JPH01256379A

JPH01256379A - トリプトファナーゼ生産菌の培養方法

Info

Publication number: JPH01256379A
Application number: JP8613688A
Authority: JP
Inventors: Susumu Nishiguchi; 進西口; Shigeru Izumida; 泉田　茂; Yukihiro Sogabe; 曽我部　行博
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 1988-04-06
Filing date: 1988-04-06
Publication date: 1989-10-12

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、トリプトファナーゼ生産菌の培養方法に関す
る。

（従来の技術）トリプトファナーゼは、アミノ酸製剤、輸液などの医薬
品や工業原料として有用なトリプトファンを製造するた
めに用いられている。このトリプトファナーゼは、ジ−
トリプトファンからピルビン酸、インドールおよびアン
モニアを生成する反応（α、β脱離反応）を触媒する酵
素として知られ。

上記トリプトファンの製造は、この逆反応を利用して行
われる。トリプトファナーゼはインドールおよびＬ−セ
リンから、Ｌ−トリプトファンを合成する反応（β置換
反応）もまた触媒し、Ｌ−トリプトファンの合成が行わ
れ得る。

上記トリプトファナーゼは大腸菌、枯草菌などの多くの
微生物により生産されることが知られている。トリプト
ファナーゼは誘導酵素であるため。

微生物にトリプトファナーゼを生産させるには。

Ｌ−）リブトファンを培養培地に存在させる必要がある
。しかし、Ｌ−トリプトファンを培地中に存在させると
、生産されたトリプトファナーゼにより該Ｌ−）リブト
ファンが加水分解されてインドールを生じる。このイン
ドールはトリプトファナーゼ生産を抑制するばかりでな
く微生物菌体の増殖をも抑制する。このように、インド
ールが培養液中に存在すると、微生物はトリプトファナ
ーゼをある程度の量以上に誘導・生産することができな
い。

そのため、インドールを培養液中から除去する方法の開
発が試みられている。

微生物菌体の増殖を抑制するインドールを培養液中から
除去する方法としては、培地または培養液に界面活性剤
を添加する方法（特公昭第５１−６２３５号公報）が知
られている。しかし、この方法を用いると、培地または
培養液中に存在する界面活性剤が滅菌または培養時に発
泡するので、この発泡を抑えるために多量の消泡剤を添
加することが必要である。さらに、トリプトファナーゼ
を回収した後の培養液中に含有される界面活性剤を処理
するための設備が必要であり、該培養液を廃液として処
理し、排水するのにかなりの費用がかかる。

そのため、界面活性剤の添加に代わるインドールの除去
方法の開発が望まれている。

（発明が解決しようとする課題）本発明は上記従来の課題を解決するものであり。

その目的とするところは、トリプトファナーゼ生産菌を
有利に培養する方法を提供することにある。

本発明の他の目的は、トリプトファナーゼ生産菌の培養
液からＬ−トリプトファンの加水分解によって生じるイ
ンドールを効果的に除去することにより、該トリプトフ
ァナーゼ生産菌を有利に培養する方法を提供することに
ある。

（課題を解決するための手段）本発明のトリプトファナーゼ生産菌の培養方法は、ジ−
トリプトファンを含む培地液中でトリプトファナーゼ生
産菌を培養する方法において、培養液中にインドール吸
着能を有する水不溶性高分子化合物を存在させて、Ｌ−
）リプトファンが加水分解されて生じるインドールを該
水不溶性高分子化合物に吸着させることを特徴とする。

本発明に使用されるトリプトファナーゼ生産菌は特に限
定されず、トリプトファナーゼを生産する微生物であれ
ばいずれも使用することができる。

このようなトリプトファナーゼ生産菌としては。

例えば、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ　）属、エシェリ
ヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　）属、エルビニア（Ｅ
ｒｗｉｎｉａ　）属、アエロバクタ−（Ａｅｒｏｂａｃ
ｔｅｒ）属、アルカリ’ｙ’ネス（Ａｌｃａ１１■旦懸
−）属、アクロモバクタ−（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅ
ｒ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　）
属などの微生物が用いられる。これらの微生物としては
例えば、プロテウス　レトゲリ（ｍ神馬り匹旦組１）　
ＩＦＯ１３５０１、プロテウス　ミラビリス（Ｐｒｏｔ
ｅｕｓ　　ｍ１ｒａｂｉｌｉｓ　）　ＡＴＣＣ１５２９
０，エシェリヒア　コリ　（Ｈｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　
　ｃｏ旦＞　ＩＦＯ１２７３４。

