JPH11500002A - 精製パピローマウイルスタンパク質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 この発明は、パピローマウイルス（ＰＶ）の精製組換えタンパク質並びに該タンパク質の製造法、測定法、使用法及び配合法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】発明の名称 精製パピローマウイルスタンパク質発明の分野 本発明は、パピローマウイルス（ＰＶ）の精製組換えタンパク質、並びに該タ ンパク質の合成法、測定法、使用法及び配合法に関する。図面の簡単な説明 図１は、パピローマウイルスＬ１及び／又はＬ２キャプシドタンパク質の発現 に用いられる二方向型酵母発現ベクターを示す。 図２は、酵母中で発現したＨＰＶ６ａ Ｌ１ ＶＬＰの電子顕微鏡写真である 。 図３は、酵母中で発現したＨＰＶ６ａ Ｌ１／Ｌ２ ＶＬＰの電子顕微鏡写真 である。 図４は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株１５５８の構築の概略図である。 図５は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株１５６９の構築の概略図である。 図６は、精製手順における主要ステップを略記したものである。 図７は、酵母株のリストである。 図８は、酵母から精製されたＨＰＶ１６ Ｌ１＋Ｌ２の一組のＳＤＳ−ＰＡＧ Ｅ分析を示す。最終精製されたＶＬＰに加えて、精製プロセス中の中間ステップ から保持されたものも含まれている。表は、各レーンにおける試料の同定を示す 。コロイドクーマシーで染色されたケル並びにＬ１及びＬ２タンパク質に対する 抗血清でプローブしたウエスタンブロットが含まれている。 図９は、代替ワタオノウサギパピローマウイルスＬ１の精製プロセスの概略図 である。発明の背景 パピローマウイルス（ＰＶ）感染は、ヒト、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウサギ、サ ル、ヘビ及びウシを含む多様な動物に発生する。パピローマウイルスは上皮細胞 に感染し、一般に感染部位に良性の上皮腫又は線維上皮腫を誘発する。ＰＶは種 特異的感染物質であり、ヒトパピローマウイルスは非ヒト動物には感染し得ない 。 パピローマウイルスは、感染する宿主に基づいて異なるグループに分類し得る 。ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）は、ＤＮＡ配列の相同性に基づきさらに７ ０以上もの型に 分類される。ＰＶの型は、ある型のパピローマウイルスによる感染に対する中和 免疫が別の型のパピローマウイルスに対する免疫を付与することはないという型 特異的免疫原であると考えられる。 ヒトでは、種々の型のＨＰＶがそれぞれ異なる疾患を引き起こす。１、２、３ 、４、７、１０及び２６〜２９型のＨＰＶは、正常な個体にも免疫力が弱くなっ た個体にも良性のいぼをつくる。５、８、９、１２、１４、１５、１７、１９〜 ２５、３６及び４６〜５０型のＨＰＶは、免疫力が弱くなった個体に扁平な病変 をつくる。６、１１、３４、３９、４１〜４４及び５１〜５５型のＨＰＶは、生 殖器又は呼吸器粘膜の非悪性コンジローマを引き起こす。１６、１８、３１、３ ３、３５、４５及び５８型のＨＰＶは、生殖器粘膜の上皮形成異常を引き起こし 、頚部、膣部、外陰部及び肛門管の殆どのｉｎ ｓｉｔｕ及び潜在的なガンの原 因物質である。 パピローマウイルスは、最大８個の初期遺伝子と２個の後期遺伝子とをコード する、エンベロープを有さない小型（５０〜６０ｎｍ）の正２０面体ＤＮＡウイ ルスである。該ウイルスゲノムの読み取り枠（ＯＲＦ）はＥ１〜Ｅ７及 びＬ１、Ｌ２（ここで、「Ｅ」は初期を、「Ｌ」は後期を表す）と称されている 。Ｌ１及びＬ２はウイルスのキャプシドタンパク質をコードする。初期（Ｅ）遺 伝子は、ウイルスの複製及び細胞の形質転換のような機能に関与する。 Ｌ１タンパク質は、主要キャプシドタンパク質であり、５５〜６０ｋＤａの分 子量を有している。Ｌ２タンパク質は、５５〜６０ｋＤａの予測分子量、ポリア クリルアミドゲル電気泳動で測定して７５〜１００ｋＤａの見かけ分子量を有す るマイナーのキャプシドタンパク質である。免疫学的データにより、殆どのＬ２ タンパク質はＬ１タンパク質の内側に存在することが示唆されている。Ｌ１ Ｏ ＲＦは、種々のパピローマウイルス中に高度に保存されている。Ｌ２タンパク質 は、種々のパピローマウイルス中でほとんど保存されていない。 Ｌ１及びＬ２遺伝子は、免疫予防剤の良好な標的とみなされている。初期遺伝 子のなかには、ワクチン開発の潜在的標的となることが証明されたものもある。 ワタオノウサギパピローマウイルス（ＣＲＰＶ）及びウシパピローマウイルス（ ＢＰＶ）系での実験により、細菌中で発現させたこれらのタンパク質を用いるか 又はワクシニアベクターを 用いて免疫感作すると、動物がウイルス感染から保護されることが証明された。 バキュロウイルス発現系中でパピローマウイルスＬ１遺伝子を発現させるか又は ワクシニアベクターを用いることにより、ウイルスチャレンジからの動物保護と 相関関係を有する高タイターウイルス中和抗体の誘発に用いられているウイルス 様粒子（ＶＬＰ）のアセンブリーが得られた。さらに、Ｌ１及びＬ２遺伝子は、 動物のパピローマウイルス感染を予防及び治療するためのクチンの製造にも用い られている。ＨＰＶ１６型Ｌ１及びＬ２遺伝子をワクシニアウイルスベクターに クローン化し、得られたベクターを用いてＣＶ−１哺乳動物細胞に感染させて、 ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を産生させた。 大量の精製ウイルス及び精製タンパク質が得られないために、Ｌ１タンパク質 、Ｌ１＋Ｌ２タンパク質又は修飾Ｌ１若しくはＬ１＋Ｌ２タンパク質を含む、Ｐ Ｖの感染及び疾患に対する子防及び治療用ワクチンの開発や商品化が遅れている 。ＰＶはｉｎ ｖｉｔｒｏでの培養が難しく、そのために必要量のＬ１及びＬ２ タンパク質をＰＶのｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖により産生させることは困難である。 その結果、供給量不足により、ＰＶ及びＰＶタンパク質の特性 決定に困難をきたしている。従って、粗ＰＶタンパク質、特にＰＶ Ｌ１及びＬ ２タンパク質又は修飾Ｌ１及びＬ２タンパク質の容易に再生可能な供給源を開発 することが有用である。さらに、大量の粗パピローマウイルスタンパク質を免疫 学的研究及びワクチンの開発に適した純度レベルに精製する方法を開発すること も有用である。また、天然タンパク質のコンフォーメイションのような、天然タ ンパク質の免疫付与特性を有する大量のパピローマウイルスタンパク質を製造す ることも有用である。さらに、ＰＶタンパク質の分析法、及び該タンパク質や該 タンパク質を含む組成物の相対純度の測定法を開発することも有用である。その ような高度に精製されたタンパク質は、ＰＶ感染の研究に有用な種々の試薬の製 造にも有用である。そのような試薬には、ポリクローナル抗体、モノクローナル 抗体及び分析標準が含まれるがそれらには限定されない。 本発明は、高度に精製されたＰＶ Ｌ１及びＬ２タンパク質に関する。本発明 はさらに、天然パピローマウイルスタンパク質の免疫付与特性を有する組換えパ ピローマウイルスタンパク質の製造法及び精製法をも包含する。本発明は、パピ ローマウイルス感染を予防及び治療するためのワ クチンの製造に関する。本発明の組換えタンパク質はウイルス様粒子（ＶＬＰ） を形成し得る。これらのＶＬＰは免疫原性であり、動物モデルにおいていぼの形 成を阻害する。本発明は、モデル系として、ワタオノウサギパピローマウイルス （ＣＲＰＶ）、ＨＰＶ６型（亜型６ａ）及びＨＰＶ１６型の組換え酵母由来Ｌ１ 及びＬ１＋Ｌ２タンパク質によって例示される。本発明の精製法及び分析法は、 他のＨＰＶ型、他のＨＰＶタンパク質及び他の組換え発現系にも適合し得る。発明の要旨 本発明は、パピローマウイルス（ＰＶ）の精製組換えタンパク質並びに該タン パク質の製造法、測定法、使用法及び配合法に関する。発明の詳細な説明 本発明は、パピローマウイルス（ＰＶ）の精製組換えタンパク質並びに該タン パク質の製造法、測定法、使用法及び配合法に関する。本発明は、ＣＲＰＶ、Ｈ ＰＶ６ａ及びＨＰＶ１６の組換え酵母由来タンパク質により例示されるがそれら には限定されない。本発明の種々の実施態様には、組換えＨＰＶ ＤＮＡ分子、 組換えＨＰＶ ＤＮＡ分子に相 補的なＲＮＡ、組換えＤＮＡ分子によりコードされるタンパク質、組換えＤＮＡ 分子及び関連タンパク質に対する抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質又は抗体を 含む組成物、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質又は抗体並びにそれらの誘導体の使用 法が含まれるがそれらには限定されない。そのような誘導体には、該ＤＮＡによ りコードされるペプチド及びタンパク質、該ＤＮＡに対する抗体又は該ＤＮＡに よりコードされるタンパク質に対する抗体、該ＤＮＡを含むワクチン又は該ＤＮ Ａによりコードされるタンパク質を含むワクチン、該ＤＮＡ又は該ＤＮＡにより コードされるタンパク質を含む免疫組成物、該ＤＮＡ、又は該ＤＮＡ由来のＲＮ Ａ又は該ＤＮＡによりコードされるタンパク質を含むキットが含まれるがそれら には限定されない。 細菌由来の組換えウシパピローマウイルスＬ１及びＬ２が合成された。組換え 細菌タンパク質に対する中和血清は、天然ウイルスとは低レベルでしか交差反応 しないが、これは、天然タンパク質と細菌由来のタンパク質のコンフォーメイシ ョンが異なるためであると考えられる。 ＨＰＶ１６ Ｌ１又はＨＰＶ１６ Ｌ２ ＯＲＦを発現する組換えバキュロウ イルスは、昆虫ＳＦ９細胞の感染及び Ｌ１及びＬ２タンパク質の生産に用いられている。ウエスタンブロット分析によ り、該バキュロウイルス由来のＬ１及びＬ２タンパク質がＨＰＶ１６に対する抗 体と反応することが証明された。該バキュロウイルス由来のＬ１はＶＬＰを形成 する。 Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの組換え株によるＨＰＶ １６ Ｌ１及びＨＰＶ１６ Ｌ２タンパク質が生産されたとの報告があった。該 組換えタンパク質は、細胞内産物としても、分泌産物としても産生された。該タ ンパク質が細胞内で発現した場合、該タンパク質の殆どは、細胞を変性試薬の不 在下に溶解すると不溶性となることが知見された。これらのタンパク質の純度に ついての報告はなかった。 酵母から分泌された組換えタンパク質は、酵母由来の炭水化物を含んでいるこ とが示された。これらのＮ結合オリゴ糖の存在により、天然エピトープがマスク されている可能性がある。さらに、分泌された組換えタンパク質は、分泌リーダ ー配列保持体のような他の修飾体を含んでいる可能性がある。該分泌プロセスは 低効率でもあり得る。 大量の精製ウイルス及び精製タンパク質が得られない ために、Ｌ１タンパク質、Ｌ１＋Ｌ２タンパク質又は修飾Ｌ１若しくはＬ１＋Ｌ ２タンパク質を含む、ＰＶの感染及び疾患を予防及び治療するためのワクチンの 開発や商品化が遅れている。ＰＶはｉｎ ｖｉｔｒｏでの培養が難しいので、必 要量のＬ１及びＬ２タンパク質をＰＶのｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖により合成するこ とは困難である。その結果、供給量不足により、ＰＶ及びＰＶタンパク質の化学 的、免疫学的及び生物学的特性決定に困難をきたしている。従って、粗ＰＶタン パク質、特にＰＶ Ｌ１及びＬ２タンパク質又は修飾Ｌ１及びＬ２タンパク質の 容易に再生可能な供給源を開発することは有用である。さらに、大量の粗パピロ ーマウイルスタンパク質を免疫学的研究及びワクチンの開発に適した純度レベル に精製する方法を開発することも有用である。また、天然タンパク質のコンフォ ーメイションのような、天然タンパク質の免疫付与特性を有する大量のパピロー マウイルスタンパク質を合成することも有用である。さらに、ＰＶタンパク質の 分析法、及び該タンパク質や該タンパク質を含む組成物の相対純度の測定法を開 発することも有用である。そのような高度に精製されたタンパク質は、ＰＶ感染 の研究に有用な種々の試薬の製造にも有用で ある。そのような試薬には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体及び分析 標準が含まれるがそれらには限定されない。 該ＤＮＡ、又は該ＤＮＡによりコードされるタンパク質、を含む医薬上有用な 組成物は、公知方法により、例えば、医薬上許容し得る担体を添加して配合し得 る。そのような担体及び配合法の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａ ｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓに見出すことができる。有効な投与に適し た医薬上許容し得る組成物を形成するためには、該組成物は、有効量のタンパク 質又はＶＬＰを含んでいなければならない。そのような組成物は少なくとも１つ の型のＨＰＶ由来のタンパク質又はＶＬＰを含み得る。 本発明の治療又は診断用組成物は、ＰＶ感染の治療又は診断に十分な量で個体 に投与する。有効量は、個体の症状、体重、性別及び年齢のような多様な要素に 応じて異なり得る。他の要素には投与形態が含まれる。一般に、該組成物は、約 １μｇ〜約１ｍｇの用量範囲で投与される。 該医薬組成物は、皮下、局所、経口、経粘膜、静脈内及び筋肉内のような種々 の経路を介して個体に投与し得る。 本発明のワクチンは、宿主に中和抗体の形成を誘発させるのに必要な抗原決定 基を含む、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はＤＮＡによってコードされるタンパク質を含む 。そのようなワクチンは、臨床感染の恐れなく投与し得るに十分なほど安全であ り、毒性の副作用が無く、効果的な経路を介して投与し得、安定であり且つワク チン担体との相容性を有する。 該ワクチンは、種々の経路を介して、例えば、経口的に、非経口的に、皮下に 、粘膜を介して、静脈内又は筋肉内に投与し得る。投与量は、個体の症状、性別 、体重及び年齢；投与経路；並びにワクチンのＰＶ型に応じて異なり得る。本発 明のワクチンは、カプセル剤、懸濁剤、エリキシル剤又は液体溶液のような剤形 で用いることができる。該ワクチンは、免疫学的に許容し得る担体と配合し得る 。 本発明のワクチンは、治療上有効量、即ち、免疫保護応答を生起させるに十分 な量で投与する。治療上有効な量は、ＰＶのタイプに応じて異なり得る。該ワク チンは単一又は多重用量で投与し得る。 本発明の精製タンパク質は、免疫原性組成物の配合に用いることができる。そ のような組成物は、適当な宿主に導 入すると、該宿主において免疫応答を誘発し得る。 本発明の精製タンパク質又はその誘導体は、抗体の産生に用いることができる 。本明細書において「抗体」という用語は、抗原又はハプテンに結合し得る、ポ リクローナル抗体及びモノクローナル抗体、並びにその断片、例えば、Ｆｖ、Ｆ ａｂ及びＦ（ａｂ）断片をも包含する。 本発明のタンパク質及びタンパク質誘導体は、ＨＰＶ感染及びＨＰＶスクリー ニングの血清型分類に用いることができる。精製タンパク質、ＶＬＰ及び抗体は 、ＨＰＶの検出及び血清型の分類に適したキットの調製に有用である。そのよう なキットは、少なくとも１個の容器を密封保持するのに適したコンパートメント 化キャリアーを含む。該キャリアーは、種々のＨＰＶ型の検出に適した、組換え ＨＰＶ６ａ Ｌ１若しくはＬ２タンパク質、ＶＬＰ又は抗ＨＰＶ６ａ抗体、ある いは組換えＨＰＶ１６ Ｌ１若しくはＬ２タンパク質、ＶＬＰ又は抗ＨＰＶ１６ 抗体のような試薬をさらに含み得る。さらに該キャリアーは、標識した抗原又は 酵素基質などのような検出手段をも含み得る。 該精製タンパク質は、免疫標準、分子量マーカー及び分子サイズマーカーとし ても有用である。 遺伝暗号は縮合しているので、１個以上のコドンを用いて特定のアミノ酸をコ ードし得、従って、該アミノ酸配列は類似のどのＤＮＡオリゴヌクレオチドセッ トによってもコードし得る。該セットのうちの１構成員だけがＨＰＶ６ａ又はＨ ＰＶ１６配列と相同であるに過ぎないであろうが、適切な条件下にはミスマッチ を有するＤＮＡオリゴヌクレオチドの存在下においてさえＨＰＶ６ａ又はＨＰＶ １６のＤＮＡにハイブリダイズし得るであろう。代替条件下には、ミスマッチを 有するＤＮＡオリゴヌクレオチドでも、ＨＰＶ６ａ又はＨＰＶ１６ＤＮＡにハイ ブリダイズすることができ、それによってＨＰＶ６ａ又はＨＰＶ１６をコードす るＤＮＡの同定及び分離が可能になる。 本発明の精製ＨＰＶ６ａ若しくはＨＰＶ１６のＤＮＡ又はその断片を用いて、 他の源からＨＰＶ６ａの同族体及び断片を分離・精製し得る。これを行うために は、最初のＨＰＶ６ａＤＮＡを、適切なハイブリダイゼーション条件下にＨＰＶ ６ａ同族体をコードするＤＮＡを含む試料と混合する。ハイブリダイズしたＤＮ Ａ複合体を分離し、該複合体から相同ＤＮＡをコードするＤＮＡを精製すること ができる。 特定のアミノ酸をコードする種々のコドンにはかなりの量の多重複性が存在す ることは公知である。従って、本発明は、同一アミノ酸の終局的翻訳部分をコー ドする代替コドンを含むＤＮＡ配列にも関する。本明細書において、１個以上の 置換コドンを有する配列は、縮重変異体と定義される。発現したタンパク質の基 本的物性を実質的に変性させない、ＤＮＡ配列又は翻訳タンパク質における突然 変異体も本発明の範囲内に包含される。例えば、ロイシンをバリンに、リシンを アルギニンに、又はグルタミンをアスパラギンに置換しても、ポリペプチドの機 能に変化は起こらない。 ペプチドをコードするＤＮＡ配列を、天然ペプチドの特性とは異なる特性を有 するペプチドをコードするように改変し得ることは公知である。ＤＮＡ配列の改 変方法には、部位特異的突然変異形成が含まれるがそれには限定されない。 本明細書に用いられている、ＨＰＶ６ａの「機能性誘導体」とは、ＨＰＶ６ａ の生物学的活性に実質的に類似した生物学的活性（機能性又は構造性）を有する 化合物である。用語「機能性誘導体」とは、ＨＰＶ６ａの「断片」、「変 異体」、「縮重変異体」、「類似体」及び「同族体」又は「化学誘導体」を包含 するものとする。用語「断片」とは、ＨＰＶ６ａの任意のポリペプチドサブセッ トを指すものとする。用語「変異体」とは、全ＨＰＶ６ａ分子又はその断片と構 造及び機能が実質的に類似している分子を指すものとする。ある分子は、該分子 がＨＰＶ６ａ分子と実質的に類似の構造を有しているか、又は該分子がＨＰＶ６ ａと実質的に類似の生物学的活性を有している場合、ＨＰＶ６ａに「実質的に類 似」である。従って、これら２種の分子は、両者が実質的に類似の活性を有して いれば、例えその一方の分子の構造が他方には見いだされなくとも、あるいは両 者のアミノ酸配列が相同でなくとも、変異体であると解釈される。用語「機能性 誘導体」にはＨＰＶ６ｂは含まれない。 用語「類似体」とは、全ＨＰＶ６ａ分子又はその断片と実質的に類似の機能を 有する分子を指す。 ＨＰＶ６ａのＤＮＡを分子的にクローン化するには、当業界で公知の種々の方 法を用い得る。これらの方法には、適切な発現ベクター系中でＨＰＶ６ａ含有ｃ ＤＮＡ又はゲノムＤＮＡライブラリーを構築した後で、ＨＰＶ６ａ遺伝 子を直接発現させる方法が含まれるがそれには限定されない。別の方法は、ＨＰ Ｖ６ａのアミノ酸配列から設計された標識オリゴヌクレオチドプローブを用いて バクテリオファージ又はプラスミドシャトルベクター中で構築されたＨＰＶ６ａ 含有ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングするものである。 また別の方法は、ＨＰＶ６ａをコードする部分ＤＮＡを用いてバクテリオファー ジ又はプラスミドシャトルベクター中で構築されたＨＰＶ６ａ含有ｃＤＮＡ又は ゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることからなる。この部分ＤＮＡ は、精製されたＨＰＶ６ａのアミノ酸配列から縮重オリゴヌタレオチドプライマ ーを設計し、ＨＰＶ６ａＤＮＡ断片を特異的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で 増幅することにより得られる。別の方法は、ＨＰＶ６ａ産生細胞からＲＮＡを分 離し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏ翻訳系を介して該ＲＮＡをタンパク 質に翻訳するものである。