JPH11341998A - アポト―シス細胞及びアポト―シスの間に活性化されたプロテア―ゼの検出のための方法及び試薬 - Google Patents
アポト―シス細胞及びアポト―シスの間に活性化されたプロテア―ゼの検出のための方法及び試薬Info
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- JPH11341998A JPH11341998A JP11127737A JP12773799A JPH11341998A JP H11341998 A JPH11341998 A JP H11341998A JP 11127737 A JP11127737 A JP 11127737A JP 12773799 A JP12773799 A JP 12773799A JP H11341998 A JPH11341998 A JP H11341998A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 アポトーシス、特にアポトーシスの初期発生
段階における検出のための単純で特異的な試験方法を提
供する。 【解決手段】 生体サンプル中のアポトーシスにおいて
活性化されたプロテアーゼまたはアポトーシス細胞の検
出のための方法及び試薬キットであって、前記方法は、
サンプルを、(a) アポトーシスにおいて活性化されたプ
ロテアーゼに特異的に結合するが、その活性中心をブロ
ックしない、固相に結合している結合することができる
結合パートナー、(b) 前記プロテアーゼに特異的な基
質、及び(c)反応バッファーに接触させ、サンプル中に
含まれるアポトーシス細胞及び／または活性化されたプ
ロテアーゼの指標として反応溶液中に形成された色原体
または蛍光色素を測定することを含む。
段階における検出のための単純で特異的な試験方法を提
供する。 【解決手段】 生体サンプル中のアポトーシスにおいて
活性化されたプロテアーゼまたはアポトーシス細胞の検
出のための方法及び試薬キットであって、前記方法は、
サンプルを、(a) アポトーシスにおいて活性化されたプ
ロテアーゼに特異的に結合するが、その活性中心をブロ
ックしない、固相に結合している結合することができる
結合パートナー、(b) 前記プロテアーゼに特異的な基
質、及び(c)反応バッファーに接触させ、サンプル中に
含まれるアポトーシス細胞及び／または活性化されたプ
ロテアーゼの指標として反応溶液中に形成された色原体
または蛍光色素を測定することを含む。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、真核生物細胞にお
けるアポトーシスまたはアポトーシス特異的プロテアー
ゼの検出のための方法、並びにこの検出方法に適した試
薬キットに関する。
けるアポトーシスまたはアポトーシス特異的プロテアー
ゼの検出のための方法、並びにこの検出方法に適した試
薬キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】いわゆるプログラムされた細胞死は、組
織、器官及び生物の全体の発生及び機能性について大き
な重要性を有しており(J. Cohen, Advances in Immunol
ogy 50(1991), 55-85)、自己免疫あるいは虚血性障害、
様々なタイプの癌、アルツハイマー病及び他の神経退化
現象のような多くの疾患において観察されている(G.M.
Cohen, Biochem. J.326 (1997), 1-16)。このようにし
て死滅した細胞は、モノヌクレオソーム及びオリゴヌク
レオソームとして細胞質中のヒストンと結合するＤＮＡ
断片によって特徴付けられる。そのような発現（manife
station ）は、例えばイオン化放射線(Yamadaら、Int.
J. Radiat. Biol. 53 (1988), 65)、あるいは抗fas(Yon
eharaら、J. Exp. Med.169 (1989), 1747-1756)もしく
は抗APO-l(Trauthら、Science 245 (1989), 301-304)等
のある種のモノクローナル抗体により引き起こされるよ
うな誘導細胞死においても観察される。細胞障害性Ｔ細
胞及びナチュラルキラー細胞も、そのような誘導細胞死
を引き起こす(例えば、S.Curnowら、Cancer Immunol. I
mmunother. 36 (1993), 149-155を参照)。しかし、それ
らはまた例えば壊死現象において観察されるような原形
質膜の亢進した透過性も引き起こす(Kraehenbuehlら、I
mmunol. Today12 (1991), 389-402)。記載したような種
類のプログラム細胞死または誘導細胞死はアポトーシス
といわれる。アポトーシスは、原形質膜の小胞性隆起、
クロマチンの凝縮、及び内在性のエンドヌクレアーゼの
活性化によって特徴付けられる。壊死とは異なり、アポ
トーシスは真核生物細胞の積極的なプロセスである。ア
ポトーシスにおいて活性化されたカルシウム及びマグネ
シウム依存性エンドヌクレアーゼは、ヌクレオソーム間
の容易に接近可能なリンカー領域中で、ＤＮＡ二本鎖を
モノヌクレオソーム及びオリゴヌクレオソームに開裂す
る。これに対し、ヌクレオソームにおけるＤＮＡは、一
定のコアヒストンと固く結合しており、従ってエンドヌ
クレアーゼによる開裂から保護されている(Burgoyne
ら、Biochem. J. 143 (1974), 67; Stachら、J. Neuroc
hem. 33 (1979), 257)。従って、アポトーシス細胞に典
型的な、約180塩基対あるいはその倍数の長さのＤＮＡ
断片のパターンである「ＤＮＡラダー」(Wyllie, Natur
e 284 (1980), 555 - 556; J. Cohen, Advances in Imm
unology 50 (1991), 55-85)が、ＤＮＡの抽出及びアガ
ロースゲルにおける分離の後に検出可能である。細胞の
原形質膜は、このアポトーシスの早期の段階においては
無傷のままである。このようにしてモノヌクレオソーム
及びオリゴヌクレオソーム及びその他の高分子量成分
は、死滅していく細胞の細胞質に蓄積される(Dukeら、L
ymphokine Research 5 (1986), 289-299)。
織、器官及び生物の全体の発生及び機能性について大き
な重要性を有しており(J. Cohen, Advances in Immunol
ogy 50(1991), 55-85)、自己免疫あるいは虚血性障害、
様々なタイプの癌、アルツハイマー病及び他の神経退化
現象のような多くの疾患において観察されている(G.M.
Cohen, Biochem. J.326 (1997), 1-16)。このようにし
て死滅した細胞は、モノヌクレオソーム及びオリゴヌク
レオソームとして細胞質中のヒストンと結合するＤＮＡ
断片によって特徴付けられる。そのような発現（manife
station ）は、例えばイオン化放射線(Yamadaら、Int.
