ES2210892T3

ES2210892T3 - Metodo para la deteccion de una proteasa activada por apoptosis.

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Publication number: ES2210892T3
Application number: ES99108890T
Authority: ES
Inventors: Georg Dr. Fertig
Original assignee: Roche Diagnostics GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1998-05-07
Filing date: 1999-05-05
Publication date: 2004-07-01
Anticipated expiration: 2019-05-05
Also published as: DE59907982D1; US20020012945A1; EP0955377B1; EP0955377A1; ATE256199T1; US20030219841A1; DE19820328A1; JPH11341998A

Abstract

PROCEDIMIENTO Y EQUIPO DE REACTIVOS PARA LA REACCION DE UNA PROTEASA ACTIVADA POR APOPTOSIS O POR CELULAS APOPTOTICAS EN UNA MUESTRA BIOLOGICA, QUE COMPRENDE LAS SIGUIENTES ETAPAS: PUESTA EN CONTACTO DE LA MUESTRA CON (A) UN LIGANTE DE UNION, QUE SE UNE DE MANERA ESPECIFICA MEDIANTE UNA PROTEASA ACTIVADA POR APOPTOSIS, PERO QUE SIN EMBARGO NO TIENE EL CENTRO ACTIVO BLOQUEADO Y QUE ESTA UNIDA A UNA FASE SOLIDA O SE PUEDE UNIR, (B) UN SUSTRATO ESPECIFICO PARA LA PROTEASA, Y (C) UN COMPUESTO AMORTIGUADOR DE REACCION, Y - DETERMINACION DEL CROMOGENO QUE SE FORMA EN LA SOLUCION O DEL FLUOROCROMO COMO MEDIDA PARA LAS CELULAS APOPTOTICAS CONTENIDAS EN LA MUESTRA Y/O PARA LA PROTEASA ACTIVADA.

Description

Método para la detección de una proteasa activada por apoptosis.

La invención hace referencia a un método para detectar la apoptosis de células eucarióticas o bien la proteasa específica de la apoptosis, así como a un estuche de reactivos adecuado para este método de detección.

La llamada "muerte celular programada" tiene una gran importancia para el desarrollo y la capacidad de funcionamiento de los tejidos, órganos y organismos (J. Cohen, Advances in Immunology 50 (1991), 55-85) y se ha observado en una serie de enfermedades, como los trastornos o las lesiones isquémicas o autoinmunológicas, diferentes tipos de cáncer, Alzheimer y otros fenómenos neurodegenerativos (G.M. Cohen, Biochem, J. 326 (1997), 1-16). Las células que mueren de esta forma se caracterizan en el citoplasma por unos fragmentos de ADN asociados a las histonas como mono- y óligonucleosomas. Dicho espectro de fenómenos se observa además en la muerte celular inducida, como por ejemplo, el fenómeno provocado por los rayos ionizantes (Yamada y cols., Int. J. Radiat. Biol. 53(1988), 65) o determinados anticuerpos monoclonales, como por ejemplo, el Anti-Fas (Yonehara y cols., J. Exp. Med. 169 (1989), 1747-1756) o bien Anti-APO-1 (Trauth y cols., Science 245 (1989), 301-304). Los linfocitos T citotóxicos y los linfocitos citolíticos naturales desencadenan una muerte celular inducida (ver por ejemplo, S. Curnow y cols., Cancer Immol. Immunother, 36 (1993), 149-155). Sin embargo, producen además una permeabilidad elevada de la membrana plasmática, como la observada en los fenómenos necróticos (Krähenbühl y cols., Immol. Today 12 (1991), 389-402). El tipo descrito de muerte celular programada o inducida se denomina apoptosis. La apoptosis se caracteriza por unos bultos en forma de ampollas de la membrana plasmática, por la condensación de la cromatina y la activación de una endonucleasa endógena. A diferencia de la necrosis, en el caso de la apoptosis se trata de un proceso activo de las células eucarióticas. La endonucleasa dependiente del calcio y del magnesio activada en la apoptosis desdobla el tramo doble del ADN en los flancos izquierdos fácilmente accesibles entre los núcleosomas en los mono- y óligonucleosomas. El ADN en los núcleosomas está asociado íntimamente a determinadas histonas centrales y por tanto, está protegido de la descomposición por la endonucleasa (Burgoyne y cols., Biochem. J. 143 (1974), 67; Stach y cols., J. Neurochem, 33 (1979), 257). Por lo tanto, tras la extracción del ADN y su separación en gel de agarosa se ha de reconocer el "conductor del ADN" típico para las células apoptópicas, una muestra de fragmentos de ADN con una longitud de aproximadamente 180 pares de bases o bien un múltiplo de ellas (Wyllie, Nature 284 (1980), 555-556; J. Cohen, Advances in Immunology 50 (1991), 55-85). La membrana plasmática de los linfocitos se mantiene intacta en este estadio prematuro de la apoptosis. De esta forma se llega a un enriquecimiento de los mono- y óligonucleosomas así como de otros componentes de alto peso molecular en un citoplasma de células muertas (Duke y cols., Lymphokine Research 5 (1986), 289-299).