エシェリヒア　コリＡＴＣＣ１３６７６、エルビニア　
ヘルビコラ（Ｅｒｗｉｎｉａ　　ｈｅｒｂｉｃｏｌａ　
）　　ＡＴＣＣ２１４３３＋エルビニア　ヘルビコラＩ
Ｆ０１２６８６　、アエロバクタ−アエロバクタ（Ａｅ
ｒｏｂａｃｔｅｒ　　邦μｍす漫−）八ＴＣＣ７２５６
、およびシュードモナス　パールシリダ（Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ　　■シミ１ｒ−１コ厚１−ｊ−リシ孕−）
八ＴＣＣ４９０が挙げられる。

本発明に用いられるインドール吸着能を有する水不溶性
高分子化合物としては２例えば、ポリエチレン、ポリプ
ロピレン、ポリウレタン、ポリアクリル酸エステルなど
の重合体、またはスチレン−ジビニルベンゼン、フェノ
ール−ホルマリンなどの共重合体が用いられる。これら
水不溶性高分子化合物の培地または培養液への添加量は
、用いる水不溶性高分子化合物およびトリプトファナー
ゼ生産菌の種類によって異なるが２通常、培地または培
養液に対して１−１０（ｈ／ν）％である。これらの水
不溶性高分子化合物は１通常、あらかじめ培地に添加す
ることによって培養の初期から存在させるが、数回に分
けて培養液中に添加してもよい。

水不溶性高分子化合物の形状は特に制限されず。

どのような形状のものでも使用できる。好ましくは直径
１〜１０ｍｍのビーズ状の粒子が用いられる。

本発明方法によりトリプトファナーゼ生産菌を培養する
には、まず、上記のようなトリプトファナーゼ生産菌を
培地に植菌する。培地は、Ｌ−トリプトファンおよび上
記インドール吸着能を有する水溶性高分子化合物を含有
すること以外は特に格別である必要はなく２通常の炭素
源、窒素源、無機塩類、有機栄養物質を含有する培地が
用いられる。上記Ｌ−トリプトファンの濃度はトリプト
ファナーゼを誘導するのに十分な量であればよく１通常
、０．１〜１．５（ｗ／ｖ）％、好ましくは０．３〜１
　、０　（ｗ／ｖ）％である。

上記炭素源としては、可溶性デンプン、アミロペクチン
、アミロース、デキストリン、グリセロールナトカ用い
られる。コーン、コーンステイープリカー、馬鈴薯、甘
苦などを用いることもできる。窒素源としては、ペプト
ン、酵母エキス、肉エキス、カザミノ酸、大豆粉、コー
ンディスティラーズソリュブルなどが用いられる。無機
塩類としては、　　Ｋ２ＨＰＯ４１ＫＨ２ＰＯ４，Ｃａ
ＣＩｚ、　　ＮａＪＰＯ４＋（Ｎｌ１４）　ＺＨＰＯ４
，ｈｓＯ４・７１１□０などが用いられる。培養ｐＨは
６．０〜１０．０．好ましくは７．０〜９．０．培養温
度は２０〜４０°Ｃ２好ましくは３０°Ｃ前後であり２
例えば、約２４時間好気的に攪拌または振盪しながら培
養を行う。培養により、トリプトファナーゼが上記微生
物菌体内および／または培養液中に蓄積される。培地中
の水不溶性高分子化合物は培養終了後１例えば、沈降分
離などにより容易に分離・除去される。水不溶性高分子
化合物が除去された培養液からは、常法により、トリプ
トファナーゼおよび／またはトリプトファナーゼ生産菌
が回収される。上記除去された水不溶性高分子化合物は
洗浄して再生することにより再利用が可能である。

この洗浄には９例えば、メタノール、エタノールなどの
低級アルコールやアセトンなどが用いられる。

このようにインドール吸着能を有する水不溶性高分子化
合物の存在下に培養を行なうことにより。

増殖が抑制されることなくトリプトファナーゼ生産菌が
培養される。上記水不溶性高分子化合物が存在しない場
合に比べると、トリプトファナーゼが約２〜１９倍もの
高生産効率で得られる。

（実施例）以下に本発明を実施例につき説明する。

災詣■土水不溶性高分子化合物として、アンバーライトＸへロー
フ（ポリアクリル酸エステル樹脂；ロームアンドハース
社）を用いた場合の、トリプトファナーゼ生産菌の増殖
およびトリプトファナーゼの生産性に対する効果を調べ
た。

