JPH1142081A

JPH1142081A - クロストリジウム・ブチリカムの製造方法

Info

Publication number: JPH1142081A
Application number: JP9201218A
Authority: JP
Inventors: Takashi Ikeda; 尊池田; Tetsuo Kitamura; 哲男北村; Hisao Usui; 久夫臼井
Original assignee: Miyarisan KK
Current assignee: Miyarisan KK
Priority date: 1997-07-28
Filing date: 1997-07-28
Publication date: 1999-02-16

Abstract

(57)【要約】【課題】クロストリジウム・ブチリカムの芽胞を高い
収率で回収することができるクロストリジウム・ブチリ
カムの製造方法を提供する。【解決手段】クロストリジウム・ブチリカムの前培養
液を本培養用培地に高温条件下で接種することを特徴と
するクロストリジウム・ブチリカムの製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、芽胞を形成する嫌
気性細菌であるクロストリジウム・ブチリカム(Clostri
dium butyricum) の製造方法に関するものである。より
詳しくは、本発明は、芽胞を形成する嫌気性細菌である
クロストリジウム・ブチリカム(Clostridium butyricu
m) ［以下、括弧内を省略する］の製造において、本培
養用培地への種菌としてのクロストリジウム・ブチリカ
ムの前培養液の接種を高温条件下で行い、該培地を培養
することによりクロストリジウム・ブチリカムの芽胞を
高収率で形成させる方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】クロストリジウム・ブチリカム(Clostri
dium butyricum) は、栄養のバランスがとれている間は
分裂増殖を繰り返す（栄養細胞）が、そのバランスが崩
れると菌体内に胞子を生じる芽胞形成性の嫌気性グラム
陽性桿菌である。嫌気性細菌に限らず、多くの細菌は、
栄養細胞の形態を有する際には、乾燥状態で放置される
と容易に死滅する。しかしながら、芽胞は休止細胞であ
るため、乾燥、熱や化学薬品等の様々な外的環境に対し
て強い抵抗性を有し、保存には好都合である。

【０００３】また、クロストリジウム・ブチリカムは、
現在、整腸剤などの医薬品、食品及び飼料添加剤など様
々な分野において有用菌として使用されており、広く一
般に知られている。上述したように、クロストリジウム
・ブチリカムは芽胞形成性であり、芽胞の状態にある際
には、様々な外的環境に対して抵抗性を有する。このた
め、クロストリジウム・ブチリカムが芽胞の形態で人や
動物に経口投与されると、胃酸、腸液や胆汁酸などの消
化液と接しても、クロストリジウム・ブチリカムは完全
には死滅せずに小腸下部から大腸に至るまでの発酵部位
にも到達し増殖することが可能となり、栄養細胞の形態
で投与される際に比べて、整腸剤などの医薬品、食品及
び飼料添加剤など様々な分野においてさらに有効に利用
できる。

【０００４】従来、クロストリジウム・ブチリカムの培
養における菌の前培養液の接種温度は、通常、培養温度
と同等の３７℃前後であった。しかしながら、この接種
温度では、必ずしも効率よく細菌を芽胞の状態で回収す
ることが可能でなく、生産効率の上で未だ問題が残って
いた。このため、芽胞の生産効率を向上させることを目
的として、従来、培地に中和剤として炭酸カルシウムを
添加したり、発芽抑制物質を添加したり、培養する培地
の窒素源や炭素源の種類を変える（「耐久型細胞」、蜂
須賀養悦、堀越弘毅編、岩波書店、頁３９８〜４０４、
１９７６年）ことなどが行われてきたが、いずれの方法
を用いても、芽胞を高収率で回収することができず、ま
たは、ある程度高濃度で芽胞を回収できたとしても費用
の面で実用的ではなかった。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明
は、クロストリジウム・ブチリカム(Clostridium butyr
icum) の芽胞を高い収率で回収することができるクロス
トリジウム・ブチリカムの製造方法を提供することを目
的とするものである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】このような諸事情を考慮
して、本発明者らは、様々なクロストリジウム・ブチリ
カムの製造条件を検討した結果、前培養後の本培養を行
う際の菌の接種を高温条件下で行うことにより高い収率
で芽胞状態の細菌が得られることを見い出し、この知見
に基づいて、本発明を完成した。

