JPH10327879A - 新規ヒト・７−トランスメンブラン受容体をコードしているｃＤＮＡクローンＨＮＦＤＹ２０ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ＨＮＦＤＹ２０ポリペプチドおよびポリヌク
レオチド、ならびに組み換え法によりかかるポリペプチ
ドを製造する方法、ならびに、とりわけ、感染症；痛
み；癌；拒食症；大食症；喘息；パーキンソン病；急性
心臓疾患；低血圧；高血圧；尿閉；骨粗鬆症；狭心症；
心筋梗塞；潰瘍；アレルギー；良性前立腺肥大；ならび
に精神病および神経学的疾病の治療プロトコールの設計
ならびにかかる症状の診断におけるＨＮＦＤＹ２０ポリ
ペプチドおよびポリヌクレオチドの使用を提供する。 【解決手段】 配列番号：２のポリペプチドまたはその
対応フラグメントをコードしているヌクレオチド配列に
対して少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド
配列を含む単離ポリヌクレオチド；あるいは上記ヌクレ
オチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新たに同定された
ポリヌクレオチド、それによりコードされるポリペプチ
ド、ならびにかかるポリヌクレオチドおよびポリペプチ
ドの使用、ならびにそれらの製造に関する。より詳細に
は、本発明ポリヌクレオチドおよびポリペプチド（以
下、ＨＮＦＤＹ２０という）はＧ蛋白結合受容体に関連
している。また本発明は、かかるポリヌクレオチドおよ
びポリペプチドの阻害または活性化にも関する。

【０００２】

【従来の技術】医学的に重要な多くのプロセスが、Ｇ蛋
白および／または第２のメッセンジャー（例えば、ｃＡ
ＭＰ）を含むシグナル変換経路に関与している蛋白によ
り行われているということは、十分にわかっている（Le
fkowitz,Nature,1991,351,353-354）。本明細書では、
これらの蛋白を、Ｇ蛋白またはＰＰＧ蛋白に関する経路
に関与する蛋白という。これらの蛋白のいくつかの例と
しては、アドレナリン作用性因子およびドパミンに対す
る受容体のごときＧＰＣ受容体（Kobilka,B.K.,et al.,
Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,1987,84:46-50;Kobolka,B.K.
et al.,Science,1987,238:650-656;Bunzow,J.R.,et a
l.,Nature,1988,336:783-787））、Ｇ蛋白自体、エフェ
クター蛋白（effector proteins）（例えば、ホスホリ
パーゼＣ、アデニルシクラーゼおよびホスホジエステラ
ーゼ）、ならびにアクチュエーター蛋白（actuator pro
teins）（例えば、蛋白キナーゼＡおよび蛋白キナーゼ
Ｃ）（Simon,M.I.,et al.,Science,1991,252:802-80
8））が挙げられる。例えば、シグナル変換の１つの形
態において、ホルモン結合の効果は細胞内酵素アデニレ
ートシクラーゼの活性化である。ホルモンによる酵素の
活性化はヌクレオチドＧＴＰの存在による。ＧＴＰはホ
ルモン結合にも影響する。Ｇ蛋白は、ホルモン受容体に
より活性化された場合には、ＧＴＰを結合ＧＤＰに交換
することが示された。次いで、ＧＴＰ担持形態は活性化
アデニレートシクラーゼに結合する。Ｇ蛋白自体により
触媒されるＧＴＰからＧＤＰへの加水分解によりＧ蛋白
はその基底不活性形態に戻る。かくして、Ｇ蛋白は２重
の役割、すなわち、受容体からエフェクターへのシグナ
ルを遅延させる中間体ならびにシグナル間隔を制御する
時計としての作用を行う。

【０００３】Ｇ蛋白結合受容体の膜蛋白遺伝子スーパー
ファミリーは、７つの推定上のトランスメンブランドメ
インを有するものと特徴づけられている。ドメインは、
細胞外または細胞質ループにより結合されたトランスメ
ンブランα−ヘリックスを示すと考えられている。Ｇ蛋
白結合受容体は広範な生物学的活性受容体を包含し、例
えば、ホルモン、ウイルス、成長因子および神経受容体
を包含する。Ｇ蛋白結合受容体（７ＴＭ受容体としても
知られる）は、少なくとも８個の種々異なる親水性ルー
プに結合した約２０ないし３０個のアミノ酸からなるこ
れら７個の保存された疎水的配列を含むものとして特徴
づけられている。結合受容体のＧ蛋白ファミリーはドパ
ミン受容体を包含し、それは精神病および神経学的疾病
の治療に使用される神経弛緩薬に結合する。このファミ
リーのメンバーの他の例は、カルシトニン、アドレナリ
ン作用性物質、エンドセリン、ｃＡＭＰ、アデノシン、
ムスカリン作動性物質、アセチルコリン、セロトニン、
ヒスタミン、スロンビン、キニン、卵胞刺激ホルモン、
オプシン、内皮分化遺伝子−１、ロドプシン、オドラン
ト、およびサイトメガロウイルス受容体が挙げられる
が、これらに限らない。たいていのＧ蛋白結合受容体
は、最初の２個の細胞外ループ中にそれぞれ１個の保存
されたシステイン残基を有し、ジスルフィド結合を形成
して機能的蛋白構造を安定化していると考えられてい
る。７個のトランスメンブラン領域はＴＭ１、ＴＭ２、
ＴＭ３、ＴＭ４、ＴＭ５、ＴＭ６、およびＴＭ７と命名
されている。ＴＭ３がシグナル変換に関与している。

【０００４】システイン残基のホスホリレーションおよ
びリピデーション（パリミチレーションまたはファルネ
シレーション）により、いくつかのＧ蛋白結合受容体の
シグナル伝達が影響を受ける可能性がある。たいていの
Ｇ蛋白結合受容体は、３番目の細胞質ループおよび／ま
たはカルボキシ末端に潜在的なホスホリレーション部位
を有する。いくつかのＧ蛋白結合受容体、例えばβ−ア
ドレナリン受容体については、蛋白キナーゼＡおよび／
または特異的受容体キナーゼによるホスホリレーション
により受容体脱感作がなされる。いくつかの受容体につ
いては、Ｇ蛋白結合受容体のリガンド結合部位は、いく
つかのＧ蛋白結合受容体トランスメンブランドメインに
より形成された親水性ソケットを含むと考えられてお
り、該ソケットはＧ蛋白結合受容体の疎水性残基により
囲まれていると考えられている。各Ｇ蛋白結合受容体ト
ランスメンブランヘリックスの親水性部位は内側を向
き、極性リガンド結合部位を形成すると考えられる。Ｔ
Ｍ３は、リガンド結合部位（例えば、ＴＭ３のアスパラ
ギン酸残基）を有するようないくつかのＧ蛋白結合受容
体中に含まれている。ＴＭ５のセリン、ＴＭ６のアスパ
ラギンおよびＴＭ６もしくはＴＭ７のフェニルアラニン
もしくはチロシンもリガンド結合に関与している。ヘテ
ロ３量体Ｇ蛋白により、Ｇ蛋白結合受容体は種々の細胞
内酵素、イオンチャンネルおよびトランスポーターに細
胞内で結合されうる（Johnson et al.,Endoc.Rev.,198
9,10:317-331参照）。別のＧ蛋白α−サブユニットは特
定のエフェクターを優先的に刺激して、細胞中の種々の
生物学的機能を転調させる。Ｇ蛋白結合受容体の細胞質
残基のホスホリレーションは、いくつかのＧ蛋白結合受
容体のＧ蛋白結合の調節のための重要な機構であると同
定されている。Ｇ蛋白結合受容体は哺乳動物宿主中の多
くの部位に見いだされている。

【０００５】過去１５年間にわたり、７トランスメンブ
ラン（７ＴＭ）受容体を標的とする約３５０種の治療薬
の市場導入が成功している。このことは、これらの受容
体が、治療標的として確立され証明された歴史を有する
ことを示すものである。細菌、真菌、原生動物およびウ
イルス感染のごとき感染症、詳細にはＨＩＶ−１または
ＨＩＶ−２による感染；痛み；癌；拒食症；大食症；喘
息；パーキンソン病；急性心臓疾患；低血圧；高血圧；
尿閉；骨粗鬆症；狭心症；心筋梗塞；潰瘍；アレルギ
ー；良性前立腺肥大；ならびに不安症、分裂病、躁鬱
病、せん妄、痴呆、重度の精神遅滞および運動障害（例
えば、Huntington病またはGilles dela Toutrett症候
群）を包含する精神病および神経学的疾病を包含（これ
らに限らない）する機能不全または疾病を予防、改善ま
たは修正することにおいて役割りを果たすことのできる
さらなる受容体の同定および特徴づけが明らかに必要で
ある。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】１の態様において、本
発明は、ＨＮＦＤＹ２０ポリペプチドならびにその製造
のための組み換え物質および方法に関する。本発明のも
う１つの態様は、ＨＮＦＤＹ２０ポリペプチドおよびポ
リヌクレオチドの使用方法に関する。かかる方法は、と
りわけ、細菌、真菌、原生動物およびウイルス感染のご
とき感染症；詳細にはＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２によ
る感染；痛み；癌；拒食症；大食症；喘息；パーキンソ
ン病；急性心臓疾患；低血圧；高血圧；尿閉；骨粗鬆
症；狭心症；心筋梗塞；潰瘍；アレルギー；良性前立腺
肥大；ならびに不安症、分裂病、躁鬱病、せん妄、痴
呆、重度の精神遅滞および運動障害（例えば、Huntingt
on病またはGilles dela Toutrett症候群）を包含する精
神病および神経学的疾病の治療を包含する。さらにもう
１つの態様において、本発明は、本発明により提供され
る材料を用いるアンタゴニストおよびアゴニストの同定
方法、ならびに同定された化合物を用いるＨＮＦＤＹ２
０のバランス不良関連症状の治療方法に関する。さらに
もう１つの態様は、不適当なＨＮＦＤＹ２０活性または
レベルに関連した疾病の検出のための診断アッセイに関
する。

【０００７】

【課題を解決するための手段および発明の実施の形態】定義 下記定義は、本明細書で頻繁に使用される特定の用語の
理解を容易にするためのものである。「ＨＮＦＤＹ２
０」は、とりわけ、配列番号：２に示すアミノ酸配列を
有するポリペプチド、またはその対立遺伝子変種をい
う。「受容体活性」または「受容体の生物学的活性」
は、該ＨＮＦＤＹ２０の代謝的または生理学的機能をい
い、類似の活性または改善された活性または望ましくな
い副作用を減じられたこれらの活性を包含する。該ＨＮ
ＦＤＹ２０の抗原性活性および免疫原性活性も含まれ
る。「ＨＮＦＤＹ２０遺伝子」は、配列番号：１に示す
ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドまたはその対
立遺伝子変種および／またはその相補物をいう。本明細
書の用語「抗体」は、ポリクローナルおよびモノクロー
ナル抗体、キメラ、１本鎖、ならびにヒト化抗体、さら
にはＦａｂフラグメントを包含し、Ｆａｂまたは他の免
疫グロブリン発現ライブラリーの生成物も包含する。

