JPH11304707A - 蛍光測定装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 位相差ドリフトの問題を解消して蛍光寿命等
を正確に測定することができる蛍光測定装置を提供す
る。 【解決手段】 励起光源２１から出力され変調器２２に
より一定周期で強度変調された励起光は、試料セル４０
中の試料に照射される。試料から発生した蛍光は、蛍光
検出光学系がシャッタ９２により遮断されていないとき
光検出器７２により検出される。励起光は、励起光検出
光学系がシャッタ９３により遮断されていないとき光検
出器７２により検出される。光検出器７２により検出さ
れた蛍光および励起光それぞれの位相は、光検出器７１
により励起光が検出されて生成された基準信号の位相を
基準として位相検出器７９により検出される。演算制御
部８０により、位相検出器７９により検出された蛍光お
よび励起光それぞれの位相に基づいて、蛍光と励起光と
の間の位相差が求められる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、一定周期で強度変
調された励起光を試料に照射し、その試料から発生した
蛍光と励起光との間の位相差を検出して、その試料中に
含まれる蛍光物質の蛍光寿命等を測定する蛍光測定装置
に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】試料に蛍光物質を含ませておき、その試
料に励起光を照射して試料中の蛍光物質から発生した蛍
光を検出し、その検出結果に基づいて試料を分析するこ
とが行われている。このような蛍光測定による試料分析
技術の１つに位相差測定法がある。この位相差測定法
は、試料に照射すべき励起光を一定周期で強度変調され
たものとし、試料中の蛍光物質から発生した蛍光と励起
光との間の位相差を検出する。そして、この位相差に基
づいて、試料中の蛍光物質の蛍光寿命、または、この蛍
光寿命と関連ある物理的もしくは化学的な特性量等を測
定する。このような位相差測定法による蛍光測定に用い
られる従来の蛍光測定装置は、例えば特開昭６２−１９
０４４５号公報に記載されている。

【０００３】図１０は、この従来の蛍光測定装置の構成
図である。この蛍光測定装置では、発光ダイオード２か
ら出力される励起光は高周波発生器１により強度変調さ
れ、その強度変調された励起光は、フィルタ３および光
ケーブル４を経て、試料５に照射される。試料５で発生
した蛍光および散乱された励起光は、光ケーブル６およ
びコリメータレンズ７を経て、分光器８により互いに分
離される。分光器８により分離された一方の励起光は、
フィルタ９およびレンズ１０を経て光検出器１１により
検出される。分光器８により分離された他方の蛍光は、
フィルタ１２およびレンズ１３を経て光検出器１４によ
り検出される。光検出器１１および１４それぞれから出
力された信号は、増幅器１５，１６を経て位相電圧変換
器１７に入力し、蛍光と散乱光との間の位相差が測定さ
れる。そして、この位相差に基づいて、試料５中の蛍光
物質の蛍光寿命等が求められる。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記従
来の蛍光測定装置では、光検出器１１および１４それぞ
れの光検出特性の変動に主に起因すると考えられる位相
差ドリフトの現象が認められる。すなわち、試料５およ
び試料５中の蛍光物質の状態が変動することなく一定で
あったとしても、光検出器１１および１４それぞれの光
検出特性が変動することから、この蛍光測定装置により
求められる位相差は時間経過とともに変動する。

【０００５】このような時間経過とともに位相差が変動
する位相差ドリフトがあると、位相差を正確に測定する
ことができず、蛍光寿命等を正確に測定することができ
ない。例えば、試料５中に含まれている蛍光物質の量が
稀薄である場合、上述したような位相差ドリフトがある
と、その蛍光物質の蛍光寿命の測定の感度が悪くなる。
また、互いに異なる蛍光寿命を有する第１および第２の
蛍光物質が試料５中に含まれている場合、その試料５か
ら発生する蛍光の寿命を測定することにより第１および
第２の蛍光物質の含有比が測定されるが、上述したよう
な位相差ドリフトがあると、蛍光寿命の測定の感度が悪
くなり、第１および第２の蛍光物質の含有比の測定の感
度が悪くなる。さらに、試料５中に蛍光物質が全く含ま
れていない場合であっても位相差ドリフトが生じ、恰も
蛍光物質が含まれているかの如き測定結果が得られる。

【０００６】本発明は、上記問題点を解消する為になさ
れたものであり、位相差ドリフトの問題を解消して蛍光
寿命等を正確に測定することができる蛍光測定装置を提
供することを目的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明に係る蛍光測定装
置は、(1) 一定周期で強度変調された励起光を出力する
励起光発生手段と、(2) 励起光発生手段から出力された
励起光を試料に照射する照射光学系と、(3) 照射光学系
による励起光の試料への照射に伴い試料から発生した蛍
光を入力し所定位置へ導く蛍光検出光学系と、(4) 試料
への照射前の励起光の一部または試料を透過した後の励
起光を入力し所定位置へ導く励起光検出光学系と、(5)
蛍光検出光学系および励起光検出光学系のうちの一方の
光路を交互に遮断する光路遮断手段と、(6) 蛍光検出光
学系により導かれた蛍光または励起光検出光学系により
導かれた励起光を、所定位置に配された受光部により受
光して検出する光検出器と、(7) 励起光の強度変調の周
期と同じ周期の基準信号の位相を基準として、光検出器
により検出された蛍光および励起光それぞれの位相を検
出する位相検出手段と、(8) 光路遮断手段を制御すると
ともに、位相検出手段により検出された蛍光および励起
光それぞれの位相に基づいて蛍光と励起光との間の位相
差を求める演算制御手段と、を備えることを特徴とす
る。