ＲＮＡをペプチド又はタンパク質に翻訳することによ り、ＨＰＶ６ａタンパク質の少なくとも１部が産生されるが、該タンパク質は、 例えば、ＨＰＶ６ａタンパク質の活性、又は抗ＨＰＶ６ａ抗体との免疫反応性に より同定することができる。この方法 で、ＨＰＶ６ａ産生細胞から分離されたＲＮＡのプールを、ＨＰＶ６ａの少なく とも１部をコードするＲＮＡの存在について分析することができる。ＲＮＡプー ルをさらに分別して、非ＨＰＶ６ａＲＮＡからＨＰＶ６ａＲＮＡを精製すること ができる。この方法で生産されたペプチド又はタンパク質を分析して、アミノ酸 配列を得、該配列を用いてＨＰＶ６ａのｃＤＮＡを作製するためのプライマーを 得ることもできるし、あるいは、翻訳に用いられるＲＮＡを分析して、ＨＰＶ６ ａをコードするヌクレオチド配列を得、ＨＰＶ６ａ ｃＤＮＡライブラリーのス クリーニング用プローブを作製することもできる。これらの方法は当業界では公 知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，Ｍａ ｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａ ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ ，１９８９に見出すことができる。 他のタイプのライブラリーや、他の細胞若しくは細胞型から構築されたライブ ラリーもＨＰＶ６ａをコードするＤＮＡの分離に有用であることは当業者には明 らかである。 他のタイプのライブラリーには、ＨＰＶ６ａ型を含む他の細胞又は細胞系由来の ｃＤＮＡライブラリー及びゲノムＤＮＡライブラリーが含まれるがそれらには限 定されない。 ｃＤＮＡライブラリーは、当業界では周知の標準法により構築し得る。ｃＤＮ Ａライブラリーの構築法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前掲に見出すことが できる。ＨＰＶ６ａをコードするＤＮＡを適当なゲノムＤＮＡライブラリーから も分離し得ることは当業者には明らかである。ゲノムＤＮＡライブラリーは、当 業界において公知の標準法により構築し得る。ゲノムＤＮＡライブラリーの構築 法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前掲に見ることができる。 本明細書に記載の方法により得られたクローン化ＨＰＶ６ａのＤＮＡ又はその 断片を、適当なプロモーター及び他の適切な転写調節成分を含む発現ベクター中 に分子クローン化して組換え体として発現させ、原核又は真核宿主細胞に移入し て、組換えＨＰＶ６ａを作製し得る。そのような操作方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ら，前掲に詳細に記載されており、当業界では公知である。 本明細書において、発現ベクターとは、適切な宿主における遺伝子のクローン 化コピーの転写及びそれらのｍＲＮ Ａの翻訳に必要とされるＤＮＡ配列であると定義される。そのようなベクターを 用いて、細菌、藍藻、植物細胞、昆虫細胞、菌類細胞及び動物細胞のような多様 な宿主中で真核生物遺伝子を発現させることができる。特異的に設計されたベク ターにより、細菌−酵母若しくは細菌−動物細胞又は細菌−真菌細胞若しくは細 菌−無脊椎動物細胞のような宿主間でのＤＮＡの移動（ｓｈｕｔｔｌｉｎｇ）が 可能になる。適切に構築された発現ベクターは、宿主細胞中での自律複製用複製 起点、選択可能マーカー、限定数の有用な制限酵素部位、高コピー数の能力、及 び活性プロモーターを含む。プロモーターとは、ＲＮＡポリメラーゼをＤＮＡに 結合させてＲＮＡ合成を開始するように誘導するＤＮＡ配列であると定義される 。強力なプロモーターは、ｍＲＮＡに高頻度で開始させるようにし向けるプロモ ーターである。発現ベクターには、クローニングベクター、改変クローニングベ クター、特異的に設計されたプラスミド又はウイルスが含まれるがそれらには限 定されない。 種々の哺乳動物発現ベクターを用いて、哺乳動物細胞中でＨＰＶ６ａのＤＮＡ 又はその断片を発現させることができる。組換えＨＰＶ６ａの発現に適当であり 得る市販の哺 乳動物発現ベクターには、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＰＭＣ１ｎ ｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＸＴ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＧ５ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ ３７５９３ ）、ｐＢＰＶ−１（８−２）（ＡＴＣＣ ３７１１０）、ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎ ｅｏ（３４２−１２）（ＡＴＣＣ ３７２２４）、ＰＲＳＶｇＰｔ（ＡＴＣＣ ３７１９９）、ｐＲＳＶｎｅｏ（ＡＴＣＣ ３７１９８），ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ （ＡＴＣＣ ３７１４６）、ｐＵＣＴａｇ（ＡＴＣＣ ３７４６０）及びλＺＤ ３５（ＡＴＣＣ ３７５６５）が含まれるがそれらには限定されない。 種々の細菌発現ベクターを用いて、細菌細胞中でＨＰＶ６ａＤＮＡ又はその断 片を発現させることができる。組換えＨＰＶ６ａの発現に適当であり得る市販の 細菌発現ベクターには、ｐＥＴ１１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）、ラムダｇｔ１１（Ｉ ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐｃＤＮＡII（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＫＫ２２３ −３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が含まれるがそれらには限定されない。 種々の菌類細胞発現ベクターを用いて、菌類細胞中でＨＰＶ６ａ又はその断片 を発現させることができる。組換え ＨＰＶ６ａの発現に適当であり得る市販の菌類細胞発現ベクターには、ｐＹＥＳ ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｐｉｃｈｉａ発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ ｎ）が含まれるがそれらには限定されない。 種々の昆虫細胞発現ベクターを用いて、昆虫細胞中でＨＰＶ６ａ又はその断片 を発現させることができる。組換えＨＰＶ６ａの発現に適当であり得る市販の昆 虫細胞発現ベクターには、ｐＢｌｕｅ ＢａｃIII（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が 含まれるがそれには限定されない。 ＨＰＶ６ａ又はその断片をコードするＤＮＡを含む発現ベタターを用いて、細 胞、組織、器官、又は動物中で、ＨＰＶ６ａタンパク質又はその断片を発現させ ることができる。宿主細胞は、細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、菌類細胞（例え ば、酵母）、哺乳動物細胞（ヒト、ウシ、ブタ、サル及びげっ歯類由来の細胞系 を含むがそれらには限定されない）、並びに昆虫細胞（ショウジョウバエ及びカ イコ由来の細胞系を含むがそれらには限定されない）を含むがそれらには限定さ れない原核細胞又は真核細胞であってよい。適当であり得且つ市販されている哺 乳動物種由来の細胞系には、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（ＴＫ^-）（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １． ３）、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １．２）、２９３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５７３）、Ｒａｊｉ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ８６）、ＣＶ−１（ＡＴＣＣ Ｃ ＣＬ ７０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴ ＣＣ ＣＲＬ １６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ６１）、３Ｔ３ （ＡＴＣＣ ＣＣＬ ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５８） 、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）、Ｃ１２７Ｉ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６１ ６）、ＢＳ−Ｃ−１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２６）及びＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ Ｃ ＣＬ １７１）が含まれるがそれらには限定されない。 発現ベクターは、形質転換、トランスフェクション、リポフエクション（ｌｉ ｐｏｆｅｃｔｉｏｎ）、プロトプラスト融合及び電気泳動を含む（但し、それら には限定されない）多くの方法のいずれかを用いて宿主細胞中に導入し得る。発 現ベクター含有細胞をクローン増幅し、個別に分析して、該細胞がＨＰＶ６ａタ ンパク質を産生するかどうかを決定する。ＨＰＶ６ａを発現する宿主細胞のクロ ーンは、抗ＨＰＶ６ａ抗体との免疫反応性、及び宿主細胞関連ＨＰＶ６ａ活性、 例えば、ＨＰＶ６ａ特異的リガンド結合又はＨＰＶ６ａにおけるＨＰＶ６ａ特異 的リガンドの相互 作用により仲介される応答と定義されるシグナル形質導入の存在を含む（但し、 それらには限定されない）いくつかの手段により同定し得る。 ＨＰＶのＤＮＡ断片は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで作製された合成ｍＲＮＡ又は天然 ｍＲＮＡを用いて発現させることもできる。合成ｍＲＮＡ又はＨＰＶ６ａ産生細 胞から単離されたｍＲＮＡは、コムギ胚芽抽出物及び網状赤血球抽出物を含む（ 但し、それらには限定されない）種々の無細胞系に効率的に翻訳することもでき るし、またカエルの卵母細胞を含む（但し、それには限定されない）細胞ベース 系にも顕微注入することによって効率的に翻訳され得るが、カエルの卵母細胞に 顕微注入するのが好ましい。 宿主細胞中でＨＰＶ６ａタンパク質を発現させた後で、ＨＰＶ６ａタンパク質 を回収して、精製形態のＨＰＶ６ａを得ることができる。利用可能且つ使用に適 したＨＰＶ６ａ精製手順がいくつかある。本明細書に記載のように、組換えＨＰ Ｖ６ａタンパク質は、細胞溶解物及び抽出物から、塩分別、イオン交換クロマト グラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイト吸着クロマ トグラフィー及び疎水的相互作用クロマトグラフィーを組み合わ せたり、別個に用いたりして精製し得る。 さらに、組換えＨＰＶ６ａは、全長の新生ＨＰＶ６ａ又はＨＰＶ６ａのポリペ プチド断片に特異的なモノクローナル又はポリクローナル抗体を用いて作製した イムノアフィニティーカラムを用いて、他の細胞タンパク質から分離することが できる。モノクローナル及びポリクローナル抗体は、当業界で公知の種々の方法 に従って産生させることができる。本明細書に用いられているモノクローナル又 は単一特異性抗体とは、ＨＰＶ６ａとホモジニアスな結合特性を有する単一抗体 種又は多重抗体種であると定義される。本明細書に用いられているホモジニアス 結合とは、抗体種が特異的抗原又はエピトープに結合する能力であると定義され る。 単一特異性抗体産生法を利用してＨＰＶポリペプチド断片又は全長の新生ＨＰ Ｖポリペプチドに特異的な抗体を産生させ得ることは当業者には明らかである。 特に、十分に機能性のＨＰＶタンパク質又はその断片に特異的な単一特異性抗体 を産生し得ることは当業者には明らかである。 本発明はさらに、ＨＰＶをコードするＤＮＡ又はＲＮＡの発現並びにｉｎ ｖ ｉｖｏでのＨＰＶ６ａタンパク質の 機能を調節する化合物のスクリーニング法にも関する。これらの活性を調節する 化合物は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、タンパク質又は非タンパク性有機分子で あり得る。化合物は、ＨＰＶ６ａをコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡの発現又は ＨＰＶ６ａタンパク質の機能を増強若しくは減弱させたりして調節し得る。ＨＰ Ｖ６ａをコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡの発現又はＨＰＶ６ａタンパク質の機 能を調節する化合物は、種々のアッセイにより検出し得る。該アッセイは、発現 又は機能が変化したかどうかを決定する単純な「イエス／ノー」アッセイであっ てよい。該アッセイは、テスト試料の発現又は機能を標準試料の発現又は機能レ ベルと比較することにより定量し得る。 ＨＰＶ６ａ ＤＮＡ、ＨＰＶ６ａ ＤＮＡの断片、ＨＰＶ６ａＤＮＡ若しくは ＨＰＶ６ａ タンパク質に対する抗体、ＨＰＶ６ａＲＮＡ又はＨＰＶ６ａタンパ ク質を含むキットを作製し得る。そのようなキットを用いて、ＨＰＶ６ａＤＮＡ にハイブリダイズするＤＮＡを検出したり、又は試料中のＨＰＶ６ａタンパク質 若しくはペプチド断片の存在を検出する。そのような特性決定は、法廷分析及び 疫学的研究を含むがそれらには限定されない多様な目的に有用で ある。 アンチセンス療法用に、ＨＰＶ６ａをコードするＤＮＡ配列に相補的なヌクレ オチド配列を合成し得る。これらのアンチセンス分子は、ＤＮＡ、ホスホロチオ エート又はメチルホスホネートのような安定なＤＮＡ誘導体、ＲＮＡ、２′−Ｏ −アルキルＲＮＡのような安定なＲＮＡ誘導体、又は他のＨＰＶ６ａアンチセン スオリゴヌクレオチド模擬体であってよい。ＨＰＶ６ａアンチセンス分子は、マ イクロインジェクション、リポソーム封入又はアンチセンス配列を有するベクタ ーから発現させることにより細胞に導入し得る。ＨＰＶ６ａアンチセンス療法は 、ＨＰＶ６ａ活性を低減させることが有利である疾患の治療に特に有用である。 用語「化学誘導体」とは、通常、基礎分子の一部ではない追加の化学部分を含 む分子を指す。そのような部分は、基礎分子の溶解度、半減期、吸収率などを改 善することができる。あるいは、該部分は、基礎分子の望ましくない副作用を減 弱させたり、又は基礎分子の毒性を低減させたりし得る。そのような部分の例は 、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ のような 様々な文献に記載されている。 本明細書に開示されている方法で同定された化合物は、日常的試験によって定 義された適切な用量で単独で用いて、潜在的な毒性を最小限にしながらＨＰＶ６ ａ又はその活性を最適に阻害することができる。また、他の薬剤との同時投与又 は順次投与も望ましい。 本発明の化合物は、１日１回用量で投与してもよいし、１日当たりの全用量を 数回分に分割して投与してもよい。さらに、本発明の化合物は、経鼻、経皮、座 薬、経口などの経路を含む（但し、それらには限定されない）多様な経路を介し て投与し得る。 別々の剤形の１種以上の活性剤との組み合わせ治療の場合、該活性剤を同時に 投与してもよいし、別個に時間をずらせて投与してもよい。 本発明の化合物を用いる投与レジメは、患者のタイプ、種、年齢、体重、性別 及び医学的な症状；治療すべき症状の重篤度；投与経路；患者の腎臓及び肝臓の 機能；並びに用いられる特定の化合物を含む（但し、それらには限定されない） 様々な要素に応じて選択する。通常の技術を有する医師であれば、該症状の進行 の予防、治療又は治癒に必 要な薬剤の有効用量を容易に決定・処方し得るであろう。毒性なしに効能を生じ る範囲内の薬剤濃度の最適且つ正確な量を知るには、標的部位に対する薬剤の利 用性についての動力学に基づく計画が必要である。これには、薬剤の分布、平衡 状態及び排泄についての考慮が含まれる。 本発明の方法において、本明細書に詳細に記載されている化合物は有効成分を 形成し得、典型的には、意図する投与形態、即ち、経口錠剤、カプセル剤、エリ キシル剤、シロップ剤、座薬、ゲルなどに適当であるとして選択され、且つ慣用 医療に合致した適当な医薬稀釈剤、賦形剤若しくは担体（本明細書では、集合的 に「担体」物質と称する）と混合して投与する。 例えば、錠剤又はカプセル剤の形態で経口投与する場合、有効薬剤成分を、エ タノール、グリセロール、水などのような、医薬上許容し得る無毒性の経口不活 性担体と組み合わせることができる。さらに、所望又は必要な場合には、適当な 結合剤、滑沢剤、崩壊剤及び着色剤を混合物中に配合することもできる。適当な 結合剤には、非限定的に、スターチ、ゼラチン、天然糖類（例えば、グルコース 若しくはβ−ラクトース）、コーン甘味剤、天然及び合成ガム（例 えば、アカシア、トラガカント若しくはアルギン酸ナトリウム）、カルボキシメ チルセルロース、ポリエチレングリコール、ワックスなどが含まれる。これらの 剤形に用いられる滑沢剤には、非限定的に、オレイン酸ナトリウム、ステアリン 酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウ ム、塩化ナトリウムなどが含まれる。崩壊剤には、非限定的に、スターチ、メチ ルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンガムなどが含まれる。 液体形態の場合、有効薬剤成分を、合成及び天然ガム、例えば、トラガカント 、アカシア、メチルセルロースなどのような適当に着香した懸濁剤又は分散剤と 組み合わせることができる。用い得る他の分散剤には、グリセリンなどが含まれ る。非経口投与の場合、滅菌懸濁剤及び溶液剤が望ましい。静脈内投与が望まし い場合には、一般に適当な保存剤を含む等張製剤を用いる。 有効薬剤成分を含む局所用製剤は、例えば、アルコール類、アロエベラゲル、 アラントイン、グリセリン、ビタミンＡ及びＥ油、鉱油、ＰＰＧ２ミリスチルプ ロピオネートなどのような、当業界で周知の種々の担体物質と混合して、 例えば、アルコール性溶剤、局所用洗浄剤、クレンジングクリーム、スキンケル 、スキンローション及びクリーム若しくはゲル配合物状のシャンプーを形成し得 る。 本発明の化合物は、小型の単層小胞、大型の単層小胞及び多層小胞のようなリ ポソーム送達系の形態で投与することもできる。リポソームは、コレステロール 、ステアリルアミン又はホスファチジルコリンのような種々のリン脂質から形成 し得る。 本発明の化合物は、化合物の分子が結合する個々の担体としてモノクローナル 抗体を用いて送出することもできる。また、本発明の化合物は、標的とし得る薬 剤担体として可溶性ポリマーと結合させてもよい。そのようなポリマーは、ポリ ビニルピロリドン、ピランコポリマー、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミ ドフェノール、ポリヒドロキシエチルアスパルタミドフェノール又はパルミトイ ル残基で置換したポリエチレンオキシドポリリシンを包含し得る。さらに、本発 明の化合物は、薬剤の制御放出に有用な生分解性ポリマー種、例えば、ポリ乳酸 、ポリエプシロンカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、 ポリアセタル、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアクリレ ート及びヒドロゲルの架橋結合性若しくは両親媒性ブロックコポリマーに結合し 得る。 以下の実施例は本発明を例示するものであって、本発明は該実施例には限定さ れない。 実施例１ 酵母株Ｕ９の作製 Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株２１５０−２３（ＭＡ Ｔａｌｐｈａ，ｌｅｕ２−０４，ａｄｅｌ，ｃｉｒ^o）は、Ｌｅｌａｎｄ Ｈａ ｒｔｗｅｌｌ博士（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｓｅ ａｔｔｌｅ，ＷＡ）から得た。株２１５０−２−３を、５ｍｌのＹＥＨＤ培地〔 Ｃａｒｔｙら，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏ．２（１９８７）１１７−１２１〕中３ ０℃で一晩増殖させた。