JPH11299485A

JPH11299485A - 核酸増幅法及びこれに用いる増幅用プライマー

Info

Publication number: JPH11299485A
Application number: JP11200698A
Authority: JP
Inventors: Kazunobu Okano; 和宣岡野; Hideki Kanbara; 秀記神原
Original assignee: Hitachi Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd
Priority date: 1998-04-22
Filing date: 1998-04-22
Publication date: 1999-11-02

Abstract

(57)【要約】【課題】通常のＰＣＲ及び選択ＰＣＲを用いて断片群
をグループ化する時の擬陽性増幅や擬陰性増幅を防止し
する方法を提供する。【解決手段】ＰＣＲに使用するプライマーの３’末端
から４塩基目から６塩基目の範囲に於いて、少なくとも
１塩基を鋳型ＤＮＡ３９に相補な塩基配列とは異なる塩
基３６で置換して、鋳型ＤＮＡ３５に対し人為的に塩基
配列が相補鎖にならないように塩基配列を改変する。【効果】３’末端から１塩基から２塩基目が鋳型ＤＮ
Ａに対しミスマッチであってもＰＣＲが起きる擬陽性増
幅では、３’末端から６塩基のうち２塩基が非相補３８
となり、プライマーの３’末端近くの塩基配列が鋳型Ｄ
ＮＡと安定な相補鎖を形成できず、ミスマッチがある場
合のＰＣＲが起きずらくなる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ポリヌクレオチド
分析、ポリヌクレオチド分析用の試料調製及び分取、核
酸増幅法及びこれに用いる増幅用プライマーに関し、特
に、ＤＮＡ多型解析、ＲＮＡ発現計測等に用いるフィン
ガープリント法、ＤＮＡ塩基配列決定用のＤＮＡ試料の
調製、及びこれらに用いるプライマーに関する。

【０００２】

【従来の技術】１．フィンガープリント法：ＤＮＡ又
はｍＲＮＡ等の生体中のポリヌクレオチドを測定して、
生命の機能を明らかにする試みが盛んになりつつある。
この目的には、（１）目的とするＤＮＡと相補な塩基配
列を持つＤＮＡプローブを作り、このプローブが目的と
するＤＮＡとハイブリダイズするか否かを調べるプロー
ブ検査、（２）目的とするＤＮＡ塩基配列のある領域を
選び、一組のプライマーを用いてＰＣＲ増幅されるか否
かを調べたり、増幅した断片の長さや塩基配列を調べる
ＰＣＲ検査等がある。

【０００３】上記の検査は、特定のＤＮＡ領域や特定の
ｍＲＮＡを調べるには良いが、不特定多数のＤＮＡ領域
や特定のｍＲＮＡを調べるには、用いるプローブやプラ
イマーの種類が膨大な数になり実用的ではない。

【０００４】そもそも生体は、非常に多種類の遺伝子が
相互に関連しながら発現して成り立っているので、染色
体に含まれる遺伝子の転写発現を総合的に評価する必要
がある。また、ガンや遺伝病をＤＮＡレベルで解明する
試みに於いても、健常細胞と変異細胞中のｍＲＮＡとの
比較、又は比較的広範囲のＤＮＡの差異の比較を行なう
必要がある。

【０００５】ｍＲＮＡの計測では、先ず、細胞からｍＲ
ＮＡを抽出し、逆転者酵素を用いてｃＤＮＡを作る。ｃ
ＤＮＡは約１万種の混合物であるため、クローニングし
て個々のｃＤＮＡを得る。クローニングで得られる個々
のｃＤＮＡ種は、元のｍＲＮＡの発現頻度に依存するの
で、同一クローンの数を数え、クローン毎に分類して各
々のｍＲＮＡの発現頻度を測定できる（Ｋａｔｓｕｊｉ
Ｍｕｒａｋａｗａｅｔ．ａｌ．、Ｇｅｎｏｍｉｃ
ｓ、、２３、３７９−３８９（１９９４））。

【０００６】また、ｃＤＮＡをクラスＩＩ制限酵素を用
いて切断した断片切断部配列が、塩基配列に応じてグル
ープに分かれることを利用して、ライゲーション反応で
識別するモレキュラーインデックス法（Ｋ．Ｋａｔｏ、
ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．、２３、３６８５
−３６９０（１９９５））が開発されている。

【０００７】また、細胞間や臓器間のｍＲＮＡ発現の比
較を行なうディファレンシャルディスプレー（Ｐｅｎｇ
ＬｉａｎｇａｎｄＡｒｔｈｕｒＢ．Ｐａｒｄｅ
ｅ、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５８、９６７−９７２（１９９
２））や、増幅断片長多系解析（Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ
ＦｒａｇｍｅｎｔＬｅｎｇｔｈＰｏｌｙｍｏｒｐｈ
ｉｓｍｓ）（ＷＯ９３／０６２３９）が注目を集めてい
る。これらの方法では、ｍＲＮＡをランダムプライマー
や任意塩基配列のプライマーを用いてＰＣＲ増幅して得
られるパターンを比較して、細胞間や臓器間のｍＲＮＡ
発現の比較を可能としている。

【０００８】一方、ゲノム、又は特定のＤＮＡ領域に注
目したフィンガープリント法も試みられている。制限酵
素ランドマークスキャニング法は、ゲノムをレアーカッ
ターであるＮｏｔＩで切断し、切断部に標識を導入す
る。次に、アガロース電気泳動で分離する。電気泳動分
離後、４塩基認識酵素でゲル中で分離ＤＮＡを再切断し
た後、アガロースゲルをポリアクリルアミドの平板ゲル
上に展開する。即ち、２次元電気泳動により、非常に多
種類のゲノム由来のＤＮＡ断片を検出できる工夫をして
いる。

【０００９】２．ＤＮＡ塩基配列決定用のＤＮＡ試料
の調製：ゲノム解析を中心にＤＮＡ塩基配列決定の高効
率化のニーズが高まっている。従来の放射性同位元素を
用いてＤＮＡ断片を標識し、ゲル電気泳動によりＤＮＡ
の長さを計測して人手を用いて行なう塩基配列決定法に
代わり、ＤＮＡを蛍光体で標識し、ゲル電気泳動しなが
ら光を照射して自動的にＤＮＡ断片を光学検出する方法
（ＤＮＡシーケンサー）が普及してきている。この方法
では、目的とするＤＮＡにプライマーであるＤＮＡオリ
ゴマーをハイブリダイズさせ、酵素を用いた相補鎖合成
で塩基配列決定に用いる種々の長さのＤＮＡ断片を作製
し、ゲル電気泳動でそれらの長さを調べて塩基配列決定
するもので、サンガー法又はダイデオキシ法と呼ばれて
いる。この方法では、一度に塩基配列決定可能な長さ
は、ゲルによる長さ分離能で決められており、４００〜
７００塩基長である。塩基配列決定の対象になるのはゲ
ノムやｍＲＮＡが殆どであるが、ｍＲＮＡの場合でも数
キロ塩基長、ゲノムの場合はこれよりも更に長い場合が
殆どであるため、シーケンサーで一度に塩基配列決定は
できない。

【００１０】このような長いＤＮＡ（数Ｋ〜数十Ｋ塩
基）の塩基配列決定には、ショットガン法が用いられて
きた。ショットガン法では、ＤＮＡを超音波等を用いて
ランダムに切断し、ＤＮＡ断片をクローニングして大腸
菌等に埋め込み、コロニー培養した後、各コロニー中の
大腸菌を培養してＤＮＡのコピーを増やす。次いで、試
料ＤＮＡを抽出して塩基配列決定等のＤＮＡ解析をす
る。この方法では、取り出したコロニーに含まれるＤＮ
Ａには断片化した試料ＤＮＡが含まれるが、それが試料
ＤＮＡのどの部分である不明であるため、リダンダンシ
ーが高く、決定しようとするＤＮＡ鎖長の５〜２０倍も
のＤＮＡに相当するＤＮＡ断片を取り解析する必要があ
り、無駄が多い。ショットガン法では、原理的に各断片
の繋がりを明らかにするため、ランダムな断片調製を行
ない、断片間のオーバラッピングをとるので、塩基配列
が全く未知の長いＤＮＡに適しており、ゲノム解析計画
の主要な手法となっている。

