルコシダーゼ ２５００００Ｕ／＃　ｘ　１００μｇ β−グルコシダーゼ ２００００　Ｕ／Ｎ　Ｘ　１００μｇ マルトペンタオーズ ２０　ｍｍｏｌｅ／ＩＸ　１００μｇ ２−クロロー４−二トロフエみルーβ−Ｄ−マルトペン
タオシド ２　　ｍｍｏｌｅ／ｊ？　Ｘ　１００　ｔｌｌＡＰＴＡ ２０　　ｕ＋ｏｌｅ／Ｎ　Ｘ　１００　ｔｔ！Ｊリン酸
緩衝波緩衝液８．５） ５００　ｍｍｏｌｅ／、Ｑ　Ｘ　１００　ｔｌＤ塩化ナ
トジナト リウム　ａ＋ｍｏｌｅ／ＩＸ　１００ｔｔｌ精製水　　
　　　゛　　　　　　　１８０μｇ計　　　９８０μｇ 上記で得られた試薬溶液を用いて実施例１と同様にして
（ただし、カルシウム濃度０〜３０ｍｇ／ｄΩ相当の酢
酸カルシウム水溶液を用いた。）測定を行なった。得ら
れた検量線を第３図に示す。

図から分るように、検量線はカルシウム濃度３０ｍｇ／
ｄｆｆまでほぼ直線性を示した。

実施例４：　［基質として発色源基を有するマルトオリ
ゴ糖を用いた、キレート剤存在下におけるα−アミラー
ゼによるカルシウムの測定］以下の試薬を混合して試薬
溶液を得た。

ブタ膵α−アミラーゼ ２０００００Ｕ／Ｎ　ｘ　１００μｇ ４−ニトロフェニルーα−Ｄ−マルトトリオシド５　　
ａ＋ａ＋ｏｌｅ／Ｎ　　ｘ　　１０　０１ｔ（ＩＢＡＰ
ＴＡ　　　　　１　＋ｎｏｌｅ／ｌ　Ｘ１００．ｕ＃Ｇ
ＥＤＴＡ　　　　１．７５　ｍｍｏｌｅ／ｌＸ１００μ
ＮＨＥＰＰＳＯ緩衝液（ｐＨ８，０） ５００　ｍｍｏｌｅ／Ｎ　Ｘ　１００　ｔｔｌ塩化ナト
リウム ５００　ａ＋ｍｏｌｅ／ｌ　ｘ　１００　ｕｌ精製水　
　　　　　　　　　　　　３９０μｇ計　　　９９０μ
ｇ 上記で褥られた試薬溶液に、カルシウム濃度０〜５０ｍ
ｇ／ｄ、ｆｆ相当の酢酸カルシウム水溶液を１０μｇ添
加し、３７℃で反応させた後、４００１ｍ（３７℃）で
の吸光度増加を経時的に測定し、各々の反応速度を出し
た。得られた検量線を第４図に示す。

図から分るように、検量線はカルシウム濃度５０ｍｇ／
ｄＪ２まで直線性を示した。

比較例１：　［本発明方法とｏ−ＣＰＣ法（従来法）に
おけるマグネシウムの影響］ 検体として、血清９００μｇとマグネシウム濃度Ｏ〜１
００ｍｇ／ｄＩに相当する酢酸マグネシウム溶液１００
μｇの混合液を用いて、実施例３に記載の方法によりカ
ルシウムの測定を行なった。

一方、ｏ−ＣＰＣ法の測定キット［ＣａｌｃｌｕｍＩＩ
−１１Ａ　Ｔｅ５ｔ　Ｗａｋｏ　　（和光紬薬社製）］
を用いて自動分析器（日立７０５型）で同一の検体のカ
ルシウムを測定した。ふたつの測定方法におけるマグネ
シウムの影響を第５図に示す。

図から分るように、本発明方法では検体中のマグネシウ
ムの影響をほとんど受けずに測定できているが、ｏ−Ｃ
ＰＣ法ではマグネシウムの影響を抑える工夫がしである
にもかかわらず、かなりの影響を受けている。

比較例２：　［本発明方法による測定値と。−ＣＰＣ法
（従来法）による測定値との相関関係］血清検体２５例
につき、実施例３に記載の方法とｏ−ＣＰＣ法（比較例
１に記載の測定用キットを用いた。）によってカルシウ
ム量を測定した。

両者の相関関係を第６図に示す。

図から分るように、相関の回帰直線はｎ−２５、ｒ　＝
０．９４４　、ｙ　＝０．９８５　ｘ　＋１．５５２と
なり、両者は良好な相関を示した。このことから、本発
明方法は日常検査用として十分利用できることが分る。

比較例３：　［本発明方法による測定値と。−ＣＰＣ法
（従来法）による測定値との相関関係］血清検体３６例
につき、実施例４に記載の方法とｏ−ＣＰＣ法（比較例
１に記載の測定用キットを用いた。）によってカルシウ
ム量を測定した。