Aunque en los últimos años se han podido identificar una serie de moléculas, que tiene un importante papel en la formación bioquímica de células apoptóticas, y también se ha reconocido cada vez mas el significado fundamental de la apoptosis para los procesos biológicos, que alcanzan desde la embriogénesis hasta el desarrollo del sistema inmunitario, en los círculos científicos, el mecanismo para la formación de la apoptosis sigue siendo poco claro (M. Tewari y cols., Cell 81 (1995), 801-809). No obstante, recientemente existen puntos de referencia de que determinadas proteasas, que pertenecen a la familia de las proteasas de la cisteina, las llamadas "CASPASEN", juegan un papel clave en la formación de la apoptosis (D.W. Nicholson y N.A. Thornberry, TIBS 22 (1997), 299-306). En particular se ha podido demostrar que el cimógeno Caspasa 3 (proteasa del ácido cisteinil-asparagínico, CPP-32, Apopaina, Yama)se presenta en forma activada en la formación de la apoptosis (D.W. Nicholson y cols., Nature 376 (1995), 37-43).

Se han descrito los métodos analíticos para la detección de la apoptosis o bien de las proteasas específicas de la apoptosis y se basan en que se descompone un sustrato peptídico correspondiente y se detecta el componente colorimétrico o fluorescente liberado (por ejemplo, D.W. Nicholson y cols., Nature 376 (1995), 37-43). Sin embargo, en el método analítico que detecta las proteasas específicas de la apoptosis existe el inconveniente de que a través de este método se analizan también otras proteasas que participan en la formación de la apoptosis, que asimismo descomponen el sustrato peptídico empleado, y por tanto no se da la especificidad requerida.

El cometido de la invención consistía por tanto en disponer de un método analítico simple y específico para la detección de la apoptosis, en particular en la fase de formación prematura de la apoptosis.

Este cometido se resuelve mediante un procedimiento para la detección de las proteasas de ácido cisteinilaspártico activado en la apoptosis, que se caracteriza por que

-: se incuba un lisado que está contenido en la población celular a investigar sin un marcaje previo de la población a investigar con un elemento de fijación o enlace, que se une de forma específica a una proteasa activada en la apoptosis, pero no bloquea el centro activo de la proteasa, y en el caso del elemento de fijación se trata de un anticuerpo, que va dirigido contra el fragmento que comprende los aminoácidos 1 hasta 219 de la proteasa humana del ácido cisteinilaspártico (CPP-32),

-: se pone en contacto con un sustrato peptídico específico para la proteasa y acoplado a un grupo detectable y

-: con un tampón de reacción y

-: se determina el grupo detectable liberado del sustrato.

