JPH11332571A

JPH11332571A - 新規遺伝子とそれにコードされる蛋白質

Info

Publication number: JPH11332571A
Application number: JP10148579A
Authority: JP
Inventors: Akiko Ikeda; 明子池田; Megumi Yamashita; 恵山下; Makoto Yoshimoto; 真吉本; Katsuki Tsuritani; 克樹釣谷; Seiji Arase; 誠治荒瀬
Original assignee: Taisho Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Taisho Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1998-05-29
Filing date: 1998-05-29
Publication date: 1999-12-07
Also published as: AU3955099A; WO1999063083A1

Abstract

(57)【要約】【課題】ヒト毛乳頭細胞由来の、毛髪の成長を調節す
る機能を有する新規蛋白質ＤＥＲＰ２と、それをコード
する遺伝子ｄｅｒｐ２を提供する。【解決手段】ヒト毛乳頭細胞由来のｃＤＮＡライブラ
リーからのクローニングによって、毛髪の成長を調節す
る機能を有する新規蛋白質ＤＥＲＰ２をコードする遺伝
子ｄｅｒｐ２が得られる。該蛋白質は、毛髪の成長を調
節する機能を有していることから、発毛促進剤等の開発
に用いることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術】本発明は、毛髪の成長を調節する
機能を有する新規蛋白質ＤＥＲＰ（dermal papilla der
ived protein）２、ならびに該蛋白質をコードする遺伝
子ｄｅｒｐ２に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】ヒト毛髪の毛包には、角化細胞、毛乳頭
細胞、繊維芽細胞および脂腺細胞等の様々な上皮系およ
び真皮系の細胞が存在しており、毛周期（毛髪の成長サ
イクル）は、これらの細胞間相互作用を介して調節され
ている。

【０００３】これらの細胞の中で、毛髪繊維を産生する
のは毛包角化細胞であるが、この細胞の増殖と分化の調
節に中心的な役割を担っているのは毛乳頭細胞であると
考えられている。すなわち、毛乳頭細胞が毛周期のコン
トローラーとして機能すると考えられている。以上の背
景から、現在、毛乳頭を中心とした毛周期調節機構の解
析が盛んに行われているが、毛髪成長の分子メカニズム
はまだほとんど明らかにされていない。

【０００４】男性型脱毛症は、毛包にアンドロジェンが
過剰に作用することにより進展することが知られてい
る。アンドロジェンは毛の成長を調節する最も重要な因
子であるが、その作用メカニズムはまだ解明されていな
い。

【０００５】毛乳頭細胞はアンドロジェン受容体および
テストステロン代謝酵素である５α-リダクターゼを高
発現していること、さらに毛乳頭細胞におけるアンドロ
ジェン受容体の発現量が発毛部より禿頭部において高い
ことから、毛包におけるアンドロジェンの主なターゲッ
ト細胞は毛乳頭細胞であると考えられている。すなわ
ち、アンドロジェンは、毛乳頭に作用し、毛乳頭細胞由
来の因子等の産生量を変化させることにより、毛髪の成
長を調節すると考えられている。

【０００６】以上の様な知見から、アンドロジェンによ
り産生量が変化する毛乳頭由来の因子が、毛髪の成長に
重要な役割を果たしていることが予測されているが、こ
の因子が何なのかはまだ明らかにされていない。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】上述のように、毛乳頭
由来の毛髪の成長に関与する因子、特に蛋白性因子は、
毛髪促進作用を示す生理活性物質の探索に極めて有用で
ある。本発明は、発毛に関する分子機構を解明する過程
で、この様な毛髪の成長を調節することのできる新規な
蛋白質とその遺伝子を提供することにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは毛髪の成長
に関与する因子の同定を目的とし、ヒト毛乳頭細胞で高
発現している遺伝子の中から、所望の蛋白質を把握する
べく鋭意研究の結果、新規蛋白質ＤＥＲＰ２の存在と、
それをコードする遺伝子ｄｅｒｐ２の単離に成功し、本
発明を完成するに至った。

【０００９】即ち、本発明は、（ａ）配列番号：１に記
載のアミノ酸配列からなる蛋白質、または（ｂ）配列番
号：１のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ
酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からな
り、かつ毛髪の成長を調節する機能を有する蛋白質に関
するものである。さらに本発明は、（ｃ）配列番号：２
に記載のＤＮＡからなる遺伝子、または、（ｄ）配列番
号：２のＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダ
イズし、かつ毛髪の成長を調節する機能を有する蛋白質
をコードするＤＮＡからなる遺伝子に関するものであ
る。

【００１０】本発明であるＤＥＲＰ２は、配列番号１に
示すように全３４５アミノ酸残基からなる分子量３７キ
ロダルトン（ｋｄ）の蛋白質である。そのアミノ酸配列
上の特徴として、疎水性アミノ酸に富む領域が複数箇所
で認められることから、膜蛋白質の一種であると推察さ
れる。

【００１１】また、もう一つの本発明であるｄｅｒｐ２
は、配列番号２に示すように１０３５塩基対（ｂｐ）か
らなる遺伝子である。

【００１２】

【発明の実施の形態】遺伝子ｄｅｒｐ２は、ヒト毛乳頭
細胞由来のｃＤＮＡライブラリーから、該遺伝子を含ん
だｃＤＮＡ断片として単離することができる。本発明者
らが使用したｃＤＮＡライブラリーは、Messengerらの
方法(Br. J. Dermatol. 114, 425, 1986)に従って分離
したヒト毛乳頭細胞から一般的な方法に従って抽出した
ｍＲＮＡを基に調製したものであるが、クローンテック
社から市販されているヒト大脳皮質のｍＲＮＡを元にし
ても同様にｃＤＮＡを調製することができる。