J. Radiat. Biol. 53 (1988), 65)、あるいは抗fas(Yon
eharaら、J. Exp. Med.169 (1989), 1747-1756)もしく
は抗APO-l(Trauthら、Science 245 (1989), 301-304)等
のある種のモノクローナル抗体により引き起こされるよ
うな誘導細胞死においても観察される。細胞障害性Ｔ細
胞及びナチュラルキラー細胞も、そのような誘導細胞死
を引き起こす(例えば、S.Curnowら、Cancer Immunol. I
mmunother. 36 (1993), 149-155を参照)。しかし、それ
らはまた例えば壊死現象において観察されるような原形
質膜の亢進した透過性も引き起こす(Kraehenbuehlら、I
mmunol. Today12 (1991), 389-402)。記載したような種
類のプログラム細胞死または誘導細胞死はアポトーシス
といわれる。アポトーシスは、原形質膜の小胞性隆起、
クロマチンの凝縮、及び内在性のエンドヌクレアーゼの
活性化によって特徴付けられる。壊死とは異なり、アポ
トーシスは真核生物細胞の積極的なプロセスである。ア
ポトーシスにおいて活性化されたカルシウム及びマグネ
シウム依存性エンドヌクレアーゼは、ヌクレオソーム間
の容易に接近可能なリンカー領域中で、ＤＮＡ二本鎖を
モノヌクレオソーム及びオリゴヌクレオソームに開裂す
る。これに対し、ヌクレオソームにおけるＤＮＡは、一
定のコアヒストンと固く結合しており、従ってエンドヌ
クレアーゼによる開裂から保護されている(Burgoyne
ら、Biochem. J. 143 (1974), 67; Stachら、J. Neuroc
hem. 33 (1979), 257)。従って、アポトーシス細胞に典
型的な、約180塩基対あるいはその倍数の長さのＤＮＡ
断片のパターンである「ＤＮＡラダー」(Wyllie, Natur
e 284 (1980), 555 - 556; J. Cohen, Advances in Imm
unology 50 (1991), 55-85)が、ＤＮＡの抽出及びアガ
ロースゲルにおける分離の後に検出可能である。細胞の
原形質膜は、このアポトーシスの早期の段階においては
無傷のままである。このようにしてモノヌクレオソーム
及びオリゴヌクレオソーム及びその他の高分子量成分
は、死滅していく細胞の細胞質に蓄積される(Dukeら、L
ymphokine Research 5 (1986), 289-299)。
【０００３】アポトーシス細胞の生化学的発生において
役割を果たすいくつかの分子が近年確認され、また胚形
成から免疫系の発生にわたる生物学的プロセスについて
のアポトーシスの基本的な重要性に関する認識が研究者
において高まっているが、アポトーシス発生のメカニズ
ムの多くの部分は未解明のままである(M. Tewariら、Ce
ll 81 (1995), 801-809)。しかし最近の証拠によれば、
システインプロテアーゼのファミリーに属するある種の
プロテアーゼ、いわゆるカスパーゼ(CASPASE)がアポト
ーシスの発生において重要な役割を果たしていることが
示されている(D.W. Nicholson及びN.A. Thornberry, TI
BS 22 (1997), 299-306)。特に、チモーゲンカスパーゼ
（caspase ）３（システイニル-アスパラギン酸プロテ
アーゼ、CPP-32、apopain、yama)がアポトーシスの発生
の間に活性形態で存在することが示された(D.W. Nichol
sonら、Nature376 (1995), 37-43)。
役割を果たすいくつかの分子が近年確認され、また胚形
成から免疫系の発生にわたる生物学的プロセスについて
のアポトーシスの基本的な重要性に関する認識が研究者
において高まっているが、アポトーシス発生のメカニズ
ムの多くの部分は未解明のままである(M. Tewariら、Ce
ll 81 (1995), 801-809)。しかし最近の証拠によれば、
システインプロテアーゼのファミリーに属するある種の
プロテアーゼ、いわゆるカスパーゼ(CASPASE)がアポト
ーシスの発生において重要な役割を果たしていることが
示されている(D.W. Nicholson及びN.A. Thornberry, TI
BS 22 (1997), 299-306)。特に、チモーゲンカスパーゼ
（caspase ）３（システイニル-アスパラギン酸プロテ
アーゼ、CPP-32、apopain、yama)がアポトーシスの発生
の間に活性形態で存在することが示された(D.W. Nichol
sonら、Nature376 (1995), 37-43)。
【０００４】アポトーシスまたはアポトーシス特異的プ
ロテアーゼの検出のための方法は記載されており、本質
的には適当なペプチド基質の開裂及びこのプロセスの間
に放出される蛍光成分または比色成分の検出に基づくも
のである(例えばD.W. Nicholsonら、Nature376 (1995),
37-43)。しかし、アポトーシス特異的プロテアーゼの
検出のための既存の試験方法の欠点は、同様にペプチド
基質を開裂する、アポトーシスの発生に関係するその他
のプロテアーゼも分析されてしまい、従って必要な特異
性を有していないということである。
ロテアーゼの検出のための方法は記載されており、本質
的には適当なペプチド基質の開裂及びこのプロセスの間
に放出される蛍光成分または比色成分の検出に基づくも
のである(例えばD.W. Nicholsonら、Nature376 (1995),
37-43)。しかし、アポトーシス特異的プロテアーゼの
検出のための既存の試験方法の欠点は、同様にペプチド
基質を開裂する、アポトーシスの発生に関係するその他
のプロテアーゼも分析されてしまい、従って必要な特異
性を有していないということである。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】従って本発明の目的