El elemento de fijación o enlace puede en un proceso conforme a la invención o bien antes de entrar en contacto con la muestra o bien con el lisado, estar unido a una fase sólida, como por ejemplo, una placa de microvaloración o bien una partícula de látex o bien tras la incubación con el sustrato de proteasa acoplarse a una fase sólida correspondiente. Las proteasas del ácido cisteinilaspártico como, por ejemplo, la caspasa 3 o la caspasa 8 son consideradas proteasas especialmente activadas por la apoptosis.

Sorprendentemente se ha demostrado que con el proceso conforme a la invención las células apoptóticas, es decir, las células que han muerto por una muerte celular programada o inducida, ya muestran una señal de medición al cabo de 1,5 hasta 2 horas de incubación y ante una existencia de menos de unas 1000 células apoptóticas, sin que se requiera un marcaje previo de la población celular a investigar. De esta forma pueden analizarse incluso células no proliferantes in vitro. El proceso conforme a la invención permite además realizar de una forma simple y rápida la determinación cuantitativa de la dimensión de la apoptosis en la muestra que se va a analizar (población celular) y es además extremadamente sensible.

Para la liberación de la(s) proteasa(s) activada(s) en la apoptosis de las células apoptóticas del citoplasma se incuba la población celular que se va a analizar con un tampón de lisis apropiado, que esencialmente contiene un detergente no iónico, como por ejemplo, Triton, Tween o Nonidet P40, en una concentración del 0,1 hasta el 2,0% (p/v) y una sustancia tamponada en una región de pH del 5,5 hasta el 9,0, preferiblemente, del 7 hasta el 9. Por ejemplo, fosfatos, tris-HCl y Hepes son adecuados. La concentración del tampón se sitúa entre 1 mM hasta 200 mM, preferiblemente 10 hasta 80 mM, muy especialmente 50 mM. Al tampón de lisis se le puede añadir de un modo opcional una sustancia reductora de los grupos sulfito, como por ejemplo el ditiotreitol (DTT) o bien ditioeritrita, en una concentración de 0,1 hasta 100 \muM, y/o cloruro sódico para garantizar las concentraciones salinas fisiológicas.

La incubación con el tampón de lisis se realiza durante un periodo de tiempo de uno hasta cinco minutos a temperaturas de 0 hasta 4ºC. Los componentes celulares no solubles se separan por centrifugación. El lisado obtenido de esta forma se añade a un elemento de enlace determinado, que se trata preferiblemente de un anticuerpo monoclonal o policlonal. Se prefieren especialmente, conforme a la invención, anticuerpos monoclonales dirigidos contra una proteasa de ácido cisteinilaspártico activada por apoptosis o bien un fragmento activo inmunológicamente. Se ha demostrado que lo más apropiado consiste en emplear anticuerpos, que se obtienen por medio de un fragmento proteínico de un tamaño de 25 kDa del CPP-32(aminoácidos 1 hasta 219) humano como inmunógeno y mediante una inyección triple, en un intervalo de aproximadamente diez días (por ejemplo, clon 19). Los clones obtenidos de esta forma, si fuera preciso tras una purificación cromatográfica según métodos conocidos por el experto, son especialmente adecuados para el procedimiento conforme a la invención. De forma alternativa, pueden adquirirse en el comercio los correspondientes anticuerpos de las empresas del ramo, como por ejemplo, de Transduction Laboratories, Lexington, KY(USA).

