JPH1142097A - Ｄ−トリプトファンの製造方法 - Google Patents
Ｄ−トリプトファンの製造方法Info
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- JPH1142097A JPH1142097A JP9329792A JP32979297A JPH1142097A JP H1142097 A JPH1142097 A JP H1142097A JP 9329792 A JP9329792 A JP 9329792A JP 32979297 A JP32979297 A JP 32979297A JP H1142097 A JPH1142097 A JP H1142097A
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
- C12P41/001—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by metabolizing one of the enantiomers
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- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 高収率かつ高い光学純度でD-トリプトファン
を製造する方法を提供することを課題とする。 【解決手段】 D,L-トリプトファン混合物にトリプトフ
ァナーゼを産生する生物を作用させてL-トリプトファン
を選択的に分解することにより、D,L-トリプトファン中
のD-トリプトファンの存在比率を増加させ、これにより
高収率かつ高い光学純度でD-トリプトファンを製造する
ことが可能になった。
を製造する方法を提供することを課題とする。 【解決手段】 D,L-トリプトファン混合物にトリプトフ
ァナーゼを産生する生物を作用させてL-トリプトファン
を選択的に分解することにより、D,L-トリプトファン中
のD-トリプトファンの存在比率を増加させ、これにより
高収率かつ高い光学純度でD-トリプトファンを製造する
ことが可能になった。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、 D,L-トリプトフ
ァン中のL-トリプトファンを選択的に分解しD-トリプト
ファンの存在比率を増加させることを特徴とするD-トリ
プトファンの製造方法に関する。
ァン中のL-トリプトファンを選択的に分解しD-トリプト
ファンの存在比率を増加させることを特徴とするD-トリ
プトファンの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】D-トリプトファンの製造方法として、DL
-インドリルメチルヒダントインに対しD-インドリルメ
チルヒダントインを選択的にN-カルバモイル-D-トリプ
トファンに加水分解する能力を有する微生物を作用させ
てN-カルバモイル-D-トリプトファンを合成し、さら
に、亜硝酸などを用いて化学的に、もしくは微生物を用
いてN-カルバモイル-D-トリプトファンをD-トリプトフ
ァンに加水分解することによりD-トリプトファンを製造
する方法（ヒダントイナーゼ法、特開昭61-17791）が知
られている。
-インドリルメチルヒダントインに対しD-インドリルメ
チルヒダントインを選択的にN-カルバモイル-D-トリプ
トファンに加水分解する能力を有する微生物を作用させ
てN-カルバモイル-D-トリプトファンを合成し、さら
に、亜硝酸などを用いて化学的に、もしくは微生物を用
いてN-カルバモイル-D-トリプトファンをD-トリプトフ
ァンに加水分解することによりD-トリプトファンを製造
する方法（ヒダントイナーゼ法、特開昭61-17791）が知
られている。
【０００３】また、DL-トリプトファンアミドのうちD-
トリプトファンアミドのみを選択的に加水分解し、D-ト
リプトファンを産生する能力を有する微生物もしくは酵
素をDL-トリプトファンアミドに作用させてD-トリプト
ファンを製造する方法（D-アミダーゼ法、特公平08-222
28）、DL-トリプトファンアミドのうちL-トリプトファ
ンアミドのみを選択的に加水分解し、残存するD-トリプ
トファンアミドを化学的に加水分解してD-トリプトファ
ンを製造する方法（L-アミダーゼ法、特開昭 57-1300
0）が知られている。
トリプトファンアミドのみを選択的に加水分解し、D-ト
リプトファンを産生する能力を有する微生物もしくは酵
素をDL-トリプトファンアミドに作用させてD-トリプト
ファンを製造する方法（D-アミダーゼ法、特公平08-222
28）、DL-トリプトファンアミドのうちL-トリプトファ
ンアミドのみを選択的に加水分解し、残存するD-トリプ
トファンアミドを化学的に加水分解してD-トリプトファ
ンを製造する方法（L-アミダーゼ法、特開昭 57-1300
0）が知られている。
【０００４】さらに、インドールピルビン酸、及びアミ
ノ基供与体としてのD-アラニンからD-アミノ酸トランス
アミナーゼの作用によりD-トリプトファンを製造する方
法（トランスアミナーゼ法、特公平07-85718）、N-アセ
チル-DL-トリプトファンに対してN-アセチル-L-トリプ
トファンを選択的に脱アセチル化するL-アミノアシラー
ゼを作用させ、残存するN-アセチル-D-トリプトファン
を化学的に脱アセチル化してD-トリプトファンを製造す
る方法 (L-アミノアシラーゼ法、Methods in.Enzymolog
y. 3, 554-570)、N-アセチル-DL-トリプトファンに対し
てN-アセチル-D-トリプトファンを選択的に脱アセチル
化するD-アミノアシラーゼを作用させてD-トリプトファ
ンを製造する方法（D-アミノシラーゼ法、特公平01-295
60）、DL-トリプトファンにD-アミノ酸アセチルトラン
スフェラーゼを作用させ、D-トリプトファンを選択的に
N-アセチル-D-トリプトファンに変換して残存するL-ト
リプトファンと分離した後、生成したN-アセチル-D-ト
リプトファンを化学的に加水分解してD-トリプトファン
を製造する方法（アセチルトランスフェラーゼ法、特開
昭60-251892）などが知られている。
ノ基供与体としてのD-アラニンからD-アミノ酸トランス
アミナーゼの作用によりD-トリプトファンを製造する方
法（トランスアミナーゼ法、特公平07-85718）、N-アセ
チル-DL-トリプトファンに対してN-アセチル-L-トリプ
トファンを選択的に脱アセチル化するL-アミノアシラー
ゼを作用させ、残存するN-アセチル-D-トリプトファン
を化学的に脱アセチル化してD-トリプトファンを製造す
る方法 (L-アミノアシラーゼ法、Methods in.Enzymolog
y. 3, 554-570)、N-アセチル-DL-トリプトファンに対し
てN-アセチル-D-トリプトファンを選択的に脱アセチル
化するD-アミノアシラーゼを作用させてD-トリプトファ
ンを製造する方法（D-アミノシラーゼ法、特公平01-295
60）、DL-トリプトファンにD-アミノ酸アセチルトラン
スフェラーゼを作用させ、D-トリプトファンを選択的に
N-アセチル-D-トリプトファンに変換して残存するL-ト
リプトファンと分離した後、生成したN-アセチル-D-ト
リプトファンを化学的に加水分解してD-トリプトファン
を製造する方法（アセチルトランスフェラーゼ法、特開
昭60-251892）などが知られている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、これら
の方法には、基質が高価である、反応工程が複雑であ
る、反応収率が悪い、光学純度が低いなど工業的なD-ト
リプトファンの製造法としては問題があった。
の方法には、基質が高価である、反応工程が複雑であ
る、反応収率が悪い、光学純度が低いなど工業的なD-ト
リプトファンの製造法としては問題があった。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、工業的に
有用なD-トリプトファンの製造方法を提供すべく鋭意研
究を行った結果、DL-トリプトファンなどD-トリプトフ
ァンとL-トリプトファンの混合物に、トリプトファナー
ゼを産生する微生物を作用させることにより、D,L-トリ
プトファン中のＬ-トリプトファンが選択的に分解してD
-トリプトファンの存在比率が増加し、これにより高収
率かつ高い光学純度でD-トリプトファンを製造すること
が可能であることを見いだした。
有用なD-トリプトファンの製造方法を提供すべく鋭意研
究を行った結果、DL-トリプトファンなどD-トリプトフ
ァンとL-トリプトファンの混合物に、トリプトファナー
ゼを産生する微生物を作用させることにより、D,L-トリ
プトファン中のＬ-トリプトファンが選択的に分解してD
-トリプトファンの存在比率が増加し、これにより高収
率かつ高い光学純度でD-トリプトファンを製造すること
が可能であることを見いだした。
【０００７】即ち、本発明はDL-トリプトファン混合物
にトリプトファナーゼを作用させることによりD,L-トリ
プトファン中のＬ-トリプトファンを選択的に分解する
ことを特徴とするD-トリプトファンの製造方法に関し、
具体的には、（１）トリプトファナーゼ、またはトリプ
トファナーゼを産生する微生物もしくはその処理物をD,
L-トリプトファン混合物に作用させ、L-トリプトファン
を選択的に分解してD,L-トリプトファン中のD-トリプト
ファンの存在比率を増加させることを特徴とする、D-ト
リプトファンを製造する方法に関し、好ましくは、
（２）アエロモナス属 (Aeromonas) 、エンテロバクタ
ー属 (Enterobacter) 、エシェリヒア属 (Escherichia)
、モルガネラ属(Morganella)、パエニバチルス属 (Pae
nibacillus) 、プロテウス属 (Proteus) 、スフェロフ
ォラス属 (Sphaerophorus) 、シンビオバクテリウム属
(Symbiobacterium) 、又はビブリオ属 (Vibrio)に属す
る微生物由来のトリプトファナーゼをD,L-トリプトファ
ン混合物に作用させることを特徴とする、（１）に記載
の方法、より好ましくは（３）トリプトファナーゼがア
エロモナス・ハイドロフィラ（Aeromonas hydrophila)
、エンテロバクター・アエロゲネス (Enterobacter ae
rogenes)、エシェリヒア・コリ (Escherichia coli) 、
モルガネラ・モルガニイ・サブスピーシーズ・モルガニ
イ(Morganella morganii subsp. morganii) 、パエニバ
チルス・アルベイ (Paenibacillus alvei) 、プロテウ
ス・バルガリス (Proteus vulgaris)、スフェロフォラ
ス・フンデュリフォルミス(Sphaerophorus funduliform
is)、又はシンビオバクテリウム・サーモフィラム (Sym
biobacterium thermophilum) 由来である、（２）に記
載の方法、に関する。
にトリプトファナーゼを作用させることによりD,L-トリ
プトファン中のＬ-トリプトファンを選択的に分解する
ことを特徴とするD-トリプトファンの製造方法に関し、
具体的には、（１）トリプトファナーゼ、またはトリプ
トファナーゼを産生する微生物もしくはその処理物をD,
L-トリプトファン混合物に作用させ、L-トリプトファン
を選択的に分解してD,L-トリプトファン中のD-トリプト
ファンの存在比率を増加させることを特徴とする、D-ト
リプトファンを製造する方法に関し、好ましくは、
（２）アエロモナス属 (Aeromonas) 、エンテロバクタ
ー属 (Enterobacter) 、エシェリヒア属 (Escherichia)
、モルガネラ属(Morganella)、パエニバチルス属 (Pae
nibacillus) 、プロテウス属 (Proteus) 、スフェロフ