【０００８】「単離」とは、「人間の手により」天然の
状態から変化させられた、すなわち、それが天然に存在
する場合、元来の環境から変化させるもしくは取り除
く、またはその両方を行ったことを意味する。例えばポ
リヌクレオチドまたはポリペプチドが、天然の状態で生
存動物に存在する場合は、「単離」されていないが、同
一のポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、天然に共
存する物質から分離されている場合は、本明細書に用い
る用語である、「単離」がなされている。

【０００９】「ポリヌクレオチド」とは、一般的には、
修飾されていないＲＮＡもしくはＤＮＡ、または修飾さ
れたＲＮＡもしくはＤＮＡであってよい、任意のポリリ
ボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを
意味する。「ポリヌクレオチド」は、一本鎖および二本
鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物または一本
鎖、二本鎖および三本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一
本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖
領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖もしくはより典型的
には二本鎖もしくは三本鎖、または一本鎖および二本鎖
領域の混合物でよいＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリ
ッド分子を意味するが、これに限定するものではない。
さらに、本明細書で用いるポリヌクレオチドは、ＲＮＡ
もしくはＤＮＡ、またはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含
む三本鎖領域を意味する。用語「ポリヌクレオチド」
は、安定性またはその他の理由により、修飾された骨格
を有するＤＮＡまたはＲＮＡ、ならびに修飾された骨格
を有するＤＮＡまたはＲＮＡを包含する。「修飾され
た」塩基は、例えば、トリチル化塩基およびイノシンの
ごとき通常的でない塩基を包含する。種々の修飾がＤＮ
ＡおよびＲＮＡについて行われており、よって、「ポリ
ヌクレオチド」は、典型的に天然において見いだされる
ポリヌクレオチドの化学的、酵素的または代謝的に修飾
された形態、ならびにウイルスおよび細胞に特徴的なＤ
ＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を包含する。また、「ポ
リヌクレオチド」は、しばしばオリゴヌクレオチドと称
する短いポリヌクレオチドを包含する。

【００１０】「ポリペプチド」は、ペプチド結合または
修飾されたペプチド結合により互いに結合している２個
またはそれ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたは
蛋白を意味する。「ポリペプチド」は、通常、例えばペ
プチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーとも称する短
鎖、および一般的に蛋白と称する長鎖の両方を意味す
る。ポリペプチドは２０種の遺伝子によりコードされた
アミノ酸とは異なるアミノ酸を含有できる。「ポリペプ
チド」には、プロセッシングおよびその他の翻訳後修飾
のような天然のプロセッシングにより修飾されたものが
含まれるが、当業者に周知の化学修飾技術によっても修
飾される。このような修飾は基礎的な参考書およびさら
に詳細な論文ならびに多数の研究文献にも詳しく記載さ
れており、これらは当業者に周知である。修飾は、ペプ
チド骨格、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシ
ル末端等のポリペプチドの任意の部位で行われうる。同
一の型の修飾は該ポリペプチドの幾つかの部位で、同一
または異なる程度で存在し得ることは理解されよう。ま
た、ポリペプチドは多くの型の修飾をも含み得る。ポリ
ペプチドは、ユビキチネーションの結果として分枝状で
あってもよく、分枝を伴うまたは伴わない環状のもので
あってもよい。環状、分枝状および分枝状かつ環状のポ
リペプチドは翻訳後の天然プロセッシングにより生じる
ものであってもよく、あるいは合成法により製造される
ものであってもよい。修飾には、アセチル化、アシル
化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結
合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオ
チド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結
合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、交差架橋、
環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、交差架橋共
有結合形成、シスチン形成、ピログルタメート形成、ホ
ルミル化、ガンマ−カルボキシル化、グリコシル化、Ｇ
ＰＩアンカー形成、水酸化、ヨウ素化、メチル化、ミリ
ストイル化、酸化、蛋白加水分解プロセッシング、リン
酸化、プレニル化、ラセミ化、グリコシル化、脂質結
合、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマ−カルボキシル
化、水酸化およびＡＤＰリボシル化、セレノイル化、硫
酸化、アルギニル化のようなトランスファーＲＮＡ媒介
の蛋白へのアミノ酸の添加、ならびにユビキチネーショ
ンなどがある。例えばProteins-Structure and Molecul
ar Properties、第２版、T.E.Creighton、W.H.Freeman
and Company、ニューヨーク（1993）およびPosttransla
tional Covalent Modification of Proteins、B.C.John
son編、アカデミックプレス、ニューヨーク（1983）のW
old,F.,Posttranslational Protein Modifications：Pe
rspective and Prospects、1〜12頁；Seifterら、Meth.
Enzymol.182:626-646（1990）およびRattanら、Protein
Synthesis：Posttranslational Modifications and Ag
ing，Ann.N.Y.Acad.Sci.663:48-62（1992）参照。

【００１１】本明細書で用いる「変種」なる用語は、対
照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは各々異なる
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドであるが、本質的
な特性は保持している。典型的なポリヌクレオチドの変
種は、別の対照ポリヌクレオチドとはヌクレオチド配列
が異なる。変種のヌクレオチド配列の差異は、対照ポリ
ヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのアミノ
酸配列を変化させるものであってもよく、変化させない
ものであってもよい。ヌクレオチドの変化は結果的に、
以下に論じるように、対照配列によりコードされるポリ
ペプチドにおけるアミノ酸置換、付加、欠損、融合およ
び末端切断を招く。典型的なポリペプチドの変種は、別
の対照ポリペプチドとはアミノ酸配列が異なる。一般的
には、差異は、対照ポリペプチドおよび変種の配列が全
体的に非常に類似しており、多くの領域で同一であるよ
うに限定される。変種および対照ポリペプチドは、１ま
たはそれ以上の置換、付加、欠損が任意の組み合わせで
起こることにより、アミノ酸配列が変化し得る。置換ま
たは挿入されたアミノ酸残基は、遺伝学的コードにより
コードされたものであってもなくてもよい。ポリヌクレ
オチドまたはポリペプチドの変種は、例えば対立遺伝子
変種のような天然発生のものでよいか、または天然に発
生することが知られていない変種でよい。ポリヌクレオ
チドおよびポリペプチドの非天然発生変種は、突然変異
技術、直接的合成、および当業者に既知のその他の組換
え技術により製造できる。

【００１２】「同一性」とは、ヌクレオチド配列または
アミノ酸配列の同一性の尺度である。一般的には、最高
の合致が得られるように配列を並置する。「同一性」は
それ固体当該分野において認識された意味を有し、公表
された方法を用いて算出できる。例えば、Computationa
l Molecular Biology，Lesk,A.M.編、オックスフォード
・ユニバーシティー・プレス、ニューヨーク、1988年；
Biocomputing：Informatics and Genome Projects，Smi
th,D.W.編、アカデミック・プレス、ニューヨーク、199
3年；Computer Analysis of Sequence Data，パート
Ｉ，Griffin,A.M.およびGriffin,H.G.編、ヒューマン・
プレス、ニュージャージー、1994年；Sequence Analysi
s in Molecular Biology，von Heinje,G.、アカデミッ
ク・プレス、1987年；およびSequence Analysis Prime
r，Gribskov,M.およびDevereux,J.編、Ｍストックトン
・プレス、ニューヨーク、1991年）。二つの配列の同一
性を測定する方法は多くあるが、用語「同一性」は当業
者によく知られている（Sequence Analysis in Molecul
ar Biology，von Heinje,G.、アカデミック・プレス、1
987年；Sequence Analysis Primer，Gribskov,M.および
Devereux,J.編、Ｍストックトン・プレス、ニューヨー
ク、1991年；ならびにCarillo,H.およびLipman,D.，SIA
M J.Applied Math.，48:1073（1988））。配列間の同一
性または類似性を測定するために通常用いられる方法は
Carillo,H.およびLipman,D.，SIAM J.Applied Math.，4
8:1073（1988）等に開示されているが、これらに限定す
るものではない。同一性および類似性を決定する方法
は、公に入手できるコンピュータープログラムに集成さ
れている。二つの配列間の同一性および類似性を測定す
る好ましいコンピュータープログラム法には、ＧＣＧプ
ログラムパッケージ（Devereux,J.ら、Nucleic Acids R
esearch 12(1):387（1984）、BLASTP、BLASTN、およびF
ASTA（Atschul,S.F.ら、J.Molec.Biol.215:403-410（19
90）））等があるが、これらに限定するものではない。

【００１３】本発明のポリペプチド １の態様において、本発明はＨＮＦＤＹ２０ポリペプチ
ドに関する。該ポリペプチドは、配列番号：２のポリペ
プチド；および配列番号：２のアミノ酸配列を含むポリ
ペプチド；および配列番号：２に対して全長にわたり少
なくとも８０％の同一性、さらに好ましくは少なくとも
９０％の同一性、そのうえさらに好ましくは配列番号：
２に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸
配列を含むポリペプチドを包含する。また、配列番号：
２のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して全長に
わたり少なくとも８０％の同一性、さらに好ましくは少
なくとも９０％の同一性、そのうえさらに好ましくは配
列番号：２に対して少なくとも９５％の同一性を有する
アミノ酸配列を有するポリペプチドもＨＮＦＤＹ２０ポ
リペプチドに含まれる。好ましくは、ＨＮＦＤＹ２０ポ
リペプチドは、その受容体の生物学的活性のうちの少な
くとも１つを示す。

【００１４】ＨＮＦＤＹ２０ポリペプチドは「成熟」蛋
白の形態であってもよく、あるいは融合蛋白のごとき大
型の蛋白の一部であってもよい。分泌またはリーダー配
列、プロ配列、複数のヒスチジン残基のごとき精製を促
進する配列、または組み換え生産を行っている間の安定
性のためのさらなる配列を含むさらなるアミノ酸配列を
含んでいることがしばしば有利である。

【００１５】ＨＮＦＤＹ２０ポリペプチドの生物学的に
活性のあるフラグメントも本発明に包含される。フラグ
メントは、前述のＨＮＦＤＹ２０ポリペプチドのアミノ
酸配列のすべてではなく一部に対して全く同一であるア
ミノ酸配列を有するポリペプチドである。ＨＮＦＤＹ２
０ポリペプチドについては、フラグメントは「独立して
存在するもの（free standing）」であるか、あるいは
より大きなポリペプチド内に含まれていてもよく、その
中でフラグメントは一部分もしくは領域を形成してい
る。最も好ましくは、単一の連続した領域として、より
大きなポリペプチドに含まれる。本発明ポリペプチドフ
ラグメントの典型例は、例えば、ＨＮＦＤＹ２０ポリペ
プチドのアミノ酸番号約１〜２０、２１〜４０、４１〜
６０、６１〜８０、８１〜１００および１０１から末端
までからなるフラグメントを包含する。この意味におい
て、「約」とは、片方の端または両端において、示され
た数よりも数個、５個、４個、３個、２個または１個多
いかまたは少ない範囲を含む。