Cuando el sustrato peptídico para la proteasa se acopla con un grupo detectable, puede tratarse por ejemplo de un péptido acoplado a un grupo cromógeno o fluorescente que consta de dos hasta 20 aminoácidos. El sustrato peptídico contiene preferiblemente menos de diez aminoácidos, y se trata preferiblemente de un tri- hasta octapéptido. Para el procedimiento conforme a la invención pueden emplearse además sustratos peptídicos cíclicos con una secuencia de desdoblamiento integrada, donde el péptido desdoblado completa un enzima en su forma activa. Los sustratos peptídicos preferidos presentan especialmente fragmentos de péptido de las secuencias de aminoácidos siguientes: Trp(Leu)-Glu-His-Asp, Asp-Glu-Val(His)-Asp o bien una de las tres secuencias siguientes Val(Leu)-Glu-His(Thr)-Asp. Los sustratos peptídicos pueden ser además acetilados y contienen los grupos detectables, preferiblemente en un aminoácido terminal no acetilado. Como grupos detectables, es decir, grupos cromógenos o fluorescentes, se prefieren los derivados de cumarina, nitroanilida o naftilamida. Han demostrado ser especialmente apropiados para la invención los sustratos siguientes: Acetil-Asp-Glu-Val-Asp-7-amido-4-trifluormetil-cumarina (acetil-asparaginil-glutaminil-valinil-aspara-ginil-7-amido-4-fluorometil-cumarina; Ac-DEVD-AFC), acetil-Asp-Glu-Asp-7-amido-4-metilcumarina (Acetil-aspariginil-glutaminil-valinil-asparaginil-7-amido-4-metil-cumarina; Ac-DEVD-AMC), (7-metoxicumarin-4-il)acetil-Asp-Glu-Val-Asp-Ala-Pro-Lis(2,4-dinitrofenil)OH (7-metoxi-cumarin-4-il)acetil-asparaginil-glutaminil-valinil-asparaginil-alaninil-prolinil-lisinil(2,4-dinitro)fenol;Mca), (4-(4-dimetilaminofenilazo)benzoil-Asp-Glu-Val-Asp-5-[(2-amino-etil)amino]-naftalen-1-sulfónico ((4-(4-dimetilaminofenil-azo)benzoil-asparaginil-glutaminil-valinil-asparaginil-5[(2-aminoetil)amino]-naftalen-1-sulfónico), o bien derivados de rodamina-110-DEVD.

La reacción entre la muestra que contiene la proteasa, el elemento de enlace o bien el anticuerpo y el sustrato de la proteasa, puede realizarse antes o después de la unión del elemento de enlace o del anticuerpo a la fase sólida. Para la incubación, las soluciones tampón empleadas contienen básicamente una sustancia tamponada en un intervalo de pH de 5,5 hasta 9,0, en una concentración de 1 hasta 200 mM así como una sustancia reductora de los grupos sulfito, como el DTT o el ditioeritrita en una concentración de 0,1 hasta 100 \muM, preferiblemente de 5 hasta 60 \muM, y si se diera el caso EDTA y/o EGTA en una concentración de aproximadamente 0,1 hasta 1,0 mM. Además, el tampón puede contener preferiblemente 1 mM debido a la solución salina fisiológica y/o a una sal de magnesio. Una forma de ejecución preferida de la invención ocurre cuando el tampón empleado para la lisis celular y el tampón de la reacción son idénticos y contiene aproximadamente 5 hasta 60 \muM de una sustancia reductora de los grupos sulfito y aproximadamente un 0,1 hasta un 1% (p/v) de un detergente.

Dependiendo del número de células apoptóticas en la muestra correspondiente, la incubación puede llevarse a cabo a una temperatura de aproximadamente 37ºC así como a un pH de 7,8 en un intervalo de tiempo de unos 30 minutos hasta 12 horas. En la mayoría de casos se ha comprobado que un periodo de reacción de 1,5 hasta 5 horas es suficiente.

Como control negativo se ha empleado un método descrito como en el ejemplo 1 o bien un cultivo paralelo de la población celular que se va a analizar, en la que no se ha inducido ninguna apoptosis. La señal medida sin lisado celular aporta el valor blanco para la determinación y se deduce de los valores de medición. Se han de valorar como positivos para la existencia de una apoptosis aquellos valores de medición para los grupos detectables en la mezcla de reacción, que parecen ser reproducibles al menos en un factor de 2 respecto al valor de medición sin inducción. Como cultivo paralelo de la población celular a investigar, en la que no se ha inducido ninguna apoptosis, se emplea un cultivo de células del mismo tipo celular y del mismo origen, en el cual debido a los antecedentes de las células empleadas así como a las condiciones del cultivo se ha podido deducir que no se ha inducido ninguna apoptosis. Para el caso en que debe determinarse una apoptosis inducida in vitro, la población celular que se va a investigar se subdivide en dos lotes paralelos y se incuba en presencia o en ausencia del agente que induce la apoptosis (por ejemplo, camptotecina).