【０００８】この蛍光測定装置によれば、一定周期で強
度変調された励起光は、励起光発生手段から出力され照
射光学系を経て試料に照射される。励起光の試料への照
射に伴い試料から発生した蛍光は、蛍光検出光学系が光
路遮断手段により遮断されていないとき、蛍光検出光学
系を経て光検出器の受光部に到達し検出される。一方、
励起光は、励起光検出光学系が光路遮断手段により遮断
されていないとき、励起光検出光学系を経て光検出器の
受光部に到達し検出される。光検出器により検出された
蛍光および励起光それぞれの位相は、励起光の強度変調
の周期と同じ周期の基準信号の位相を基準として位相検
出手段により検出される。そして、演算制御手段によ
り、光路遮断手段が制御されて蛍光検出光学系および励
起光検出光学系のうちの一方の光路が交互に遮断される
とともに、位相検出手段により検出された蛍光および励
起光それぞれの位相に基づいて、蛍光と励起光との間の
位相差が求められる。

【０００９】また、本発明に係る蛍光測定装置では、演
算制御手段は、位相検出手段により検出された蛍光およ
び励起光それぞれの位相の双方または何れか一方を平均
化することを特徴とする。また、本発明に係る蛍光測定
装置では、演算制御手段は、蛍光と励起光との間の位相
差を平均化することを特徴とする。これら何れの場合に
も、ノイズの影響が低減され、Ｓ／Ｎ比が優れた位相差
が求められる。

【００１０】また、本発明に係る蛍光測定装置では、光
路遮断手段は、蛍光検出光学系の光路を遮断する第１の
シャッタと、励起光検出光学系の光路を遮断する第２の
シャッタと、を備えることを特徴とする。また、本発明
に係る蛍光測定装置では、光路遮断手段は、光を通過さ
せる通過部と光を遮断する遮断部とが周方向に交互に設
けられ中心点を中心として回転するチョッパであること
を特徴とする。これら何れの場合にも、蛍光検出光学系
および励起光検出光学系のうちの一方の光路を交互に遮
断する光路遮断手段を実現するのに好適である。

【００１１】また、本発明に係る蛍光測定装置では、励
起光の一部を分岐する励起光分岐手段と、励起光分岐手
段により分岐された励起光を検出して基準信号を発生す
る基準信号発生手段とを更に備えることを特徴とする。
また、本発明に係る蛍光測定装置では、励起光発生手段
は、一定強度の励起光を出力する励起光源と、一定周期
の変調信号を出力する変調信号発生部と、励起光源から
出力された励起光を変調信号発生部から出力された変調
信号に基づいて強度変調して出力する変調器とを備え、
基準信号は、変調信号発生部から出力された変調信号に
基づくものであることを特徴とする。また、本発明に係
る蛍光測定装置では、励起光発生手段は、一定周期の変
調信号を出力する変調信号発生部と、変調信号発生部か
ら出力された変調信号に基づいて強度変調された励起光
を出力する半導体発光素子とを備え、基準信号は、変調
信号発生部から出力された変調信号に基づくものである
ことを特徴とする。これら何れの場合にも、蛍光および
励起光それぞれの位相を検出する際の基準信号を得るの
に好適である。

【００１２】

【発明の実施の形態】以下、添付図面を参照して本発明
の実施の形態を詳細に説明する。尚、図面の説明におい
て同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省
略する。

【００１３】（第１の実施形態）先ず、第１の実施形態
について説明する。図１は、第１の実施形態に係る蛍光
測定装置の構成図である。

【００１４】一定周期で強度変調された励起光を出力す
る励起光発生手段は、励起光源２１、変調器２２および
シンセサイザ（変調信号発生部）２３を備えて構成され
る。励起光源２１は、一定強度の励起光を連続発振し出
力する。この励起光源２１が出力する励起光は、測定し
ようする蛍光物質を励起し得る波長のものである。変調
器２２は、励起光源２１から出力された励起光と、シン
セサイザ２３から出力された一定周期の変調信号とを入
力し、変調信号に基づいて励起光を強度変調し、その強
度変調された励起光を出力する。