下記の組成の培地（Ａ）、および該組成からアンバーラ
イ）　ＸＡＤ−７を除いた組成の培地（Ｂ）を調製した
。

上記の培地（Ａ）または（Ｂ）の６０ｍ１を坂ロフラス
コに入れ、これにトリプトファナーゼ生産菌を１白金耳
植菌し、３０°Ｃにて２４時間振盪培養を行った。

トリプトファナーゼ生産菌としては、プロテウスレトゲ
リ　ＩＦＯ１３５０１，エシェリヒア　コリＡＴＣＣ１
３６７６、エシェリヒア　コリ　ＩＰＯＬ２７３４およ
びエルビニア　ヘルビコラＩＰＯ１２６８６を用いた。

培養終了後、各培養液中のトリプトファナーゼ生産量を
下記の方法により測定した。、その結果を表１に示す。

トリプトファナーゼ生産量の測定：培養液を沈降分離す
ることにより水不溶性高分子化合物から分離した。得ら
れた菌体を含む液を１０　ｍｌ採取し。

遠心分離により集菌した。この菌体を０．１Ｍリン酸緩
衝液（５ｍＭ２−メルカプトエタノール、２ｍＭＥＤＴ
Ａ　・２Ｎａおよび０　、１２ｍＭピリドキサール−５
゛−リン酸を含有；　ｐ８７．０）に懸濁した。この懸
濁液を超音波菌体破砕装置（モデルＴ−Ａ−４２８０；
海上電機社）で７分間処理し２次いで遠心分離すること
によって上清を得た。この上清のトリプトファナーゼ活
性をＥ、Ｅ、５ｎｅｌｌの方法（ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、
　６６．２３０−２３２（１９７６））に従って測定し
、１分間に１μｍｏｌｅの０−ニトロチオフェノールを
生成し得る酵素量を１ｕｎｉｔとした。

（以下余白）表１表１から、水不溶性高分子化合物としてアンバーライ）
　ＸＡＤ−７を培地に添加した培地（八）を用いた場合
には、無添加の培地（Ｂ）の場合に比べて。

トリプトファナーゼが約２〜１８倍もの高効率で生産さ
れることがわかる。

実重量Ｉ〜培地（八）のアンバーライト　ＸＡＤ−７の代わりにエ
スバ（ポリウレタン繊維；東洋紡績■）を５％含有する
培地（Ｃ）を用い、実施例１に準じてトリプトファナー
ゼ生産菌の増殖およびトリプトファナーゼの生産性に対
する効果を調べた。その結果を表２に示す。

表２表２から、水不溶性高分子化合物としてエスパを培地に
添加した培地（Ｃ）を用いた場合には、無添加の培地（
Ｂ）の場合に比べてトリプトファナーゼが約３〜１９倍
もの高効率で生産されることがわかる。

比較、拠培地（Ａ）のアンバーライトＸＡＤ−７の代わりに。

インドールを除去するための添加剤として、ノニオン系
界面活性剤であるノニオンＭＳ−２３０（日本油脂社製
）を５％含有する培地（Ｉｌ）を用い、実施例１に準じ
てトリプトファナーゼ生産菌の増殖およびトリプトファ
ナーゼの生産性に対する効果を調べた。その結果を表３
に示す。

表３から、ノニオンＮＳ−２３０を培地に添加した培地
（Ｄ）を用いた場合も、無添加の培地（Ｂ）の場合に比
べてトリプトファナーゼが約２〜１７倍生産されること
がわかった。

（発明の効果）本発明方法によれば、インドール吸着能を有する水不溶
性高分子化合物を培養液中に存在させることによりイン
ドールが効果的に除去され、トリプトファナーゼ生産菌
が効果的に培養される。さらに、この水不溶性高分子化
合物は培養終了後に固体として培養液から容易に分離さ
れ、再生して再利用することが可能であるので、従来の
界面活性剤を用いる方法のように発泡、廃液の処理など
の問題がない。このような方法でトリプトファナーゼが
大量に生産され、Ｌ−トリプトファンを工業規模で効果
的に製造することが可能となる。Ｌ−トリプトファンは
、アミノ酸製剤、輸液などの医薬品として、あるいは飼
料への添加物として、各種目的に広く利用される。

以上

Claims

【特許請求の範囲】

１、Ｌ−トリプトファンを含む培地液中でトリプトファ
ナーゼ生産菌を培養する方法において、培養液中にイン
ドール吸着能を有する水不溶性高分子化合物を存在させ
て、Ｌ−トリプトファンが加水分解されて生じるインド
ールを該水不溶性高分子化合物に吸着させることを特徴
とするトリプトファナーゼ生産菌の培養方法。