En una forma de ejecución preferida del método conforme a la invención se presenta el elemento de enlace empleado biotinilizado, para enlazarse antes o después de la incubación a una fase sólida recubierta de estreptavidina.

Con ayuda de un método conforme a la invención es posible de un modo simple determinar tanto la citotoxicidad de las células o de los compuestos que inducen apoptosis, como las proteasas inducidas específicamente por la apoptosis.

Otro objetivo de la invención es por tanto la utilización de un método conforme a la invención para determinar la acción citotóxica o la actividad de los linfocitos citotóxicos, linfocitos citolíticos naturales, rayos ionizantes o sustancias químicas como, por ejemplo, los anticuerpos monoclonales, las hormonas (por ejemplo, los glucocorticoides) o las toxinas (por ejemplo, dioxinas). La acción o actividad citotóxica se deduce por tanto de la dimensión de la apoptosis estimada mediante el método conforme a la invención, en la población celular empleada como células objetivo.

Otro objetivo de la invención es un estuche de reactivos para la detección de células apoptóticas o bien una proteasa activada en la apoptosis en una muestra biológica sin marcaje previo de la población celular a investigar, que contiene un elemento de enlace, que se une de forma específica a la proteasa activada en la apoptosis, sin bloquear el centro activo de la proteasa, un sustrato específico para la proteasa y un tampón de reacción adecuado. En el caso del elemento de enlace se trata de un anticuerpo, que se dirige contra el fragmento que comprende los aminoácidos 1 hasta 219 de la proteasa humana del ácido cisteinilaspártico (CPP-32). El elemento de enlace (en un ejemplo caspasa 3) puede presentarse acoplado a una fase sólida, o bien se acopla únicamente tras la incubación. Las formas de ejecución preferidas son, cuando se emplea como elemento de enlace un anticuerpo monoclonal o policlonal, que está dirigido contra un fragmento proteínico de un tamaño de 25 kDa del CPP-32 humano, y/o un sustrato peptídico marcado con fluorescencia, como por ejemplo, el acetil-Asp-Glu-Val-Asp-7-amido-4-trifluormetilcumarina.

Además, se ha demostrado que resulta apropiada la utilización del estuche de reactivos conforme a la invención para hallar aquellas sustancias que serán capaces de inhibir las proteasas activadas en un estadio de apoptosis. Asimismo, pueden hallarse sustancias que tengan un efecto o una acción intensa, es decir que induzcan a proteasas activadas en la apoptosis. Las sustancias inhibidoras o inductoras correspondientes pueden emplearse como sustancias activas, como por ejemplo los medicamentos. Por medio de sustancias, que inhiben las proteasas activadas en un estado de apoptosis en un 90% o más, se puede mantener por ejemplo la muerte de las células apoptóticas o bien retardar al menos su pérdida. Los derivados peptídicos como el aldehído del ácido acetil-asparaginil-glutaminil-valinilasparagínico (Ac-DEVD-CHO) o bien la flúormetilcetona del ácido benciloxicarbonil-valinil-alaninil-DL-asparagínico (Z-VAD-fmk) son apropiados. Además, las sustancias que son capaces de inducir las proteasas activadas en un estadio de apoptosis, sirven como herramientas válidas para la obtención de proteasas específicas. En particular se ha demostrado que son apropiadas aquellas sustancias que pueden reforzar la actividad de las correspondientes proteasas al menos 1,5 veces.

En el caso de proteasas activadas en un estado de apoptosis se trata de proteasas del ácido cistein- o cisteinil-aspártico.