【００１６】好ましいフラグメントは、例えば、アミノ
末端を含む一連の残基が欠失、またはカルボキシ末端を
含む一連の残基が欠失、あるいは一方がアミノ末端でも
う一方がカルボキシ末端を含む２種の一連の残基が欠失
していること以外はＨＮＦＤＹ２０ポリペプチドのアミ
ノ酸配列を有する末端切断ポリペプチドを包含する。ま
た、構造的または機能的属性により特徴づけられるフラ
グメント、例えばアルファーヘリックスおよびアルファ
ーヘリックス形成領域、ベータシートおよびベータシー
ト形成領域、ターンおよびターン形成領域、コイルおよ
びコイル形成領域、親水性領域、疎水性領域、アルファ
ー両親媒性領域、ベータ両親媒性領域、可変領域、表面
形成領域、基質結合領域、および高抗原性指標領域を含
むフラグメントなども好ましい。受容体活性を媒介す
る、生物学的に活性な領域も好ましく、類似の活性もし
くは改善された活性のある、または望ましくない活性を
減じたフラグメント等がある。動物、とりわけヒトにお
いて抗原的または免疫原的なフラグメントもまた含まれ
る。

【００１７】好ましくは、これらのポリペプチドのすべ
ては、抗原的活性を包含する受容体の生物学的活性を保
持している。上記配列およびフラグメントの変種もこの
グループに含まれる。好ましい変種は、保存的アミノ酸
置換により変化したものであり、すなわち、同様の特徴
を有するアミノ酸により置換されているものである。典
型的なかかる置換は、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩ
ｌｅ間：ＳｅｒおよびＴｈｒ間；ＡｓｐおよびＧｌｕ
間；ＡｓｎおよびＧｌｎ間；ならびに塩基性残基Ｌｙｓ
およびＡｒｇ間；あるいは芳香族残基ＰｈｅおよびＴｙ
ｒ間におけるものである。数個、５ないし１０個、１な
いし５個、または１ないし２個のアミノ酸がいずれかの
組み合わせで置換、欠失または付加されている変種が特
に好ましい。

【００１８】いずれの適当な方法でも本発明ＨＮＦＤＹ
２０ポリペプチドを製造することができる。かかるポリ
ペプチドは、単離された天然ポリペプチド、組み換え法
によるポリペプチド、合成法によるポリペプチド、また
はこれらの方法の組み合わせによるポリペプチドを包含
する。かかるポリペプチドの製造手段は当該分野におい
てよく理解されている。

【００１９】本発明のポリヌクレオチド 本発明のもう１つの態様は、ＨＮＦＤＹ２０ポリヌクレ
オチドに関する。ＨＮＦＤＹ２０ポリヌクレオチドは、
ＨＮＦＤＹ２０ポリペプチドおよびフラグメントをコー
ドしている単離ポリヌクレオチド、ならびにそれらに密
接に関連しているポリヌクレオチドを包含する。より詳
細には、本発明ＨＮＦＤＹ２０ポリヌクレオチドは、配
列番号：２のＨＮＦＤＹ２０ポリペプチドをコードして
いる配列番号：１に示すヌクレオチド配列を含むポリヌ
クレオチド、ならびに配列番号：１の特定の配列を有す
るポリヌクレオチドを包含する。さらにＨＮＦＤＹ２０
ポリヌクレオチドは、配列番号：２のＨＮＦＤＹ２０ポ
リペプチドをコードしているポリヌクレオチドに対して
全長にわたり少なくとも８０％の同一性を有するヌクレ
オチド配列を含むポリヌクレオチド、配列番号：１の配
列を有するポリヌクレオチドに対して全長にわたり少な
くとも８０％の同一性を有するポリヌクレオチドを含
む。この点において、詳細には、少なくとも９０％同一
であるポリヌクレオチドが好ましく、少なくとも９５％
同一であるものが特に好ましい。さらにそのうえ、少な
くとも９７％同一のものが非常に好ましく、少なくとも
９８−９９％同一のものが最も非常に好ましく、９９％
同一のものが最高に好ましい。配列番号：１に含まれる
ヌクレオチド配列に対して十分な同一性を有し、増幅に
使用可能であるかまたはプローブもしくはマーカーとし
て使用される条件下でハイブリダイゼーションするヌク
レオチド配列もＨＮＦＤＹ２０ポリヌクレオチドに包含
される。また本発明は、かかるＨＮＦＤＹ２０ポリヌク
レオチドに対して相補的なポリヌクレオチドも提供す
る。

【００２０】ヒト・ＨＮＦＤＹ２０をコードしているｃ
ＤＮＡの配列決定の結果により示されるように、本発明
ＨＮＦＤＹ２０は、Ｇ蛋白結合受容体の他の蛋白に構造
的に関連している。そのｃＤＮＡ配列は４０１個のアミ
ノ酸の読み枠を含んでいる。表２のアミノ酸配列（配列
番号：２）は、スロンビン受容体に対して２９９個のア
ミノ酸残基において約３０．８％の同一性（FASTAを用
いた場合）を有する（Coughlin,S.R.et al,AC#P25116,C
ell,64:1057-1068,1993）。さらにそのうえ、ＨＮＦＤ
Ｙ２０（配列番号：２）は、キセノプス・ラエビス（Xe
nopus laevis）のスロンビン受容体に対して３７０個の
アミノ酸について２６．５％同一である（Coughlin,S.
R.et al,AC#P47749,Nature 368:648-651,1994）。さら
にそのうえ、ＨＮＦＤＹ２０（配列番号：２）は、ＡＴ
Ｐ受容体に対して２９０個のアミノ酸残基について２
７．２％同一である（AC#P3383,Lustig,K.D.et al,Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA.90:5113-5117,1993）。さらにそ
のうえ、ＨＮＦＤＹ２０（配列番号：２）は、Ｐ−２Ｕ
ヌクレオチド受容体に対して２８８個のアミノ酸残基に
ついて２８．５％同一である（米国特許#5596088）。表
１（配列番号：１）のヌクレオチド配列は、ＣＤ２２ゲ
ノムＤＮＡの雑多な部分に対して１８４１個のヌクレオ
チドにおいて約９９．９４％の同一性（BLASTを用いた
場合）を有する（AC#U62631,Kehrl,J.H.et al）。さら
にそのうえ、ＨＮＦＤＹ２０（配列番号：１）は、ヒト
・Ｇ蛋白結合受容体ポリヌクレオチドに対して２１４個
のヌクレオチド残基について５７．０１％同一である
（AC#U35399,Goetzl,E.J.未公表）。

【００２１】表１および表２は、ヒト・ＨＮＦＤＹ２０
からのヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列（それぞれ
配列番号：１および配列番号：２）

【表１】

【表２】

【００２２】標準的クローニングおよびスクリーニング
を用い、ヒト・精巣細胞およびヒト・肝臓細胞中のｍＲ
ＮＡ由来のｃＤＮＡライブラリーから、発現配列タグ
（ＥＳＴ）分析（Adams,M.D.,et al.Science(1991)252:
1651-1656;Adams,M.D.et al.,Nature(1992)355:632-63
4;Adams,M.D.,et al.,Nature(1995)377 Supp:3-174）を
用いて、ＨＮＦＤＹ２０をコードしている本発明の１の
ポリヌクレオチドを得てもよい。ゲノムＤＮＡライブラ
リーのごとき天然起源から本発明ポリヌクレオチドを得
ることもでき、あるいはよく知られ市販されている手段
方法を用いて合成することもできる。

【００２３】配列番号：２のＨＮＦＤＹ２０ポリペプチ
ドをコードしているヌクレオチド配列は、その全長にわ
たり表１のコーディング配列（配列番号：１）に対して
同一であってもよく、あるいは配列番号：２のポリペプ
チドをコードしているヌクレオチド配列の縮重の結果生
じる配列であってもよく、あるいは配列番号：２のポリ
ペプチドをコードしているヌクレオチド配列に対して高
度な同一性を有するものであってもよい。好ましくは、
本発明ポリヌクレオチドは、ＨＮＦＤＹ２０ポリペプチ
ドをコードしているヌクレオチド配列に対して非常に同
一、少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列、あ
るいはＨＮＦＤＹ２０ポリペプチドをコードしている表
１（配列番号：１）に含まれる配列に対して少なくとも
８０％同一であるヌクレオチド配列、あるいは配列番
号：２のポリペプチドをコードしているヌクレオチド配
列に対して少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配
列を含む。

【００２４】本発明ポリヌクレオチドをＨＮＦＤＹ２０
ポリペプチドの組み換え生産に用いる場合、ポリヌクレ
オチドはそれ自体、成熟ポリペプチドまたはそのフラグ
メントのコーディング配列を含むものであってもよく；
あるいは他のコーディング配列を伴った読み枠中の成熟
ポリペプチドまたはフラグメントのコーディング配列を
含むものであってもよい。他のコーディング配列として
は、例えば、リーダーまたは分泌配列、プレ、プロ、プ
レプロ蛋白配列をコードするコーディング配列、または
他の融合ペプチド部分が挙げられる。例えば、融合ポリ
ペプチドの精製を促すマーカー配列をコードしていても
よい。本発明のこの態様の１の好ましい具体例におい
て、マーカー配列は、ｐＱＥベクター（Qiagen,Inc.）
中に提供されるようなヘキサ−ヒスチジンペプチド（Ge
ntzら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA，86:821-824（1989）
に記載される）またはＨＡタグ（Wilsonら、Cell，37:7
67（1984））である。また本発明のポリヌクレオチド
は、転写配列、非翻訳配列、スプライシングおよびポリ
アデニル化シグナル、リボソーム結合部位、ｍＲＮＡを
安定化する配列のごとき非コーディング５'および３'配
列を含有していてもよい。

【００２５】さらに好ましい具体例は、表２（配列番
号：２）に示すＨＮＦＤＹ２０ポリペプチドのアミノ酸
配列を含むＨＮＦＤＹ２０変種をコードしているポリヌ
クレオチドであり、数個、５ないし１０個、１ないし５
個、１ないし３個、１ないし２個または１個のアミノ酸
残基がいずれかの組み合わせで置換、欠失または付加さ
れているものである。さらに本発明は、上記配列にハイ
ブリダイゼーションするポリヌクレオチドにも関する。
この点において、特に本発明は、厳密な条件下で上記ポ
リヌクレオチドにハイブリダイゼーションするポリヌク
レオチドに関連する。本明細書の用語「厳密な条件」と
は、配列間に少なくとも９５％、好ましくは少なくとも
９７％の同一性がある場合にのみハイブリダイゼーショ
ンが起こることを意味する。