ォラス属 (Sphaerophorus) 、シンビオバクテリウム属
(Symbiobacterium) 、又はビブリオ属 (Vibrio)に属す
る微生物由来のトリプトファナーゼをD,L-トリプトファ
ン混合物に作用させることを特徴とする、（１）に記載
の方法、より好ましくは（３）トリプトファナーゼがア
エロモナス・ハイドロフィラ（Aeromonas hydrophila)
、エンテロバクター・アエロゲネス (Enterobacter ae
rogenes)、エシェリヒア・コリ (Escherichia coli) 、
モルガネラ・モルガニイ・サブスピーシーズ・モルガニ
イ(Morganella morganii subsp. morganii) 、パエニバ
チルス・アルベイ (Paenibacillus alvei) 、プロテウ
ス・バルガリス (Proteus vulgaris)、スフェロフォラ
ス・フンデュリフォルミス(Sphaerophorus funduliform
is)、又はシンビオバクテリウム・サーモフィラム (Sym
biobacterium thermophilum) 由来である、（２）に記
載の方法、に関する。
【０００８】また、本発明は、（４）アクロモバクター
属 (Achromobacter) 、アエロモナス属 (Aeromonas) 、
アグロバクテリウム属 (Agrobacterium) 、アルカリゲ
ネス属 (Alcaligenes) 、バクテロイデス属 (Bacteroid
es) 、セルロモナス属 (Cellulomonas) 、シトロバクタ
ー属 (Citrobacter) 、クロストリジウム属 (Clostridi
um) 、コリネバクテリウム属(Corynebacterium)、エン
テロバクター属 (Enterobacter) 、エルビニア属 (Erwi
nia) 、エシェリヒア属 (Escherichia) 、モルガネラ属
(Morganella)、フソバクテリウム属 (Fusobacterium)
、クレブジエラ属 (Klebsiella) 、クルイベラ属 (Klu
yvera) 、モルガネラ属 (Morganella) 、ノカルディア
属 (Nocardia) 、パエニバチルス属 (Paenibacillus)
、パントエア属 (Pantoea) 、パステウレラ属 (Pasteu
rella) 、ペプトストレプトコッカス属 (Peptostreptoc
occus) 、ピキア属 (Pichia) 、プロピオニバクテリウ
ム属 (Propionibacterium)、プロテウス属 (Proteus)
、プロビデンシア属 (Providencia) 、シュードモナス
属 (Pseudomonas) 、サルモネラ属 (Salmonella) 、セ
ラチア属 (Serratia)、スフェロフォラス属 (Sphaeroph
orus) 、シンビオバクテリウム属 (Symbiobacterium)
、ビブリオ属 (Vibrio)、又はキサントモナス属 (Xant
homonas) に属する微生物またはその処理物をD,L-トリ
プトファン混合物に作用させることを特徴とする、
（１）に記載の方法、好ましくは、（５）微生物がアク
ロモバクター・リキダム (Achromobacter liquidum) 、
アエロモナス・ハイドロフィラ (Aeromonas hydrophil
a)、アエロモナス・ハイドロフィラ・サブスピーシーズ
・ハイドロファイラ (Aeromonas hydrophila subsp.hyd
rophila) 、アグロバクテリウム・ツメファシエンス (A
grobacterium tumefasciens) 、アルカリゲネス・フェ
ーカリス (Alcaligenes faecalis) 、バクテロイデス・
フラジリス (Bacteroides fragilis) 、シトロバクター
・フロインディー (Citrobacter freundii) 、クロスト
リジウム・ファルシネウム (Clostridium felsineum)
、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス(Corynebact
erium ammoniagenes)、エンテロバクター・アエロゲネ
ス (Enterobacter aerogenes)、エンテロバクター・ク
ロアカエ (Enterobacter cloacae)、 エルビニア・カロ
トボーラ (Erwinia carotovora）、エシェリヒア・コリ
(Escherichia coli) 、フソバクテリウム・バリウム(F
usobacterium varium)、クレブジエラ・オキシトカ (Kl
ebsiella oxytoca) 、 クレブジエラ・プランチコラ (K
lebsiella planticola)、クレブジエラ・プノイモニエ
(Klebsiella pneumoniae)、クルイベラ・アスコルバー
タ (Kluyvera ascorbata) 、モルガネラ・モルガニイ・
サブスピーシーズ・モルガニイ (Morganella morganii
subsp. morganii) 、ノカルディア・アステロイデス (N
ocardia asteroides) 、パエニバチルス・アルベイ (Pa
enibacillus alvei) 、パントエア・アグロメランス (P
antoea agglomerans) 、パントエア・アナナス (Pantoe
a ananas) 、パステウレラ・マルトシダ (Pasteurella
multocida) 、ペプトストレプトコッカス・アサッカロ
リティカス (Peptostreptococcus asaccharolyticus)
、ピキア・アノマーラ (Pichia anomala) 、プロピオ
ニバクテリウム・アクネス (Propionibacterium acnes)
、プロテウス・インコンスタンス（Proteus inconstan
s）、プロテウス・ミラビリス (Proteus mirabilis) 、
プロテウス・バルガリス (Proteus vulgaris) 、プロビ
デンシア・レットジェリ (Providencia rettgeri) 、シ
ュードモナス・プチダ (Pseudomonas putida) 、サル
モネラ・コレラエスイス・サブスピーシーズ・コレラエ
スイス (Salmonella choleraesuis subsp. choleraesui
s)、セラチア・グリメジー (Serratia grimesii) 、ス
フェロフォラス・フンデュリフォルミス(Sphaerophorus
funduliformis) 、シンビオバクテリウム・サーモフィ
ラム (Symbiobacterium thermophilum)、ビブリオ・ハ
ーベイ (Vibrio harveyi)、ビブリオ・コレラ (Vibrioc
holerae) 、又はキサントモナス・キャンペストリス (X
anthomonas campestris) である、（４）記載の方法、
に関する。
属 (Achromobacter) 、アエロモナス属 (Aeromonas) 、
アグロバクテリウム属 (Agrobacterium) 、アルカリゲ
ネス属 (Alcaligenes) 、バクテロイデス属 (Bacteroid
es) 、セルロモナス属 (Cellulomonas) 、シトロバクタ
ー属 (Citrobacter) 、クロストリジウム属 (Clostridi
um) 、コリネバクテリウム属(Corynebacterium)、エン
テロバクター属 (Enterobacter) 、エルビニア属 (Erwi
nia) 、エシェリヒア属 (Escherichia) 、モルガネラ属
(Morganella)、フソバクテリウム属 (Fusobacterium)
、クレブジエラ属 (Klebsiella) 、クルイベラ属 (Klu
yvera) 、モルガネラ属 (Morganella) 、ノカルディア
属 (Nocardia) 、パエニバチルス属 (Paenibacillus)
、パントエア属 (Pantoea) 、パステウレラ属 (Pasteu
rella) 、ペプトストレプトコッカス属 (Peptostreptoc
occus) 、ピキア属 (Pichia) 、プロピオニバクテリウ
ム属 (Propionibacterium)、プロテウス属 (Proteus)
、プロビデンシア属 (Providencia) 、シュードモナス
属 (Pseudomonas) 、サルモネラ属 (Salmonella) 、セ
ラチア属 (Serratia)、スフェロフォラス属 (Sphaeroph
orus) 、シンビオバクテリウム属 (Symbiobacterium)
、ビブリオ属 (Vibrio)、又はキサントモナス属 (Xant
homonas) に属する微生物またはその処理物をD,L-トリ
プトファン混合物に作用させることを特徴とする、
（１）に記載の方法、好ましくは、（５）微生物がアク
ロモバクター・リキダム (Achromobacter liquidum) 、
アエロモナス・ハイドロフィラ (Aeromonas hydrophil
a)、アエロモナス・ハイドロフィラ・サブスピーシーズ
・ハイドロファイラ (Aeromonas hydrophila subsp.hyd
rophila) 、アグロバクテリウム・ツメファシエンス (A
grobacterium tumefasciens) 、アルカリゲネス・フェ
ーカリス (Alcaligenes faecalis) 、バクテロイデス・
フラジリス (Bacteroides fragilis) 、シトロバクター
・フロインディー (Citrobacter freundii) 、クロスト
リジウム・ファルシネウム (Clostridium felsineum)
、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス(Corynebact
erium ammoniagenes)、エンテロバクター・アエロゲネ
ス (Enterobacter aerogenes)、エンテロバクター・ク
ロアカエ (Enterobacter cloacae)、 エルビニア・カロ
トボーラ (Erwinia carotovora）、エシェリヒア・コリ
(Escherichia coli) 、フソバクテリウム・バリウム(F
usobacterium varium)、クレブジエラ・オキシトカ (Kl
ebsiella oxytoca) 、 クレブジエラ・プランチコラ (K
lebsiella planticola)、クレブジエラ・プノイモニエ
(Klebsiella pneumoniae)、クルイベラ・アスコルバー
タ (Kluyvera ascorbata) 、モルガネラ・モルガニイ・
サブスピーシーズ・モルガニイ (Morganella morganii
subsp. morganii) 、ノカルディア・アステロイデス (N
ocardia asteroides) 、パエニバチルス・アルベイ (Pa
enibacillus alvei) 、パントエア・アグロメランス (P
antoea agglomerans) 、パントエア・アナナス (Pantoe
a ananas) 、パステウレラ・マルトシダ (Pasteurella
multocida) 、ペプトストレプトコッカス・アサッカロ
リティカス (Peptostreptococcus asaccharolyticus)
、ピキア・アノマーラ (Pichia anomala) 、プロピオ
ニバクテリウム・アクネス (Propionibacterium acnes)
、プロテウス・インコンスタンス（Proteus inconstan
s）、プロテウス・ミラビリス (Proteus mirabilis) 、
プロテウス・バルガリス (Proteus vulgaris) 、プロビ
デンシア・レットジェリ (Providencia rettgeri) 、シ
ュードモナス・プチダ (Pseudomonas putida) 、サル
