JPH11292701A - 細胞保護液 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 細胞や臓器を損傷少なく保存する細胞保護液
に関するものである。本発明の細胞保護液は、長期間安
定であるばかりでなく、細胞や臓器に与える損傷が少な
く、生着率も良好である。 【解決手段】 カリウムイオンとナトリウムイオンおよ
びリン酸イオンを含む電解質液に、ベーターヒドロキシ
酪酸を０．２−５ミリモル添加したことを特徴とする細
胞保護液。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、細胞保護液、特
に、臓器移植に際して用いられる細胞保護液に関するも
のである。

【０００２】

【従来の技術】細胞、特に、肝臓、腎臓、膵臓、心臓、
肺臓等の臓器の移植に際して、摘出された臓器は、移植
するまでの間、新鮮な状態に維持する必要があり、臓器
保存液が重要な役割を果たしている。

【０００３】初期の移植に際しては、ユーロコリンズ液
が用いられていたが、その場合における臓器の保存可能
な時間は、肝臓の場合でも２４時間未満であり、より長
時間保存可能で、かつ生着率の良い保存液が求められて
いた。

【０００４】最近、ウイスコンシン大学のグループが膵
臓移植時の保存液としてＵＷ液を開発した（特公平７−
６８０８２号、特公平８−２２８０１号）。このＵＷ液
は、膵臓の保存のみならず肝臓や腎臓の保存液としても
有用であり、肝臓の２４時間保存が可能となった。

【０００５】しかしながら、ＵＷ液は溶液状態では室温
で不安定であり、冷所保存が必要で、かつ、高価につく
等の問題点がある。又、ＵＷ液は、粘稠性が高いため、
急速な注入が困難であり、電解質組成が細胞内液組成に
基づいているので、再灌流直前にグラフトからの溶液の
十分なリンスが必要で、そのため臓器の活きの良さが損
なわれる原因ともなっている。又、高浸透圧により、グ
ラフト周辺の急激な変化のために再灌流障害の起こる可
能性がある。また、このようなＵＷ液を改良した細胞外
液形の臓器保存液も提案されている（特開平６−５６６
０１号，同９−３２８４０１号）。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、このよ
うな従来品の問題点に鑑み、溶液状態においてより長期
間安定であり、臓器をより長期間保存可能であり、再環
流直前のリンスが不要であり、移植後の機能不全が少な
く、生着率の良い、安価な臓器保存液の開発を検討し
た。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、鋭意検討
した結果、一定量のベーターヒドロキシ酪酸（β−ヒド
ロキシ酪酸）を共存させることにより、細胞や臓器の損
傷が少なくなり、かつ、臓器の生着率も改善されること
を知見し、本発明を完成した。