【００２６】配列番号：１に含まれるヌクレオチド配列
に対して同一または十分に同一である本発明ポリヌクレ
オチドをｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ用のハイブリダイ
ゼーションプローブとして用いて、全長のｃＤＮＡおよ
びＨＮＦＤＹ２０をコードしているゲノムクローンを単
離し、またＨＮＦＤＹ２０遺伝子に対して高い類似性を
有する配列を有する他の遺伝子のｃＤＮＡおよびゲノム
クローンを単離してもよい。かかるハイブリダイゼーシ
ョン法は当業者に知られている。典型的には、これらの
ヌクレオチド配列は、対照に対して７０％、好ましくは
８０％、より好ましくは９０％の同一性を有する。一般
的には、プローブは少なくとも１５個のヌクレオチドを
含むであろう。好ましくは、かかるプローブは少なくと
も３０個のヌクレオチドを有し、少なくとも５０個のヌ
クレオチドを有していてもよい。特に好ましいプローブ
は３０ないし５０個の範囲のヌクレオチドを含む。

【００２７】１の具体例において、Ｇ蛋白結合受容体を
コードしているポリヌクレオチドを得ることは、配列番
号：１の配列またはそのフラグメント配列を有する標識
プローブを用いて厳密なハイブリダイゼーション条件下
で適当なライブラリーをスクリーニングし、次いで、該
ポリヌクレオチド配列を含有する全長のｃＤＮＡおよび
ゲノムクローンを単離する工程を含む。かかるハイブリ
ダイゼーション法は当業者によく知られている。厳密な
ハイブリダイゼーション条件は上で定義したものである
か、または５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（１５０ｍ
Ｍ ＮａＣｌ、１５ｍＭ クエン酸三ナトリウム）、５０
ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５ｘデンハー
ツ溶液、１０％デキストラン硫酸、および２０マイクロ
グラム／ｍｌの変性剪断サケ・精子ＤＮＡを含む溶液
中、４２℃で一晩、次いで、約６５℃において０．１ｘ
ＳＳＣ中での洗浄といった条件であってもよい。本発明
ポリヌクレオチドおよびポリペプチドを、動物およびヒ
トの疾病の治療および診断のための研究試薬および材料
として用いてもよい。

【００２８】ベクター、宿主細胞、発現 本発明はまた、ポリヌクレオチドまたは本発明のポリヌ
クレオチドを含むベクター、本発明のベクターで遺伝子
操作される宿主細胞ならびに組換え法による本発明のポ
リペプチドの製造にも関する。本発明ＤＮＡ構築物由来
のＲＮＡを用て、無細胞翻訳系を用いてかかる蛋白を製
造することもできる。組換え体を製造するために、宿主
細胞を遺伝子操作して、発現系もしくはそれらの一部、
または本発明のポリヌクレオチドを組み込むことができ
る。ポリヌクレオチドの宿主細胞への導入は、例えば、
Davisら、Basic Methods in Molecular Biology（198
6）；Sambrookら、Molecular Cloning；A Laboratory M
anual、第２版；コールド・スプリング・ハーバー・ラ
ボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバ
ー、ニューヨーク（1989）のごとき多くの標準的な実験
マニュアルに記載される方法により行うことができ、例
えばリン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ
−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベ
クション、マイクロインジェクション、陽イオン脂質媒
介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形
質導入、スクレープ負荷（scrape loading）、バリステ
ィック導入（ballistic introduction）および感染等が
ある。

【００２９】適当な宿主の代表的なものには、細菌細
胞、例えば連鎖球菌属（streptococci）、ブドウ球菌属
（staphylococci）、大腸菌（E.coli）、ストレプトミ
セス（Streptomyces）および枯草菌（Bacillus subtii
s）細胞；真菌細胞、例えば酵母細胞およびアスペルギ
ルス属（Aspergillus）細胞；昆虫細胞、例えばドロソ
フィラＳ２（Drosophila S2）およびスポドプテラＳｆ
９（Spodoptera Sf9）細胞；動物細胞例えばＣＨＯ、Ｃ
ＯＳ、ＨｅＬａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、２９３お
よびボウズ（Bows）メラノーマ細胞；ならびに植物細胞
等がある。

【００３０】本発明のポリペプチドを製造するために非
常に多くの発現系を使用できる。このようなベクターに
は、染色体、エピソームおよびウイルス由来のベクタ
ー、例えば細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由
来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由来、挿入エ
レメント由来、酵母染色体エレメント由来、例えばバキ
ュロウイルス、パポバウイルス、例えばＳＶ４０、ワク
シニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性
狂犬病ウイルスおよびレトロウイルス等のウイルス由来
のベクター、ならびにそれらを組み合わせたものに由来
するベクター、例えばプラスミドおよびバクテリオファ
ージの遺伝学的エレメント由来のベクター、例えばコス
ミドおよびファージミド等がある。発現系の構築物には
発現を制御および引き起こす調節領域を含有できる。通
常、宿主中にポリヌクレオチドを保持、伸長または発現
するのに、および／またはポリペプチドを発現するのに
適した任意の系またはベクターを、この点に関する発現
に使用できる。周知のおよび通常的な種々の任意の技術
により、適当なＤＮＡ配列を発現系に挿入でき、例えば
Sambrookら、Molecular Cloning，A Laboratory Manual
（上記）に記載されている。

【００３１】翻訳蛋白を、小胞体内腔、ペリプラスミッ
クスペースまたは細胞外環境へ分泌させるために、適当
な分泌シグナルを発現するポリペプチドに組み込むこと
ができる。これらのシグナルはポリペプチドに本来的な
ものであってもく、あるいは異種性のシグナルであって
もよい。

【００３２】ＨＮＦＤＹ２０ポリペプチドをスクリーニ
ングアッセイのために発現させる場合、一般的には、細
胞表面にポリペプチドを生産させるのが好ましい。この
場合、スクリーニングアッセイに使用する前に細胞を集
めてもよい。ＨＮＦＤＹ２０ポリペプチドを培地中でス
クリーニングする場合、培地を回収し、ポリペプチドを
回収し精製することができる。細胞内に生成される場
合、まず細胞を溶解し、次いで、ポリペプチドを回収し
なければならない。

【００３３】ＨＮＦＤＹ２０ポリペプチドは周知の方法
により、組換え細胞培養物から回収および精製でき、そ
の方法には例えば硫酸アンモニウムまたはエタノール沈
殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラ
フィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性
相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィ
ー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよび
レクチンクロマトグラフィー等がある。高速液体クロマ
トグラフィーを精製に用いるのが最も好ましい。ポリペ
プチドが単離および／または精製中に変性した場合、再
び活性な立体配座にするために、蛋白再生のための周知
の技法を用いることができる。

【００３４】診断アッセイ 本発明は、診断試薬としての本発明ＨＮＦＤＹ２０ポリ
ヌクレオチドの使用にも関する。機能不全に関連した変
異形態のＨＮＦＤＹ２０遺伝子の検出は、ＨＮＦＤＹ２
０の発現不足、過剰発現または変化した発現から生じる
疾病またはかかる疾病に対する感受性を決定するための
診断的手段を提供するであろう。ＨＮＦＤＹ２０遺伝子
における変異を有する個体を、種々の方法によりＤＮＡ
レベルで検出してもよい。診断用の核酸は、感染個体の
細胞、例えば血液、尿、唾液、組織生検または剖検材料
から得てもよい。ゲノムＤＮＡを検出に直接使用しても
よく、あるいは分析前にＰＣＲもしくはその他の増幅法
を用いることにより酵素的に増幅してもよい。ＲＮＡま
たはｃＤＮＡを同様に用いてもよい。正常遺伝子型との
比較において、増幅生成物のサイズ変化により欠失およ
び挿入を検出することができる。増幅ＤＮＡを標識ＨＮ
ＦＤＹ２０ヌクレオチド配列にハイブリダイゼーション
させることにより点突然変異を同定することができる。
ＲＮアーゼ消化により、または融解温度の差により、完
全に対合した配列を誤対合二重らせんから区別すること
ができる。ＤＮＡ配列の相違はまた、変性物質含有また
は不含のゲル中のＤＮＡフラグメントの電気泳動の移動
度の変化を検出することにより、または直接的なＤＮＡ
配列決定により検出できる。例えばMeyers et.al.Scien
ce，230:1242（1985）参照。特異的な位置での配列の変
化はまた、ヌクレアーゼ保護アッセイ、例えばＲＮアー
ゼおよびＳ１保護または化学的切断法によっても明らか
にすることができる。例えばCotton et al.Proc.Natl.A
cad.Sci.,USA，85:4397-4401（1985）参照。もう１つの
具体例において、ＨＮＦＤＹ２０ヌクレオチドまたはそ
のフラグメントを含むオリゴヌクレオチドプローブのア
レイ（array）を構築して、例えば遺伝学的変異の効果
的なスクリーニングを行うことができる。アレイ法はよ
く知られており、広い適用範囲を有し、遺伝子発現、遺
伝学的連関、および遺伝学的変異可能性を包含する分子
遺伝学における種々の問題を調べるために用いられうる
（例えば、M.Chee et al.,Science.Vol 274,pp 610-613
(1996)参照）。

【００３５】診断アッセイは、本明細書記載の方法によ
りＨＮＦＤＹ２０遺伝子の変異を検出することにより、
細菌、真菌、原生動物およびウイルス感染のごとき感染
症；詳細にはＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２による感染；
痛み；癌；拒食症；大食症；喘息；パーキンソン病；急
性心臓疾患；低血圧；高血圧；尿閉；骨粗鬆症；狭心
症；心筋梗塞；潰瘍；アレルギー；良性前立腺肥大；な
らびに不安症、分裂病、躁鬱病、せん妄、痴呆、重度の
精神遅滞および運動障害（例えば、Huntington病または
Gilles dela Toutrett症候群）を包含する精神病および
神経学的疾病の診断方法またはかかる疾病に対する感受
性の診断方法を提供する。

【００３６】さらに、対象由来の試料の異常に上昇また
は低下したＨＮＦＤＹ２０ポリペプチドまたはＨＮＦＤ
Ｙ２０ ｍＲＮＡレベルを調べることを特徴とする方法
によって、特に、細菌、真菌、原生動物およびウイルス
感染のごとき感染症；詳細にはＨＩＶ−１またはＨＩＶ
−２による感染；痛み；癌；拒食症；大食症；喘息；パ
ーキンソン病；急性心臓疾患；低血圧；高血圧；尿閉；
骨粗鬆症；狭心症；心筋梗塞；潰瘍；アレルギー；良性
前立腺肥大；ならびに不安症、分裂病、躁鬱病、せん
妄、痴呆、重度の精神遅滞および運動障害（例えば、Hu
ntington病またはGilles dela Toutrett症候群）を包含
する精神病および神経学的疾病を診断することができ
る。ＨＮＦＤＹ２０ポリヌクレオチドの発現の増加また
は低下を、ポリヌクレオチドの定量法として当該分野で
周知の方法の任意の方法、例えば増幅、ＰＣＲ、ＲＴＰ
ＣＲ、ＲＮアーゼ保護、ノーザンブロッティングおよび
その他のハイブリダイゼーション法を用いてＲＮＡレベ
ルで測定することができる。宿主由来の試料中のＨＮＦ
ＤＹ２０蛋白レベルを決定するために用いることができ
るアッセイ法は当業者に周知である。このようなアッセ
イ法には、ラジオイムノアッセイ、競争結合アッセイ、
ウェスタンブロット分析およびＥＬＩＳＡアッセイ等が
ある。