モネラ・コレラエスイス・サブスピーシーズ・コレラエ
スイス (Salmonella choleraesuis subsp. choleraesui
s)、セラチア・グリメジー (Serratia grimesii) 、ス
フェロフォラス・フンデュリフォルミス(Sphaerophorus
funduliformis) 、シンビオバクテリウム・サーモフィ
ラム (Symbiobacterium thermophilum)、ビブリオ・ハ
ーベイ (Vibrio harveyi)、ビブリオ・コレラ (Vibrioc
holerae) 、又はキサントモナス・キャンペストリス (X
anthomonas campestris) である、（４）記載の方法、
に関する。
【０００９】また、本発明は、（６）トリプトファナー
ゼ遺伝子を導入された形質転換体またはその処理物をD,
L-トリプトファン混合物に作用させることを特徴とす
る、（２）に記載の方法、好ましくは、（７）トリプト
ファナーゼ遺伝子がアルカリゲネス (Alcaligenes)
属、エンテロバクター属 (Enterobacter) 、エシェリヒ
ア属 (Escherichia) 、プロテウス属 (Proteus) 、プロ
ビデンシア属 (Providencia) 、又はシンビオバクテリ
ウム属 (Symbiobacterium) に属する微生物由来であ
る、（６）に記載の方法、より好ましくは、（８）トリ
プトファナーゼ遺伝子がアルカリゲネス・フェーカリス
(Alcaligenes faecalis) 、エンテロバクター・アエロ
ゲネス (Enterobacter aerogenes)、エシェリヒア・コ
リ (Escherichia coli) 、プロテウス・インコンスタン
ス（Proteus inconstans）、プロテウス・バルガリス
(Proteus vulgaris) 、プロビデンシア・レットジェリ
(Providencia rettgeri) 、又はシンビオバクテリウム
・サーモフィラム (Symbiobacterium thermophilum) 由
来である、（７）に記載の方法、に関する。
ゼ遺伝子を導入された形質転換体またはその処理物をD,
L-トリプトファン混合物に作用させることを特徴とす
る、（２）に記載の方法、好ましくは、（７）トリプト
ファナーゼ遺伝子がアルカリゲネス (Alcaligenes)
属、エンテロバクター属 (Enterobacter) 、エシェリヒ
ア属 (Escherichia) 、プロテウス属 (Proteus) 、プロ
ビデンシア属 (Providencia) 、又はシンビオバクテリ
ウム属 (Symbiobacterium) に属する微生物由来であ
る、（６）に記載の方法、より好ましくは、（８）トリ
プトファナーゼ遺伝子がアルカリゲネス・フェーカリス
(Alcaligenes faecalis) 、エンテロバクター・アエロ
ゲネス (Enterobacter aerogenes)、エシェリヒア・コ
リ (Escherichia coli) 、プロテウス・インコンスタン
ス（Proteus inconstans）、プロテウス・バルガリス
(Proteus vulgaris) 、プロビデンシア・レットジェリ
(Providencia rettgeri) 、又はシンビオバクテリウム
・サーモフィラム (Symbiobacterium thermophilum) 由
来である、（７）に記載の方法、に関する。
【００１０】また本発明は、（９） L-トリプトファン
を含む培地で培養した微生物を用いることを特徴とす
る、’（２）〜（８）に記載の方法、に関する。
を含む培地で培養した微生物を用いることを特徴とす
る、’（２）〜（８）に記載の方法、に関する。
【００１１】また、本発明は、（１０） 界面活性剤、
インドールの溶解しやすい非水溶性溶媒、またはインド
ール結合性を有し水に不溶性の樹脂を反応液に添加する
ことを含む、（１）〜（９）に記載の方法、好ましく
は、（１１） 界面活性剤がソルポールW-200またはノ
ニオンNS230であり、インドール結合性の樹脂がアンバ
ーライトXAD-7であり、有機溶媒がトルエンまたはへキ
サンである、（１０）に記載の方法、に関する。
インドールの溶解しやすい非水溶性溶媒、またはインド
ール結合性を有し水に不溶性の樹脂を反応液に添加する
ことを含む、（１）〜（９）に記載の方法、好ましく
は、（１１） 界面活性剤がソルポールW-200またはノ
ニオンNS230であり、インドール結合性の樹脂がアンバ
ーライトXAD-7であり、有機溶媒がトルエンまたはへキ
サンである、（１０）に記載の方法、に関する。
【００１２】また、本発明は、（１２） ピルビン酸分
解能を有する微生物を反応液に添加することを含む、
（１）〜（９）に記載の方法、好ましくは、（１３）
ピルビン酸分解能を有する微生物がコリネバクテリウム
属に属する微生物である、（１２）に記載の方法、に関
する。
解能を有する微生物を反応液に添加することを含む、
（１）〜（９）に記載の方法、好ましくは、（１３）
ピルビン酸分解能を有する微生物がコリネバクテリウム
属に属する微生物である、（１２）に記載の方法、に関
する。
【００１３】なお、本発明においてトリプトファナーゼ
とは、L-トリプトファンに作用してインドール、アンモ
ニア、及びピルビン酸の生成を触媒する酵素を指す。
とは、L-トリプトファンに作用してインドール、アンモ
ニア、及びピルビン酸の生成を触媒する酵素を指す。
【００１４】
【発明の実施の形態】本発明においてDL-トリプトファ
ン混合物に作用させるトリプトファナーゼには、精製酵
素の他、部分精製酵素なども含まれる。
ン混合物に作用させるトリプトファナーゼには、精製酵
素の他、部分精製酵素なども含まれる。
【００１５】本発明において使用するトリプトファナー
ゼを産生する微生物には、トリプトファナーゼを産生す
る動物細胞、植物細胞なども含まれる。また、本発明に
おいて処理物とは、界面活性剤処理、有機溶媒処理、機
械的処理、酵素処理などによりこれら微生物に膜透過性
を付与したもの、上記処理によりこれら微生物を破砕し
たものなどが含まれる。
ゼを産生する微生物には、トリプトファナーゼを産生す
る動物細胞、植物細胞なども含まれる。また、本発明に
おいて処理物とは、界面活性剤処理、有機溶媒処理、機
械的処理、酵素処理などによりこれら微生物に膜透過性
を付与したもの、上記処理によりこれら微生物を破砕し
たものなどが含まれる。
【００１６】本発明におけるトリプトファナーゼを産生
する微生物としては、アクロモバクター属 (Achromobac
ter) 、アエロモナス属 (Aeromonas) 、アグロバクテリ
ウム属 (Agrobacterium) 、アルカリゲネス属 (Alcalig
enes) 、バクテロイデス属 (Bacteroides) 、セルロモ
ナス属 (Cellulomonas)、クロストリジウム属 (Clostri
dium) 、シトロバクター属 (Citrobacter) 、コリネバ
クテリウム属(Corynebacterium)、エンテロバクター属
(Enterobacter) 、エルビニア属(Erwinia）、エシェリ
ヒア属 (Escherichia) 、フソバクテリウム属 (Fusobac
terium、J. Gen.Microbiol. 86, 147-155 (1975)) 、ハ
ンゼヌラ属 (Hansenula) 、クレブジエラ属 (Klebsiell
a) 、クルイベラ属 (Kluyvera) 、ミクロコッカス属 (M
icrococcus) 、モルガネラ属 (Morganella) 、ノカルデ
ィア (Nocardia) 、パエニバチルス属 (Paenibacillus)
、パントエア属 (Pantoea) 、パステウレラ属 (Pasteu
rella) 、ペプトストレプトコッカス属 (Peptostreptoc
occus) 、ピキア属 (Pichia 、特公昭51-6235) 、プロ
ピオニバクテリウム属 (Propionibacterium) 、プロテ
ウス属 (Proteus) 、プロビデンシア属 (Providencia)
、シュードモナス属(Pseudomonas) 、サルモネラ属 (S
almonella)、セラチア属 (Serratia)、スフェロフォラ
ス属 (Sphaerophorus) 、シンビオバクテリウム属 (Sym
biobacterium)、ビブリオ属 (Vibrio) 、キサントモナ
ス属 (Xanthomonas )などが挙げられる。
する微生物としては、アクロモバクター属 (Achromobac
ter) 、アエロモナス属 (Aeromonas) 、アグロバクテリ
ウム属 (Agrobacterium) 、アルカリゲネス属 (Alcalig
enes) 、バクテロイデス属 (Bacteroides) 、セルロモ
ナス属 (Cellulomonas)、クロストリジウム属 (Clostri
dium) 、シトロバクター属 (Citrobacter) 、コリネバ
クテリウム属(Corynebacterium)、エンテロバクター属
(Enterobacter) 、エルビニア属(Erwinia）、エシェリ
ヒア属 (Escherichia) 、フソバクテリウム属 (Fusobac
terium、J. Gen.Microbiol. 86, 147-155 (1975)) 、ハ
ンゼヌラ属 (Hansenula) 、クレブジエラ属 (Klebsiell
a) 、クルイベラ属 (Kluyvera) 、ミクロコッカス属 (M
icrococcus) 、モルガネラ属 (Morganella) 、ノカルデ
ィア (Nocardia) 、パエニバチルス属 (Paenibacillus)
、パントエア属 (Pantoea) 、パステウレラ属 (Pasteu
rella) 、ペプトストレプトコッカス属 (Peptostreptoc
occus) 、ピキア属 (Pichia 、特公昭51-6235) 、プロ
ピオニバクテリウム属 (Propionibacterium) 、プロテ
ウス属 (Proteus) 、プロビデンシア属 (Providencia)
、シュードモナス属(Pseudomonas) 、サルモネラ属 (S
almonella)、セラチア属 (Serratia)、スフェロフォラ
ス属 (Sphaerophorus) 、シンビオバクテリウム属 (Sym
biobacterium)、ビブリオ属 (Vibrio) 、キサントモナ
ス属 (Xanthomonas )などが挙げられる。
【００１７】これらの微生物の内、特に好ましい菌とし
ては、アクロモバクター・リキダム(Achromobacter liq
uidum、Appl. Environ Microbiol. 46, 1-5 (1983)) OU
T 8012（大阪大学保存）、アエロモナス・ハイドロフィ
ラ (Aeromonas hydrophila)ATCC 14715(文献発表時の分
類では、Aeromonas liquefaciens、J. Biol. Chem.240,
1211-1218 (1965))、アエロモナス・ハイドロフィラ・
サブスピーシーズ・ハイドロフィラ (Aeromonas hydrop
hila subsp. hydrophila) IFO 3820，IFO12658（特開昭
60-34192）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス
(Agrobacterium tumefasciens、特公昭51-6235) IFO 30
58、アルカリゲネス・フェーカリス(Alcaligenes faeca
lis、J. Biotechnol. 5, 17-28 (1987) ) OUT 8025（大
阪大学保存）、バクテロイデス・フラジリス (Bacteroi
des fragilis、J. Natl. Cancer Inst. 54, 1073-1078
(1975)) 、セルロモナス・エスピー (Cellulomonassp.)