両者の相関関係を第７図に示す。

図から分るように、相関の回帰直線はｎ＝３６、ｒ　−
０，９２３、ｙ　−１，０１７１＋０．１０２となり、
両者は良好な相関を示した。このことから、本発明方法
は日常検査用として十分利用できることが分る。

発明の効果 本発明は、酵素を用いた方法であるため、他の方法に比
し特異性が高く、また従来の酵素を用いた方法に比べて
長い反応時間を必要としない、正確かつ簡便なカルシウ
ムの測定方法である。

【図面の簡単な説明】

第１図、第２図、第３図および第４図は本発明方法によ
るカルシウム検量線を示し、第５図は本発明方法とｏ−
ＣＰＣ法（従来法）における検体中のマグネシウムの影
響を比較したグラフであり、第６図および第７図は本発
明方法による測定値とｏ−ＣＰＣ法（従来法′）による
測定値との相関関係を示すグラフである。 特許出願人　小野薬品工業株式会社

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）検体に、 （ｉ）α−アミラーゼとα−アミラーゼの基質を、カル
   シウムにより特異的なキレート剤の存 在下に作用させるか、あるいは （ｉｉ）α−アミラーゼとα−アミラーゼの基質として （ａ）マルトオリゴ糖およびその還元末端グルコースに
   非発色源基が結合したマルトオ リゴ糖から選ばれる基質と、 （ｂ）その還元末端グルコースに発色源基が結合したマ
   ルトオリゴ糖およびその還元末 端グルコースに発色源基が結合し、かつ 非還元末端グルコースに置換基が結合し たマルトオリゴ糖から選ばれる基質を組 合せて、 カルシウムにより特異的なキレート剤の不 存在下に作用させることを特徴とする、体 液中のカルシウム測定方法。 ２）検体にα−アミラーゼとα−アミラーゼの基質とし
   て （１）マルトオリゴ糖を単独で、または （２）その還元末端グルコースに非発色源基が結合した
   マルトオリゴ糖を単独で、または （３）その還元末端グルコースに発色源基が結合したマ
   ルトオリゴ糖を単独で、または （４）その還元末端グルコースに発色源基が結合し、か
   つ非還元末端グルコースに置換基が 結合したマルトオリゴ糖を単独で、あるい は （５）（ａ）マルトオリゴ糖およびその還元末端グルコ
   ースに非発色源基が結合したマルトオリ ゴ糖から選ばれる基質と、 （ｂ）その還元末端グルコースに発色源基が結合したマ
   ルトオリゴ糖およびその還元末端グ 端グルコースに発色源基が結合し、かつ非 還元末端グルコースに置換基が結合したマ ルトオリゴ糖から選ばれる基質を組合せて、カルシウム
   により特異的なキレート剤の存 在下に作用させることを特徴とする請求項 第１項記載の測定方法。 ３）検体にα−アミラーゼとα−アミラーゼの基質とし
   て （１）その還元末端グルコースに発色源基が結合したマ
   ルトオリゴ糖を単独で、あるいは （２）（ａ）マルトオリゴ糖およびその還元末端グルコ
   ースに非発色源基が結合したマルトオ リゴ糖から選ばれる基質と、 （ｂ）その還元末端グルコースに発色源基が結合したマ
   ルトオリゴ糖およびその還元末 端グルコースに発色源基が結合し、かつ非 還元末端グルコースに置換基が結合したマ ルトオリゴ糖から選ばれる基質を組合せて、カルシウム
   により特異的なキレート剤の存 在下に作用させることを特徴とする請求項 第２項記載の測定方法。 ４）α−アミラーゼの基質として、 （１）４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マルトトリオシド
   、 （２）２−クロロ−４−ニトロフェニル−β−Ｄ−マル
   トペンタオシド、あるいは （３）マルトペンタオーズと２−クロロ−４−ニトロフ
   ェニル−β−Ｄ−マルトペンタオシ ドを組合せて用いることを特徴とする請求 項第３項記載の測定方法。 ５）キレート剤がグリコールエーテルジアミン四酢酸ま
   たは１，２−ビス（ｏ−アミノフ ェノキシ）エタン四酢酸またはそれらの混 合物であることを特徴とする請求項第２項 記載の測定方法。 ６）検体にα−アミラーゼとα−アミラーゼの基質とし
   て （ａ）マルトオリゴ糖およびその還元末端グルコースに
   非発色源基が結合したマルトオリゴ 糖から選ばれる基質と、 （ｂ）その還元末端グルコースに発色源基が結合したマ
   ルトオリゴ糖およびその還元末端グ ルコースに発色源基が結合し、かつ非還元 末端グルコースに置換基が結合したマルト オリゴ糖から選ばれる基質を組合せて、 カルシウムにより特異的なキレート剤の不 存在下に作用させることを特徴とする請求 項第１項記載の測定方法。 ７）α−アミラーゼの基質として、 ２，４−ジクロロフェニル−β−Ｄ−マル トペンタオシドと ２−クロロ−４−ニトロフェニル−β−Ｄ −マルトペンタオシドを組合せて用いるこ とを特徴とする請求項第６項記載の測定方 法。