は、アポトーシス、特にアポトーシスの初期発生段階に
おける検出のための単純で特異的な試験方法を提供する
ことであった。
は、アポトーシス、特にアポトーシスの初期発生段階に
おける検出のための単純で特異的な試験方法を提供する
ことであった。
【０００６】
【課題を解決するための手段】上記目的は、分析される
細胞集団を含むライゼートを、アポトーシスの間に活性
化されたプロテアーゼに特異的に結合するが、該プロテ
アーゼの活性中心をブロックしない結合パートナーとイ
ンキュベートし、前記プロテアーゼに特異的なペプチド
基質に接触させて検出可能な基に結合し、反応バッファ
ーに接触させ、基質から放出される検出可能な基を測定
することを特徴とする、アポトーシス特異的プロテアー
ゼの検出方法によって達成される。
細胞集団を含むライゼートを、アポトーシスの間に活性
化されたプロテアーゼに特異的に結合するが、該プロテ
アーゼの活性中心をブロックしない結合パートナーとイ
ンキュベートし、前記プロテアーゼに特異的なペプチド
基質に接触させて検出可能な基に結合し、反応バッファ
ーに接触させ、基質から放出される検出可能な基を測定
することを特徴とする、アポトーシス特異的プロテアー
ゼの検出方法によって達成される。
【０００７】
【発明の実施の形態】本発明の方法においては、結合パ
ートナーは、サンプルすなわちライゼートとの接触の前
にマイクロタイタープレートまたはラテックス粒子のよ
うな固相に結合するか、あるいはプロテアーゼ基質との
インキュベートの後に適当な固相に結合することができ
る。システイニル-アスパラギン酸プロテアーゼ、例え
ばカスパーゼ3またはカスパーゼ8はアポトーシスの間に
活性化される本発明に特に適したプロテアーゼである。
ートナーは、サンプルすなわちライゼートとの接触の前
にマイクロタイタープレートまたはラテックス粒子のよ
うな固相に結合するか、あるいはプロテアーゼ基質との
インキュベートの後に適当な固相に結合することができ
る。システイニル-アスパラギン酸プロテアーゼ、例え
ばカスパーゼ3またはカスパーゼ8はアポトーシスの間に
活性化される本発明に特に適したプロテアーゼである。
【０００８】驚くべきことに、アポトーシス細胞、すな
わちプログラムされたあるいは誘導された細胞死により
死滅した細胞が、約1.5〜2時間のインキュベートの後
で、約1000未満のアポトーシス細胞が存在する場合に、
試験される細胞集団を予備標識することなく、既に測定
シグナルを生成することが判明した。この結果、非増殖
細胞をin vitroで調べることも可能である。さらに、本
発明の方法は、分析されるサンプル(細胞集団)における
アポトーシスの程度の単純で迅速な定量測定を可能と
し、しかも非常に感度が高い。
わちプログラムされたあるいは誘導された細胞死により
死滅した細胞が、約1.5〜2時間のインキュベートの後
で、約1000未満のアポトーシス細胞が存在する場合に、
試験される細胞集団を予備標識することなく、既に測定
シグナルを生成することが判明した。この結果、非増殖
細胞をin vitroで調べることも可能である。さらに、本
発明の方法は、分析されるサンプル(細胞集団)における
アポトーシスの程度の単純で迅速な定量測定を可能と
し、しかも非常に感度が高い。
【０００９】アポトーシス細胞の細胞質からアポトーシ
スにおいて活性化されたプロテアーゼを放出させるた
め、分析される細胞集団を、約0.1〜2.0%(w/v)の濃度の
アニオン性または非イオン性界面活性剤、例えばTrito
n、Tween、もしくはNonidet P40等、及び約5.5〜9.0、
好ましくは約7〜9のpH範囲に緩衝する物質を本質的に含
む適当な溶解バッファーとインキュベートする。例え
ば、リン酸、トリス-HCl及びHepesが適している。バッ
ファーの濃度は、約1〜200 mM、好ましくは約10〜80 m
M、特に好ましくは約50 mMである。さらに、約0.1〜100
μMの濃度の、亜硫酸基を還元する物質、例えばジチオ
トレイトール(DTT)またはジチオエリトリトール及び／
または塩化ナトリウムを溶解バッファーに任意に加え
て、生理的な塩濃度を確保することができる。
スにおいて活性化されたプロテアーゼを放出させるた
め、分析される細胞集団を、約0.1〜2.0%(w/v)の濃度の
アニオン性または非イオン性界面活性剤、例えばTrito
n、Tween、もしくはNonidet P40等、及び約5.5〜9.0、
好ましくは約7〜9のpH範囲に緩衝する物質を本質的に含
む適当な溶解バッファーとインキュベートする。例え
ば、リン酸、トリス-HCl及びHepesが適している。バッ
ファーの濃度は、約1〜200 mM、好ましくは約10〜80 m
M、特に好ましくは約50 mMである。さらに、約0.1〜100
μMの濃度の、亜硫酸基を還元する物質、例えばジチオ
トレイトール(DTT)またはジチオエリトリトール及び／
または塩化ナトリウムを溶解バッファーに任意に加え
て、生理的な塩濃度を確保することができる。
【００１０】溶解バッファーとのインキュベートは、約
1〜5分間、約0〜4℃の温度で行う。不溶解性の細胞成分
は遠心分離によって除去する。このようにして得られた
ライゼートを、好ましくはモノクローナルまたはポリク
ローナル抗体である適当な結合パートナーに加える。本
発明によれば、システイニル-アスパラギン酸プロテア
ーゼまたは免疫学的に活性なその断片に対するモノクロ
ーナル抗体が特に好ましい。約25 kDaの巨大タンパク質
断片(例えばヒトCPP-32(アミノ酸1〜219)またはMACHプ
ロテアーゼのもの)を免疫原として使用して、好ましく
は約10日の間隔で、3回注射することにより得られた抗
体(例えばクローン19)を使用することが特に適している
ことが判明した。このようにして得られるクローンは、
当業者に知られている方法により任意にクロマトグラフ
ィー精製したものが本発明の方法に特に適している。あ
るいは、適する抗体は、例えばTransduction Laborator