【００１５】その強度変調された励起光を試料セル４０
へ導く照射光学系は、ハーフミラー３１およびレンズ３
２を備えて構成される。ハーフミラー３１は、変調器２
２から出力された励起光を入力して２分岐する。レンズ
３２は、ハーフミラー３１により２分岐された励起光の
一方を入力し、その励起光を試料セル４０中の試料に集
光照射する。また、ＮＤフィルタ３３は、励起光に対し
所定の透過率を有するものであり、ハーフミラー３１に
より２分岐された励起光の他方を入力し、その励起光を
減衰させて透過させる。ＮＤフィルタ３３を透過した励
起光は、光検出器７１により検出される。

【００１６】試料セル４０中の試料に励起光が照射され
ると、その試料中の蛍光物質が励起され、その蛍光物質
から蛍光が発生する。その蛍光は、レンズ５１、バンド
パスフィルタ５２、ダイクロイックミラー５３およびレ
ンズ５４を備えて構成される蛍光検出光学系を経て、光
検出器７２により検出される。ここで、バンドパスフィ
ルタ５２は、蛍光の波長成分を透過させ、他の波長成分
を遮断するものである。また、ダイクロイックミラー５
３は、蛍光の波長成分を透過させ、励起光の波長成分を
反射させるものである。

【００１７】試料セル４０中の試料に励起光が照射され
ると、その励起光の一部は試料セル４０を透過する。そ
の透過した励起光は、レンズ６１、ミラー６２、ＮＤフ
ィルタ６３、ミラー６４、ダイクロイックミラー５３お
よびレンズ５４を備えて構成される励起光検出光学系を
経て、光検出器７２により検出される。ここで、ＮＤフ
ィルタ６３は、励起光に対し所定の透過率を有するもの
であり、励起光を減衰させて透過させ、光検出器７２に
到達する蛍光および励起光それぞれの強度を互いに同程
度とすることで、光検出器７２による蛍光および励起光
それぞれの検出を安定にすることを目的としている。

【００１８】光検出器７１，７２それぞれは、シンセサ
イザ７３から出力されＲＦアンプ７４により増幅された
一定周期で強度変調されたゲイン信号を入力するととも
に、受光部に入射した光を検出し、その光の強度とゲイ
ン信号の強度とに応じた電気信号を出力する。すなわ
ち、出力される電気信号は、検出された光の強度がゲイ
ン信号に従ってゲイン変調されたものである。なお、シ
ンセサイザ２３および７３それぞれは、互いに同期して
一定周期の信号を出力する。

【００１９】アンプ７５，７６それぞれは、光検出器７
１，７２から出力された電気信号を電流電圧変換すると
ともに、その電気信号のうち高周波成分を遮断するロー
パスフィルタとしても作用する。バンドパスフィルタ７
７，７８それぞれは、アンプ７５，７６から出力された
電気信号を入力し、その電気信号のうち所定波長帯域成
分のみを出力する。位相検出器７９は、バンドパスフィ
ルタ７７，７８それぞれから出力された電気信号を入力
し、バンドパスフィルタ７７から出力された電気信号
（基準信号）の位相を基準として、バンドパスフィルタ
７８から出力された電気信号の位相を求め、その求めら
れた位相を表す位相信号を出力する。なお、光検出器７
１、アンプ７５およびバンドパスフィルタ７７は、基準
信号を発生する基準信号発生手段を構成している。

【００２０】演算制御部８０は、位相検出器７９から出
力された位相信号を入力するとともに、シャッタ制御部
９１を介してシャッタ９２および９３それぞれの開閉を
制御する。ここで、シャッタ９２は、試料セル４０とレ
ンズ５１との間に設けられ、シャッタ制御部９１による
指示に従って蛍光検出光学系の光路を遮断するものであ
る。一方、シャッタ９３は、ミラー６２とＮＤフィルタ
６３との間に設けられ、シャッタ制御部９１による指示
に従って励起光検出光学系の光路を遮断するものであ
る。そして、演算制御部８０は、シャッタ９２および９
３それぞれの開閉に関する情報ならびに位相検出器７９
から入力した位相信号に基づいて、蛍光と励起光との間
の位相差を検出する。

【００２１】なお、図示していないが、光検出器７１お
よび７２それぞれに迷光が入射するのを防止する為に、
適切な箇所に遮光板を設けるのが好適である。例えば、
試料セル４０からダイクロイックミラー５３に到るまで
の間の蛍光検出光学系および励起光検出光学系それぞれ
は、両者間の光路長差の短縮化および蛍光測定装置の小
型化などを考慮すると互いに近接したものであることが
好ましいが、その場合に光検出器７２に迷光が入射する
危険があるので、特に、この間の蛍光検出光学系および
励起光検出光学系の間に遮光板を設けるのが望ましい。
また、蛍光検出光学系および励起光検出光学系それぞれ
と、ハーフミラー３１から光検出器７１に到るまでの光
学系との間でも、同様である。