【００１１】現在進行中のヒトゲノム計画の分野で特記
すべきことは、約３０億塩基対の殆どが２１世紀初頭に
は解明される予定であることである。既に解明された塩
基配列部分では、ＤＮＡ塩基配列の疾病による変異や、
個体間のＤＮＡ塩基配列の違いをベースに遺伝子機能の
解明を行なう研究がスタートしている。このような目的
には、ランダムなＤＮＡ調製よりも特定の部分（通常、
塩基配列決定して意味のあるエキソンの部分は長い場合
でも数キロ塩基長、実際に発現している遺伝子に対応す
るｍＲＮＡを塩基配列決定する場合でも数キロ塩基長で
ある）にしぼった試料調製と塩基配列決定が重要とな
る。即ち、一旦ゲノム塩基配列の全体像がわかった後
は、ランダムな断片調製を行ない断片間のオーバラッピ
ングをとる必要はない。

【００１２】一方、塩基配列決定しようとするＤＮＡ断
片を端から順に決めていく方法（プライマーウオーキン
グ法：ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ、２２２、２３７−１３５（１９９４））も提案され
ている。プライマーウオーキング法では、塩基配列を決
定したら、その中から次のプライマー領域を選びダイデ
オキシ法により塩基配列を再び決定する。このため無駄
が少なく効率の良い塩基配列決定ができるが、時系列的
に塩基配列を決定していくので、時間がかかる点と、解
析の都度プライマーを用意する手間がかかる欠点があ
る。

【００１３】発明者らは、上記の欠点を克服する方法と
して、予め準備した選択プライマーのセットを用いる方
法を提案した。この方法では、塩基配列決定しようとす
るＤＮＡを４塩基認識酵素等の制限酵素で完全に切断
し、重複のない断片群を作製する。生成したＤＮＡ断片
は酵素が認識して切断する部分の塩基配列を除くと塩基
配列は未知である。既知塩基配列を持ったプライマーが
ハイブリダイズし相補鎖合成の起点となるプライミング
サイトは特に持っていない。そこで生成した断片の３’
末端側に既知塩基配列のオリゴマーを結合してプライミ
ングサイトとする。プライマーをＤＮＡ断片にハイブリ
ダイズさせ相補鎖合成でＤＮＡ伸長鎖を作る時、プライ
マーの３’末端２塩基（選別塩基配列と呼ぶ）が、ＤＮ
Ａ断片と完全に相補的でピッタりハイブリダイズしてい
る時には反応が進行するが、そうでない時には反応が遅
いことが知られている。

【００１４】そこで、導入したオリゴマーに相補的な塩
基配列の３’末端に、任意の２塩基（１６通りの塩基配
列）をつけたプライマーセット（全部で末端２塩基の塩
基配列が異なる１６種のプライマーからなる）を予め用
意し、これから一組のプライマーを選ぶことにより、Ｄ
ＮＡ断片混合物の中からプライマーと完全に相補な塩基
配列を持つ特定の断片を選択的に増幅分離できる（ＤＮ
ＡＲｅｓｅａｒｃｈ１、２３１−２３７（１９９
４）、Ｇｅｎｅ、１７６、２３１−１３５（１９９
６）、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ１７、１８３
３−１７４０（１９９６）。この方法では、２本鎖ＤＮ
Ａの料末端に対応する一組のプライマーでＰＣＲ増幅を
行なう（以後選択ＰＣＲと呼ぶ）ので、プライマー組は
２５６組ある。ＤＮＡ断片群中に含まれるＤＮＡ断片の
種類が４０断片程度であれば、ほぼ確実に特定の断片の
みを増幅できる。このようにして選択ＰＣＲを用いれ
ば、混合状態にあるＤＮＡ断片の塩基配列を１６個のプ
ライマーを用いてクローニング等せずに、重複なく簡単
に決定できる。

【００１５】

【発明が解決しようとする課題】多種類のｍＲＮＡや、
ゲノムのように巨大なＤＮＡの全体像を把握すること
は、生命現象をＤＮＡや遺伝子発現のレベルで解明する
上で重要であるが、良い方法がないのが現状である。上
記１．で説明したｍＲＮＡや巨大なＤＮＡの計測に於け
るＤＮＡプローブやＰＣＲによる通常の増幅による検出
では、通常はせいぜい数十種のＤＮＡを一度に調べられ
るだけで、１万種に及ぶｍＲＮＡやＤＮＡ断片を一網打
尽に検出することはできない。

【００１６】近年、１万〜１０万種のプローブを基盤上
に整列させるプローブチップの技術が進歩し、プローブ
ハイブリダイゼーションを用いて、多種類のｍＲＮＡや
ＤＮＡ断片を同時に検出可能になって来ている。しか
し、プローブチップは面積が狭いため、固定されるプロ
ーブの量に制限があるため微量検出には向かない。ま
た、イブリダイゼーションにより捕捉したＤＮＡ等を回
収する手段が未開発なため、せっかく分離したＤＮＡや
ｍＲＮＡの利用という面では電気泳動を用いる方法に比
べ不利となっている。分子生物の分野では、ディファレ
ンシャルディスプレーのように検出したｍＲＮＡ（又は
ＤＮＡ）を分取し、塩基配列決定により差異を確認でき
ることが重要である。

【００１７】ディファレンシャルディスプレー法や増幅
断片長多系解析や制限酵素ランドマークスキャニング法
は分取は可能である。しかし、ディファレンシャルディ
スプレー法や増幅断片長多系解析では、ＰＣＲ増幅を用
いるため、擬陽性増幅や、増幅すべき断片が増幅しない
ケース（以下、偽陰性増幅と呼ぶ）が多く、必ずしも生
体内に於けるｍＲＮＡ発現を反映しているとは言えな
い。

【００１８】また、制限酵素ランドマークスキャニング
法は、通常は増幅反応を利用しないため擬陽性の問題は
少ないが、検出感度の制限がある。また、２次元電気泳
動の再現性を得ることが難しく、データベース化が重要
なＤＮＡ関連分野の解析の中では普及が遅れている。

【００１９】何れにしても、微量のゲノムやｍＲＮＡか
らの情報を得たり分取するには、ＤＮＡ断片やｃＤＮＡ
断片の増幅が必須のポイントである。即ち、最大の問題
となるのが、増幅時の擬陽性増幅の問題である。プライ
マーの３’末端近傍が鋳型に対して相補的でない場合で
も極僅かではあるが増幅が起きる。一旦間違った鋳型が
増幅されると、その後はプライマーと間違って増幅した
鋳型は完全に相補な関係となるため、正しい鋳型と同様
な勢いで増幅が起きる。増幅に用いるプライマーの選択
度が最大の問題となる。

【００２０】一方塩基配列決定の分野では、ポストゲノ
ムをにらんだ新しい塩基配列決定法の出現が望まれる
が、試料調製のランダム性を最大現に利用したショット
ガン法は、限られた領域の予め塩基配列がわかった領域
での変異を検出する目的には非力であることは前述の通
りである。選択ＰＣＲか通常のＰＣＲで特定領域の増幅
断片を得、塩基配列決定するのが良いが、やはりＰＣＲ
時の擬陽性増幅と偽陰性増幅が多く、良好なＰＣＲ増幅
が得られるプライマー組が得られないことも多々ある。

【００２１】本発明の目的は、擬陽性増幅が少ない良好
なＤＮＡ増幅を提供し、これをもとにした新しいフィン
がープリント法と塩基配列決定法を提供することにあ
る。また、本発明の目的は、新規なポリヌクレオチド増
幅用プライマーとポリヌクレオチド増幅法を提示するこ
とにある。

