JPH11299487A - 新規遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 血管内皮細胞のずり応力に関する生理的環境
の有無についての検出が可能となる。 【構成】 下記の制限酵素地図 【化１】 に示される制限酵素サイトにより特徴付けられるヒト遺
伝子に由来するＤＮＡ、そのペプチドコード領域のＤＮ
Ａ、およびそれらの断片からなる群より選択されるＤＮ
Ａ。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規遺伝子を含む
ＤＮＡおよび該ＤＮＡを含有する組換えプラスミドに関
する。

【０００２】

【従来の技術】近年、血管の機能についての研究はめざ
ましい発展を遂げている。中でも血管における血管内皮
細胞が果たす役割は非常に大きいことが知られ、その機
能として血管内腔から組織への物質の透過性調節、抗血
液凝固物質の発現による抗血栓作用の維持、血管腔の拡
張や収縮の調節等がある。これらの機能が何らかの影響
で働かなくなると、種々の脈管疾患発症へと展開するこ
とも指摘されている。

【０００３】この血管内皮細胞の機能をコントロールす
る因子の一つとして、物理的因子であるずり応力が知ら
れている〔Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ
ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉ
ｎｇ、５、２４５−２６４（１９９３）〕。ずり応力は
血流速度と血液の粘性、さらには血管の径や形態によっ
て規定されるが、生体内においては血管の分岐部側壁内
側などのずり応力の低い部位に動脈硬化症がよく発生す
ることが知られており〔Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｂｌｏｏｄ
Ｆｌｏｗ ｉｎ Ａｔｈｅｒｏｇｅｎｅｓｉｓ（Ｙ．Ｙ
ｏｓｈｉｄａｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ）、Ｓｐｒｉｎｇｅ
ｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｔｏｋｙｏ（１９８８）〕、ずり応
力と血管内皮細胞機能制御の重要性が指摘されている。

【０００４】しかしながら、このずり応力と血管内皮細
胞についての研究はかならずしも十分ではなく、血管内
皮細胞の機能がその生理環境下でどのように制御されて
いるのかは明確ではなかった。ところで、一般に生理活
性物質やレセプター等の蛋白は、それぞれの動物の種類
により、配列が異なることが普通であり、したがって、
似たような蛋白をそれぞれの動物が有するとしても、他
の種類の動物に由来する該蛋白を異なる種類の動物に与
えても反応性や効果に差があることが予想される。例え
ば、ヒトとウシのγ−ＩＦＮは、ＲＮＡに強く結合して
ウシの精子から単離したＲＮａｓｅＡダイマーの活性を
阻害するが、マウスγ−ＩＦＮにはその阻害能がないと
報告している［Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３０７，１２３
−１２７（１９９５）］。さらにまた、組換えラットプ
ロテインＣとラット血漿由来プロテインＣは、ラット血
漿を用いた活性化部分トロンボプラスチン時間を用量依
存的に延長するが、ヒト血漿由来プロテインＣは延長作
用が弱いと報告している［Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓａｎｄ
Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ，７１，５４−６１（１９９
４）］。このように種差があることが予想される状況に
おいては、ヒトに特異な蛋白を取得することが、ヒトの
医薬分野の将来の展開に極めて好ましいことは論を待た
ない。

【０００５】血管内皮細胞がずり応力の加わる正常な生
理的環境にあるか否かについての検出方法を提供する場
合、種差というのは非常に大きな影響を与えるかもしれ
ないという可能性を予め考慮しなければならない。つま
り、ヒト生体内あるいはヒト由来の血管内皮細胞につい
て検出を行なう際には、後述の方法によってある特定の
ＤＮＡあるいは蛋白質の発現量を測定することが最も効
果的であるが、他の動物等の組織や細胞から取得したＤ
ＮＡ等は、場合によりヒトにおいてはその相同性が低
く、またコードする蛋白質のアミノ酸配列もかなり異な
ることがあり、定量的あるいは定性的な検出が不可能に
なることがある。そのような可能性を考慮し、ヒトから
単離したＤＮＡ等を利用して検出することが望まれる。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】血管内皮細胞のおかれ
ている環境や機能等を測定することは重要なことと判断
されるが、例えば、血管内皮細胞がずり応力の加わる正
常な生理的環境にあるか否かについての検出方法を提供
することが望まれていた。従って本発明の課題は、血管
内皮細胞の機能が生理的環境下でどのように制御されて
いるのかを明確にすることであり、さらに詳しくは血管
内皮細胞のずり応力に関する生理的環境の有無について
の検出を可能にすることであった。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者は上記問題点を
開発すべく鋭意研究したところ、ずり応力を負荷した血
管内皮細胞より抽出したｍＲＮＡを用いて得たｃＤＮＡ
ライブラリーから、新規な遺伝子のＤＮＡ断片を単離す
ることに成功した。そしてそのＤＮＡ断片を用いて、新
規遺伝子全長を含むＤＮＡを単離・取得するに至った。
そしてさらにこの遺伝子の発現量が、血管内皮細胞が受
けるずり応力に比例して変化することを見いだし、該遺
伝子が血管内皮細胞のずり応力に関する生理的環境の有
無についての検出が可能であることを確認し、本発明を
完成するに至った。

【０００８】即ち本発明は、下記の制限酵素地図

【０００９】

【化２】

【００１０】に示される制限酵素サイトにより特徴付け
られるヒト遺伝子に由来するＤＮＡ、そのペプチドコー
ド領域のＤＮＡ、およびそれらの断片からなる群より選
択されるＤＮＡである。ここで、上記のペプチドコード
領域が、配列番号１の１−４２３のアミノ酸配列をコー
ドする塩基配列が好ましい例として挙げられる。さらに
具体的には、このペプチドコード領域が、配列番号２の
１−１２６９の塩基配列であることが好ましい例として
挙げられる。また、上記制限酵素地図に示される制限酵
素サイトにより特徴付けられるＤＮＡが、配列番号３の
１−１５６２であることが好ましい例として挙げられ
る。

【００１１】以下に本発明を詳細に説明する。本発明の
ＤＮＡを調製するに際して用いられる細胞としては、ず
り応力に対して応答を示すものならば特に限定されない
が、接着性の細胞が好ましく、例えば血管内皮細胞があ
げられ、特に好ましくはヒト血管内皮細胞が例示され
る。さらに好ましくは、ヒトさい帯静脈内皮細胞（ＨＵ
ＶＥＣ）があげられる。この血管内皮細胞はヒトさい帯
より、細胞、２０、３２９（１９８８）またはＨｕｍａ
ｎＣｅｌｌ、１、１８８（１９８８）に記載の方法に従
って容易に分離できる。また、分離済みの２次培養細胞
を入手し、利用することも可能である。血管内皮細胞の
継代数は血管内皮細胞としての性質を保持するものであ
れば良く、好ましくは１０継代以内のものがあげられ
る。細胞は単独で使用することも可能であるが、二種類
以上の細胞を同時に用いることも可能である。

【００１２】ずり応力としては、細胞が産生する遺伝子
の発現が変化し得る程度の強度であれば特に限定されな
いが、通常は０．１ｄｙｎ／ｃｍ² 以上であればよく、
好ましくは１．５ｄｙｎｅｓ／ｃｍ² 以上、更に好まし
くは１５ｄｙｎｅｓ／ｃｍ²以上が例示される。また、
上限としては細胞を破壊したり、接着せずに浮遊させて
しまう程の強度でなければよく、また、動力的な経済効
率からも選択すればよいが、通常は１０００ｄｙｎｅｓ
／ｃｍ² 以下、好ましくは２５ｄｙｎｅｓ／ｃｍ² 以下
が例示される。ずり応力の値によって生体内の動脈系内
皮細胞や静脈系内皮細胞が受けているずり応力下で内皮
細胞を培養することができる。ずり応力の値は次に示す
方法にて求めることができる。

【００１３】ずり応力＝粘度×（（６×流量）／（流路
の幅×流路の高さ²) ） つまり、培養液の粘度、培養液の流量、さらに流路の形
状を変化させることによって、容易にずり応力の値を種
々変化させることができる。ｃＤＮＡライブラリーを作
製するに際しては、細胞に負荷するずり応力は平均値と
して上記の好ましい範囲にあることが好ましい。また、
それぞれの細胞に均一に負荷されるようにすることも可
能であり、流路が、幅と高さが一致しないような変形し
たものである場合には、細胞の接着した面によってその
細胞に負荷されるずり応力は異なるので、好ましくは平
面に囲まれた四角柱が例示される。この四角柱において
は、いずれかの一面に細胞を接着するか、その面に相対
する面に細胞を接着し、その側面には接着しない方法に
より、細胞と均一のずり応力を負荷することができる。

【００１４】細胞の培養に用いる培養液は、通常の公知
の組成に従えばよく、例えば、血管内皮細胞の場合に
は、ウシなどの動物の血清を０〜２０％添加した細胞培
養用培地を用いることが好ましく、さらに好ましくはＥ
−ＧＭ ＵＶ培地（２％ウシ胎児血清含有、クラボウ社
製）あるいはＭ１９９培地にウシ胎児血清を２０％添加
したものが例示される。さらに、培養液中にＥＣＧＳ
〔Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ｓ
ｕｐｐｌｅｍｅｎｔ〕、ＥＧＦ〔Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ
ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ；Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、７７、７７４−７８８（１
９７８）〕あるいはｂａｓｉｃ−ＦＧＦ〔Ｆｉｂｒｏｂ
ｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ；Ｊｏｕｒｎａ
ｌ ｏｆＣｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、７７、７７４−７
８８（１９７８）〕等の細胞増殖因子を添加することに
よって、細胞の増殖を良くすることも好ましい。また、
デキストラン等を添加することによって培養液の粘性を
上昇させ、培養細胞に高いずり応力を負荷することもで
きる。

【００１５】ずり応力を負荷することができる培養装置
としては、回転円板型〔Ｂｉｏｒｈｅｏｌｏｇｙ、２
５、４６１（１９８８）〕、平行平板型〔Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎ
ｇ、２７、１０２１（１９８５）〕及びマイクロキャリ
ア型〔特開平４−１７９４７６号公報〕等が利用できる
が、好ましくは平行平板型が用いられ得る。

【００１６】ずり応力負荷において、血管内皮細胞の培
養は特定されるものではないが、例えば、以下に示す方
法が例示される。細胞培養面に血管内皮細胞を敷石状に
接着させ、培養装置をセットする。培養温度は細胞が培
養可能な温度であるならばよいが、３７℃が好ましく、
さらに５％の二酸化炭素ガスを満たしたふ卵器内にて行
うことが好ましい。細胞数は特に限定されないが、鋳型
ｃＤＮＡ調製に必要なｍＲＮＡが抽出可能なものであれ
ばよく、通常の培養で行われる程度が例示され、好まし
くは１×１０⁴ 個以上、特に好ましくは１×１０⁶ 個以
上であればよい。培養時間は特定するものではないが、
静置培養に比べて明らかに発現状態の変化している条件
が良好であり、さらに細胞の生存状態が良い時間であれ
ば良く、好ましくは、６時間以上４８時間以内があげら
れる。