【０００８】すなわち、本発明は、 １．ナトリウムイオン，カリウムイオンおよびリン酸イ
オンを含有する電解質溶液に、０．２−５ｍｍｏｌ／Ｌ
のベーターヒドロキシ酪酸を添加したことを特徴とする
細胞保護液、 ２．ｐＨ６．５−８．０で、かつ、浸透圧が２５０−４
００ｍＯｓｍ／Ｌである上記１の細胞保護液、 ３．有機酸（イオン）または（および）炭酸（イオン）
を含有する上記１または２の細胞保存液、 ４．平均分子量１５−９０万のヒドロキシエチル澱粉を
２−１０％含有する上記１−３の細胞保護液、 ５．粘度が１．５−５ｃｐである上記１−４の細胞保護
液、 ６．平均分子量１５−９０万のヒドロキシエチル澱粉を
２−３．５％含有する上記１−５の細胞保護液、 ７．ヒドロキシエチル澱粉の平均分子量が４０−９０万
である上記１−６の細胞保護液、 ８．カリウムイオンとナトリウムイオンのモル比が０．
３−１０である上記１−７の細胞保護液、 ９．カリウムイオンとナトリウムイオンのモル比が０．
３−０．８である上記１−８の細胞保護液、 １０．平均分子量４０−９０万のヒドロキシエチル澱粉
を２−３．５％、リン酸を１２−２８ｍｍｏｌ／Ｌ、グ
ルコン酸を４５−１３５ｍｍｏｌ／Ｌ、ベーターヒドロ
キシ酪酸を０．２−１０ｍｍｏｌ／Ｌおよびマンニトー
ルを２０−６０ｍｍｏｌ／Ｌ含有し、カリウムイオンと
ナトリウムイオンのモル比が０．２−０．８であり、ｐ
Ｈが７．０−８．０であり、浸透圧が２８０−３３０ｍ
Ｏｓｍ／Ｌであり、粘度が１．８−２．５ｃｐである細
胞保護液、 １１．平均分子量１５−３５万のヒドロキシエチル澱粉
を２−７％、リン酸を１２−２８ｍｍｏｌ／Ｌ、グルコ
ン酸を４５−１３５ｍｍｏｌ／Ｌ、ベーターヒドロキシ
酪酸を０．２−１０ｍｍｏｌ／Ｌ、およびマンニトール
２０−６０ｍｍｏｌ／Ｌ含有し、カリウムとナトリウム
イオンのモル比が１−１０であり、ｐＨ値が６．５−
８．０であり、浸透圧が２８０−３３０ｍＯｓｍ／Ｌで
あり、粘度が１．５−５ｃｐである細胞保護液、 １２．炭酸ガス２０−４０％を含有する混合ガスでガス
置換した上記１−１１の細胞保護液、 １３．活性炭処理し、かつ炭酸ガスでバブリング処理し
た上記１−１２の細胞保護液、である。

【０００９】本発明の細胞保護液は、ナトリウムイオ
ン、カリウムイオンを含み、更に必要に応じてマグネシ
ウムイオン、カルシウムイオン等の陽イオンを含有して
いても良い。また、陰イオンとしては、第１リン酸イオ
ン、第２リン酸イオンを含むリン酸イオンの他、必要に
応じてクロルイオンなどのハロゲンイオン、重炭酸イオ
ンを含む炭酸イオン、および乳酸、酢酸、プロピオン
酸、クエン酸、ラクトビオン酸、グルコン酸等の有機酸
類から得られるものも含まれ、これらにより電解質溶液
を形成している。

【００１０】本発明の細胞保護液においては、ナトリウ
ムイオン濃度が高い細胞外液型であっても、カリウムイ
オンの濃度が高い細胞内液型のいずれであっても、細胞
保護作用を発揮することができる。従って、ナトリウム
イオンに対するカリウムイオンのモル比が０．２−０．
８、好ましくは、０．３−０．５の範囲内の細胞外液型
であってもよいし、また、この比が１−１０の細胞内液
型であっても良い。このような電解質溶液は、上述の如
き陽イオンまたは陰イオンからなるアルカリ又は酸によ
って、所定のｐＨ６．５−８．０、望ましくは７．０−
８．０になるように調節する。また、浸透圧も２５０−
３４０ｍＯｓｍ／Ｌに公知の手段によって調整すること
が出来る。

【００１１】本発明の細胞保護液には、平均分子量１５
−９０万のヒドロキシエチル澱粉を２−１０％含有せし
めるのがよい。これらは、例えば分子量５万以下のもの
は実質的に含まないのが望ましく、望ましくは３０−９
０万、更に望ましくは６０−８０万で出来るだけ分布巾
の狭いものが好ましい。後者の場合には、例えば分子量
２０万以下のものを実質的に含まないものがよい。ヒド
ロキシエチル澱粉は、通常、２−１０％、望ましくは２
−３．５％の濃度で用いるのがよい。

【００１２】また、マンニトール、トレハロース、キシ
ロース、グルコース、ラクトース、ラフィノース等の比
較的小分子量の糖類を適当量添加することが出来る。ま
た、必要に応じ、アデノシン、アロプリノール、グルタ
チオン、デキサメサゾン等を、適宜添加することができ
る。