【００２２】次に、本実施形態に係る蛍光測定装置の作
用を説明する。試料セル４０中の試料に含まれる蛍光物
質を励起するための励起光は、励起光源２１から一定強
度のものとして出射され、シンセサイザ２３から出力さ
れた一定周期の変調信号に基づいて変調器２２により強
度変調され、ハーフミラー３１およびレンズ３２を経
て、試料セル４０に入射する。この励起光のうち一部
は、ハーフミラー３１およびＮＤフィルタ３３を経て、
光検出器７１により検出される。また、試料セル４０中
の試料に励起光が照射されて試料中に含まれる蛍光物質
から発生した蛍光は、シャッタ９２が開いている時の
み、レンズ５１、バンドパスフィルタ５２、ダイクロイ
ックミラー５３およびレンズ５４を経て、光検出器７２
により検出される。また、試料セル４０を透過した励起
光は、シャッタ９３が開いている時のみ、レンズ６１、
ミラー６２、ＮＤフィルタ６３、ミラー６４、ダイクロ
イックミラー５３およびレンズ５４を経て、光検出器７
２により検出される。

【００２３】光検出器７１，７２それぞれから出力され
る電気信号は、シンセサイザ７３から出力されＲＦアン
プ７４により増幅された一定周期で強度変調されたゲイ
ン信号に従って、検出された光の強度が変調されたもの
である。すなわち、光検出器７１から出力されアンプ７
５およびバンドパスフィルタ７７を経て位相検出器７９
に入力する電気信号は、光検出器７２により検出された
蛍光および励起光それぞれの位相を検出する際の基準と
なる基準信号となる。一方、光検出器７２から出力され
アンプ７６およびバンドパスフィルタ７８を経て位相検
出器７９に入力する電気信号は、シャッタ９２が開かれ
シャッタ９３が閉じられている時には、蛍光の強度変化
を表す電気信号であり、シャッタ９２が閉じられシャッ
タ９３が開かれている時には、励起光の強度変化を表す
電気信号である。

【００２４】光検出器７２から出力されアンプ７６およ
びバンドパスフィルタ７８を経て位相検出器７９に入力
した電気信号の位相は、上記基準信号の位相を基準とし
て位相検出器７９により検出され、その位相を表す位相
信号が演算制御部８０へ出力される。そして、演算制御
部８０により、シャッタ制御部９１を介してシャッタ９
２が開かれシャッタ９３が閉じられている時に位相検出
器７９から入力した位相信号に基づいて蛍光の位相が求
められ、シャッタ制御部９１を介してシャッタ９２が閉
じられシャッタ９３が開かれている時に位相検出器７９
から入力した位相信号に基づいて励起光の位相が求めら
れ、さらに蛍光と励起光との間の位相差が求められる。

【００２５】なお、演算制御部８０は、蛍光および励起
光それぞれの位相の双方または何れか一方を平均化する
のが好適であり、また、蛍光と励起光との間の位相差を
平均化するのも好適である。これら何れの場合にも、ノ
イズの影響が低減され、Ｓ／Ｎ比が優れた位相差が求め
られる。

【００２６】図２は、従来の蛍光測定装置および本実施
形態に係る蛍光測定装置それぞれにより求められる位相
差について説明する図である。図２（ａ）は従来の蛍光
測定装置の場合を示し、図２（ｂ）は本実施形態に係る
蛍光測定装置の場合を示す。なお、ここでは試料セル４
０中の試料および蛍光物質それぞれの状態は変動せず一
定であるとする。

【００２７】従来の蛍光測定装置の場合には、一方の光
検出器で蛍光を検出し、他方の光検出器で励起光を検出
することから、光検出器の光検出特性の変動に起因し
て、これら２つの光検出器による検出結果に基づいて得
られる蛍光と励起光との間の位相差は、図２（ａ）に示
すように時間の経過とともに変動する。

【００２８】これに対して、本実施形態に係る蛍光測定
装置の場合には、図２（ｂ）に示すように、時刻ｔ0 〜
ｔ1 、時刻ｔ2 〜ｔ3 および時刻ｔ4 〜ｔ5 それぞれの
期間では、シャッタ９２が開かれシャッタ９３が閉じら
れて、光検出器７１により検出された励起光の位相を基
準として、光検出器７２により検出された蛍光の位相が
位相検出器７９により求められる。このようにして求め
られた蛍光の位相は、光検出器７１および７２それぞれ
の光検出特性の変動に因り、時間の経過とともに変動す
る。また、時刻ｔ1 〜ｔ2 、時刻ｔ3 〜ｔ4 および時刻
ｔ5 〜ｔ6 それぞれの期間では、シャッタ９２が閉じら
れシャッタ９３が開かれて、光検出器７１により検出さ
れた励起光の位相を基準として、光検出器７２により検
出された励起光の位相が位相検出器７９により求められ
る。このようにして求められた励起光の位相も、光検出
器７１および７２それぞれの光検出特性の変動に因り、
時間の経過とともに変動する。