【００１３】ヒト毛乳頭細胞で高発現している遺伝子を
識別する方法として、大久保らの方法（Okubo et al.,N
ature Genet.,2, p173, 1992）による、遺伝子の発現頻
度を解析する方法を用いることができる。具体的には、
以下の手順による。

【００１４】ヒト毛乳頭細胞由来のｍＲＮＡを鋳型と
し、適当な制限酵素で開環させたベクタープラスミドの
一端にオリゴｄＴを結合させたものをプライマーとして
ｃＤＮＡ合成を行った後、制限酵素ＭｂｏＩと制限酵素
ＢａｍＨＩで切断する。当該ベクターはｄａｍメチラー
ゼ陽性の大腸菌を宿主として調製されたため、ＭｂｏＩ
の認識配列である「ＧＡＴＣ」のＡ残基がメチル化され
ている。従ってＭｂｏＩは、新たに合成されたｃＤＮＡ
部分のみを切断する。当該ベクターは、オリゴｄＴを結
合させた末端とは反対側の末端近傍にＢａｍＨＩ切断部
位を１ヶ所だけ有しているので、本酵素は当該ベクター
を１ヶ所切断し、さらに新たに合成されたｃＤＮＡ部分
にもしＢａｍＨＩ認識配列が存在すれば、その部位も切
断する。ＢａｍＨＩとＭｂｏＩは「ＧＡＴＣ」なる配列
からなる、同一の付着端を生ぜしめるため、両酵素で切
断した後、ＤＮＡリガーゼを作用させれば、プラスミド
を閉環することができる。このようにして調製したプラ
スミドを用いて、大腸菌を形質転換することで３’末端
ｃＤＮＡライブラリーを構築した。従って当該ライブラ
リーは、各ｍＲＮＡの３’端のポリＡ部位から、その
５’側部分のうち最初にＧＡＴＣなる塩基配列が出現す
る部位までの領域を含んでいる。当該３’末端ｃＤＮＡ
ライブラリーから無作為に適当個数の組換え体を選択
し、各組換え体中のｃＤＮＡ断片の全塩基配列を決定す
る。このようにして決定された特定配列を有するｃＤＮ
Ａ断片が、無作為に選択された組み換え体の中から幾つ
確認されるかをもって、臓器特異的遺伝子及び高発現遺
伝子を識別することができる。

【００１５】上記の高発現遺伝子を識別する方法では、
無作為に選択する組み換え体の総数は数百から千程度が
適当であるが、必要ならばそれ以上の個数の組み換え体
を処理すればよい。

【００１６】本発明者らは上記方法を実施し、７８９個
の組み換え体中のｃＤＮＡ断片の塩基配列を全て決定
し、その中から、同一の配列を有するｃＤＮＡとしての
出現頻度が３／７８９であったｃＤＮＡ断片を、ヒト毛
乳頭細胞で高発現している遺伝子のＤＮＡ断片の候補と
して選別した。

【００１７】上記ｃＤＮＡ断片は前述したとおり、ｍＲ
ＮＡの３’端の一部の領域しか含んでいない。そこで本
発明者らは当該領域（以下３’断片）の塩基配列情報を
元にして、全鎖長ｃＤＮＡを取得した。

【００１８】クローンテック社から市販されているヒト
大脳皮質ｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、上記３’断
片内の配列を有する適当な長さのオリゴヌクレオチドと
ベクター中の配列を有する同程度の長さのオリゴヌクレ
オチドをそれぞれ合成し、これらをプライマーとしてＰ
ＣＲを行った。その結果、約１．５ｋｂのＤＮＡ断片を
増幅することができた。この際、ヒト培養毛乳頭細胞か
ら常法に従って抽出したｍＲＮＡを鋳型とし、クローン
テック社またはギブコ社の５’ＲＡＣＥキットを用いる
ことによっても行うことができる。さらにこれはまた、
上記３’断片をプローブとして、上記ヒト大脳皮質また
は毛乳頭細胞ｃＤＮＡライブラリーを、コロニーハイブ
リダイゼーションまたはプラークハイブリダイゼーショ
ンで、常法に従ってスクリーニングすることによっても
行うことができる。

【００１９】上記方法によって増幅したｃＤＮＡ断片
は、プロメガ社から市販されているベクターpGEM-Tに組
み込み、全塩基配列を決定した。この際、組換えＤＮＡ
を独立に２クローン取得して、それぞれのｃＤＮＡ断片
の塩基配列を決定することにより、配列の確認を行っ
た。この配列中に一つの蛋白質翻訳領域（Open Reading
Flame、ＯＲＦ）を見いだし、この遺伝子をｄｅｒｐ
２、該遺伝子にコードされる蛋白質をＤＥＲＰ２と命名
した。

【００２０】遺伝子ｄｅｒｐ２は、適当な宿主ベクター
系による一般的な遺伝子組み換え技術によって、組み換
え遺伝子とすることができる。適当なベクターとして
は、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２、ｐＵ
Ｃ１１８その他）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵ
Ｂ１１０、ｐＣ１９４その他）、酵母由来のプラスミド
（例、ｐＳＨ１９その他）、さらにバクテリオファージ
やレトロウィルスやワクシニアウィルス等の動物ウィル
ス等が利用できる。組み換えに際しては、適当な合成Ｄ
ＮＡアダプターを用いて翻訳開始コドンや翻訳終止コド
ンを付加することも可能である。さらに該遺伝子を発現
させるために、遺伝子の上流に適当な発現プロモーター
を接続する。使用するプロモーターは、宿主に応じて適
宜選択すればよい。例えば、宿主が大腸菌である場合に
は、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプ
ロモーター、λＰＬプロモーターなどが、宿主がバチル
ス属菌である場合にはＳＰＯ系プロモーター等が、宿主
が酵母である場合にはＰＨＯ５プロモーター、ＧＡＰプ
ロモーター、ＡＤＨプロモーター等が、宿主が動物細胞
である場合にはＳＶ４０由来プロモーター、レトロウィ
ルスプロモーター等が、それぞれ使用できる。