【００１３】又、浸透圧も所望の浸透圧とすることが出
来るが、２８０−３３０ｍＯｓｍ／Ｌの範囲であること
が好ましく、２８０−３１０ｍＯｓｍ／Ｌ、２９０−３
００ｍＯｓｍ／Ｌの範囲であることが特に好ましい。粘
度も所望の粘度に調整することが出来るが、１．８−
２．５ｃｐの範囲とすることが好ましく、１．９−２．
２ｃｐの範囲とすることが更に好ましい。

【００１４】このようにして得られた臓器保存液は、活
性炭添加ないし活性炭フィルター等を用いて処理するの
が良い。また、必要に応じて保存液を炭酸ガスでバブリ
ングすることにより長期に亘って安定性を保つことが出
来る。更に、炭酸ガス濃度２０−４０％好ましくは２０
−３０％の不活性ガスを充填することにより、組成の変
化を防止することができる。

【００１５】このようにして得られる本発明の臓器保存
液は、ガラス瓶やバッグ等に収納して滅菌することによ
り更に安定に長期間保存することが出来る。

【００１６】

【実施例】［実験例１］ １）被験液の調整 生理塩溶液のグルコース・フリー・ハンクス緩衝液（ｐ
Ｈ７．４）［塩化ナトリウム１３６．８ミリモル、塩化
カリウム０．９５ミリモル、塩化カルシウム１．２６ミ
リモル、第２リン酸カリウム０．４４ミリモル、リン酸
第１ナトリウム０．１６ミリモル、重炭酸ナトリウム
４．１７ミリモルおよび硫酸マグネシウム０．８３ミリ
モル］に、β−ヒドロキシ酪酸（ＢＨＢ）を０．１，
０．３および１．０ミリモル、および対照としてグルコ
ース５．６ミリモル添加した。

【００１７】２）試験方法 血管内皮細胞は、ブタ胸部大動脈から、東京化学同人社
発行の新生化学実験講座１０，血管，動物の血管内皮細
胞の分離・培養法（５１−５５頁、１９９３年）によ
り、単離培養した。内皮細胞を培養後、グルコース・フ
リー・ハンクス緩衝液（ｍ−Ｈａｎｋ’ｓ）で２回洗浄
した。次に、各試験液を含む培地（表１および２参照）
を培養細胞に１０００μｌ添加し、４％酸素含有ガスで
通気したデシケーター内に入れ、３７℃で２時間保温し
た（低酸素群）。その後、３７℃に保温した５％二酸化
炭素保温器に移し、再酸素化した（再酸素化群）。

【００１８】細胞傷害性の測定は、各群に添加した培地
を回収し、培地中に漏出された乳酸脱水素酵素活性を測
定することで求めた。また、内皮細胞を界面活性剤にて
可溶化したときの乳酸脱水素酵素活性を全乳酸脱水素酵
素活性とし、これに対する百分率（％）を算出し、細胞
傷害率とした。

【００１９】

【表１】

【表２】 ３）結果 ２時間低酸素化後の細胞傷害率は第１図に、更に再酸素
化した場合の細胞傷害率は第２図に示した。

【００２０】［実施例１］グルコン酸カリウム４３．５
ミリモル、グルコン酸ナトリウム４６．５ミリモル、炭
酸水素ナトリウム１０ミリモル、ベーターヒドロキシ酪
酸１．２ミリモル、リン酸２水素ナトリウム６．５ミリ
モル、リン酸１水素ナトリウム１８．５ミリモル、マン
ニトール４０ミリモル、及び平均分子量７０万のヒドロ
キシエチル澱粉３０グラムを溶解し、ｐＨを７．４に調
整して１リットルの水溶液とした。ナトリウムイオンに
対するカリウムイオンのモル比は０．４３５、浸透圧が
３２５ｍＯｓｍ／Ｌ、粘度が２．３０ｃｐであった。