【０００７】すなわち、上記目的は下記（１）〜（３）
によって達成される。

【０００８】（１）クロストリジウム・ブチリカム(C
lostridium butyricum) の前培養液を本培養用培地に高
温条件下で接種することを特徴とするクロストリジウム
・ブチリカム(Clostridium butyricum) の製造方法。

【０００９】（２）上記クロストリジウム・ブチリカ
ム(Clostridium butyricum) がクロストリジウム・ブチ
リカム・ミヤイリ５８８(Clostridium butyricum MIY
AIRI 588) 、クロストリジウム・ブチリカム・ＡＴＣＣ
８５９(Clostridium butyricumATCC859) 、クロストリ
ジウム・ブチリカム・ＩＦＯ３３１５(Clostridium but
yricum IFO3315) 、クロストリジウム・ブチリカム・Ａ
ＴＣＣ８６０(Clostridium butyricum ATCC860) または
クロストリジウム・ブチリカム・ＡＴＣＣ１９３９８(C
lostridium butyricum ATCC19398) である、前記（１）
に記載の製造方法。

【００１０】（３）上記クロストリジウム・ブチリカ
ム(Clostridium butyricum) がクロストリジウム・ブチ
リカム・ミヤイリ５８８(Clostridium butyricum MIY
AIRI 588) である、前記（２）に記載の製造方法。

【００１１】（４）上記クロストリジウム・ブチリカ
ム(Clostridium butyricum) の前培養液の本培養用培地
への接種温度が６０〜１００℃である、前記（１）〜
（３）のいずれかに記載の製造方法。

【００１２】（５）上記接種温度が７０〜９０℃であ
る、前記（４）に記載の製造方法。

【００１３】

【発明の実施の形態】本発明のクロストリジウム・ブチ
リカムの製造方法は、前培養液を高温条件下で本培養用
培地に接種した後、クロストリジウム・ブチリカムの本
培養を行うことにより、クロストリジウム・ブチリカム
の芽胞を高い収率で回収することを特徴とするものであ
る。

【００１４】以下、本発明を詳細に説明する。

【００１５】本発明の製造方法に使用される微生物は、
クロストリジウム・ブチリカム(Clostridium butyricu
m) に属する菌であればいずれでも使用できるが、具体
的には、クロストリジウム・ブチリカム・ミヤイリ５
８８(Clostridium butyricum MIYAIRI 588) 、クロスト
リジウム・ブチリカム・ＡＴＣＣ８５９(Clostridium b
utyricum ATCC859) 、クロストリジウム・ブチリカム・
ＩＦＯ３３１５(Clostridium butyricum IFO3315) 、ク
ロストリジウム・ブチリカム・ＡＴＣＣ８６０(Clostri
dium butyricum ATCC860) 及びクロストリジウム・ブチ
リカム・ＡＴＣＣ１９３９８(Clostridium butyricum A
TCC19398) などが挙げられる。これらのうち、好ましく
はクロストリジウム・ブチリカム・ミヤイリ５８８(C
lostridiumbutyricum MIYAIRI 588) （以下、単に「５
８８株」とも称する）が使用され、本菌は微工研条寄第
２７８９号（ＦＥＲＭＢＰ−２７８９）の受託番号で
通商産業省工業技術院生命工学工業研究所に寄託されて
いる。

【００１６】本発明において、クロストリジウム・ブチ
リカムの製造は、既知の培養方法によって行われるが、
その一実施態様を、５８８株を用いた場合について、下
記に詳細に説明する。５８８株を、コーンスターチ２．
０％、アミノ酸液２．０％及び炭酸カルシウム０．７５
％からなるＣＳ液体培地１０ｍｌに５８８株を接種し、
３５〜３７℃で１６〜２４時間、炭酸ガス置換スチール
ウール法により嫌気培養し、前培養液を調製する。所定
時間培養終了後、この前培養液０．０１〜１ｍｌを本培
養用のＣＳ液体培地１０ｍｌに６０〜１００℃で接種し
た後、ＣＳ液体培地の温度を３０〜４０℃まで水で冷却
して、３５〜３７℃で４０〜４８時間、炭酸ガス置換ス
チールウール法により嫌気培養することにより、目的と
する培養液を得る。