ATCC 490(文献発表時の分類ではPseudomonas perlurid
a、特公昭51-6235)、シトロバクター・フロインディー
(Citrobacter freundii) IFO 12681，ATCC8090 (特公昭
51-6235)、クロストリジウム・ファルシネウム (Clostr
idium felsineum) ATCC 13160 (特公昭51-6235) 、コリ
ネバクテリウム・アンモニアゲネス(Corynebacterium a
mmoniagenes) IFO12612、エンテロバクター・アエロゲ
ネス(Enterobacter aerogenes) IFO 12010, SM-12（Agr
i. Biol. Chem. 48, 2663-2668 (1984) )、エンテロバ
クター・クロアカエ (Enterobacter cloacae) ATCC 725
6 (文献発表時の分類ではAerobacter aerogenes、特公
昭51-6235)、フソバクテリウム・バリウム (Fusobacter
ium varium) ATCC 8501(文献発表時の分類では、Sphaer
ophorus varius、J.Bacteriol.98,167-171(1969))エル
ビニア・カロトボーラ (Erwinia carotovora、アミノ酸
核酸 27, 19-24 (1973)）、エシェリヒア・コリ (Esche
richia coli) IFO 12713 (W3110) , ATCC 10798, ATCC
3655 (特公昭51-6235)、クレブジエラ・オキシトカ (Kl
ebsiella oxytoca) ATCC 8724(文献発表時の分類ではEn
terobacter aerogenes、アミノ酸核酸27, 19-24 (197
3)) 、クレブジエラ・プランチコラ (Klebsiella plant
icola) ATCC 8329 (文献発表時の分類ではEnterobacter
aerogenes、アミノ酸核酸27, 19-24 (1973) )、クレブ
ジエラ・プノイモニエ (Klebsiella pneumoniae) IFO 3
318、クルイベラ・アスコルバータJCM 1681, ATCC 1423
6 (Kluyvera ascorbata、文献発表時の分類ではKluyver
a citrophila、特公昭51-6235)、モルガネラ・モルガニ
イ・サブスピーシーズ・モルガニイ (Morganella morga
nii subsp. morganii) IFO 3848 (文献発表時の分類で
はProteus morganii、アミノ酸核酸27, 19-24 (197
3))、ノカルディア・アステロイデス (Nocardia astero
ides) IFO 3384 (特公昭51-6235) 、パエニバチルス・
アルベイ (Paenibacillus alvei) IFO 3343、パントエ
ア・アグロメランス (Pantoea agglomerans) ATCC 2143
3, ATCC 21434 (文献発表時の分類ではErwinia herbico
la、特公昭51-6235) 、パントエア・アナナス(Pantoea
ananas) ATCC 23822 (文献発表時の分類ではErwinia he
rbicola、アミノ酸核酸27, 19-24 (1973)) 、パステウ
レラ・マルトシダ (Pasteurella multocida、Bull. Uni
v. Osaka Prefect., Ser. B, 19, 31-41 (1967) ) 、ペ
プトストレプトコッカス・アサッカロリティカス (Pept
ostreptococcus asaccharolyticus) JCM 8143、ピキア
・アノマーラ (Pichia anomala) IFO 0118 (特公昭51-6
235) 、プロピオニバクテリウム・アクネス (Propionib
acterium acnes) ATCC 6919 (文献発表時の分類ではCor
ynebacterium acnes、J. Bacteriol. 98, 167-171(196
9)) 、プロテウス・インコンスタンス（Proteus incons
tans) IFO 12931(特開平03−47080）、プロテウス・ミ
ラビリス (Proteus mirabilis) IFO 13300,ATCC 15290
(特公昭51-6235) 、プロテウス・バルガリス (Proteus
vulgaris)IFO 3167 、プロビデンシア・レットジェリ
(Providencia rettgeri) ATCC 9919(特開昭63-52884) ,
ATCC 29944(特開平02-255082)、シュードモナス・プチ
ダ(Pseudomonas putida) IFO 14796、セラチア・グリメ
ジー (Serratia grimesii)ATCC 14460 (文献発表時の分
類ではAerobacter licheniformis 、特公昭51-6235) 、
サルモネラ・コレラエスイス・サブスピーシーズ・コレ
ラエスイス (Salmonella choleraesuis subsp. cholera
esuis、文献発表時の分類ではSalmonella gallinarum、
特公昭51-6235)、スフェロフォラス・フンデュリフォル
ミス(Sphaerophorus funduliformis、Biochim. Biophy
s. Acta 386, 340-351 (1975) ) 、シンビオバクテリウ
ム・サーモフィラム (Symbiobacterium thermophilum)
IAM 13621 (Appl. Environ. Microbiol. 58, 2633-2642
(1992) )、ビブリオ・ハーベイ (Vibrio harveyi、文
献発表時の分類ではPhotobacterium harveyi、J. Bacte
riol. 98, 167-171 (1969)) 、ビブリオ・コレラ (Vibr
io cholerae、Acta Microbiol. Pol., Ser. A, 5, 75-7
9 (1973)) 、キサントモナス・キャンペストリス(Xanth
omonas campestris、特公昭51-6235)などが挙げられ
る。
ては、アクロモバクター・リキダム(Achromobacter liq
uidum、Appl. Environ Microbiol. 46, 1-5 (1983)) OU
T 8012（大阪大学保存）、アエロモナス・ハイドロフィ
ラ (Aeromonas hydrophila)ATCC 14715(文献発表時の分
類では、Aeromonas liquefaciens、J. Biol. Chem.240,
1211-1218 (1965))、アエロモナス・ハイドロフィラ・
サブスピーシーズ・ハイドロフィラ (Aeromonas hydrop
hila subsp. hydrophila) IFO 3820，IFO12658（特開昭
60-34192）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス
(Agrobacterium tumefasciens、特公昭51-6235) IFO 30
58、アルカリゲネス・フェーカリス(Alcaligenes faeca
lis、J. Biotechnol. 5, 17-28 (1987) ) OUT 8025（大
阪大学保存）、バクテロイデス・フラジリス (Bacteroi
des fragilis、J. Natl. Cancer Inst. 54, 1073-1078
(1975)) 、セルロモナス・エスピー (Cellulomonassp.)
ATCC 490(文献発表時の分類ではPseudomonas perlurid
a、特公昭51-6235)、シトロバクター・フロインディー
(Citrobacter freundii) IFO 12681，ATCC8090 (特公昭
51-6235)、クロストリジウム・ファルシネウム (Clostr
idium felsineum) ATCC 13160 (特公昭51-6235) 、コリ
ネバクテリウム・アンモニアゲネス(Corynebacterium a
mmoniagenes) IFO12612、エンテロバクター・アエロゲ
ネス(Enterobacter aerogenes) IFO 12010, SM-12（Agr
i. Biol. Chem. 48, 2663-2668 (1984) )、エンテロバ
クター・クロアカエ (Enterobacter cloacae) ATCC 725
6 (文献発表時の分類ではAerobacter aerogenes、特公
昭51-6235)、フソバクテリウム・バリウム (Fusobacter
ium varium) ATCC 8501(文献発表時の分類では、Sphaer
ophorus varius、J.Bacteriol.98,167-171(1969))エル
ビニア・カロトボーラ (Erwinia carotovora、アミノ酸
核酸 27, 19-24 (1973)）、エシェリヒア・コリ (Esche
richia coli) IFO 12713 (W3110) , ATCC 10798, ATCC
3655 (特公昭51-6235)、クレブジエラ・オキシトカ (Kl
ebsiella oxytoca) ATCC 8724(文献発表時の分類ではEn
terobacter aerogenes、アミノ酸核酸27, 19-24 (197
3)) 、クレブジエラ・プランチコラ (Klebsiella plant
icola) ATCC 8329 (文献発表時の分類ではEnterobacter
aerogenes、アミノ酸核酸27, 19-24 (1973) )、クレブ
ジエラ・プノイモニエ (Klebsiella pneumoniae) IFO 3
318、クルイベラ・アスコルバータJCM 1681, ATCC 1423
6 (Kluyvera ascorbata、文献発表時の分類ではKluyver
a citrophila、特公昭51-6235)、モルガネラ・モルガニ
イ・サブスピーシーズ・モルガニイ (Morganella morga
nii subsp. morganii) IFO 3848 (文献発表時の分類で
はProteus morganii、アミノ酸核酸27, 19-24 (197
3))、ノカルディア・アステロイデス (Nocardia astero
ides) IFO 3384 (特公昭51-6235) 、パエニバチルス・
アルベイ (Paenibacillus alvei) IFO 3343、パントエ
ア・アグロメランス (Pantoea agglomerans) ATCC 2143
3, ATCC 21434 (文献発表時の分類ではErwinia herbico
la、特公昭51-6235) 、パントエア・アナナス(Pantoea
ananas) ATCC 23822 (文献発表時の分類ではErwinia he
rbicola、アミノ酸核酸27, 19-24 (1973)) 、パステウ
レラ・マルトシダ (Pasteurella multocida、Bull. Uni
v. Osaka Prefect., Ser. B, 19, 31-41 (1967) ) 、ペ
プトストレプトコッカス・アサッカロリティカス (Pept
ostreptococcus asaccharolyticus) JCM 8143、ピキア
・アノマーラ (Pichia anomala) IFO 0118 (特公昭51-6
235) 、プロピオニバクテリウム・アクネス (Propionib
acterium acnes) ATCC 6919 (文献発表時の分類ではCor
ynebacterium acnes、J. Bacteriol. 98, 167-171(196
9)) 、プロテウス・インコンスタンス（Proteus incons
tans) IFO 12931(特開平03−47080）、プロテウス・ミ
ラビリス (Proteus mirabilis) IFO 13300,ATCC 15290
(特公昭51-6235) 、プロテウス・バルガリス (Proteus
vulgaris)IFO 3167 、プロビデンシア・レットジェリ
(Providencia rettgeri) ATCC 9919(特開昭63-52884) ,
ATCC 29944(特開平02-255082)、シュードモナス・プチ
ダ(Pseudomonas putida) IFO 14796、セラチア・グリメ
ジー (Serratia grimesii)ATCC 14460 (文献発表時の分
類ではAerobacter licheniformis 、特公昭51-6235) 、
サルモネラ・コレラエスイス・サブスピーシーズ・コレ
ラエスイス (Salmonella choleraesuis subsp. cholera
esuis、文献発表時の分類ではSalmonella gallinarum、
特公昭51-6235)、スフェロフォラス・フンデュリフォル
ミス(Sphaerophorus funduliformis、Biochim. Biophy
s. Acta 386, 340-351 (1975) ) 、シンビオバクテリウ
ム・サーモフィラム (Symbiobacterium thermophilum)
IAM 13621 (Appl. Environ. Microbiol. 58, 2633-2642
(1992) )、ビブリオ・ハーベイ (Vibrio harveyi、文
献発表時の分類ではPhotobacterium harveyi、J. Bacte
riol. 98, 167-171 (1969)) 、ビブリオ・コレラ (Vibr
io cholerae、Acta Microbiol. Pol., Ser. A, 5, 75-7
9 (1973)) 、キサントモナス・キャンペストリス(Xanth
omonas campestris、特公昭51-6235)などが挙げられ
る。
【００１８】また、本発明においては部分精製酵素、ま
たは精製酵素を用いることも可能である。酵素の精製
は、トリプトファナーゼ産生能が知られている上記微生
物などから常法、例えば、硫酸アンモニウムなどを用い
た塩析、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマト
グラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ゲル濾
過などを適当に組み合わせる方法を用いて行うことが可
能である。例えば、アエロモナス・ハイドロフィラ (Ae
romonas hydrophila) ATCC 14715 (文献発表時の分類で
はAeromonas liquefaciens、 J. Biol. Chem. 240, 121
1-1218 (1965))、エンテロバクター・アエロゲネス (En
terobacter aerogenes) ではトリプトファナーゼ遺伝子
がクローニングされており、該遺伝子を導入して発現さ
せた大腸菌からトリプトファナーゼを容易に精製するこ
とができる（Biosci. Biotech. Biochem. 59, 1938-194
3 (1995) )。また、エシェリヒア・コリ (Escherichia
coli、J. Biol. Chem. 247, 1566- (1972) )、モルガネ
ラ・モルガニイ・サブスピーシーズ・モルガニイ(Morga
nella morganii subsp. morganii) ATCC 23548（文献発
表時の分類ではProteus morganii、Can. J. Microbiol.