【００２１】［実施例２］１リットル中に、ベーターヒ
ドロキシ酪酸１ミリモル、グルコン酸ナトリウムを９０
ミリモル、炭酸水素ナトリウムを１０ミリモル、リン酸
２水素カリウムを６．５ミリモル、リン酸１水素カリウ
ムを３０ミリモル、マンニトールを４０ミリモル、平均
分子量６０万のヒドロキシエチル澱粉を３％濃度で含有
し、カリウムイオンとナトリウムイオンの比を０．６６
５、ｐＨ値を７．４、浸透圧を３２５ｍＯｓｍ／Ｌ、粘
度を２．３０ｃｐに調節した臓器保存液。

【００２２】［実施例３］リン酸２水素カリウム６．５
ミリモル、リン酸１水素カリウム１８．５ミリモル、グ
ルコン酸ナトリウム９０ミリモル、ベーターヒドロキシ
酪酸０．８ミリモル、炭酸水素ナトリウム１０ミリモ
ル、マンニトール４０ミリモル及び平均分子量６０万の
ヒドロキシエチル澱粉３０グラムを溶解し、ｐＨを７．
３２に調整して１リットルの水溶液とした。

【００２３】この水溶液は、カリウムイオンとナトリウ
ムイオンのモル比が０．４３５、浸透圧が２９１ｍＯｓ
ｍ／Ｌ、粘度が２．３０ｃｐの臓器保存液である。

【００２４】［実施例４］リン酸２水素カリウム１０ミ
リモル、リン酸１水素カリウム３５ミリモル、グルコン
酸ナトリウム９０ミリモル、ベーターヒドロキシ酪酸２
ミリモル、炭酸水素ナトリウム１０ミリモル、トレハロ
ース５０ミリモル、平均分子量６０万のヒドロキシエチ
ル澱粉３０グラム、アロプリノール０．７２ミリモル、
デキサメタゾン４ミリグラムを１リットル当たり配合
し、ｐＨ値を７．３２に調整した。

【００２５】この配合剤は、カリウムイオンとナトリウ
ムイオンのモル比が０．８０、浸透圧が３００ｍＯｓｍ
／Ｌ、粘度が２．３０ｃｐである臓器保存液である。

【００２６】［実施例５］グルコン酸ナトリウム１０ミ
リモル、グルコン酸カリウム８６．５ミリモル、重炭酸
ナトリウム１０ミリモル、リン酸２水素カリウム６．５
ミリモル、リン酸１水素カリウム１８．５ミリモル、ベ
ーターヒドロキシ酪酸ナトリウム１ミリモル、平均分子
量６０万のヒドロキシエチル澱粉６０グラム、マンニト
ール９０ミリモル、アロプリノール１００ミリグラム、
デキサメサゾン４ミリグラムを１リットル当たりに配合
した。

【００２７】［実施例６］炭酸水素ナトリウム９ミリモ
ル、塩化カリウム１９ミリモル、リン酸２水素カリウム
１０ミリモル、リン酸１水素カリウム３０ミリモル、ベ
ーターヒドロキシ酪酸ナトリウム０．８ミリモル、マン
ニトール４．３％、平均分子量４５万のヒドロキシエチ
ル澱粉６％を１リットル当たり配合した。

【００２８】［実施例７］平均分子量３０万のヒドロキ
シエチル澱粉５０グラム、ラクトビオン酸３５．８３グ
ラム、ベーターヒドロキシ酪酸ナトリウム０．５グラ
ム、一塩基リン酸カリウム３．４グラム、硫酸マグネシ
ウム・７水和物１．２３グラム、ラフィノース５水和物
１７．８３グラム、アデノシン１．３４グラム、アロプ
リノール０．１３６グラム、グルタチオン０．９２２グ
ラムを１リットル当たりに配合し、水酸化ナトリウムと
水酸化カリウムを用いてｐＨ７．４に調整した。

【００２９】［実施例８］リン酸２水素カリウム４．５
ミリモル、リン酸１水素カリウム１８．５ミリモル、グ
ルコン酸ナトリウム１００ミリモル、ベーターヒドロキ
シ酪酸０．８ミリモル、マンニトール４０ミリモル、及
び平均分子量７０万のヒドロキシエチル澱粉３０グラム
を溶解し、ｐＨを７．４に調整して１リットルの水溶液
とした。