【００１７】本発明において、微生物の培養は、使用さ
れるクロストリジウム・ブチリカムが偏性嫌気性である
ため、窒素ガス若しくは炭酸ガスで培養系内を置換する
ことにより、培地中に還元剤を加えることにより酸化還
元電位を下げることにより、または通気をしない静置培
養によるなどの嫌気的条件下で行われる。また、培養装
置は通常嫌気性菌に対して用いられるいずれの装置でも
使用できる。

【００１８】本発明における培養条件は、使用されるク
ロストリジウム・ブチリカムの菌株の生育範囲、培地の
組成や培養法などによって適宜選択され、当業者には既
知であるが、具体的には、培養温度は、通常、３０〜４
０℃、好ましくは３５〜３７℃であり、培地のｐＨは、
通常、５〜８、好ましくは６〜７である。

【００１９】本発明の製造方法において、前培養液を本
培養用の培地に接種する際の温度は、６０℃〜１００
℃、好ましくは７０℃〜９０℃である。上記接種温度が
６０℃未満である際には、本培養後の培養液中の芽胞の
濃度が低くなり好ましくない。また、接種温度が１００
℃を超えると、接種される菌が著しく死滅しやはり好ま
しくない。

【００２０】本発明による本培養時における菌の前培養
液の接種量は、本培養用の培地に対して、０．０１〜２
０（ｖ／ｖ）％、好ましくは０．１〜１０（ｖ／ｖ）％
である。

【００２１】本発明におけるクロストリジウム・ブチリ
カムを培養するための培地は、使用するクロストリジウ
ム・ブチリカムが資化しうる炭素源、適量の窒素源、無
機塩及びビタミン類などのその他の栄養を含有し、本発
明によるクロストリジウム・ブチリカムが増殖可能であ
れば、合成培地または天然培地のいずれであってもよ
い。

【００２２】例えば、本発明による培養において使用さ
れる炭素源の例としては、使用する菌株が資化できる炭
素源であれば、特に制限されない。炭素原としては、必
ずしも糖に制限されないが、菌株の増殖等を考慮する
と、使用する菌株が利用できる糖または糖を含むものが
好ましく使用される。具体的には、セロビオース、グル
コース、フルクトース、ガラクトース、ラクトース、マ
ルトース、マンノース、メリビオース、ラフィノース、
サリシン、スターチ、シュクロース、トレハロース、キ
シロース、デキストリン及び糖蜜等が挙げられる。これ
らのうち、スターチ、グルコース、フルクトース、シュ
クロース及び糖蜜などが好ましく使用される。上記した
炭素源は、使用する微生物の資化を考慮して、１種また
は２種以上を選択して使用してもよい。本発明におい
て、炭素源の添加濃度は、使用する菌株や炭素源の種類
及び使用する培地の組成等によっても異なるが、通常、
０．５〜５．０（ｗ／ｖ）％、好ましくは１〜３（ｗ／
ｖ）％である。

【００２３】また、本発明による培養において使用され
る窒素原としては、一般的に微生物の培養に使用される
窒素源が使用されるが、例えば、肉エキス、ポリペプト
ン、ペプトン、酵母エキスやアミノ酸液等の大豆及び小
麦の加水分解物、大豆粉末、ミルクカゼイン、カザミノ
酸、各種アミノ酸、コーンスティープリカー、その他の
動物、植物及び微生物の加水分解物等の有機窒素化合
物、および硫酸アンモニウム等のアンモニウム塩などが
挙げられる。これら窒素源のうち、ペプトン、酵母エキ
ス、肉エキス、コーンスティープリカー、アミノ酸液及
びカミザノ酸などが好ましく使用される。上記した窒素
源は、使用する微生物の生育等を考慮して、１種または
２種以上選択して使用してもよい。この際、窒素源の添
加濃度は、使用する菌株や窒素源の種類及び使用する培
地の組成等によっても異なるが、通常、０．５〜４．０
（ｗ／ｖ）％、好ましくは２〜３（ｗ／ｖ）％である。

【００２４】さらに、本発明による培養において用いら
れる無機塩としては、通常当業者に公知の塩が使用さ
れ、例えば、マグネシウム、マンガン、カルシウム、ナ
トリウム、カリウム、モリブデン、ストロンチウム、ホ
ウ素、銅、鉄、錫及び亜鉛等のリン酸塩、塩酸塩、硫酸
塩、酪酸塩、プロピオン酸塩及び酢酸塩等からなる群よ
り選ばれた１種または２種以上を使用することができ
る。また、培地中に、必要に応じて、消泡剤、植物油、
界面活性剤、血液及び血液成分、ビタミン類及び抗生物
質等の薬剤、植物または動物ホルモン等の生理活性物質
などを適時添加してもよい。