【００１７】ずり応力負荷された細胞からのｍＲＮＡの
抽出方法は特に限定されないが、ＲＮＡの物理的および
化学的な分解が少ない方法が好ましく、具体的にはグア
ニジンを含む溶液で細胞を破砕溶解後、塩化セシウム密
度勾配による超遠心にて取得した全ＲＮＡを、ｏｌｉｇ
ｏ（ｄＴ）カラムを用いてｐｏｌｙＡ⁺ ＲＮＡとして精
製する方法が例示される。得られたｍＲＮＡを鋳型にｃ
ＤＮＡを合成し、取得することができる。この場合のｃ
ＤＮＡ合成法は特に限定されないが、ｍＲＮＡのｐｏｌ
ｙＡ領域にアニールするプライマーの存在下、逆転写酵
素にてｃＤＮＡｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄを合成する方
法が例示される。このとき使用する逆転写酵素は特に限
定されないが、鋳型であるｍＲＮＡと同じ長さのｃＤＮ
Ａを合成可能な活性を有する酵素であればよく、具体的
にはＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴＩＩ逆転写酵素（ＧＩＢＣ
Ｏ ＢＲＬ社製）が例示される。得られたｃＤＮＡｆｉ
ｒｓｔ ｓｔｒａｎｄはＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡ ｐｏｌ
ｙｍｅｒａｓｅ Ｉにて二本鎖ｃＤＮＡとして取得する
ことも可能である。ｃＤＮＡはそのままの状態で鋳型と
して使用することも可能であるが、ベクターへ挿入して
宿主細胞へ導入せしめｃＤＮＡライブラリーとすること
が好ましい。ｃＤＮＡライブラリーは、ｃＤＮＡを安定
に保持するとともに導入した細胞を培養することで常に
増幅して供給することが可能になる。ｃＤＮＡライブラ
リー作製の方法は特に限定されないが、具体的にはリン
カープライマー法が例示される。この場合のｃＤＮＡ合
成の際に使用するプライマーは、特に限定されないが、
合成したｃＤＮＡを特定の制限酵素で消化することで、
ベクターのクローニング部位と対合末端を生じ、容易に
ベクターへの挿入が可能なものが好ましく、具体的には
遺伝子ライブラリーの作製法（野島博編、羊土社）に記
載されたリンカープライマーが例示される。このリンカ
ープライマーはｃＤＮＡ合成後に制限酵素ＮｏｔＩにて
消化することでｃＤＮＡのｐｏｌｙＡ領域下流の３’末
端にＮｏｔＩ末端を生じ、ベクターのＮｏｔＩ部位へ容
易に挿入が可能である。この場合、ＮｏｔＩは認識配列
中の特定のデオキシシチジン残基がメチル化を受けてい
ると切断しないことから、ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ配列
中にＮｏｔＩ切断部位があってもｃＤＮＡが消化されな
いように、ｃＤＮＡ ｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ合成の
際のデオキシシチジンの供給は５−メチルデオキシシチ
ジン−５’−三リン酸によって行われることが好まし
い。また、ｃＤＮＡの５’末端は３’末端と異なる制限
酵素末端を作製することでベクターへ一方向の挿入を可
能とする。この制限酵素末端作製の方法は限定されない
が、制限酵素アダプターを用いる方法が好ましく、具体
的にはＥｃｏＲＩアダプターが例示される。ｃＤＮＡ合
成後にこのＥｃｏＲＩアダプターを連結することで、ｃ
ＤＮＡの５’末端にＥｃｏＲＩ末端を生じ、ベクターの
ＥｃｏＲＩ部位へ容易に挿入が可能である。つまり、
５’末端にＥｃｏＲＩ末端、３’末端にＮｏｔＩ末端を
有するｃＤＮＡが得られ、ベクターのＥｃｏＲＩとＮｏ
ｔＩ部位に一方向に挿入することが可能となる。ｃＤＮ
Ａを保持するベクターは特に限定されないが、各ｃＤＮ
Ａが安定に保持されるものであればよく、プラスミドベ
クターが例示され、好ましくはプラスミドベクターｐＳ
Ｉ（プロメガ社製）が挙げられる。ｐＳＩを制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩとＮｏｔＩで消化して得たベクターアームとＥ
ｃｏＲＩとＮｏｔＩ末端を有するｃＤＮＡをライゲーシ
ョン後、大腸菌へ導入することで多くの種類のｃＤＮＡ
を保持するｃＤＮＡライブラリーが効率よく得られる。
プラスミドベクターｐＳＩは動物細胞において発現可能
なプロモーターＳＶ４０ ｅａｒｌｙを有する。この下
流にｃＤＮＡを５’側からの一方向に挿入後、動物細胞
へ導入することでｃＤＮＡの発現を可能とし、ｃＤＮＡ
がコードするタンパク質を直接発現取得させることがで
きる。これにより、ｃＤＮＡライブラリーを動物細胞に
導入して作らせたタンパク質の活性を検出することで、
活性物質の探索さらにはその物質をコードする遺伝子を
容易にクローン化することもできる。また、構造上相同
性があるファミリーに属する遺伝子をクローニングする
場合にはそのファミリーに属する既知の遺伝子からプロ
ーブＤＮＡやＰＣＲプライマーを設計してこのｃＤＮＡ
ライブラリーを鋳型にずり応力負荷時に発現量の増加す
る遺伝子を効率的にクローン化することも容易である。

【００１８】また、このｃＤＮＡライブラリーはずり応
力を負荷した血管内皮細胞の特徴を有していることか
ら、生体内血管の低ずり応力部位に起こる疾患、具体的
には動脈硬化等の発症に関わる生理活性因子やその他関
連遺伝子の研究に大きく寄与すると共に、それら因子の
クローニングさらにはそれらをコントロールすることに
よる医薬品開発の可能性も考えられる。また、このｃＤ
ＮＡライブラリーは他の種の細胞、具体的にはずり応力
の負荷していない血管内皮細胞から抽出したｍＲＮＡを
用いて作製したｃＤＮＡライブラリー等とは、その含有
する遺伝子の種類や含有量も異なることが考えられる。
つまり、その差を指標に前述の関連遺伝子あるいはそれ
がコードするタンパク質を単離することも容易である。
また、既知の生理活性因子の遺伝子発現量をこのｃＤＮ
Ａライブラリーを用いて解析することも可能であり、そ
の因子の前述の疾患等への関与を解析することも可能で
ある。

【００１９】ｃＤＮＡライブラリーから、本発明のＤＮ
Ａを調製する方法としては、ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ Ｐ
ＣＲプライマーを用いたファミリー遺伝子クローニング
法〔Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉ
ｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏ
ｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆＡｍｅ
ｒｉｃａ、８６、１６０３−１６０７（１９８９）、Ｓ
ｃｉｅｎｃｅｓ、２４４、５６９−５７２（１９８
９）〕を参考に行うことができるが、具体的には、例え
ば、配列番号４および５に記載されたＤＮＡをプライマ
ーとして、ＰＣＲ法により遺伝子を増幅することができ
る。ＰＣＲ反応にて増幅した断片はベクター上にクロー
ン化することが好ましい。さて、上述の配列番号４およ
び５に記載されたＤＮＡをプライマーとした場合には、
増幅されて調製されるＤＮＡは、本発明の遺伝子の一部
断片であり、該プライマーに挟まれるＤＮＡ断片（即
ち、配列番号２の５１１位〜１０２１位）が得られる。
さらに、遺伝子全長をクローン化するには、例えば、先
にクローン化したＤＮＡ断片の全てあるいは一部断片を
プローブＤＮＡとして用い、ハイブリダイゼイション法
にてｃＤＮＡライブラリーより陽性クローンを取得する
方法が例示される。また、本願により開示された配列番
号２または配列番号３のＤＮＡまたはその適宜の断片を
プローブとして用いてハイブリダイゼイション法にてｃ
ＤＮＡライブラリーより陽性クローンを取得する方法
や、本願により開示された配列番号２または配列番号３
の塩基配列における３’末端側および５’末端側のそれ
ぞれの配列を有するＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ法
による増幅法によって調製してもよい。なお、上述の通
りのｃＤＮＡライブラリーを調製する方法の他、本発明
者らが調製した後述のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ ＪＭ１０９／ｐＧＩＲ１０株（ＦＥＲＭ Ｐ−１５
５４６）を原料とすれば、極めて簡単に本発明のＤＮＡ
が入手可能である。

【００２０】かくして得た配列番号１に記載したアミノ
酸配列をコードする遺伝子をＨＧＩＲと命名した。とこ
ろで、一般に生理活性物質やレセプター等の蛋白は、そ
れぞれの動物の種類により、配列が異なることが普通で
あり、したがって、似たような蛋白をそれぞれの動物が
有するとしても、他の種類の動物に由来する該蛋白を異
なる種類の動物に与えても反応性や効果に差があること
が予想され、ヒトに特異な蛋白を取得することが、ヒト
の医薬分野の将来の展開に極めて好ましいことは論を待
たない。本発明者らは、上記の点を考慮して、ヒトに特
異的な遺伝子を求めて検討も同時に行った。本明細書の
実施例にも詳述しているが、本発明のＨＧＩＲ遺伝子を
取得するに際して、本発明のＨＧＩＲ遺伝子の全長を含
むｃＤＮＡ（即ち、配列番号３の１−１５６２の塩基配
列）を取得しているが、このｃＤＮＡの上流側の約２７
０ｂｐの断片からなるＤＮＡ断片（即ち、ｐＧＩＲ１０
を常法に従って制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＥａｅＩにて
消化して得られる配列番号３の１−２６５の塩基配列を
含むＤＮＡ断片）を作成し、マウス染色体ＤＮＡに対す
るハイブリダイゼイションを行ったが、陽性シグナルを
検出することはできなかった。この結果、このＨＧＩＲ
遺伝子をヒトに特徴的なものであると判断した。ところ
が引き続き行ったこのＨＧＩＲの配列の決定の完了後、
この決定されたアミノ酸配列を基に、既知の蛋白質デー
タベース上でホモロジー検索を行なったところ、マウス
由来のＧ蛋白質共役レセプター遺伝子〔Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、５、１３３１−１
３３８（１９９１）〕がコードするアミノ酸配列と高い
相同性が確認された。しかし、両者は勿論完全に一致し
ているものではなく、上記のマウス染色体ＤＮＡに対す
るハイブリダイゼイションにて、全く検出することがで
きなかったという実験結果も存在し、両者は全く相違す
る遺伝子と判断することが妥当である。本発明のＨＧＩ
Ｒ遺伝子を取得し、その塩基配列を決定してから判るこ
とであるが、上記のハイブリダイゼイションにて、全く
検出することができなかったという実験結果は、実験の
誤りではなく、このマウス由来のＧ蛋白質共役レセプタ
ー遺伝子の塩基配列から考えて、当然の結果であること
が後日認められた。

【００２１】いずれにしても、従来公知のマウス由来の
Ｇ蛋白質共役レセプター遺伝子と相違し、さらにまた、
ヒト由来である本発明のＨＧＩＲ遺伝子は、今までに取
得されていない新規な遺伝子であることが明らかとなっ
た。本発明のＤＮＡは、上記配列番号１に記載したアミ
ノ酸配列をコードする遺伝子またはその断片を含有する
ＤＮＡであって、配列番号１にて表されるアミノ酸配列
をコードする遺伝子の上流または下流に、各種のアミノ
酸残基またはポリペプチド残基をコードするＤＮＡを含
有してもよく、アミノ酸配列として説明すれば、配列番
号１のアミノ酸配列におけるアミノ末端側であるＭｅｔ
の上流にはさらに一個または複数のアミノ酸残基を有し
てもよく、またカルボキシル末端側のＳｅｒの下流に
は、さらに一個または複数個のアミノ酸残基を有しても
よい。Ａｌａはアラニン、Ａｒｇはアルギニン、Ａｓｎ
はアスパラギン、Ａｓｐはアスパラギン酸、Ｃｙｓはシ
ステイン、Ｇｌｎはグルタミン、Ｇｌｕはグルタミン
酸、Ｇｌｙはグリシン、Ｈｉｓはヒスチジン、Ｉｌｅは
イソロイシン、Ｌｅｕはロイシン、Ｌｙｓはリジン、Ｍ
ｅｔはメチオニン、Ｐｈｅはフェニルアラニン、Ｐｒｏ
はプロリン、Ｓｅｒはセリン、Ｔｈｒはスレオニン、Ｔ
ｒｐはトリプトファン、Ｔｙｒはチロシン、Ｖａｌはバ
リンである。