【００２２】

【課題を解決するための手段】擬陽性増幅や偽陰性増幅
を少なくして目的とするＤＮＡのみを増幅するには、プ
ライマーの３’末端近傍のハイブリダイゼーションの安
定性をコントロールする必要がある。プライマーの３’
末端近傍の塩基配列が鋳型に対して非相補でも極僅かで
はあるが、ギャップを乗り越えてＤＮＡポリメラーゼに
よる伸身長反応が起きることが、擬陽性増幅の発生の原
因である。擬陽性増幅の発生は、一般のＰＣＲでも起こ
るし、選択ＰＣＲでは更に顕著である。選択ＰＣＲのプ
ライマー（選択プライマー）は、種々鋳型に対し常に共
通な塩基配列部分と（６〜４０塩基で、通常は１０〜２
０塩基程度が好適である）と、共通な塩基配列に続き
３’末端に１塩基から３塩基からなるそれぞれ異なる選
択用塩基配列部分とから構成される。選択用塩基配列部
分は、１塩基から３塩基の全ての塩基の組み合わせを含
む。選択プライマーは、共通な塩基配列部分と選択用塩
基配列部分とからなるプライマー群であり複数のプライ
マーのセットから構成され、各選択プライマーは、全て
の断片に部分的にハイブリダイズするために、選択ＰＣ
Ｒでは擬陽性増幅の発生が顕著となる。選択ＰＣＲの忠
実度は、プライマーの３’末端の１塩基から３塩基の選
択塩基配列に依存しているために、例え１塩基程度がミ
スマッチしていても伸長反応が起きるケースがある。こ
のため擬陽性増幅が多くなる。

【００２３】図１は、プライマーミスマッチによる擬陽
性ＰＣＲ増幅の例を説明する図である。ライゲーション
で既知オリゴマー３を導入したＤＮＡ断片１、２がある
とする。ＤＮＡ断片１と完全相補鎖をつくるプライマー
４、５で相補鎖合成反応を行なうと、ＤＮＡ断片１はプ
ライマー４、５と相補鎖を形成するので、相補鎖伸長反
応６が起きる。プライマー４の３’末端のＡＧ、及びプ
ライマー５の３’末端のＴＣは各々選択用塩基配列部分
であり、ＡＧとＴＣがＰＣＲに於けるプライマペアの選
択用塩基配列部分となる。伸張反応生成物はＰＣＲ反応
中に更に伸張が進み断片（ＰＣＲ産物）９を生じ、正し
い増幅産物９’を与える。プライマー４、５により、Ｄ
ＮＡ断片２は本来なら増幅しないが、実際には、プライ
マー４の末端から２塩基目の塩基（Ａ）７’が、ＤＮＡ
断片２の塩基（Ｃ）７と非相補でも伸長反応８が起き
る。このような伸張反応が一旦起きるとその後のＰＣＲ
では断片（ＰＣＲ産物）１０を生じ、増幅産物１０’を
与える。この増幅産物１０、１０’が偽陽性増幅産物で
ある。

【００２４】本発明で最も考慮すべき点は、プライマー
の３’末端の１塩基から３塩基が、確実にハイブリダイ
ズした時のみ伸長反応、即ち、増幅可能にすることであ
る。このため本発明では、プライマーの３’末端から数
塩基内の位置の塩基を、ハイブリダイゼーションを起こ
しずらいもので人為的に置換する。以下、本発明のより
具体的な構成を図を用いて説明する。

【００２５】図２は、本発明のプライマーを用いて擬陽
性ＰＣＲ増幅の防止する原理を示す図である。図２で
は、説明を簡単にするため、ＤＮＡの一方の鎖を用いて
説明する。実際のＰＣＲでは２本鎖であるが、同じポリ
メラーゼ伸長反応と考えて差し支えない。

【００２６】（Ａ）増幅しようとするポリヌクレオチド
の特定塩基配列部位又はポリヌクレオチド断片混合物中
の特定断片を、ＤＮＡポリメラーゼを用いて選択的に増
幅する方法に於いて、ミスハイブリダイゼーションに関
与するＤＮＡ断片（鋳型）を１１とする。プライマーと
して、従来のプライマー１２の３’末端から４塩基目か
ら６塩基目の範囲に於いて、少なくとも１塩基を鋳型の
特定塩基配列部位又は特定断片に相補な塩基配列とは異
なるＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔの何れかの塩基で置換したプライマ
ー１３を使用する。図２では、従来のプライマー１２の
３’末端から４塩基目の塩基１５’（塩基Ａ）を、置換
して塩基１５（塩基Ｃ）としたプライマー１３を使用す
る。即ち、従来のプライマー１２は、５’…ＴＧＴＡＣ
ＡＧ３’の塩基配列を持ち、プライマー１３は、５’…
ＴＧＴＣＣＡＧ３’の塩基配列を持つ。ここで置換する
塩基はＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔの何れとも異なる塩基Ｘ、例え
ば、イノシン等でも良い。即ち、プライマー１３の塩基
配列を、５’…ＴＧＴＸＣＡＧ３’としても良い。

【００２７】従来のプライマー１２の３’末端から４塩
基目の塩基１５’を改変したプライマー１３では、５’
末端の数塩基は鋳型と完全に相補であるが、その３’末
端から４塩基目の塩基が置換されたことにより、ハイブ
リダイズしないギャップ１６の部分ができる。このた
め、３’末端近傍に他のミスマッチ１４があると、末端
近傍のハイブリダイゼーションが非常に不安定になる。

【００２８】即ち、本発明に基づき人為的に導入したミ
スマッチの他に、サンプルや反応条件由来のミスマッチ
が重なると１７のようにプライマー１３の３’末端近傍
が鋳型１１より遊離してしまい、伸長反応（増幅反応）
がより起きずらくなる。一方、従来のプライマー１２を
用いる伸長反応（増幅反応）では、ミスマッチギャップ
を乗り越えてＤＮＡポリメラーゼによる伸身長反応１
７’が起きてしまう。

【００２９】（Ｂ）本発明では、通常のＰＣＲや伸長反
応の忠実度向上はもちろん、選択プライマーを用いたケ
ースに於いても、擬陽性増幅防止効果が得られる。

【００３０】図３は、選択プライマーを用いた場合に、
擬陽性増幅防止効果が得られることを説明する図であ
る。任意の共通塩基配列部位３２とその３’末端に特定
のポリヌクレオチド断片を選択するための１塩基から３
塩基の任意の塩基種の組合せからなる選別塩基配列（選
択用塩基配列）３３を持つ選択プライマーに於いて、
３’末端から４塩基目から６塩基目の範囲３４（変異導
入部分）に於いて、少なくとも１塩基を特定断片に相補
な塩基配列とは異なる塩基で置換した塩基配列を持つプ
ライマー３１を使用することにより、擬陽性増幅の生成
を少なくする。

【００３１】図３に示すように、ＤＮＡ断片に既知塩基
配列のオリゴマー３０を導入した断片群３５、３９に対
し、プライマー３１をハイブリダイズさせる。図３に於
いて、Ｎ₁、Ｎ₂、Ｎ₃ 、Ｎ₃’、Ｍ、Ｘ、Ｙ、ｎ₁、ｎ₂、
ｎ₃、ｍ、ｘ、ｙは、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔの何れかの塩基を
示す。通常、塩基配列部分ｎ₁ｎ₂ｎ₃ｍは制限酵素の認
識配列の一部又は全部に対応する。プライマー３１は、
従来のプライマー３１’の３’末端から４塩基目の塩基
Ｎ₃（３６’）を、鋳型ＤＮＡに対し人為的に塩基配列
が相補鎖にならないように、塩基Ｎ₃’（３６）に置換
して改変したプライマーである。即ち、従来のプライマ
ー３１’は、５’…Ｎ₁Ｎ₂ Ｎ₃ ＭＸＹ３’の塩基配列を
持ち、プライマー３１は、５’…Ｎ₁Ｎ₂ Ｎ₃’ＭＸＹ
３’の塩基配列を持つ。なお、Ｎ₁Ｎ₂Ｎ₃ＭＸＹは、ｎ₁
ｎ₂ｎ₃ｍｘｙと相補である。

【００３２】また、置換する塩基はＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔの何
れとも異なる塩基Ｘ’、例えば、イノシン等でも良い。
即ち、プライマー３１の塩基配列を、５’…Ｎ₁Ｎ₂ Ｘ’
ＭＸＹ３’としても良い。３’末端から２塩基目がミス
マッチ３７であるようなＤＮＡ断片に対しては、３’末
端から４塩基の内２塩基が非相補な塩基配列部分３
６”、３７とななるため、この部分は３８のように鋳型
３５とプライマー３１とがハイブリダイズできない。従
って、ＰＣＲ等の伸長反応は起きずらくなる。