21, 828-833 (1975)）、パエニバチルス・アルベイ (P
aenibacillus alvei、文献発表時の分類ではBacillus a
lvei、J. Biol. Chem. 247, 1750- (1972)) 、スフェロ
フォラス・フンデュリフォルミス(Sphaerophorus fundu
liformis、Biochim. Biophys. Acta 386, 340-351 (197
5) )、シンビオバクテリウム・サーモフィラム (Symbio
bacterium thermophilum、Agri. Biol. Chem. 55, 3059
-3066 (1991)) 、ビブリオ・エスピー (Vibrio sp.、Ar
ch. Microbiol. 122, 169-175 (1979))などから、それ
ぞれの文献に記載の方法により精製することができる。
たは精製酵素を用いることも可能である。酵素の精製
は、トリプトファナーゼ産生能が知られている上記微生
物などから常法、例えば、硫酸アンモニウムなどを用い
た塩析、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマト
グラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ゲル濾
過などを適当に組み合わせる方法を用いて行うことが可
能である。例えば、アエロモナス・ハイドロフィラ (Ae
romonas hydrophila) ATCC 14715 (文献発表時の分類で
はAeromonas liquefaciens、 J. Biol. Chem. 240, 121
1-1218 (1965))、エンテロバクター・アエロゲネス (En
terobacter aerogenes) ではトリプトファナーゼ遺伝子
がクローニングされており、該遺伝子を導入して発現さ
せた大腸菌からトリプトファナーゼを容易に精製するこ
とができる（Biosci. Biotech. Biochem. 59, 1938-194
3 (1995) )。また、エシェリヒア・コリ (Escherichia
coli、J. Biol. Chem. 247, 1566- (1972) )、モルガネ
ラ・モルガニイ・サブスピーシーズ・モルガニイ(Morga
nella morganii subsp. morganii) ATCC 23548（文献発
表時の分類ではProteus morganii、Can. J. Microbiol.
21, 828-833 (1975)）、パエニバチルス・アルベイ (P
aenibacillus alvei、文献発表時の分類ではBacillus a
lvei、J. Biol. Chem. 247, 1750- (1972)) 、スフェロ
フォラス・フンデュリフォルミス(Sphaerophorus fundu
liformis、Biochim. Biophys. Acta 386, 340-351 (197
5) )、シンビオバクテリウム・サーモフィラム (Symbio
bacterium thermophilum、Agri. Biol. Chem. 55, 3059
-3066 (1991)) 、ビブリオ・エスピー (Vibrio sp.、Ar
ch. Microbiol. 122, 169-175 (1979))などから、それ
ぞれの文献に記載の方法により精製することができる。
【００１９】さらに、トリプトファナーゼ遺伝子を導入
した異種微生物より得られたトリプトファナーゼ、また
は該異種微生物もしくはその処理物を利用することも可
能である。例えば、アルカリゲネス・フェーカリス (Al
caligenes faecalis、J. Biotechnol. 5, 17-28 (1987)
) 、エンテロバクター・アエロゲネス (Enterobacter
aerogenes、J. Gen. Microbiol. 139, 3275-3281 (199
3) )、エシェリヒア・コリ (Escherichia coli、J. Bac
teriol. 147, 787-796 (1981) ) 、プロテウス・インコ
ンスタンス（Proteus inconstans、特開平03−4708
0）、プロテウス・バルガリス (Proteus vulgaris、J.
Biol. Chem. 267, 19978-19985 (1992) )、プロビデン
シア・レットジェリ (Providencia rettgeri、特開平02
-255082)、シンビオバクテリウム・サーモフィラム (Sy
mbiobacterium thermophilum、Appl. Environ. Microbi
ol. 58, 2633-2642 (1992)) では、トリプトファナーゼ
遺伝子がクローニングされ、その塩基配列が明らかにさ
れており、これら遺伝子を異種微生物の宿主、例えば、
アスペルギルス (Aspergillus) 属、バチルス (Bacillu
s) 属、ブレビバクテリウム (Brevibacterium) 属、キ
ャンディダ (Candida) 属、セファロスポリウム(Cephal
osporium)属、コリネバクテリウム (Corynebacterium)
属、大腸菌 (Escherichia coli) 、ハンゼヌラ (Hansen
ula) 属、クライベロマイセス (Kluyveromyces) 属、ラ
クトバチルス(Lactobacillus)属、ノイロスポラ (Neuro
spora) 属、ピキア (Pichia) 属、プロビデンシア(Prov
idencia)、シュードモナス(Pseudomonas)属、ロドスポ
リジウム(Rhodosporidium)属、サッカロミセス (Saccha
romyces) 属、シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomy
ces)属、セラチア (Serratia) 属、ストレプトコッカス
(Streptococcus)属、トリコスポロン(Trichosporon)
属、トリコデルマ (Trichoderma)、ヤロウイア(Yarrowi
a)属、チゴサッカロマイセス属(Zygosaccharomyces) 属
などに導入してトリプトファナーゼを発現させることが
可能である。トリプトファナーゼ遺伝子は、その発現効
率を高めるために、適当なプロモーター、発現制御因
子、ターミネーターなどと組み合わせてベクターに組み
込み、宿主に導入して発現させることも可能である。ト
リプトファナーゼ遺伝子を含む好適な発現ベクターとし
ては、例えば、実施例において用いた「pKT901EA」、
「pKT951EC」などが挙げられる。
した異種微生物より得られたトリプトファナーゼ、また
は該異種微生物もしくはその処理物を利用することも可
能である。例えば、アルカリゲネス・フェーカリス (Al
caligenes faecalis、J. Biotechnol. 5, 17-28 (1987)
) 、エンテロバクター・アエロゲネス (Enterobacter
aerogenes、J. Gen. Microbiol. 139, 3275-3281 (199
3) )、エシェリヒア・コリ (Escherichia coli、J. Bac
teriol. 147, 787-796 (1981) ) 、プロテウス・インコ
ンスタンス（Proteus inconstans、特開平03−4708
0）、プロテウス・バルガリス (Proteus vulgaris、J.
Biol. Chem. 267, 19978-19985 (1992) )、プロビデン
シア・レットジェリ (Providencia rettgeri、特開平02
-255082)、シンビオバクテリウム・サーモフィラム (Sy
mbiobacterium thermophilum、Appl. Environ. Microbi
ol. 58, 2633-2642 (1992)) では、トリプトファナーゼ
遺伝子がクローニングされ、その塩基配列が明らかにさ
れており、これら遺伝子を異種微生物の宿主、例えば、
アスペルギルス (Aspergillus) 属、バチルス (Bacillu
s) 属、ブレビバクテリウム (Brevibacterium) 属、キ
ャンディダ (Candida) 属、セファロスポリウム(Cephal
osporium)属、コリネバクテリウム (Corynebacterium)
属、大腸菌 (Escherichia coli) 、ハンゼヌラ (Hansen
ula) 属、クライベロマイセス (Kluyveromyces) 属、ラ
クトバチルス(Lactobacillus)属、ノイロスポラ (Neuro
spora) 属、ピキア (Pichia) 属、プロビデンシア(Prov
idencia)、シュードモナス(Pseudomonas)属、ロドスポ
リジウム(Rhodosporidium)属、サッカロミセス (Saccha
romyces) 属、シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomy
ces)属、セラチア (Serratia) 属、ストレプトコッカス
(Streptococcus)属、トリコスポロン(Trichosporon)
属、トリコデルマ (Trichoderma)、ヤロウイア(Yarrowi
a)属、チゴサッカロマイセス属(Zygosaccharomyces) 属
などに導入してトリプトファナーゼを発現させることが
可能である。トリプトファナーゼ遺伝子は、その発現効
率を高めるために、適当なプロモーター、発現制御因
子、ターミネーターなどと組み合わせてベクターに組み
込み、宿主に導入して発現させることも可能である。ト
リプトファナーゼ遺伝子を含む好適な発現ベクターとし
ては、例えば、実施例において用いた「pKT901EA」、
「pKT951EC」などが挙げられる。
【００２０】トリプトファナーゼを産生する微生物の培
養方法としては、トリプトファナーゼ活性を増大させる
ための添加物などを含む通常の培養基を用いることがで
きる。例えば、一般にトリプトファナーゼは誘導酵素で
あり、培地にL-トリプトファンを添加することによりト
リプトファナーゼ生産性は向上することが知られてい
る。また、誘導物質として添加したL-トリプトファンが
トリプトファナーゼにより代謝され生成するインドール
は一般に微生物の成育を阻害するため、培養液にソルポ
ールW-200 (東邦化学工業製) などの界面活性剤を添加
することによりインドールによる微生物の成育の阻害を
解除することができる (特公昭51-6235)。また、トリプ
トファナーゼをコードする遺伝子を異種微生物において
発現させる場合には、利用するプロモーターに応じた培
養及び誘導方法を用いることが望ましい。例えば、大腸
菌においてtrc, lac, tacなどのプロモーターを用いて
発現する場合には、誘導物質としてラクトース、IPTG
（イソプロピルチオガラクトピラノシド）などを培養の
当初から、もしくは、培養中の適当な時期に添加するこ
とでトリプトファナーゼ活性を増大することができる。
養方法としては、トリプトファナーゼ活性を増大させる
ための添加物などを含む通常の培養基を用いることがで
きる。例えば、一般にトリプトファナーゼは誘導酵素で
あり、培地にL-トリプトファンを添加することによりト