【００３７】染色体アッセイ 本発明ヌクレオチド配列は染色体の同定にも価値があ
る。該配列は、個々のヒト・染色体上の特定の位置を標
的とし、これにハイブリダイゼーションしうる。本発明
による重要な配列の染色体へのマッピングは、それらの
配列を遺伝子関連疾病と関連づける重要な第１工程であ
る。配列を正確な染色体位置にマッピングしたならば、
染色体上の配列の物理的位置を遺伝学的地図のデータと
関連づけることができる。かかるデータは、例えば、V.
McKusick,Mendelian Inheritance in Man（Johns Hopki
ns University Welch Medical Libraryからオンライン
で利用できる）に見いだされる。次いで、連関（物理的
に近接した遺伝子の同時遺伝）の分析により、同じ染色
体領域にマッピングされた遺伝子と疾病との関係を同定
する。罹病個体と未罹病個体との間のｃＤＮＡまたはゲ
ノム配列の相違も調べることができる。罹病個体のいく
つかまたは全部において変異が観察されるが正常個体に
おいては観察されない場合、その変異は疾病の原因であ
る可能性がある。

【００３８】抗体 本発明のポリペプチドもしくはそれらの変種、またはそ
れらを発現する細胞を免疫原として用いて、ＨＮＦＤＹ
２０ポリペプチドに対して免疫特異的な抗体を製造する
こともできる。用語「免疫特異的」は、先行技術の他の
関連ポリペプチドに対するアフィニティーよりも、本発
明ポリペプチドに対するアフィニティーが実質的に大き
いことを意味する。ポリペプチドまたはエピトープが付
いたフラグメント、アナログまたは細胞を、好ましくは
ヒトはでない動物に通常の実験法を用いて投与すること
により、ＨＮＦＤＹ２０ポリペプチドに対して生じる抗
体を得ることができる。連続的細胞系培養により産生さ
れる抗体を提供する、当業者周知の技術を用いて、モノ
クローナル抗体を調製することができる。実例として
は、ハイブリドーマ法（Kohler,G. and Milstein,C.，N
ature，256:495-497（1975））；トリオーマ法（Kozbor
et al.Immunology Today，4:72（1983））；およびＥＢ
Ｖ−ハイブリドーマ法（Cole et al.Monoclonal Antibo
dies and Cancer Therapy,Alan R Liss,Inc.,77-96頁
（1985））に記載されるような種々の技法がある。

【００３９】一本鎖抗体の産生のために記載された技術
（米国特許第４９４６７７８号）は、本発明のポリペプ
チドに対する一本鎖抗体を産生するのに適用できる。ま
た、トランスジェニックマウス、または他の哺乳動物を
包含する他の生物を用いてヒト化抗体を発現させてもよ
い。上記抗体を用いて、ポリペプチドを発現するクロー
ンを単離または同定してもよく、あるいはアフィニティ
ークロマトグラフィーによりポリペプチドを精製しても
よい。

【００４０】ＨＮＦＤＹ２０ポリペプチドに対する抗体
を用いて、とりわけ、細菌、真菌、原生動物およびウイ
ルス感染のごとき感染症；詳細にはＨＩＶ−１またはＨ
ＩＶ−２による感染；痛み；癌；拒食症；大食症；喘
息；パーキンソン病；急性心臓疾患；低血圧；高血圧；
尿閉；骨粗鬆症；狭心症；心筋梗塞；潰瘍；アレルギ
ー；良性前立腺肥大；ならびに不安症、分裂病、躁鬱
病、せん妄、痴呆、重度の精神遅滞および運動障害（例
えば、Huntington病またはGilles dela Toutrett症候
群）を包含する精神病および神経学的疾病を治療しても
よい。

【００４１】ワクチン 本発明のもう１つの態様は、哺乳動物における免疫学的
反応を誘起する方法に関し、該方法は、抗体および／ま
たはＴ細胞を産生させるに十分なＨＮＦＤＹ２０または
そのフラグメントを哺乳動物に接種して、とりわけ、細
菌、真菌、原生動物およびウイルス感染のごとき感染
症；詳細にはＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２による感染；
痛み；癌；拒食症；大食症；喘息；パーキンソン病；急
性心臓疾患；低血圧；高血圧；尿閉；骨粗鬆症；狭心
症；心筋梗塞；潰瘍；アレルギー；良性前立腺肥大；な
らびに不安症、分裂病、躁鬱病、せん妄、痴呆、重度の
精神遅滞および運動障害（例えば、Huntington病または
Gilles dela Toutrett症候群）を包含する精神病および
神経学的疾病から該動物を防御することを特徴とする。
本発明のさらにもう１つの態様は、哺乳動物における免
疫学的応答を誘導する方法に関し、該方法は、ＨＮＦＤ
Ｙ２０ポリペプチドをインビボで発現させるための核酸
ベクターを送達して、かかる免疫学的応答を誘導し、該
動物を疾患から保護する抗体を生じさせることを特徴と
する。

【００４２】本発明のさらなる態様は免疫学的ワクチン
処方（組成物）に関し、それは、哺乳動物宿主中に導入
された場合、ＨＮＦＤＹ２０ポリペプチドに対する哺乳
動物の免疫学的応答を誘導する。該組成物はＨＮＦＤＹ
２０ポリペプチドまたはＨＮＦＤＹ２０遺伝子を含んで
なる。ワクチン処方は、さらに適当な担体を含んでいて
もよい。ＨＮＦＤＹ２０ポリペプチドは胃で分解される
可能性があるので、好ましくは非経口投与する（皮下、
筋肉内、静脈、皮内等への注射を包含）。非経口投与に
適した処方は、抗酸化剤、バッファー、静細菌剤および
処方をレシピエントの血液と等張にする溶質を含んでい
てもよい水性または非水性滅菌注射用溶液；ならびに懸
濁剤または増粘剤を含んでいてもよい水性または非水性
滅菌懸濁液を包含する。処方を１回量または複数回量と
して容器に入れて提供してもよく、例えば、密封アンプ
ルおよびバイアルに入れて提供してもよく、また使用直
前に滅菌液体担体の添加のみを必要とする凍結乾燥状態
として保存してもよい。またワクチン処方は、水中油系
および当該分野で知られた他の系のごとき処方の免疫原
性を高めるためのアジュバント系を含んでいてもよい。
用量は、個々のワクチンの活性に左右され、通常の実験
により容易に決定することができる。

【００４３】スクリーニングアッセイ 本発明受容体ポリペプチドに結合してこれを活性化（ア
ゴニスト）または阻害（アンタゴニスト）する化合物に
ついてのスクリーニングプロセスにおいて本発明ＨＮＦ
ＤＹ２０ポリペプチドを用いてもよい。よって、本発明
ポリペプチドを用いて、例えば細胞、無細胞調製物、化
学ライブラリーおよび天然産物混合物中において、小型
分子基質およびリガンドの結合を評価してもよい。これ
らの基質およびリガンドは天然の基質およびリガンドで
あってもよく、あるいは構造または機能を模倣したもの
であってもよい。Coligan et al.,Current Protocols i
nImmunology 1(2):Chapter5(1991)参照。

【００４４】ＨＮＦＤＹ２０蛋白は哺乳動物宿主に広く
存在し、多くの生物学的機能に関与しており、多くの病
気にもかかわっている。したがって、ＨＮＦＤＹ２０を
刺激する化合物および薬剤、あるいはまたＨＮＦＤＹ２
０を阻害しうる化合物または薬剤を見いだすことが望ま
れる。一般的には、細菌、真菌、原生動物およびウイル
ス感染のごとき感染症；詳細にはＨＩＶ−１またはＨＩ
Ｖ−２による感染；痛み；癌；拒食症；大食症；喘息；
パーキンソン病；急性心臓疾患；低血圧；高血圧；尿
閉；骨粗鬆症；狭心症；心筋梗塞；潰瘍；アレルギー；
良性前立腺肥大；ならびに不安症、分裂病、躁鬱病、せ
ん妄、痴呆、重度の精神遅滞および運動障害（例えば、
Huntington病またはGilles dela Toutrett症候群）を包
含する精神病および神経学的疾病のごとき症状を治療ま
たは予防するためにアゴニストが用いられる。細菌、真
菌、原生動物およびウイルス感染のごとき感染症；詳細
にはＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２による感染；痛み；
癌；拒食症；大食症；喘息；パーキンソン病；急性心臓
疾患；低血圧；高血圧；尿閉；骨粗鬆症；狭心症；心筋
梗塞；潰瘍；アレルギー；良性前立腺肥大；ならびに不
安症、分裂病、躁鬱病、せん妄、痴呆、重度の精神遅滞
および運動障害（例えば、Huntington病またはGilles d
ela Toutrett症候群）を包含する精神病および神経学的
疾病のごとき症状の種々の治療または予防のためにアン
タゴニストを用いてもよい。

【００４５】一般的には、かかるスクリーニング手順
は、細胞表面に本発明受容体ポリペプチドを発現する適
当な細胞を製造することを含む。かかる細胞は、哺乳動
物由来の細胞、酵母、DrosophilaまたはE.coliを包含す
る。次いで、受容体発現細胞（または発現された受容体
を含む細胞膜）を試験化合物と接触させて、結合または
機能的応答の刺激もしくは阻害を観察する。

【００４６】１のスクリーニング方法は、本発明受容体
を発現する細胞（例えば、トランスフェクションされた
ＣＨＯ細胞）を使用し、系において受容体活性化により
引き起こされる細胞外ｐＨまたは細胞内カルシウム変化
を測定することを用いる。この方法において、本発明受
容体ポリペプチドを発現する細胞に化合物を接触させて
もよい。次いで、第２のメッセンジャー応答、例えば、
シグナル伝達、ｐＨ変化、またはカルシウムレベル変化
を測定して候補化合物が受容体を活性化または阻害する
かどうかを決定する。