細胞を滅菌蒸留水で３回洗浄し、２ｍｌの滅菌蒸留水に 再懸濁し、ｕｒａ３突然変異体（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａ ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）を 選択するために、０．１ｍｌずつの細胞懸濁液を６個の５−フルオロ−オロット 酸（ＦＡＯ）プレート上に入れ、３０℃でインキュベートした。該培地は、２５ ０ｍｌ蒸留水当たり：ア ミノ酸及び硫酸アンモニウムを含まない、３．５ｇのＤｉｆｃｏ Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｏｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ；０．５ｇの５−フルオロ−オロット酸；２５ｍ ｇのウラシル；及び１０．０ｇのデキストロースを含んでいた。 ０．２μｍの膜を通して濾過して培地を殺菌し、次いで、５０℃に維持した４ ％Ｂａｃｔｏ−Ａｇａｒ（Ｄｉｆｃｏ）２５０ｍｌ、アデニンの１．２ｍｇ／ｍ ｌ溶液１０ｍｌ及びＬ−ロイシン溶液（１８０ｍｇ／５０ｍｌ）５ｍｌと混合し た。得られた培地をペトリ皿１個当たり２０ｍｌで分注した。 インキュベーションしてから５日後、多くのコロニーが出現した。初期ＦＯＡ プレート由来のコロニーから新鮮なＦＯＡプレート上に再画線培養（ｒｅｓｔｒ ｅａｋ）して単コロニーを分離し、次いで、３０℃でインキュベートした。第２ セットのＦＯＡプレート由来の数個のコロニーを、ＹＥＨＤプレート及びウラシ ルを欠くプレート上にレプリカプレーティングして、ｕｒａ３突然変異の存在に ついてテストした。ＹＥＨＤ上で所望の良好な増殖が見られ、ウラシルを欠く培 地上では増殖が見られなかった。これらの特性を示す１つの分離体（Ｕ９）を得 た。該分離体を、後 で使用するめに、凍結グリセロール保存体（株３２５号）として−７０℃で保存 した。 実施例２ 酵母ＭＮＮ９遺伝子を破壊するためのベクターの作製 ＭＮＮ９遺伝子を破壊（ｄｉｓｒｕｐｔ）するためのベクターを作製するため には、先ず、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのゲノムＤＮＡからＭＮＮ９遺伝子をク ローン化する必要があった。これは、標準ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法に より行った。全長のＭＮＮ９コード配列のＰＣＲ用５′センスプライマーと３′ アンチセンスプライマーを、酵母ＭＮＮ９遺伝子（Ｚｙｍｏｇｅｎｅｔｉｃｓ： ＥＰＯ特許出願第８８１１７８３４．７号，公開番号０−３１４−０９６−Ａ２ ）の公開配列に基づいて設計した。フランキングＨｉｎｄIII部位（下線）を含 む以下のオリゴデオキシヌクレオチドプライマーを用いた： ＭＮＮ９遺伝子の開始メチオニンコドンは太字で強調 している。ＰＣＲは、テンプレートとしてＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＪＲＹ１ ８８（Ｒｉｎｅら）由来のゲノムＤＮＡ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒ ｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）及び２５サイクルの増幅（９４℃で１分、３７℃で２分、 ７２℃で３分）を用いて行った。得られた１．２ｋｂｐのＰＣＲ断片をＨｉｎｄ IIIで消化、ゲル精製し、ＨｉｎｄIII消化し且つアルカリ−ホスファターゼで処 理したｐＵＣ１３（Ｐｈａｒ−ｍａｃｉａ）と連結した。得られたプラスミドを ｐ１１８３と称した。 酵母ＵＲＡ３遺伝子でＭＮＮ９遺伝子を破壊するために、（ｐＢＲ３２２のＨ ｉｎｄIII部位にサブクローン化したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＵＲＡ３遺伝 子をコードする１．１ｋｐｂのＨｉｎｄIII断片を含む）プラスミドｐＢＲ３２ ２−ＵＲＡ３をＨｉｎｄIIIで消化し、機能性ＵＲＡ３遺伝子を有する１．１ｋ ｂｐのＤＮＡ断片をゲル精製し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とし、次 いで、ＰｍｌＩで消化したプラスミドｐ１１８３（ＰｍｌＩがＭＮＮ９コード配 列内部を切断する）と連結した。得られたプラスミドｐ１１９９は、機能性ＵＲ Ａ３遺伝子によるＭＮＮ９遺伝子の破壊体を含む。 実施例３ ＭＮＮ９遺伝子破壊体を含むＵ９誘導体株１３７２の構築 酵母株Ｕ９（＃３２５）のＭＮＮ９遺伝子を破壊するために、３０μｇのプラ スミドｐ１１９９をＨｉｎｄIIIで消化して、線状ｍｎｎ９：：ＵＲＡ３破壊カ セットを作成した。スフェロプラスト法（Ｈｉｎｎｅｎら，１９７８，Ｐｒｏｃ ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：１９２９−１９３３）に従い、 株３２５の細胞を、ＨｉｎｄIIIで消化したｐ１１９９ＤＮＡで形質転換し、ウ ラシルを欠き、１．０Ｍソルビトールを含む合成寒天培地上で形質転換体を選択 した。該合成培地は、蒸留水１リットル当たり：寒天、２０ｇ；アミノ酸を含ま ない酵母窒素ベース、６．７ｇ；アデニン、０．０４ｇ；Ｌ−チロシン、０．０ ５ｇ；ソルビトール、１８２ｇ；グルコース、２０ｇ；及びＬｅｕｃｉｎｅ Ｍ ｉｎｕｓ Ｓｏｌｕｓｉｏｎ＃２、１０ｍｌを含んでいた。Ｌｅｕｃｉｎｅ Ｍ ｉｎｕｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ＃２は、蒸留水１リットル当たり：Ｌ−アルギニン 、２ｇ；Ｌ−ヒスチジン、１ｇ；Ｌ−ロイシン、６ｇ；Ｌ−イソロイシン、６ｇ ；Ｌ−リシン、４ｇ；Ｌ−メチオニン、１ｇ；Ｌ−フェニルアラニン、６ｇ；Ｌ −トレオニン、６ ｇ；Ｌ−トリプトファン、４ｇを含む。 プレートを３０℃で５日間インキュベートしたが、その間に多くのコロニーが 出現した。１０個のコロニーから染色体ＤＮＡ調製物を作り、次いで、ＥｃｏＲ Ｉ＋ＨｉｎｄIIIで消化した。次いで、ＤＮＡ消化体を、プローブとして（プラ スミドｐ１１９９から分離した）ＭＮＮ９遺伝子を有する１．２ｋｂｐのＨｉｎ ｄIII断片を用いるサザーンブロット（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕ ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９８９）により評価した。サザーンブロット上で予測ＤＮＡバンドシフトを示 し、且つｍｎｎ９突然変異体に典型的な極端な凝集性（ｃｌｕｍｐｉｎｅｓｓ） を示す分離体を同定した（株＃１３７２）。 実施例４ 酵母ＨＩＳ３遺伝子の破壊用ベクターの構築 Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＨＩＳ３遺伝子がＵＲＡ３遺伝子で破壊される破 壊カセットを構築するために、プラスミドＹＥｐ６（Ｋ．Ｓｔｒ−ｕｈｌら，１ ９７９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：１０３５） をＢａｍＨＩで消化し、ＨＩＳ３遺伝子を有する１．７ｋｂｐのＢａｍＨＩ断片 をゲル精製し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とし、あらかじめＢａｍＨＩ で消化し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理しておいたｐＵＣ１８と連結した。 得られた（ｐ１５０１又はｐＵＣ１８−ＨＩＳ３と称される）プラスミドを（Ｈ ＩＳ３コード配列内部を切断する）ＮｈｅＩで消化し、ベクター断片をゲル精製 し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とし、次いで、仔ウシ腸アルカリホス ファターゼで処理した。ＨｉｎｄIIIで消化して、ＵＲＡ３遺伝子をプラスミド ｐＢＲ３２２−ＵＲＡ３から分離し、ＵＲＡ３遺伝子を有する１．１ｋｂｐ断片 をゲル精製し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とし、上記のｐＵＣ１８−Ｈ ＩＳ３ ＮｈｅＩ断片と連結した。得られた（ｐＵＣ１８−ｈｉｓ３：：ＵＲＡ ３又はｐ１５０５と称される）プラスミドは、酵母ＨＩＳ３遺伝子を機能性ＵＲ Ａ３遺伝子で破壊する破壊カセットを含む。 実施例５ ＨＩＳ３遺伝子による酵母ＰＲＢＩ遺伝子破壊用ベクターの構築 Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＰＲＢ１遺伝子を保有する プラスミドＦＰ８ΔＨは、Ｃａｒｎｅｇｉｅ−Ｍｅｌｌｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉ ｔｙのＥ．Ｊｏｎｅｓ博士から提供された（Ｃ．Ｍ．Ｍｏｅｈｌｅら， １９８ ７，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １１５：２５５−２６３）。該プラスミドをＨｉｎｄII I＋ＸｈｏＩで消化し、ＰＲＢ１遺伝子を保有する３．２ｋｂｐのＤＮＡ断片を ゲル精製し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理して平滑末端とした。プラスミド ｐＵＣ１８をＢａｍＨＩで消化、ゲル精製し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理 して平滑末端とした。得られたベクター断片を上記のＰＲＢ１遺伝子断片に連結 して、プラスミドｐＵＣ１８−ＰＲＢ１を得た。ＨＩＳ３遺伝子を含むプラスミ ドＹＥｐ６をＢａｍＨＩで消化した。得られた、機能性ＨＩＳ３遺伝子を保有す る１．７ｋｂｐのＢａｍＨＩ断片をゲル精製し、次いで、Ｔ４ ＤＮＡポリメラ ーゼで処理して平滑末端とした。プラスミドｐＵＣ１８−ＰＲＢ１を、（ＰＲＢ １コード配列内で切断する）ＥｃｏＲＶ＋ＮｃｏＩで消化してプロテアーゼＢ活 性部位及びフランキング配列を除去した。ｐＵＣ１８中のＰＲＢ１コード配列の 残りの５′及び３′部分を保有する５．７ｋｂｐのＥｃｏＲＶ−ＮｃｏＩ断片を ゲル精製し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理して 平滑末端とし、仔ウシ腸アルカリホスファターゼで脱リン酸化して、上記の平滑 末端ＨＩＳ３断片と連結した。得られた、（ｐＵＣ１８−ｐｒｂ１：：ＨＩＳ３ 、保存株＃１２４５と称される）プラスミドは、上記のように欠失したＰＲＢ１ 遺伝子部分の代わりに機能性ＨＩＳ３遺伝子を含む。 実施例６ ＭＮＮ９遺伝子及びＰＲＢ１遺伝子の破壊体を含むＵ９関連酵母株の構築 ＭＮＮ９遺伝子破壊体を含むＵ９関連株１３７２は実施例３に記載した。株１ ３７２のクローン分離体を、（実施例１に記載のように）ＦＯＡプレート上で継 代して、ｕｒａ３突然変異体を選択した。株１３７２からいくつかのｕｒａ３分 離体を得、引き続きＨＩＳ３遺伝子を破壊するために１つの特定の分離体（株１ ２９３０−１９０−Ｓ１−１）を選択した。ｐＵＣ１８−ｈｉｓ３：：ＵＲＡ３ 遺伝子破壊ベクター（ｐ１５０５）をＸｂａＩ＋ＥｃｏＲＩで消化して、線状ｈ ｉｓ３：：ＵＲＡ３破壊カセットを形成し、酢酸リチウム法〔Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９４：２９０（１９９１）〕による株１２ ９３０−１９０−Ｓ１−１の形質転換に用いた。ウラシルを欠く合成寒天培地上 でＵｒａ⁺形質転換体を選択し、該培地上でクローン分離体を再画線培養し、次 いで、ウラシル又はヒスチジンを欠く培地上にレプリカプレートして、該分離体 をＵｒａ⁺及びＨｉｓ^-であるものについてスクリーニングした。引き続きＰＲＢ １遺伝子を破壊するために１つの分離体（株１２９３０−２３０−１）を選択し た。ＰＲＢ１遺伝子破壊ベクター（ｐＵＣ１８−ｐｒｂ１：：ＨＩＳ３、保存株 ＃１２４５）をＳａｃＩ＋ＸｂａＩで消化して、線状ｐｒｂ１：：ＨＩＳ３破壊 カセットを形成し、酢酸リチウム法による株１２９３０−２３０−１の形質転換 に用いた。ヒスチジンを欠く寒天培地上でＨｉｓ⁺形質転換体を選択し、該培地 上でクローン分離体を再画線培養した。得られたＨｉｓ⁺分離体のいくつかから ゲノムＤＮＡを作製し、ＥｃｏＲＩで消化、次いで、０．８％アガロースゲル上 で電気泳動させた。次いで、放射性標識した６１７ｂｐプローブを用い、以下の オリゴデオキシヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲで作製しておいたＰＲＢ １遺伝子についてサザーンブロット分析を行った： プローブと２．４４ｋｐｂのｐｒｂ１：：ＨＩＳ３ ＤＮＡ断片との予測ハイ ブリダイゼーションを示した１１個の分離体を得た。これは、該プローブと野生 型ＰＲＢ１遺伝子の１．５９ｋｂｐの断片とのハイブリダイゼーションとは対照 的であった。所望の破壊ｐｒｂ１：：ＨＩＳ３を含むこれらの分離体のうちの１ つをその後の使用のために選択し、株＃１５５８と称した。 実施例７ 酵母ＰＥＰ４遺伝子破壊用ベタターの構築 下記の方法で酵母ゲノムライブラリーからＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＰＥＰ ４遺伝子をクローン化した。酵母ゲノムライブラリーｐＬＳ１０１（Ｓｃｈｕｌ ｔｚ及びＦｒｉｅｓｅｎ，１９８３，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５５：８−１ ４）を含むＥ．ｃｏｌｉ細胞を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む５ｍｌ のＬＢ培地中で一晩増殖させた。この培養株から、１０^-4及び１０^-5稀釈物をＬ Ｂ＋アンピシリンプレート上で平板培養した。ニトロセルロースフィルターを用 いて、コロニープレートリフトを作製した。Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ｐＬ Ｓ１０１酵母ライブ ラリー由来の全プラスミドＤＮＡ、及びＰＥＰ４の公表ＤＮＡ配列〔Ｃ．Ａ．Ｗ ｏｏｌｆｏｒｄら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：２５００（１９８６）〕 に基づいて設計した以下のオリゴデオキシヌクレオチドプライマー、を用いるＰ ＣＲにより、酵母ＰＥＰ４遺伝子用の６００ｂｐプローブを作製した： ２５サイクルの増幅（９４℃で１分、３７℃で２分、７２℃で３分）によりＰ ＣＲを行った。ＰＣＲプローブをゲル精製し、放射性標識して、上記コロニーフ ィルターとハイブリダイズさせた。単コロニーを得るために、ＰＥＰ４プローブ とのハイブリダイゼーションで陽性だったいくつかのコロニーをＬＢ＋アンピシ リンプレート上で再画線培養した。いくつかの分離体からアルカリ−ＳＤＳ溶解 （Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前掲）によりプラスミドＤＮＡを作製し、ＢａｍＨＩで 消化した。予測した１４ｋｂｐのベクターバンド及び６．９ｋｂｐのＰＥＰ４挿 入体バンドが認められた。ＥｃｏＲＩ＋ＸｈｏＩで二重消化すると、予測した１ ．５ｋｂｐのＰＥＰ４バンドが認められた。予測結果 を示す１つの分離体（Ｅ．ｃｏｌｉ株＃８６０）をその後の使用のために選択し た。Ｅ．ｃｏｌｉ株＃８６０由来のプラスミドＤＮＡをＢａｍＨＩで消化し、染 色体ＰＥＰ４遺伝子を有する６．９ｋｂｐのＢａｍＨＩ ＤＮＡ断片を、ｐＵＣ １３のＢａｍＨＩ部位にサブクローン化して、プラスミドｐ８９０を得た。次い で、プラスミドｐ８９０を（ＰＥＰ４コード配列内で切断する）ＮｃｏＩで消化 、ゲル精製し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで処理して平滑末端とし、（実施例２の ように調製した）機能性ＵＲＡ３遺伝子を有する１．１ｋｂｐの平滑末端断片と 連結した。得られた、ＵＲＡ３遺伝子で破壊したＰＥＰ４遺伝子を含むプラスミ ドをｐＵＣ１３−ｐｅｐ４：：ＵＲＡ３（株＃９０６）と称した。 実施例８ ｐｒｂ１及びｐｅｐ４突然変異体を共に含む株Ｕ９の誘導体である酵母株＃１５ ６９、＃１５３８及び＃１５９２の構築 酵母株Ｕ９のＨＩＳ３遺伝子を破壊するために、破壊ベクターｐＵＣ１８−ｈ ｉｓ３：：ＵＲＡ３をＥｃｏＲＩ＋ＸｂａＩで消化し、次いで、酢酸リチウム法 による酵母株 Ｕ９の形質転換に用いた。ウラシルを欠く寒天培地上でＵｒａ⁺形質転換体を選 択し、クローン分離体を得るために該培地上で再画線培養した。次いで、得られ たＵｒａ⁺分離体のいくつかを、ウラシル又はヒスチジンのいずれかを欠く寒天 培地上にレプリカプレートし、Ｕｒａ⁺及びＨｉｓ^-であるものについてスクリー ニングした。その後のＰＲＢ１遺伝子破壊のために１つの分離体（株＃１５２４ ）を選択した。ＰＲＢ１遺伝子破壊ベクターｐＵＣ１８−ｐｒｂ１：：ＨＩＳ３ をＳａｃＩ＋ＸｂａＩで消化し、次いで、該ベクターを酢酸リチウム法による株 ＃１５２４の形質転換に用いた。ヒスチジンを欠く寒天培地上でＨｉｓ⁺形質転 換体を選択し、該培地上で、クローン分離体を得るために再画線培養した。Ｈｉ ｓ⁺分離体のいくつかからゲノムＤＮＡを作製し、放射性標識したＰＲＢ１プロ ーブとのサザーンブロットハイブリダイゼーションを評価した。ＨＩＳ３による 所望のＰＲＢ１遺伝子破壊（即ち、ｐｒｂ１：：ＨＩＳ３）を示す分離体のうち の１つ（株＃１５３７）をその後のＰＥＰ４遺伝子破壊用に選択した。株＃１５ ３７をＦＯＡプレート上で継代して、ｕｒａ３分離体を得、その後の使用のため に１つの分離体（株＃１５４１） を選択した。 株＃１５４１のＰＥＰ４遺伝子を破壊するために、ＰＥＰ４遺伝子破壊ベクタ ーｐＵＣ１３−ｐｅｐ４：：ＵＲＡ３をＸｈｏＩで消化して、線状ｐｅｐ４：： ＵＲＡ３破壊カセットを形成し、酢酸リチウム法による株＃１５４１の形質転換 に用いた。ウラシルを欠く寒天培地上でＵｒａ⁺形質転換体を選択し、該培地上 で、クローン分離体を得るために画線培養した。得られたＵｒａ⁺形質転換体の いくつかからゲノムＤＮＡを作製し、放射性標識したプローブを用いるサザーン ブロットによりＰＥＰ４遺伝子について評価した。その後の使用のために、ＵＲ Ａ３による所望のＰＥＰ４遺伝子破壊を示す１つの分離体（株＃１５６９）を選 択した。別個の実験で、実質的に同じステップ順序に従って株＃１５３８を構築 した。株＃１５３８は株Ｕ９の誘導体である。株＃１５３８は、ｐｒｂ１及びｐ ｅｐ４の突然変異を共に含んでいる。さらに、ＦＯＡプレート上で継代して株＃ １５６９のｕｒａ３誘導体を得た。得られた株＃１５６９のｕｒａ３誘導体を株 ＃１５９２と称した。 実施例９ 生検からの核酸の抽出 ２５歳の出産後の女性患者から大きな尖形外陰コンジローム病変を得た。該病 変の断片を液体窒素中で凍結し、次いで、Ｂｒａｕｎ ｍｉｋｒｏｄｉｓｍｅｍ ｂｒａｔｏｒII（Ｂ．Ｂｒａｕｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ，Ｍｅｌｓｕｎｇｅｎ ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で処理した。得られた物質を０．６％（ｗ／ｖ）ドデシル硫 酸ナトリウム（ＳＤＳ）で可溶化し、プロテイナーゼＫ（５０μｇ／ｍｌ）で処 理、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールで抽出した。ＤＮＡをエ タノール沈殿させ、ＵＶ分光光度計で定量した。アガロースゲル電気泳動、次い で、臭化エチジウムで染色することにより、高分子量ＤＮＡの存在を確認した。 実施例１０ ＨＰＶ ＤＮＡの型分類 ＶｉｒａＴｙｐｅ Ｐｌｕｓ（Ｄｉｇｅｎｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｂｅ ｌｔｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）として市販されているハイブリッド捕獲アッセイを用 いて、ＨＰＶ ＤＮＡ型を決定した。用いたＨＰＶプローブを、その組成が各型 と生殖管の悪性度との関連に基づくく２つのプールに分割した。プローブ群Ａは 、「低リスク」のＨＰＶ６、１１、４２、４３及び４４型を含み、プローブＢは 、「高リ スク」の１６、１８、３１、３３、３５、４５、５１、５２及び５６型を含んで いた。全ＤＮＡを、ＰｓｔＩ、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄIIIで消化し、高ストリ ンジェンシー条件（Ｔ_m−１５℃）下にサザーンブロットを実施して、ＨＰＶの 亜型を決定した。 