【００２２】配列番号１のアミノ酸配列をコードする遺
伝子としては、配列番号２の塩基配列のＤＮＡが例示さ
れる。さらに、配列番号２の遺伝子を含むｃＤＮＡとし
て配列番号３の塩基配列のＤＮＡが例示される。いずれ
の塩基配列についても、データベース上配列が一致する
遺伝子またはＤＮＡは存在せず、この遺伝子またはそれ
を含むＤＮＡが今までにクローン化されていない新規な
ものであることが明らかとなった。さらに、いずれの遺
伝子またはその断片についても、少なくとも示された配
列あるいは相補的な塩基配列の中でハイブリダイゼイシ
ョンやアニーリング等によって遺伝子ＨＧＩＲを特徴づ
けられる長さの配列であればよく、好ましくは３０塩基
以上、さらに好ましくは４０塩基以上、特に好ましくは
５０塩基以上の連続した断片が例示される。この断片に
おいて、さらに好ましい態様としては、配列番号１の１
−４５のアミノ酸配列における少なくとも１０個（さら
に好ましくは１５個以上、特に好ましくは２０個以上、
又は３０個以上）の連続したアミノ酸配列をコードする
塩基配列からなるＤＮＡ断片か、またはその塩基配列を
含有するＤＮＡ断片が挙げられる。また、上記制限酵素
地図における各制限酵素サイトを両端に有する断片も好
ましい例として挙げられる。

【００２３】また、本発明の遺伝子の翻訳産物である配
列番号１に示したアミノ酸配列を持つタンパク質または
ペプチド断片はその特徴を保持する配列であればよく、
したがって本発明の遺伝子も一個またはそれ以上の塩基
の置換または欠損があってもよい。また本願において
は、上記ＤＮＡに対する相補的ＤＮＡも包含するもので
あって、周知の塩基対の法則（ＡとＴが対になり、Ｃと
Ｇが対になる。）によって得ることができる。配列中、
Ａはデオキシアデニル、Ｃはデオキシシチジル、Ｇはデ
オキシグアニル、Ｔはチミジル残基を示す。

【００２４】さらに本発明は、上述した本発明のいずれ
かのＤＮＡを含有することを特徴とする組換えプラスミ
ドである。本発明の組換えプラスミドを調製するために
用いられるプラスミドとしては、特に限定されないが、
通常用いられるプラスミドを利用することができる。本
発明の組換えプラスミドの具体的な例としてはｐＧＩＲ
１０が挙げられる。また、本発明の組換えプラスミドは
公知の宿主に移入することが好ましい。

【００２５】本発明の遺伝子ＨＧＩＲは、静置培養した
血管内皮細胞に比べてずり応力負荷した血管内皮細胞に
おいての発現が高いことが確認された。即ち、血管内皮
細胞にかかるずり応力の値とほぼ相関することから、血
管内皮細胞におけるＨＧＩＲの発現量を測定すること
で、その内皮細胞にかかるずり応力値を間接的に測定す
ることが可能である。ひいては、本発明の遺伝子を測定
対象とした測定法によれば、生体内血管の低ずり応力部
位に起こる疾患、具体的には動脈硬化等が発症しやすい
領域を検知し、発症を未然に防ぐ予防あるいはその領域
の血管内皮細胞機能をコントロールすることでの治療を
早期に行うことも可能となる。さらに、ＨＧＩＲの発現
状態からこの内皮細胞の機能を推測し、その状態での生
理活性物質の関与あるいは新規な分子を探索することで
疾患発症のメカニズム解明を可能にすることにもつなが
る。

【００２６】発現量の解析法としては特に限定されない
が、血管内皮細胞内のｍＲＮＡレベルを測定する方法と
蛋白質の抗原量を測定する方法が例示される。ｍＲＮＡ
レベルを調べる場合には配列番号３に示したＨＧＩＲの
ｃＤＮＡ配列からプローブＤＮＡやＰＣＲプライマー等
を容易に作製し使用することができ、ノーザンハイブリ
ダイゼイション、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼイショ
ンやＲＴ−ＰＣＲ法などの解析法が用いられる。

【００２７】また、配列番号１に示したアミノ酸配列を
もとにペプチドを合成、または発現させて蛋白質あるい
は一部ペプチド断片を取得し、その蛋白質あるいはペプ
チドを認識する抗体を作製することができる。その抗体
は、この蛋白質を免疫学的な手法で検出することを可能
とし、具体的には、細胞膜表面上の蛋白質を免疫染色に
て調べることやフローサイトメトリー法にて定量的に解
析することもできる。

【００２８】配列番号１からなる蛋白質を取得する方法
は特に限定されないが、これらをコードする遺伝子、つ
まり配列番号２の塩基配列を含むＤＮＡを宿主細胞内で
働くプロモーターの下流につないで得た組換えプラスミ
ドを用いて、宿主細胞へ導入後発現させることが好まし
い。宿主細胞としては特に限定されないが、動物細胞で
あることが好ましく、プロモーターとしては宿主細胞内
で効率的に働くものであれば良く、ＳＶ４０由来のプロ
モーターが例示される。このようなプロモーターの下流
にＨＧＩＲをつないだ組換えプラスミドとしては特に限
定されないが、ｐＧＩＲ１０あるいはｐＧＩＲ２０より
制限酵素ＥｃｏＲＩにて切り出されるＨＧＩＲを含む約
１．５ｋｂｐのＤＮＡ断片を上述のプロモーターを有す
るベクターに挿入することで容易に構築することができ
る。図２には、ｐＧＩＲ１０並びにｐＧＩＲ２０の制限
酵素切断部位並びに機能地図を示す。ｐＧＩＲ１０およ
びｐＧＩＲ２０はクローニングベクターｐＵＣ１１８の
ＥｃｏＲＩ ｓｉｔｅに本発明の遺伝子ＨＧＩＲを含む
約１．５ｋｂｐのＤＮＡ断片を挿入した組換えプラスミ
ドであり、それぞれＤＮＡ断片が逆方向に挿入されてい
る。すなわち、図２のＨＧＩＲを含むＤＮＡに示す矢印
は、それぞれＨＧＩＲの蛋白質をコードする領域約１．
２ｋｂｐを蛋白質のＮ末端側からＣ末端側の方向で記載
したものである。また、このＨＧＩＲを含むＤＮＡ断片
は図２に示す制限酵素切断部位を有することを特徴とす
る。組換えプラスミドｐＧＩＲ１０を導入して得た形質
転換体はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（エシェリ
ヒア・コリ）ＪＭ１０９／ｐＧＩＲ１０株（ＦＥＲＭ
Ｐ−１５５４６）として工業技術院生命工学工業技術研
究所に寄託されている。プロモーターの下流にＨＧＩＲ
を挿入した組換えプラスミドを宿主細胞へ導入しＨＧＩ
Ｒを発現させることで、コードする蛋白質を容易に取得
することができる。取得した蛋白質は硫酸アンモニウム
分画やカラムクロマトグラフィーなどの方法にて単離精
製することができ、精製した蛋白質を認識する抗体ある
いは抗体を含む抗血清を取得することも可能である。ま
た、この蛋白質はレセプターとして宿主細胞の細胞膜上
に存在していると考えられることから、ＨＧＩＲ遺伝子
を導入して発現するように構築した細胞を用いて、生理
的なリガンドを含むレセプターに作用する物質の探索あ
るいはこのレセプターの機能を解析することも可能であ
る。すなわち、このＨＧＩＲ発現細胞にこのレセプター
に対する生理的リガンドが含まれる組織抽出液や細胞の
培養上清等を添加し、細胞への接着を指標としてリガン
ドを探索することができる。また、生理的リガンドの他
に合成化合物や微生物の培養上清等を用いることで、こ
のレセプターに作用する物質を探索することも可能であ
る。さらに、ＨＧＩＲを発現する細胞にこのレセプター
に対するリガンドが作用すると細胞内へシグナルが伝わ
る。そのシグナルは細胞内でのシグナル伝達物質の濃度
変化等を通して細胞全体へと伝わると予想されるが、そ
のシグナル伝達物質の変化を捉えることでレセプターへ
の作用の有無および強弱が測定できる。具体的にはレセ
プターを介して細胞内カルシウムイオンやｃＡＭＰ、さ
らにはＩＰ₃ 等の濃度変化が例示され、それらを指標に
した測定系を構築することも可能である。さらに、この
測定法を利用してこのレセプターに対するアゴニストや
アンタゴニストを探索することも可能であり、このレセ
プターの生理的機能をコントロールすることによる医薬
品への応用を可能にする。

【００２９】

【実施例】本発明をより詳細に記述するために、実施例
により説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例のみ
に限定されるものではない。

【００３０】

【実施例１】ヒトさい帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の
ずり応力負荷とｍＲＮＡ（ｐｏｌｙＡ⁺ ＲＮＡ）の調製 （１）ＨＵＶＥＣの培養 ＨＵＶＥＣ（Ｅｎｄｏｃｅｌｌ−ＵＶ、クラボウ社製）
は３次継代細胞を用いた。細胞培養装置は図１に示した
特願平６−７０３１３号公報に記載の平行平板型ずり応
力負荷培養装置の大型のものを使用した。１５０ｍｍφ
のプラスチック製ディッシュ（ｎｕｎｃ社製）にガラス
製カバースリップ（９４×５２×１．０ｍｍ、ＰＹＲＥ
Ｘ製）を静置し、１％のゼラチン（ウシスキン由来、シ
グマ社製）を含む生理食塩水５ｍｌを注ぎ、４℃にて一
晩放置し、ゼラチンコート処理カバースリップとした。
新しい１５０ｍｍφディッシュに培養液（Ｅ−ＧＭ Ｕ
Ｖ、クラボウ社製）で洗浄したゼラチンコート処理カバ
ースリップを静置し、１．０×１０⁴ 個／ｃｍ² となる
ようにＨＵＶＥＣを植え付けた。平行平板型ずり応力負
荷培養装置にセットし、５％の二酸化炭素ガスを満たし
た３７℃のふ卵器内で１５ｄｙｎｅｓ／ｃｍ² のずり応
力を負荷するように８時間灌流培養を行なった。 （２）細胞からのｍＲＮＡの抽出 ずり応力負荷培養したＨＵＶＥＣ、あるいはカバースリ
ップに植え付けただけの静置培養ＨＵＶＥＣは、カバー
スリップごと装置より取りだし、予め３７℃に保温して
おいた燐酸緩衝生理食塩水〔ＰＢＳ（１３７ｍＭ塩化ナ
トリウム、２．７ｍＭ塩化カリウム、４．３ｍＭリン酸
水素二ナトリウムおよび１．４ｍＭリン酸二水素カリウ
ム）〕にて洗浄後、０．７ｍｌのグアニジン溶液〔４Ｍ
グアニジンチオシアン酸塩（Ｆｌｕｋａ社製）、２０ｍ
Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）、０．１ｍＭジチオス
レイトール（ＤＴＴ、シグマ社製）および０．５％Ｎ−
ラウロイルサルコシンナトリウム（シグマ社製）〕を用
いて付着細胞を剥がした。２１Ｇの注射針を装着した１
ｍｌの注射筒を用いて細胞を含む溶液を１０回ほど出し
入れし、細胞を完全に破砕した。この溶液を１．５ｍｌ
容のマイクロチューブに移し、−８０℃にて凍結保存し
た。