【００２９】そして、演算制御部８０により、時刻ｔ0
〜ｔ1 の期間に求められた蛍光の位相の平均値と、時刻
ｔ1 〜ｔ2 の期間に求められた励起光の位相の平均値と
に基づいて、蛍光と励起光との間の位相差が求められ
る。時刻ｔ2 〜ｔ3 の期間に求められた蛍光の位相の平
均値と、時刻ｔ3 〜ｔ4 の期間に求められた励起光の位
相の平均値とに基づいて、蛍光と励起光との間の位相差
が求められる。また、時刻ｔ4 〜ｔ5 の期間に求められ
た蛍光の位相の平均値と、時刻ｔ5 〜ｔ6 の期間に求め
られた励起光の位相の平均値とに基づいて、蛍光と励起
光との間の位相差が求められる。このようにして蛍光と
励起光との間の位相差を求める際に、光検出器７１およ
び７２それぞれの光検出特性の変動が相殺されるので、
蛍光と励起光との間の位相差が正確に測定される。

【００３０】次に、従来の蛍光測定装置および本実施形
態に係る蛍光測定装置それぞれによる位相差測定の結果
について説明する。図３および図４それぞれは、従来の
蛍光測定装置および本実施形態に係る蛍光測定装置それ
ぞれによる位相差測定の結果を示すグラフである。図３
は、一方のシャッタが開かれ他方のシャッタが閉じられ
ている各期間において１００個の位相データを求めて平
均化する場合のグラフであり、図４は、一方のシャッタ
が開かれ他方のシャッタが閉じられている各期間におい
て５０個の位相データを求めて平均化する場合のグラフ
である。

【００３１】ここで、励起光源２１は、Ｈｅ−Ｎｅレー
ザ光源であり、これから出射される波長５４３．５ｎｍ
のレーザ光を励起光とした。シンセサイザ２３から変調
器２２へ出力される変調信号は、周波数が２０ＭＨｚで
あり、ビート周波数が１０Ｈｚであった。試料セル４０
中の試料は、蛍光物質としてローダミンＢを１０^-6Ｍ含
む水溶液であり、測定の期間中で一定とした。これらの
図から判るように、蛍光と励起光との間の位相差は、従
来の蛍光測定装置では時間の経過とともに大きくなって
いくが、本実施形態に係る蛍光測定装置では変動が小さ
い。

【００３２】以上のように、本実施形態に係る蛍光測定
装置では、光検出器７１等により得られる基準信号の位
相を基準として、光検出器７２により検出された蛍光お
よび励起光それぞれの位相が検出され、蛍光と励起光と
の間の位相差が求められるので、光検出器７１および７
２それぞれの光検出特性が変動したとしても、それらの
光検出特性の変動は、蛍光と励起光との間の位相差が求
められる際に相殺される。したがって、位相差ドリフト
の問題が解消され、位相差が正確に測定されて、蛍光寿
命または蛍光寿命と関連ある物理的もしくは化学的な特
性量等が正確に測定される。

【００３３】（第２の実施形態）次に、第２の実施形態
について説明する。図５は、第２の実施形態に係る蛍光
測定装置の構成図である。本実施形態に係る蛍光測定装
置は、第１の実施形態の場合と比較して、シャッタ制御
部９１ならびにシャッタ９２および９３に替えて、チョ
ッパ制御部９４およびチョッパ９５が設けられている点
が異なる。

【００３４】本実施形態では、演算制御部８０は、位相
検出器７９から出力された位相信号を入力するととも
に、チョッパ制御部９４を介してチョッパ９５の回転を
制御する。チョッパ９５は、光を通過させる通過部と光
を遮断する遮断部とが周方向に交互に設けられ中心点を
中心として回転するものであって、試料セル４０とレン
ズ５１との間およびミラー６２とＮＤフィルタ６３との
間に設けられ、チョッパ制御部９４による指示に従って
蛍光検出光学系および励起光検出光学系それぞれの光路
のうちの一方の光路を交互に遮断するものである。そし
て、演算制御部８０は、チョッパ９５の回転位置に関す
る情報および位相検出器７９から入力した位相信号に基
づいて、蛍光と励起光との間の位相差を検出する。

【００３５】図６は、本実施形態に係る蛍光測定装置に
おけるチョッパ９５の例を示す図である。このチョッパ
９５は、中心点９５Ａを中心として回転する円形状の板
に設けられた２つの開口部それぞれが通過部９５Ｂおよ
び９５Ｄとされ、周方向に関し通過部９５Ｂと通過部９
５Ｄとに挟まれた部分が遮断部９５Ｃおよび９５Ｅとさ
れている。通過部９５Ｂ、遮断部９５Ｃ、通過部９５Ｄ
および遮断部９５Ｅそれぞれの間の境界線は、中心点９
５Ａで互いに直交する２つの直線のうちの何れかの直線
上にある。

【００３６】本実施形態に係る蛍光測定装置の作用は、
第１の実施形態に係る蛍光測定装置の作用と略同様であ
るが、蛍光検出光学系および励起光検出光学系それぞれ
の光路のうちの一方の光路がチョッパ制御部９４および
チョッパ９５により交互に遮断される点で異なる。以下
では、主に本実施形態に係る蛍光測定装置におけるチョ
ッパ９５の作用について図７および図８を用いて説明す
る。

