JPH11349599A - 新規なゼラチンおよびその製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】医薬品、食品、化粧品等、特にワクチン等の注
射用微量蛋白質成分の安定剤として有用なペプシン分解
ゼラチンを提供する。 【解決手段】ゲル濾過高速液体クロマトグラフィーによ
る重量平均分子量が３，５００〜２０，０００であり、
SDS-ポリアクリルアミド電気泳動において１５ｋｄ、１
７ｋｄ、３６ｋｄおよび６０ｋｄに特徴的分離パターン
があるペプシン分解ゼラチン。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、加水分解ゼラチン
に関し、さらに詳細には、医薬品、食品、化粧品等、特
にワクチン等の注射用微量蛋白質成分の安定剤として有
用なペプシン分解ゼラチンに関する。

【０００２】

【従来の技術】注射用のワクチン製剤、エリスロポイエ
チン等の有効微量蛋白質成分にはウシまたはブタ組織か
ら抽出して得られたゼラチンが安定剤として含まれてい
る。これは有効微量蛋白質成分の安定剤のみならず、製
剤中の蛋白質の凝集の防止や、ガラス面その他器具壁面
への有効微量蛋白質成分の吸着防止効果がある。

【０００３】ゼラチンは生体結合組織に大量に存在する
コラーゲンを熱水等で抽出したものを指し、一般的に分
子量もコラーゲンより小さい。一般に、コラーゲンは、
動物種間でアミノ酸配列の相同性が高く、特にウシ、ブ
タおよびヒトにおいて９０％以上同じである。このため
コラーゲンより得られたゼラチンはアレルゲンとしての
作用が低く、従来から注射剤用の安定剤として用いられ
てきた。

【０００４】しかし、ごく少例ではあるが、近年幼児に
おいて、ワクチン接種後にアレルギー反応が報告され、
そのアレルゲンがワクチン剤に添加されたゼラチンであ
ることが明らかになった。アレルギー患者の血清中に抗
ゼラチン免疫グロブリンＥ抗体（IgE)が検出されたこと
から、本ゼラチンアレルギーはＩ型アレルギー反応であ
ることが明らかになった。ゼラチンと同様の効果がある
蛋白質として、ヒト血清アルブミンがあるが、エイズ、
肝炎ウイルスの混入等の危険性等を考えた場合、従来通
りゼラチンを利用した方が安全と考えられる。また、コ
スト面からも、ゼラチンは、比較的安価に供給可能であ
る。従来、低アレルゲン性のゼラチンについて以下のよ
うな報告がある。すなわち、特開平７−８２２９９号公
報には、コラーゲン成分あるいはその変性体であるゼラ
チン成分を含む原材料を細菌性のコラゲナーゼ酵素で特
異的に分解することによって、分子量１０００以下の抗
原性がなく、アミノ酸配列が(Gly-X-Y)n：n＝１〜３で
あるペプチドが７０％以上含有するようなペプチド組成
物が報告されている。しかし、ここで示されているよう
なコラーゲン分解酵素を用いた方法で得られたゼラチン
は、食品としては有効であろうが、分子量が１０００以
下では、ワクチンの安定剤としては適さない。

【０００５】さらに、特開平９−２２９９３２号公報に
は、ゼラチンアレルギーのヒトがウシ由来のゼラチンの
α２鎖に反応することを見いだし、他の動物由来のゼラ
チンをワクチン等に使用できることを報告する。しか
し、一般的なウシ由来のゼラチンを低アレルゲン性のゼ
ラチンに製造することについて何も教示していない。

【０００６】本発明者等も、ゼラチンにアレルギー反応
を示す患者がコラーゲンまたはゼラチンのα２鎖に反応
することの詳細について、日本免疫学会において発表し
た（第２７回日本免疫学会、平成９年１０月２９日〜３
１日）。

【０００７】したがって、ゼラチンに対してアレルギー
反応のある患者に安心して使用できるワクチン用の安定
剤として有用なゼラチンに対する要求は依然として高
い。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、医薬
品、食品、化粧品等、特にワクチン等の注射用微量蛋白
質成分の安定剤として有用な低アレルゲン性の加水分解
ゼラチンを提供することにある。