【００３１】高圧蒸気滅菌済みのポリアロマー製超遠心
チューブ（Ｎｏ．３３１３７２、ベックマン社製）に
３．５ｍｌの塩化セシウム溶液〔０．１Ｍエチレンジア
ミン四酢酸（ＥＤＴＡ）溶液（ｐＨ８．０）に塩化セシ
ウム（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）を５．７Ｍの濃度にな
るように溶解し、０．２％のピロ炭酸ジエチル（ＤＥＰ
Ｃ、和光純薬工業社製）を加えて激しく撹拌後一晩放置
し、１２０℃で２０分間高圧滅菌したもの。〕を入れ、
その上に溶解した１．２×１０⁷ 個分の細胞破砕溶液に
グアニジン溶液を加えて８．２ｍｌに合わせたものを静
かに重層した。ベックマン社製超遠心ローター（ＳＷ４
１Ｔｉ）を用いて１８℃、１５０，０００ｘｇにて２０
時間遠心分離した。

【００３２】滅菌パスツールピペットを用いて上清を底
から約０．５ｃｍのところまで静かに除去し、滅菌済み
のメスを用いて遠心チューブの下から約１ｃｍのところ
を切断した。遠心チューブの底に沈殿となったＲＮＡ画
分が流れ出ないように注意しながら、滅菌ペーパーの上
に転倒静置し、上清を完全に除去した。室温にて５分間
静置後、沈殿を３６０μｌのＴＥ−ＳＤＳ溶液（５ＰＲ
ＩＭＥ−３ＰＲＩＭＥ社製）に溶解し、１．５ｍｌ容の
マイクロチューブに移し入れた。ＲＮＡ溶液に等量のク
ロロホルム／１−ブタノール混液（４：１）を加えて激
しく撹拌後、室温、１５，０００ｒｐｍにて５分間の遠
心分離を行ない、水層を別の１．５ｍｌ容マイクロチュ
ーブに移した。１／１０量の３Ｍ酢酸ナトリウム及び
２．５倍量のエタノールを加えて撹拌し、−８０℃に３
０分間静置後、４℃、１５，０００ｒｐｍにて２０分間
の遠心を行ない、沈殿を回収した（以後この操作をエタ
ノール沈殿と言う。）。沈殿を３６０μｌの滅菌精製水
に溶解し、再度エタノール沈殿でＲＮＡを回収した後、
沈殿を１００μｌの滅菌精製水に溶解し、全ＲＮＡ溶液
とした。

【００３３】全ＲＮＡからのｍＲＮＡ（ｐｏｌｙＡ⁺ Ｒ
ＮＡ）の分離精製は、ｍＲＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉ
ｏｎ ｋｉｔ（ファルマシア社製）を使用し、添付のマ
ニュアルに従って操作した。

【００３４】

【実施例２】ｃＤＮＡライブラリーの作製 ｃＤＮＡライブラリーの作製は、遺伝子ライブラリーの
作製法（野島博編、羊土社）に示されるリンカープライ
マー法に準じて行なった。 （１）発現ベクターアームの調製 １００μｇのｐＳＩベクター（プロメガ社製）を５０Ｕ
の制限酵素ＮｏｔＩ（宝酒造社製）を含む２００μｌの
ＮｏｔＩ ｂｕｆｆｅｒ〔１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、７ｍＭ塩
化マグネシウム、１ｍＭのＤＴＴ、０．０１％のＢＳＡ
および０．０１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００〕に溶解
し、３７℃で１２０分間保温後、さらに２０ＵのＮｏｔ
Ｉを加えて３７℃で６０分間保温して完全消化した。等
量のフェノール／クロロホルム混液〔５００ｍｌのクロ
ロホルムと５００ｇのフェノール（和光純薬工業社製）
および１ｇの８−ヒドロキシキノリン（ナカライテスク
社製）をよく混合した後２００ｍｌの精製水を加えて振
って得た下層を用いた。〕を加えよく攪拌した後、室
温、１２，０００ｒｐｍにて５分間の遠心分離を行な
い、上清を別の１．５ｍｌ容マイクロチューブに移した
（以後この操作をフェノール／クロロホルム抽出と言
う。）。等量のクロロホルムを加えよく攪拌した後、室
温、１２，０００ｒｐｍにて５分間の遠心分離を行な
い、上清を別の１．５ｍｌ容マイクロチューブに移した
（以後この操作をクロロホルム抽出と言う。）。エタノ
ール沈殿でＤＮＡを回収、７５％エタノールで沈殿を洗
浄した。得られた沈殿を１ＵのＢａｃｔｅｒｉａｌ ａ
ｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｅ．ｃｏｌ
ｉ Ｃ７５、宝酒造社製）を含む２００μｌのＢａｃｔ
ｅｒｉａｌ ａｌｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ
ｂｕｆｆｅｒ〔５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
８．０）および１ｍＭ塩化マグネシウム〕に溶解し、３
７℃で３０分間保温した。２度のフェノール／クロロホ
ルム抽出、クロロホルム抽出後、エタノール沈殿でＤＮ
Ａを回収後、７５％エタノールで沈殿を洗浄した。得ら
れた沈殿を１００Ｕの制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社
製）を含む２００μｌのＨ ｂｕｆｆｅｒ〔５０ｍＭト
リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ塩化マグネ
シウム、１ｍＭのＤＴＴおよび１００ｍＭ塩化ナトリウ
ム〕に溶解し、３７℃で１２０分間保温した。フェノー
ル／クロロホルム抽出、クロロホルム抽出後、エタノー
ル沈殿にてＤＮＡを回収してベクターアームとした。 （２）ｃＤＮＡ断片の調製 実施例１にてずり応力負荷培養ＨＵＶＥＣより抽出した
ｍＲＮＡ２μｇ（０．５μｇ／μｌを４μｌ）に、３．
５μｌの５ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を加
え、６５℃に５分間保温した後、氷上に置いた。このｍ
ＲＮＡ溶液を２００ＵのＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ ＩＩ
逆転写酵素（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）、遺伝子ライブ
ラリーの作製法に記載された１．６μｇのリンカープラ
イマー（日本バイオサービス社製）、１０ｍＭのＤＴ
Ｔ、各０．６ｍＭの２’−デオキシアデノシン−５’−
三リン酸（ｄＡＴＰ）、２’−デオキシグアノシン−
５’−三リン酸（ｄＧＴＰ）およびチミジン−５’−三
リン酸（ｄＴＴＰ）（共にファルマシア社製）、０．３
ｍＭの５−メチルデオキシシチジン−５’−三リン酸
（ファルマシア社製）および２０ＵのＲＮａｓｅ ｉｎ
ｈｉｂｉｔｏｒ（東洋紡績社製）を含む２５μｌのｃＤ
ＮＡ ｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｂｕｆｆｅｒ〔５０
ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）、７５ｍＭ塩化
カリウムおよび３ｍＭ塩化マグネシウム〕中で３７℃で
６０分間保温し、さらに２００ＵのＳＵＰＥＲＳＣＲＩ
ＰＴ ＩＩ逆転写酵素を加えて４５℃で３０分間保温し
てｃＤＮＡｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄを合成した。

【００３５】合成したｃＤＮＡ ｆｉｒｓｔ ｓｔｒａ
ｎｄを２ＵのＲＮａｓｅ Ｈ（ファルマシア社製）、５
０ＵのＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
Ｉ（ファルマシア社製）、各２２５μＭのｄＡＴＰ、ｄ
ＧＴＰおよびｄＴＴＰ、３７５μＭの２’−デオキシシ
チジン−５’−三リン酸（ｄＣＴＰ、ファルマシア社
製）、５ｍＭのＤＴＴを含むｃＤＮＡ ｓｅｃｏｎｄ
ｓｔｒａｎｄ ｂｕｆｆｅｒ〔２５ｍＭトリス−塩酸緩
衝液（ｐＨ８．３）、１００ｍＭ塩化カリウムおよび５
ｍＭ塩化マグネシウム〕中で、１６℃で１５０分間保温
してｃＤＮＡ ｓｅｃｏｎｄ ｓｔｒａｎｄを合成し
た。フェノール／クロロホルム抽出、クロロホルム抽出
後の上清２００μｌをミリポアフィルター（ＵＦＣＰ３
ＴＫ５０、ミリポア社製）に移し、室温、７，５００ｒ
ｐｍにて１０分間、溶液がほとんどなくなるまで遠心を
行なった。フィルターカップに１００μｌのＴＥ溶液
〔１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）および１
ｍＭのＥＤＴＡ〕を加えて、室温、７，５００ｒｐｍに
て１０分間、溶液がほとんどなくなるまで遠心を行なっ
た。再度フィルターカップに１００μｌのＴＥ溶液を加
えて、室温、７，５００ｒｐｍにて１０分間、溶液がほ
とんどなくなるまで遠心を行なった後、３０μｌの１／
１０濃度のＴＥ溶液を加え、ピペッティングによりフィ
ルターを洗浄した後、フィルターカップを逆さにして
１．５ｍｌ容マイクロチューブにはめ込み、室温、５，
０００ｒｐｍにて１０秒間の遠心操作により二本鎖ｃＤ
ＮＡ溶液を回収した（以後この操作をミリポアフィルタ
ーによる精製と言う。）。

【００３６】得られた二本鎖ｃＤＮＡ溶液を５ＵのＴ４
ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）、各１
２５μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴ
Ｐを含む１００μｌのＴ４ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａ
ｓｅ ｂｕｆｆｅｒ〔５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ８．３）、５０ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ塩化マ
グネシウムおよび１０ｍＭのＤＴＴ〕中で３７℃で３０
分間保温した。フェノール／クロロホルム抽出、クロロ
ホルム抽出の後、上清１００μｌをミリポアフィルター
による精製を行ない、最終的に２０μｌのＴＥ溶液に平
滑末端ｃＤＮＡ溶液を回収した。

【００３７】得られた４μｌの平滑末端ｃＤＮＡ溶液を
４ＵのＴ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ（ＧＩＢＣＯ ＢＲ
Ｌ社製）、０．３５μｇのＥｃｏＲＩアダプター〔２５
μｇのＥｃｏＲＩ−ＳｍａＩ ａｄａｐｔｏｒ（Ｎｏ．
４５０２、宝酒造社製）と１４．２μｇのｐＳｍａＩ
ｌｉｎｋｅｒ（Ｎｏ．４５８５Ｐ、宝酒造社製）を１：
１のモル比で１１２μｌの１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＥＤＴＡおよび１０ｍＭ塩化
マグネシウムに懸濁し、６５℃で２分間、３７℃で１０
分間、室温で 5分間反応させることによってアニーリン
グさせた後、−２０℃で保存したもの。〕を含む２０μ
ｌのＴ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ ｂｕｆｆｅｒ〔５０
ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ塩化
マグネシウム、１ｍＭアデノシン−５’−三リン酸、１
ｍＭのＤＴＴおよび５％ポリエチレングリコール−８０
００〕中で８℃に一晩保温し、アダプターを連結させ
た。７０℃で３０分間保温してＴ４ ＤＮＡ ｌｉｇａ
ｓｅを失活させ、氷上に置いた後、引き続き２４ＵのＮ
ｏｔＩおよび２７μｌのＮｏｔＩ補充液（２７８ｍＭ塩
化ナトリウム、８ｍＭ塩化マグネシウム、１．８ｍＭの
ＤＴＴ、０．０１８％牛血清アルブミンおよび０．０１
８％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）を加えて全量５０μ
ｌとし、３７℃で９０分間保温した。５μｌの１０倍濃
度ＳＴＥ溶液〔１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
８．０）、１Ｍ塩化ナトリウムおよび１０ｍＭのＥＤＴ
Ａ〕および１０μｇのｔＲＮＡを加えた後、Ｃｈｒｏｍ
ａ Ｓｐｉｎ−４００スピンカラム（ＣＬＯＮＴＥＣＨ
社製）を用いて分画し、小断片を除去した。エタノール
沈殿後、７５％エタノールで沈殿を洗浄回収してｃＤＮ
Ａ断片とした。 （３）ベクターとｃＤＮＡ断片の連結および大腸菌の形
質転換 ＮｏｔＩ消化したｃＤＮＡ断片の沈殿を３１３．６μｇ
のベクターアームおよび４ＵのＴ４ ＤＮＡ ｌｉｇａ
ｓｅを含む３０μｌのＴ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ ｂ
ｕｆｆｅｒに溶解し、１２℃で一晩保温した。７０℃で
３０分間保温してＴ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅを失活さ
せ、ＴＥ溶液を加えて１００μｌとした後、フェノール
／クロロホルム抽出、クロロホルム抽出後の上清をミリ
ポアフィルターによる精製を行ない、最終的に３０μｌ
のＴＥ溶液にＤＮＡを回収し、ライゲーション混液とし
た。