【００３３】増幅されなくてはならない断片３９に対し
ては、識別塩基部分（選択用塩基配列）３３が鋳型３９
に相補であり、プライマー３１’の３’末端の４塩基の
うち非相補な部分３６’は１塩基のみなので、ギャップ
を乗り越えてＤＮＡポリメラーゼによる伸身長反応３
８’が起きる。

【００３４】置換する塩基の位置は、３’末端から４塩
基目又は６塩基目の位置が好ましく、置換する塩基の位
置が４塩基目又は６塩基目より更に３’末端側では、ピ
リメラーゼ伸長反応が妨害を受けるケースがある。置換
する塩基の位置が３’末端から７塩基以上離れた位置で
は、擬陽性増幅防止の効果が少なくなる。１塩基のみを
置換する場合は、３’末端から４塩基目の置換が最も効
果的であった。

【００３５】（Ｃ）置換する塩基は、３’末端から４塩
基目から６塩基目の範囲に於ける、Ａ又はＴの塩基配列
の少なくとも１塩基をＣ又はＧに置換するのが、偽陽性
増幅の防止のみならず偽陰性増幅の観点からも効果があ
る。この点については実施例の中でも詳しく述べる。こ
れは特に３’末端から４塩基目を置換したプライマーに
関して有効である。

【００３６】（Ｄ）２塩基の変異を入れる場合、４塩基
〜６塩基のうち２塩基を置換するのが良いが、この場合
の少なくとも１塩基はＡ又はＴからＣ又はＧに置換する
のが効果的である。にもかかわらず２塩基を置換する場
合で偽陰性増幅が多い場合は、１塩基をＡ又はＴからＣ
又はＧに置換し、残りの１塩基をイノシンやユニバーサ
ル塩基（何れの塩基とも相補鎖を形成するが通常の塩基
に比べて安定性の低い塩基）の利用が適している。

【００３７】（Ｅ）（Ａ）から（Ｄ）のケースでは、制
限酵素切断ＤＮＡ断片（ｃＤＮＡでも良い）の制限酵素
認識部に続く数塩基の違いを利用して、選択的増幅反応
やＤＮＡ断片群のクラス分けを行なう際に特に有効であ
る。

【００３８】（Ｆ）本発明の選択プライマーを用いる実
際の増幅は、制限酵素により２本鎖試料ＤＮＡを断片化
してＤＮＡ断片を得る工程と、ＤＮＡ断片にオリゴマー
を付加する工程と、オリゴマーの塩基配列及び制限酵素
が認識する塩基配列と実質的に相補な塩基配列からなる
共通塩基配列を有し、３’末端に１塩基から３塩基の塩
基種の組合せからなり、特定のＤＮＡ断片を選択するた
めの選別塩基配列を持つプライマーからなるプライマー
セットを使用して特定ＤＮＡ断片を選別して増幅する工
程とを有するＤＮＡ試料調製方法に於いて、増幅工程に
於いて上記（Ａ）から（Ｄ）に記載のポリヌクレオチド
増幅用プライマーを用いて達成できる。

【００３９】（Ｇ）ｍＲＮＡの発現プロファイルの計測
は、ｍＲＮＡを逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを得る行程
と、ｃＤＮＡを制限酵素により断片化する行程と、ｃＤ
ＮＡ断片にオリゴマーを付加する工程と、オリゴマーの
塩基配列及び制限酵素が認識する塩基配列と実質的に相
補な塩基配列からなる共通塩基配列を有し、３’末端に
１塩基から３塩基の塩基種の組合せからなり、特定のＤ
ＮＡ断片を選択するための選別塩基配列を持つプライマ
ーからなるプライマーセットを使用して特定ＤＮＡ断片
を選別して増幅する工程とを有するＤＮＡ試料調製方法
に於いて、増幅工程に於いて上記（Ａ）から（Ｄ）に記
載のポリヌクレオチド増幅用プライマーを用いて達成で
きる。

【００４０】もちろん、本発明のプライマー及び増幅方
法を用いて増幅したＤＮＡ等のポリヌクレオチドを使用
したのと同様な種類のプライマー（選択プライマー）で
塩基配列決定することもできる。

【００４１】以下、本発明を要約する。本発明の核酸増
幅法は、（１）核酸の特定塩基配列を持つ塩基配列部
位、又は核酸断片混合物中の特定塩基配列を持つ特定断
片を、３’末端から４塩基目から６塩基目の範囲の少な
くとも１塩基を除いて特定塩基配列に相補な塩基配列を
持つプライマーと、ＤＮＡポリメラーゼとを用いて選択
的にＰＣＲ増幅すること、（２）核酸の特定塩基配列を
持つ塩基配列部位、又は核酸断片混合物中の特定塩基配
列を持つ特定断片を、特定塩基配列と相補な塩基配列
の、３’末端から４塩基目から６塩基目の範囲の塩基Ａ
又は塩基Ｔの少なくとも１塩基を塩基Ｇ又は塩基Ｃに置
換した、特定塩基配列と実質的に相補な塩基配列を持つ
プライマーと、ＤＮＡポリメラーゼとを用いて選択的に
ＰＣＲ増幅することに特徴がある。

【００４２】本発明の核酸増幅法は、核酸を制限酵素を
用いて複数の核酸断片に断片化する工程と、核酸断片の
３’末端に既知塩基配列を持つオリゴマーを付加する工
程と、制限酵素が認識する塩基配列と上記オリゴマーの
塩基配列とからなる共通塩基配列に相補な塩基配列を持
つ共通塩基配列と、３’末端に１塩基から３塩基からな
る選択用塩基配列と持つプライマー（又はそれぞれ異な
る選択用塩基配列を持つプライマー群）に於いて、
（ａ）共通塩基配列の３’末端から１塩基目から３塩基
目の範囲の少なくとも１塩基を除いて、共通塩基配列と
同じ塩基配列を持つプライマー（又はプライマー群）、
又は、（ｂ）共通塩基配列の３’末端から１塩基目から
３塩基目の範囲の塩基Ａ又は塩基Ｔの少なくとも１塩基
を塩基Ｇ又は塩基Ｃに置換した塩基配列を持つプライマ
ー（又はプライマー群）を用いて、特定の核酸断片をＰ
ＣＲ増幅する工程とを有することに特徴がある。

【００４３】本発明の核酸断片の混合物の分析法は、上
記（ａ）、又は（ｂ）のプライマー群を用いた核酸増幅
法により増幅された核酸断片を、選択用塩基配列の塩基
配列毎に電気泳動して得る電気泳動パターンをフインガ
プリントとすることに特徴がある。選択用塩基配列は、
塩基Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃから選択された１塩基から３塩基の
全ての組合せであるので、選択用塩基配列数が１塩基、
２塩基、３塩基である場合、全ての組合せは、４、１
６、６４通りであり、選択ＰＣＲでフインガプリントを
構成する電気泳動パターンの数は１６、２５６、４０９
６となる。

【００４４】本発明の増幅用プライマーは、核酸の特定
塩基配列を持つ塩基配列部位、又は核酸断片混合物中の
特定塩基配列を持つ特定断片を、ＤＮＡポリメラーゼを
用いて選択的にＰＣＲ増幅する核酸増幅法に用いる増幅
用プライマーに於いて、増幅用プライマーは、（Ｉ）
３’末端から４塩基目から６塩基目の範囲の少なくとも
１塩基を除いて特定塩基配列に相補な塩基配列を有する
こと、（ＩＩ）特定塩基配列と相補な塩基配列の、３’
末端から４塩基目から６塩基目の範囲の塩基Ａ又は塩基
Ｔの少なくとも１塩基を塩基Ｇ又は塩基Ｃに置換した、
特定塩基配列と実質的に相補な塩基配列を有することに
特徴がある。