リプトファナーゼ生産性は向上することが知られてい
る。また、誘導物質として添加したL-トリプトファンが
トリプトファナーゼにより代謝され生成するインドール
は一般に微生物の成育を阻害するため、培養液にソルポ
ールW-200 (東邦化学工業製) などの界面活性剤を添加
することによりインドールによる微生物の成育の阻害を
解除することができる (特公昭51-6235)。また、トリプ
トファナーゼをコードする遺伝子を異種微生物において
発現させる場合には、利用するプロモーターに応じた培
養及び誘導方法を用いることが望ましい。例えば、大腸
菌においてtrc, lac, tacなどのプロモーターを用いて
発現する場合には、誘導物質としてラクトース、IPTG
（イソプロピルチオガラクトピラノシド）などを培養の
当初から、もしくは、培養中の適当な時期に添加するこ
とでトリプトファナーゼ活性を増大することができる。
【００２１】トリプトファナーゼ、またはトリプトファ
ナーゼを産生する微生物もしくはその処理物をD,L-トリ
プトファン混合物に作用させる方法としては、トリプト
ファナーゼの活性、安定性にとって好ましい条件であれ
ばよい。トリプトファナーゼは一般に、アンモニウムイ
オン、カリウムイオンなどにより活性化されるため、こ
れらイオンを反応液に添加することは活性の増大に効果
的である。また、トリプトファナーゼは、ピリドキサー
ル-5’-リン酸を補酵素とする酵素であることから、ピ
リドキサール-5’-リン酸を添加することは活性増大、
安定性増大に効果的である。反応液のpHは、トリプトフ
ァナーゼが活性を発現できるpHに維持することが好まし
く、特に、pH7.0〜9.5に維持することが好ましい。
ナーゼを産生する微生物もしくはその処理物をD,L-トリ
プトファン混合物に作用させる方法としては、トリプト
ファナーゼの活性、安定性にとって好ましい条件であれ
ばよい。トリプトファナーゼは一般に、アンモニウムイ
オン、カリウムイオンなどにより活性化されるため、こ
れらイオンを反応液に添加することは活性の増大に効果
的である。また、トリプトファナーゼは、ピリドキサー
ル-5’-リン酸を補酵素とする酵素であることから、ピ
リドキサール-5’-リン酸を添加することは活性増大、
安定性増大に効果的である。反応液のpHは、トリプトフ
ァナーゼが活性を発現できるpHに維持することが好まし
く、特に、pH7.0〜9.5に維持することが好ましい。
【００２２】トリプトファナーゼを産生する微生物を用
いて反応させる場合には、界面活性剤による処理、熱処
理、pH処理、有機溶媒による処理などにより膜の透過性
を向上させた菌体を用いることができる。
いて反応させる場合には、界面活性剤による処理、熱処
理、pH処理、有機溶媒による処理などにより膜の透過性
を向上させた菌体を用いることができる。
【００２３】また、トリプトファナーゼによるL-トリプ
トファンの代謝に由来して生成するインドールは、トリ
プトファナーゼの阻害物質であり、D-トリプトファン合
成反応を抑制する。このインドールによるトリプトファ
ナーゼの阻害は、例えば、反応液中のインドール濃度を
低濃度に維持することにより抑制することができ、これ
によりD-トリプトファン合成反応を促進することができ
る。反応液中のインドール濃度を低くする方法として
は、例えば、反応液にソルポールW-200（東邦化学
製）、ノニオンNS230 (日本油脂製) などの非イオン
性、カチオン性、アニオン性、両イオン性界面活性剤を
添加する、インドールの溶解性が高く、水と混和しにく
いトルエン、ヘキサンなどの有機溶媒を添加する、イン
ドール結合性を有する水不溶性高分子、例えば、ポリエ
チレン、ポリプロピレン、ポリウレタン、アンバーライ
トXAD-7（オルガノ製)などを添加する、などが挙げられ
る。
トファンの代謝に由来して生成するインドールは、トリ
プトファナーゼの阻害物質であり、D-トリプトファン合
成反応を抑制する。このインドールによるトリプトファ
ナーゼの阻害は、例えば、反応液中のインドール濃度を
低濃度に維持することにより抑制することができ、これ
によりD-トリプトファン合成反応を促進することができ
る。反応液中のインドール濃度を低くする方法として
は、例えば、反応液にソルポールW-200（東邦化学
製）、ノニオンNS230 (日本油脂製) などの非イオン
性、カチオン性、アニオン性、両イオン性界面活性剤を
添加する、インドールの溶解性が高く、水と混和しにく
いトルエン、ヘキサンなどの有機溶媒を添加する、イン
ドール結合性を有する水不溶性高分子、例えば、ポリエ
チレン、ポリプロピレン、ポリウレタン、アンバーライ
トXAD-7（オルガノ製)などを添加する、などが挙げられ
る。
【００２４】また、トリプトファナーゼによるL-トリプ
トファンの代謝に由来して生成するピルビン酸も、トリ
プトファナーゼの阻害物質であり、D-トリプトファン合
成反応を抑制する。このピルビン酸によるトリプトファ
ナーゼの阻害は、例えば、反応液中のピルビン酸濃度を
低濃度に維持することにより抑制することができ、これ
によりD-トリプトファン合成反応を促進することができ
る。
トファンの代謝に由来して生成するピルビン酸も、トリ
プトファナーゼの阻害物質であり、D-トリプトファン合
成反応を抑制する。このピルビン酸によるトリプトファ
ナーゼの阻害は、例えば、反応液中のピルビン酸濃度を
低濃度に維持することにより抑制することができ、これ
によりD-トリプトファン合成反応を促進することができ
る。
【００２５】反応液中のピルビン酸濃度を低濃度に保つ
方法としては、例えば、ピルビン酸の化学的な分解、微
生物的な分解などが挙げられる。特に、ピルビン酸分解
活性を有し、D-トリプトファン分解活性を有しない微生
物を反応系に添加することにより効率的なピルビン酸の
分解を行なうことができる。
方法としては、例えば、ピルビン酸の化学的な分解、微
生物的な分解などが挙げられる。特に、ピルビン酸分解
活性を有し、D-トリプトファン分解活性を有しない微生
物を反応系に添加することにより効率的なピルビン酸の
分解を行なうことができる。
【００２６】ピルビン酸分解活性を有する微生物として
は、例えば、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウ
ム属、サッカロマイセス属に属する微生物などが好まし
い。
は、例えば、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウ
ム属、サッカロマイセス属に属する微生物などが好まし
い。
【００２７】本発明においては、さらに、微生物菌体内
に存在するD-トリプトファンの分解に関与する酵素、例
えば、D-アミノ酸脱水素酵素 (D-amino acid dehydrog
enase) 、D-アミノ酸酸化酵素 (D-amino acid oxidase)
、D-アミノ酸トランスアミナーゼ (D-amino acid tran
saminase) 、トリプトファン-2,3-ジオキシゲナーゼ(tr
yptophan 2,3-dioxygenase) 、D-アミノ酸アセチルトラ
ンスフェラーゼ (D-amino acid acetyltransferase) 、
アミノ酸ラセマーゼ (amino acid racemase)などを人工
変異、遺伝子組換え技術などを利用して欠損させた菌株
を用いることも可能である。
に存在するD-トリプトファンの分解に関与する酵素、例
えば、D-アミノ酸脱水素酵素 (D-amino acid dehydrog
enase) 、D-アミノ酸酸化酵素 (D-amino acid oxidase)
、D-アミノ酸トランスアミナーゼ (D-amino acid tran
saminase) 、トリプトファン-2,3-ジオキシゲナーゼ(tr
yptophan 2,3-dioxygenase) 、D-アミノ酸アセチルトラ
ンスフェラーゼ (D-amino acid acetyltransferase) 、
アミノ酸ラセマーゼ (amino acid racemase)などを人工
変異、遺伝子組換え技術などを利用して欠損させた菌株
を用いることも可能である。
【００２８】なお、本発明においてトリプトファナー
ゼ、またはトリプトファナーゼを産生する微生物もしく
はその処理物を作用させるD,L-トリプトファン混合物中
のD-トリプトファンとL-トリプトファンの存在比には特
に制限はないが、L-トリプトファンの存在比が50％以下
であることが好ましい。
ゼ、またはトリプトファナーゼを産生する微生物もしく
はその処理物を作用させるD,L-トリプトファン混合物中
のD-トリプトファンとL-トリプトファンの存在比には特
に制限はないが、L-トリプトファンの存在比が50％以下
であることが好ましい。
【００２９】また、生成したL-トリプトファンまたはD-
トリプトファンは、公知の方法、例えば、遠心分離や限
外濾過膜などを用いて菌体を分離し、濃縮晶析法、冷却
晶析法、または中和晶析法などを用いて晶析することに
より分離することが可能である（例えば、特開昭59-458
97号公報、特開昭62-265254号公報、特開平3-147794号
公報など）。
トリプトファンは、公知の方法、例えば、遠心分離や限
外濾過膜などを用いて菌体を分離し、濃縮晶析法、冷却
晶析法、または中和晶析法などを用いて晶析することに
より分離することが可能である（例えば、特開昭59-458
97号公報、特開昭62-265254号公報、特開平3-147794号
公報など）。
【００３０】
【実施例】以下、実施例により本発明を更に詳しく説明
するが、本発明はこれに限定されるものではない。
するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３１】［実施例１］トリプトファナーゼ生産能を
有する微生物の培養 アエロモナス・ハイドロフィラ・サブスピーシーズ・ハ
イドロフィラ IFO 3820、アグロバクテリウム・ツメフ
ァシエンスIFO3058、アルカリゲネス・フェーカリスIFO
1311、セルロモナス・スピーシーズATCC490、シトロバ
クター・フロインディー IFO 12681、コリネバクテリウ
ム・アンモニアゲネスIFO12612、エンテロバクター・ア
エロゲネス IFO 12010、エルビニア・カロトボーラ・サ
ブスピーシーズ・カロトボーラIFO12380、エシェリヒア
・コリ IFO 12713、クレブジエラ・プノイモニエ IFO 3
318、クルイベラ・アスコルバータ JCM 1681、モルガネ
ラ・モルガニーIFO3168、パエニバチルス・アルベイ IF
O 3343、パントエア・アグロメランスFERM P 11349、
ペプトストレプトコッカス・アサッカロリティカス JCM
8143、ピキア・アノマーラIFO0118、プロテウス・ミラ
ビリス IFO 13300、プロテウス・バルガリス IFO 316
7、プロビデンシア・レットジェリATCC29944、シュード
モナス・プチダ IFO 14796、セラチア・グリメジーATCC
14460、キサントモナス・キャンペストリス・ピーブイ
・オリジーIAM1657 をそれぞれ肉汁培地 (日水製薬製)
5 mLに植菌し、30℃において20時間しんとう培養し、こ
れをトリプトファナーゼ生産培地（L−トリプトファン
2g、りん酸1カリウム2水素 5g、硫酸マグネシウム7水和