ies Company, Lexington, KY (USA)のような適当な販売
者から市販品として得ることができる。
1〜5分間、約0〜4℃の温度で行う。不溶解性の細胞成分
は遠心分離によって除去する。このようにして得られた
ライゼートを、好ましくはモノクローナルまたはポリク
ローナル抗体である適当な結合パートナーに加える。本
発明によれば、システイニル-アスパラギン酸プロテア
ーゼまたは免疫学的に活性なその断片に対するモノクロ
ーナル抗体が特に好ましい。約25 kDaの巨大タンパク質
断片(例えばヒトCPP-32(アミノ酸1〜219)またはMACHプ
ロテアーゼのもの)を免疫原として使用して、好ましく
は約10日の間隔で、3回注射することにより得られた抗
体(例えばクローン19)を使用することが特に適している
ことが判明した。このようにして得られるクローンは、
当業者に知られている方法により任意にクロマトグラフ
ィー精製したものが本発明の方法に特に適している。あ
るいは、適する抗体は、例えばTransduction Laborator
ies Company, Lexington, KY (USA)のような適当な販売
者から市販品として得ることができる。
【００１１】検出可能な基に結合されるプロテアーゼの
ためのペプチド基質は、例えば色原体あるいは蛍光基に
結合される2〜約20のアミノ酸からなるペプチドであ
る。ペプチド基質は好ましくは少なくとも10アミノ酸を
含み、特に好ましくはトリペプチドからオクタペプチド
である。さらに一体化された開裂配列を有する環式のペ
プチド基質も本発明の方法に使用でき、その場合、開裂
ペプチドは酵素を相補してその活性型を形成する。好ま
しいペプチド基質は特に以下のアミノ酸配列： Trp(Le
u)-Glu-His-Asp、Asp-Glu-Val(His)-Asp、または以下の
3種の配列Va1(Leu)-Glu-His(Thr)-Aspのうちの1つを有
するペプチド断片である。さらにペプチド基質はアセチ
ル化することができ、好ましくは末端の非アセチル化ア
ミノ酸に検出可能な基を含む。適した検出可能な、すな
わち色原体または蛍光基は、好ましくはクマリン、ニト
ロアニリドまたはナフチルアミド誘導体である。特に以
下の基質、アセチル-Asp-Glu-Val-Asp-7-アミド-4-トリ
フルオロメチル-クマリン(Ac-DEVD-AFC)、アセチル-Asp
-Glu-Val-Asp-7-アミド-4-メチルクマリン(Ac-DEVD-AM
C)、(7-メトキシクマリン-4-イル)アセチル-Asp-Glu-Va
l-Asp-Ala-Pro-Lys(2,4-ジニトロフェニル)OH(Mca)、(4
-(4-ジメチルアミノフェニルアゾ)ベンゾイル-Asp-Glu-
Val-Asp-5-[(2-アミノエチル)アミノ]-ナフタレン-1-ス
ルホン酸またはローダミン-110-DEVD誘導体が本発明に
適していることが判明した。
ためのペプチド基質は、例えば色原体あるいは蛍光基に
結合される2〜約20のアミノ酸からなるペプチドであ
る。ペプチド基質は好ましくは少なくとも10アミノ酸を
含み、特に好ましくはトリペプチドからオクタペプチド
である。さらに一体化された開裂配列を有する環式のペ
プチド基質も本発明の方法に使用でき、その場合、開裂
ペプチドは酵素を相補してその活性型を形成する。好ま
しいペプチド基質は特に以下のアミノ酸配列： Trp(Le
u)-Glu-His-Asp、Asp-Glu-Val(His)-Asp、または以下の
3種の配列Va1(Leu)-Glu-His(Thr)-Aspのうちの1つを有
するペプチド断片である。さらにペプチド基質はアセチ
ル化することができ、好ましくは末端の非アセチル化ア
ミノ酸に検出可能な基を含む。適した検出可能な、すな
わち色原体または蛍光基は、好ましくはクマリン、ニト
ロアニリドまたはナフチルアミド誘導体である。特に以
下の基質、アセチル-Asp-Glu-Val-Asp-7-アミド-4-トリ
フルオロメチル-クマリン(Ac-DEVD-AFC)、アセチル-Asp
-Glu-Val-Asp-7-アミド-4-メチルクマリン(Ac-DEVD-AM
C)、(7-メトキシクマリン-4-イル)アセチル-Asp-Glu-Va
l-Asp-Ala-Pro-Lys(2,4-ジニトロフェニル)OH(Mca)、(4
-(4-ジメチルアミノフェニルアゾ)ベンゾイル-Asp-Glu-
Val-Asp-5-[(2-アミノエチル)アミノ]-ナフタレン-1-ス
ルホン酸またはローダミン-110-DEVD誘導体が本発明に
適していることが判明した。
【００１２】プロテアーゼを含むサンプル、結合パート
ナーすなわち抗体、及びプロテアーゼ基質の間の反応
は、結合パートナーすなわち抗体を固相に結合する前ま
たは後に行うことができる。インキュベートに使用する
バッファー溶液は、本質的に1〜200 mMの濃度の約5.5〜
9.0のpH範囲に緩衝する物質、約0.1〜100μM、好ましく
は約5〜60μMの濃度の亜硫酸基を還元する物質、例えば
DTTまたはジチオエリトリトール、及び任意に約0.1〜1.
0 mMの濃度のEDTA及び／またはEGTAを含む。さらにバッ
ファーは、生理食塩水及び／またはマグネシウム塩を好
ましくは約1mM含むことができる。本発明の別の好まし
い態様は、細胞を溶解するために使用されるバッファー
及び反応バッファーが同一で、約0.1〜1%(w/v)の適当な
界面活性剤、及び約5〜60μMの亜硫酸基を還元する物質
を含む場合である。
ナーすなわち抗体、及びプロテアーゼ基質の間の反応
は、結合パートナーすなわち抗体を固相に結合する前ま
たは後に行うことができる。インキュベートに使用する
バッファー溶液は、本質的に1〜200 mMの濃度の約5.5〜
9.0のpH範囲に緩衝する物質、約0.1〜100μM、好ましく
は約5〜60μMの濃度の亜硫酸基を還元する物質、例えば
DTTまたはジチオエリトリトール、及び任意に約0.1〜1.