【００２１】また該遺伝子を他の蛋白質（例、グルタチ
オンＳトランスフェラーゼ、プロテインＡその他）との
融合蛋白質として発現させることも可能である。このよ
うにして発現させた融合型ＤＥＲＰ２は、適当なプロテ
アーゼ（例、トロンビンその他）を用いて切り出すこと
が可能である。

【００２２】ＤＥＲＰ２の発現の際に利用できる宿主と
しては、エシェリヒア属菌であるEscherichia coliの各
種菌株、バチルス属菌であるBacillus subtilisの各種
菌株、酵母としてはSaccharomyc es cerevisiaeの各種菌
株、動物細胞としてはＣＯＳ−７細胞、ＣＨＯ細胞等が
利用できる。上記組み換えベクターを用いて宿主細胞を
形質転換する方法としては、常法または各宿主細胞に対
して一般に用いられる形質転換方法が適用できる。

【００２３】尚、本発明においては、配列番号２に示し
た塩基配列の他に、該配列とハイブリダイズしかつ毛髪
の成長を調節する機能を有する蛋白質をコードするＤＮ
Ａも、本発明の範囲内である。

【００２４】すなわち、遺伝子ｄｅｒｐ２の全長配列に
おいて、種々の人為的処理、例えば部位特異的変異導
入、変異剤処理によるランダム変異、制限酵素切断によ
るＤＮＡ断片の変異・欠失・連結等により、部分的にＤ
ＮＡ配列が変化したものであっても、これらＤＮＡ変異
体が遺伝子ｄｅｒｐ２とストリンジェントな条件下でハ
イブリダイズし、かつ毛髪の成長を調節する機能を有す
る蛋白質をコードするＤＮＡであれば、配列番号２に示
したＤＮＡ配列との相違に関わらず、本発明の範囲内の
ものである。

【００２５】上記のＤＮＡ変異の程度は、遺伝子ｄｅｒ
ｐ２のＤＮＡ配列と９０％以上の相同性を有するもので
あれば許容範囲内である。また、遺伝子ｄｅｒｐ２とハ
イブリダイズする程度としては、通常の条件下（例えば
DIG DNA Labeling kit、ベーリンガー・マンハイム社製
Cat No.1175033）でプローブをラベルした場合に、３２
℃のDIG Easy Hyb溶液（ベーリンガー・マンハイム社製
Cat No.1603558）中でハイブリダイズさせ、５０℃の
０．５×ＳＳＣ溶液（０．１％［ｗ／ｖ］ＳＤＳを含
む）中でメンブレンを洗浄する条件（１×ＳＳＣは０．
１５ＭＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム
である）でのサザンハイブリダイゼーションで、遺伝子
ｄｅｒｐ２にハイブリダイズする程度であればよい。

【００２６】また、上記のごとく遺伝子ｄｅｒｐ２と相
同性の高い変異体遺伝子にコードされる蛋白質であっ
て、毛髪の成長を調節する機能を有する蛋白質もまた、
本発明の範囲内のものである。

【００２７】すなわち、新規蛋白質ＤＥＲＰ２のアミノ
酸配列の１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換もし
くは付加された変異体であっても、該変異体が毛髪の成
長を調節する機能を有する蛋白質であれば、該変異体は
本発明の範囲内のものである。蛋白質の構成要素とな
るアミノ酸の側鎖は、疎水性、電荷、大きさなどにおい
てそれぞれ異なるものであるが、実質的に蛋白質全体の
３次元構造（立体構造とも言う）に影響を与えないとい
う意味で保存性の高い幾つかの関係が、経験的にまた物
理化学的な実測により知られている。例えば、アミノ酸
残基の置換については、グリシン（Ｇｌｙ）とプロリン
（Ｐｒｏ）、Ｇｌｙとアラニン（Ａｌａ）またはバリン
（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）とイソロイシン（Ｉｌ
ｅ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）とグルタミン（Ｇｌ
ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）とアスパラギン（Ａｓ
ｎ）、システイン（Ｃｙｓ）とスレオニン（Ｔｈｒ）、
Ｔｈｒとセリン（Ｓｅｒ）またはＡｌａ、リジン（Ｌｙ
ｓ）とアルギニン（Ａｒｇ）、等が挙げられる。

【００２８】従って、配列番号１に示した新規蛋白質Ｄ
ＥＲＰ２のアミノ酸配列上の置換、挿入、欠失等による
変異蛋白質であっても、その変異がＤＥＲＰ２蛋白質の
３次元構造において保存性が高い変異であって、その変
異蛋白質がＤＥＲＰ２と同様に毛髪の成長を調節する機
能を有する蛋白質であれば、これらは本発明の範囲内に
あるものと言うことができる。変異の程度としては、配
列番号１に示したアミノ酸配列との相同性が、９０％以
上のものが許容し得る範囲である。