Los ejemplos siguientes aclaran la invención:

Ejemplo 1 Activación de la proteasa/camptotecina

Para la inducción de la apoptosis en un sistema celular se trataron células humanas (U937; linfoma histiolítico humano de un caucasiano) con Camptotecina (inhibidor de la topoisomerasa I, quimioterapéutico). En la incubación de 5 x 10^{5} células/ml con 4 \mug/ml de camptotecina (CAM) para diferentes intervalos de tiempo, se ha de reconocer un incremento de la actividad de la proteasa al cabo de 2 horas. Para la detección de la proteasa activada por la apoptosis (Caspasa 3)se extraerán del cultivo celular tratado, aproximadamente 10^{6} células y se someterán a una lisis en hielo en un tampón de lisis (50 mM de NaPO_{4}, 10 mM NaCl, 1 mM MgCl_{2}, 0,25% (p/v) Nonidet P40, 0,3 mM de EDTA; pH 7,8). El lisado se pondrá en contacto con un anticuerpo dirigido contra la caspasa 3 para el análisis específico de la caspasa 3, que se acopla a una fase sólida y se une a la caspasa 3 del lisado. Tras retirar el exceso (contiene todos los componentes no específicos o los enzimas) se añadirá un sustrato (Ac-DEVD-AFC 50 \mum) y se medirá el volumen de sustrato determinado por la caspasa 3 a través de la formación del producto de desdoblamiento fluorescente de cumarina. Tras la retirada del valor blanco (fluorescencia propia del sustrato sin adición de lisado) puede representarse gráficamente el curso o la marcha cinética de la actividad de la caspasa 3 (figura 1).

Ejemplo 2 Sustrato de color-/fluorescencia sin un elemento de enlace específico

Como prueba de funcionamiento para el modelo celular empleado (U937/CAM)se empleaba una valoración no específica de la caspasa (Clonetech), que es capaz de analizar el lisado, pero no permite ninguna capturación específica de la caspasa 3. El sustrato empleado se emplea como el Ac-DEVD-AFC en el ejemplo 1, y paralelamente al mismo se emplea un sustrato colorimétrico (Ac-DEVD-pNA). Por tanto estos modelos son inespecíficos, porque cada sustrato DEVD se desdobla tanto de la caspasa 3 como de la caspasa 1, casp 2 y casp 7.

La valoración demuestra que el modelo de apoptosis principalmente funciona y tanto el sustrato de fluorescencia como el colorimétrico muestran un desdoblamiento en la inducción por apoptosis.

Ejemplo 3 Selección de anticuerpos

Se han fijado diferentes anticuerpos reconocidos de la caspasa 3 a una fase sólida (MTP) y por tanto se ha enlazado la caspasa 3 (enzima activado y no activado) del lisado. Tras la adición del sustrato de fluorescencia (50 \muM AMC) aparecía únicamente una señal positiva cuando se empleaba un anticuerpo conforme a la invención (por ejemplo, clon 19). Los otros tres anticuerpos empleados se unen ciertamente pero no dan ninguna señal significativa, es decir, no se puede averiguar la actividad de la proteasa averiguarse.

TABLA 1

MAK<CPP-32>	Clon 19	PAK	Ab-1	Ab-2
-CAM	2,38	2,59	2,34	2,214
+CAM	6,65	2,88	2,31	2,344
Factor	2,79	1,11	0,99	1,06

Ejemplo 4 Selección del sustrato de fluorescencia óptimo

Se han analizado tres sustratos de fluorescencia. Se trata por tanto de un acetil-Asp-Glu-Val-Asp-7-Amido-4-trifluormetil-cumarina (AFC), acetil-Asp-Glu-Val-Asp-7-amido4-metilcumarina (AMC) y (7-metoxicumarin-4-il)acetil-Asp-Glu-Val-Asp-Ala-Pro-Lis (2,4-dinitrofenil)OH(Mca). Los tres sustratos se comparaban unos con otros, de manera que los criterios de selección eran i)background ii)altura de la señal y iii)cociente de la señal de una inducción +/-. Se demuestra que el derivado AMC genera ciertamente las señales máximas, pero la propia fluorescencia del sustrato sin la adición del lisado es relativamente alta. El sustrato Mca por el contrario aporta un cociente bastante mejor, pero alturas de señal bajas. En caso del sustrato AFC se recibe un cociente óptimo para un rendimiento de la señal muy bueno.