0 mMの濃度のEDTA及び／またはEGTAを含む。さらにバッ
ファーは、生理食塩水及び／またはマグネシウム塩を好
ましくは約1mM含むことができる。本発明の別の好まし
い態様は、細胞を溶解するために使用されるバッファー
及び反応バッファーが同一で、約0.1〜1%(w/v)の適当な
界面活性剤、及び約5〜60μMの亜硫酸基を還元する物質
を含む場合である。
【００１３】それぞれのサンプルにおけるアポトーシス
細胞の数により、インキュベートは約37℃の温度及びpH
7.8で、約30分〜12時間行うことができる。ほとんどの
場合1.5〜5時間の反応時間が適当であることが判明し
た。アポトーシスが誘導されなかった分析される細胞集
団の、実施例1で記載する手順、すなわち平行培養を陰
性対照として使用する。細胞ライゼートなしで測定され
るシグナルは測定のためのブランク値を与え、これは測
定値から減じられる。反応混合物中で検出可能な基につ
いての測定値は、誘導のない測定値より少なくとも2倍
上回るアポトーシスが再現性をもって存在することによ
り陽性とする。この場合、同じ細胞型及び同じ起源の細
胞の培養を、アポトーシスが誘導されなかった分析され
る細胞集団の平行培養として使用し、ここでは使用する
細胞のこれまでの来歴と培養条件に基づいてアポトーシ
スが誘導されなかったと推定される。in vitroで誘導さ
れたアポトーシスを測定することを意図する場合は、分
析される細胞集団を2つの平行調製物に分割し、アポト
ーシスを誘発する試薬（例えばカンプトテシン)の存在
下及び非存在下において予備インキュベートする。
細胞の数により、インキュベートは約37℃の温度及びpH
7.8で、約30分〜12時間行うことができる。ほとんどの
場合1.5〜5時間の反応時間が適当であることが判明し
た。アポトーシスが誘導されなかった分析される細胞集
団の、実施例1で記載する手順、すなわち平行培養を陰
性対照として使用する。細胞ライゼートなしで測定され
るシグナルは測定のためのブランク値を与え、これは測
定値から減じられる。反応混合物中で検出可能な基につ
いての測定値は、誘導のない測定値より少なくとも2倍
上回るアポトーシスが再現性をもって存在することによ
り陽性とする。この場合、同じ細胞型及び同じ起源の細
胞の培養を、アポトーシスが誘導されなかった分析され
る細胞集団の平行培養として使用し、ここでは使用する
細胞のこれまでの来歴と培養条件に基づいてアポトーシ
スが誘導されなかったと推定される。in vitroで誘導さ
れたアポトーシスを測定することを意図する場合は、分
析される細胞集団を2つの平行調製物に分割し、アポト
ーシスを誘発する試薬（例えばカンプトテシン)の存在
下及び非存在下において予備インキュベートする。
【００１４】本発明の方法の好ましい態様においては、
結合パートナーは、インキュベートの前あるいは後にス
トレプトアビジンで被覆した固相に結合するためにビオ
チン化される。
結合パートナーは、インキュベートの前あるいは後にス
トレプトアビジンで被覆した固相に結合するためにビオ
チン化される。
【００１５】このように、本発明の方法により、アポト
ーシスを誘発する細胞または化合物の細胞毒性（傷害
性）、並びにアポトーシスによって特異的に誘導される
プロテアーゼを単純な方法で判定することが可能であ
る。
ーシスを誘発する細胞または化合物の細胞毒性（傷害
性）、並びにアポトーシスによって特異的に誘導される
プロテアーゼを単純な方法で判定することが可能であ
る。
【００１６】従って本発明はさらに、細胞毒性細胞、ナ
チュラルキラー細胞、イオン化放射線、化学的物質、例
えばモノクローナル抗体、ホルモン(例えば糖質コルチ
コイド)または毒素(例えばダイオキシン)の細胞傷害作
用あるいは活性を測定するための本発明の方法の使用に
関する。細胞傷害作用または活性は、この場合標的細胞
として使用される細胞集団において本発明の方法により
測定されるアポトーシスの程度により得られる。
チュラルキラー細胞、イオン化放射線、化学的物質、例
えばモノクローナル抗体、ホルモン(例えば糖質コルチ
コイド)または毒素(例えばダイオキシン)の細胞傷害作
用あるいは活性を測定するための本発明の方法の使用に
関する。細胞傷害作用または活性は、この場合標的細胞
として使用される細胞集団において本発明の方法により
測定されるアポトーシスの程度により得られる。
【００１７】本発明はまた、アポトーシス細胞またはア
ポトーシスにおいて活性化されたプロテアーゼの検出の
ための試薬キットであって、アポトーシスにおいて活性
化されたプロテアーゼに特異的に結合するが、該プロテ
アーゼの活性中心をブロックすることがない結合パート
ナー、該プロテアーゼに特異的な基質、及び適当な反応
バッファーを含む試薬キットに関する。結合パートナー
(実施例におけるカスパーゼ3)は固相に結合して存在す
るか、あるいはインキュベートの後にそのような固相に
結合されるだけのものとし得る。好ましい態様は、結合
パートナーがヒトCPP-32の約25 kDaタンパク質断片及び
／またはアセチル-Asp-Glu-Val-Asp-7-アミド-4-トリフ
ルオロメチル-クマリンのような蛍光標識されたペプチ
ド基質に対して生成されたモノクローナルまたはポリク
ローナル抗体である場合である。
ポトーシスにおいて活性化されたプロテアーゼの検出の
ための試薬キットであって、アポトーシスにおいて活性
化されたプロテアーゼに特異的に結合するが、該プロテ
アーゼの活性中心をブロックすることがない結合パート
ナー、該プロテアーゼに特異的な基質、及び適当な反応
バッファーを含む試薬キットに関する。結合パートナー
(実施例におけるカスパーゼ3)は固相に結合して存在す
るか、あるいはインキュベートの後にそのような固相に
結合されるだけのものとし得る。好ましい態様は、結合
パートナーがヒトCPP-32の約25 kDaタンパク質断片及び
／またはアセチル-Asp-Glu-Val-Asp-7-アミド-4-トリフ
ルオロメチル-クマリンのような蛍光標識されたペプチ
ド基質に対して生成されたモノクローナルまたはポリク
ローナル抗体である場合である。
【００１８】さらに、本発明の試薬キットは、アポトー
シス状態において活性化されたプロテアーゼを阻害する