【００２９】

【発明の効果】ＤＥＲＰ２が毛髪の成長を調節する機能
を有していることから、遺伝子ｄｅｒｐ２の発現異常や
ＤＥＲＰ２の活性発現異常は、毛髪の成長に影響を与え
るものと推測される。そのため、当該遺伝子の発現を調
節する物質やＤＥＲＰ２の機能を調節する物質は、発毛
剤または育毛剤として期待され得るものであり、遺伝子
ｄｅｒｐ２や蛋白質ＤＥＲＰ２は、この様な生理活性物
質の探索に利用することができる。例えば、遺伝子ｄｅ
ｒｐ２の転写発現系中に被験物質を同時に存在させ、遺
伝子ｄｅｒｐ２の発現量をＰＣＲ等の適当な方法で検出
することにより、被験物質の遺伝子発現に与える影響を
調べることができる。また、ＤＥＲＰ２に直接作用し
て、ＤＥＲＰ２の毛髪の成長を調節する機能を制御する
生理活性蛋白質の検索も行うことができる。

【００３０】

【実施例】以下実施例を挙げて詳述する。尚、以下特に
断らない限り、実施例で示す各種実験方法、例えば組み
換え体ｃＤＮＡの抽出やｃＤＮＡの塩基配列の決定等
は、いずれも当業者にとって自体公知の各種方法（Mole
cular Cloning、2nd.ed.,ColdSpring Harbor Lab.Press、
1989、その他当業者にとって標準的な方法を紹介した技
術解説書等に記載の方法）により行った。

【００３１】＜１．毛乳頭細胞の分離と培養＞ヒト毛乳
頭細胞は、健常人男性（３０才）の発毛部頭皮の毛包か
らMessengerらの方法(Br. J. Dermatol. 114, 425, 198
6)に従って分離し、培養した。毛包下部から毛乳頭を取
り出し、１２％牛胎児血清（ＦＢＳ）を添加したＭＥＭ
培地を入れたシャーレに設置し、５％ＣＯ₂／９５％ａ
ｉｒ、３７℃のＣＯ₂インキュベーター中で７日間培養
した。毛乳頭からアウトグロウスしてきた細胞を、０．
０５％トリプシン−０．５３ｍＭＥＤＴＡ溶液を用い
て回収した。分離した毛乳頭細胞は同培地で継代培養を
行い、継代４回目および５回目の細胞を実験に用いた。

【００３２】＜２．遺伝子ｄｅｒｐ２のクローニング＞１）遺伝子の部分配列の決定ヒト毛乳頭細胞由来のｍＲＮＡを鋳型として、大久保ら
の方法（Okubo et al.Nature Genet.,1992、2、p173）に
従い、３’末端ｃＤＮＡライブラリーを作成した。当該
ライブラリーから無作為に７８９個の組換え体を選択
し、ｃＤＮＡ部分の塩基配列を決定した。配列決定には
ＤＮＡシークエンサー（ABI社製PRISM377）と同社製反
応キットを用いた。７８９個の組み換え体中の各ＤＮＡ
断片の発現頻度を解析した結果、図１に示す配列（配列
−１）を有する遺伝子の発現頻度が３／７８９であっ
た。

【００３３】２）配列−１を含むｃＤＮＡ断片のクロー
ニング配列−１を含むｃＤＮＡ断片のクローニングを以下の方
法により行った。まず、配列−１の一部分と逆相補鎖と
なるオリゴヌクレオチド（図１の配列−２）を、ＤＮＡ
合成機（ABI社製380B）で合成した。次いで、ラムダフ
ァージクローニングベクター（λＤＲ２）のｃＤＮＡ挿
入部位近傍の配列を有するオリゴヌクレオチド（図１の
配列−３）を、同様に合成した。λＤＲ２をクローニン
グベクターとする、Human Brain cerebral cortex 5'-S
TRETCH cDNA library（クロンテックラボラトリーズ社
製)を鋳型とし、配列−２のオリゴヌクレオチドと配列
−３のオリゴヌクレオチドをプライマーとし、さらにタ
カラLA PCR Kit Ver.2とＰＣＲサーマルサイクラーＭＰ
（いずれも宝酒造製）を用いて、以下のＰＣＲ操作を行
った。

【００３４】 cDNA library(≧10⁸pfu/ml) 5μl 10×PCRバッファー(25mM Mg⁺⁺を含む) 5μl 2.5mM dNTP 1μl 10μM 配列−２ 2μl 10μM 配列−３ 2μl 水 34.5μlLA Taqホ゜リメラーセ゛ 0.5μl 総量 50 μl ＰＣＲサイクルは、９４℃で２分保持後、９８℃で２０
秒間反応させ、６８℃まで−１℃／２秒の速度で冷却
し、６８℃で３分保持し、更に７２℃で１０分間保持を
３０回繰り返して行った。

【００３５】上記方法により、配列−１を有するＤＮＡ
断片（約１．５ｋｂ）を特異的に増幅させた（図２）。

【００３６】３）塩基配列決定用ベクターへのサブクロ
ーニング２）で増幅したＤＮＡ断片を、アガロースゲル電気泳動
（ゲル濃度１％）で分画した。ゲルをエチジウムブロマ
イドで染色した後、紫外光照射して目的とするバンドを
含むゲルを切り出した。アガロースゲルからのＤＮＡ断
片の抽出と精製は、GENECLEAN II Kit（バイオ１０１
社製）を用いて行った。

【００３７】この抽出精製したＤＮＡ断片を、塩基配列
決定用ベクターpGEM-T（プロメガ社製）にサブクローニ
ングした（図３）。Ligation溶液はタカラDNA Ligation
KitVer.2（宝酒造製）を用い、以下の組成で１６℃で
１．５時間反応させた。