【００３７】図７は、本実施形態に係る蛍光測定装置に
おけるチョッパ９５の各回転位置それぞれについて、蛍
光検出光学系および励起光検出光学系それぞれの光路と
チョッパ９５の通過部および遮断部との関係を説明する
図である。この図において、蛍光検出光学系の光路がチ
ョッパ９５の面と交わる部分を符号Ａで示し、励起光光
検出光学系の光路がチョッパ９５の面と交わる部分を符
号Ｂで示している。この図に示すように、チョッパ９５
の中心点９５Ａから蛍光検出光学系の光路Ａおよび励起
光検出光学系の光路Ｂそれぞれへ下した直線が互いにな
す角度が９０度となるように、蛍光検出光学系の光路
Ａ、励起光検出光学系の光路Ｂおよびチョッパ９５それ
ぞれが配置される。また、図８は、本実施形態に係る蛍
光測定装置により求められる位相差について説明する図
である。

【００３８】図７（ａ）に示すように蛍光検出光学系の
光路Ａが通過部９５Ｄを通過し且つ励起光検出光学系の
光路Ｂが遮断部９５Ｃにより遮断される回転位置にチョ
ッパ９５があるとき（図８の時刻ｔ0 〜ｔ1 の期間）に
は、光検出器７１により検出された励起光の位相を基準
として、光検出器７２により検出された蛍光の位相が位
相検出器７９により求められる。その後、チョッパ９５
が中心点９５Ａを中心にして回転するに従い、蛍光検出
光学系の光路Ａが通過部９５Ｄと遮断部９５Ｃとの境界
線上にあり且つ励起光検出光学系の光路Ｂが遮断部９５
Ｃと通過部９５Ｂとの境界線上にある状態（図７
（ｂ））を経て、図７（ｃ）に示すような状態となる。

【００３９】図７（ｃ）に示すように蛍光検出光学系の
光路Ａが遮断部９５Ｃにより遮断され且つ励起光検出光
学系の光路Ｂが通過部９５Ｂを通過する回転位置にチョ
ッパ９５があるとき（図８の時刻ｔ1 〜ｔ2 の期間）に
は、光検出器７１により検出された励起光の位相を基準
として、光検出器７２により検出された励起光の位相が
位相検出器７９により求められる。その後、チョッパ９
５が中心点９５Ａを中心にして回転するに従い、蛍光検
出光学系の光路Ａが遮断部９５Ｃと通過部９５Ｂとの境
界線上にあり且つ励起光検出光学系の光路Ｂが通過部９
５Ｂと遮断部９５Ｅとの境界線上にある状態（図７
（ｄ））を経て、図７（ｅ）に示すような状態となる。

【００４０】図７（ｅ）に示すように蛍光検出光学系の
光路Ａが通過部９５Ｂを通過し且つ励起光検出光学系の
光路Ｂが遮断部９５Ｅにより遮断される回転位置にチョ
ッパ９５があるとき（図８の時刻ｔ2 〜ｔ3 の期間）に
は、光検出器７１により検出された励起光の位相を基準
として、光検出器７２により検出された蛍光の位相が位
相検出器７９により求められる。

【００４１】以降、同様にして、蛍光および励起光のう
ちの一方が交互に位相検出される。すなわち、図８に示
すように、時刻ｔ0 〜ｔ1 、時刻ｔ2 〜ｔ3 および時刻
ｔ4〜ｔ5 それぞれの期間では、光検出器７１により検
出された励起光の位相を基準として、光検出器７２によ
り検出された蛍光の位相が位相検出器７９により求めら
れる。また、時刻ｔ1 〜ｔ2 、時刻ｔ3 〜ｔ4 および時
刻ｔ5 〜ｔ6 それぞれの期間では、光検出器７１により
検出された励起光の位相を基準として、光検出器７２に
より検出された励起光の位相が位相検出器７９により求
められる。このようにして求められた蛍光および励起光
それぞれの位相は、光検出器７１および７２それぞれの
光検出特性の変動に因り、時間の経過とともに変動す
る。

【００４２】そして、演算制御部８０により、時刻ｔ0
〜ｔ1 の期間に求められた蛍光の位相の平均値と、時刻
ｔ1 〜ｔ2 の期間に求められた励起光の位相の平均値と
に基づいて、蛍光と励起光との間の位相差が求められ
る。時刻ｔ2 〜ｔ3 の期間に求められた蛍光の位相の平
均値と、時刻ｔ3 〜ｔ4 の期間に求められた励起光の位
相の平均値とに基づいて、蛍光と励起光との間の位相差
が求められる。また、時刻ｔ4 〜ｔ5 の期間に求められ
た蛍光の位相の平均値と、時刻ｔ5 〜ｔ6 の期間に求め
られた励起光の位相の平均値とに基づいて、蛍光と励起
光との間の位相差が求められる。このようにして蛍光と
励起光との間の位相差を求める際に、光検出器７１およ
び７２それぞれの光検出特性の変動が相殺されるので、
蛍光と励起光との間の位相差が正確に測定される。