【００４５】また、本発明の増幅用プライマーは、核酸
を制限酵素を用いて複数の核酸断片に断片化する工程
と、核酸断片の３’末端に既知塩基配列を持つオリゴマ
ーを付加する工程と、制限酵素が認識する塩基配列と上
記オリゴマーの塩基配列とからなる共通塩基配列に相補
な塩基配列を持つ共通塩基配列と、３’末端に１塩基か
ら３塩基からなるそれぞれ異なる選択用塩基配列と持つ
プライマー群を用いて特定の核酸断片をＰＣＲ増幅する
工程とを有する核酸増幅法に用いる増幅用プライマーに
於いて、増幅用プライマーは、（ＩＩＩ）共通塩基配列
の３’末端から１塩基目から３塩基目の範囲の少なくと
も１塩基を除いて、共通塩基配列と同じ塩基配列を有す
るプライマー群であること、（ＩＶ）共通塩基配列の
３’末端から１塩基目から３塩基目の範囲の塩基Ａ又は
塩基Ｔの少なくとも１塩基を塩基Ｇ又は塩基Ｃに置換し
た塩基配列を有するプライマー群であることに特徴があ
る。

【００４６】

【発明の実施の形態】プライマーのミスマッチハイブリ
ダイゼーションに起因する偽陽性増幅を防止するには、
使用するプライマーの３’末端が鋳型ＤＮＡに近づきず
らくすれば良い。３’末端の識別（選択用）塩基配列近
くの塩基配列を改変して、ハイブリダイゼーションの安
定度を低下させることにより、３’末端２塩基の選択性
を高めることを試みた。３’末端近傍のハイブリダイゼ
ーションの安定性が低下すれば、末端２塩基がミスマッ
チの場合、ＤＮＡ断片からプライマー末端が解離しやす
くなる。選択プライマーを使用する場合、共通塩基配列
部分があるので、プライマー全体の安定性を損なわずに
３’末端近傍の安定性だけをコントロールできる。

【００４７】本実施例では、８．７ｋｂのヒト由来ＤＮ
Ａを４塩基認識酵素ＮｌａＩＩＩを用いて切断し、生成
した断片群から特定のＤＮＡ断片を増幅分離するケース
について述べる。このＤＮＡ断片群の塩基配列は、各々
異なる塩基配列を持っており、殆どのフラグメントは、
制限酵素切断部に続く両端の数塩基の塩基配列が断片毎
に異なる。この制限酵素切断部に続く両端の２の塩基配
列の違いを用いて、各断片を選択ＰＣＲで分離する。本
実施例では、偽陽性増幅を抑える方法を中心に述べる。
以下に具体的な実施内容を示す。

【００４８】試料：モデル試料として、８．７ｋｂのヒ
ト由来ＤＮＡクローンを制限酵素で切断して、３’末端
にアダプター塩基配列を結合したＤＮＡ断片混合物を用
意する。この８．７ｋｂのＤＮＡを、制限酵素Ｈｓｐ９
２ＩＩで切断し、３’両末端に既知塩基配列アダプター
をＤＮＡリガーゼで連結した。即ち、４００ｆｍｏｌの
切断ＤＮＡを、１０ｍＭのＭｇＣｌ₂、１５ｍＭのＫＣ
ｌを含む１０ｍＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌの（ｐＨ７．４）
溶液に溶解し、４０ユニットのＨｓｐ９２ＩＩ（Ｐｒｏ
ｍｅｇａ、ＵＫ）を加え、３７℃、２時間反応させて完
全に切断した。エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した
後、アルカリホスファターゼで５’末端のリン酸基を除
去した。

【００４９】アダプター（５’ｐＡＣＴＧＧＣＣＧＴＣ
ＧＴＴＴ３’）（２０ｐｍｏｌ）と、ヘルパーオリゴマ
ー（５’ＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＣＡＴＧｐ
３’）（２０ｐｍｏｌ）とを、４００ｆｍｏｌの切断Ｄ
ＮＡ断片混合物に添加し、４０μＬ（マイクロリット
ル）とし、ライゲーションハイ（ＴＯＹＯＢＯ）２０μ
Ｌを添加し、１６℃で１６時間、ライゲーション反応を
行なった。

【００５０】ライゲーション反応により、各ＤＮＡ断片
の３’末端にのみ、アダプター塩基配列（ＡＣＴＧＧＣ
ＣＧＴＣＧＴＴＴ）が導入される。ライゲーション反応
は、ＤＮＡの５’末端のリン酸基と３’末端のＯＨとの
間を連結する反応である。ここで示した方法は、ヘルパ
ーオリゴマーの５末端は、リン酸基で修飾されているた
めアダプター同士のライゲーションが抑えられる上、Ｄ
ＮＡ断片の５’末端のリン酸基を除去してあるため、Ｄ
ＮＡ断片間の再結合を防止できる。このため確実にアダ
プターを導入できた。

【００５１】反応後、ＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲＰｕ
ｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮＧｍ
ｂＨ、ＨｉｌｄｅｎＧｅｒｍａｎｙ）を用いて未反応
のアダプターを除去した後、エタノール沈殿によりアダ
プターを導入した断片群を回収した。

【００５２】選択ＰＣＲ用のプライマーセット：プライ
マーはサワデーテクノロジー（東京）に発注した。以下
に示す塩基配列（配列番号１、２、３）を持つ選択プラ
イマーセットを３種類用意した。なお、Ｎは任意のＡ、
Ｃ、Ｇ、Ｔである。ＮＮは、選択用塩基配列部分であ
る。

【００５３】５’ＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣ
ＣＡＧＴＣＡＴＧＮＮ３’…セット１５’ＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＣＡ
ＣＧＮＮ３’…セット２５’ＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＣＡ
ＡＧＮＮ３’…セット３セット１は、制限酵素Ｈｓｐ９２ＩＩの認識塩基配列Ｃ
ＡＴＧを認識し、鋳型ＤＮＡ断片と完全な相補鎖を形成
できる。セット２は、３’末端より４塩基目がＴからＣ
に変化した構造をしている。セット３は、３’末端より
４塩基目がＴからＡに変化した構造をしている。

【００５４】選択ＰＣＲ：種々選択プライマーの組み合
わせで、ＤＮＡ断片群のＰＣＲ増幅を行なった。増幅は
２５μＬ容量で行ない、以下に記載の条件は、ＰＣＲに
使用する１容器当たりの条件である。予め、マイクロプ
レーとにプライマーを分注した後に、その他の混合溶液
を添加し、ホットスタートで反応を開始した。即ち、１
容器当たりの内容は、ＤＮＡ断片群（５ｆｍｏｌ）０．
０５μＬに、２種のプライマー（１０ｐｍｏｌ／μＬ）
各々０．５μＬと、Ｔａｑポリメラーゼ（５ユニット
／μＬ、ファルマシア社、製品番号２７−０７９９）
０．０７５μＬ、５０ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＭｇ
Ｃｌ₂を含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９．０）
２．５μＬ、Ｈ₂Ｏが２０μＬである。

【００５５】この混合液を９０℃で２分間変成させた
後、ｄＮＴＰ基質（各２．５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴ
Ｐ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰの混合液）２μＬを添加し、
熱サイクル反応をスタートさせた。熱サイクルは、９４
℃で３０秒間（変成）、６６℃で３０秒間（アニー
ル）、７２℃で６０秒間（伸長）を３５回繰り返すこと
を基本とした。ＰＣＲ産物は、１×ＴＡＥ緩衝液（１ｍ
ＭのＥＤＴＡ、４０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ−Ａｃｅｔ
ａｔｅ、ｐＨ８．０）で飽和した２％のＳｙｎａｇａｒ
ｏｓｅ−２（ＤｉｖｅｒｓｉｆｉｅｄＢｉｏｔｅｃ
ｈ．、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ、製品番号ＳＹＮＡＧ−２）
ゲルを担体にして電気泳動を行なった。泳動分離バンド
は、０．５マイクログラム／ｍＬのエチジウムブロマイ
ドを含む１×ＴＡＥ緩衝液で蛍光染色し、ＦＭバイオ−
１００イメージアナライザー（日立）により解析した。