実施例１１ ＨＰＶ６ａゲノムのクローニング ＨＰＶ６ａ陽性生検試料から抽出した全ＤＮＡをＨｉｎｄIIIエンドヌクレア ーゼで消化した。０．８％低融解温度アガロース分離ゲルを通してサイズ分別し た後、〜８ｋｂｐのＤＮＡに対応する領域をゲルから切り出し、アガロースをゲ ラーゼ^{( 商標)}酵素（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ． ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）で消化した。試料を、ＨｉｎｄIIIで消化し、脱リン 酸化しておいたｐＵＣ１８（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｉｎｃ．Ｐｉｓｃａｔａｗａ ｙ，ＮＪ）と連結した。コンピテントＥ．ｃｏｌｉＤＨ５細胞（Ｇｉｂｃｏ，Ｂ ＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を形質転換した後、ＨＰＶ６ｂＬ１遺 伝子（５′−ＧＡＧ ＡＧＡ ＴＣＴ ＴＡＣ ＣＴＴ ＴＴＡ ＧＴＴ ＴＴ Ｇ ＧＣＧ ＣＧＣ ＴＴＡ Ｃ−３′）の３′− 末端に相補的なアンチセンス³²Ｐ−標識オリゴデオキシヌクレオチドを用いるコ ロニーハイブリダイゼーションにより、プラスミドライブラリーをＨＰＶ６ａ陽 性クローンについてスクリーニングした。８．１ｋｂｐのＨＰＶ６ａゲノムを含 むｐＵＣ１８プラスミドを分離し、制限酵素及びサザーンブロット分析により特 性決定した。このプラスミドをｐＵＣ１８−ＨＰＶ６ａと称した。Ｑｉａｇｅｎ^{( 商標)} Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉキット（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ.,Ｃｈａｔｓｗ ｏｒｔｈ，ＣＡ）を用いてプラスミドＤＮＡを作製した。 実施例１２ ｐＵＣ１８−ＨＰＶ６ａの配列分析 完全なＨＰＶ６ａ配列を決定するために、公表されたＨＰＶ６ｂ配列に基づい て配列決定プライマーを合成した。完全な８．１ｋｂｐのＨＰＶ６ａゲノムの両 方のＤＮＡ鎖を、製造業者の指示（ＡＢＩ，Ｉｎｃ．Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）に従って、ＰＲＩＳＭ^（商標）キット及びＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓ ｔｅｍｓ（ＡＢＩ）自動配列決定装置（３７３Ａ）を用いる（ジデオキシ）チェ インターミネーター法により配列決定した。センス配列とアンチセン ス配列とがマッチしなかった場合、追加のＨＰＶ６ａ特異的プライマーを当該領 域全体にわたり両方向で再配列決定して一致を得るように合成した。 ＨＰＶ６ａ及びＨＰＶ６ｂのＤＮＡ配列は、９７％を超える相同性を示し、８ ０１０ｂｐのうち合計２２９ｂｐの変化が確認された。ＨＰＶ６ｂ配列と比べて 最も著しい差異が、長い制御配列（ＬＣＲ；ｎｔ７２０６−ｎｔ１０６）に認め られた。ＨＰＶ６ａ ＬＣＲにおけるいくつかの単ヌクレオチド（ｎｔ）の変化 とは別に、ｎｔ７３５０に９４ｂｐの挿入体が、またｎｔ７８０４にも別の１９ ｂｐの挿入体が認められた。ｎｔ７６１５では、ＨＰＶ６ａゲノムから６つの塩 基対が欠失していた。 実施例１３ ＨＰＶ６ａＬ１酵母発現ベクターの構築 ＰＣＲ用のテンプレートとしてＨＰＶ６ａ型ＤＮＡを用いた。Ｖｅｎｔポリメ ラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）、３５サイクル の増幅（９４℃で１分、４８℃で１分、７２℃で１分４５秒）及びフランキング ＢｇｌII部位（下線）を含む下記のオリゴデオキシヌクレオチドプライマーを用 いるＰＣＲにより、ＨＰＶ６ ａ Ｌ１遺伝子を増幅した： センスプライマーは、ＨＰＶ６ａ Ｌ１開始メチオニンコドン（太字で強調し てある）に対してすぐ上流の酵母非翻訳リーダー配列を導入する。１．５ｋｂｐ のＬ１ ＰＣＲ産物をＢｇｌIIで消化し、ゲル精製した。両側がそれぞれ酵母Ａ ＤＨ１転写ターミネーター〔Ｂｅｎｎｔｚｅｎ，Ｊ．Ｌ．及びＨａｌｌ，Ｂ．Ｄ ．（１９８２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：３０１８−３０２５〕のコピ ーでフランキングされたプラスミドｐＢＭ２７２（Ｍａｒｋ Ｊｏｈｎｓｔｏｎ 博士,Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓから恵 与）由来のダイバージェントのＧＡＬ１／ＧＡＬ１０プロモーターを含む二方向 型ＧＡＬプロモーターベクターｐＵＣ１８−ＧＡＬ１ｐ−ＧＡＬ１０ｐから１． ４ｋｂｐのＳｐｈＩ断片を分離し、ＧＡＬ１プロモーターとＡＤＨ１転写ターミ ネーターの最初のコピーとの間に位置するＢａｍＨＩ部位、及びダイバージ ェントのＧＡＬ１０プロモーターとＡＤＨ１転写ターミネーターの２番目のコピ ーとの間に位置するＳｍａＩクローニング部位、にクローニングして、ｐＧＡＬ １０発現ベクターを構築した。ｐＢＲ３２２、酵母ＬＥＵ２−ｄ遺伝子、及びＳ ｐｈＩを有する２μｍの酵母環状体（ｃｉｒｃｌｅ）からなる酵母シャトルベク ターを１．４ｋｂｐのＳｐｈＩＧＡＬプロモーター断片と連結した。得られたベ クター、ｐＧＡＬ１０、をＧＡＬ１プロモーターとＡＤＨ１転写ターミネーター との間で切断するＢａｍＨＩを用いて線状にした。ＢａｍＨＩで消化したｐＧＡ Ｌ１０ベクターとＢｇｌIIで消化したＨＰＶ６ａ Ｌ１ ＰＣＲ断片とを連結し 、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５細胞（ＢＲＬ）の形質転換に用いた。ＨＰＶ６ａ Ｌ１ 遺伝子を含むｐＣ１／１−ＧＡＬプラスミドを分離し、ｐ１３１７３−３５７− ６と称した。ｐ１３１７３−３５７−６のＬ１遺伝子を配列決定する（ＡＢＩ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ ３７３Ａ）と、ｐＵＣ１８−ＨＰＶ６ａクローンのＬ１遺 伝子と同一であることが証明された。 実施例１４ ＨＰＶ６ａ Ｌ１及びＬ２酵母発現ベクターの構築 プラスミドｐ１３１７３−３５７−６（ｐＧＡＬ１０＋ＨＰＶ６ａ Ｌ１）を 、ＧＡＬ１０プロモーターとＡＤＨ１転写ターミネーターとの間で切断するＳｍ ａＩで消化した。テンプレートとしてのｐＵＣ１８−ＨＰＶ６ａＤＮＡ、Ｖｅｎ ｔポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）、１０ サイクルのＰＣＲ増幅（９４℃で１分；４８℃で１分；７２℃で１分４５秒）、 及びフランキングＳｍａＩ部位（下線）を含む下記のオリゴデオキシヌクレオチ ドプライマーを用いるＰＣＲにより、１．４ｋｂｐのＨＰＶ６ａ Ｌ２遺伝子を 増幅した： センスプライマーは、ＨＰＶ６ａＬ２開始メチオニンコドン（太字で強調して ある）に対してすぐ上流の酵母非翻訳リーダー配列を導入する。ＰＣＲ断片をＳ ｍａＩで消化し、ゲル精製して、ＳｍａＩで消化したｐ１３１７３−３５７−６ プラスミドと連結した。ＨＰＶ６ａＬ１及びＬ２遺伝子の両方を含むｐＧＡＬ１ ０プラスミドを分離し、ｐ １４０４９−７−２と称した。Ｌ２遺伝子の配列決定（ＡＢＩ Ｓｅｑｕｅｎｃ ｅｒ ３７３Ａ）により、該遺伝子がｐＵＣ１８−ＨＰＶ６ａクローンのＬ２遺 伝子と同一であることが判明した。 実施例１５ 酵母におけるＨＰＶ６ａ Ｌ１の発現並びにＨＰＶ６ａＬ１及びＬ２の同時発現 プラスミドｐ１３１７３−３５７−６（ｐＧＡＬ１０＋ＨＰＶ６ａ Ｌ１）と 、ｐ１４０４９−７−２（ｐＧＡＬ１０＋ＨＰＶ６ａ Ｌ１及びＬ２）とを用い て、Ｓ．ｃｅｒｖｉｓｉａｅ株＃１５６９（ＭＡＴＡａ，ｌｅｕ２−０４、ｐｒ ｂｌ、ａｄｅｌ、ｐｅｐ４，ｃｊｒ^o）及び＃１５５８（ＭＡＴａ，ｌｅｕ２− ０４、ｐｒｂｌ、ｍｎｎ９、ａｄｅ１、ｃｉｒ^o）を形質転換した。宿主株＃１ ５５８を用いて得られた組換え株は、表に示されている株＃１６４４（ＨＰＶａ Ｌ１）及び＃１６７０（ＨＰＶ６ａ Ｌ１＋Ｌ２）であった。クローン分離体 を、２％ガラクトースを含むＹＥＨＤ培地中３０℃で６０〜７８時間増殖させた 。細胞を収穫した後、細胞ペレットをガラスビーズで破壊し、イムノブロット分 析により、細胞溶解物をＨＰＶ６ａ Ｌ１ 又はＨＰＶ６ａ Ｌ２タンパク質の発現について分析した。還元・変性条件下に 、４０μｇの全細胞タンパク質を含む試料を１０％トリス−グリシンゲル上で電 気泳動させ、ニトロセルロースフィルター上に電気ブロットした。一次抗体とし てｔｒｐＥ−ＨＰＶ１１融合タンパク質（Ｂｒｏｗｎ，Ｄ．Ｒ．ら，Ｖｉｒｏｌ ｏｇｙ ２０１：４６−５４）に対するウサギ抗血清を、また二次抗体としてロ バ抗ウサギＩｇＧ西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合全抗体（Ａｍｅｒ ｓｈａｍ，Ｉｎｃ．）を用いて、Ｌ１タンパク質を免疫検出した。化学ルミネセ ントＥＣＬ^（商標）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｉｎｃ． ）を用いてフィルターを処理した。陰性対照（Ｌ１又はＬ２遺伝子を含まないベ クター対照）以外の全ての試料に５０〜５５ｋＤａのＬ１タンパク質バンドが検 出された。 一次抗体として、実質的にＣａｒｔｅｒらの方法に従って調製したｔｒｐＥ− ＨＰＶ６ａ Ｌ２融合タンパク質を用いて３回免疫感作したマウス由来の１：２ ５０稀釈血清を、また二次抗体としてＨＲＰ結合ヒツジ抗マウスＩｇＧ（Ａｍｅ ｒｓｈａｍ，Ｉｎｃ．）（１：１０００稀釈）を用いるウエスタン分析により７ ０ｋＤａのタンパク質バン ドとしてＬ２タンパク質を検出した。 ＥＭ分析（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｐｒｏｂｅ，Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ，Ｐ Ａ）の場合、各試料のアリコートを２００メッシユの炭素コーティング銅グリッ ド上に置いた。１滴の２％リンタングステン酸（ＰＴＡ）、ｐＨ７．０をグリッ ド上に２０秒間置いた。ＴＥＭ検査に先立ち、グリッドを風乾した。１００ＫＶ の加速電圧でＪＥＯＬ １００ＣＸ透過電子顕微鏡（ＪＥＯＬ ＵＳＡ，Ｉｎｃ ．）を用いて、全顕微鏡検査を行った。作製された顕微鏡写真は、１００，００ ０×の最終倍率を有する。 ＨＰＶ６ａ Ｌ１プラスミドか、ＨＰＶ６ａ Ｌ１及びＬ２同時発現プラスミ ドを有する全ての酵母試料に、５０〜５５ｎｍの直径範囲のＶＬＰが認められた 。酵母対照試料にはＶＬＰは認められなかった。 実施例１６ ＨＰＶ６ａＬ１＋Ｌ２（株＃１６７０）の発酵 株１６７０を平板培養した表面増殖体を、（培地１リットル当たり）：アミノ 酸及び硫酸アンモニウムを含まない８．５ｇのＤｉｆｃｏ酵母窒素ベース；０． ２ｇのアデニン；０．２ｇのウラシル；１０ｇのコハク酸；５ｇの硫酸 アンモニウム；及び０．２５ｇのＬ−チロシンを含む、無ロイシン液体培地に無 菌的に移した。この培地は、滅菌する前にＮａＯＨを加えてｐＨを５．０−５． ３に調整した。回転振とう機上２５０ｒｐｍで２５時間２８℃で増殖させた後、 滅菌グリセロールを加えて最終濃度を１７％（ｗ／ｖ）にして凍結培養バイアル を作製し、−７０℃で保存した（低温バイアル１個当たり１ｍｌ）。該培地（２ Ｌ容量フラスコ１個当たり５００ｍｌ）中で株１６７０の発酵用接種原を増殖さ せ、２つの凍結培養バイアルから解凍した内容物を２Ｌ容量のフラスコに移し、 回転振とう機上２５０ｒｐｍで２５時間２８℃でインキュベートして発酵を開始 した。株１６７０の発酵には、接種後１０Ｌ作業容量でＮｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉ ｃｋ ＳＦ−１１６発酵槽を用いた。用いた産生培地は、（１リットル当たり） ：２０ｇのＤｉｆｃｏ酵母エキス;１０ｇのＳｈｅｆｆｉｅｌｄ ＨｙＳｏｙペ プトン；２０ｇのグルコース；２０ｇのガラクトースを含んでいた。該培地は、 滅菌前にｐＨ５．３に調整した。２Ｌ容量の接種原フラスコの全内容物（５００ ｍｌ）を発酵槽に移し、２８℃、毎分５Ｌの空気、４００ｒｐｍ、圧力３．５ｐ ｓｉでインキュベートした。必要に応じて攪拌 数を増大させ、４０％を超える溶解酸素飽和レベルに維持した。発酵の進行をオ フライングルコース測定法（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｇｌｕｃｏｓｅ ２ Ａｎａｌｙ ｚｅｒ）及びオンライン質量分光計（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ １２００）で モニターした。６９時間インキュベートした後では、１リットル当たり９．９ｇ 乾燥細胞重量の細胞密度に達した。培養体をホローファイバー濾過（Ａｍｉｃｏ ｎ ＤＣ−１０濾過システムのＡｍｉｃｏｎ Ｈ５ＭＰ０１−４３カートリッジ ）により約２Ｌに濃縮し、２Ｌのリン酸緩衝塩水で透析濾過（ｄｉａｆｉｌｔｅ ｒ）し、さらに（約１Ｌに）濃縮して、５００ｍｌ容量の遠心ボトルに分配した 。細胞ペレットを８，０００ｒｐｍで２０分間４℃で遠心した（Ｓｏｒｖａｌ ＧＳ３ローター）。上清をデカントした後、ペレット（合計２２５ｇの湿潤細胞 ）を使用時まで−７０℃で保存した。 実施例１７ 組換えＨＰＶ６ａ Ｌ１＋Ｌ２キャプシドタンパク質の精製 特に断りのない限り、全てのステップは４℃で行った。 株＃１６７０の細胞を−７０℃で凍結保存した。凍結細 胞（湿潤重量＝３８．０ｇ）を２０〜２３℃で解凍し、５０ｍｌの「Ｌ１緩衝液 」（２０ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ７．２、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１．７ ｍＭ ＥＤＴＡ）に再懸濁した。プロテアーゼ阻害剤ＰＭＳＦ及びペプスタチン Ａを加えて、それぞれ、２ｍＭ及び１．７μＭの最終濃度とした。約８，０００ ｐｓｉの圧力下にＭ１１０ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ（Ｍｉｃｒｏｆｌｕ ｉｄｉｃｓ Ｃｏｒｐ．，Ｎｅｗｔｏｎ，ＭＡ）に３回通して細胞スラリーを破 壊した。破壊された細胞スラリーを５，０００×ｇで１０分間遠心して、細胞片 を除去した。Ｌ１＋Ｌ２抗原を含む上清液を回収した。 緩衝液Ａ（２０ｍＭ ＭＯＰＳ，ｐＨ７．０）を加えて上清液を１：５稀釈し 、緩衝液Ａ中で平衡にした、Ｆｒａ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）のアニオン交換捕獲カラ ム（５．０ｃｍ（内径）×４．０ｃｍ）にかけた。緩衝液Ａで洗浄した後、抗原 を、緩衝液Ａ中０→１．０Ｍ勾配のＮａＣｌで溶離した。イムノドットブロッテ ィングを行って、カラムからのどの画分がＬ１タンパク質を含んでいるかを決定 した。 イムノドットブロットで測定してＬ１タンパク質を含む画分を、Ｂｒａｄｆｏ ｒｄ法、次いで、銀染色を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティン グにより全タンパク質についてアッセイした。 同程度の純度及び濃度のＬ１タンパク質を示すＴＭＡＥ画分をプールした。硫 酸アンモニウム分別により抗原を濃縮した。３０分かけてゆるやかに攪拌しなが ら固体試薬を加え、溶液の硫酸アンモニウム飽和度を６３％に調整した。試料を 氷の上に置き、３０分間沈殿を進行させた。試料を１２，０００×ｇで遠心した 。ペレットを２０．０ｍｌのＰＢＳ（６．２５ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ７ ．２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）に再懸濁した。 再懸濁したペレットを、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ ５００ＨＲ樹脂（Ｐｈａｒｍａ ｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）のサイズ排除カラム〔２．６ｃｍ（内径 ）×８９ｃｍ〕上のクロマトグラフィーにかけた。操作時の緩衝液はＰＢＳであ った。クロマトグラフィーは２０〜２３℃で実施した。銀染色を用いるＳＤＳ− ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット検出により、画分を分析した。最も純度の高い 画分をプールし、得られたプールを濃縮した。 コロイドクーマシー染色を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、最終生成物を分析 した。Ｌ１及びＬ２タンパク質は８５％ホモジニアスであると予測された。Ｌ１ 及びＬ２タンパク質を、適切な抗血清を用いるウエスタンブロッティングにより 同定した。最終生成物をアリコートに分けて、−７０℃で保存した。この処理に より、合計３．０ｍｇのタンパク質を得た。 Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｐｒｏｂｅ（Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ）により 、電子顕微鏡分析を行った。試料のアリコートを２００メッシュの炭素コーティ ング銅グリッド上に置いた。該グリッド上に１滴の２％リンタングステン酸、ｐ Ｈ７．０を２０秒間置いた。ＴＥＭ検査の前に、グリッドを風乾した。１００ｋ Ｖの加速電圧でＪＥＯＬ １００ＣＸ透過電子顕微鏡（ＪＥＯＬ ＵＳＡ，Ｉｎ ｃ．）を用いて、全顕微鏡検査を行った。作製された顕微鏡写真は、１００，０ ００Ｘの最終倍率を有する。５０〜５５ｎｍサイズ範囲のウイルス様粒子の存在 が確認された。 実施例１８ ＣＲＰＶ Ｌ１発現ベクターの構築 完全なＣＲＰＶウイルスゲノム（Ｐｅｔｅｒ Ｈｏｗｌ ｅｙ博士，ＮＣＩ）を含むプラスミドｐＬＡIIから、Ｖｅｎｔポリメラーゼ（Ｎ ｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）；３５サイクルの増幅（９ ４℃で１分；５０℃で１分；７２℃で２分）及びフランキングＢｇｌII部位（下 線）を含む以下のオリゴヌタレオチドプライマーを用いるＰＣＲにより、ＣＲＰ Ｖ Ｌ１遺伝子を増幅した： センスプライマーは、ＣＲＰＶ Ｌ１開始メチオニンコドン（太字で強調）の すぐ上流の酵母非翻訳リーダー配列を導入する。１．６ｋｂのＬ１ ＰＣＲ産物 をＢｇｌIIで消化し、ゲル精製して、ベクターｐＳＰ７２（Ｐｒｏｍｅｇａ）の ＢｇｌII部位にサブクローン化し、プラスミドｐＳＰ７２−ＣＲＰＶ−Ｌ１（ｐ １２９３０−３１４−４−１）を得た。 １つのサブクローンを完全に配列決定すると、公表されたＣＲＰＶ Ｌ１配列 とは４つのヌクレオチドが異なることが知見された。この変化によってアミノ酸 は変わらない。 ｐＳＰ７２−ＣＲＰＶ−Ｌ１からＢｇｌII断片としてＬ１遺伝子を切り出し、Ｙ Ｅｐ５２（Ｂｒｏａｃｈら，Ｅｘｐ．Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎ ｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，１９８３，８３：８１−１１６）由来のＧＡＬ１０ プロモーター及び同一ベクターバックボーン中のＡＤＨ１転写ターミネーターを 含む酵母発現ベクターの酵母ＧＡＬ１０プロモーターとＡＤＨ１転写ターミネー ターとの間に位置する単一のＢａｍＨＩ部位にサブクローン化した。得られたプ ラスミドをｐ１２９３０−３２３−６−１と称した。 実施例１９ ＣＲＰＶ Ｌ２発現ベクターの構築 ＳａｌＩで消化し、７．９ｋｂの断片をゲル精製し、該断片をそれ自体と連結 した後のプラスミドｐＬＡIIから、Ｖｅｎｔポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａ ｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）によりＣＲＰＶ Ｌ２遺伝子を増幅した。３ ５サイクルの増幅（９０℃で１分；５０℃で１分；７２℃で２分）及び以下のフ ランキングＥｃｏＲＩ部位（下線）を含むオリゴヌクレオチドプライマーを用い た： センスプライマーは、ＣＲＰＶ Ｌ２開始メチオニンコドン（太字で強調）の すぐ上流の酵母非翻訳リーダー配列を導入する。１．５ｋｂのＰＣＲ産物をＥｃ ｏＲＩで消化し、ゲル精製して、ダイバージェントの酵母ＧＡＬ１／ＧＡＬ１０ プロモーターを含む二方向型プロモーターベクターｐＵＣ１８−ＧＡＬ１ｐ−Ｇ ＡＬ１０ｐのＥｃｏＲＩ部位にサブクローン化した。