物 0.5 g、コーンスティープリカー 60 g、大豆蛋白加
水分解物 20 g／1 L、pH 7.5）50 mLに植菌し、30℃に
て20時間培養した。得られた培養液を遠心分離し、トリ
プトファナーゼを含有する微生物菌体を調製した。
有する微生物の培養 アエロモナス・ハイドロフィラ・サブスピーシーズ・ハ
イドロフィラ IFO 3820、アグロバクテリウム・ツメフ
ァシエンスIFO3058、アルカリゲネス・フェーカリスIFO
1311、セルロモナス・スピーシーズATCC490、シトロバ
クター・フロインディー IFO 12681、コリネバクテリウ
ム・アンモニアゲネスIFO12612、エンテロバクター・ア
エロゲネス IFO 12010、エルビニア・カロトボーラ・サ
ブスピーシーズ・カロトボーラIFO12380、エシェリヒア
・コリ IFO 12713、クレブジエラ・プノイモニエ IFO 3
318、クルイベラ・アスコルバータ JCM 1681、モルガネ
ラ・モルガニーIFO3168、パエニバチルス・アルベイ IF
O 3343、パントエア・アグロメランスFERM P 11349、
ペプトストレプトコッカス・アサッカロリティカス JCM
8143、ピキア・アノマーラIFO0118、プロテウス・ミラ
ビリス IFO 13300、プロテウス・バルガリス IFO 316
7、プロビデンシア・レットジェリATCC29944、シュード
モナス・プチダ IFO 14796、セラチア・グリメジーATCC
14460、キサントモナス・キャンペストリス・ピーブイ
・オリジーIAM1657 をそれぞれ肉汁培地 (日水製薬製)
5 mLに植菌し、30℃において20時間しんとう培養し、こ
れをトリプトファナーゼ生産培地（L−トリプトファン
2g、りん酸1カリウム2水素 5g、硫酸マグネシウム7水和
物 0.5 g、コーンスティープリカー 60 g、大豆蛋白加
水分解物 20 g／1 L、pH 7.5）50 mLに植菌し、30℃に
て20時間培養した。得られた培養液を遠心分離し、トリ
プトファナーゼを含有する微生物菌体を調製した。
【００３２】[実施例２]トリプトファナーゼ生産能を有
する微生物の培養 ピキア・アノマーラ IFO0118をYM培地5mlに植菌し、30
℃において20時間しんとう培養し、これをトリプトファ
ナーゼ生産培地50mlに植菌し、30℃にて20時間培養し
た。得られた培養液を遠心分離し、トリプトファナーゼ
を含有する微生物菌体を調製した。
する微生物の培養 ピキア・アノマーラ IFO0118をYM培地5mlに植菌し、30
℃において20時間しんとう培養し、これをトリプトファ
ナーゼ生産培地50mlに植菌し、30℃にて20時間培養し
た。得られた培養液を遠心分離し、トリプトファナーゼ
を含有する微生物菌体を調製した。
【００３３】[実施例３]トリプトファナーゼ遺伝子を有
する組換え菌の培養 プラスミド（pKT901EA、pKT951EC)を有するエシェリヒ
ア・コリJM109株をアンピシリン50μg/ml含むLB培地に
植菌し、37℃において3時間しんとう培養し、これをア
ンピシリン50μg/ml、IPTG1mM、ピリドキシン塩酸塩0.5
mMを含むLB培地に植菌し、37℃において9時間しんとう
培養した。得られた培養液を遠心分離し、トリプトファ
ナーゼを含有する微生物菌体を調製した。なお、「pKT9
01EA」は、エンテロバクター・アエロゲネスSM-18株(En
terobacter aerogenes SM-18）由来トリプトファナーゼ
遺伝子を含むpKT421（J. Gen. Microbiol. 139, 3275-3
281(1993)）よりVspI消化、pUC119へのサブクローニン
グ、XbaI消化を経て、pTrc99AのTrcプロモーターのもと
連結、構築し（Biosci. Biotech. Biochem.,59, 1938-1
943, 1995）、また「pKT951EC」は、エシェリヒア・コ
リK-12株（Escherichiacoli K-12）由来トリプトファナ
ーゼ遺伝子を含むpMD6（J. Bacteriol. 147, 787-796
(1981)）より「pKT901EA」と同様の方法で構築した（図
１）。
する組換え菌の培養 プラスミド（pKT901EA、pKT951EC)を有するエシェリヒ
ア・コリJM109株をアンピシリン50μg/ml含むLB培地に
植菌し、37℃において3時間しんとう培養し、これをア
ンピシリン50μg/ml、IPTG1mM、ピリドキシン塩酸塩0.5
mMを含むLB培地に植菌し、37℃において9時間しんとう
培養した。得られた培養液を遠心分離し、トリプトファ
ナーゼを含有する微生物菌体を調製した。なお、「pKT9
01EA」は、エンテロバクター・アエロゲネスSM-18株(En
terobacter aerogenes SM-18）由来トリプトファナーゼ
遺伝子を含むpKT421（J. Gen. Microbiol. 139, 3275-3
281(1993)）よりVspI消化、pUC119へのサブクローニン
グ、XbaI消化を経て、pTrc99AのTrcプロモーターのもと
連結、構築し（Biosci. Biotech. Biochem.,59, 1938-1
943, 1995）、また「pKT951EC」は、エシェリヒア・コ
リK-12株（Escherichiacoli K-12）由来トリプトファナ
ーゼ遺伝子を含むpMD6（J. Bacteriol. 147, 787-796
(1981)）より「pKT901EA」と同様の方法で構築した（図
１）。
【００３４】［実施例４］トリプトファナーゼ含有菌体
によるD-トリプトファン生産 培養液10 mLより得られた菌体を10 mL の反応液 (DL-ト
リプトファン 2.5 g/L, ピリドキサール-5’-りん酸 0.
05 mM, 300 mM りん酸カリウム緩衝液 (pH 8.0) ）に
懸濁し、37℃で20時間しんとうしながら反応させた。反
応後のトリプトファンの光学純度、ならびに定量は、
「Crown Pak CR(+)」(ダイセル化学製) を用い、過塩素
酸水溶液 (pH 2.0) を溶離液として40℃で測定した。こ
の反応結果を表1に示した。
によるD-トリプトファン生産 培養液10 mLより得られた菌体を10 mL の反応液 (DL-ト
リプトファン 2.5 g/L, ピリドキサール-5’-りん酸 0.
05 mM, 300 mM りん酸カリウム緩衝液 (pH 8.0) ）に
懸濁し、37℃で20時間しんとうしながら反応させた。反
応後のトリプトファンの光学純度、ならびに定量は、
「Crown Pak CR(+)」(ダイセル化学製) を用い、過塩素
酸水溶液 (pH 2.0) を溶離液として40℃で測定した。こ
の反応結果を表1に示した。
【００３５】[実施例５]トリプトファナーゼ含有菌体培
養液によるD-トリプトファンの生産 培養液9mlに1M りん酸カリウム緩衝液（pH8.0）1ml、DL
-トリプトファン0.025g、10mMピリドキサール-5'-りん
酸50μlを加え、37℃で20時間しんとうしながら反応さ
せた。反応後のトリプトファンの光学純度、ならびに定
量は、「CrownpakCR(+)」（ダイセル化学工業製）を用
い、過塩素酸水溶液(pH2.0)を溶出液として、40℃で測
定した。この反応結果を表1に示した。
養液によるD-トリプトファンの生産 培養液9mlに1M りん酸カリウム緩衝液（pH8.0）1ml、DL
-トリプトファン0.025g、10mMピリドキサール-5'-りん
酸50μlを加え、37℃で20時間しんとうしながら反応さ
せた。反応後のトリプトファンの光学純度、ならびに定
量は、「CrownpakCR(+)」（ダイセル化学工業製）を用
い、過塩素酸水溶液(pH2.0)を溶出液として、40℃で測
定した。この反応結果を表1に示した。
【００３６】
【表１】 [実施例６]ピルビン酸分解能を有する菌体の培養 コリネバクテリウム・アンモニアゲネスIFO12612をブイ
ヨン培地5mlに植菌し、30℃において20時間しんとう培
養し、これをブイヨン培地50mlに植菌し、30℃にて20時
間培養した。得られた培養液を遠心分離し、ピルビン酸
分解能を含有する微生物菌体を調製した。
ヨン培地5mlに植菌し、30℃において20時間しんとう培
養し、これをブイヨン培地50mlに植菌し、30℃にて20時
間培養した。得られた培養液を遠心分離し、ピルビン酸
分解能を含有する微生物菌体を調製した。
【００３７】[実施例７]ピルビン酸資化能を有する菌体
とトリプトファナーゼ含有菌体によるD-トリプトファン
の生産 トリプトファナーゼ生産菌の培養液10 mLより得られた
菌体、およびピルビン酸分解性菌の培養液10mlより得ら
れた菌体ともに10 mL の反応液 (DL-トリプトファン 0.
24g/10ml, ピリドキサール-5’-りん酸 0.05 mM, 300 m
M りん酸カリウム緩衝液 (pH 8.0) ）に懸濁し、37℃
で20時間しんとうしながら反応させた。反応後のトリプ
トファンの光学純度、ならびに定量は、「Crown Pak CR
(+)」(ダイセル化学製) を用い、過塩素酸水溶液 (pH
2.0) を溶離液として、40℃で測定した。この反応結果
を表2に示した。
とトリプトファナーゼ含有菌体によるD-トリプトファン
の生産 トリプトファナーゼ生産菌の培養液10 mLより得られた
菌体、およびピルビン酸分解性菌の培養液10mlより得ら
れた菌体ともに10 mL の反応液 (DL-トリプトファン 0.
24g/10ml, ピリドキサール-5’-りん酸 0.05 mM, 300 m
M りん酸カリウム緩衝液 (pH 8.0) ）に懸濁し、37℃
で20時間しんとうしながら反応させた。反応後のトリプ
トファンの光学純度、ならびに定量は、「Crown Pak CR
(+)」(ダイセル化学製) を用い、過塩素酸水溶液 (pH
2.0) を溶離液として、40℃で測定した。この反応結果
を表2に示した。
【００３８】[実施例８]界面活性剤・溶媒・吸着樹脂を
添加したトリプトファナーゼ含有菌体によるD-トリプト
ファンの生産 培養液9mlに1M りん酸カリウム緩衝液（pH8.0）1ml、DL
トリプトファン0.24g、10mM ピリドキサール-5'-りん
酸50μlを加え、さらにトルエン5ml、へキサン5ml、ソ
ルポールW200 500μl、ノニオンNS230 500μlまたはア
ンバーライトXAD7 0.7gのいずれかを加え、37℃で20時
間しんとうしながら反応させた。反応後のトリプトファ
ンの光学純度、ならびに定量は、「Crownpak CR(+)」
（ダイセル化学工業製）を用い、過塩素酸水溶液(pH2.
0)を溶出液として、40℃で測定した。この反応結果を表
2に示した。
添加したトリプトファナーゼ含有菌体によるD-トリプト
ファンの生産 培養液9mlに1M りん酸カリウム緩衝液（pH8.0）1ml、DL
トリプトファン0.24g、10mM ピリドキサール-5'-りん
酸50μlを加え、さらにトルエン5ml、へキサン5ml、ソ
ルポールW200 500μl、ノニオンNS230 500μlまたはア
ンバーライトXAD7 0.7gのいずれかを加え、37℃で20時
間しんとうしながら反応させた。反応後のトリプトファ
ンの光学純度、ならびに定量は、「Crownpak CR(+)」
（ダイセル化学工業製）を用い、過塩素酸水溶液(pH2.