Ejemplo 5 Optimización del tampón de incubación

Para disponer de un tampón sustrato óptimo, con el cual puede fabricarse simultáneamente el lisado celular, se analizaban diferentes composiciones tampón. La valoración correspondiente indica que las alturas de las señales dependen notablemente de la presencia de DTT. Además, se observaba el cociente óptimo y el rendimiento de la señal en la composición tampón 2 de las soluciones analizadas. En casos individuales, puede renunciarse al EDTA y/o al EGTA, y en el empleo sin DTT la presencia de EDTA o de EGTA presenta unas ventajas claras (EDTA y EGTA existen únicamente en el tampón 2 y 3, donde las propias composiciones tampón son las que generan una señal positiva sin DTT). El pH es preferiblemente neutro hasta débilmente alcalino, donde una amplia gama de pH alcalino conduce a resultados bastante aceptables.

TABLA 2 Soluciones tampón empleadas 1 hasta 12

1

Pasos:

El MPT se revestía con 2 \mug/ml de anti-CPP32 (Clon 19) (por ejemplo con tampón de carbonato)

Se pipeteaba el lisado de las células no tratadas e inducidas por apoptosis

Formación de CPP32 (caspasa 3)

Lavado

Adición de sustratos de fluorescencia (AFC) en el tampón de incubación correspondiente

Medición del FU al cabo de 2h

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 3

2

Resultado

1) sin DTT apenas se genera una señal en un lisado que contiene caspasa 3

2) la concentración de DTT puede situarse entre 1 y 100 \muM

3) la valoración muestra que la composición tampón 2 produce la señal máxima(FU) y el factor máximo(lisado apoptótico y no apoptótico)

Ejemplo 6 Fabricación de anticuerpos

Para la fabricación de anticuerpos monoclonales frente a la caspasa 3 se empleaba un fragmento proteínico de 24,7 kDa (aminoácidos 1-219 del CPP-32 humano) como inmunógeno. Para la inmunización los ratones reciben (por ejemplo, Balb/c) una inyección de inmunógeno(aproximadamente 50 \mug de péptido) tres veces en un intervalo de 10 días. Al cabo de unas 50 semanas (según la respuesta inmunológica del suero)se fusionan las células del bazo seropositivas con células de mieloma (por ejemplo, P3-X63-Ag8.653). Los excesos de hibridoma se detectan en una reacción inmunológica positiva (inmunotransferencia). Los hibridomas positivos se clonan en un procedimiento de "limiting dilution". Los anticuerpos monoclonales se purifican por medio de técnicas cromatográficas y se almacenan en 20 mM de fosfato sódico pH 7,5, 50% de glicerina, 150 mM de NaCl, 1 mg/ml de RSA y 1,5 mM de NaN_{3}.

Claims

1. Método para la detección de una proteasa de un ácido cisteinilaspártico activada en una apoptosis o bien de células apoptóticas, en una muestra biológica sin etiquetado previo de la población celular que va a ser examinada, que comprende las etapas siguientes:

-: poner la muestra en contacto con (a) un elemento de enlace que se una específicamente a una proteasa del ácido cisteinilaspártico activada en una apoptosis pero que no bloquea el centro activo, de manera que el elemento de enlace sea un anticuerpo monoclonal o policlonal que vaya dirigido contra el fragmento de aminoácidos 1 a 219 de la proteasa humana del ácido cisteinilaspártico (CPP-32) y esté unido o pueda unirse a una fase sólida, b) un sustrato que es específico para la proteasa y (c) un tampón de reacción y

-: determinar el cromógeno o el fluorocromo formado en la solución de reacción como una medida de las células apoptóticas y/o de la proteasa activada contenida en la muestra.

2. Procedimiento conforme a la reivindicación 1, que se caracteriza porque la proteasa activada en la apoptosis es una proteasa del ácido cisteinilaspártico.