【００４３】以上のように、本実施形態に係る蛍光測定
装置でも、光検出器７１等により得られる基準信号の位
相を基準として、光検出器７２により検出された蛍光お
よび励起光それぞれの位相が検出され、蛍光と励起光と
の間の位相差が求められるので、光検出器７１および７
２それぞれの光検出特性が変動したとしても、それらの
光検出特性の変動は、蛍光と励起光との間の位相差が求
められる際に相殺される。したがって、位相差ドリフト
の問題が解消され、位相差が正確に測定されて、蛍光寿
命または蛍光寿命と関連ある物理的もしくは化学的な特
性量等が正確に測定される。

【００４４】本発明は、上記実施形態に限定されるもの
ではなく種々の変形が可能である。位相検出器７９に入
力する一方の信号である基準信号は、励起光の一部を分
岐して光検出器７１により検出しアンプ７５およびバン
ドパスフィルタ７７を経て生成されるものに限られるも
のではない。例えば、シンセサイザ２３および７３それ
ぞれから出力される一定周期の信号を互いに混波しロー
パスフィルタを経て生成されるものでもよい。また、励
起光発生手段は、一定周期の変調信号を出力する変調信
号発生部と、変調信号発生部から出力された変調信号に
基づいて強度変調された励起光を出力する半導体発光素
子（例えば、ＬＥＤ）とを備えたものとするとともに、
基準信号は、変調信号発生部から出力された変調信号に
基づいて生成されるものでもよい。

【００４５】また、第２の実施形態に係る蛍光測定装置
におけるチョッパ９５は、図６に示したような２対の通
過部および遮断部を有するものに限られるものではな
く、１対または３対以上の通過部および遮断部を有する
ものでもよい。例えば、図９に示すような３対の通過部
および遮断部を有するものである場合には、通過部９５
Ｂ、遮断部９５Ｃ、通過部９５Ｄ、遮断部９５Ｅ、通過
部９５Ｆおよび遮断部９５Ｇそれぞれの間の境界線は、
中心点９５Ａで互いに６０度で交わる３つの直線のうち
の何れかの直線上にある。また、この場合、チョッパ９
５の中心点９５Ａから蛍光検出光学系の光路および励起
光検出光学系の光路それぞれへ下した直線が互いになす
角度が６０度または１８０度となるように、蛍光検出光
学系の光路、励起光検出光学系の光路およびチョッパ９
５それぞれが配置される。このような構成および配置と
して、チョッパ９５が中心点９５Ａを中心にして回転す
ることにより、蛍光検出光学系および励起光検出光学系
のうちの一方の光路が交互に遮断される。

【００４６】

【発明の効果】以上、詳細に説明したとおり、本発明に
よれば、一定周期で強度変調された励起光は、励起光発
生手段から出力され照射光学系を経て試料に照射され
る。励起光の試料への照射に伴い試料から発生した蛍光
は、蛍光検出光学系が光路遮断手段により遮断されてい
ないとき、蛍光検出光学系を経て光検出器の受光部に到
達し検出される。一方、励起光は、励起光検出光学系が
光路遮断手段により遮断されていないとき、励起光検出
光学系を経て光検出器の受光部に到達し検出される。光
検出器により検出された蛍光および励起光それぞれの位
相は、励起光の強度変調の周期と同じ周期の基準信号の
位相を基準として位相検出手段により検出される。そし
て、演算制御手段により、光路遮断手段が制御されて蛍
光検出光学系および励起光検出光学系のうちの一方の光
路が交互に遮断されるとともに、位相検出手段により検
出された蛍光および励起光それぞれの位相に基づいて、
蛍光と励起光との間の位相差が求められる。

【００４７】このような構成としたことにより、基準信
号の位相を基準として、光検出器により検出された蛍光
および励起光それぞれの位相が検出され、蛍光と励起光
との間の位相差が求められるので、光検出器の光検出特
性が変動したとしても、その光検出特性の変動は、蛍光
と励起光との間の位相差が求められる際に相殺される。
したがって、位相差ドリフトの問題が解消され、位相差
が正確に測定されて、蛍光寿命または蛍光寿命と関連あ
る物理的もしくは化学的な特性量等が正確に測定され
る。

【００４８】また、演算制御手段が位相検出手段により
検出された蛍光および励起光それぞれの位相の双方また
は何れか一方を平均化する場合や、演算制御手段が蛍光
と励起光との間の位相差を平均化する場合には、ノイズ
の影響が低減され、Ｓ／Ｎ比が優れた位相差が求められ
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】第１の実施形態に係る蛍光測定装置の構成図で
ある。