ことができる物質を発見するために適していることが判
明した。さらに、アポトーシスの間に活性化されたプロ
テアーゼに対する増幅効果、すなわち誘導効果を有する
物質を見出すことができる。そのような阻害あるいは誘
導物質は、薬剤のような活性物質として使用することが
できる。例えば、アポトーシス状態において活性化され
たプロテアーゼの90%以上の阻害を引き起こす物質は、
アポトーシス細胞の死滅を停止させることができるか、
あるいはそれらの消滅を遅らせることができる。好適で
あることが判明したそのような阻害物質は、例えばアセ
チルアスパラギニル-グルタミニル-バリニル-アスパラ
ギン酸アルデヒド(Ac-DEVD-CHO)またはベンジルオキシ
カルボニル-バリニル-アラニニル-DL-アスパラギン酸-
フルオロメチルケトン(Z-VAD-fmk)のようなペプチド誘
導体である。さらに、アポトーシス状態において活性化
されたプロテアーゼを誘導することができる物質は特異
的プロテアーゼの単離のための有用な道具である。この
場合、そのようなプロテアーゼの活性を少なくとも1.5
倍増幅することができる物質が適していることが判明し
た。
シス状態において活性化されたプロテアーゼを阻害する
ことができる物質を発見するために適していることが判
明した。さらに、アポトーシスの間に活性化されたプロ
テアーゼに対する増幅効果、すなわち誘導効果を有する
物質を見出すことができる。そのような阻害あるいは誘
導物質は、薬剤のような活性物質として使用することが
できる。例えば、アポトーシス状態において活性化され
たプロテアーゼの90%以上の阻害を引き起こす物質は、
アポトーシス細胞の死滅を停止させることができるか、
あるいはそれらの消滅を遅らせることができる。好適で
あることが判明したそのような阻害物質は、例えばアセ
チルアスパラギニル-グルタミニル-バリニル-アスパラ
ギン酸アルデヒド(Ac-DEVD-CHO)またはベンジルオキシ
カルボニル-バリニル-アラニニル-DL-アスパラギン酸-
フルオロメチルケトン(Z-VAD-fmk)のようなペプチド誘
導体である。さらに、アポトーシス状態において活性化
されたプロテアーゼを誘導することができる物質は特異
的プロテアーゼの単離のための有用な道具である。この
場合、そのようなプロテアーゼの活性を少なくとも1.5
倍増幅することができる物質が適していることが判明し
た。
【００１９】アポトーシス状態において活性化されたプ
ロテアーゼは、特に、システインまたはシステイニル-
アスパラギン酸プロテアーゼである。
ロテアーゼは、特に、システインまたはシステイニル-
アスパラギン酸プロテアーゼである。
【００２０】
【実施例】以下の実施例により本発明をさらに説明す
る。
る。
【００２１】実施例1：プロテアーゼ活性化/カンプトテ
シン 細胞系においてアポトーシスを誘発するために、ヒト細
胞(U937;コーカサス人のヒト組織球性リンパ腫)をカン
プトテシン(トポイソメラーゼI阻害剤、化学治療剤)で
処理した。5×105細胞/mlを4 μg/mlのカンプトテシン
(CAM)と種々の時間インキュベートした場合、プロテア
ーゼ活性の増加は2時間後にすでに検出される。アポト
ーシスによって活性化されたプロテアーゼ(カスパーゼ
3)を検出するために、処理された細胞培養物から約106
の細胞を取り、氷上で溶解バッファー(50 mM NaPO4、10
mM NaCl、1 mM MgCl2、0.25%(w/v) Nonidet P40、0.3
mM EDTA、pH 7.8)中で溶解した。次に特異的カスパーゼ
3の分析のために、固相に結合され、ライゼートからカ
スパーゼ3を結合する、カスパーゼ3に対して生成された
抗体にライゼートを接触させる。上清(全ての非特異的
成分及び酵素を含む)を除去した後、基質(50μM Ac-DEV
D-AFC)を加え、そのカスパーゼ3により媒介される基質
転換を蛍光クマリン開裂生成物の形成によって測定す
る。ブランク値(ライゼート添加なしの基質の自己蛍光)
を差し引いた後、カスパーゼ3活性の動力学的変化をグ
ラフとして示すことができる(図1)。
シン 細胞系においてアポトーシスを誘発するために、ヒト細
胞(U937;コーカサス人のヒト組織球性リンパ腫)をカン
プトテシン(トポイソメラーゼI阻害剤、化学治療剤)で
処理した。5×105細胞/mlを4 μg/mlのカンプトテシン
(CAM)と種々の時間インキュベートした場合、プロテア
ーゼ活性の増加は2時間後にすでに検出される。アポト
ーシスによって活性化されたプロテアーゼ(カスパーゼ
3)を検出するために、処理された細胞培養物から約106
の細胞を取り、氷上で溶解バッファー(50 mM NaPO4、10
mM NaCl、1 mM MgCl2、0.25%(w/v) Nonidet P40、0.3
mM EDTA、pH 7.8)中で溶解した。次に特異的カスパーゼ
3の分析のために、固相に結合され、ライゼートからカ
スパーゼ3を結合する、カスパーゼ3に対して生成された
抗体にライゼートを接触させる。上清(全ての非特異的
成分及び酵素を含む)を除去した後、基質(50μM Ac-DEV
D-AFC)を加え、そのカスパーゼ3により媒介される基質
転換を蛍光クマリン開裂生成物の形成によって測定す
る。ブランク値(ライゼート添加なしの基質の自己蛍光)
を差し引いた後、カスパーゼ3活性の動力学的変化をグ
ラフとして示すことができる(図1)。
【００２２】実施例2：特異的結合パートナーなしの色
素/蛍光基質 ライゼートを分析することができるが、カスパーゼ3を
特異的に捕捉することはできない細胞モデル(U937/CAM)
についての機能試験として非特異的カスパーゼアッセイ
(Clonetech)を使用した。実施例1と同様に、Ac-DEVD-AF
Cを基質として使用し、比色基質(Ac-DEVD-pNA)を平行し
て使用した。各DEVD基質はカスパーゼ3並びにカスパー
ゼ1、カスパーゼ2及びカスパーゼ7によって開裂される
ので、これらの混合物は非特異的である。
素/蛍光基質 ライゼートを分析することができるが、カスパーゼ3を
特異的に捕捉することはできない細胞モデル(U937/CAM)
についての機能試験として非特異的カスパーゼアッセイ