【００３８】抽出精製したＤＮＡ断片 1μl(50ng) pGEM-T 1μl(17ng) 水 3μl Ligation溶液 5μl 総量 10μl 上記反応後の溶液を用いて、大腸菌Ｋ１２株ＤＨ５の形
質転換を行った。形質転換体をアンピシリン（Ａｍｐ）
５０μｇ／ｍｌ、5-Bromo-4-Chloro-3-indolyl-β-D-ga
lactoside４０μｇ／ｍｌ、Isopropyl-β-D-Thio-Galac
topyranoside１００μＭを含有するＬＢ寒天培地にプレ
ーティングし、３７℃で一晩培養した。

【００３９】上記プレートに出現したコロニーを５０μ
ｇ／ｍｌのＡｍｐを含むＬＢ液体培地１０ｍｌに接種し
て３７℃で一晩培養し、遠心分離によって菌体を集めた
後、QIAprep Spin Plasmid Miniprep Kit（キアゲン社
製）で組換えＤＮＡを精製した。

【００４０】４）ＤＮＡ断片の塩基配列の決定塩基配列決定にはＤＮＡシークエンサー（ABI社製PRISM
377）を用い、ダイターミネーター法を用いた。決定さ
れた塩基配列を元にしてオリゴヌクレオチドを合成し、
プライマーウオーキング法で両鎖の全塩基配列を決定し
た（図４）。当該クローンのｃＤＮＡの全塩基配列を配
列番号３に示す。当該塩基配列が配列−２及び配列−１
のうち配列−２の上流領域を含んでいたことから、目的
とする遺伝子ｄｅｒｐ２がクローニングされたことを確
認した。

【００４１】当該ｃＤＮＡは３４５残基より成る蛋白質
（ＤＥＲＰ２）をコードするＯＲＦを含んでいる（配列
番号３）。該蛋白質の開始コドンであるメチオニン残基
の上流域に同じreading frameで終止コドンが出現した
ことから、当該ｃＤＮＡ断片がコードする蛋白質のアミ
ノ酸配列は配列番号３に示したものが唯一のものである
ことが確認された。

【００４２】＜３．抗ＤＥＲＰ２ペプチド抗体の調製＞
抗ペプチド抗体は、細胞工学別冊抗ペプチド抗体実験プ
ロトコール（大海忍、辻村邦夫著、秀潤社）に従って作
成した。ＤＥＲＰ２のアミノ酸配列の一部を含むペプチ
ド（図１の配列−４）を、ペプチドシンセサイザー（AB
I社製）を用いて合成し、これをキャリア蛋白質へモシ
アニンにマレイミド法で架橋して抗原とした。この抗原
０．５ｍｇをウサギ（Ｋｂｌ：ＪＷ、１０齢, オス）の
背部皮下に注入した。初回免疫後１４、２８、４２日後
に同量の抗原を用いて更に免疫を行い、初回免疫から５
２日目に全血を採取した。抗血清から、硫酸アンモニウ
ム塩析法により粗ＩｇＧ画分を調製し、さらにプロテイ
ンＡセファロースカラム、続いて抗原ペプチド固定化カ
ラムを用いてアフィニティー精製を行い、抗原特異的な
抗体を取得した。この抗体は、in vitro 転写翻訳シス
テム（プロメガ社製）を用いて翻訳合成したＤＥＲＰ２
に特異的に結合した。また、毛乳頭細胞を１ｍＭＳＤ
Ｓ溶液に溶解して調製した蛋白質溶液に存在する３７ｋ
ｄの蛋白質と特異的に結合した。

【００４３】＜４．毛乳頭細胞の抗体染色＞１．で分離
培養した毛乳頭細胞を、８穴チャンバースライド（Nun
c）に１．５ｘ１０⁴ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように
播種し、１２％ＦＢＳを添加したＭＥＭ培地中で、一晩
培養した。培地を除去し、細胞を４％パラホルムアルデ
ヒド−０．２５％Ｔｗｅｅｎ２０を用いて室温で１５分
間固定した。これを抗ＤＥＲＰ２ペプチド抗体５μｇ／
ｍｌで４℃、一晩処理し、更にビオチン化抗ラビットＩ
ｇＧ抗体を反応させた後、AEC staining kit（シグマ社
製）で発色させた。その結果を図５に示した。毛乳頭細
胞の核周辺のオルガネラ（ER-Golgiの領域）が強く染色
された。

【００４４】＜５．毛乳頭細胞におけるｄｅｒｐ２の発
現＞１．で分離培養した健常人男性（３０才）発毛部由
来の毛乳頭細胞、および同様の方法で分離した男性型脱
毛症患者男性（３４才）禿頭部由来の毛乳頭細胞から、
常法により全ＲＮＡを抽出した。各全ＲＮＡ１μｇを、
DNaseI(Gibco BRL)１ユニット（Ｕ）で処理した後、Oli
go(dT)_12-18Primer(GIBCO BRL)およびSuperscriptII(G
IBCO BRL)を用いて、SuperscriptII添付のプロトコール
に従い、ｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡを鋳型と
し、ＤＮＡ合成機（ABI社製380B）で合成したｄｅｒｐ
２特異的なプライマー（図１の配列−５および６）を用
いて、全量４０μｌとして以下のＰＣＲを行った。

【００４５】 cDNA 40ng Ex taq buffer (Takara) ×1 dNTPs (Takara) 0.16mM [α-32P]-dCTP (NEN) 590kBq Ex Taq (Takara) 2 U 配列−５ 0.2μM 配列−６ 0.2μM ＰＣＲサイクルは、９４℃で２分間加熱後、９４℃３０
秒、６０℃３０秒、７２℃１分を１８サイクル繰り返し
た。