3. Procedimiento conforme a la reivindicación 1, que se caracteriza porque el anticuerpo puede obtenerse con un fragmento de 25 kDa de CPP-32 humano como inmunógeno.

4. Procedimiento conforme a la reivindicación 1,2 ó 3 que se caracteriza porque un derivado del péptido de cumarina o del péptido de rodamina, o un derivado del péptido de paranitroanilida o un derivado del péptido de naftilamida se utiliza como sustrato de la proteasa.

5. Procedimiento conforme a la reivindicación 4, que se caracteriza porque se trata de un derivado del acetil-asparaginil-glutaminil-valinil-asparaginil-7-amido-4-fluormetil-cumarina o bien del 7-amido-4-metilcumarina, de un (7-metoxi-cumarin-4-il)acetil-asparaginil-glutaminil-valinil-asparaginil-alaninil-prolinil-lisinil(2,4-dinitro)fenol o bien del ácido 4-(4-dimetilamino-fenilazo)benzoil-asparaginil-glutaminil-valinil-asparaginil-5-(2-aminoetil)amino)-naftalen-1-sulfónico.

6. Procedimiento conforme a una de las reivindicaciones 1-5, que se caracteriza porque el tampón de reacción presenta un valor del pH de 5,5 hasta 9,0, contiene un detergente y una sustancia que reduce los grupos sulfito.

7. Procedimiento conforme a una de las reivindicaciones 1-6, que se caracteriza porque en la muestra existen menos de 1000 células apoptóticas.

8. Procedimiento conforme a una de las reivindicaciones 1-7, que se caracteriza porque la reacción se lleva a cabo a 37ºC en un periodo de tiempo de 30 minutos hasta doce horas.

9. Procedimiento conforme a la reivindicación 8, que se caracteriza porque la duración de la reacción es de 1,5 hasta 5 horas.

10. Uso de un procedimiento conforme a una de las reivindicaciones 1 hasta 9 para la determinación de la acción o actividad citotóxica de las células citotóxicas, de los linfocitos citolíticos naturales, de la radiación ionizante o de los compuestos químicos, como en particular la camptotecina, las dioxinas o los anticuerpos.

11. Estuche de reactivos para la detección de linfocitos apoptóticos o bien una proteasa del ácido cisteinilaspártico activada en la apoptosis en una muestra biológico sin un marcaje previo de la población celular a investigar, que contiene

a): Un elemento de unión, que se une de forma específica a una proteasa del ácido cisteinilaspártico activada en la apoptosis, sin bloquear el centro activo de la proteasa, y que se trata de un anticuerpo que va dirigido contra el fragmento que comprende los aminoácidos 1 hasta 219 del CPP-32 humano.

b): Un sustrato específico para la proteasa y

c): Un tampón de reacción

12. Estuche de reactivos conforme a la reivindicación 11, que se caracteriza porque el elemento de unión (a) está presente acoplado a una fase sólida o bien se ha diseñado de manera que puede acoplarse a una fase sólida.

13. Estuche de reactivos conforme a la reivindicación 11 ó 12, que se caracteriza porque el elemento de unión es un anticuerpo que se enlaza a una proteasa del ácido cisteinilaspártico, que puede obtenerse usando un fragmento 25 kDa del CPP-32 humano como inmunógeno.

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14. Estuche de reactivos conforme a una de las reivindicaciones 11 hasta 13, que se caracteriza porque el sustrato específico de la proteasa es el acetil-asparaginil-glutaminil-valinil-asparaginil-7-amido-4-trifluormetil-cumarina.

15. Utilización de un estuche de reactivos conforme a una de las reivindicaciones 11 hasta 14 para hallar una sustancia que sea capaz de inhibir o inducir una proteasa activada en la apoptosis.

16. Utilización conforme a la reivindicación 15, que se caracteriza porque la sustancia inhibe la proteasa como mínimo un 90%

17. Utilización conforme a la reivindicación 15, que se caracteriza porque la sustancia induce la proteasa al menos 1,5 veces.