【００２５】このようにして得られる培養液は、３７℃
で前培養液を接種する従来法に比べて芽胞を高濃度で含
むため、乾燥、熱や化学薬品等の様々な外的環境に対し
て強い抵抗性を有する。

【００２６】また、上記製造方法によって得られた培養
液は、濾過、限外濾過や遠心分離などの一般的な方法に
よって集菌され、集められた菌体を蒸留水に懸濁して撹
拌した後、遠心分離によるなどの洗浄操作を繰り返し行
い、さらに凍結乾燥やスプレードライヤーなどの一般的
な方法により粉末化したものを、そのままの形態でまた
は必要の応じて保存性向上剤や他の薬剤を配合すること
により、整腸剤などの医薬品、食品及び飼料添加剤など
として使用できる。

【００２７】

【実施例】以下、実施例を参照しながら、本発明をさら
に具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例
に限定されるものではない。

【００２８】実施例１〜２、比較例１コーンスターチ２．０％、アミノ酸液２．０％及び炭酸
カルシウム０．７５％からなるＣＳ液体培地１０ｍｌに
クロストリジウム・ブチリカム・ミヤイリ５８８(Clo
stridium butyricum MIYAIRI 588) 株を接種し、３７℃
で２４時間、炭酸ガス置換スチールウール法により嫌気
培養し、前培養液を調製した。所定時間培養終了後、こ
の前培養液０．７ｍｌを本培養用のＣＳ液体培地（培地
組成は上記と同様）１０ｍｌに７０℃（実施例１）ある
いは９０℃（実施例２）の温度条件下で接種した後、培
地温度を３７℃まで水冷して、同温度で４８時間、炭酸
ガス置換スチールウール法により嫌気培養した。

【００２９】対照（比較例１）として、上記操作におい
て、前培養液の本培養用のＣＳ液体培地への接種温度を
３７℃に変更した以外は、同様の操作を行った。

【００３０】このようにして培養された各培養液中のク
ロストリジウム・ブチリカムの芽胞菌数を以下のように
して測定した：１ｍｌの培養液に等量の９９．５％エタ
ノールを加え混合し、室温で４５分間、アルコールショ
ック処理を施し、このアルコールショック処理液を滅菌
生理食塩水で１０倍希釈していき１０倍希釈系列を作製
し、この希釈液をそれぞれ変法ＧＡＭ寒天培地（日水製
薬株式会社製）に塗抹し、３７℃で２４時間、炭酸ガス
置換スチールウール法で嫌気培養を行い、発生したコロ
ニー数を計測した。結果を下記表１に示す。

【００３１】

【表１】

【００３２】表１に示される結果から、本発明の製造方
法を用いてクロストリジウム・ブチリカムを培養するこ
とにより、クロストリジウム・ブチリカムの培養液には
高濃度の芽胞が含まれることが分かった。

【００３３】

【発明の効果】以上述べたように、本発明の製造方法
は、クロストリジウム・ブチリカムの前培養液を本培養
用培地に高温条件下で接種することを特徴とするもので
ある。したがって、本発明の方法によれば、医薬品ある
いは飼料添加剤として有用に使用されるクロストリジウ
ム・ブチリカムの芽胞を、より高濃度で回収できる。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｒ 1:145） (Ｃ１２Ｎ 3/00 Ｃ１２Ｒ 1:145）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】クロストリジウム・ブチリカム(Clostri
dium butyricum) の前培養液を本培養用培地に高温条件
下で接種することを特徴とするクロストリジウム・ブチ
リカム(Clostridium butyricum) の製造方法。
【請求項２】該クロストリジウム・ブチリカム(Clost
ridium butyricum)がクロストリジウム・ブチリカム・
ミヤイリ５８８(Clostridium butyricum MIYAIRI 58
8) である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】該クロストリジウム・ブチリカム(Clost
ridium butyricum)の前培養液の本培養用培地への接種
温度が６０〜１００℃である、請求項１または２に記載
の製造方法。
【請求項４】該接種温度が７０〜９０℃である、請求
項３に記載の製造方法。