【００３８】大腸菌の形質転換はＧＥＮＥ ＰＵＬＳＥ
Ｒ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いたエレクトロポレーシ
ョン法にて行なった。また遺伝子ライブラリー作製法に
記載された方法に従い、宿主大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ１１Ｓ株（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社
製）をコンピテントセルとなして使用した。氷中で溶解
した５０μｌのコンピテントセルに３μｌのライゲーシ
ョン混液を加えて泡立たないように混ぜ合わせた。予め
氷中で冷却しておいたキュベット（電極間距離：０．１
ｃｍ、ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）内に菌液を移し、チャンバ
ースライドにセット後、ＣＡＰＡＣＩＴＡＮＣＥ：２５
μＦ、抵抗：２００Ω、電圧：２．０ｋＶの条件下で電
圧パルスを加えた。すぐに予め３７℃に保温しておいた
０．８ｍｌのＳＯＣ培地〔２％のＢａｃｔｏ Ｔｒｙｐ
ｔｏｎｅ（ディフコ社製）、０．５％のＢａｃｔｏ Ｙ
ｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ（ディフコ社製）、１０ｍＭ
塩化ナトリウム、２．５ｍＭ塩化カリウム、１０ｍＭ硫
酸マグネシウム、１０ｍＭ塩化マグネシウムおよび２０
ｍＭグルコース〕を加えてピペッティングし、１５ｍｌ
の遠沈管に移した。キュベット内を０．２ｍｌのＳＯＣ
培地にてすすいで上記菌液に合わせ、３７℃にて１時間
振盪培養した。菌液を５００ｍｌのＬＢ／Ａｍｐ培地
〔ＬＢ培地（１％のＢａｃｔｏ Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、
０．５％のＢａｃｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔお
よび１％塩化ナトリウム）に５０μｇ／ｍｌとなるよう
にアンピシリンを添加したもの〕に移し、さらに３７℃
で１６時間振盪培養した。菌液５０ｍｌあたり３．５ｍ
ｌのジメチルスルフォキシド（和光純薬工業社製）を加
えて−８０℃にて保存、ｃＤＮＡライブラリー菌液とし
た。

【００３９】

【実施例３】新規遺伝子ＨＧＩＲｃＤＮＡの一部断片の
クローニング （１）ｃＤＮＡライブラリーテンプレートの調製 ｃＤＮＡライブラリーテンプレート用プラスミドＤＮＡ
の調製はＱＩＡＧＥＮＰｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ Ｋｉ
ｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて行なった。ｃＤＮＡラ
イブラリー菌液１５０ｍｌを出発材料とし、添付マニュ
アルに従ってプラスミドＤＮＡを抽出精製し、最終的に
１ｍｌのＴＥ溶液に溶解した。 （２）Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ＰＣＲプライマーを用い
たＤＮＡの増幅と増幅産物のクローン化 ０．５ｍｌ容のマイクロチューブ内に調製した２．５Ｕ
のＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社
製）、各０．２ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰお
よびｄＴＴＰ、および下記に示す配列からなる各１μｇ
の一組のプライマー（配列番号：４に示されるセンスプ
ライマー混合物及び配列番号：５に示されるアンチセン
スプライマー混合物、日本バイオサービス社製）を含む
１００μｌのＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
ｂｕｆｆｅｒ〔１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．
３）、５０ｍＭ塩化カリウムおよび１．５ｍＭ塩化マグ
ネシウム〕に（１）において調製した２μｇのｃＤＮＡ
ライブラリーテンプレート用プラスミドＤＮＡを加え、
１００μｌのミネラルオイル（シグマ社製）を重層し、
ＰＣＲ装置（ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ、
宝酒造社製）を用いて、９５℃で２分間保温した後に、
９５℃、１分、４２℃、２分および７２℃、３分を１サ
イクルとする増幅反応（以下ＰＣＲ増幅反応とする）を
４０サイクル行なった後、７２℃で７分間、４℃で５分
間保温した。

【００４０】Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、 Ｓｅｃｏ
ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）に記載の方法にて、
アガロースゲル電気泳動を行なった。１０μｌの増幅反
応液をアガロースゲル電気泳動に供し、臭化エチジウム
染色後のＵＶ照射にて検出される約５００〜８００ｂｐ
のＤＮＡ断片を含むアガロースゲルを切り出した。アガ
ロースゲルからのＤＮＡ断片の精製はＤＮＡ回収用ガラ
スパウダーＥＡＳＹＴＲＡＰ（宝酒造社製）を用いて行
なった。回収後のＤＮＡ溶液をフェノール／クロロホル
ム抽出後、エタノール沈殿にてＤＮＡ断片を回収した。

【００４１】回収したＤＮＡ断片５０ｎｇを同じプライ
マーおよび同じ条件でＰＣＲ増幅反応を行なった後、フ
ェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿にてＤＮ
Ａを回収し、７５％エタノールで沈殿を洗浄した。この
沈殿を各５０Ｕの制限酵素ＳａｌＩ（宝酒造社製）およ
びＥｃｏＲＩを含む２００μｌのＨ ｂｕｆｆｅｒに溶
解し、３７℃で２時間保温後、フェノール／クロロホル
ム抽出、エタノール沈殿し、７５％エタノールで沈殿を
洗浄した。沈殿を５０μｌのＴＥ溶液に溶解後、５μｌ
の１０倍濃度ＳＴＥおよび１０μｇのｔＲＮＡを加えた
後、Ｃｈｒｏｍａ Ｓｐｉｎ−１００スピンカラム（Ｃ
ＬＯＮＴＥＣＨ社製）を用いて分画し、小断片を除去し
た。フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿
後、７５％エタノールで沈殿を洗浄回収し、増幅ＤＮＡ
断片とした。

【００４２】１０μｇのプラスミドベクターｐｃＤＮＡ
ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を各１０Ｕの制限酵
素ＸｈｏＩ（宝酒造社製）およびＥｃｏＲＩを含む１０
０μｌのＨ ｂｕｆｆｅｒに溶解し、３７℃にて２時間
保温して完全消化した。アガロースゲル電気泳動を行な
い、臭化エチジウム染色後のＵＶ照射にて検出される約
３．０ｋｂｐのＤＮＡ断片を含むアガロースゲルを切り
出した。アガロースゲルからのＤＮＡ断片の精製はＤＮ
Ａ回収用ガラスパウダーＥＡＳＹＴＲＡＰを用いて行な
い、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿に
より回収したＤＮＡ断片をｐｃＤＮＡＩＩ ＸｈｏＩ−
ＥｃｏＲＩアームとした。

【００４３】０．５ｍｌ容のマイクロチューブに０．５
μｇのｐｃＤＮＡＩＩ ＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩアームお
よび０．４μｇの増幅ｃＤＮＡ断片を移し、滅菌精製水
で１０μｌに合わせた。これにＤＮＡ ｌｉｇａｔｉｏ
ｎ ｋｉｔ ｖｅｒ．２（宝酒造社製）のＩ液を１０μ
ｌ加え、よく混合してから１６℃にて１時間反応を行な
った。７０℃にて３０分間保温して反応を止め、フェノ
ール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿にてＤＮＡを
回収した。大腸菌の形質転換は、実施例２に示したエレ
クトロポレーション法にて行ない、形質転換後の菌液を
５０μｇ／ｍｌのアンピシリン、０．０２％のＸ−Ｇａ
ｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガ
ラクトシド、和光純薬工業社製）および５０ｍＭのＩＰ
ＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオ−ガラクトピラノシ
ド、和光純薬工業社製）を含むＬＢ寒天培地〔ＬＢ培地
に１．５％のＢａｃｔｏ Ａｇａｒ（ディフコ社製）を
加えて高圧蒸気滅菌後にシャーレにまき拡げて固化した
もの〕に塗り拡げて３７℃にて１６時間静置してコロニ
ーを形成させた。

【００４４】出現した単一の白色コロニーを２ｍｌのＬ
Ｂ／Ａｍｐで一晩振盪培養し、１２，０００ｒｐｍ・３
分間の遠心分離により菌体を回収した。菌体を１ｍｇ／
ｍｌのリゾチーム（生化学工業社製）を含む２５ｍＭト
リス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１０ｍＭのＥＤＴＡ
および５０ｍＭグルコースからなるリゾチーム溶液３０
０μｌに懸濁して、３７℃にて５分間保温した後、２％
のＳＤＳを含む０．３Ｎ水酸化ナトリウム溶液１８０μ
ｌを加えて激しく撹拌して大腸菌を溶菌させた。６５℃
で２０分間保温後、室温に放置して冷却した溶菌液に１
２０μｌのフェノール／クロロホルム混液を加えて激し
く撹拌して抽出した。遠心分離後の水層に１／１０量の
３Ｍ酢酸ナトリウム、等量のイソプロパノールを加えて
室温に５分間静置し、１５，０００ｒｐｍにて５分間の
遠心分離で沈殿を回収した。沈殿を１０μｇ／ｍｌのＲ
ＮａｓｅＡ（シグマ社製）を含むＴＥ溶液５０μｌに溶
解し、３７℃で３時間保温して混入ＲＮＡを除去した。
３０μｌの２．５Ｍ塩化ナトリウムを含む２０％ポリエ
チレングリコール−６０００溶液を加えて１５分間氷中
にて冷却後、４℃、１５，０００ｒｐｍにて２０分間の
遠心を行なって沈殿を回収し、７５％エタノールで沈殿
を洗浄してシークエンス用鋳型ＤＮＡとした。 （３）クローンの塩基配列の決定 挿入ｃＤＮＡ断片の塩基配列の決定はＡｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製の蛍光シークエンサーを用い
て実施した。シークエンスサンプルの調製はＰＲＩＳ
Ｍ、Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍ
ｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋ
ｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を
用いて行なった。０．５ｍｌ容のマイクロチューブに
９．５μｌの反応ストック液、４．０μｌの０．８ｐｍ
ｏｌ／μｌのＴ７プロモータープライマー（ＧＩＢＣＯ
ＢＲＬ社製）および６．５μｌの０．１６μｇ／μｌ
シークエンス用鋳型ＤＮＡを加えて混合し、５０μｌの
ミネラルオイルを重層後、９６℃、３０秒、５５℃、１
５秒および６０℃、４分を１サイクルとするＰＣＲ増幅
反応を２５サイクル行ない、４℃で５分間保温した。反
応後、８０μｌの滅菌精製水を加えて撹拌し、遠心分離
後の水層を３回のフェノール／クロロホルム抽出を行な
った。１００μｌの水層に１０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウ
ム（ｐＨ５．２）および３００μｌエタノールを加えて
撹拌後、室温、１４，０００ｒｐｍにて１５分間の遠心
を行ない沈殿を回収した。沈殿を７５％エタノールで洗
浄後、真空下に２分間静置して乾燥させ、シークエンス
用サンプルとした。シークエンスサンプルは、４μｌの
１０ｍＭのＥＤＴＡを含むホルムアミドに溶解して９０
℃・２分間で変性後、氷中で冷却してシークエンスに供
した。