(Clonetech)を使用した。実施例1と同様に、Ac-DEVD-AF
Cを基質として使用し、比色基質(Ac-DEVD-pNA)を平行し
て使用した。各DEVD基質はカスパーゼ3並びにカスパー
ゼ1、カスパーゼ2及びカスパーゼ7によって開裂される
ので、これらの混合物は非特異的である。
【００２３】評価により、アポトーシスモデルが原則と
して機能し、比色及び蛍光基質はアポトーシス誘導の間
に開裂されることが示された。
して機能し、比色及び蛍光基質はアポトーシス誘導の間
に開裂されることが示された。
【００２４】実施例3：抗体選択 カスパーゼ3を認識する種々の抗体を固相(MTP)上に固定
し、これによりカスパーゼ3(活性化及び非活性化酵素)
がライゼートから結合された。しかし、蛍光基質(50μM
AMC)の添加の後、陽性のシグナルは本発明による抗体
(例えばクローン19)を使用した場合にのみ見られた。そ
の他3種の抗体はカスパーゼ3に結合するが、有意なシグ
ナル、すなわちプロテアーゼ活性は測定できない。
し、これによりカスパーゼ3(活性化及び非活性化酵素)
がライゼートから結合された。しかし、蛍光基質(50μM
AMC)の添加の後、陽性のシグナルは本発明による抗体
(例えばクローン19)を使用した場合にのみ見られた。そ
の他3種の抗体はカスパーゼ3に結合するが、有意なシグ
ナル、すなわちプロテアーゼ活性は測定できない。
【００２５】
【表１】
【００２６】実施例4：最適な蛍光基質の選択 3種の蛍光基質を試験した。それらは、アセチル-Asp-Gl
u-Val-Asp-7-アミド-4-トリフルオロメチル-クマリン(A
FC)、アセチル-Asp-Glu-Val-Asp-7-アミド-4-メチル-ク
マリン(AMC)、及び(7-メトキシクマリン-4-イル)アセチ
ル-Asp-Glu-Val-Asp-Ala-Pro-Lys(2,4-ジニトロフェニ
ル)OH(Mca)である。これら3種の基質を、i)バックグラ
ウンド、ii) シグナルレベル、及びiii) +/-誘導からの
シグナル比の評価基準を使用して互いに比較した。AMC
誘導体が最も高いシグナルを生成したが、ライゼート添
加なしの基質の自己蛍光も比較的高いことがわかった。
さらに、Mca基質はいくらか良好な比を示したが、シグ
ナルレベルは低かった。これに対し、非常に良好なシグ
ナル収量の最適比はAFC基質により得られた。
u-Val-Asp-7-アミド-4-トリフルオロメチル-クマリン(A
FC)、アセチル-Asp-Glu-Val-Asp-7-アミド-4-メチル-ク
マリン(AMC)、及び(7-メトキシクマリン-4-イル)アセチ
ル-Asp-Glu-Val-Asp-Ala-Pro-Lys(2,4-ジニトロフェニ
ル)OH(Mca)である。これら3種の基質を、i)バックグラ
ウンド、ii) シグナルレベル、及びiii) +/-誘導からの
シグナル比の評価基準を使用して互いに比較した。AMC
誘導体が最も高いシグナルを生成したが、ライゼート添
加なしの基質の自己蛍光も比較的高いことがわかった。
さらに、Mca基質はいくらか良好な比を示したが、シグ
ナルレベルは低かった。これに対し、非常に良好なシグ
ナル収量の最適比はAFC基質により得られた。
【００２７】実施例5：インキュベーションバッファー
の最適化 細胞ライゼートを調製するためにも使用することができ
る最適な基質バッファーを得るため、種々のバッファー
組成物を試験した。評価により、シグナルレベルがDTT
の存在に大きく依存することが示された。さらに、最適
比及びシグナル収量は、試験した溶液のバッファー組成
物2に見出された。それぞれの場合において、EDTA及び
／またはEGTAを省略することは可能であるが、DTTを使
用しない場合、EDTAまたはEGTAの存在は明らかに利点を
有する(EDTA及びEGTAはバッファー2及び3においてのみ
存在し、これらのみがDTTなしで陽性シグナルを生成す
るバッファーの組み合わせである)。pHは好ましくは中
性から弱アルカリ性であるが、広いアルカリ性pH範囲で
も許容できる結果が得られる。
の最適化 細胞ライゼートを調製するためにも使用することができ
る最適な基質バッファーを得るため、種々のバッファー
組成物を試験した。評価により、シグナルレベルがDTT
の存在に大きく依存することが示された。さらに、最適
比及びシグナル収量は、試験した溶液のバッファー組成
物2に見出された。それぞれの場合において、EDTA及び
／またはEGTAを省略することは可能であるが、DTTを使
用しない場合、EDTAまたはEGTAの存在は明らかに利点を
有する(EDTA及びEGTAはバッファー2及び3においてのみ
存在し、これらのみがDTTなしで陽性シグナルを生成す
るバッファーの組み合わせである)。pHは好ましくは中
性から弱アルカリ性であるが、広いアルカリ性pH範囲で
も許容できる結果が得られる。
【００２８】
【表２】
【００２９】方法：MTPを2μg/mlの抗CPP32(クローン1
9)で被覆した(例えば炭酸バッファーを含む)。未処理お
よびアポトーシス誘導細胞のライゼートはピペットで加
えた。CPP32(カスパーゼ3)の結合。
9)で被覆した(例えば炭酸バッファーを含む)。未処理お
よびアポトーシス誘導細胞のライゼートはピペットで加
えた。CPP32(カスパーゼ3)の結合。
【００３０】洗浄。 各インキュベーションバッファーへの蛍光基質(AFC)の
添加。 2時間後のFUの測定。
添加。 2時間後のFUの測定。
【００３１】
【表３】
【００３２】結果： 1)カスパーゼ3を含むライゼート中、DTTなしではシグナ
ルはほとんど生成されない。 2) DTT濃度は1〜100μMとし得る。 3)評価は、バッファー組成物2が最も高いシグナル(FU)
及び最も大きい倍率を生じる（アポトーシス：非アポト
ーシスライゼート）ことを示している。
ルはほとんど生成されない。 2) DTT濃度は1〜100μMとし得る。 3)評価は、バッファー組成物2が最も高いシグナル(FU)
及び最も大きい倍率を生じる（アポトーシス：非アポト
ーシスライゼート）ことを示している。
【００３３】実施例6：抗体産生 カスパーゼ3に対するモノクローナル抗体を生産するた
めに、24.7 kDaタンパク質断片(ヒトCPP-32のアミノ酸