【００４６】この反応液６μｌを、１２％ポリアクリル
アミドゲルを用いて電気泳動し、ゲルを乾燥後、BAS−2
000II（フジフィルム）にて、増幅されたｄｅｒｐ２断
片に取り込まれた放射能を測定した。ｄｅｒｐ２ｍＲＮ
Ａ量は、測定した放射能を増幅産物中のdCTP含量で補正
後、内部標準として用いたLibosomal protein S26に対
する相対値として表した。その結果を図６に示す。

【００４７】男性型脱毛症患者禿頭部由来の毛乳頭細胞
では、健常人発毛部由来の毛乳頭細胞と比較して、ｄｅ
ｒｐ２ｍＲＮＡの発現が高かった。

【００４８】＜６．テストステロン処理による遺伝子ｄ
ｅｒｐ２の発現変化＞１．と同様の方法で、男性型脱毛
症患者男性（３８才）発毛部由来の毛乳頭細胞を分離培
養した。継代５回目の細胞を、２Ｘ１０⁵ｃｅｌｌｓ／
６ｃｍシャーレにとなるように播種し、コンフルエント
に達するまで培養した。その後、培地をテストステロン
添加培地（０、１０、５０、２５０ｎＭ）と交換して、
２４〜７２時間さらに培養した。培地を除去後、細胞を
ＰＢＳ（−）で洗浄し、全ＲＮＡを抽出した。５．と同
様にして調製したｃＤＮＡ４０ｎｇを鋳型とし、配列−
５および配列−６をプライマーとして、全量２０μｌで
以下のＰＣＲを行った。

【００４９】 cDNA 40ng Ex taq buffer (Takara) 1x dNTPs (Takara) 0.5mM Ex Taq (Takara) 1U 配列−５ 0.5μM 配列−６ 0.5μM ＰＣＲサイクルは、９５℃で２分間加熱後、９５℃３０
秒、６０℃３０秒、７２℃１分を２３サイクル繰り返し
た。

【００５０】この反応液を、２％アガロースゲルを用い
て電気泳動し、エチジウムブロマイドにて染色した。結
果を図７に示す。５０ｎＭ以上のテストステロンを添加
した培養により、毛乳頭細胞における遺伝子ｄｅｒｐ２
の発現量が増加することが確認された。