このベクターは、ＧＡＬ１ プロモーターとＡＤＨ１転写ターミネーターの最初のコピーとの間に位置する単 一のＢａｍＨＩ部位並びに、ＧＡＬ１プロモーターとＡＤＨ１転写ターミネータ ーの２番目のコピーとの間に位置する単一のＥｃｏＲＩ部位及びＳｍａＩ部位を 含む。得られた発現カセットを１．４ｋｂのＳｐｈＩ断片上に移す。ＧＡＬ１０ プロモーターに隣接する所望のＬ２挿入体を含む１つのクローン（ｐ１２９３０ −２９５−２−２）を完全に配列決定すると、公表された配列から６つのヌクレ オチドが変化したことが示され、そのうちの４つはアミノ酸も変化した。初期テ ンプレートのＤＮＡを 配列決定すると、変化はｐＬＡIIにも存在し、これは、ＰＣＲにより導入された ものではないことが確認された。Ｌ２遺伝子を含むｐＵＣ１８−ＧＡＬ１ｐ−Ｇ ＡＬ１０ｐベクターをＳｐｈＩで切断し、ＡＤＨ１ｔ−ＧＡＬ１ｐ−ＧＡＬ１０ ｐ−Ｌ２−ＡＤＨ１ｔ発現カセットを有する２．９ｋｂの断片を、酵母シャトル ベクターの大型Ｓｐｈ１断片と連結した。得られたプラスミドをｐ１２９３０− ３２３−２−３と称した。 実施例２０ 酵母におけるＣＲＰＶ Ｌ１及びＬ２キャプシドタンパク質の発現 プラスミドｐ１２９３０−３２３−６−１及びｐ１２９３０−３２３−２−３ を用いて、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株＃１５６９、＃１５３８、ＢＪ５４６２ 〔Ｅ．Ｗ．Ｊｏｎｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１９４（ １９９１）４２８−４５３〕及びＢＪ１９９５〔Ｊｏｎｅｓ，前掲〕を形質転換 した。クローン分離体を、２％ガラクトースを含むＹＥＨＤ培地中３０℃で４８ 〜７２時間増殖させた。細胞を収穫した後、細胞ペレットをガラスビーズで破壊 し、トリトンＸ−１００を加えて０．５％の 最終濃度とし、得られた細胞溶解物を、イムノブロット分析によりＣＲＰＶ Ｌ １及びＬ２の発現について評価した。４０μｇの全細胞タンパク質を含む試料を 、還元・変性条件下に１２％トリス−グリシンゲル（Ｎｏｖｅｘ）上で電気泳動 させ、ＰＶＤＦ膜（Ｎｏｖｅｘ）上に電気ブロットした。一次抗体としてポリク ローナルウサギ抗Ｌ１又は抗Ｌ２抗血清（Ｈｅｒｓｈｅｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃ ｅｎｔｅｒのＪｏｈｎ Ｋｒｅｉｄｅｒ博士により恵与）を、また二次抗体とし て西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したタンパク質Ａ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｉ ｎｃ．）を用いて、ＣＲＰＶ Ｌ１及びＬ２タンパク質を検出した。化学ルミネ セントＥＣＬ^（商標）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｉｎｃ ．）を用いてＰＶＤＦ膜を処理した。Ｌ１発現プラスミドを有する全ての試料に ５５〜６１ｋＤａのＬ１タンパク質バンドが検出され、Ｌ２発現プラスミドを有 する酵母クローン由来の全ての試料には、〜９０ｋＤａのＬ２タンパク質バンド が検出された。 抗Ｌ２抗血清を用いたときの、Ｌ１発現プラスミドを保有する酵母クローン由 来の試料、又は抗Ｌ１抗血清を用いたときの、Ｌ２発現プラスミドを保有する酵 母クローン由 来の試料ではシグナルは全く検出されなかった（図６）。 これらの発現結果から、その後の実験用に以下の組換え酵母株を選択した：プ ラスミドｐ１２９３０−３２３−６−１を含む宿主株＃１５６９である株＃１５ ８２；及びプラスミドｐ１２９３０−３２３−２−３を含む宿主株＃１５３８で ある株＃１５８３。 実施例２１ Ａ． 組換えＣＲＰＶ Ｌ１キャプシドタンパク質の精製 −７０℃で保存していおいた株＃１５８２の細胞を解凍し、等量の破壊緩衝液 （ｂｒｅａｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）（２０ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ７． ２、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１．７ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁した。該スラリーに 、プロテアーゼ阻害剤ＰＭＳＦ及びペプスタチンＡをそれぞれ２ｍＭ及び１．７ μＭの最終濃度まで加えた。細胞をマイクロフルイダイザー（ｍｉｃｒｏｆｌｕ ｉｄｉｚｅｒ）に１０回通して溶解した。溶解物を５０００×ｇで１０分間遠心 して清澄化した。上清をＬ１緩衝液中の４５％スクロース（ｗ／ｖ）の５ｃｍク ッション上に重層し、Ｌ１を１００，０００×ｇで４時間遠心してペレット化し た。該ペレットを１０分の１容量のＬ１緩衝液に再懸濁し た。再懸濁したペレットを５０００×ｇで１０分間遠心して清澄化した。上清に Ｔｗｅｅｎ−８０を０．０１％の最終濃度まで加え、上清を、室温で、Ｓｅｐｈ ａｃｒｙｌ Ｓ−１０００樹脂（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の１７００ｍｌカラム（ ５ｃｍ（内径））上のサイズ排除クロマトグラフィーにかけて分画した。このカ ラム用の操作緩衝液は、１０ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ７．２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−８０であった。イムノドットブロットアッ セイで得られた免疫反応性物質を含む画分をプールし、直径７６ｍｍのＹＭ−１ ００フラットシート膜（１００，０００ＭＷＣＯ）を備えたＡｍｉｃｏｎ攪拌セ ルを用いた限外濾過により６分の１容量に濃縮した。Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＶ ０． ２２μｍ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通して生成物を減菌濾過した。 Ｂ． 組換えＣＲＰＶ Ｌ１キャプシドタンパク質の特性決定 最終生成物は、ウエスタンブロッティング及びＮ末端配列分析により同定した 。純度は、クーマシー及び銀染色を用いるＳＤＳ／ＰＡＧＥ、並びに２１５ｎｍ での光学検出を用いる溶液ふるいキャピラリー電気泳動〔Ｓｏｌｕｔｉ ｏｎ Ｓｉｅｖｉｎｇ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ （ＳＳＣＥ）〕により評価した。ＳＳＣＥによればＬ１は純度７５％であった。 電子顕微鏡検査により、直径５０〜５５ｎｍのサイズ範囲のＶＬＰが存在するこ とが証明された。 Ｃ． 分析用サイズ排除ＨＰＬＣ ＶＬＰをアッセイするために、サイズ排除クロマトグラフィーに従って試料を 分画した。２００μｌ注入ループを具備したＩＳＳ１００自動注入装置を備えた Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｓｅｒｉｅｓ ４１０ Ｂｉｏｐｕｍｐ ＨＰＬＣ を用いてクロマトグラフィーを実施した。該カラムは、ＴＳＫ−ゲルＧ５０００ ＰＷ、７．５×６００ｍｍ（ＴＯＳＯＨＡＡＳ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌ ｅ，ＰＡ）であった。カラムからのタンパク質の溶出をモニターするために、Ｐ ｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅr−ＬＣ−２３５ダイオードアレイ検出器を用いて２８０ ｎｍで光学検出を行った。移動層は、１０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ ７．２中０．５Ｍ ＮａＣｌであった。流速は０．５ｍｌ／分で、１ｍｌ画分を 補集した。カラムの較正は、Ｓｉｇｍａ社製のタンパク質標準及び組換えＢ型肝 炎表面抗原（Ｒｅｃｏ ｍｂｉｖａｘ^（商標），Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．，Ｗｅｓｔ Ｐｏｉｎｔ，ＰＡ ）を用いて行った。溶離中に補集した画分中の抗原の検出は、イムノドットブロ ットアッセイにより行った。 Ｄ． イムノドットブロットアッセイ 各画分の１０μｌ試料を、予め湿らせて湿潤ブロッティングペーパー上に置い たＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．，Ｂ ｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）の細片に塗布した。試料を膜に浸し、膜を、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０２％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム及び０．０１Ｍ リン酸ナト リウム、ｐＨ７．２に溶解した脱脂粉乳のブロッキング溶液〔５％（ｗ／ｖ）〕 に入れ、ゆるやかに撹拌しながら室温で少なくとも３時間インキュベートした。 ブロッキング溶液をデカントし、一次抗体溶液と取り換えた。 用いる一次抗体は、検出すべき抗原によって変えた： ＣＲＰＶ Ｌ１は、ウサギ抗ＣＲＰＶ血清、「遅延応答」（Ｂｉｏｄｅｓｉｇ ｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｋｅｎｎｅｂｕｎｋ，ＭＥ）を用いてプロー ブした。ＣＲＰＶ Ｌ２は、ウサギ抗ＣＲＰＶ Ｌ２血清を用いてプローブした 。 ＨＰＶ６ａ Ｌ１は、モノクローナル抗体ＭＡＢ８３７（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉ ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）を用いてプロ ーブした。ＨＰＶ６ａ Ｌ２はマウス抗ＨＰＶ６ａ Ｌ２ｔｒｐＥ融合血清でプ ローブした。 免疫複合体の視覚化は、アルカリホスファターゼに結合した二次抗体及び染色 体基質ＮＢＴ／ＢＣＩＰを用い、標準法に従って実施した。 Ｅ． 組換えＣＲＰＶ Ｌ１キャプシドタンパク質からのワクチンの製造 精製したＣＲＰＶ Ｌ１キャプシドタンパク質をＡｌ（ＯＨ）₃に１００μｇ ／ｍｌの濃度で吸着させた。 実施例２２ 組換えＣＲＰＶ Ｌ１キャプシドタンパク質の精製−スキーム２ 特に断りのない限り、全てのステップは４℃で実施した。 −７０℃で保存した株＃１５８２の細胞を解凍し、等量の破壊緩衝液（２０ｍ Ｍ リン酸ナトリウム、ｐＨ７．２、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１．７ｍＭ ＥＤ ＴＡ）に懸濁した。該スラリーに、プロテアーゼ阻害剤ＰＭＳＦ及びペプスタ チンＡをそれぞれ２ｍＭ及び１．７μＭの最終濃度まで加えた。ＢｉｏＮｅｂ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｒｕｐｔｏｒシステム（Ｇｌａｓ−Ｃｏｌ Ａｐｐａｒａｔｕ ｓ Ｃｏ．，Ｔｅｒｒａ Ｈａｕｔｅ，ＩＮ）を用いて細胞を溶解した。溶解物 を５０００×ｇで１０分間遠心して清澄化した。 上清を、Ｌ１緩衝液中４５％スクロース（ｗ／ｖ）の５ｃｍクッション上に重 層し、Ｌ１を１００，０００×ｇで４時間遠心してペレット化した。ペレットを １０分の１容量のＬ１緩衝液に再懸濁した。再懸濁したペレットを５０００×ｇ で１０分間遠心して清澄化した。 上清をＰＢＳで１：５稀釈し、Ｓｏｒｖａｌｌ ＳＡ−６００ローター上６， ５００ｒｐｍで１０分間４℃で遠心して再清澄化した。上清を０．２２ミクロン シリンジフィルターを介して濾過し、アニオン交換クロマトグラフィーにかけて 分画した。 アニオン交換クロマトグラフィーは、５ｍｌ注入ループを具備したＰｅｒｋｉ ｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｓｅｒｉｅｓ ４１０ Ｂｉｏｐｕｍｐ ＨＰＬＣにより実施 した。該クロマトグラフィーの媒質は、１５０ｍｍ×１０ｍｍ（内径）ガラスカ ラム中のＦｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＦ ＴＭＡＥ−６５ ０（Ｓ）２５−４０ミクロン樹脂（ＥＭ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ｇｉｂｂｓ ｔｏｗｎ，ＮＪ）であった。カラムからのタンパク質の溶出をモニターするため に、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ＬＣ−２３５ダイオードアレー検出器を用い、 ２８０ｎｍで光学検出を行った。カラムは、０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液 、ｐＨ７．２（緩衝液Ａ）中０．１５Ｍ ＮａＣｌで予め平衡にした。カラムは 、０．７５ｍｌ／分の流速で操作した。試料をカラムに注入し、カラムを緩衝液 Ａで洗浄して、結合しなかった物質を除去した。結合した物質を線形濃度勾配の 塩化ナトリウム、０．１５Ｍ→０．６５Ｍで５分間、次いで０．６５Ｍ→１．１ ５Ｍの線形勾配で３０分間溶離した。溶離中に補集した画分中の抗原の検出は、 イムノドットブロットアッセイにより行った。免疫反応性物質（即ち、０．８１ Ｍ〜１．０５Ｍの範囲のＮａＣｌで溶離する画分）をプールした。 プールした画分を、Ｍａｃｒｏｓｅｐ遠心濃縮装置（Ｆｉｌｔｒｏｎ Ｔｅｃ ｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐ．，Ｎｏｒｔｈｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）で５分の１容 量に濃縮した。 濃縮物を、８７ｃｍ×２７ｍｍ（内径）カラム中のＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ− １０００ ＳＦ樹脂（Ｐｈａｒｍａｃ ｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いるサイズ排除クロマトグラフィーに かけて分画した。カラムは、２．５ｍｌ／分の流速で操作した。タンパク質の溶 出をＡ２８０ｎｍでモニターした。抗原はイムノブロットにより検出した。 免疫反応性物質を含む画分をプールし、窒素下に１０ｐｓｉの圧力で、直径４ ３ｍｍのＹＭ−１００フラットシート膜（Ａｍｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒ ｌｙ，ＭＡ）を具備した攪拌セル（Ａｍｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＭＡ）を用い、限外濾過により濃縮した。 クーマシー染色を用いるＳＤＳ／ＰＡＧＥ及び溶液ふるいキャピラリー電気泳 動（ＳＳＣＥ）により最終生成物の特性決定を行った。ＳＳＣＥによれば、スキ ーム２由来の最終生成物は純度８８％であった。 実施例２３ Ａ． 組換えＣＲＰＶ Ｌ１キャプシドタンパク質の精製−スキーム３（図１７ ） 特に明記されていない限り、全てのステップは４℃で実施した。 −７０℃で保存した株＃１５８２の細胞を解凍し、等量 の破壊緩衝液（２０ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ７．２、１００ｍＭ ＮａＣ ｌ、１．７ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁した。該スラリーに、プロテアーゼ阻害剤Ｐ ＭＳＦ及びペプスタチンＡをそれぞれ２ｍＭ及び１．７μＭの最終濃度まで加え た。ＢｉｏＮｅｂ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｒｕｐｔｏｒシステム（Ｇｌａｓ−Ｃｏｌ Ａｐｐａｒａｔｕｓ Ｃｏ．，Ｔｅｒｒａ Ｈａｕｔｅ，ＩＮ）を用いて細胞 を溶解した。溶解物を５０００×ｇで１０分間遠心して清澄化した。 上清を、Ｌ１緩衝液中４５％スクロース（ｗ／ｖ）の５ｃｍクッション上に重 層し、Ｌ１を１００，０００×ｇで４時間遠心してペレット化した。ペレットを １０分の１容量のＬ１緩衝液に再懸濁した。再懸濁したペレットを５０００×ｇ で１０分間遠心して清澄化した。 上清を２分の１容量のクロロホルムで抽出した。水性層を除去し、Ｂｅｃｋｍ ａｎ超遠心機中１２，０００ｒｐｍで５分間室温で遠心して清澄化した。 上清をＰＢＳで１：５稀釈し、Ｓｏｒｖａｌｌ ＳＡ−６００ローター上６５ ００ｒｐｍで１０分間４℃で遠心して再清澄化した。上清を０．２２ミクロンシ リンジフィルターを介して濾過し、アニオン交換クロマトグラフィーに かけて分画した。 アニオン交換クロマトグラフィーは、５ｍｌ注入ループを具備したＰｅｒｋｉ ｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｓｅｒｉｅｓ ４１０ Ｂｉｏｐｕｍｐ ＨＰＬＣにより実施 した。該クロマトグラフィーの媒質は、１５０ｍｍ×１０ｍｍ（内径）ガラスカ ラム中のＦｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＦ ＴＭＡＥ−６５０（Ｓ）２５−４０ミク ロン樹脂（ＥＭ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）であっ た。カラムからのタンパク質の溶出をモニターするために、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌ ｍｅｒ ＬＣ−２３５ダイオードアレー検出器を用いて２８０ｎｍでの光学検出 を行った。カラムは、０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．２（緩衝液 Ａ）中０．１５Ｍ ＮａＣｌで予め平衡にした。カラムは、０．７５ｍｌ／分の 流速で操作した。試料をカラムに注入し、カラムを緩衝液Ａで洗浄して、結合し なかった物質を除去した。結合した物質を線形濃度勾配の塩化ナトリウム、０． １５Ｍ→０．６５Ｍで５分間、次いで０．６５Ｍ→１．１５Ｍの線形勾配で３０ 分間溶離した。溶離中に補集した画分中の抗原の検出は、イムノドットブロット アッセイにより行った。免疫反応性物質（即ち、０．８１Ｍ〜１．０５ Ｍの範囲のＮａＣｌで溶出する画分）をプールした。 プールした画分を、Ｍａｃｒｏｓｅｐ遠心濃縮装置（Ｆｉｌｔｒｏｎ Ｔｅｃ ｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐ．，Ｎｏｒｔｈｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）で５分の１容 量に濃縮した。 濃縮物を、８７ｃｍ×２７ｍｍ（内径）カラム中のＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ− １０００ ＳＦ樹脂（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用 い、サイズ排除クロマトグラフィーにかけて分画した。該カラムは、２．５ｍｌ ／分の流速で操作した。タンパク質の溶出をＡ２８０ｎｍでモニターした。抗原 はイムノブロットで検出した。 免疫反応性物質を含む画分をプールし、窒素下に１０ｐｓｉの圧力で、直径４ ３ｍｍのＹＭ−１００フラットシート膜（Ａｍｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒ ｌｙ，ＭＡ）を具備した攪拌セル（Ａｍｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＭＡ）を用い、限外濾過により濃縮した。 最終生成物を、クーマシー染色を用いるＳＤＳ／ＰＡＧＥ及び溶液ふるいキャ ピラリー電気泳動（ＳＳＣＥ）により特性決定した。ＳＳＣＥによれば、スキー ム３からの最終生成物は純度９５％であった。溶液ふるいキャピラリー電気泳動（ＳＳＣＥ） ＣＲＰＶ ＶＬＰ（〜０．２ｍｇ／ｍｌ）の試料を１％２−メルカプトエタノ ール及び１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ中１００℃で１５分間加熱した。試料を参照マー カー、メリト酸と共に、１０ルーメン容量の０．１Ｎ ＮａＯＨ、水及びＰｒｏ Ｓｏｒｔふるい試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）で予平衡にした４２ｃｍ（検出器に対して２２ｃｍ）×０．０ ５ｍｍ（内径）のシリカ融合キャピラリーに動電学的に加えた。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｏｄｅｌ ２７０Ａ−ＨＴ ＣＥ装置を用いて３０ ０ボルト／ｃｍの分離電圧をかけた。