【００４７】もう１つの方法は、受容体により伝達され
るｃＡＭＰおよび／またはアデニレートシクラーゼ蓄積
の阻害または刺激を調べることにより受容体阻害剤をス
クリーニングすることを包含する。かかる方法は、本発
明受容体で真核細胞をトランスフェクションして細胞表
面に受容体を発現させることを用いる。次いで、本発明
受容体存在下において細胞を候補アンタゴニストと接触
させる。次いで、ｃＡＭＰ蓄積量を測定する。候補アン
タゴニストが受容体に結合し、受容体結合を阻害する場
合には、受容体により伝達されるｃＡＭＰのレベルまた
はアデニレートシクラーゼ活性が低下または上昇するで
あろう。

【００４８】本発明受容体のアゴニストまたはアンタゴ
ニストを検出するためのもう１つの方法は、米国特許第
５４８２８３５号記載の酵母による方法である。そのア
ッセイは候補化合物の結合を試験するだけでよく、候補
化合物に直接的または間接的に結合した標識を用いるこ
とにより、あるいは標識競争物質との競争を用いるアッ
セイにより、受容体を有する細胞への付着を検出する。
さらに、これらのアッセイにおいて、受容体を表面に有
する細胞に適する検出系を用いて、受容体活性化により
発生するシグナルを候補化合物が生じるかどうかを試験
してもよい。一般的には、活性化に対する阻害剤を、既
知アゴニスト存在下においてアッセイして、アゴニスト
による活性化に対する候補化合物の存在の影響を観察す
る。かかるスクリーニングアッセイを行うための標準的
方法は当該分野においてよく理解されている。潜在的な
ＨＮＦＤＹ２０アンタゴニストの例は、抗体、あるいは
いくつかの場合にはオリゴヌクレオチドまたはＨＮＦＤ
Ｙ２０のリガンドに密接に関連した蛋白（例えば、リガ
ンドのフラグメント、または受容体に結合するが応答を
誘発せず、その結果受容体活性を妨害する小型分子）を
包含する。

【００４９】予防および治療方法 本発明は、過剰または不十分な量のＨＮＦＤＹ２０活性
に関連する異常な状態の治療方法を提供する。ＨＮＦＤ
Ｙ２０活性が過剰な場合、いくつかの方法を用いること
ができる。１の方法は、有効量の錠阻害剤化合物（アン
タゴニスト）を医薬上許容される担体とともに対象に投
与して、ＨＮＦＤＹ２０へのリガンドの結合をブロック
することあるいは第２のシグナルを阻害することにより
活性化を阻害し、そのことにより異常な症状を改善する
ことを特徴とする。

【００５０】もう１つのアプローチにおいて、内在性Ｈ
ＮＦＤＹ２０と競争してリガンドに結合する能力をやは
り有している可溶性形態のＨＮＦＤＹ２０ポリペプチド
を投与してもよい。かかる競争物質の典型的な具体例は
ＨＮＦＤＹ２０ポリペプチドのフラグメントを含む。

【００５１】さらにもう１つの方法において、発現ブロ
ック法を用いて内在性ＨＮＦＤＹ２０をコードしている
遺伝子の発現を阻害してもよい。細胞内で生成した、あ
るいは別個に投与されたアンチセンス配列を、かかる知
られた方法に使用する。例えば、Oligodeoxynucleotide
s as Antisense Inhibitors of Gene Expression,CRCPr
ess,Boca Raton, FL(1988)中、O'Coccor,J.Neurochem(1
991)56:560参照。別法として、遺伝子とともに三重らせ
んを形成するオリゴヌクレオチドを用いてもよい。例え
ば、Lee et al.,Nucleic Acids Res(1979)6:3073;Coone
y et al.,Science(1988)241:456;Dervan et al.,Scienc
e(1991)251:1360参照。これらのオリゴヌクレオチドは
それ自体投与することができ、あるいは関連オリゴマー
をインビボで発現させることもできる。

【００５２】ＨＮＦＤＹ２０およびその活性の発現不足
に関連する異常な症状の治療には、いくつかの方法が用
いられる。１の方法は、ＨＮＦＤＹ２０を活性化する治
療上有効量の化合物（すなわち上記アゴニスト）を医薬
上許容される担体とともに投与し、そのことにより異常
な症状を改善することを特徴とする。別法として、遺伝
子治療を用いて、対象中の細胞によるＨＮＦＤＹ２０の
細胞内での生成を有効ならしめてもよい。例えば、上記
のごとく本発明ポリヌクレオチドを処理加工して複製欠
損レトロウイルスベクターに入れて発現するようにして
もよい。次いで、レトロウイルス発現構築物を単離し、
本発明ポリペプチドをコードしているＲＮＡを含むレト
ロウイルスプラスミドベクターで形質導入したパッケー
ジング細胞中に導入して、今度はパッケージング細胞が
目的遺伝子を含む感染性ウイルス粒子を生成するように
してもよい。インビボでの細胞の処理加工およびインビ
ボイでのポリペプチドの発現のために、これらのプロデ
ューサー細胞を対象に投与してもよい。遺伝子治療の概
説としては、Human Molecular Genetics,T.Strachan an
d A.P.Read,BIOS Scientific Publishers Ltd(1986)
中、第２０章、Gene Therapy and other Molecular Gen
etic-based Therapeutic Approaches（およびその中の
引用文献）参照。

【００５３】処方および投与 可溶性形態のＨＮＦＤＹ２０ポリペプチドのごときペプ
チド、ならびにアゴニストおよびアンタゴニストペプチ
ドまたは小型分子を、適当な医薬担体と組み合わせて処
方してもよい。かかる処方は、治療上有効量のポリペプ
チドまたは化合物、および医薬上許容される担体または
賦形剤を含んでなる。かかる担体としては、セイライ
ン、緩衝化セイライン、デキストロース、水、グリセロ
ール、エタノール、およびそれらの混合物が挙げられる
が、これらに限らない。処方は投与経路に適したものと
すべきであり、当業者によく知られている。さらに本発
明は、上記本発明成分の１種またはそれ以上を充填し
た、１個またはそれ以上の容器を含んでなる医薬パック
およびキットにも関する。

【００５４】本発明ポリペプチドおよび他の化合物を単
独で使用してもよく、あるいは治療化合物のごとき他の
化合物と一緒に使用してもよい。医薬組成物の全身投与
の好ましい形態は、注射、典型的には静脈注射を包含す
る。皮下、筋肉内または腹腔内のごとき他の注射経路を
用いることもできる。全身投与のための別の手段は、胆
汁酸塩またはフシジン酸または他の界面活性剤のごとき
浸透剤を用いる経粘膜または経皮投与を包含する。さら
に、腸溶処方またはカプセル処方がうまく処方されるな
らば、経口投与も可能である。これらの化合物の投与は
局所的なものであってもよく、膏薬、パスタ、ゲル等の
形態であってもよい。

【００５５】必要な用量範囲は、ペプチド、投与経路、
処方の性質、対象の症状の性質、および担当医師の判断
による。しかしながら、適当な用量は対象の体重１ｋｇ
あたり０．１ないし１００μｇの範囲である。しかしな
がら、種々の使用化合物および種々の投与経路のさまざ
まな有効性を考慮すれば、必要な用量は広範囲なものと
思われる。例えば、経口投与には静脈注射よりも多い用
量が必要であると考えられる。当該分野においてよく知
られた最適化のための標準的な常套的実験を用いてこれ
らの用量の変更を行うことができる。

【００５６】しばしば「遺伝子治療」と称される上記治
療方法において、治療に使用するポリペプチドを対象中
において生成させることもできる。よって、例えば、ポ
リペプチドをコードしているＤＮＡまたはＲＮＡのごと
きポリヌクレオチドを用いて、例えばレトロウイルスプ
ラスミドベクターを用いることによりエクスビボにおい
て対象由来の細胞を処理加工してもよい。次いで、細胞
を対象に導入する。

【００５７】

【実施例】特記しないかぎり、当業者によく知られた標
準的方法を用いて下記実施例を行う。実施例は本発明を
例示説明するものであり、本発明を限定するものではな
い。 実施例１ 発現配列タグ（ＥＳＴ）として知られる短い配列からな
るHuman Genome Sciencesから得られたランダムなｃＤ
ＮＡ配列を、ｃＤＮＡ配列をコードしている７−ＴＭド
メインに関してＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて検索す
ることにより、Ｐ２ｙプリノレセプター様７−トランス
メンブラン受容体に対して相同的であるＥＳＴ配列が示
された。配列決定ダータのさらなる分析により、５、６
および７番目のトランスメンブランドメインの存在が示
された。クローンは３’ＤＮＡ（カルボキシ末端および
ストップコドン）および５’ＤＮＡ（上流のストップコ
ドン、Ｍｅｔおよび１−４ ＴＭｓ）を欠いていた。完
全な３’末端配列を得るために、遺伝子特異的プライマ
ーおよびヒト・精巣プラスミドライブラリーを用いて
３’ＲＡＣＥ ＰＣＲ（Life Technologies）を行った。
ＰＣＲバンドをＰＣＲ２．１ベクター（Invitrogen）中
にサブクローンし、配列決定した。配列決定したアッセ
ンブリーおよび分析により、正しい３’末端が得られた
ことが示された。失われた５’末端を得るために、遺伝
子特異的プライマーおよび精巣ライブラリーを用いて
５’ＲＡＣＥ ＰＣＲを行った。ＰＣＲバンドをサブク
ローンし、配列決定し、分析した。このバンドから大部
分の情報を得たが、当該クローンはやはり５’Ｍｅｔお
よび上流ストップコドンを欠いたままであった。この情
報を得るために、標準的手順を用いてＨＮＦＤＹ２０に
関して単離されたＰＡＣクローンを用いた。簡単に説明
すると、ＰＡＣライブラリー（大型のヒト・ＤＮＡフラ
グメントを増殖させるための新たなバクテリオファージ
Ｐ１由来のベクター、Nature Genet.6,84-89 1994）
を、３８４ウェルプレート群を代表するＰＣＲプールと
してフォーマットした。ＰＣＲ法を用い、ＨＮＦＤＹ２
０特異的プライマー対を用いてこれらのプールをスクリ
ーニングした（サイクル：９４℃で４０秒、６０℃で３
０秒、７２℃で３０秒として３５サイクル行い、生成物
を１ｘＴＡＥ中３％アガロースゲル上で泳動させた）。
陽性のプールを同じＰＣＲにより試験して、ＰＡＣクロ
ーンを含んでいるユニークな３８４ウェルプレートを同
定した。このプレート中の３８４個のクローンを、行お
よび列のプールと同じＰＣＲ法によりスクリーニングし
て、当該遺伝子を含有するクローンを同定した。次い
で、このクローンを遺伝子特異的プライマーで配列決定
して、全長のクローンについてのＤＮＡ配列情報を得
た。ＧＣＧソフトウェアを用いるＤＮＡ配列のマップ分
析により、４０１個のアミノ酸残基からなる１つの読み
枠（ＯＲＦ）が示された。ＦＡＳＴＡおよびＢＬＡＳＴ
アルゴリズムによる、ＤＮＡ配列についてのさらなる分
析により、このポリペプチド配列の７−トランスメンブ
ラン様Ｇ蛋白結合受容体に対する相同性が示された。さ
らに、lasergene proteanソフトウェアを用いる疎水性
プロット分析により、Ｇ蛋白結合受容体に共通したいく
つかの特徴が示された。最も際立った特徴は、それぞれ
約２０個ないし３０個のアミノ酸からなる７つの疎水性
領域の存在であり、そのことは、Ｇ蛋白結合受容体のス
ーア−ファミリーにおいて見いだされる７−トランスメ
ンブラン構造トポロジーを規定する膜貫通ドメインを示
す可能性がある。さらに当該クローンの同一性を確認す
るために、読み枠（ＯＲＦ）のヌクレオチド配列を用い
てＰＣＲプライマーを設計し、そのＤＮＡ配列を２種以
上のライブラリー（ヒト胎児肝臓および白血球）から増
幅した。正しいサイズのＰＣＲバンドをＰＣＲ２．１ベ
クター(Invitrogenから得た）中にサブクローンし、配
列決定した。