【００５１】

【配列表】配列の数：１配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１配列の長さ：３４５残基配列の型：アミノ酸トポロジ−：直鎖状配列の種類：蛋白質配列 Met Leu Ala Ala Arg Leu Val Cys Leu Arg Thr Leu Pro Ser Arg 5 10 15 Val Phe His Pro Ala Phe Thr Lys Ala Ser Pro Val Val Lys Asn 20 25 30 Ser Ile Thr Lys Asn Gln Trp Leu Leu Thr Pro Ser Arg Glu Tyr 35 40 45 Ala Thr Lys Thr Arg Ile Gly Ile Arg Arg Gly Arg Thr Gly Gln 50 55 60 Glu Leu Lys Glu Ala Ala Leu Glu Pro Ser Met Glu Lys Ile Phe 65 70 75 Lys Ile Asp Gln Met Gly Arg Trp Phe Val Ala Gly Gly Ala Ala 80 85 90 Val Gly Leu Gly Ala Leu Cys Tyr Tyr Gly Leu Gly Leu Ser Asn 95 100 105 Glu Ile Gly Ala Ile Glu Lys Ala Val Ile Trp Pro Gln Tyr Val 110 115 120 Lys Asp Arg Ile His Ser Thr Tyr Met Tyr Leu Ala Gly Ser Ile 125 130 135 Gly Leu Thr Ala Leu Ser Ala Ile Ala Ile Ser Arg Thr Pro Val 140 145 150 Leu Met Asn Phe Met Met Arg Gly Ser Trp Val Thr Ile Gly Val 155 160 165 Thr Phe Ala Ala Met Val Gly Ala Gly Met Leu Val Arg Ser Ile 170 175 180 Pro Tyr Asp Gln Ser Pro Gly Pro Lys His Leu Ala Trp Leu Leu 185 190 195 His Ser Gly Val Met Gly Ala Val Val Ala Pro Leu Thr Ile Leu 200 205 210 Gly Gly Pro Leu Leu Ile Arg Ala Ala Trp Tyr Thr Ala Gly Ile 215 220 225 Val Gly Gly Leu Ser Thr Val Ala Met Cys Ala Pro Ser Glu Lys 230 235 240 Phe Leu Asn Met Gly Ala Pro Leu Gly Val Gly Leu Gly Leu Val 245 250 255 Phe Val Ser Ser Leu Gly Ser Met Phe Leu Pro Pro Thr Thr Val 260 265 270 Ala Gly Ala Thr Leu Tyr Ser Val Ala Met Tyr Gly Gly Leu Val 275 280 285 Leu Phe Ser Met Phe Leu Leu Tyr Asp Thr Gln Lys Val Ile Lys 290 295 300 Arg Ala Glu Val Ser Pro Met Tyr Gly Val Gln Lys Tyr Asp Pro 305 310 315 Ile Asn Ser Met Leu Ser Ile Tyr Met Asp Thr Leu Asn Ile Phe 320 325 330 Met Arg Val Ala Thr Met Leu Ala Thr Gly Gly Asn Arg Lys Lys 335 340 345 配列の数：１配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：２配列の長さ：１０３５塩基配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジ−：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 配列 10 20 30 40 50 60 ATGTTGGCTG CAAGGCTGGT GTGTCTCCGG ACACTACCTT CTAGGGTTTT CCACCCAGCT 60 TTCACCAAGG CCTCCCCTGT TGTGAAGAAT TCCATCACGA AGAATCAATG GCTGTTAACA 120 CCTAGCAGGG AATATGCCAC CAAAACAAGA ATTGGGATCC GGCGTGGGAG AACTGGCCAA 180 GAACTCAAAG AGGCAGCATT GGAACCATCG ATGGAAAAAA TATTTAAAAT TGATCAGATG 240 GGAAGATGGT TTGTTGCTGG AGGGGCTGCT GTTGGTCTTG GAGCATTGTG CTACTATGGC 300 TTGGGACTGT CTAATGAGAT TGGAGCTATT GAAAAGGCTG TAATTTGGCC TCAGTATGTC 360 AAGGATAGAA TTCATTCCAC CTATATGTAC TTAGCAGGGA GTATTGGTTT AACAGCTTTG 420 TCTGCCATAG CAATCAGCAG AACGCCTGTT CTCATGAACT TCATGATGAG AGGCTCTTGG 480 GTGACAATTG GTGTGACCTT TGCAGCCATG GTTGGAGCTG GAATGCTGGT ACGATCAATA 540 CCATATGACC AGAGCCCAGG CCCAAAGCAT CTTGCTTGGT TGCTACATTC TGGTGTGATG 600 GGTGCAGTGG TGGCTCCTCT GACAATATTA GGGGGTCCTC TTCTCATCAG AGCTGCATGG 660 TACACAGCTG GCATTGTGGG AGGCCTCTCC ACTGTGGCCA TGTGTGCGCC CAGTGAAAAG 720 TTTCTGAACA TGGGTGCACC CCTGGGAGTG GGCCTGGGTC TCGTCTTTGT GTCCTCATTG 780 GGATCTATGT TTCTTCCACC TACCACCGTG GCTGGTGCCA CTCTTTACTC AGTGGCAATG 840 TACGGTGGAT TAGTTCTTTT CAGCATGTTC CTTCTGTATG ATACCCAGAA AGTAATCAAG 900 CGTGCAGAAG TATCACCAAT GTATGGAGTT CAAAAATATG ATCCCATTAA CTCGATGCTG 960 AGTATCTACA TGGATACATT AAATATATTT ATGCGAGTTG CAACTATGCT GGCAACTGGA 1020 GGCAACAGAA AGAAA 1035 配列の数：１配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：３配列の長さ：１２６８塩基配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジ−：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 配列 AACTGCGAGG CGAAGGTGAC CGGGGACCGA GCATTTCAGA TCTGCTCGGT AGACCTGGTG 60 CACCACCACC ATG TTG GCT GCA AGG CTG GTG TGT CTC CGG ACA CTA CCT TCT 112 Met Leu Ala Ala Arg Leu Val Cys Leu Arg Thr Leu Pro Ser 1 5 10 AGG GTT TTC CAC CCA GCT TTC ACC AAG GCC TCC CCT GTT GTG AAG 157 Arg Val Phe His Pro Ala Phe Thr Lys Ala Ser Pro Val Val Lys 15 20 25 AAT TCC ATC ACG AAG AAT CAA TGG CTG TTA ACA CCT AGC AGG GAA 202 Asn Ser Ile Thr Lys Asn Gln Trp Leu Leu Thr Pro Ser Arg Glu 30 35 40 TAT GCC ACC AAA ACA AGA ATT GGG ATC CGG CGT GGG AGA ACT GGC 247 Tyr Ala Thr Lys Thr Arg Ile Gly Ile Arg Arg Gly Arg Thr Gly 45 50 55 CAA GAA CTC AAA GAG GCA GCA TTG GAA CCA TCG ATG GAA AAA ATA 292 Gln Glu Leu Lys Glu Ala Ala Leu Glu Pro Ser Met Glu Lys Ile 60 65 70 TTT AAA ATT GAT CAG ATG GGA AGA TGG TTT GTT GCT GGA GGG GCT 337 Phe Lys Ile Asp Gln Met Gly Arg Trp Phe Val Ala Gly Gly Ala 75 80 85 GCT GTT GGT CTT GGA GCA TTG TGC TAC TAT GGC TTG GGA CTG TCT 382 Ala Val Gly Leu Gly Ala Leu Cys Tyr Tyr Gly Leu Gly Leu Ser 90 95 100 AAT GAG ATT GGA GCT ATT GAA AAG GCT GTA ATT TGG CCT CAG TAT 427 Asn Glu Ile Gly Ala Ile Glu Lys Ala Val Ile Trp Pro Gln Tyr 105 110 115 GTC AAG GAT AGA ATT CAT TCC ACC TAT ATG TAC TTA GCA GGG AGT 472 Val Lys Asp Arg Ile His Ser Thr Tyr Met Tyr Leu Ala Gly Ser 120 125 130 ATT GGT TTA ACA GCT TTG TCT GCC ATA GCA ATC AGC AGA ACG CCT 517 Ile Gly Leu Thr Ala Leu Ser Ala Ile Ala Ile Ser Arg Thr Pro 135 140 145 GTT CTC ATG AAC TTC ATG ATG AGA GGC TCT TGG GTG ACA ATT GGT 562 Val Leu Met Asn Phe Met Met Arg Gly Ser Trp Val Thr Ile Gly 150 155 160 GTG ACC TTT GCA GCC ATG GTT GGA GCT GGA ATG CTG GTA CGA TCA 607 Val Thr Phe Ala Ala Met Val Gly Ala Gly Met Leu Val Arg Ser 165 170 175 ATA CCA TAT GAC CAG AGC CCA GGC CCA AAG CAT CTT GCT TGG TTG 652 Ile Pro Tyr Asp Gln Ser Pro Gly Pro Lys His Leu Ala Trp Leu 180 185 190 CTA CAT TCT GGT GTG ATG GGT GCA GTG GTG GCT CCT CTG ACA ATA 697 Leu His Ser Gly Val Met Gly Ala Val Val Ala Pro Leu Thr Ile 195 200 205 TTA GGG GGT CCT CTT CTC ATC AGA GCT GCA TGG TAC ACA GCT GGC 742 Leu Gly Gly Pro Leu Leu Ile Arg Ala Ala Trp Tyr Thr Ala Gly 210 215 220 ATT GTG GGA GGC CTC TCC ACT GTG GCC ATG TGT GCG CCC AGT GAA 787 Ile Val Gly Gly Leu Ser Thr Val Ala Met Cys Ala Pro Ser Glu 225 230 235 AAG TTT CTG AAC ATG GGT GCA CCC CTG GGA GTG GGC CTG GGT CTC 832 Lys Phe Leu Asn Met Gly Ala Pro Leu Gly Val Gly Leu Gly Leu 240 245 250 GTC TTT GTG TCC TCA TTG GGA TCT ATG TTT CTT CCA CCT ACC ACC 877 Val Phe Val Ser Ser Leu Gly Ser Met Phe Leu Pro Pro Thr Thr 255 260 265 GTG GCT GGT GCC ACT CTT TAC TCA GTG GCA ATG TAC GGT GGA TTA 922 Val Ala Gly Ala Thr Leu Tyr Ser Val Ala Met Tyr Gly Gly Leu 270 275 280 GTT CTT TTC AGC ATG TTC CTT CTG TAT GAT ACC CAG AAA GTA ATC 967 Val Leu Phe Ser Met Phe Leu Leu Tyr Asp Thr Gln Lys Val Ile 285 290 295 AAG CGT GCA GAA GTA TCA CCA ATG TAT GGA GTT CAA AAA TAT GAT 1012 Lys Arg Ala Glu Val Ser Pro Met Tyr Gly Val Gln Lys Tyr Asp 300 305 310 CCC ATT AAC TCG ATG CTG AGT ATC TAC ATG GAT ACA TTA AAT ATA 1057 Pro Ile Asn Ser Met Leu Ser Ile Tyr Met Asp Thr Leu Asn Ile 315 320 325 TTT ATG CGA GTT GCA ACT ATG CTG GCA ACT GGA GGC AAC AGA AAG 1102 Phe Met Arg Val Ala Thr Met Leu Ala Thr Gly Gly Asn Arg Lys 330 335 340 AAA TGA AGTGACT CAGCTTCTGG CTTCTCTGCT ACATCAAATA TCTTGTTTAA 1155 Lys 345 TGGGGCAGAT ATGCATTAAA TAGTTTGTAC AAGCAGCTTT CGTTGAAGTT TAGAAGATAA 1215 GAAACATGTC ATCATATTTA AATGTTCCGG TAATGTGATG CCTCAGGTCT GCC 1268