0)を溶出液として、40℃で測定した。この反応結果を表
2に示した。
【００３９】
【表２】
【００４０】
【発明の効果】本発明によりD-トリプトファンを高収率
かつ高い光学純度で製造する方法が提供された。
かつ高い光学純度で製造する方法が提供された。
【図１】プラスミド「pKT901EA」および「pKT951EC」の
構築過程を示す。
構築過程を示す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:05） (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:18） (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:22） (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:84） (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:37） (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:40） (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:425） (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:64） (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:15 1:19） (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:15 1:01）
Claims (13)
- 【請求項1】 トリプトファナーゼ、またはトリプトフ
ァナーゼを産生する微生物もしくはその処理物をD,L-ト
リプトファン混合物に作用させ、L-トリプトファンを選
択的に分解してD,L-トリプトファン中のD-トリプトファ
ンの存在比率を増加させることを特徴とする、D-トリプ
トファンを製造する方法。 - 【請求項２】 アエロモナス属 (Aeromonas) 、エンテ
ロバクター属 (Enterobacter) 、エシェリヒア属 (Esch
erichia) 、モルガネラ属(Morganella)、パエニバチル
ス属 (Paenibacillus) 、プロテウス属 (Proteus) 、ス
フェロフォラス属 (Sphaerophorus) 、シンビオバクテ
リウム属 (Symbiobacterium) 、又はビブリオ属 (Vibri
o)に属する微生物由来のトリプトファナーゼをD,L-トリ
プトファン混合物に作用させることを特徴とする、請求
項１に記載の方法。 - 【請求項３】 トリプトファナーゼがアエロモナス・ハ
イドロフィラ（Aeromonas hydrophila) 、エンテロバク
ター・アエロゲネス (Enterobacter aerogenes)、エシ
ェリヒア・コリ (Escherichia coli) 、モルガネラ・モ
ルガニイ・サブスピーシーズ・モルガニイ(Morganella
morganii subsp. morganii) 、パエニバチルス・アルベ
イ (Paenibacillus alvei) 、プロテウス・バルガリス
(Proteus vulgaris) 、スフェロフォラス・フンデュリ
フォルミス(Sphaerophorus funduliformis) 、又はシン
ビオバクテリウム・サーモフィラム (Symbiobacterium
thermophilum) 由来である、請求項２に記載の方法。 - 【請求項４】 アクロモバクター属 (Achromobacter)
、アエロモナス属 (Aeromonas) 、アグロバクテリウム
属 (Agrobacterium) 、アルカリゲネス属 (Alcaligene
s) 、バクテロイデス属 (Bacteroides) 、セルロモナス
属 (Cellulomonas) 、シトロバクター属 (Citrobacter)
、クロストリジウム属 (Clostridium)、コリネバクテ
リウム属(Corynebacterium)、エンテロバクター属 (Ent
erobacter) 、エルビニア属 (Erwinia) 、エシェリヒア
属 (Escherichia) 、フソバクテリウム属 (Fusobacteri
um) 、クレブジエラ属 (Klebsiella) 、クルイベラ属
(Kluyvera) 、モルガネラ属 (Morganella) 、ノカルデ
ィア属 (Nocardia) 、パエニバチルス属 (Paenibacillu
s) 、パントエア属 (Pantoea) 、パステウレラ属 (Past
eurella) 、ペプトストレプトコッカス属 (Peptostrept
ococcus) 、ピキア属 (Pichia) 、プロピオニバクテリ
ウム属 (Propionibacterium) 、プロテウス属 (Proteu
s) 、プロビデンシア属 (Providencia) 、シュードモナ
ス属 (Pseudomonas) 、サルモネラ属 (Salmonella) 、
セラチア属 (Serratia) 、スフェロフォラス属 (Sphaer
ophorus) 、シンビオバクテリウム属 (Symbiobacteriu
m) 、ビブリオ属 (Vibrio)、又はキサントモナス属 (Xa
nthomonas) に属する微生物またはその処理物をD,L-ト
リプトファン混合物に作用させることを特徴とする、請
求項１に記載の方法。 - 【請求項５】 微生物がアクロモバクター・リキダム
(Achromobacter liquidum) 、アエロモナス・ハイドロ
フィラ (Aeromonas hydrophila)、アエロモナス・ハイ
ドロフィラ・サブスピーシーズ・ハイドロファイラ (Ae
romonas hydrophila subsp. hydrophila) 、アグロバク
テリウム・ツメファシエンス (Agrobacterium tumefasc
iens) 、アルカリゲネス・フェーカリス (Alcaligenes
faecalis) 、バクテロイデス・フラジリス (Bacteroide
s fragilis) 、シトロバクター・フロインディー (Citr
obacter freundii) 、クロストリジウム・ファルシネウ
ム(Clostridium felsineum) 、コリネバクテリウム・ア
ンモニアゲネス(Corynebacterium ammoniagenes)、エン
テロバクター・アエロゲネス (Enterobacter aerogene
s)、エンテロバクター・クロアカエ (Enterobacter clo
acae)、 エルビニア・カロトボーラ (Erwinia carotovo
ra）、エシェリヒア・コリ (Escherichia coli) 、フソ
バクテリウム・バリウム(Fusobacterium varium)、クレ
ブジエラ・オキシトカ (Klebsiella oxytoca) 、 クレ
ブジエラ・プランチコラ (Klebsiellaplanticola) 、ク
レブジエラ・プノイモニエ (Klebsiella pneumoniae)、
クルイベラ・アスコルバータ (Kluyvera ascorbata) 、
モルガネラ・モルガニイ・サブスピーシーズ・モルガニ
イ (Morganella morganii subsp. morganii) 、ノカル
ディア・アステロイデス (Nocardia asteroides) 、パ
エニバチルス・アルベイ(Paenibacillus alvei) 、パン
トエア・アグロメランス (Pantoea agglomerans)、パン
トエア・アナナス (Pantoea ananas) 、パステウレラ・
マルトシダ (Pasteurella multocida) 、ペプトストレ
プトコッカス・アサッカロリティカス (Peptostreptoco
ccus asaccharolyticus) 、ピキア・アノマーラ (Pichi
a anomala)、プロピオニバクテリウム・アクネス (Prop
ionibacterium acnes) 、プロテウス・インコンスタン
ス（Proteus inconstans）、プロテウス・ミラビリス
(Proteus mirabilis) 、プロテウス・バルガリス (Prot
eus vulgaris) 、プロビデンシア・レットジェリ (Prov
idencia rettgeri) 、シュードモナス・プチダ (Pseud
omonas putida) 、サルモネラ・コレラエスイス・サブ
スピーシーズ・コレラエスイス (Salmonella choleraes
uis subsp. choleraesuis)、セラチア・グリメジー (Se
rratia grimesii) 、スフェロフォラス・フンデュリフ
ォルミス(Sphaerophorus funduliformis) 、シンビオバ
クテリウム・サーモフィラム (Symbiobacterium thermo
philum)、ビブリオ・ハーベイ (Vibrio harveyi)、ビブ
リオ・コレラ (Vibrio cholerae) 、又はキサントモナ
ス・キャンペストリス (Xanthomonas campestris) であ
る、請求項４に記載の方法。 - 【請求項６】 トリプトファナーゼ遺伝子を導入された
形質転換体またはその処理物をD,L-トリプトファン混合
物に作用させることを特徴とする、請求項１に記載の方
法。 - 【請求項７】 トリプトファナーゼ遺伝子がアルカリゲ
ネス (Alcaligenes)属、エンテロバクター属 (Enteroba
cter) 、エシェリヒア属 (Escherichia) 、プロテウス
属 (Proteus) 、プロビデンシア属 (Providencia) 、又
はシンビオバクテリウム属 (Symbiobacterium) に属す
る微生物由来である、請求項６に記載の方法。 - 【請求項８】 トリプトファナーゼ遺伝子がアルカリゲ
ネス・フェーカリス(Alcaligenes faecalis) 、エンテ
ロバクター・アエロゲネス (Enterobacter aerogene
s)、エシェリヒア・コリ (Escherichia coli) 、プロテ
ウス・インコンスタンス（Proteus inconstans）、プロ
テウス・バルガリス (Proteus vulgaris) 、プロビデン
シア・レットジェリ (Providencia rettgeri) 、又はシ
ンビオバクテリウム・サーモフィラム (Symbiobacteriu
m thermophilum) 由来である、請求項７に記載の方法。 - 【請求項９】 L-トリプトファンを含む培地で培養した
微生物を用いることを特徴とする、請求項２〜８に記載
の方法。 - 【請求項１０】 界面活性剤、インドールの溶解しやす
い非水溶性溶媒、またはインドール結合性を有し水に不
溶性の樹脂を反応液に添加することを含む、請求項１〜
９に記載の方法。 - 【請求項１１】 界面活性剤がソルポールW-200または
ノニオンNS230であり、インドール結合性の樹脂がアン
バーライトXAD-7であり、有機溶媒がトルエンまたはへ
キサンである、請求項１０に記載の方法。 - 【請求項１２】 ピルビン酸分解能を有する微生物を反
応液に添加することを含む、請求項１〜９に記載の方
法。 - 【請求項１３】 ピルビン酸分解能を有する微生物がコ
リネバクテリウム属に属する微生物である、請求項１２
に記載の方法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9329792A JPH1142097A (ja) | 1997-01-09 | 1997-12-01 | Ｄ−トリプトファンの製造方法 |
| US09/005,110 US5916781A (en) | 1997-01-09 | 1998-01-09 | Method for producing D-tryptophan |
| EP98100314A EP0853128A1 (en) | 1997-01-09 | 1998-01-09 | Method for producing D-tryptophan |
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| JP9-2228 | 1997-05-27 | ||
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| JP9329792A JPH1142097A (ja) | 1997-01-09 | 1997-12-01 | Ｄ−トリプトファンの製造方法 |
Publications (1)
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|---|---|
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|---|---|---|---|
| JP9329792A Pending JPH1142097A (ja) | 1997-01-09 | 1997-12-01 | Ｄ−トリプトファンの製造方法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5916781A (ja) |
| EP (1) | EP0853128A1 (ja) |
| JP (1) | JPH1142097A (ja) |
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| US6967087B1 (en) | 2000-03-02 | 2005-11-22 | Korea Research Institute Of Bioscience And Biotechnology | Obligately symbiotic thermophile symbiobacterium toebii SC-1 producing thermostable L-tyrosine phenol-lyase and L-tryptophan indole-lyase and a method for screening its relative bacteria |
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1997
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1998
- 1998-01-09 US US09/005,110 patent/US5916781A/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-01-09 EP EP98100314A patent/EP0853128A1/en not_active Withdrawn
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| US7323328B2 (en) | 2000-03-02 | 2008-01-29 | Korea Research Institute Of Bioscience And Biotechnology | Obligately symbiotic thermophile Symbiobacterium toebii SC-1 producing thermostable L-tyrosine phenol-lyase and L-tryptophan indole-lyase |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5916781A (en) | 1999-06-29 |
| EP0853128A1 (en) | 1998-07-15 |
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