【００３０】この水溶液は、カリウムイオンとナトリウ
ムイオンのモル比が０．４１５、浸透圧が２９１ｍＯｓ
ｍ／Ｌ、粘度が２．１ｃｐの臓器保存液である。

【００３１】

【発明の効果】本発明により得られる細胞保護液は、長
期間安定であるばかりでなく、細胞や臓器に与える損傷
が少なく、生着率も良好である。

【００３２】

【図面の簡単な説明】

【図１】 ２時間低酸素後の細胞傷害率

【図２】 ２時間低酸素後、更に再酸素化した場合の細
胞傷害率

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ナトリウムイオン，カリウムイオンおよび
   リン酸イオンを含有する電解質に、０．２−５ｍｍｏｌ
   ／Ｌのベーターヒドロキシ酪酸を添加したことを特徴と
   する細胞保護液。
2. 【請求項２】ｐＨ６．５−８．０で、かつ、浸透圧が２
   ５０−４００ｍＯｓｍ／Ｌであることを特徴とする請求
   項１の細胞保護液。
3. 【請求項３】有機酸（イオン）または（および）炭酸
   （イオン）を含有することを特徴とする請求項１または
   ２の細胞保護液。
4. 【請求項４】平均分子量１５−９０万のヒドロキシエチ
   ル澱粉を２−１０％含有することを特徴とする請求項１
   −３の細胞保護液。
5. 【請求項５】粘度が１．５−５ｃｐであることを特徴と
   する請求項１−４の細胞保護液。
6. 【請求項６】平均分子量１５−９０万のヒドロキシエチ
   ル澱粉を２−３．５％含有することを特徴とする請求項
   １−５の細胞保護液。
7. 【請求項７】ヒドロキシエチル澱粉の平均分子量が４０
   −９０万であることを特徴とする請求項１−６の細胞保
   護液。
8. 【請求項８】カリウムイオンとナトリウムイオンのモル
   比が０．３−１０であることを特徴とする請求項１−７
   の細胞保護液。
9. 【請求項９】カリウムイオンとナトリウムイオンのモル
   比が０．３−０．８であることを特徴とする請求項１−
   ８の細胞保護液。
10. 【請求項１０】平均分子量４０万−９０万のヒドロキシ
    エチル澱粉を２−３．５％、リン酸を１２−２８ ｍｍ
    ｏｌ／Ｌ、グルコン酸を４５−１３５ｍｍｏｌ／Ｌ、ベ
    ーターヒドロキシ酪酸を０．２−１０ｍｍｏｌ／Ｌおよ
    びマンニトールを２０−６０ｍｍｏｌ／Ｌ含有し、カリ
    ウムイオンとナトリウムイオンのモル比が０．２−０．
    ８であり、ｐＨ値が７．０−８．０であり、浸透圧が２
    ８０−３３０ｍＯｓｍ／Ｌであり、粘度が１．８−２．
    ５ｃｐであることを特徴とする細胞保護液。
11. 【請求項１１】平均分子量１５−３５万のヒドロキシエ
    チル澱粉を２−７％、リン酸を１２−２８ｍｍｏｌ／
    Ｌ、グルコン酸を４５−１３５ｍｍｏｌ／Ｌ、ベーター
    ヒドロキシ酪酸を０．２−１０ｍｍｏｌ／Ｌおよびマン
    ニトールを２０−６０ｍｍｏｌ／Ｌ含有し、カリウムイ
    オンとナトリウムイオンのモル比が１−１０であり、ｐ
    Ｈ値が６．５−８．０であり、浸透圧が２８０−３３０
    ｍＯｓｍ／Ｌであり、粘度が１．５−５ｃｐであること
    を特徴とする細胞保護液。
12. 【請求項１２】炭酸ガス２０−４０％を含有する混合ガ
    スでガス置換したことを特徴とする請求項１−１１の細
    胞保護液。
13. 【請求項１３】活性炭処理し、かつ炭酸ガスでバブリン
    グ処理したことを特徴とする請求項１−１２の細胞保護
    液。