【００５８】実施例２：哺乳動物細胞での発現 本発明受容体は、ヒト胚腎臓２９３細胞（ＨＥＫ２９
３）または付着性ｄｈｆｒ ＣＨＯ細胞のいずれかにお
いて発現される。受容体発現を最大にするために、ＣＤ
ＮまたはｐＣＤＮＡ３ベクターに挿入する前に、典型的
にはすべての５’および３’非翻訳領域（ＵＴＲｓ）を
受容体ｃＤＮＡから除去した。リポフェクチンにより個
々の受容体ｃＤＮＡで細胞をトランスフェクションし、
４００ｍｇ／ｍｌのＧ４１８存在下で選択した。３週間
の選択期間後、個々のクローンを拾い、さらなる分析の
ために増殖させた。ベクターのみでトランスフェクショ
ンされたＨＥＫ２９３またはＣＨＯ細胞は負の対照とし
て役立った。個々の受容体を安定に発現する細胞系を単
離するために、典型的には、約２４個のクローンを選択
し、ノーザンブロット分析により分析した。受容体ｍＲ
ＮＡは、分析したＧ４１８耐性クローンの約５０％にお
いて検出された。

【００５９】実施例３：結合および機能のアッセイのた
めのリガンドバンク ２００個以上の推定上の受容体リガンドからなるバンク
をスクリーニング用に集めた。バンクは、伝達物質、ホ
ルモン、およびヒト・７トランスメンブラン（７ＴＭ）
受容体を介して作用するサイトカイン、ヒト・７ＴＭ受
容体に対する推定上のアゴニスト、非哺乳動物の生物学
的に活性のあるペプチドであってその哺乳動物同等物が
見いだされていないもの、ならびに自然界には見いださ
れないが未知の天然リガンドとともに７ＴＭ受容体を活
性化する化合物を含んでいる。まず、機能のアッセイ
（すなわち、カルシウム、ｃＡＭＰ、マイクロフィジオ
メーター、卵母細胞の電気生理学等、下記参照）ならび
に結合アッセイの両方を用い、このバンクを用いて既知
リガンドに関して受容体をスクリーニングした。

【００６０】実施例４：リガンド結合アッセイ リガンド結合アッセイは、受容体機能を確認するための
直接的方法を提供し、高処理量フォーマットに適用可能
である。受容体に対する精製リガンドを放射性標識して
高比活性（５０ないし２０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）とし、
結合の研究に備える。次いで、放射性標識プロセスが受
容体に対するリガンドの活性を減じないように測定を行
う。バッファー、イオン、ｐＨおよびヌクレオチドのご
とき他のモジュレーターに関するアッセイ条件を最適化
して、膜および全細胞受容体源に関して測定可能な雑音
対シグナル比を得る。これらのアッセイのために、全結
合放射活性から過剰の未標識競争リガンドの存在下で測
定した放射活性を差し引いたものを、特異的受容体結合
を定義する。可能ならば、１種よりも多い競争リガンド
を用いて残りの非特異的結合を決定する。

【００６１】実施例５：アフリカツメガエルにおける機
能のアッセイ 本発明受容体ｃＤＮＡをコードしている直鎖状プラスミ
ド鋳型由来のキャップしたＲＮＡ転写物を、標準的手順
に従ってＲＮＡポリメラーゼを用いて合成する。インビ
トロ転写物を水に懸濁して最終濃度０．２ｍｇ／ｍｌと
する。卵巣葉を成体メスのカエルから取り、段階Ｖの脱
卵胞した卵母細胞を得て、Drummond微量注入装置を用い
てＲＮＡ転写物（１０ｎｇ／卵母細胞）を５０ｎｌのボ
ーラスとして注入する。２個の電極電圧クランプを用い
て個々のアフリカツメガエル卵母細胞からの電流を測定
する。室温のＣａ²⁺不含Barth培地中で記録を行う。ア
フリカツメガエルの系を用いて既知リガンドおよび組織
／細胞抽出物をリガンド活性化についてスクリーニング
することができる。

【００６２】実施例６：マイクロフィジオメトリックア
ッセイ（Microphysiometric Assays） 広範囲の２次メッセンジャー系の活性化により、少量の
酸が細胞から生じる。大まかにいえば、生じた酸は、細
胞内シフナリングプロセスの燃料として必要な代謝活性
の増大の結果である。細胞周辺の培地のｐＨ変化は非常
に小さいが、サイトセンサー・マイクロフィジオメータ
ー（CYTOSENSOR microphysiometer）（Molecular Devic
es Ltd.,Menlo Park,CA）により検出可能である。よっ
て、CYTOSENSORは、本発明Ｇ蛋白結合受容体のごときエ
ネルギーを使用する細胞内シグナリング経路に連動した
受容体の活性化を検出することができる。

【００６３】実施例７：抽出物／細胞上清のスクリーニ
ング 多くの哺乳動物受容体が存在するが、それらに対する同
族活性化リガンド（アゴニスト）はいままでのところ存
在しない。よって、これらの受容体に対して活性のある
リガンドは、いままで同定されたようなリガンドバンク
には含まれていない可能性がある。したがって、本発明
７ＴＭ受容体を組織抽出物に対して機能面からもアッセ
イして（カルシウム、ｃＡＭＰ、マイクロフィジオメー
ター、卵母細胞の電気生理学等、すなわち機能的スクリ
ーニングを用いて）天然リガンドを同定する。次いで、
活性化するリガンドが単離同定されるまで、陽性の機能
応答を生じる抽出物をさらに分画する。

【００６４】実施例８：カルシウムおよびｃＡＭＰ機能
アッセイ ＨＥＫ２９３細胞において発現される７ＴＭ受容体は、
ＰＬＣおよびカルシウム可動化の活性化に機能的に連動
していることが示されている。ＨＥＫ２９３細胞、受容
体でトランスフェクションされた細胞、あるいはベクタ
ーで制御されている細胞における基底カルシウムレベル
が正常であること、すなわち１００ｎＭないし２００ｎ
Ｍの範囲であることが観察された。組み換え受容体を発
現するＨＥＫ２９３細胞をfura2とともに負荷し、１日
で１５０個以上の選択リガンドを、アゴニストにより誘
導されるカルシウム可動化について評価する。同様に、
標準的なｃＡＭ定量アッセイを用いて、組み換え受容体
を発現しているＨＥＫ２９３細胞を、ｃＡＭＰ産生の刺
激または阻害について評価する。カルシウムトランジエ
ントまたはｃＡＭＰ変動を示すアゴニストを、ベクター
で制御された細胞において試験して、応答が受容体を発
現している形質転換細胞に独自のものであるかどうかを
決定する。

【００６５】

【配列表】

【００６６】（１）一般的情報： （ｉ）出願人：バーグズマ，ダーク ギャネシュ，サザ フュータラー，ウェンディ マオ，ジョイス （ｉｉ）発明の名称：新規ヒト・７−トランスメンブラ
ン受容体をコードしているｃＤＮＡクローンＨＮＦＤＹ
２０ （ｉｉｉ）配列の数：２ （ｖｉ）連絡先： （Ａ）宛て名：スミスクライン・ビーチャム・コーポレ
イション （Ｂ）通り名：スウェードランド・ロード （Ｃ）都市名：キング・オブ・プルシア （Ｄ）州名：ペンシルベニア （Ｅ）国名：アメリカ合衆国 （Ｆ）ＺＩＰ：１９４０６ （ｖ）コンピューター・リーダブル・フォーム： （Ａ）媒体タイプ：ディスケット （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭコンパチブル （Ｃ）作動システム：ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウェア：Windowsバージョン２.０用FastSE
Q （ｖｉ）本願のデータ： （Ａ）出願番号：不明 （Ｂ）出願日：１９９７年３月１９日 （Ｃ）分類：不明 （ｖｉｉ）先の出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （ｖｉｉｉ）代理人等の情報： （Ａ）氏名：ハン，ウィリアム・ティ （Ｂ）登録番号：３４３４４ （Ｃ）代理人等における処理番号：ＡＴＧ５００１１ （ｘｉ）テレコミュニケーションの情報： （Ａ）電話番号：６１０−２７０−５２１９ （Ｂ）ファックス番号：６１０−２７０−４０２６ （Ｃ）テレックス：