試料の溶出を、２１５ｎｍでの吸光度でモ ニターし、Ｎｅｌｓｏｎ Ｔｕｒｂｏｃｈｒｏｍ ３ソフトウエアを用いてデー タを収集した。 実施例２４ 酵母由来のＣＲＰＶ Ｌ１ ＶＬＰを用いたワクチン接種による、ＣＲＰＶに起 因するパピローマ発症に対する保護 ５匹のニュージーランド白ウサギを、ミョウバンに吸着させた１３５μｇのＬ １ ＶＬＰ（純度７５％）か、又は陰性対照として水酸化アルミニウムに吸着さ せた１００μｇの組換えＢ型肝炎表面抗原（純度９９％）を用いて筋肉内 に免疫感作した。８週間の間に動物にさらに２回追加免疫をし、最後の追加免疫 の１０日後にＣＲＰＶでチャレンジした。免疫感作前、各追加免疫時及びチャレ ンジ前に採取した血清をＬ１特異的ＥＬＩＳＡで分析した。９６ウエルプレート を酵母由来ＣＲＰＶ−Ｌ１又はＣＲＰＶ−Ｌ２の粗溶解物５μｇでコーティング した。タンパク質を除去し、プレートを、１０％粉乳（Ｃａｒｎａｔｉｏｎ）＋ ＴＴＢＳ（２０ｍＭ トリス、ｐＨ７．４，５００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％Ｔ ｗｅｅｎ）中４℃で２時間ブロックした。プレートをＴＴＢＳで洗浄した後、稀 釈したウサギ血清を１％粉乳＋ＴＴＢＳに加え、４℃で２時間インキュベートし た。プレートをＴＴＢＳで洗浄し、１：１０００稀釈した１％ミルク＋ＴＴＢＳ 中の抗ウサギＩｇＧ−アルカリホスファターゼ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｓ．，Ｉｎｃ．）と共に４℃で２時間インキュベートした 。プレートをＴＴＢＳで洗浄し、リン酸ｐ−ニトロフェニル（Ｋｉｒｋｅｇａａ ｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｓ．、Ｔｎｃ．）を加えて発色させた。５％ ＥＤＴＡを加えて反応を停止した。吸光度は４０５ｎｍで測定した。タイターは 、Ｌ１／Ｌ２の吸光度比が２：１であれば陽性と考えた。 最初の注入の４週間後に抗Ｌ１抗体タイターが現われ、該タイターは追加免疫 を行う度に上昇した。対照動物は陰性であった。ＣＲＰＶチャレンジの６週間後 に、ワクチン接種した動物には１５部位（１：２稀釈又は１：１２稀釈したウイ ルスストック）全てにいぼが形成されなかったが、対照動物では、１５部位（１ ：２稀釈したウイルス）中１２部位又は１５部位（１：１２稀釈したウイルス） 中９部位にいぼの形成が認められた。１５週間たった後でも、ワクチン接種した 動物にはいぼの形成が認められなかった。 ウサギ血清をＣＲＰＶと混合し、次いでウサギを処理ＣＲＰＶでチャレンジし て、（実質的にＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら，１９９１，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８ １：５７２−５７９の方法に従って）ウイルス中和アッセイを実施した。中和抗 体の決定標準は、完全なウイルス中和（いぼの形成について３／３部位が陰性） とした。５匹のワクチン接種動物及び５匹の対照動物由来の血清を分析した。Ｃ ＲＰＶＬ１ ＶＬＰを１回投薬した後で補集した血清は、８０％のウサギ（４／ ５）において、非稀釈ウイルスを完全に中和する抗体を含んでいた。ＣＲＰＶ Ｌ１ ＶＬＰを２又は３回投薬した後では、１００％のウサギ（５／５）がウイ ル ス中和抗体を有していた。対照血清は、ウイルス中和活性を示さなかった。最終 タイターに応じて、選択されたワクチン接種動物の血清を１０〜１０００倍の範 囲で稀釈したが、それでも１００％の中和が認められた。 実施例２５ 単一のプラスミドからのＣＲＰＶ Ｌ１／Ｌ２を同時発現させるためのベクター の構築 プラスミドｐＳＰ７２−ＣＲＰＶ−Ｌ１（ｐ１２９３０−３１３−４−１）を ＢｇｌIIで消化し、酵母５′−非翻訳リーダー配列を含むＣＲＰＶ Ｌ１ ＯＲ Ｆを有する１．５ｋｂｐのＢｇｌII断片をゲル精製した。プラスミドｐ１２９３ ０−３２３−２−３を、ＧＡＬ１プロモーターとＡＤＨ１転写ターミネーターと の間で切断するＢａｍＨＩで消化した。線状ベクター断片をゲル精製し、次いで 、上記ＣＲＰＶ−Ｌ１ ＢｇｌII断片と連結して、プラスミドｐ１２９３０−３ ６６−１−２を得た。得られたこのプラスミドは、ＧＡＬ１プロモーターの制御 下のＣＲＰＶ−Ｌ１ ＯＲＦとＧＡＬ１０プロモーターの制御下のＣＲＰＶ−Ｌ ２ＯＲＦとを含んでいる。 実施例２６ ２つのプラスミドからのＣＲＰＶ Ｌ１／Ｌ２を同時発現させるためのベクター の構築 Ｌ２遺伝子を含むｐＵＣ１８−ＧＡＬ１ｐ−ＧＡＬ１０ｐベクターをＳｐｈＩ で切断し、ＡＤＨ１ｔ−ＧＡＬ１ｐ−ＧＡＬ１０ｐ−Ｌ２−ＡＤＨ１ｔ発現カセ ットを有する２．９ｋｂの断片をゲル精製し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理 して平滑末端とした。酵母シャトルベクターＹＥｐ２４〔Ｂｏｔｓｔｅｉｎら， Ｇｅｎｅ ８：１７（１９７９）〕をＢａｍＨＩで消化し、Ｔ４ ＤＮＡポリメ ラーゼで処理して平滑末端とし、仔ウシ腸アルカリホスファターゼで脱リン酸化 し、次いで、上記平滑末端Ｌ２発現カセットと連結して、プラスミドｐ１５９４ を得た。 実施例２７ 酵母におけるＣＲＰＶ Ｌ１及びＬ２の同時発現 プラスミドｐ１２９３０−３６６−１−２（ｐＣ１／１−ＧＡＬ１／１０ｐ −ＣＲＰＶ／Ｌ１＋Ｌ２）を用いて、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株＃１５６９及 びＢＪ５４６２（１プラスミド系）を形質転換し、得られた形質転換細胞を、ロ イシンを欠く合成寒天培地上で選択した。平行実験で、株＃１５９２をＣＲＰＶ −Ｌ１発現ベクターｐ１２９ ３０−３２３−６−１＋ＹＥｐ２４−ＧＡＬ１０ｐ−Ｌ２発現ベクターｐ１５９ ４（２プラスミド系）で同時に形質転換し、得られた、両ベクターを含む形質転 換細胞をロイシン及びウラシルを共に欠く合成寒天培地上で選択した。１プラス ミド系と２プラスミド系の両方のクローン分離体を、２％ガラクトースを含むＹ ＥＨＤ複合培地中３０℃で４８〜７２時間増殖させた。細胞を収穫した後、細胞 ペレットをガラスビーズで破壊した。トリトンＸ−１００を０．５％最終濃度ま で加え、細胞溶解物をイムノブロット分析によりＣＲＰＶ Ｌ１及びＬ２の発現 について分析した。５０μｇの全細胞タンパク質を含む試料を、還元・変性条件 下に、８→１６％トリス−グリシン勾配ゲル（Ｎｏｖｅｘ）上で電気泳動させ、 ＰＶＤＦ膜（Ｎｏｖｅｘ）上に電気ブロットした。一次抗体としてポリクローナ ルウサギ抗Ｌ１又は抗Ｌ２抗血清（Ｊｏｈｎ Ｋｒｅｉｄｅｒ博士より恵与）を 、また二次抗体として西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したタンパク質Ａ（Ａ ｍｅｒｓｈａｍ，Ｉｎｃ．）を用いて、ＣＲＰＶ Ｌ１及びＬ２タンパク質を検 出した。該膜は、化学ルミネセントＥＣＬ^（商標）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ （Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｉｎｃ．）を用いて処理し た。Ｌ１＋Ｌ２発現プラスミドを有する酵母クローン由来の全ての試料に、５５ 〜６１ｋＤａのＬ１タンパク質バンド及び〜９０ｋＤａのＬ２タンパク質バンド が検出された。Ｌ１用の発現プラスミドを有する酵母クローン由来の試料には、 Ｌ２のシグナルは検出されなかった（図６）。Ｌ２発現ベクターのみを含む細胞 由来の試料には、Ｌ１のシグナルは検出されなかった。 実施例２８ ＥＭ検査用のＣＲＰＶ Ｌ１ ＶＬＰ及びＣＲＰＶ Ｌ１＋Ｌ２ ＶＬＰの精製 ＣＲＰＶ Ｌ１タンパク質並びにＣＲＰＶ Ｌ１及びＬ２タンパク質を発現し た酵母を部分精製し、電子顕微鏡（ＥＭ）検査用に濃縮した。２％ガラクトース を含む１〜１．５ＬのＹＥＨＤ培地に、Ｌ１＋Ｌ２同時発現ベクターｐ１２９３ ０−３６６−１−２で形質転換したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株＃１５６９又は ＢＪ５４６２を接種し、３０℃で４８〜７２時間増殖させた。平行実験で、ＣＲ ＰＶ−Ｌ１発現ベクターｐ１２９３０−３２３−６−１＋ＹＥｐ２４−ＧＡＬ１ ０ｐ−Ｌ２プラスミドｐ１５９４で同時形質転換した株＃１５６９の細胞を類似 の方法で増殖させ た。細胞を収穫し、細胞のペレットを−７０℃で凍結した。全ての後続ステップ を４℃で実施した。細胞のペレットを解凍し、等量の「Ｌ１緩衝液」（２０ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ７．２、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１．７ｍＭ ＥＤＴ Ａ）に懸濁した。該スラリーに、タンパク質阻害剤ＰＭＳＦ及びペプスタチンＡ をそれぞれ２μＭ及び１．７μＭの最終濃度で加えた。細胞をマイクロフルイダ イザーに３〜５回通して溶解した。溶解物を５０００×ｇで１０分間遠心して清 澄化した。上清をＬ１緩衝液中の４５％（ｖ／ｖ）スクロースの５ｃｍクッショ ン上に重層し、Ｌ１、Ｌ２又はＬ１＋Ｌ２タンパク質を、１００，０００×ｇで ４時間遠心してペレット化した。該ペレットを１０分の１容量のＬ１緩衝液に再 懸濁した。再懸濁したペレットを５０００×ｇで１０分間遠心して清澄化した。 ＥＭ分析（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｐｒｏｂｅ，Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ，Ｐ Ａ）用に、各試料のアリコートを２００メッシュ炭素コーティング銅グリッド上 に置いた。１滴の２％リンタングステン酸（ＰＴＡ）、ｐＨ７．０を該グリッド 上に２０秒間置いた。ＴＥＭ試験の前にグリッドを風乾した。全ての顕微鏡検査 は、ＪＥＯＬ １００ＣＸ透過電 子顕微鏡（ＪＥＯＬ ＵＳＡ，Ｉｎｃ．）を用い１００ＫＶの加速電圧で行った 。作製された顕微鏡写真は１００，０００Ｘの最終倍率を有する。 ＣＲＰＶ Ｌ１発現プラスミド又はＣＲＰＶ Ｌ１及びＬ２の同時発現用プラ スミドを有する全ての酵母試料に、直径サイズ範囲が≦２５ｎｍのＶＬＰが認め られた。酵母対照試料、即ち、Ｌ２発現プラスミドのみを有する酵母試料にはＶ ＬＰは認められなかった。 実施例２９ 富裕化複合培地及び既知組成培地におけるＣＲＰＶ Ｌ１（細胞株１５８２）及 びＨＰＶ ６ａ型Ｌ１（株１６４４）の発現 これらの株の接種原を、上記ロイシンを欠く合成培地中で増殖させ、振とうフ ラスコ培養に移した。用いた振とうフラスコに、高通気能を得るためにバッフル を取り付け（３００ｍｌ容量フラスコ、Ｔｕｎａｉｒ Ｌａｂｗａｒｅ１個当た り７０ｍｌの液体）、培地に約０．５ｍｌ／Ｌの消泡剤（ＵＣＯＮ ＬＢ−６２ ５，Ｕｎｉｏｎ Ｃａｒｂｉｄｅ）を加えた。富裕化複合培地は、（１リットル 当たり）：４０ｇのＤｉｆｃｏ酵母エキス；２０ｇのＳｈｅｆｆｉｅｌ ｄ ＨｙＳｏｙペプトン；３０ｇのグルコース；５０ｇのガラクトースを含んで いた。該培地は、滅菌前にｐＨ５．３に調整した。用いた既知組成培地は、Ｏｕ ｒａ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒ １６：１１９７−１２ １２，１９７４）に記載のものと類似であったが、但し、該培地に、（１リット ル当たり）：０．１ｇの塩化コリン；０．４ｇのアデニン；窒素源としての３０ ｇのグルタミン酸一ナトリウム；０．２ｇのウラシル；２０ｇのグルコース；４ ０ｇのガラクトースを加えた。フラスコに３ｍｌの接種原を接種し、回転振とう 機上２５０ｒｐｍ、２８℃で６６時間インキュベートした。フラスコから時間間 隔をおいて試料を採取し、抗ＣＲＰＶ Ｌ１及び抗ＨＰＶ６ａ Ｌ１抗血清を用 い、イムノブロットにより発現を確認した。 実施例３０ ＨＰＶ１６ Ｌ１及びＬ２造伝子のクローニング 標準法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前掲）に従い、Ｃａｓｋｉ細胞（ＡＴＣＣ Ｃ ＲＬ番号 １５５０）から全ゲノムＤＮＡを抽出した。ＤＮＡをＢＳｔ１１０７ Ｉ及びＳｐｈＩエンドヌクレアーゼで消化し、０．８％低融点アガロース 分離用ゲルを介して電気泳動させた。〜３．５ｋｂｐのＤＮＡに対応する領域を ゲルから切り出し、アガロースをゲラーゼ^{( 商標)}酵素（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｔ ｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）で消化した。ゲル精製したＤＮＡをＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理して平滑末端とし、隠されたＨｉｎｄIII部位を含む 平滑末端リン酸化オリゴデオキシヌクレオチドリンカーと連結した。連結混合物 をＨｉｎｄIIIで完全に消化し、〜３．５ｋｂｐのＤＮＡを、上記のようなアガ ロースゲルを通してサイズ分別した。ゲル精製したＤＮＡを、ＨｉｎｄIIIで消 化し、脱リン酸化しておいたｐＵＣ１８プラスミドＤＮＡと連結した。コンピテ ントＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５細胞（ＢＲＬ）を形質転換した後、ＨＰＶ−１６ Ｌ １遺伝子の３′末端に相補的なアンチセンス³²Ｐ標識オリゴデオキシヌクレオチ ド（５′−ＧＡＧ ＡＧＡ ＴＣＴ ＴＡＣ ＡＧＣ ＴＴＡ ＣＧＴ ＴＴＴ ＴＴＧ ＣＧＴ ＴＴＡ ＧＣ−３′）を用い、コロニーハイブリダイゼーシ ョンにより、プラスミドライブラリーをＨＰＶ１６陽性クローンについてスクリ ーニングした。３．３ｋｂｐのＨＰＶ１６ゲノム断片を含むｐＵＣ１８プラスミ ドを分離し、制限酵素分析及びサザーンブロット分析により特性 決定した。このプラスミドは、ｐＵＣ１８−ＨＰＶ１６ Ｌ１／Ｌ２と称され、 Ｌ１及びＬ２をコードするＤＮＡ配列の全てを含んでいる。Ｑｉａｇｅｎ（^商標 ）Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）を用いてプラス ミドＤＮＡを作製した。 実施例３１ ＨＰＶ１６Ｌ１酵母発現ベクターの構築 ＰＣＲ用のテンプレートとして、クローン、ｐＵＣ１８−ＨＰＶ１６ Ｌ１／ Ｌ２を用いた。Ｖｅｎｔポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ ｓ，Ｉｎｃ．）、１０サイクルの増幅（９４℃で１分、４８℃で１分、７２℃で １分４５秒）、及びフランキングＢｇｌII部位（下線）を含む以下のオリゴデオ キシヌクレオチドプライマーを用い、ＰＣＲによりＨＰＶ１６ Ｌ１遺伝子を増 幅した。 センスプライマーは、ＨＰＶ１６ Ｌ１開始メチオニンコドン（太字で強調） に対してすぐ上流の酵母非翻訳リー ダー配列を導入する。１．５ｋｂｐのＬ１ ＰＣＲ産物をＢｇｌIIで消化、ゲル 精製し、ＢａｍＨＩで消化したｐＧＡＬ１０ベクターに連結した。ＨＰＶ１６ Ｌ１遺伝子を含むｐＧＡＬ１０プラスミドを分離し、ｐ１４０４９−３７１−１ と称した。ｐ１４０４９−３７−１中のＬ１遺伝子を、製造業者の指示に従い、 ＰＲＩＳＭ^（商標）キット（ＡＢＩ，Ｉｎｃ.）及びＡＢＩ シーケンサー３７ ３Ａモデルを用いて配列決定した。この分離体中のＬ１遺伝子は、訂正された公 表プロトタイプ配列〔Ｋｉｒｎｂａｕｅｒ，Ｒ．ら（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ．６７：６９２９−６９３６〕とは異なる３つのヌクレオチドを含み、２つのア ミノ酸に変化：Ｈｉｓ−２０２→Ａｓｐ；Ｔｈｒ−２６６→Ａｌａが起こったこ とが示された。もとのテンプレートＤＮＡの配列分析により、これらの変化がゲ ノムクローンｐＵＣ１８−ＨＰＶ１６ Ｌ１／Ｌ２にも存在し、それがＰＣＲに よって導入されたものではないことが確認された。 実施例３２ ＨＰＶ１６ Ｌ１及びＬ２酵母発現ベクターの構築 プラスミドｐ１４０４９−３７−１を、ＧＡＬ１０プロモーターとＡＤＨ１転 写ターミネーターとの間で切断する ＳｍａＩで消化した。テンプレートとしてのｐＵＣ１８−ＨＰＶ１６ Ｌ１／Ｌ ２ＤＮＡ、Ｖｅｎｔポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｉｎｃ．）、１０サイクルの増幅（９４℃で１分、４８℃で１分、７２℃で１分 ４５秒）及びフランキングＳｍａＩ部位（下線）を含む以下のオリゴデオキシヌ クレオチドプライマーを用い、ＰＣＲにより、１．４ｋｐｂのＨＰＶ１６ Ｌ２ 遺伝子を増幅した： センスプライマーは、ＨＰＶ１６ Ｌ２開始メチオニンコドン（太字で強調） に対してすぐ上流の酵母非翻訳リーダー配列を導入する。１．４ｋｂｐのＬ２ ＰＣＲ産物をＳｍａＩで消化、ゲル精製し、ＳｍａＩで消化したｐ１４０４９− ３７１−ベクターに連結した。ＨＰＶ１６Ｌ１及びＬ２遺伝子を共に含むｐＬＳ １１０プラスミドを分離し、ｐ１４０４９−４２−２と称した。ｐ１４０４９− ４２−２中のＬ２遺伝子を、製造業者の指示に従い、ＰＲＩＳＭ^（商標） キット（ＡＢＩ，Ｉｎｃ．）及びＡＢＩ シーケンサー３７３Ａモデル を用いて配列決定した。この分離体中のＬ２遺伝子は、訂正された公表プロトタ イプ配列〔Ｋｉｒｎｂａｕｅｒ，Ｒ．ら（１９９３），前掲〕から変化した５つ のヌクレオチドを含み、１つのアミノ酸変化：Ｓｅｒ−２６９→Ｐｒｏが起こっ たことが示された。ゲノムクローンｐＵＣ１８−ＨＰＶＩ６ Ｌ１／Ｌ２の配列 分析により、この変化がもとのテンプレートＤＮＡにも存在し、ＰＣＲによって 導入されたものではないことが確認された。 実施例３３ Ａ． 酵母におけるＨＰＶ１６ Ｌ１の発現並びにＨＰＶ１６ Ｌ１及びＬ２の 同時発現 プラスミドｐ１４０４９−３７−１及びｐ１４０４９−４２−２を用いて、Ｓ ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株＃１５５８を形質転換した。得られた組換え株は、表 に示されているように、株＃１６７８（ＨＰＶ１６−Ｌ１）及び＃１６７９（Ｈ ＰＶ１６−Ｌ１＋Ｌ２）であった。クローン分離体を、２％ガラクトースを含む ＹＥＨＤ培地中３０℃で６８〜７８時間増殖させた。細胞を収穫した後、細胞ペ レットをガラスビーズで破壊し、イムノブロット分析により、 細胞溶解物をＨＰＶ１６ Ｌ１又はＨＰＶ１６ Ｌ２タンパク質の発現について 分析した。還元・変性条件下に、４０μｇの全細胞タンパク質を含む試料を１０ ％トリス−グリシンゲル上で電気泳動させ、ニトロセルロースフィルター上に電 気ブロットした。一次抗体としてｔｒｐＥ−ＨＰＶ１１ Ｌ１融合タンパク質（ Ｄ．Ｂｒｏｗｎら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２０１：４６−５４）に対するウサギポ リクローナル抗血清を、また二次抗体としてＨＲＰに結合したロバ抗ウサギＩｇ Ｇ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｉｎｃ．）を用いて、ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質 を免疫検出した。化学ルミネセントＥＣＬ^（商標）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎキット（ Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｉｎｃ．）を用いてフィルターを処理した。陰性対照（Ｌ１ 又はＬ２遺伝子を含まないベクター対照）を除く全ての試料に５０〜５５ｋＤａ のＬ１タンパク質バンドが検出された。一次抗体としてＥ．ｃｏｌｉ中で発現さ れたｔｒｐＥ−Ｌ２融合タンパク質に対するマウス抗ＨＰＶ１６ Ｌ２血清を用 いるイムノブロットにより７０ｋＤａのタンパク質バンドとしてＬ２タンパク質 を検出した。二次抗体としてはヤギ抗マウスＩｇＧ ＨＲＰ結合体（Ａｍｅｒｓ ｈａｍ，Ｉｎｃ．）を用い、フィルターは上記のよ うに処理した。 Ｂ．組換えＨＰＶ１６型Ｌ１＋Ｌ２キャプシドタンパク質の精製 特に断りのない限り、全てのステップは４℃で実施した。 細胞を−７０℃で凍結保存した。凍結細胞（湿潤重量＝２７．６ｇ）を２０〜 ２３℃で解凍し、４０ｍｌの「Ｌ１緩衝液」（２０ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐ Ｈ７．２、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１．７ｍＭ ＥＤＴＡ）に再懸濁した。