【０００９】本発明の別の目的は、上記のような低アレ
ルゲン性の加水分解ゼラチンを含有する、ワクチン等の
注射用微量蛋白質成分の安定剤を提供することにある。

【００１０】さらに本発明の目的は上記のような加水分
解ゼラチンの製造法を提供することにある。

【００１１】

【課題を解決するための手段】そこで、上記課題を解決
するために本発明者等は鋭意検討をした結果、ゼラチン
をペプシンにより分解させた加水分解ゼラチンが低アレ
ルゲン性であることを見いだし本発明を完成した。

【００１２】すなわち、本発明は、ゲル濾過高速液体ク
ロマトグラフィーによる重量平均分子量が３，５００〜
２０，０００であり、SDS-ポリアクリルアミド電気泳動
において１５ｋｄ、１７ｋｄ、３６ｋｄおよび６０ｋｄ
に特徴的分離パターンがあるペプシン分解ゼラチンにあ
る。

【００１３】また、本発明は上記ペプシン分解ゼラチン
を含有する注射用微量蛋白質成分の安定剤にある。

【００１４】さらに、本発明はゼラチンをペプシンによ
り分解させることを特徴とするゲル濾過高速液体クロマ
トグラフィーによる重量平均分子量が３，５００〜２
０，０００であり、SDS-ポリアクリルアミド電気泳動に
おいて１５ｋｄ、１７ｋｄ、３６ｋｄおよび６０ｋｄに
特徴的分離パターンがあるペプシン分解ゼラチンの製造
法である。

【００１５】以下、本発明をさらに詳細に説明する。

【００１６】汎用性のある低アレルゲン性のゼラチンを
論理的に開発するためには、なるべく多くの症例のゼラ
チンアレルギー患者の血清を用いて、血清IgEのゼラチ
ンにおけるエピトープを明らかにすることが必要である
と考えられる。そこで、本発明者等は、ゼラチンアレル
ギー患者のIgEのエピトープを明らかにして、ゼラチン
におけるIgE反応部位を特異的酵素で破壊する方法で、
アレルゲン性が低くかつワクチン等の注射用微量蛋白質
の安定作用の高いゼラチン分解物を提供することを目的
とした。

【００１７】はじめに、ゼラチンにアレルギー反応を示
す患者の血清を用いて、蛍光エライザ（ＥＬＩＳＡ）法
によってさまざまな従来知られている方法によって得ら
れたゼラチンおよび加水分解ゼラチンに対するIgEの反
応性を調べた。アレルゲン性は患者の血清IgEの反応性
で評価できる。コラーゲンはもともと分子量１０万のα
１鎖、α２鎖と呼ばれる二種類の異なったポリペプチド
からなっているので、ゼラチンはコラーゲン由来のこの
二種類のポリペプチドの混合物である。下記の表１に示
されているように、患者血清はゼラチン、コラーゲンか
ら精製したα２鎖には反応するが、精製したα１鎖には
反応しない（詳細は上掲日本免疫学会要旨集で発表）。

【００１８】

【表１】 一方、ゼラチンの原料として用いられるウシコラーゲン
のうち、抗原性を有するα２鎖の完全なアミノ酸の配列
について、最近、本発明者等はcDNA配列より明らかにし
た（Ｔ．Ｓｉｒａｉ等 " The complete cDNA coding se
quence for thebovine proa2(I) chain of type I Proc
ollagen ", Matrix Biol. 1998；核酸data base EMBL/G
enBank AB008683 を参照）。

【００１９】ゼラチンは疎水性アミノ酸が非常に少ない
蛋白質であるが、上記で明らかにしたα２鎖とすでに知
られていたα１鎖の配列を比較するとα２鎖では疎水性
アミノ酸残基がα１鎖の約２倍含まれていることが見い
だされた（１０１４残基中α１鎖では６２残基、α２鎖
では１０４残基）。さらにＮ末端付近とＣ末端付近の２
カ所にα２鎖ではα１鎖に見られない疎水性アミノ酸の
クラスターが見られた（図１）。またα２鎖のペプチド
断片を分離精製して患者のIgEとの反応性を検討したと
ころα２鎖のＣ末端のアミノ酸配列で７５０番付近のペ
プチドに抗原性があることが判明した。これはＣ末端付
近の疎水性アミノ酸のクラスターの位置と一致する。

【００２０】以上の知見をふまえ、本発明者等はα２鎖
上に存在する抗原性部分を破壊すれば低アレルゲン性の
ゼラチン分解物が得られると考え、種々の分解酵素を検
討した。