【００６７】（２）配列番号：１に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１８４１塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ （ｘｉ）配列の記載：配列番号：１： GACAGCAAGG TGCTGTGCGG CAGAGCATTT GGGGTCTCAA AGAAGCAGGT GAGCCTGGGC 60 CCGAGGGGCT GGGTGGAGGA GCACCTTGGT GCTTCTCTGC TGGGGAAGGG ACAGGGGACA 120 GGGCATGCTC AGGAAGACAG GCAGGCTGAC CCCGCCTGGA AGGCACCCAG AGACAAGAGG 180 GGTGGGCGTA GTGACCTCGT GCCCTTTTAG GGGAGATGCT GCTGGCCAGA GGCCGTTAGG 240 GCCCCCACTA CCAACTCCAT GTTACTCTCT CTCACCAGTG GCCACCACCA TGGATACAGG 300 CCCCGACCAG TCCTACTTCT CCGGCAATCA CTGGTTCGTC TTCTCGGTGT ACCTTCTCAC 360 TTTCCTGGTG GGGCTCCCCC TCAACCTGCT GGCCCTGGTG GTCTTCGTGG GCAAGCTGCA 420 GCGCCGCCCG GTGGCCGTGG ACGTGCTCCT GCTCAACCTG ACCGCCTCGG ACCTGCTCCT 480 GCTGCTGTTC CTGCCTTTCC GCATGGTGGA GGCAGCCAAT GGCATGCACT GGCCCCTGCC 540 CTTCATCCTC TGCCCACTCT CTGGATTCAT CTTCTTCACC ACCATCTATC TCACCGCCCT 600 CTTCCTGGCA GCTGTGAGCA TTGAACGCTT CCTGAGTGTG GCCCACCCCC TGTGGTACAA 660 GACCCGGCCG AGGCTGGGGC AGGCAGGTCT GGTGAGTGTG GCCTGCTGGC TGTTGGCCTC 720 TGCTCACTGC AGCGTGGTCT ACGTCATAGA ATTCTCAGGG GACATCTCCC ACAGCCAGGG 780 CACCAATGGG ACCTGCTACC TGGAGTTCCG GAAGGACCAG CTAGCCATCC TCCTGCCCGT 840 GCGGCTGGAG ATGGCTGTGG TCCTCTTTGT GGTCCCGCTG ATCATCACCA GCTACTGCTA 900 CAGCCGCCTG GTGTGGATCC TCGGCAGAGG GGGCAGCCAC CGCCGGCAGA GGAGGGTGGC 960 GGGGCTGTTG GCGGCCACGC TGCTCAACTT CCTTGTCTGC TTTGGGCCCT ACAACGTGTC 1020 CCATGTCGTG GGCTATATCT GCGGTGAAAG CCCGGCGTGG AGGATCTACG TGACGCTTCT 1080 CAGCACCCTG AACTCCTGTG TCGACCCCTT TGTCTACTAC TTCTCCTCCT CCGGGTTCCA 1140 AGCCGACTTT CATGAGCTGC TGAGGAGGTT GTGTGGGCTC TGGGGCCAGT GGCAGCAGGA 1200 GAGCAGCATG GAGCTGAAGG AGCAGAAGGG AGGGGAGGAG CAGAGAGCGG ACCGACCAGC 1260 TGAAAGAAAG ACCAGTGAAC ACTCACAGGG CTGTGGAACT GGTGGCCAGG TGGCCTGTGC 1320 TGAAAGCTAG GTCCTCCGGG GGAGGAGGGT GTAGCTGGCG TGTCATCCTC AGGGCGCTTC 1380 CTCGCTCACA CCAGGAGGGA CTTGGAGTGG CGAGCTGGGG CCCGATGGGG CTTGGGGGCA 1440 GAGTAGACAT CTAGCCTCCC TAAGGGTATG CGCGCTAAAG CCCAGCTCTC GATCTCACCT 1500 CCATCCCCAT CCACCCACAC ACTATGGATT GGGCTCTGGG AAGGGGTCAG GGTGAGAGGC 1560 TGCTCTGGAG AACAATGAGG TCCTCACAGC AGCAGGCAGC TCCTGTGTTT TCTTGAGGGT 1620 GGCAGAGGAG CTAAGAGCAG TGCCCAGGGT CTGAGGGGGC TGCCCAGTGA GTGGCAGGGG 1680 CAGGAGAGGG GAGAACCCCA TCCTCAGAGC TGCTCCCAGC CAGCGAGTCA GGAGCGGGGG 1740 AGACAGGGCT CCAGGGATGA GGCCGCATTC TGCTCCCACA GTGCCTTTTC CAGAAAGTTC 1800 CCATTGCTCA ATAAATGTGG ATCATCAGAG ACATTTATGA A 1841

【００６８】（２）配列番号：２に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：４０１アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：１本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：蛋白 （ｘｉ）配列の記載：配列番号：２： Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｔｈｒ
Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｈｉｓ Ｐｒｏ Ｇｌｕ １ ５
１０ １５ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｓｅｒ
Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ａｌａ ２０ ２５
３０ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｐｒｏ
Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ｓｅｒ ３５ ４０
４５ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｍｅｔ Ａｓｐ
Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｔｙｒ ５０ ５５
６０ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｈｉｓ Ｔｒｐ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｐｈｅ
Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｐｈｅ ６５ ７０
７５ ８０ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｌｅｕ
Ａｌａ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｇｌｙ ８５
９０ ９５ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｌａ Ｖａｌ
Ａｓｐ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ １００ １０５
１１０ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ
Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ｖａｌ １１５ １２０
１２５ Ｇｌｕ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｔｒｐ Ｐｒｏ
Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｐｒｏ １３０ １３５
１４０ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｔｈｒ
Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｐｈｅ １４５ １５０
１５５ １６０ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｌａ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｐｈｅ
Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ａｌａ Ｈｉｓ Ｐｒｏ Ｌｅｕ １６５
１７０ １７５ Ｔｒｐ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｙ
Ｇｌｎ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｖａｌ １８０ １８５
１９０ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｈｉｓ
Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｉｌｅ １９５ ２００
２０５ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ｓｅｒ
Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｃｙｓ ２１０ ２１５
２２０ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｌｅｕ
Ａｌａ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｒｇ ２２５ ２３０
２３５ ２４０ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｖａｌ
Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｓｅｒ ２４５
２５０ ２５５ Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｔｒｐ Ｉｌｅ
Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｈｉｓ ２６０ ２６５
２７０ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｖａｌ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｅｕ
Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｓｎ ２７５ ２８０
２８５ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ａｓｎ
Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｔｙｒ ２９０ ２９５
３００ Ｉｌｅ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｔｒｐ Ａｒｇ
Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｓｅｒ ３０５ ３１０
３１５ ３２０ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｐｈｅ
Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ ３２５
３３０ ３３５ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ａｌａ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｌｅｕ
Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｌｅｕ ３４０ ３４５
３５０ Ｔｒｐ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｓｅｒ
Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｌｙｓ ３５５ ３６０
３６５ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｒｇ
Ｐｒｏ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｓｅｒ ３７０ ３７５
３８０ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｇｌｙ
Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ａｌａ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｇｌｕ ３８５ ３９０
３９５ ４００ Ｓｅｒ

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 16/28 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｎ 5/10 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ギャネシュ・エム・サザ アメリカ合衆国19406ペンシルベニア州キ ング・オブ・プルシア、ハンターズ・ラン 107番 (72)発明者 ウェンディ・エス・フュータラー アメリカ合衆国19348ペンシルベニア州ケ ネット・スクエア、ベイヤード・ロード 435番 (72)発明者 ジョイス・ワイ・マオ アメリカ合衆国08108ニュージャージー州 ウエストモント、イースト・カスバート・ ブールバード119番 カスバート・マナ ー・アパートメンツ・アール−３

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号：２のポリペプチドをコードし
   ているヌクレオチド配列に対してその全長にわたり少な
   くとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列または
   該ヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列
   を含む、単離ポリヌクレオチド。
2. 【請求項２】 ＤＮＡまたはＲＮＡである請求項１のポ
   リヌクレオチド。
3. 【請求項３】 ヌクレオチド配列が配列番号：１に含ま
   れるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一
   性を有するものである請求項１のポリヌクレオチド。
4. 【請求項４】 ヌクレオチド配列が、配列番号：１に含
   まれるＨＮＦＤＹ２０ポリペプチドコーディング配列を
   含むものである請求項３のポリヌクレオチド。
5. 【請求項５】 配列番号：１のポリヌクレオチドである
   請求項３のポリヌクレオチド。
6. 【請求項６】 適合する宿主細胞中に存在する場合に、
   配列番号：２のポリペプチドをに対して少なくとも８０
   ％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＮＦＤＹ２０
   ポリペプチドを生成する能力のある発現系を含む、ＤＮ
   ＡまたはＲＮＡ分子。
7. 【請求項７】 請求項６の発現系を含む宿主細胞。
8. 【請求項８】 ＨＮＦＤＹ２０ポリペプチドの生成に十
   分な条件下で請求項７の宿主を培養し、次いで、培地か
   ら該ポリペプチドを回収することを特徴とする、ＨＮＦ
   ＤＹ２０ポリペプチドの製造方法。
9. 【請求項９】 請求項６の発現系で宿主細胞を形質転換
   またはトランスフェクションして、適当な培養条件下で
   宿主細胞がＨＮＦＤＹ２０ポリペプチドを生成するよう
   にすることを特徴とする、ＨＮＦＤＹ２０ポリペプチド
   を生成する細胞の製造方法。
10. 【請求項１０】 配列番号：２のアミノ酸配列に対して
    その全長にわたり少なくとも８０％同一であるアミノ酸
    配列を含むＨＮＦＤＹ２０ポリペプチド。
11. 【請求項１１】 配列番号：２のアミノ酸配列を含む請
    求項１０のポリペプチド。
12. 【請求項１２】 請求項１０のＨＮＦＤＹ２０ポリペプ
    チドに免疫特異的な抗体。
13. 【請求項１３】 請求項１０のＨＮＦＤＹ２０ポリペプ
    チドの活性または発現の増強を必要とする対象の治療方
    法であって、 （ａ）該受容体に対する治療上有効量のアゴニストを対
    象に投与すること；および／または（ｂ）インビボにお
    いて該受容体活性を生じさせる形態の請求項１のポリヌ
    クレオチドを対象に与えることを特徴とする方法。
14. 【請求項１４】 請求項１０のＨＮＦＤＹ２０ポリペプ
    チドの活性または発現の阻害を必要とする対象の治療方
    法であって、 （ａ）該受容体に対する治療上有効量のアンタゴニスト
    を対象に投与すること；および／または（ｂ）該受容体
    をコードしているヌクレオチド配列の発現を阻害する核
    酸分子を対象に投与すること；および／または（ｃ）リ
    ガンドを求めて該受容体と競争する治療上有効量のポリ
    ペプチドを対象に投与することを特徴とする方法。
15. 【請求項１５】 対象中の請求項１０のＨＮＦＤＹ２０
    ポリペプチドの発現または活性に関連した、対象におけ
    る疾病または疾病に対する感受性の診断方法であって、 （ａ）対象のゲノム中の該ＨＮＦＤＹ２０ポリペプチド
    をコードしているヌクレオチド配列中の変異の存在また
    は不存在を決定すること；および／または（ｂ）該対象
    由来の試料中のＨＮＦＤＹ２０ポリペプチドの発現の存
    在または量を分析することを特徴とする方法。
16. 【請求項１６】 請求項１０のＨＮＦＤＹ２０ポリペプ
    チドのアゴニストの同定方法であって、 （ａ）請求項９により製造された細胞を候補化合物と接
    触させること；次いで（ｂ）候補化合物が、ＨＮＦＤＹ
    ２０ポリペプチドの活性化により生じるシグナルを発生
    させるかどうかを決定することを特徴とする方法。
17. 【請求項１７】 請求項１６の方法により同定されるア
    ゴニスト。
18. 【請求項１８】 請求項１０のＨＮＦＤＹ２０ポリペプ
    チドに対するアンタゴニストの同定方法であって、 （ａ）請求項９により製造された細胞をアゴニストと接
    触させること；次いで（ｂ）該アゴニストにより生じた
    シグナルが、候補化合物の存在下で小さくなるかどうか
    を決定することを特徴とする方法。
19. 【請求項１９】 請求項１８の方法により同定されるア
    ンタゴニスト。