１-219) を免疫原として使用した。免疫化のために、マ
ウス(例えばBalb/c)に10日の間隔で免疫原(約50μgのペ
プチド)を3回注射した。約50週間後(血清の免疫反応に
よる)、血清陽性マウスの脾臓細胞を骨髄腫細胞(例えば
P3-X63-Ag8.653)と融合させる。ハイブリドーマ上清
を、陽性の免疫反応(免疫組織化学分析、ウエスタンブ
ロット)についてスクリーニングする。陽性のハイブリ
ドーマを限界希釈法でクローン化する。モノクローナル
抗体をクロマトグラフィーにより精製し、20 mM リン酸
ナトリウム、pH 7.5、50% グリセロール、150 mM NaC
l、1 mg/ml BSA及び1.5 mM NaN3中に保存する。
めに、24.7 kDaタンパク質断片(ヒトCPP-32のアミノ酸
１-219) を免疫原として使用した。免疫化のために、マ
ウス(例えばBalb/c)に10日の間隔で免疫原(約50μgのペ
プチド)を3回注射した。約50週間後(血清の免疫反応に
よる)、血清陽性マウスの脾臓細胞を骨髄腫細胞(例えば
P3-X63-Ag8.653)と融合させる。ハイブリドーマ上清
を、陽性の免疫反応(免疫組織化学分析、ウエスタンブ
ロット)についてスクリーニングする。陽性のハイブリ
ドーマを限界希釈法でクローン化する。モノクローナル
抗体をクロマトグラフィーにより精製し、20 mM リン酸
ナトリウム、pH 7.5、50% グリセロール、150 mM NaC
l、1 mg/ml BSA及び1.5 mM NaN3中に保存する。
【図１】 公知の試験方法(アネキシンV-結合)と比較し
た、種々の濃度のカンプトテシンとのヒトU937細胞のイ
ンキュベートによるカスパーゼ3の活性化を示す図であ
る。
た、種々の濃度のカンプトテシンとのヒトU937細胞のイ
ンキュベートによるカスパーゼ3の活性化を示す図であ
る。
Claims (19)
- 【請求項１】 生体サンプル中のアポトーシスにおいて
活性化されたプロテアーゼまたはアポトーシス細胞の検
出方法であって、下記の段階、 サンプルを、(a) アポトーシスにおいて活性化されたプ
ロテアーゼに特異的に結合するが、その活性中心をブロ
ックしない、固相に結合しているか結合することができ
る結合パートナー、(b) 前記プロテアーゼに特異的な基
質、及び(c) 反応バッファーに接触させ、 サンプル中に含まれるアポトーシス細胞及び／または活
性化されたプロテアーゼの指標として反応溶液中に形成
された色原体または蛍光色素を測定すること、を含む前
記方法。 - 【請求項２】 アポトーシスにおいて活性化されたプロ
テアーゼがシステイニル-アスパラギン酸プロテアーゼ
である請求項1に記載の方法。 - 【請求項３】 活性中心をブロックしない特異的結合パ
ートナーがモノクローナルまたはポリクローナル抗体で
ある請求項1または2に記載の方法。 - 【請求項４】 クマリン-ペプチド誘導体、p-ニトロア
ニリドまたはナフチルアミド-ペプチド誘導体をプロテ
アーゼ基質として使用する請求項1〜3のいずれか１項に
記載の方法。 - 【請求項５】 それがアセチル-Asp-Glu-Val-Asp-7-ア
ミド-4-トリフルオロメチル-クマリンもしくは-7-アミ
ド-4-メチル-クマリンまたは(7-メトキシ-クマリン-4-
イル)アセチル-Asp-Glu-Val-Asp-Ala-Pro-Lys(2,4-ジニ
トロフェニル)OHである請求項4に記載の方法。 - 【請求項６】 反応バッファーが約5.5〜9.0のpH値を有
し、界面活性剤及び亜硫酸基を還元する物質を含む請求
項1〜5のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項７】 サンプル中に少なくとも1000のアポトー
シス細胞が存在する請求項1〜6のいずれか１項に記載の
方法。 - 【請求項８】 反応を約37℃において約30分〜12時間行
う請求項1〜7のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項９】 反応時間が1.5〜5時間である請求項8に
記載の方法。 - 【請求項１０】 細胞毒性細胞、ナチュラルキラー細
胞、イオン化放射線、または化学化合物、例えば、特
に、カンプトテシン、ダイオキシン、もしくは抗体、の
細胞傷害効果または活性を測定するための請求項1〜9の
いずれか１項に記載の方法の使用。 - 【請求項１１】 生体サンプル中のアポトーシス細胞ま
たはアポトーシスにおいて活性化されたプロテアーゼの
検出用の試薬キットであって、 (a) アポトーシスにおいて活性化されたプロテアーゼに
特異的に結合するが、該プロテアーゼの活性中心をブロ
ックしない結合パートナー、 (b) 前記プロテアーゼの特異的基質、及び (c) 反応バッファー を含んでなる上記キット。 - 【請求項１２】 結合パートナー(a)が固相に結合して
存在するか、固相に結合できるように設計されている請
求項11に記載の試薬キット。 - 【請求項１３】 結合パートナーがシステイニル-アス
パラギン酸プロテアーゼに結合する抗体である請求項11
または12に記載の試薬キット。 - 【請求項１４】 前記抗体が免疫原としてヒトCPP-32プ
ロテアーゼの断片を使用することによって得られる請求
項13に記載の試薬キット。 - 【請求項１５】 プロテアーゼ特異的基質がアセチル-A
sp-Glu-Val-Asp-7-アミド-4-トリフルオロメチル-クマ
リンである請求項11〜14のいずれか１項に記載の試薬キ
ット。 - 【請求項１６】 アポトーシスにおいて活性化されたプ
ロテアーゼを阻害するか、誘導することができる物質を
見つけるための請求項11〜15のいずれか１項に記載の試
薬キットの使用。 - 【請求項１７】 前記物質がプロテアーゼを少なくとも
90%阻害する請求項16に記載の使用。 - 【請求項１８】 前記物質がプロテアーゼを少なくとも
1.5倍誘導する請求項16に記載の使用。 - 【請求項１９】 プロテアーゼがシステイニル-アスパ
ラギン酸プロテアーゼである請求項16〜18のいずれか１
項に記載の使用。
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