【００２１】驚いたことに、種々の分解酵素のうちペプ
シンにより分解されるゼラチンのみがワクチン等の注射
用微量蛋白質の安定剤として使用するのに最適であるこ
とを見出し本発明を完成した。すなわち、種々の酵素で
処理したゼラチンのうちペプシン、コラゲナーゼ（C. h
istricum, カニ膵臓由来）、キモトリプシン、エラスタ
ーゼ、ブロメライン、フィシン、アルカリプロテアーゼ
で処理したものがアレルギー患者のIgEに対する反応性
を低下させた。しかし、ペプシン以外のコラゲナーゼ
（C. histricum, カニ膵臓由来）、キモトリプシン、エ
ラスターゼ、ブロメライン、フィシン、アルカリプロテ
アーゼで処理したものは、分子量が微量蛋白質の安定化
に必要な分子量である３，５００よりも低く、微量成分
の安定化には適さない。一方、ペプシンで処理したもの
は微量蛋白質の安定化に必要な分子量である３，５００
を十分上回る７，６００という平均分子量を示した。そ
の他の酵素では、分子量如何に関わらずIgEとの反応性
を十分低下させることが出来なかった。さらに、本発明
ではゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過法による分
画によって、低分子ペプチドを除去することにより、重
量平均分子量のより高い、たとえば、２０，０００の低
アレルゲン性のペプチドを得ることができる。

【００２２】本願発明のゼラチン分解物の原料となるゼ
ラチンには限定はなく、酸性法により得られたゼラチン
でもアルカリ法により得られたゼラチンでもよい。さら
に可溶化コラーゲンを熱変性させたゼラチンでもよい。
可溶化コラーゲンは、当業界により公知の酢酸可溶化で
も、微生物産生プロテアーゼ（例えば、明治製菓販売の
「プロクターゼ」）もしくはペプシンのような動物由来
のプロテアーゼにより可溶化したコラーゲンでもよい。

【００２３】ゼラチンを分解するのに使用するペプシン
は当業界で入手できるいずれのペプシンでもよい。例え
ば、シグマ社から市販されているブタ胃粘膜由来のもの
等がある。

【００２４】分解は以下に示すような条件が好ましい。

【００２５】ゼラチンに対するペプシンの濃度は重要で
なく、通常、当業界でプロテアーゼを使用して蛋白質を
加水分解するような濃度であり、当業者は容易に定める
ことができる。例えば、基質と酵素との重量比は１０，
０００：１〜１０：１、 好ましくは、２００：１〜５
０：１、より好ましくは、１００：１である。

【００２６】溶液は５〜５００ミリモルの酢酸もしくは
塩酸溶液が好ましく、ゼラチン濃度は０．０１％〜数１
０％が好ましい。分解温度は３７℃〜６０℃が好まし
く、分解時間は数時間〜数日間が好ましく、電気泳動上
で分子量１０万のα鎖が検出されなくなるまで分解させ
るのが好ましい。もし分子量１０万のα鎖が残った場合
も、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過法によって
未分解画分を除くことができる。

【００２７】分解に用いたペプシンは、イオン交換樹
脂、抗ペプシン抗体固定化樹脂で除くことができる。ま
た、樹脂に固定化したペプシンを用いてペプシンが混入
しないようにゼラチンを分解することができる。

【００２８】得られた加水分解ゼラチンは、ゲル濾過高
速液体クロマトグラフィーによる重量平均分子量が３，
５００〜２０，０００であり、好ましくは４，０００〜
１０，０００であり、最も好ましくは約７，６００であ
る。さらに、得られた加水分解ゼラチンは、SDS-ポリア
クリルアミド電気泳動において１５ｋｄ、１７ｋｄ、３
６ｋｄおよび６０ｋｄに特徴的分離パターンがあり、コ
ラーゲンα２鎖由来成分は検出されない。