【００５６】図４は、選択ＰＣＲの結果を示す電気泳動
分離結果例である。図４（ａ）は、通常のプライマー塩
基配列（５’……ＣＡＴＧＸＹ３’（ＸＹ：断片識別
（選択用）塩基配列）：セット１）を用いて選択ＰＣＲ
を行なった結果例を示す。図４（ｂ）は、通常のプライ
マー塩基配列（５’……ＣＡＴＧＸＹ３’（ＸＹ：断片
識別（選択用）塩基配列））の塩基配列を持つプライマ
ーの３’末端から４塩基目の塩基Ｔを塩基Ｃに改変し、
鋳型ＤＮＡ断片とミスマッチとしたプライマー（５’…
…ＣＡＣＧＸＹ３’（ＸＹ：断片識別（選択用）塩基配
列）：セット２）を用いて選択ＰＣＲを行なった例であ
る。

【００５７】図４（ｃ）は図４（ａ）のトレース、図４
（ｄ）は図４（ｂ）のトレースを示す。図４（ａ）と図
４（ｂ）（図４（ｃ）と図４（ｄ））に示す４１、４２
は、分子量マーカーである。図４（ａ）と図４（ｂ）
（図４（ｃ）と図４（ｄ））に示すプライマーペアー
（例えば、ＡＧ／ＧＧ、ＡＡ／ＴＣ、…）は選択ＰＣＲ
に使用した２種類のプライマーからなる組（ペア）の１
６例を示す。４３に示すグループは、プライマーのＸＹ
の塩基配列が完全に一致したＤＮＡ断片が増幅された例
である。４４に示すグループは、ＸＹが非相補な断片の
例で、偽陽性増幅産物を表わす。

【００５８】図４（ａ）と図４（ｂ）（図４（ｃ）と図
４（ｄ））との比較から明らかなように、３’末端から
４塩基目をＴからＣに改変したプライマー（５’……Ｃ
ＡＣＧＸＹ３’：セット２）を使用した場合（図４
（ｂ））には、偽陽性増幅が劇的に低下した。このプラ
イマーは３’末端の断片識別（選択用）塩基配列ＸＹか
ら２塩基離れた部位（プライマーの３‘末端からは４塩
基目になる）の塩基配列が改変されているため、ＰＣＲ
の最初の伸長反応では、鋳型となるＤＮＡ断片とは完全
に相補とはならない。従って、プライマーの３’末端近
傍と鋳型との相補鎖ハイブリッドの安定性は低くなる。
プライマーの３’末端の識別（選択用）２塩基ＸＹが、
鋳型ＤＮＡに相補な場合は、３’末端側の３塩基で鋳型
ＤＮＡとハイブリッドを形成するため、ポリメラーゼ伸
長反応は起きる。

【００５９】しかし、識別（選択用）２塩基部ＸＹが鋳
型とミスマッチである場合、３’末端部の４塩基のうち
２塩基がミスマッチとなり、鋳型との相補的なハイブリ
ッドを形成できなくなる。このため、３’末端から４塩
基目を改変したプライマーを用いることにより、偽陽性
増幅を防止できたと考えられる。

【００６０】３’末端から遠く離れた部分を改変しても
効果は期待できないので、制限酵素認識部がＣＡＴＧで
あるＨｓｐ９２ＩＩを使用した場合では、３’末端から
４塩基目の塩基配列を変えることが有効であった。

【００６１】３’末端から４塩基目をＴからＡに改変し
たプライマー（５’……ＣＡＡＧＸＹ３’（ＸＹ：断片
識別（選択用）塩基配列）：セット３）を使用した場合
でも、擬陽性増幅は低下した。しかし、特異的な増幅産
物の量は、ＴからＣに変えたプライマー（５’……ＣＡ
ＣＧＸＹ３’（セット２））を使用した場合に比較し
て、２０％から５０％程度であった。塩基配列ＣＡＣＧ
は、塩基配列ＣＡＡＧより解離温度Ｔｍが高い。プライ
マ５’……ＣＡＣＧＸＹ（セット２）については、鋳型
ＤＮＡとの最初のハイブリダイズでは３’末端から４塩
基目がミスマッチとなるため、解離温度Ｔｍが低くなり
末端２塩基の識別能（選択能）が向上する。しかし、一
度伸長反応が起きると、２回目以降の伸長反応では、末
端近傍の解離温度Ｔｍが上がり特異的なＤＮＡ断片の増
幅量が上がったと考えられる。このことは、プライマー
の３’末端から４塩基目から６塩基目のＡ又はＴの塩基
配列を、Ｃ又はＧに変換して、擬陰性増幅を防止できる
ことを示している。

【００６２】次に、図５に選択ＰＣＲに最も影響の大き
いアニーリング温度依存性（プライマ５’……ＣＡＣＧ
ＸＹ（セット２）を使用した例）について調べた結果
を、電気泳動パターンで示す。図６（ａ）は図５（ａ）
のトレース、図６（ｂ）は図５（ｂ）のトレース、図６
（ｃ）は図５（ｃ）のトレース、図６（ｄ）は図５
（ｄ）のトレースを示す。図５、及び図６に示す参照番
号４１〜４４は図４の番号と同様であり、４３は反応液
中のＤＮＡ断片に対し相補的な選択２塩基を持つプライ
マー組（ペア）の増幅結果の電気泳動パターンであり、
４４は相補的な断片がない場合の増幅結果の電気泳動パ
ターン（擬陽性産物）である。図５（ａ）（又は図６
（ａ））、図５（ｂ）（又は図６（ｂ））、図５（ｃ）
（又は図６（ｃ））、図５（ｄ）（又は図６（ｄ））
は、各々、アニール温度が５５℃、６０℃、６６℃、７
０℃の場合の増幅結果の電気泳動パターンである。アニ
ール温度５５℃では、若干の偽陽性増幅産物が観測され
た。１６種の特異的な増副産物全てが、アニール温度５
５℃から６６℃の範囲で得られた。ＣＣとＧＧのプライ
マーペアーでは特異的な断片増幅と偽陽性増幅が競合し
ていたが、アニール温度が６０℃〜６６℃になると特異
的増幅産物だけが得られた。７０℃では、アニール温度
が高すぎるため増副産物を得ることができなかった。他
の偽陽性産物もアニール温度の上昇と共に少なくなり、
６６℃ではほぼなくなった。以上の事実から選択ＰＣＲ
では、偽陽性産物を減少させるにはアニール温度を６６
℃と高めにする必要がある。

【００６３】以上、選択ＰＣＲの偽陽性増幅防止につい
て説明したが、選択ＰＣＲでは、増幅されるべき断片が
存在しても増幅しないという偽陰性のケースの問題も解
決することが実用上大切である。選択プライマーは、共
通配列を持つため、全てのＤＮＡ断片に等しくハイブリ
ダイズする能力があり、このことは３’末端の２塩記の
配列が伸長反応に大きく影響することを意味する。

【００６４】図７は、プライマー濃度を変化させた場合
の選択ＰＣＲの結果を示す電気泳動分離結果例を示す図
である。図７（ｂ）は、図７（ａ）のトレースである。
図７に示す参照番号４１〜４４は、図４の番号と同様で
ある。種々のプライマーの組み合わせで増幅される断片
量を調べると、ＡＡ、ＡＴ（但し、図７に図示せず）、
ＴＡ及びＴＴを末端にもつプライマーについては、他の
プライマーペアを用いたＰＣＲ（ＣＧとＴＧのプライマ
ーペアーで増幅した例）に比べ増幅率が低いことが分か
った。ＡＡとＴＡのプライマーペアーでは殆ど増副産物
が検出されない程増幅率が低かった。この理由として、
ＡＡ、ＡＴ、ＴＡ及びＴＴ末端のＴｍが低いためと考え
られる。そこで、Ｔｍの低さを補うため、プライマー濃
度を３倍上げて０．６ｐｍｏｌ／μＬとした時、ＣＧと
ＴＧのプライマーペアーで増幅した場合と同程度の増副
産物を得ることができた。即ち、図７に示す結果から擬
陰性増幅の防止を図るためにはプライマー濃度を大とす
れば良いことが分かる。

【００６５】以上の結果は、制限酵素Ｈｓｐ９２ＩＩだ
けでなく、Ｓａｕ３ＡＩやＡｌｕＩ等の他の制限酵素で
も効果があった。即ち、一般的にＰＣＲでは、プライマ
ーの３’末端の識別能（選択能）を上げるために、鋳型
ＤＮＡの塩基配列に対して相補的なプライマーの３’末
端から４塩基目から６塩基目の、Ａ又はＴの塩基配列を
Ｃ又はＧに変換し、それらの部分が鋳型ＤＮＡの塩基配
列に対して非相補的な塩基配列とすることが有効である
ことが分かった。