【図２】従来の蛍光測定装置および第１の実施形態に係
る蛍光測定装置それぞれにより求められる位相差につい
て説明する図である。

【図３】従来の蛍光測定装置および第１の実施形態に係
る蛍光測定装置それぞれによる位相差測定の結果を示す
グラフである。

【図４】従来の蛍光測定装置および第１の実施形態に係
る蛍光測定装置それぞれによる位相差測定の結果を示す
グラフである。

【図５】第２の実施形態に係る蛍光測定装置の構成図で
ある。

【図６】第２の実施形態に係る蛍光測定装置におけるチ
ョッパの例を示す図である。

【図７】第２の実施形態に係る蛍光測定装置におけるチ
ョッパ９５の各回転位置それぞれについて、蛍光検出光
学系および励起光検出光学系それぞれの光路と、チョッ
パ９５の通過部および遮断部との関係を説明する図であ
る。

【図８】第２の実施形態に係る蛍光測定装置により求め
られる位相差について説明する図である。

【図９】第２の実施形態に係る蛍光測定装置におけるチ
ョッパの他の例を示す図である。

【図１０】従来の蛍光測定装置の構成図である。

【符号の説明】

２１…励起光源、２２…変調器、２３…シンセサイザ、
３１…ハーフミラー、３２…レンズ、３３…ＮＤフィル
タ、４０…試料セル、５１…レンズ、５２…バンドパス
フィルタ、５３…ダイクロイックミラー、５４…レン
ズ、６１…レンズ、６２…ミラー、６３…ＮＤフィル
タ、６４…ミラー、７１，７２…光検出器、７３…シン
セサイザ、７４…ＲＦアンプ、７５，７６…アンプ、７
７，７８…バンドパスフィルタ、７９…位相検出器、８
０…演算制御部、９１…シャッタ制御部、９２，９３…
シャッタ、９４…チョッパ制御部、９５…チョッパ。

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 一定周期で強度変調された励起光を出力
   する励起光発生手段と、 前記励起光発生手段から出力された前記励起光を試料に
   照射する照射光学系と、 前記照射光学系による前記励起光の前記試料への照射に
   伴い前記試料から発生した蛍光を入力し所定位置へ導く
   蛍光検出光学系と、 前記試料への照射前の前記励起光の一部または前記試料
   を透過した後の前記励起光を入力し前記所定位置へ導く
   励起光検出光学系と、 前記蛍光検出光学系および前記励起光検出光学系のうち
   の一方の光路を交互に遮断する光路遮断手段と、 前記蛍光検出光学系により導かれた前記蛍光または前記
   励起光検出光学系により導かれた前記励起光を、前記所
   定位置に配された受光部により受光して検出する光検出
   器と、 前記励起光の強度変調の周期と同じ周期の基準信号の位
   相を基準として、前記光検出器により検出された前記蛍
   光および前記励起光それぞれの位相を検出する位相検出
   手段と、 前記光路遮断手段を制御するとともに、前記位相検出手
   段により検出された前記蛍光および前記励起光それぞれ
   の位相に基づいて前記蛍光と前記励起光との間の位相差
   を求める演算制御手段と、 を備えることを特徴とする蛍光測定装置。
2. 【請求項２】 前記演算制御手段は、前記位相検出手段
   により検出された前記蛍光および前記励起光それぞれの
   位相の双方または何れか一方を平均化することを特徴と
   する請求項１記載の蛍光測定装置。
3. 【請求項３】 前記演算制御手段は、前記蛍光と前記励
   起光との間の位相差を平均化することを特徴とする請求
   項１記載の蛍光測定装置。
4. 【請求項４】 前記光路遮断手段は、 前記蛍光検出光学系の光路を遮断する第１のシャッタ
   と、 前記励起光検出光学系の光路を遮断する第２のシャッタ
   と、 を備えることを特徴とする請求項１記載の蛍光測定装
   置。
5. 【請求項５】 前記光路遮断手段は、光を通過させる通
   過部と光を遮断する遮断部とが周方向に交互に設けられ
   中心点を中心として回転するチョッパであることを特徴
   とする請求項１記載の蛍光測定装置。
6. 【請求項６】 前記励起光の一部を分岐する励起光分岐
   手段と、 前記励起光分岐手段により分岐された前記励起光を検出
   して前記基準信号を発生する基準信号発生手段と、 を更に備えることを特徴とする請求項１記載の蛍光測定
   装置。
7. 【請求項７】 前記励起光発生手段は、 一定強度の励起光を出力する励起光源と、 前記一定周期の変調信号を出力する変調信号発生部と、 前記励起光源から出力された励起光を前記変調信号発生
   部から出力された変調信号に基づいて強度変調して出力
   する変調器と、 を備え、 前記基準信号は、前記変調信号発生部から出力された変
   調信号に基づくものであることを特徴とする請求項１記
   載の蛍光測定装置。
8. 【請求項８】 前記励起光発生手段は、 前記一定周期の変調信号を出力する変調信号発生部と、 前記変調信号発生部から出力された変調信号に基づいて
   強度変調された励起光を出力する半導体発光素子と、 を備え、 前記基準信号は、前記変調信号発生部から出力された変
   調信号に基づくものであることを特徴とする請求項１記
   載の蛍光測定装置。