【００２９】注射用微量蛋白質成分の安定剤として加水
分解ゼラチンを使用するための量は当業者により容易に
定めることができる。

【００３０】

【実施例】アスペルギルス属産生のプロテアーゼ（商標
名：プロクターゼ、明治製菓より販売）処理で可溶化さ
せたウシコラーゲンＩ型（商品名：ＳＣＥ）を１００℃
で２分間処理して熱変性させて得たゼラチンを、種々の
酵素を使用して分解させた。使用した酵素は、ペプシ
ン、バクテリアコラゲナーゼ、コラゲナーゼ（カニ膵
臓）、キモトリプシン、エラスターゼ、ブロメライン、
フィシン、アルカリプロテアーゼ、アクチナーゼ、Ｖ８
プロテアーゼ、バクテリアコラゲナーゼ（VibrioSp)、
トリプシンおよびパパインであった。ペプシンはシグマ
社のブタ胃粘膜由来のものを使用し、その他の酵素はシ
グマ社または（株）和光純薬工業から市販されているも
のを使用した。分解条件は、ＳＣＥをあらかじめ１００
℃で２分間処理して熱変性させたゼラチン０．１％中
（０．５Ｍ酢酸溶液）にペプシン最終濃度０．００１％
になるようにペプシンを加え、３７℃で２４時間処理し
た。その他の酵素の溶媒条件は当業界で当該酵素に知ら
れている最適溶媒中でその他の分解条件は同様にして処
理した。

【００３１】ゼラチンに対するIgE抗体の測定：酵素処
理したゼラチンをELISA用プレートに吸着させ、ELISA法
によって、患者血清中のゼラチンに反応するIgE抗体価
を測定した。対照として、酵素未処理のゼラチンのIgE
抗体も測定した。

【００３２】平均分子量の測定：酵素処理した分解ゼラ
チンの平均分子量を高速液体クロマトグラフィーにより
測定した。分離用カラムは、Ｓhodex OHpak SB803とＳh
odexOHpak SB802.5(昭和電工）を直列につないだものを
使用した。溶媒にはリン酸カルシウム緩衝液（ｐＨ６．
９）を使用し、流速は１ｍｌ／分で、カラム温度は４０
℃とした。分子量はポリエチレンオキサイドの分子量マ
ーカを標準とした。ゼラチンに対するIgE抗体の測定と
同様、酵素未処理のゼラチンの分子量も測定した。

【００３３】上記のようにして得た酵素分解ゼラチンの
ゼラチンアレルギー患者血清中のIgEとの反応性を表２
に示す。

【００３４】

【表２】 上記の表より、ペプシン、コラゲナーゼ（C. histricu
m, カニ膵臓由来）、キモトリプシン、エラスターゼ、
ブロメライン、フィシン、アルカリプロテアーゼで処理
したものがアレルギー患者のIgEに対する反応性を低下
させたことがわかる。しかし、ペプシン以外のコラゲナ
ーゼ（C. histricum, カニ膵臓由来）、キモトリプシ
ン、エラスターゼ、ブロメライン、フィシン、アルカリ
プロテアーゼで処理したものは、分子量が微量蛋白質の
安定化に必要な分子量である３，５００よりも低く、微
量成分の安定化には適さない。一方、ペプシンで処理し
たものは微量蛋白質の安定化に必要な分子量である３，
５００を十分上回る７，６００という重量平均分子量を
示した。その他の酵素では、分子量如何に関わらずIgE
との反応性を十分低下させることが出来なかった。

【００３５】次に、未分解ゼラチン（ＳＣＥを熱変性さ
せたもの）とペプシン分解ゼラチンとの前述の条件で行
った高速液体クロマトグラフィーの分離パターンを図に
示す。未分解ゼラチンの保持時間２０．６３分のバンド
のピークは分子量２０万以上のゼラチン鎖、２１．９５
分はゼラチンの鎖の単量体である１０万のピークである
（図２）。ペプシン処理したものは数万以下の幅広いピ
ークを示す。２８．６４分に最大ピークがあり重量平均
分子量７６００と算定された（図３）。 ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動：酵素処理した
分解ゼラチンを、１０％ポリアクリルアミドゲル中で電
気泳動させた。後蛋白質のバンドをクマシーブリリアン
トブルーで可視化した（図４）。それぞれのバンドの下
にIgEの反応性を定量的に示した。図４から分かるよう
に、IgEの反応性を低下させるコラゲナーゼ、ブロメラ
イン、フィシン、アルカリプロテアーゼ等の酵素で処理
した分解ゼラチンは分子量が小さく、ポリアクリルアミ
ドゲルからぬけてしまって、電気泳動させても殆どバン
ドが検出できない。一方、トリプシン、パパインのよう
にバンドが検出できなくなるほど切れてしまっていて
も、IgE反応性が維持される酵素処理分解ゼラチンもあ
った。また、V8プロテアーゼやコラゲナーゼ（vibrio )
分解ゼラチンのように分子量が大きく、いくつかのバン
ドが電気泳動で確認できるものは、IgEの反応性が下が
らなかった。ペプシン処理したゼラチンは、１５ｋｄ、
１７ｋｄ、３６ｋｄおよび６０ｋｄに主要なバンドとよ
り少ない１万以上のペプチドの分離パターンを示した。