【００６６】選択ＰＣＲ産物の塩基配列決定：３’末端
から４塩基目の塩基をＴからＣに改変したプライマー
（５’……ＣＡＣＧＸＹ（セット２））に於いて、ＸＹ
＝ＡＣ、ＸＹ＝ＴＴとしたプライマーペアー（５’……
ＣＡＣＧＡＣ、５’……ＣＡＣＧＴＴ）を使用してＰＣ
Ｒ増幅した後に、ＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲＰｕｒｉ
ｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔとエタノール沈殿で増幅した
ＰＣＲ産物を回収した。ＰＣＲ産物２５ｆｍｏｌとスル
フォローダミン１０１標識した選択プライマー１ｐｍｏ
ｌとＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅ（ＲＰＮ２４４
０、Ａｍｅｒｓｈａｍ社、ＵＫ）キットを用い、サイク
ルシーケンシング反応を行なった。熱サイクルは、９４
℃で３０秒間（変成）と６３℃で３０秒間（アニール）
を２５回を行なった後、９４℃で３０秒間、７２℃で３
０秒間のサイクルを１０回行なった。エタノール沈殿
後、日立蛍光式ＤＮＡシーケンサーＳＱ−５５００で塩
基配列決定した。

【００６７】図８は、識別（選択用）塩基配列として塩
基配列ＡＣとＴＴを各々持つ選択プライマーを使用して
増幅した５８０塩基長のＰＣＲ産物（実際の塩基長は５
２３塩基）の塩基配列決定結果例である。５２３塩基長
の位置の大きなピーク５０は、ＰＣＲ産物の終点まで標
識プライマーが伸長して生じたピークである。ＰＣＲ産
物の両末端では、塩基配列の決定精度が低下するので決
定できた塩基配列は５０９塩基であった。

【００６８】決定した塩基配列は、クローニングによる
方法で求めた塩基配列と、９７．３％で一致していた。
両末端近傍の１３塩基を除いた塩基配列の中心部では、
９９．８％の一致度であった。この結果は、選択ＰＣＲ
を用いて未知塩基配列のＤＮＡ断片をサブクローニング
なしで、塩基配列決定可能なことを示している。僅か１
６種の選択プライマーセットを予め用意しておき、長い
ＤＮＡの広い範囲から種々の部分の領域の塩基配列を増
幅して、塩基配列決定可能なことが確認できた。

【００６９】本発明では、使用するプライマーの３’末
端近傍のハイブリダイゼーションの安定性をコントロー
ルして、擬陽性増幅や偽陰性増幅を少なくして目的のＤ
ＮＡのみを増幅する。

【００７０】

【発明の効果】本発明によれば、プライマーの３’末端
近くが鋳型ＤＮＡに対して非相補な状態でＰＣＲ増幅が
起きる、いわゆる擬陽性増幅を低下させる効果がある。
また、プライマーの３’末端近傍の塩基配列と鋳型ＤＮ
Ａの塩基配列との間の相補結合の解離温度Ｔｍが低いた
めに増幅すべき鋳型ＤＮＡが増幅しない、いわゆる擬陰
性増幅を少なくする効果がある。これら効果によりＰＣ
Ｒの信頼性が向上する。従って、従来技術では困難を伴
った、混合ＤＮＡ断片やｃＤＮＡ断片を選択ＰＣＲで分
類する際に、全ての断片をより確実に検出可能になる。
また、混合ＤＮＡ断片やｃＤＮＡ断片又は長い断片中の
特定領域をＰＣＲを利用して分取する際にも、より確実
にこれらを分取できる効果があるため、クローニングの
代わりにＰＣＲを用いることが可能になる。本発明によ
れば、従来技術では成功率が低かったＤＮＡ混合物の非
クローニングの塩基配列決定が確実に可能になる。

【００７１】（配列表）配列番号：１配列の長さ：２７配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジ−：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列ＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＣＡＴＧ
ＮＮ配列番号：２配列の長さ：２７配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジ−：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列ＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＣＡＣＧ
ＮＮ配列番号：３配列の長さ：２７配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジ−：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列ＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＣＡＡＧ
ＮＮ