プロ テアーゼ阻害剤ＰＭＳＦ及びペプスタチンＡを加えて、それぞれ、２ｍＭ及び１ ．７μＭの最終濃度とした。約８，０００ｐｓｉの圧力でＭ１１０ Ｍｉｃｒｏ ｆｌｕｉｄｉｚｅｒ（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｃｏｒｐ．Ｎｅｗｔｏｎ， ＭＡ）に３回通して細胞スラリーを破壊した。破壊された細胞スラリーを５，０ ００×ｇで１０分間遠心して、細胞片を除去した。Ｌ１＋Ｌ２抗原を含む上清液 を回収した。 緩衝液Ａ（２０ｍＭ ＭＯＰＳ，ｐＨ７．０）を加えて上清液を１：５稀釈し Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）の アニオン交換捕獲カラム〔５．０ｃｍ（内径）×４．０ｃｍ〕に加えた。緩衝液 Ａで洗浄した後、抗原を、緩衝液Ａ中０→１．０Ｍ勾配のＮａＣｌで溶離した。 イムノドットブロッティングを行って、カラムからのどの画分がＬ１タンパク質 を含んでいるかを決定した。 イムノドットブロットで測定してＬ１タンパク質を含む画分を、Ｂｒａｄｆｏ ｒｄ法、次いで、銀染色を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティン グにより全タンパク質についてアッセイした。 同程度の純度及び濃度のＬ１タンパク質を示すＴＭＡＥ画分をプールした。硫 酸アンモニウム分画により抗原を濃縮した。３０分かけてゆるやかに攪拌しなが ら固体試薬を加えて、試料を４８％飽和硫酸アンモニウムに調整した。試料を氷 の上に置き、一晩沈殿させた。試料を１２，０００×ｇで遠心した。ペレットを ２０．０ｍｌのＰＢＳ（６．２５ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ７．２、１５０ ｍＭ ＮａＣｌ）に再懸濁した。 再懸濁したペレットを、別々に、２０−２３℃で、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ ５０ ０ＨＲ樹脂（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）のサイズ排除 カラム〔２．６ ｃｍ（内径）×８９ｃｍ〕上のクロマトグラフィーにかけた。操作緩衝液はＰＢ Ｓであった。銀染色を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット検出によ り、画分を分析した。最も純度の高い画分をプールした。得られたプールを、４ 〜６ｐｓｉのＮ₂圧力下に４３ｍｍのＹＭ−１００フラットシート膜（Ａｍｉｃ ｏｎ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を用い、５０ｍｌの攪拌セル中で濃縮した。 コロイドクーマシー染色を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、最終生成物を分析 した。Ｌ１及びＬ２タンパク質は７０％ホモジニアスであると予測された。Ｌ１ 及びＬ２タンパク質は、適切な抗血清を用いるウエスタンブロッティングにより 同定した。最終生成物をアリコートに分けて、−７０℃で保存した。この処理に より、合計０．５３ｍｇのタンパク質を得た。 Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｐｒｏｂｅ（Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ）により 、電子顕微鏡分析を行った。試料のアリコートを２００メッシュ炭素コーティン グした銅グリッド上に置いた。該グリッド上に１滴の２％リンタングステン酸、 ｐＨ７．０を２０秒間置いた。ＴＥＭ検査の前にグリッドを風乾した。１００ｋ Ｖの加速電圧でＪＥＯＬ １０ ０ＣＸ透過電子顕微鏡（ＪＥＯＬ ＵＳＡ，Ｉｎｃ．）を用いて、全顕微鏡検査 を行った。作製された顕微鏡写真は、１００，０００Ｘの最終倍率を有する。≦ ２５ｎｍサイズ範囲のウイルス様粒子の存在が確認された。 Ｃ． 組換えＨＰＶ１６型Ｌ１＋Ｌ２キャプシドタンパク質の精製 特に断りのない限り、全てのステップは４℃で実施した。 細胞を−７０℃で凍結保存した。凍結細胞（湿潤重量＝９２．８ｇ）を２０〜 ２３℃で解凍し、１０５ｍｌの「Ｌ１緩衝液」（２０ｍＭ リン酸ナトリウム、 ｐＨ７．２、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１．７ｍＭ ＥＤＴＡ）に再懸濁した。プ ロテアーゼ阻害剤ＰＭＳＦ及びペプスタチンＡを加えて、それぞれ、２ｍＭ及び １．７μＭの最終濃度とした。約１６，０００ｐｓｉの圧力下にＭ１１０−Ｙ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｃｏｒｐ．Ｎｅ ｗｔｏｎ，ＭＡ）に３回通して細胞スラリーを破壊した。破壊された細胞スラリ ーを６，１００×ｇで１５分間遠心して、細胞片を除去した。Ｌ１＋Ｌ２抗原を 含む上清液を回収した。 緩衝液Ａ（２０ｍＭ ＭＯＰＳ，ｐＨ７．０）を加えて 上清液を１：５稀釈し、緩衝液Ａ中で平衡にした、Ｆｒａ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）のアニオン交換捕獲カラ ム〔５．０ｃｍ（内径）×４．０ｃｍ〕に加えた。緩衝液Ａで洗浄した後、抗原 を、緩衝液Ａ中０→１．０Ｍ勾配のＮａＣｌで溶離した。イムノドットブロッテ ィングを行って、カラムからのどの画分がＬ１タンパク質を含んでいるかを決定 した。 イムノドットブロットで測定してＬ１タンパク質を含む画分を、Ｂｒａｄｆｏ ｒｄ法、次いで、銀染色を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティン グにより全タンパク質についてアッセイした。 同程度の純度及び濃度のＬ１タンパク質を示すＴＭＡＥ画分をプールした。硫 酸アンモニウム分画により抗原を濃縮した。１０分かけてゆるやかに撹拌しなが ら固体試薬を加えて、試料を３５％飽和硫酸アンモニウムに調整した。試料を氷 の上に置き、４時間沈殿させた。試料を１２，０００×ｇで遠心した。ペレット を、１ｍＭのＥＤＴＡを含む２０．０ｍｌのＰＢＳ（６．２５ｍＭ リン酸ナト リウム、ｐＨ７．２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）に再懸濁した。 再懸濁したペレットを、別々に、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ ５００ＨＲ樹脂（Ｐｈ ａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）のサイズ排除カラム〔２．６ｃ ｍ（内径）×８９ｃｍ〕上のクロマトグラフィーにかけた。操作緩衝液はＰＢＳ ＋１ｍＭ ＥＤＴＡであった。銀染色を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタン ブロット検出により、画分を分析した。最も純度の高い画分をプールした。得ら れたプールを、４〜６ｐｓｉのＮ₂圧力下に４３ｍｍのＹＭ−１００フラットシ ート膜（Ａｍｉｃｏｎ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を用い、５０ｍｌ容量の攪拌セ ル中で濃縮した。 コロイドクーマシー染色を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、最終生成物を分析 した。Ｌ１及びＬ２タンパク質は７０％ホモジニアスであると予測された。Ｌ１ 及びＬ２タンパク質は、適切な抗血清を用いるウエスタンブロッティングにより 同定した。最終生成物をアリコートに分けて、−７０℃で保存した。この処理に より、合計３．８ｍｇのタンパク質を得た。 実施例３４ Ａ．株１６７９（ＨＰＶ１６型Ｌ１＋Ｌ２）の発酵 凍結ストック培養株の調製、接種原の増殖、発酵及び株 １６７９の細胞回収に用いた手順は、実質的に上記の手順と同様であった。６７ 時間インキュベートした後では、１リットル当たり４．２ｇの乾燥細胞重量の細 胞密度に達し、回収後に合計９３ｇの湿潤細胞ペレットを得た。 Ｂ．株１６７８（ＨＰＶ１６型Ｌ１）の発酵 凍結ストック培養株の調製、接種原の増殖、発酵及び株１６７８の細胞回収に 用いた手順は、実質的に上記の手順と同様であった。７０．５時間インキュベー トした後、２つの１０Ｌ容量発酵槽の内容物をプールし（１リットル当たり８． ７ｇの乾燥細胞重量の細胞密度）、回収後に合計２５８ｇの湿潤細胞ペレットを 得た。 Ｃ．組換えＨＰＶ１６型Ｌ１キャプシドタンパク質の精製 特に断りのない限り、全てのステップは４℃で実施した。 株＃１６７８の細胞を−７０℃で凍結保存した。凍結細胞（湿潤重量＝１２８ ｇ）を２０〜２３℃で解凍し、１４０ｍｌの「改良Ｌ１緩衝液」（２０ｍＭ リ ン酸ナトリウム、ｐＨ７．２、１００ｍＭ ＮａＣｌ）に再懸濁した。プロテア ーゼ阻害剤ＰＭＳＦ及びペプスタチンＡを加えて、それぞれ、２ｍＭ及び１．７ μＭの最終濃度とした。約１６，０００ｐｓｉの圧力下にＭ１１０ Ｍｉｃｒｏ ｆｌｕｉｄ ｉｚｅｒ（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｃｏｒｐ．，Ｎｅｗｔｏｎ，ＭＡ）に ３回通して細胞スラリーを破壊した。破壊された細胞スラリーを１１，０００× ｇで４０分間遠心して、細胞片を除去した。Ｌ１抗原を含む上清液を回収した。 緩衝液Ａ（２０ｍＭ ＭＯＰＳ，ｐＨ７．０）を加えて上清液を１：５稀釈し 、緩衝液Ａ中で平衡にした、Ｆｒａ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）のアニオン交換捕獲カラ ム〔５．０ｃｍ（内径）×４．０ｃｍ〕にかけた。緩衝液Ａで洗浄した後、抗原 を、緩衝液Ａ中０→１．０Ｍ勾配のＮａＣｌで溶離した。イムノドットブロッテ ィングを行って、カラムからのどの画分がＬ１タンパク質を含んでいるかを決定 した。 イムノドットブロットで測定してＬ１タンパク質を含む画分を、Ｂｒａｄｆｏ ｒｄ法、次いで、銀染色を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティン グにより全タンパタ質についてアッセイした。 同程度の純度及び濃度のＬ１タンパク質を示すＴＭＡＥ画分をプールした。硫 酸アンモニウム分画により抗原を 濃縮した。１０分かけてゆるやかに攪拌しながら固体試薬を加えて、試料を３５ ％飽和硫酸アンモニウムに調整した。試料を氷の上に置き、５時間沈殿させた。 試料を１２，０００×ｇで遠心した。ペレットを２０．０ｍｌのＰＢＳ（６．２ ５ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ７．２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）に再懸濁した 。 再懸濁したペレットを、別々に、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ ５００ＨＲ樹脂（Ｐｈ ａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）のサイズ排除カラム〔２．６ｃ ｍ（内径）×８９ｃｍ〕上のクロマトグラフィーにかけた。操作緩衝液はＰＢＳ であった。銀染色を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット検出により 、画分を分析した。最も純度の高い画分をプールした。得られたプールを、４〜 ６ｐｓｉのＮ₂圧力下に４３ｍｍのＹＭ−１００フラットシート膜（Ａｍｉｃｏ ｎ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を用い、５０ｍｌ容量の攪拌セル中で濃縮した。 コロイドクーマシー染色を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、最終生成物を分析 した。Ｌ１タンパク質は７０％ホモジニアスであると推定された。Ｌ１タンパク 質を、適切な抗血清を用いるウエスタンブロッティングにより同定し た。最終生成物をアリコートに分けて、−７０℃で保存した。この処理により、 合計７．４ｍｇのタンパク質を得た。 Ｄ．分析手順 イムノドットブロット手順 （必要なら）試料をＭｉｌｌｉ−Ｑ−Ｈ₂Ｏに１：１０稀釈し、１０μｌの試 料をＰｏｌｙＳｃｒｅｅｎ^（商標）ＰＶＤＦ膜（ＮＥＮ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐ ｒｏｄｕｃｔｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）上にスポットした。スポットが乾いた後 、膜を水で洗浄し、乾燥させた。適切な抗血清をブロッティング緩衝液（６．２ ５ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ７．２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２％Ｎ ａＮ₃中５％脱脂粉乳）に稀釈して一次抗体溶液を調製した。２０〜２３℃で少 なくとも１時間インキュベートした。ＰＢＳ（６．２５ｍＭ リン酸ナトリウム 、ｐＨ７．２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）を３回変えて１回当たり１分間ブロット を洗浄した。適切なアルカリホスファターゼに結合した接合体抗血清をブロッテ ィング緩衝液に稀釈して二次抗体溶液を調製した。上記と同一条件下に少なくと も１時間インキュベーションを進めた。ブロットを上記のように洗浄し、１ステ ップＮＢＴ／ＢＣＩＰ基質（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏ ｒｄ，ＩＬ）を用いて検出した。 検出に用いた抗体は以下の通りであった： ＨＰＶ６ａ Ｌ１は、ＭＡＢ８３７（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉ ｏｎａｌ，Ｉｎｃ．Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）により検出した。ＨＰＶ６ａ Ｌ ２は、マウス抗ＨＰＶ６ａ Ｌ２−ｔｒｐＥ融合血清プール＃６４１及び＃６４ ７（Ｍ．Ｒｏｓｏｌｏｗｓｋｉが当社内で製造したもの）により検出した。ＨＰ Ｖ１６ Ｌ１は、ＭＡＢ８８５（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａ ｌ，Ｉｎｃ．，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）により検出した。ＨＰＶ１６Ｌ２は、 マウス抗ＨＰＶ１６ Ｌ２−ｔｒｐＥ融合血清プール＃６１１（Ｋ．Ｊａｎｓｅ ｎが当社内で製造したもの）により検出した。全タンパク質についてのＢｒａｄｆｏｒｄアッセイ ｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いて全タンパク質をアッセイした。試料を Ｍｉｌｌｉ−Ｑ−Ｈ₂Ｏに適切なレベルに稀釈した。必要な容量は、標準プロト コル及びマイクロアッセイプロトコル用に、それぞれ０．１ｍｌ及び１．０ｍｌ であった。どちらのプロトコルでも、ＢＳＡ（Ｐｉ ｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いて標準曲線を形成した。アッセイは 、製造業者の指示に従って実施した。標準曲線は、Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ IIｃｉ コンピューターの トした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットアッセイ 全てのゲル、緩衝液及び電気泳動装置は、Ｎｏｖｅｘ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）から入手し、製造業者の指示に従って操作した。簡潔に述べれば、試料を Ｍｉｌｌｉ−Ｑ−Ｈ₂Ｏ中に等タンパク質濃度に稀釈し、２００ｍＭ ＤＴＴを 含む試料インキュベーション緩衝液と１：１混合した。試料を１００℃で１５分 間インキュベートし、予形成した１２％トリス−グリシンゲル上に充填した。試 料を１２５Ｖで１時間４５分電気泳動させた。Ｈｅｕｋｅｓｈｏｖｅｎ及びＤｅ ｒｎｉｃｋの方法〔Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，６（１９８５）１０３− １１２〕の改良による銀染色、又は市販のキット（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｓｅ ｐａｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ）を用いたコロイドク ーマシー染色を用いてゲルを発色させた。ウエスタンブロット法では、タンパク 質を２５Ｖで４０分 間ＰＶＤＦ膜に移し取った。膜を乾燥し、イムノドットブロット法の場合のよう に抗体溶液と共にインキュベートした。 実施例３５ 免疫原性組成物の調製 精製したＶＬＰを、医薬上許容し得る担体、安定剤又はワクチンアジュバント の混合によるような公知方法に従って配合する。本発明の免疫原性ＶＬＰは、例 えば、ＰＢＳ、生理的食塩水又は蒸留水のような生理学的に許容し得る組成物と 組み合わせてワクチン用に製造し得る。免疫原性ＶＬＰは、所望の免疫原性効果 を得るために、約０．１〜１００μｇ、好ましくは約１〜約２０μｇの用量範囲 で投与する。製剤当たりのＶＬＰの量は、個体の症状、体重、年齢及び性別を含 む（但し、それらには限定されない）種々の要素に応じて異なり得る。ＶＬＰ製 剤は、経口、皮下、局所、経粘膜、及び筋肉内を含む（但し、それらには限定さ れない）種々の経路を介して投与し得る。そのようなＶＬＰ製剤は、単一型ＶＬ Ｐ（即ち、ＨＰＶ６ａ由来のＶＬＰ）か、ＶＬＰ混合物（即ち、ＨＰＶ６ａ、Ｈ ＰＶ１１，ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８由来のＶＬＰ）から構成し得る。 場合によって、抗菌性保存剤、例えば、チメロサルが存在してもよい。所望な ら、本発明の免疫原性抗原をワクチン安定剤及びワクチンアジュバントと組み合 わせて用いてもよい。典型的な安定剤は、特異的化合物、例えば、ヘパリン、イ ノシトールヘキサ硫酸、硫酸化β−シクロデキストリンのようなポリアニオン、 特異性の低い賦形剤、例えば、アミノ酸、ソルビトール、マンニトール、キシリ トール、グリセロール、スクロース、デキストロース、トレハロース、及び溶液 条件、例えば、中性ｐＨ、高イオン強度（約０．５−２．０Ｍ 塩）、２価のカ チオン（Ｃａ²⁺Ｍｇ²⁺）を変動させる成分である。アジュバントの例には、Ａｌ （ＯＨ）₃及びＡｌ（ＰＯ₄）がある。本発明のワクチンは、凍結又は凍結乾燥形 態で保存し得る。 実施例３６ ＶＬＰに対する抗体の調製 精製されたＶＬＰを用いて抗体を産生させる。本明細書に用いられている用語 「抗体」には、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体並びにその断片、例 えば、抗原又はハプテンに結合し得るＦｖ、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ）₂断片が含ま れる。抗体は、組換えＶＬＰの精製、天然Ｌ１又 はＬ２タンパク質の精製及びキットを含む（但し、それらには限定されない）種 々の用途に用いられる。キットは、少なくとも１個の容器を密閉保持するのに適 したコンパートメント化されたキャリアーを含む。該キャリアーはさらに、ＨＰ Ｖ、ＨＰＶの断片又はＨＰＶに対する抗体の検出に適した抗ＶＬＰ抗体又はＶＬ Ｐのような試薬を含む。担体はさらに、標識抗原又は酵素基質などのような検出 媒体をも含み得る。抗体、ＶＬＰ又はキットは法廷用分析及び疫学的研究を含む （但し、それらには限定されない）多様な目的に有用である。 実施例３７ 組換えＨＰＶ１１型Ｌ１キャプシドタンパク質の精製 特に記載のない限り、全てのステップは４℃で実施した。 細胞を−７０℃で凍結した。凍結細胞（湿潤重量＝１８０ｇ）を２０〜２３℃ で解凍し、９００ｍｌの「破壊緩衝液」（５０ｍＭ ＭＯＰＳ、ｐＨ７．２、５ ００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ₂）に再懸濁した。プロテアーゼ阻害剤 ＡＥＢＳＦ及びペプスタチンＡを、それぞれ１ｍＭ及び１．７μＭの最終濃度ま で加えた。細胞スラリーを、約１６，０００ｐｓｉの圧力下に、Ｍ１１０−Ｙ Ｍｉｃｒｏ ｆｕｌｕｉｄａｉｚｅｒ（Ｍｉｃｒｏｆｕｉｄｉｃｓ Ｃｏｒｐ．，Ｎｅｗｔｏ ｎ，ＭＡ）に４回通して破壊した。