【００３６】さらに、抗原性を失わせることなくコラー
ゲンを１カ所のみで切断するオタマジャクシ由来のマト
リックスメタロプロテアーゼ処理をし、ＣＭ−セルロー
スカラム（ファルマシア社製）でα１鎖由来のペプチド
（α１ＴＣａとα１ＴＣｂ）とα２鎖由来のペプチド
（α２ＴＣａとα２ＴＣｂ）に分離したものをそれぞれ
ペプシン（シグマ社製）にて基質と酵素の重量比率１
０：１として、０．１Ｍ酢酸中で３７℃、２４時間処理
した（図５）。その後、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル
電気泳動１０％および１５％ゲル中で各サンプルを分析
した。図５中、レーン１は分子量マーカーであり、上か
ら１０３ｋＤ、７７ｋＤ、４８ｋＤ、３４ｋＤ、２８ｋ
Ｄおよび２０ｋＤのバンドである。レーン２は、コラー
ゲンα１鎖の７５ｋＤと２５ｋＤのみを分離した画分で
ある。レーン３は、コラーゲンα２鎖の７５ｋＤと２５
ｋＤのみを分離した画分である。レーン４は、コラーゲ
ンα１鎖をペプシン処理をしたものである。レーン５
は、コラーゲンα２鎖をペプシン処理をしたものであ
る。図５から分かるように、図４で見られた主要な１５
ｋｄ、１７ｋｄ、３６ｋｄおよび６０ｋｄのバンドおよ
びより少ない１万以上のペプチドはすべてα１由来であ
ることが明らかとなった（図５、レーン４）。一方、抗
原性のあるα２鎖はペプシンによって完全に分解されバ
ンドが検出されなかった（図５、レーン５）。

【００３７】

【発明の効果】本発明の新規なペプシン分解ゼラチン
は、微量蛋白質成分の安定化に十分な大きさの分子量で
あり、低アレルゲン性である。したがって、医薬品、食
品、化粧品、特にワクチン等の注射用微量蛋白質成分の
安定剤として有用である。

【図面の簡単な説明】

【図１】ウシコラーゲンのα１鎖とα２鎖の配列中の疎
水性アミノ酸（バリン、ロイシン、イソロイシン、メチ
オニン、フェニルアラニン、トリプトファン）の位置を
バンドで示した図である。

【図２】未分解ゼラチン（ＳＣＥを熱変性させたもの）
の高速液体クロマトグラフィーの分離パターン図であ
る。

【図３】ペプシン分解ゼラチンの高速液体クロマトグラ
フィーの分離パターン図である。

【図４】種々の酵素で分解させたゼラチンのSDS-ポリア
クリルアミド電気泳動を示す写真である。それぞれのバ
ンドの下にIgEの反応性を定量的に示した。

【図５】抗原性もたないコラーゲンα１鎖と抗原性のあ
るコラーゲンα２鎖をＣＭ−セルロースカラムで分離
し、それぞれをペプシンで分解させたもののSDS-ポリア
クリルアミド電気泳動写真である。図５ａは１０％ＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲルの電気泳動写真であり、図
５ｂは１５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの電気泳
動写真である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 入江 伸吉 東京都足立区千住緑町１丁目１番地１ 株 式会社ニッピバイオマトリックス研究所内

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ゲル濾過高速液体クロマトグラフィーに
   よる重量平均分子量が３，５００〜２０，０００であ
   り、SDS-ポリアクリルアミド電気泳動において１５ｋ
   ｄ、１７ｋｄ、３６ｋｄおよび６０ｋｄに特徴的分離パ
   ターンがあるペプシン分解ゼラチン。
2. 【請求項２】 請求項１に記載のペプシン分解ゼラチン
   を含有する注射用微量蛋白質成分の安定剤。
3. 【請求項３】 ゼラチンをペプシンにより分解させるこ
   とを特徴とする請求項１に記載のペプシン分解ゼラチン
   の製造法。