【００４５】その結果、配列番号３の配列の遺伝子ＨＧ
ＩＲｃＤＮＡ断片の一部からなる塩基配列を確認した。

【００４６】

【実施例４】遺伝子ＨＧＩＲ全長ｃＤＮＡのクローニン
グ （１）ＨＧＩＲプローブＤＮＡの調製 実施例３にて得られたＨＧＩＲｃＤＮＡの一部断片を含
むプラスミドＤＮＡを保持する大腸菌コロニーを１５０
ｍｌのＬＢ／Ａｍｐに移植し、３７℃にて一晩振盪培養
した。プラスミドＤＮＡの調製はＱＩＡＧＥＮ Ｐｌａ
ｓｍｉｄ Ｍａｘｉ Ｋｉｔを用いて行なった。

【００４７】調製した１０μｇのプラスミドＤＮＡを各
１０Ｕの制限酵素ＳｐｈＩ（宝酒造社製）およびＥｃｏ
ＲＩを含む１００μｌのＨ ｂｕｆｆｅｒに溶解し、３
７℃にて２時間保温して完全消化した。アガロースゲル
電気泳動を行ない、臭化エチジウム染色後のＵＶ照射に
て検出される約５００ｂｐのＤＮＡ断片を含むアガロー
スゲルを切り出した。アガロースゲルからのＤＮＡ断片
の精製はＤＮＡ回収用ガラスパウダーＥＡＳＹＴＲＡＰ
を用いて行ない、フェノール／クロロホルム抽出、エタ
ノール沈殿により回収したＤＮＡ断片をＨＧＩＲプロー
ブＤＮＡとした。

【００４８】プローブＤＮＡの標識は〔α−³²Ｐ〕ｄＣ
ＴＰ（１１１ＴＢｑ／ｍｍｏｌ、ＮＥＮ社製）を用いて
Ｒａｎｄｏｍ Ｐｒｉｍｅｒ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎ
ｇＫｉｔ（宝酒造社製）にて行なった。 （２）プラークハイブリダイゼイションによる陽性クロ
ーンの取得 ｃＤＮＡライブラリーは、Ｈｕｍａｎ Ｂｒａｉｎ
５’−ＳｔｒｅｔｃｈＰｌｕｓ ｃＤＮＡ Ｌｉｂｒａ
ｒｙ（ＨＬ３００２ａ，ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を使用
した。宿主大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
Ｃ６００Ｈｆｌ株を１０ｍＭ硫酸マグネシウムおよび
０．２％マルトースを含むＬＢ培地で１６時間振盪培養
し、宿主菌液とした。ｃＤＮＡライブラリーを宿主菌液
に加えて感染後、１０ｍＭ硫酸マグネシウムを含むＬＢ
寒天培地上にまき拡げ、３７℃で８時間静置して約１２
０万個の単一プラークを形成させた。プラークを形成し
た寒天上にＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋メンブラン（アマシャム
社製）を静かに置き、約１分間静置した。メンブランを
静かに剥がし、プラークと接触した面を上にして変性溶
液（１．５Ｍ塩化ナトリウムおよび０．５Ｍ水酸化ナト
リウム）に浸した濾紙上に７分間静置した。同様にメン
ブランを中和溶液〔１．５Ｍ塩化ナトリウムおよび０．
５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）〕を含む濾紙上
に移した。３分間放置後、新たに中和溶液でしめらせた
新しい濾紙を用いてこの操作を繰り返した後、メンブラ
ンを２倍濃度ＳＳＣ（０．３Ｍ塩化ナトリウムおよび
０．０３Ｍクエン酸三ナトリウム）で洗浄し、菌体の残
査を取り除いた。プラーク側を上にして乾いた濾紙上に
置いて風乾したメンブランをサランラップで包み、プラ
ーク側を下にしてＵＶトランスイルミネーター上に置き
５分間２５４ｎｍのＵＶを照射した。プレートは４℃に
保存した。

【００４９】５倍濃度ＳＳＰＥ〔０．９Ｍ塩化ナトリウ
ム、５０ｍＭリン酸ナトリウムおよび５ｍＭのＥＤＴＡ
（ｐＨ７．７）〕、５倍濃度Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ液
（各０．１％のＢＳＡ、フィコールおよびポリビニルピ
ロリドン）および０．５％のＳＤＳからなる液に終濃度
１００μｇ／ｍｌとなるように変性サケ精子ＤＮＡ〔サ
ケ精子ＤＮＡ（シグマ社製）を滅菌精製水に溶解し、１
７Ｇ注射針を取り付けたシリンジを用いて溶液を出し入
れし、ＤＮＡを細かく裁断した。フェノール／クロロホ
ルム抽出、エタノール沈殿後、滅菌精製水に１０ｍｇ／
ｍｌとなるように溶解し、必要量を１００℃・５分間の
保温後に氷中で急冷して使用した。〕を加えてプレ−ハ
イブリダイゼイション液とした。先に調製した約１２０
万個のプラークのＤＮＡを固定したメンブランをハイブ
リダイゼイションバッグに入れ、メンブラン１ｃｍ² あ
たり０．１ｍｌのプレ−ハイブリダイゼイション液を入
れてシールし、６５℃の水浴中で３時間振盪保温した。
このバッグに１００℃・５分間の保温後に氷中で急冷し
た標識ＨＧＩＲプローブＤＮＡを終濃度１ｘ１０⁶ ｃｐ
ｍ／ｍｌとなるように加えてシールし、さらに６５℃の
水浴中で２４時間振盪保温した。メンブランを取り出
し、室温で洗浄液１（２倍濃度ＳＳＰＥおよび０．１％
のＳＤＳ）にて１０分間洗浄した。引き続き、６５℃で
洗浄液２（１倍濃度ＳＳＰＥおよび０．１％のＳＤＳ）
を用いて１５分間洗浄後、さらに６５℃で洗浄液３（１
／１０倍濃度ＳＳＰＥおよび０．１％のＳＤＳ）を用い
て１５分間洗浄した。メンブランは一枚ずつサランラッ
プに包んでカセットに固定し、増感紙１枚を用いて−８
０℃でＸ線フィルムに焼き付けた。６時間後にＸ線フィ
ルムを現像して陽性のシグナルを検出し、４℃に保存し
ておいてプレートより陽性クローンを分離した。

【００５０】次に以下の方法により、陽性クローンから
λファージＤＮＡを抽出した。滅菌パスツールピペット
を用いて陽性クローンを打ち抜き、予め５０ｍｌの遠沈
管に分注しておいた２００μｌのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ ｃｏｌｉ Ｃ６００Ｈｆｌ株の宿主菌液に懸濁し
た。３７℃にて１５分間保温した後、１０ｍＭ硫酸マグ
ネシウムを含むＬＢ培地１２ｍｌを加えて、３７℃にて
１６時間振盪培養した。菌液を１５ｍｌ容の遠沈管に移
し、７０００ｒｐｍにて１０分間遠心し残査を除去し
た。上清１１ｍｌを超遠心用チューブ（Ｎｏ．３３１３
７２）に移し、ベックマン社製超遠心ローター（ＳＷ４
１Ｔｉ）を用いて１８℃、３０，０００ｒｐｍにて３５
分間遠心分離した。上清を完全に除いた残査に４００μ
ｌのｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（１００μｇ／ｍｌのｐ
ｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ、０．２Ｍ塩化ナトリウムおよ
び０．１％のＳＤＳ）を加えて５５℃にて９０分間保温
した。等量の水飽和フェノール溶液〔５００ｇのフェノ
ール（和光純薬工業社製）および０．５ｇの８−ヒドロ
キシキノリン（ナカライテスク社製）をよく混合した後
２００ｍｌの精製水を加えて振って得た下層を用い
た。〕を加えよく攪拌した後、室温、１２，０００ｒｐ
ｍにて５分間の遠心分離を行ない、上清を別の１．５ｍ
ｌ容マイクロチューブに移した。フェノール／クロロホ
ルム抽出、エタノール沈殿を行ない、陽性クローンλＤ
ＮＡとした。 （３）組換えプラスミドの作製 調製した１μｇの陽性クローンλＤＮＡを１Ｕの制限酵
素ＥｃｏＲＩを含む５０μｌのＨ ｂｕｆｆｅｒに溶解
し、３７℃にて２時間保温して完全消化した。アガロー
スゲル電気泳動を行ない、臭化エチジウム染色後のＵＶ
照射にて検出される約１．５ｋｂｐのＤＮＡ断片を含む
アガロースゲルを切り出した。アガロースゲルからのＤ
ＮＡ断片の精製はＤＮＡ回収用ガラスパウダーＥＡＳＹ
ＴＲＡＰを用いて行ない、フェノール／クロロホルム抽
出、エタノール沈殿により回収したＤＮＡ断片をＨＧＩ
Ｒ断片（１．５ｋｂｐ）とした。

【００５１】１μｇのプラスミドベクターｐＵＣ１１８
（宝酒造社製）を１Ｕの制限酵素ＥｃｏＲＩを含む５０
μｌのＨ ｂｕｆｆｅｒに溶解し、３７℃にて２時間保
温して完全消化した。フェノール／クロロホルム抽出、
エタノール沈殿により回収したＤＮＡをｐＵＣ１１８
ＥｃｏＲＩベクターとした。０．５ｍｌ容のマイクロチ
ューブに０．２μｇのｐＵＣ１１８ ＥｃｏＲＩベクタ
ーおよび０．１μｇのＨＧＩＲ断片（１．５ｋｂｐ）を
移し、滅菌精製水で５μｌに合わせた。これにＤＮＡ
ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ ｖｅｒ．２のＩ液を５μｌ
加え、よく混合してから１６℃にて１時間反応を行なっ
た。７０℃にて３０分間保温して反応を止め、フェノー
ル／クロロホルム抽出、エタノール沈殿にてＤＮＡを回
収後、５μｌのＴＥ溶液に溶解してライゲーション混液
とした。大腸菌の形質転換はコンピテントセルＥｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（東洋紡績社
製）を用いて行なった。氷中で溶解した１００μｌのコ
ンピテントセルに５μｌのライゲーション混液を加えて
混ぜ合わせ、引き続き氷中で３０分間静置した。４２℃
にて３０秒間保温した後、予め３７℃に保温しておいた
０．９ｍｌのＳＯＣ培地を加えて１５ｍｌの遠沈管に移
し、３７℃にて１時間振盪培養した。この菌液を５０μ
ｇ／ｍｌのアンピシリン、０．０２％のＸ−Ｇａｌおよ
び５０ｍＭのＩＰＴＧを含むＬＢ寒天培地に塗り拡げて
３７℃にて１６時間静置してコロニーを形成させた。