【図面の簡単な説明】

【図１】プライマーミスマッチによる擬陽性ＰＣＲ増幅
の例を説明する図。

【図２】本発明のプライマーを用いて擬陽性ＰＣＲ増幅
の防止する原理を示す図。

【図３】本発明の選択プライマーを用いて擬陽性増幅防
止効果が得られることを説明する図。

【図４】本発明の実施例に於いて、選択ＰＣＲの結果を
示す電気泳動分離結果例を示す図。

【図５】本発明の実施例に於けるプライマーを用いたＰ
ＣＲ増幅のアニール温度依存性を示す電気泳動パター
ン。

【図６】本発明の図５のトレース。

【図７】本発明の実施例に於いて、プライマー濃度を変
化させた時の選択ＰＣＲの結果を示す電気泳動分離結果
例を示す図。

【図８】本発明の実施例に於いて、選択ＰＣＲで得られ
たＤＮＡ増幅産物の塩基配列決定例を示す図。

【符号の説明】

１、２、１１、３５、３９…試料ＤＮＡ断片、３…ライ
ゲーションで結合した既知オリゴマー、４、５…選択プ
ライマー、６…相補鎖伸長反応、７、７’…非相補な部
分塩基配列、８…プライマーと試料ＤＮＡのミスハイブ
リダイゼーションによる相補鎖伸長反応、９、９’…Ｐ
ＣＲ産物、１０、１０’…擬陽性増幅によるＰＣＲ産
物、１２、３１’…従来のプライマー、１３、３１…本
発明のプライマー、１４、１６、３６”、３７…鋳型Ｄ
ＮＡとプライマーの非相補な塩基配列部分、１５、３６
…本発明で鋳型ＤＮＡと非相補になるように塩基を改変
した部分、１５’、３６’…通常のプライマーの塩基、
１７、３８…プライマーの３’末端部分が鋳型ＤＮＡに
対して遊離した状態、１７’、３８’…伸長反応部分、
３０…既知塩基配列のオリゴマー、３２…共通塩基配列
部分、３３…識別（選択用）塩基配列部分、３４…変異
導入部分。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】核酸の特定塩基配列を有する塩基配列部
位、又は核酸断片混合物中の特定塩基配列を有する特定
断片を、３’末端から４塩基目から６塩基目の範囲の少
なくとも１塩基を除いて前記特定塩基配列に相補な塩基
配列を有するプライマーと、ＤＮＡポリメラーゼとを用
いて選択的にＰＣＲ増幅することを特徴とする核酸増幅
法。
【請求項２】請求項１に記載の核酸増幅法に於いて、前
記核酸は、ｍＲＮＡを逆転写酵素を用いて得たｃＤＮＡ
であることを特徴とする核酸増幅法。
【請求項３】請求項１に記載の核酸増幅法に於いて、前
記核酸断片は、ｍＲＮＡを逆転写酵素を用いて得たｃＤ
ＮＡを、前記制限酵素により断片化して得た断片である
ことを特徴とする核酸増幅法。
【請求項４】核酸の特定塩基配列を有する塩基配列部
位、又は核酸断片混合物中の特定塩基配列を有する特定
断片を、前記特定塩基配列と相補な塩基配列の、３’末
端から４塩基目から６塩基目の範囲の塩基Ａ又は塩基Ｔ
の少なくとも１塩基を塩基Ｇ又は塩基Ｃに置換した、前
記特定塩基配列と実質的に相補な塩基配列を有するプラ
イマーと、ＤＮＡポリメラーゼとを用いて選択的にＰＣ
Ｒ増幅することを特徴とする核酸増幅法。
【請求項５】請求項４に記載の核酸増幅法に於いて、前
記核酸は、ｍＲＮＡを逆転写酵素を用いて得たｃＤＮＡ
であることを特徴とする核酸増幅法。
【請求項６】請求項４に記載の核酸増幅法に於いて、前
記核酸断片は、ｍＲＮＡを逆転写酵素を用いて得たｃＤ
ＮＡを、前記制限酵素により断片化して得た断片である
ことを特徴とする核酸増幅法。
【請求項７】核酸を制限酵素を用いて複数の核酸断片に
断片化する工程と、前記核酸断片の３’末端に既知塩基
配列を有するオリゴマーを付加する工程と、前記制限酵
素が認識する塩基配列と前記オリゴマーの塩基配列とか
らなる共通塩基配列に相補な塩基配列を有する共通塩基
配列と、３’末端に１塩基から３塩基からなるそれぞれ
異なる選択用塩基配列と有するプライマー群に於いて、
前記共通塩基配列の３’末端から１塩基目から３塩基目
の範囲の少なくとも１塩基を除いて、前記共通塩基配列
と同じ塩基配列を有するプライマー群を用いて、特定の
前記核酸断片をＰＣＲ増幅する工程とを有することを特
徴とする核酸増幅法。
【請求項８】請求項７に記載の核酸増幅法に於いて、前
記核酸断片は、ｍＲＮＡを逆転写酵素を用いて得たｃＤ
ＮＡを、前記制限酵素により断片化し得た断片であるこ
とを特徴とする核酸増幅法。
【請求項９】前記選択用塩基配列の塩基配列毎に、請求
項７に記載の核酸増幅法により増幅された前記核酸断片
を電気泳動して得る電気泳動パターンをフインガプリン
トとすることを特徴とする核酸断片の混合物の分析法。
【請求項１０】核酸を制限酵素を用いて複数の核酸断片
に断片化する工程と、前記核酸断片の３’末端に既知塩
基配列を有するオリゴマーを付加する工程と、前記制限
酵素が認識する塩基配列と前記オリゴマーの塩基配列と
からなる共通塩基配列に相補な塩基配列を有する共通塩
基配列と、３’末端に１塩基から３塩基からなるそれぞ
れ異なる選択用塩基配列と有するプライマー群に於い
て、前記共通塩基配列の３’末端から１塩基目から３塩
基目の範囲の塩基Ａ又は塩基Ｔの少なくとも１塩基を塩
基Ｇ又は塩基Ｃに置換した塩基配列を有するプライマー
群を用いて特定の前記核酸断片をＰＣＲ増幅する工程と
を有することを特徴とする核酸増幅法。
【請求項１１】請求項１０に記載の核酸増幅法に於い
て、前記核酸断片は、ｍＲＮＡを逆転写酵素を用いて得
たｃＤＮＡを、前記制限酵素により断片化して得た断片
であることを特徴とする核酸増幅法。
【請求項１２】前記選択用塩基配列の塩基配列毎に、請
求項１０に記載の核酸増幅法により増幅された前記核酸
断片を電気泳動して得る電気泳動パターンをフインガプ
リントとすることを特徴とする核酸断片の混合物の分析
法。
【請求項１３】核酸を制限酵素を用いて複数の核酸断片
に断片化する工程と、前記核酸断片の３’末端に既知塩
基配列を有するオリゴマーを付加する工程と、前記制限
酵素が認識する塩基配列と前記オリゴマーの塩基配列と
からなる共通塩基配列に相補な塩基配列を有する共通塩
基配列と、３’末端に１塩基から３塩基からなる選択用
塩基配列と有するプライマーに於いて、前記共通塩基配
列の３’末端から１塩基目から３塩基目の範囲の少なく
とも１塩基を除いて、前記共通塩基配列と同じ塩基配列
を有するプライマーを用いて特定の前記核酸断片をＰＣ
Ｒ増幅する工程とを有することを特徴とする核酸増幅
法。
【請求項１４】請求項１３に記載の核酸増幅法に於い
て、前記核酸断片は、ｍＲＮＡを逆転写酵素を用いて得
たｃＤＮＡを、前記制限酵素により断片化して得た断片
であることを特徴とする核酸増幅法。
【請求項１５】請求項１３に記載の核酸増幅法により増
幅された前記核酸断片を電気泳動することを特徴とする
核酸断片の混合物の分析法。
【請求項１６】核酸を制限酵素を用いて複数の核酸断片
に断片化する工程と、前記核酸断片の３’末端に既知塩
基配列を有するオリゴマーを付加する工程と、前記制限
酵素が認識する塩基配列と前記オリゴマーの塩基配列と
からなる共通塩基配列に相補な塩基配列を有する共通塩
基配列と、３’末端に１塩基から３塩基からなる選択用
塩基配列と有するプライマーに於いて、前記共通塩基配
列の３’末端から１塩基目から３塩基目の範囲の塩基Ａ
又は塩基Ｔの少なくとも１塩基を塩基Ｇ又は塩基Ｃに置
換した塩基配列を有するプライマーを用いて特定の前記
核酸断片をＰＣＲ増幅する工程とを有することを特徴と
する核酸増幅法。
【請求項１７】請求項１６に記載の核酸増幅法に於い
て、前記核酸断片は、ｍＲＮＡを逆転写酵素を用いて得
たｃＤＮＡを、前記制限酵素により断片化して得た断片
であることを特徴とする核酸増幅法。
【請求項１８】請求項１６に記載の核酸増幅法により増
幅された前記核酸断片を電気泳動することを特徴とする
核酸断片の混合物の分析法。
【請求項１９】核酸の特定塩基配列を有する塩基配列部
位、又は核酸断片混合物中の特定塩基配列を有する特定
断片を、ＤＮＡポリメラーゼを用いて選択的にＰＣＲ増
幅する核酸増幅法に用いる増幅用プライマーに於いて、
前記増幅用プライマーは、３’末端から３塩基目から６
塩基目の範囲の少なくとも１塩基を除いて前記特定塩基
配列に相補な塩基配列を有することを特徴とする増幅用
プライマー。
【請求項２０】核酸の特定塩基配列を有する塩基配列部
位、又は核酸断片混合物中の特定塩基配列を有する特定
断片を、ＤＮＡポリメラーゼを用いて選択的にＰＣＲ増
幅する核酸増幅法に用いる増幅用プライマーに於いて、
前記増幅用プライマーは、前記特定塩基配列と相補な塩
基配列の、３’末端から４塩基目から６塩基目の範囲の
塩基Ａ又は塩基Ｔの少なくとも１塩基を塩基Ｇ又は塩基
Ｃに置換した、前記特定塩基配列と実質的に相補な塩基
配列を有することを特徴とする増幅用プライマー。
【請求項２１】核酸を制限酵素を用いて複数の核酸断片
に断片化する工程と、前記核酸断片の３’末端に既知塩
基配列を有するオリゴマーを付加する工程と、前記制限
酵素が認識する塩基配列と前記オリゴマーの塩基配列と
からなる共通塩基配列に相補な塩基配列を有する共通塩
基配列と、３’末端に１塩基から３塩基からなるそれぞ
れ異なる選択用塩基配列と有するプライマー群を用いて
特定の前記核酸断片をＰＣＲ増幅する工程とを有する核
酸増幅法に用いる増幅用プライマーに於いて、前記増幅
用プライマーは、前記共通塩基配列の３’末端から１塩
基目から３塩基目の範囲の少なくとも１塩基を除いて、
前記共通塩基配列と同じ塩基配列を有するプライマー群
であることを特徴とする増幅用プライマー。
【請求項２２】核酸を制限酵素を用いて複数の核酸断片
に断片化する工程と、前記核酸断片の３’末端に既知塩
基配列を有するオリゴマーを付加する工程と、前記制限
酵素が認識する塩基配列と前記オリゴマーの塩基配列と
からなる共通塩基配列に相補な塩基配列を有する共通塩
基配列と、３’末端に１塩基から３塩基からなるそれぞ
れ異なる選択用塩基配列と有するプライマー群を用いて
特定の前記核酸断片をＰＣＲ増幅する工程とを有する核
酸増幅法に用いる増幅用プライマーに於いて、前記増幅
用プライマーは、前記共通塩基配列の３’末端から１塩
基目から３塩基目の範囲の塩基Ａ又は塩基Ｔの少なくと
も１塩基を塩基Ｇ又は塩基Ｃに置換した塩基配列を有す
るプライマー群であることを特徴とする増幅用プライマ
ー。