破壊された細胞スラリーに、十分量の１０％ トリトンＸ−１ Ｌ）を加え、トリトンＸ−１００の濃度を０．５％とした。スラリーを２０時間 攪拌した。トリトンＸ−１００で処理した溶解物を１２，０００×ｇで４０分間 遠心して細胞片を除去した。Ｌ１タンパク質を含む上清液を回収した。 ３００Ｋ接面流動膜（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ ｆｌｏｗｍｅｍｂｒａｎｅ）カ セット（Ｆｉｌｔｒｏｎ，Ｎｏｒｔｈｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）を用いて、上清液 を５容量の２０ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ７．２，０．５Ｍ ＮａＣｌに対 して透析した。ラジオイムノアッセイ及びウエスタンブロッティングにより、該 膜によって保持された物質はＬ１タンパク質を含むことが証明された。 保持物質を、２０ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ７．２、０．５Ｍ ＮａＣｌ で平衡にした、ＳＰ Ｓｐｈｅｒｏｄｅ Ｇａｒｅｎｎｅ，Ｆｒａｎｃｅ）の高分離能のアフィニティーカラム〔１１．０ ｃｍ（内径）×５．３ｃｍ〕にかけ た。平衡緩衝液で洗浄し、２０ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ７．２、１．０Ｍ ＮａＣｌで段階洗浄した後、Ｌ１タンパク質を、２０ｍＭ リン酸ナトリウム 、ｐＨ７．２、２．５Ｍ ＮａＣｌで段階洗浄して溶離した。洗浄・溶離中に画 分を補集した。Ｂｒａｄｆｏｒｄ法に従い、カラム画分を全タンパク質について アッセイした。次いで、画分を、ウエスタンブロッティング、及びコロイドクー マシー検出を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。画分をさらにラジオイム ノアッセイにより分析した。 同程度の純度及び濃度のＬ１タンパク質を示すＳＰ Ｓｐｈｅｒｏｄｅｘ画分 をプールした。 最終生成物を、ウエスタンブロッティング、及びコロイドクーマシー検出を用 いるＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。Ｌ１タンパク質は≧９０％ホモジニアス であると予測された。Ｌ１タンパク質をウエスタンブロッティングにより同定し た。最終生成物を０．２２μｍ膜を通して無菌濾過し、４℃で保存した。この処 理により、合計１００ｍｇのタンパク質を得た。 Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｐｒｏｂｅ（Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ）により 電子顕微鏡分析を行う。試料のアリコ ートを２００メッシュ炭素コーティング銅グリッド上に置く。該グリッド上に１ 滴の２％リンタングステン酸、ｐＨ７．０を２０秒間置く。ＴＥＭ検査の前にグ リッドを風乾する。全ての顕微鏡検査は、１００ｋＶの加速電圧でＪＥＯＬ １ ００ＣＸ透過電子顕微鏡（ＪＥＯＬ ＵＳＡ，Ｉｎｃ．）を用いて実施する。作 製された顕微鏡写真は１００，０００×の最終倍率を有する。全タンパク質についてのＢｒａｄｆｏｒｄアッセイ ｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いて全タンパク質をアッセイした。試料を Ｍｉｌｌｉ−Ｑ−Ｈ₂Ｏに適切なレベルで稀釈した。必要な容量は、標準プロト コル及びマイクロアッセイプロトコルに対して、それぞれ０．１ｍｌ及び１．０ ｍｌであった。どちらのプロトコルでも、ＢＳＡ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏ ｒｄ，ＩＬ）を用いて標準曲線を作製した。アッセイは、製造業者の指示に従っ て実施した。標準曲線は、Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ IIｃｉコンピュ いてプロットした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットアッセイ 全てのゲル、緩衝液及び電気泳動装置はＮｏｖｅｘ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃ Ａ）から入手し、製造業者の指示に従って操作した。簡潔に言えば、試料をＭｉ ｌｌｉ−Ｑ−Ｈ₂Ｏに等タンパク質濃度に稀釈し、２００ｍＭ ＤＴＴを含む試 料インキュベーション緩衝液と１：１混合した。試料を１００℃で１５分間イン キュベートし、予形成した１２％トリス−グリシンゲル上に充填した。試料を１ ２５Ｖで１時間４５分電気泳動させた。市販のキット（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ）を用いてコロイ ドクーマシー染色によりゲルを発色させた。 ウエスタンブロット法では、タンパク質を２５Ｖで４０分間ＰＶＤＦ膜に移し 取った。膜をＭｉｌｌｉ−Ｑ−Ｈ₂Ｏで洗浄し、風乾した。一次抗体は、Ｔｒｐ Ｅ−ＨＰＶ１１ Ｌ１融合タンパク質に対するポリクローナルウサギ抗血清（Ｄ ．Ｂｒｏｗｎ博士から恵与）であった。抗血清をブロッティング緩衝液（６．２ ５ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ７．２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２％Ｎ ａＮ₃中５％脱脂粉乳）に稀釈して抗体溶液を調製した。インキュベーションは ２０〜２３℃で少なくとも１時間行った。Ｐ ＢＳ（６．２５ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ７．２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ） を３回変えて、各１分ずつブロットを洗浄した。二次抗体は、ヤギ抗ウサギＩｇ Ｇアルカリホスフアターゼ結合抗血清（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ ）をブロッティング緩衝液に稀釈して調製した。上記と同じ条件下に少なくとも １時間インキュベーションを行った。ブロットを上記のように洗浄し、１ステッ プＮＢＴ／ＢＣＩＰ基質（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いて検 出した。 実施例３８ 組換えＨＰＶ６ａ型Ｌ１キャプシドタンパク質の精製 特に記載のない限り、全てのステップは４℃で実施した。 細胞を−７０℃で凍結した。凍結細胞（湿潤重量＝６０ｇ）を４５℃の水浴中 で解凍し、３００ｍｌの「破壊緩衝液」（５０ｍＭ ＭＯＰＳ、ｐＨ７．２、５ ００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ₂）に再懸濁した。プロテアーゼ阻害剤 ＡＥＢＳＦ及びペプスタチンＡを、それぞれ１ｍＭ及び１．７μＭの最終濃度ま で加えた。細胞スラリーを、約１６，０００ｐｓｉの圧力下に、Ｍ１１０−Ｙ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ（Ｍｉｃｒｏｆｕｉｄｉｃｓ Ｃｏｒ ｐ．，Ｎｅｗｔｏｎ，ＭＡ）に４回通して破壊した。破壊された細胞スラリーに 、十分量の１０％トリトンＸ−１０ を加え、トリトンＸ−１００の濃度を０．５％とした。スラリーを１８時間攪拌 した。トリトンＸ−１００で処理した溶解物を１２，０００×ｇで４０分間遠心 して細胞片を除去した。Ｌ１タンパク質を含む上清液を回収した。 上清液を、３００Ｋの接面流動膜カセット（Ｆｉｌｔｒｏｎ，Ｎｏｒｔｈｂｏ ｒｏｕｇｈ，ＭＡ）を用い、５容量の２０ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ７．２ 、０．５Ｍ ＮａＣｌに対して透析した。ラジオイムノアッセイ及びウエスタン ブロッティングにより、膜で保持された物質はもとの量の≧９０％のＬ１タンパ ク質を含むことが証明された。 保持された物質を、２０ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ ０ＨＳ樹脂（ｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ，ＭＡ）の高分離能のアフィニティーカラム〔５．０ｃｍ（内径）×１０．０ｃ ｍ〕にかけた。平衡緩衝液で洗浄した後、Ｌ１タンパク質を、２０ｍＭ リン酸 ナトリウム、ｐＨ７．２中線形勾配の０．５→１．５ Ｍ ＮａＣｌで溶離した。洗浄・溶離中に画分を補集した。Ｂｒａｄｆｏｒｄ法 に従い、カラム画分を全タンパク質についてアッセイした。次いで、画分を、ウ エスタンブロッティング、及びコロイドクーマシー検出を用いるＳＤＳ−ＰＡＧ Ｅにより分析した。画分をさらにラジオイムノアッセイにより分析した。 同程度の純度及び濃度のＬ１タンパク質を示すカラム画分をプールした。プー ルした画分を０．２２μｍ膜を通して無菌濾過した。４〜６ｐｓｉのＮ₂圧下に ４３ｍｍのＹＭ−１００フラットシート膜（Ａｍｉｃｏｎ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍ Ａ）を用い、５０ｍｌ容量の攪拌セル中で濃縮した。生成物を４℃で保存した。 この処理により、合計２．７ｍｇのタンパク質を得た。 最終生成物の試料を、ＴＣＡ沈降法によりさらに濃縮し、ウエスタンブロッテ ィング、及びコロイドクーマシー検出を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した 。Ｌ１タンパク質は、コロイドクーマシー染色ゲルのデンシトメトリーにより≧ ９０％ホモジニアスであることが証明された。Ｌ１タンパク質をウエスタンブロ ッティングにより同定した。 Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｐｒｏｂｅ（Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔ ｅｒ，ＰＡ）により電子顕微鏡分析を行う。試料のアリコートを２００メッシュ 炭素コーティング銅グリッド上に置く。グリッド上に１滴の２％リンタングステ ン酸、ｐＨ７．０を２０秒間置く。ＴＥＭ検査の前にグリッドを風乾する。全顕 微鏡検査は、１００ｋＶの加速電圧でＪＥＯＬ １００ＣＸ透過電子顕微鏡（Ｊ ＥＯＬ ＵＳＡ，Ｉｎｃ．）を用いて実施する。作製された顕微鏡写真は１００ ，０００×の最終倍率を有する。全タンパク質のＢｒａｄｆｏｒｄアッセイ ｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いて全タンパク質をアッセイした。試料を Ｍｉｌｌｉ−Ｑ−Ｈ₂Ｏに適切なレベルで稀釈した。必要な容量は、標準プロト コル及びマイクロアッセイプロトコルに対して、それぞれ０．１ｍｌ及び１．０ ｍｌであった。どちらのプロトコルでも、ＢＳＡ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏ ｒｄ，ＩＬ）を用いて標準曲線を作製した。アッセイは、製造業者の指示に従っ て実施した。標準曲線は、Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ IIｃｉコンピュ てプロットした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットアッセイ 全てのゲル、緩衝液及び電気泳動装置はＮｏｖｅｘ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃ Ａ）から入手し、製造業者の指示に従って操作した。簡潔に言えば、試料をＭｉ ｌｌｉ−Ｑ−Ｈ₂Ｏに等タンパク質濃度に稀釈し、２００ｍＭ ＤＴＴを含む試 料インキュベーション緩衝液と１：１混合した。試料を１００℃で１５分間イン キュベートし、予形成した１２％トリス−グリシンゲル上に充填した。試料を１ ２５Ｖで１時間４５分電気泳動させた。市販のキット（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ）を用いてコロイ ドクーマシー染色によりゲルを発色させた。 ウエスタンブロット法では、タンパク質を２５Ｖで４０分間ＰＶＤＦ膜に移し 取った。膜をＭｉｌｌｉ−Ｑ−Ｈ₂Ｏで洗浄し、風乾した。一次抗体は、アルカ リホスファターゼ酵素（Ｊ．Ｃｏｏｋ，ＭＲＬ）に共有結合させたＭＡＢ８３７ （Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．，Ｔｅｍｅｃｕｌ ａ，ＣＡ）であった。抗血清をブロッティング緩衝液（６．２５ｍＭ リン酸ナ トリウム、ｐＨ７．２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２％ＮａＮ₃中 ５％脱脂粉乳）に稀釈して抗体溶液を調製した。インキュベーションは２０〜２ ３℃で少なくとも１時間行った。ＰＢＳ（６．２５ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐ Ｈ７．２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）を３回変えて、各１分ずつブロットを洗浄し た。１ステップＮＢＴ／ＢＣＩＰ基質（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ ）を用いてブロットを検出した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｌ 33/569 Ａ６１Ｋ 37/02 // Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，Ｕ Ｇ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｃ Ａ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＧ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ， ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ ，ＵＺ (72)発明者 クツク，ジエイムズ・シイ，ザ・サード アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカー ン・アベニユー・126 (72)発明者 ジヨージ，ヒユー・エイ アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカー ン・アベニユー・126 (72)発明者 ホフマン，キヤスリン・ジエイ アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカー ン・アベニユー・126 (72)発明者 ジヤンセン，キヤスリン・ユー アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカー ン・アベニユー・126 (72)発明者 ジヨイス，ジヨージフ・ジー アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカー ン・アベニユー・126 (72)発明者 マークス，ヘンリー・ゼツド アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカー ン・アベニユー・126 (72)発明者 シユルツ，ローレン・デイ アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカー ン・アベニユー・126

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． パピローマウイルスから分離・精製されたキャプシドタンパク質であって 、Ｌ１タンパク質、Ｌ２タンパク質、Ｌ１＋Ｌ２タンパク質及びそれらの機能性 誘導体から選択され、少なくとも７０％の純度を有する前記タンパク質。 ２． パピローマウイルスが、ヒトパピローマウイルス及びワタオノウサギパピ ローマウイルスからなる群から選択される、請求項１に記載の精製タンパク質。 ３． ヒトパピローマウイルスが、ＨＰＶ６ａ、ＨＰＶ６ｂ、ＨＰＶ１１、ＨＰ Ｖ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ４１、ＨＰ Ｖ４５及びＨＰＶ５８からなる群から選択される、請求項２に記載の精製タンパ ク質。 ４． タンパク質が、組換え宿主を含む合成系により産生される、請求項１に記 載の精製タンパク質。 ５． 請求項１に記載のタンパク質からなるキャプシド。 ６． 請求項１に記載のタンパク質からなるウイルス様粒子。 ７． 請求項１に記載の精製タンパク質を製造する方法で あって、 （ａ）パピローマウイルスＬ１タンパク質、パピローマウイルスＬ２タンパク質 、パピローマウイルスＬ１＋Ｌ２タンパク質及びそれらの機能性誘導体から選択 されるタンパク質をコードする組換えＤＮＡ分子で宿主を形質転換するステップ ； （ｂ）形質転換された宿主を、組換えＤＮＡ分子を発現させて粗組換えパピロー マウイルスタンパク質を産生させ得る条件下に培養するステップ； （ｃ）粗組換えパピローマウイルスタンパク質を精製して、精製タンパク質を製 造するステップ を含む前記方法。 ８． 請求項７に記載の方法により産生された組換えパピローマウイルスタンパ ク質。 ９． 請求項７に記載のタンパク質からなるキャプシド。 １０． 請求項７に記載のタンパク質からなるウイルス様粒子。 １１． 請求項１に記載のタンパク質を含むワクチン。 １２． 請求項１に記載のタンパク質を含む医薬組成物。 １３． パピローマウイルスタンパク質をコードする組換 えＤＮＡ分子、精製パピローマウイルスタンパク質、精製パピローマウイルスタ ンパク質からなるウイルス様粒子、パピローマウイルスタンパク質に対する抗体 及びウイルス様粒子に対する抗体からなる群から選択される試薬を含む、パピロ ーマウイルス又はパピローマウイルスに対する抗体を検出するためのキット。 １４． キャプシドに組み立てられた組換えパピローマウイルスキャプシドタン パク質を産生させる方法であって、 （ａ）少なくとも１種のパピローマウイルスキャプシドタンパク質をコードする パピローマウイルス遺伝子をベクターにクローン化するステップ； （ｂ）該ベタターを宿主細胞に移入して、組換え宿主細胞を産生させるステップ ； （ｃ）該組換え宿主細胞を、パピローマウイルスキャプシドタンパク質を産生さ せる条件下に培養するステップ；及び （ｄ）該パピローマウイルスキャプシドタンパク質を、キャプシドの形成を可能 にする条件下に精製するステップ を含む前記方法。 １５． 請求項１４に記載の方法により産生されたキャプ シド。 １６． 請求項１５に記載のキャプシドからなるウイルス様粒子。 １７． ヒト以外の動物に請求項１に記載のタンパク質を投与することを含む、 前記動物に免疫応答を誘発させる方法。 １８． 請求項６に記載のウイルス様粒子を含む医薬組成物。 １９． 請求項５に記載のキャプシドを含む医薬組成物。 ２０． 形質転換昆虫細胞、形質転換酵母細胞、形質転換細菌細胞、形質転換真 菌細胞、形質転換植物細胞及び形質転換動物細胞から選択される、請求項４に記 載の合成系。 ２１． 少なくとも１種の精製パピローマウイルスタンパク質からなる精製ウイ ルス様粒子を生産する方法であって、 （ａ）少なくとも１種の粗パピローマウイルスタンパク質を含む溶液をアニオン 交換クロマトグラフィーで処理して、部分精製されたパピローマウイルスタンパ ク質を産生させるステップ； （ｂ）処理された部分精製パピローマウイルスタンパク質を硫酸アンモニウム沈 降にかけるステップ；及び （ｃ）該タンパク質をサイズ排除クロマトグラフィーにかけてさらに精製するス テップ を含む前記方法。 ２２． 組換えパピローマウイルスタンパク質を含み且つ少なくとも７０％の純 度を有する、パピローマウイルスのウイルス様粒子。 ２３． 少なくとも１種の精製パピローマウイルスタンパク質からなる精製キャ プシドタンパク質を製造する方法であって、 （ａ）少なくとも１種の粗パピローマウイルスタンパク質を含む溶液をアニオン 交換クロマトグラフィーにかけて処理し、部分精製パピローマウイルスタンパク 質を生産するステップ； （ｂ）処理された部分精製パピローマウイルスタンパク質を硫酸アンモニウム沈 降にかけるステップ；及び （ｃ）該タンパク質をサイズ排除クロマトグラフィーにかけてさらに精製するス テップ を含む前記方法。 ２４． 組換えパピローマウイルスタンパク質を含み且つ少なくとも７０％の純 度を有する、パピローマウイルスの キャプシド。