【００５２】出現した単一の白色コロニーより、実施例
３と同様の方法によってプラスミドＤＮＡを抽出してＨ
ＧＩＲ断片（１．５ｋｂｐ）がそれぞれ逆向きに挿入し
た組換えプラスミドｐＧＩＲ１０およびｐＧＩＲ２０を
取得した。即ち、出現した単一の白色コロニーを２ｍｌ
のＬＢ／Ａｍｐで一晩振盪培養し、１２，０００ｒｐｍ
・３分間の遠心分離により菌体を回収した。菌体を１ｍ
ｇ／ｍｌのリゾチームを含む２５ｍＭトリス−塩酸緩衝
液（ｐＨ８．０）、１０ｍＭのＥＤＴＡおよび５０ｍＭ
グルコースからなるリゾチーム溶液３００μｌに懸濁し
て、３７℃にて５分間保温した後、２％のＳＤＳを含む
０．３Ｎ水酸化ナトリウム溶液１８０μｌを加えて激し
く撹拌して大腸菌を溶菌させた。６５℃で２０分間保温
後、室温に放置して冷却した溶菌液に１２０μｌのフェ
ノール／クロロホルム混液を加えて激しく撹拌して抽出
した。遠心分離後の水層に１／１０量の３Ｍ酢酸ナトリ
ウム、等量のイソプロパノールを加えて室温に５分間静
置し、１５，０００ｒｐｍにて５分間の遠心分離で沈殿
となったプラスミドＤＮＡを回収した。

【００５３】これらプラスミドの制限酵素地図並びに機
能地図を図２に示した。また、ｐＧＩＲ１０を保持する
形質転換体はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ
１０９／ｐＧＩＲ１０株（ＦＥＲＭ Ｐ−１５５４６）
と命名して工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託し
た。ｐＧＩＲ１０並びにｐＧＩＲ２０を保持する大腸菌
コロニーをそれぞれ１５０ｍｌのＬＢ／Ａｍｐに移植
し、３７℃にて一晩振盪培養後、プラスミドＤＮＡをＱ
ＩＡＧＥＮ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ Ｋｉｔを用い
て調製した。

【００５４】

【実施例５】マウス染色体ＤＮＡを用いた相同遺伝子の
解析 （１）プローブＤＮＡ断片の調製 １０μｇの組換えプラスミドｐＧＩＲ１０を各１０Ｕの
制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＥａｅＩ（宝酒造社製）を含
む１００μｌのＭ ｂｕｆｆｅｒ〔１０ｍＭトリス−塩
酸緩衝液（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ塩化マグネシウム、
１ｍＭのＤＴＴおよび５０ｍＭ塩化ナトリウム〕に溶解
し、３７℃で１２０分間保温した。

【００５５】続いて、アガロース電気泳動を行い、臭化
エチジウム染色後のＵＶ照射にて検出される約２７０ｂ
ｐのＤＮＡ断片を含むアガロースゲルを切り出した。ア
ガロースゲルからのＤＮＡ断片の精製は、ＤＮＡ回収用
ガラスパウダーＥＡＳＹＴＲＡＰを用いて行い、フェノ
ール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿によりＤＮＡ
断片を回収した。得られた約２７０ｂｐのＤＮＡ断片
を、〔α−³²Ｐ〕ｄＣＴＰを用いてＲａｎｄｏｍ Ｐｒ
ｉｍｅｒ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔにて標識
し、プローブＤＮＡ断片とした。 （２）マウス染色体ＤＮＡのサザンハイブリダイゼイシ
ョン 各５μｇのマウス染色体ＤＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社
製）を５Ｕの制限酵素ＥｃｏＲＩを含む１００μｌのＨ
ｂｕｆｆｅｒ、あるいは５Ｕの制限酵素ＨｉｎｄＩＩ
Ｉ（宝酒造社製）を含む１００μｌのＭ ｂｕｆｆｅｒ
に溶解し、３７℃で１２０分間保温した。それぞれ、フ
ェノール／クロロホルム抽出、クロロホルム抽出後、エ
タノール沈殿にてＤＮＡを回収した。

【００５６】得られた制限酵素消化ＤＮＡをアガロース
ゲル電気泳動に供した後、電気泳動後のゲルを２００ｍ
ｌの０．５Ｎ水酸化ナトリウムおよび１．５Ｍ塩化ナト
リウム溶液中で２０分間室温に放置した。ゲルをバキュ
ームトランスファー装置（ＢＣ−６００型、バイオクラ
フト社製）に移し、トランスファーバッファーとして
０．４Ｎ水酸化ナトリウム溶液を用い、７ｃｍ／Ｈｇに
て４０分間吸引して、ＤＮＡをＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋メン
ブランへトランスファーした。メンブランを静かに剥が
し、２倍濃度ＳＳＣ中にて３０秒間緩やかに洗浄後、濾
紙上に移して約１時間風乾させた。メンブランは（１）
にて調製した約２７０ｂｐのプローブＤＮＡ断片を用い
て、実施例４と同様の方法にてハイブリダイゼイション
を行なった。即ち、５倍濃度ＳＳＰＥ、５倍濃度Ｄｅｎ
ｈａｒｄｔ’ｓ液および０．５％のＳＤＳからなる液に
最終濃度１００μｇ／ｍｌとなるように変性サケ精子Ｄ
ＮＡを加えてプレ−ハイブリダイゼイション液とした。
先に調製したメンブランをハイブリダイゼイションバッ
グに入れ、メンブラン１ｃｍ² 当たり０．１ｍｌのプレ
−ハイブリダイゼイション液を加えてシールし、６５℃
の水浴中で３時間振盪保温した。このバッグに１００
℃、５分間の保温後に氷中で急冷した上記（１）にて調
製のプローブＤＮＡ断片を、最終濃度１×１０⁶ ｃｐｍ
／ｍｌとなるように加えてシールし、さらに６５℃の水
浴中で２４時間振盪保温した。メンブランを取り出し、
室温で洗浄液１にて１０分間洗浄した。引き続き、６５
℃で洗浄液２を用いて１５分間洗浄後、さらに６５℃で
洗浄液３を用いて１５分間洗浄した。メンブランは、Ｂ
ＡＳ２０００イメージングアナライザー（富士写真フィ
ルム社製）にて放射活性の読み取り並びに検出を行なっ
た。

【００５７】その結果、マウス染色体ＤＮＡからは陽性
シグナルは検出できなかった。つまり、今回取得したＨ
ＧＩＲ遺伝子はヒト特有のものであると考えられた。

【００５８】

【実施例６】ＨＧＩＲ全塩基配列の決定 組換えプラスミドｐＧＩＲ１０を材料に、Ｋｉｌｏ−Ｓ
ｅｑｕｅｎｃｅ用 Ｄｅｌｅｔｉｏｎ Ｋｉｔ（宝酒造
社製）を用いて様々なインサート長のデレーションミュ
ータントを作製し、ＨＧＩＲ遺伝子全長を含むＤＮＡ塩
基配列を決定するために使用した。すなわち、１０μｇ
のｐＧＩＲ１０をそれぞれ２０Ｕの制限酵素ＳｐｈＩお
よびＢａｍＨＩ（共に宝酒造社製）を含むＨ ｂｕｆｆ
ｅｒに溶解して３７℃・２時間の保温で完全に消化し
た。添付のプロトコールに従って、Ｅｘｏｎｕｃｌｅａ
ｓｅ ＩＩＩ、Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎ Ｎｕｃｌｅａｓｅ
およびＫｌｅｎｏｗ ＦｒａｇｍｅｎｔによるＤＮＡの
欠失、平滑末端化を行なった。それぞれライゲーション
によりプラスミドを環状にした後にＥｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９株を形質転換して各種長さ
のＤＮＡ断片を保持したクローンを取得した。各クロー
ンは、実施例３（３）と同様の方法、即ち、ＰＲＩＳ
Ｍ，Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍ
ｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋ
ｉｔを用いて、プライマーとしてＭ１３（−２１）およ
びＭ１３ｒｅｖｅｒｓｅシークエンスプライマー（Ａｐ
ｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）にてシークエンス
サンプルを調製後、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅ
ｍ社製の蛍光シークエンサーを用いて、塩基配列を決定
した。

【００５９】その結果、配列番号３の塩基配列からなる
ＨＧＩＲ遺伝子を含むｃＤＮＡの塩基配列を決定した。

【００６０】

【実施例７】ノーザンハイブリダイゼイション法による
ｍＲＮＡレベルの解析 実施例１にてずり応力負荷培養ＨＵＶＥＣ、並びに静置
培養ＨＵＶＥＣより抽出したｍＲＮＡ各２μｇを、Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、 Ａ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、 Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉ
ｏｎ（１９８９）に記載の方法にて、ホルムアルデヒド
ゲルによる電気泳動を行なった。電気泳動後のゲルを、
２００ｍｌの０．０５Ｎ水酸化ナトリウム溶液中で２０
分間室温に放置した。ゲルをバキュームトランスファー
装置に移し、トランスファーバッファーとして０．０５
Ｎ水酸化ナトリウム溶液を用いて、７ｃｍ／Ｈｇにて４
０分間吸引して、ｍＲＮＡをＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋メンブ
ランへトランスファーした。メンブランを静かに剥が
し、２倍濃度ＳＳＣ中にて３０秒間緩やかに洗浄後、濾
紙上に移して約１時間風乾させた。メンブランは実施例
４と同様の方法にてＨＧＩＲプローブＤＮＡを用いてハ
イブリダイゼイションを行なった。ハイブリダイゼイシ
ョン後のメンブランは、ＢＡＳ２０００イメージングア
ナライザーにて放射活性の読み取り並びに検出を行なっ
た。その結果、図３に示すように、静置培養ＨＵＶＥＣ
より抽出したｍＲＮＡを用いた場合に比べて、ずり応力
負荷培養したＨＵＶＥＣより抽出したｍＲＮＡを用いた
場合に特に明らかなシグナルが検出された。つまり、血
管内皮細胞においては、ずり応力負荷した際にＨＧＩＲ
遺伝子の発現量が増加することが明らかとなった。

【００６１】

【発明の効果】本発明によれば、新規遺伝子ＨＧＩＲを
用いることで、血管内皮細胞機能をコントロールしてい
るずり応力が個々の細胞においてどの程度負荷している
かをＨＧＩＲ遺伝子さらにその遺伝子がコードする蛋白
質の発現量に置き換えて簡便に測定することが可能とな
り、個々の内皮細胞機能について詳細に解析することが
できる。さらには血管内皮細胞の機能とずり応力との関
係をさらに詳細に解析し、血管内皮細胞機能障害からな
る種々の脈管疾患発症メカニズムの解明を行なうための
効率的な発現物質解析並びに関連物質探索が可能とな
る。