【図面の簡単な説明】

【図１】配列−１は、ヒト毛乳頭細胞から大久保らの方
法により得られる３’末端ｃＤＮＡライブラリーから、
３／７８９の頻度で確認されるＤＮＡ断片の塩基配列を
表わす。配列−２は、配列−１の一部分の逆相補鎖の配
列を示す。配列−３は、ラムダファージクローニングベ
クターのｃＤＮＡ挿入部近傍の配列を有するオリゴヌク
レオチドの配列を示す。配列−４は、抗ＤＥＲＰ２ペプ
チド抗体を調製するために使用した、ＤＥＲＰ２の部分
配列を含む抗原ペプチドの配列を示す。配列−５は、ｄ
ｅｒｐ２をＰＣＲで増幅するための部分配列である。配
列−６は、ｄｅｒｐ２をＰＣＲで増幅するための部分配
列である。

【図２】配列−１を含むｃＤＮＡライブラリーに対する
ＰＣＲを示す。

【図３】クローニングベクターpGEM Tに遺伝子ｄｅｒｐ
２を組み換えるスキームを示す。

【図４】プライマーウォーキング法の概略を示す。

【図５】抗ＤＥＲＰ２ペプチド抗体を用いて、分離培養
した毛乳頭細胞を免疫染色した図を示す。

【図６】健常人男性発毛部由来の毛乳頭細胞および男性
型脱毛症患者禿頭部由来の毛乳頭細胞での、遺伝子ｄｅ
ｒｐ２の発現量を比較した図を示す。

【図７】各種濃度のテストステロンの存在下での、遺伝
子ｄｅｒｐ２の発現を示した図を示す。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者釣谷克樹東京都豊島区高田３丁目24番地１号大正製薬株式会社内 (72)発明者荒瀬誠治徳島県徳島市南矢三町３丁目９番15号

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】以下の（ａ）または（ｂ）の蛋白質；（ａ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなる蛋白
質；（ｂ）配列番号：１のアミノ酸配列において１もしくは
数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ
酸配列からなり、かつ毛髪の成長を調節する機能を有す
る蛋白質。
【請求項２】以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡ（ａ）配列番号：２に記載の塩基配列からなるＤＮＡ（ｂ）配列番号：２のＤＮＡとストリンジェントな条件
でハイブリダイズし、かつ毛髪の成長を調節する機能を
有する蛋白質をコードするＤＮＡ。