【００６２】

【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：４２３ 配列の型：タンパク質 配列の種類：アミノ酸 配列 Met Val Pro His Leu Leu Leu Leu Cys Leu Leu Pro Leu Val Arg Ala 1 5 10 15 Thr Glu Pro His Glu Gly Arg Ala Asp Glu Gln Ser Ala Glu Ala Ala 20 25 30 Leu Ala Val Pro Asn Ala Ser His Phe Phe Ser Trp Asn Asn Tyr Thr 35 40 45 Phe Ser Asp Trp Gln Asn Phe Val Gly Arg Arg Arg Tyr Gly Ala Glu 50 55 60 Ser Gln Asn Pro Thr Val Lys Ala Leu Leu Ile Val Ala Tyr Ser Phe 65 70 75 80 Ile Ile Val Phe Ser Leu Phe Gly Asn Val Leu Val Cys His Val Ile 85 90 95 Phe Lys Asn Gln Arg Met His Ser Ala Thr Ser Leu Phe Ile Val Asn 100 105 110 Leu Ala Val Ala Asp Ile Met Ile Thr Leu Leu Asn Thr Pro Phe Thr 115 120 125 Leu Val Arg Phe Val Asn Ser Thr Trp Ile Phe Gly Lys Gly Met Cys 130 135 140 His Val Ser Arg Phe Ala Gln Tyr Cys Ser Leu His Val Ser Ala Leu 145 150 155 160 Thr Leu Thr Ala Ile Ala Val Asp Arg His Gln Val Ile Met His Pro 165 170 175 Leu Lys Pro Arg Ile Ser Ile Thr Lys Gly Val Ile Tyr Ile Ala Val 180 185 190 Ile Trp Thr Met Ala Thr Phe Phe Ser Leu Pro His Ala Ile Cys Gln 195 200 205 Lys Leu Phe Thr Phe Lys Tyr Ser Glu Asp Ile Val Arg Ser Leu Cys 210 215 220 Leu Pro Asp Phe Pro Glu Pro Ala Asp Leu Phe Trp Lys Tyr Leu Asp 225 230 235 240 Leu Ala Thr Phe Ile Leu Leu Tyr Ile Leu Pro Leu Leu Ile Ile Ser 245 250 255 Val Ala Tyr Ala Arg Val Ala Lys Lys Leu Trp Leu Cys Asn Met Ile 260 265 270 Gly Asp Val Thr Thr Glu Gln Tyr Phe Ala Leu Arg Arg Lys Lys Lys 275 280 285 Lys Thr Ile Lys Met Leu Met Leu Val Val Val Leu Phe Ala Leu Cys 290 295 300 Trp Phe Pro Leu Asn Cys Tyr Val Leu Leu Leu Ser Ser Lys Val Ile 305 310 315 320 Arg Thr Asn Asn Ala Leu Tyr Phe Ala Phe His Trp Phe Ala Met Ser 325 330 335 Ser Thr Cys Tyr Asn Pro Phe Ile Tyr Cys Trp Leu Asn Glu Asn Phe 340 345 350 Arg Ile Glu Leu Lys Ala Leu Leu Ser Met Cys Gln Arg Pro Pro Lys 355 360 365 Pro Gln Glu Asp Arg Pro Pro Ser Pro Val Pro Ser Phe Arg Val Ala 370 375 380 Trp Thr Glu Lys Asn Asp Gly Gln Arg Ala Pro Leu Ala Asn Asn Leu 385 390 395 400 Leu Pro Thr Ser Gln Leu Gln Ser Gly Lys Thr Asp Leu Ser Ser Val 405 410 415 Glu Pro Ile Val Thr Met Ser 420 423

【００６３】

【配列表】 配列番号：２ 配列の長さ：１２６９ 配列の型：核酸 配列の種類：ＤＮＡ 配列 ATGGTCCCTC ACCTCTTGCT GCTCTGTCTC CTCCCCTTGG TGCGAGCCAC CGAGCCCCAC 60 GAGGGCCGGG CCGACGAGCA GAGCGCGGAG GCGGCCCTGG CCGTGCCCAA TGCCTCGCAC 120 TTCTTCTCTT GGAACAACTA CACCTTCTCC GACTGGCAGA ACTTTGTGGG CAGGAGGCGC 180 TACGGCGCTG AGTCCCAGAA CCCCACGGTG AAAGCCCTGC TCATTGTGGC TTACTCCTTC 240 ATCATTGTCT TCTCACTCTT TGGCAACGTC CTGGTCTGTC ATGTCATCTT CAAGAACCAG 300 CGAATGCACT CGGCCACCAG CCTCTTCATC GTCAACCTGG CAGTTGCCGA CATAATGATC 360 ACGCTGCTCA ACACCCCCTT CACTTTGGTT CGCTTTGTGA ACAGCACATG GATATTTGGG 420 AAGGGCATGT GCCATGTCAG CCGCTTTGCC CAGTACTGCT CACTGCACGT CTCAGCACTG 480 ACACTGACAG CCATTGCGGT GGATCGCCAC CAGGTCATCA TGCACCCCTT GAAACCCCGG 540 ATCTCAATCA CAAAGGGTGT CATCTACATC GCTGTCATCT GGACCATGGC TACGTTCTTT 600 TCACTCCCAC ATGCTATCTG CCAGAAATTA TTTACCTTCA AATACAGTGA GGACATTGTG 660 CGCTCCCTCT GCCTGCCAGA CTTCCCTGAG CCAGCTGACC TCTTCTGGAA GTACCTGGAC 720 TTGGCCACCT TCATCCTGCT CTACATCCTG CCCCTCCTCA TCATCTCTGT GGCCTACGCT 780 CGTGTGGCCA AGAAACTGTG GCTGTGTAAT ATGATTGGCG ATGTGACCAC AGAGCAGTAC 840 TTTGCCCTGC GGCGCAAAAA GAAGAAGACC ATCAAGATGT TGATGCTGGT GGTAGTCCTC 900 TTTGCCCTCT GCTGGTTCCC CCTCAACTGC TACGTCCTCC TCCTGTCCAG CAAGGTCATC 960 CGCACCAACA ATGCCCTCTA CTTTGCCTTC CACTGGTTTG CCATGAGCAG CACCTGCTAT 1020 AACCCCTTCA TATACTGCTG GCTGAACGAG AACTTCAGGA TTGAGCTAAA GGCATTACTG 1080 AGCATGTGTC AAAGACCTCC CAAGCCTCAG GAGGACAGGC CACCCTCCCC AGTTCCTTCC 1140 TTCAGGGTGG CCTGGACAGA GAAGAATGAT GGCCAGAGGG CTCCCCTTGC CAATAACCTC 1200 CTGCCCACCT CCCAACTCCA GTCTGGGAAG ACAGACCTGT CATCTGTGGA ACCCATTGTG 1260 ACGATGAGT 1269

【００６４】

【配列表】 配列番号：３ 配列の長さ：１５６２ 配列の型：核酸 配列の種類：ＤＮＡ 配列 GTCCCGAGGA GCCAGGGAGC CCGGACGCGC GGAGCACCGC GCCGCCCGCC ACCAGCCCGC 60 GGTCGGCCTT GTATGCTGTG CGCCCCGCAC CCCGGCTGCG CGCTCCGATC CCAGCGGGAG 120 GGGACGCCCG GCCCGCAGGC TCCCAGGGGA GGGGTGGCTC CTGCAAAATG GTCCCTCACC 180 TCTTGCTGCT CTGTCTCCTC CCCTTGGTGC GAGCCACCGA GCCCCACGAG GGCCGGGCCG 240 ACGAGCAGAG CGCGGAGGCG GCCCTGGCCG TGCCCAATGC CTCGCACTTC TTCTCTTGGA 300 ACAACTACAC CTTCTCCGAC TGGCAGAACT TTGTGGGCAG GAGGCGCTAC GGCGCTGAGT 360 CCCAGAACCC CACGGTGAAA GCCCTGCTCA TTGTGGCTTA CTCCTTCATC ATTGTCTTCT 420 CACTCTTTGG CAACGTCCTG GTCTGTCATG TCATCTTCAA GAACCAGCGA ATGCACTCGG 480 CCACCAGCCT CTTCATCGTC AACCTGGCAG TTGCCGACAT AATGATCACG CTGCTCAACA 540 CCCCCTTCAC TTTGGTTCGC TTTGTGAACA GCACATGGAT ATTTGGGAAG GGCATGTGCC 600 ATGTCAGCCG CTTTGCCCAG TACTGCTCAC TGCACGTCTC AGCACTGACA CTGACAGCCA 660 TTGCGGTGGA TCGCCACCAG GTCATCATGC ACCCCTTGAA ACCCCGGATC TCAATCACAA 720 AGGGTGTCAT CTACATCGCT GTCATCTGGA CCATGGCTAC GTTCTTTTCA CTCCCACATG 780 CTATCTGCCA GAAATTATTT ACCTTCAAAT ACAGTGAGGA CATTGTGCGC TCCCTCTGCC 840 TGCCAGACTT CCCTGAGCCA GCTGACCTCT TCTGGAAGTA CCTGGACTTG GCCACCTTCA 900 TCCTGCTCTA CATCCTGCCC CTCCTCATCA TCTCTGTGGC CTACGCTCGT GTGGCCAAGA 960 AACTGTGGCT GTGTAATATG ATTGGCGATG TGACCACAGA GCAGTACTTT GCCCTGCGGC 1020 GCAAAAAGAA GAAGACCATC AAGATGTTGA TGCTGGTGGT AGTCCTCTTT GCCCTCTGCT 1080 GGTTCCCCCT CAACTGCTAC GTCCTCCTCC TGTCCAGCAA GGTCATCCGC ACCAACAATG 1140 CCCTCTACTT TGCCTTCCAC TGGTTTGCCA TGAGCAGCAC CTGCTATAAC CCCTTCATAT 1200 ACTGCTGGCT GAACGAGAAC TTCAGGATTG AGCTAAAGGC ATTACTGAGC ATGTGTCAAA 1260 GACCTCCCAA GCCTCAGGAG GACAGGCCAC CCTCCCCAGT TCCTTCCTTC AGGGTGGCCT 1320 GGACAGAGAA GAATGATGGC CAGAGGGCTC CCCTTGCCAA TAACCTCCTG CCCACCTCCC 1380 AACTCCAGTC TGGGAAGACA GACCTGTCAT CTGTGGAACC CATTGTGACG ATGAGTTAGA 1440 AGAGGTTGGG AAGAGGGAGT GGGAGGGGTC TGTCTCCACC TGAGGCAGGG AAAGAGAGCC 1500 TATTCTCACA CATGATCTTC AGAGTGCTGG AAACACACTC CTGCAGAAGC TGTAGGACTC 1560 TT 1562

【００６５】

【配列表】 配列番号：４ 配列の長さ：３８ 配列の型：核酸 配列の種類：ＤＮＡ 配列 TAGTCGACWK YCTIACIGYI MTIRSIRTIG AYMGITWY 38

【００６６】

【配列表】 配列番号：５ 配列の長さ：３６ 配列の型：核酸 配列の種類：ＤＮＡ 配列 TGGAATTCTT RYTIAARAAI SCRTAIATIA VIGGRT 36

【図面の簡単な説明】

【図１】平行平板型ずり応力負荷培養装置の構造を示す
図である。

【図２】組換えプラスミドｐＧＩＲ１０並びにｐＧＩＲ
２０の制限酵素切断部位並びに機能地図を示す図であ
る。

【図３】ＨＧＩＲに対応するｍＲＮＡレベルを示す図で
ある（ノーザンハイブリダイゼイション）。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記の制限酵素地図 【化１】 に示される制限酵素サイトにより特徴付けられるヒト遺
   伝子に由来するＤＮＡ、そのペプチドコード領域のＤＮ
   Ａ、およびそれらの断片からなる群より選択されるＤＮ
   Ａ。
2. 【請求項２】 ペプチドコード領域が、配列番号１の１
   −４２３のアミノ酸配列をコードする塩基配列である請
   求項１に記載のＤＮＡ。
3. 【請求項３】 ペプチドコード領域が、配列番号２の１
   −１２６９の塩基配列である請求項１または２に記載の
   ＤＮＡ。
4. 【請求項４】 制限酵素地図に示される制限酵素サイト
   により特徴付けられるＤＮＡが、配列番号３の１−１５
   ６２である請求項１〜３のいずれかに記載のＤＮＡ。
5. 【請求項５】 請求項１〜４のいずれかに記載のＤＮＡ
   に対する相補的ＤＮＡ。
6. 【請求項６】 請求項１〜５のいずれかに記載のＤＮＡ
   を含有することを特徴とする組換えプラスミド。
7. 【請求項７】 該組換えプラスミドがｐＧＩＲ１０であ
   る請求項５記載の組換えプラスミド。