JPH11500421A

JPH11500421A - 生物学的材料の大量低温保存法及び低温保存され、そして封入された生物学的材料の使用法

Info

Publication number: JPH11500421A
Application number: JP8521872A
Authority: JP
Inventors: ブイ．ラヨテ，レイ; アール．ティー．ラケイ，ジョナサン; エーオー，ジーリアン; コルビー，シー．ブッド; フラッシュナー，マイケル; エス．コーブット，グレゴリー; エル．ワーノック，ガース
Original assignee: University of Alberta
Current assignee: University of Alberta
Priority date: 1995-01-12
Filing date: 1996-01-16
Publication date: 1999-01-12
Also published as: CA2209952A1; AU4701596A; EP0802726A2; CA2146098A1; US5863715A; WO1996021351A3; WO1996021351A2

Abstract

(57)【要約】生物学的材料を大量低温保存するための方法は、凍結防止剤により処理される生物学的材料を含む柔軟な容器、たとえばフリーザーバッグを供給し、そして前記生物学的材料を、長期貯蔵のために−100℃以下及び好ましくは−196℃以下に凍結する段階を包含する。好ましい態様においては、前記バッグは、そのバッグのすべての領域に及びそれからの均等な熱伝達を促進するために、前記バッグの横断面積を実質的に一定して且つ十分に小さく（たとえば約５mmの幅）維持するホルダーに配置される。これは、約−7.5℃から約−40℃〜−80℃の範囲の温度への調節され且つ均等な遅い冷却を可能にする過冷却の後、生物学的材料の均等な核形成を促進し、それにより細胞の生存性を維持する。本発明はまた、低温保存の前、生物学的材料の封入を提供し、それにより、前記材料はゲル、たとえばアルギン酸塩に封入される。輸送、培養での貯蔵、及び封入の使用を通しての移植のために生物学的材料を安定化するための方法が、さらに提供される。前記材料の封入はまた、封入されていない材料よりもその生存性の保持を改良し、又は助ける。

Description

【発明の詳細な説明】生物学的材料の大量低温保存法及び低温保存され、そして封入された生物学的材料の使用法発明の分野本発明は、生物学的材料の低温保存法及びその使用法に関する。より詳しくは、本発明は、生物学的材料、たとえば組織、小島及び他の細胞、並びに封入された材料の大量低温保存法に関する。発明の背景低温保存は、生物学的材料、たとえば小島の長期貯蔵のための効果的な方法であった。臨床学的移植への使用のための細胞及び組織の長期貯蔵は、適切なドナー細胞又は組織を採取し、そして患者への移植のために適切である時点でそれを利用可能にする固有の必要性に基づかれている。たとえば、ヒト膵臓から十分な数のランゲルハンス島を単離し、そし精製するための現在の方法は制限され、そして複数のドナーがインシュリン依存性糖尿病の好結果をもたらす逆転のために必要とされるので、長期の貯蔵が続く移植のための適切な量の島の採取を可能にする。また、長期の貯蔵により、受容体プールが他の医療センターにおける患者を含めるために拡張され得る。現在のランゲルハンス島の低温保存法は本来、ゲッ歯動物の小島の低温保存のために開発された方法に一般的に基づかれている。Rajotteなど．、“Viability Studies on Frozen-Thawed Rat Islets of Langerhans,”Cryobiology，14：11 6-120（1977）(引用により本明細書に組込まれる)を参照のこと。それらの方法は、複数のガラス凍結管及びそれらの個々のガラス凍結管当たり小量の小島を用いる。それらの凍結−融解手段が大きな動物及びヒトに拡張される場合、より多くの数の凍結管が高められた数の凍結される小島を収容するために必要とされる。これは、典型的なヒト小島単離のために総計30〜40本の管に達する。また、多数の凍結管の低温保存は、大きな労力を要し、そして微生物汚染に対して高められた可能性を有する。さらに、低温貯蔵の間、ガラス管中への液体窒素の漏れは、液体窒素を排出しないで融解される場合、それらの管はたぶん、破裂するであろうから、潜在的に危険である。従って、汚染又は損失の最少の危険性を伴って且つ効果的に、大量（たとえば、単離された小島の全調製物）に生物学的材料を低温保存するためのより効果的方法を提供する必要性がある。また、複数のドナーが通常、材料、たとえば小島の適切な量での採取のために必要とされるので、移植のための生物学的材料の生存性を安定化し、供給し、そして保持するためのより効果的な方法を提供する必要性も存在する。時間にわたってのそれらの材料の採取は正しい貯蔵及び次に培養を必要とし；従って、それらの工程における改良が必要とされ、それにより材料の生存性が保持される。発明の要約本発明は、従来技術の問題及び欠点を回避する、生物学的材料の低温保存方法に向けられる。本発明の方法は、次の段階を包含する：（１）生物学的材料及び凍結防止剤の溶液を含む柔軟な容器を供給する段階；（２）前記生物学的材料の温度を約−100℃又はそれ以下に低める段階；及び（３）段階（２）の間、前記材料のすべての領域からの実質的に均等な熱伝達を維持する段階。その均等な熱伝達は、生物学的材料のすべての凍結を促進せしめる。次に、前記溶液は長期低温貯蔵を容易にできる。単一のフリーザーバッグ法は、類似するか又は改良された回復性を有する従来の複数管低温保存法に比較して、多量の材料、たとえば単離された小島の全調製物の低温保存を促進する。さらに、単一のフリーザーバッグ法は、微生物汚染の危険性、すなわち、低温保存の凍結−融解サイクルの前、間及び後で、複数の管に材料を添加し、そしてそれらの管から材料を除去する場合の問題を減じる。密封されたバッグ構造はまた、そのバッグ中に漏れ、そして材料を融解する場合、そのバッグの破裂を引き起こす貯蔵液体（たとえば液体窒素）の危険性も減じる。好ましい態様において、バッグは、そのバッグのすべての領域への及びその領域からの均等な熱伝達を促進するのに十分な、実質的に一定し且つ小さなバッグの断面積を維持するホルダーに配置される。これは、遅い冷却相を通して調節された遅い冷却を可能にする過冷却の後、生物学的材料の均等な核形成を促進し、これにより細胞の生存性を維持する。本発明はまた、低温保存の前、生物学的材料の封入にも向けられる。封入は、最初に封入されていなければ、低温保存の間、ばらばらにこわれる脆い細胞、たとえばブタの小島を凍結する場合、特に重要である。典型的には、小島、又は生物学的材料の個々の細胞は、可逆的にゲル化できる材料、たとえばアガロース又はアルギン酸塩の水溶液に懸濁される。より容易に輸送され得、そして次に、封入を通して長時間、貯蔵され得るように細胞を安定化するための方法がまた、本発明により提供される。封入された細胞が移植のための細胞の寿命及び生存性を高めることもまた、本発明の一部である。たとえば、少数の封入された小島は、封入されていないか又は裸の小島と同じレベルの血漿グルコースを移植された糖尿病動物において維持することが必要とされる。低温保存への使用のための特定のバッグ及びホルダーがさらに提供される。特に、バッグ又は柔軟な容器は、生存性試験のために使用され得る補助低温保存貯蔵単位を供給する、２つの側部空間に別々の及び分離可能な区画を有する。ホルダーは、柔軟な容器からの均等な熱伝導又は均等な熱排出を促進する。ホルダーは、２つの実質的に平面のパネル、及び柔軟な容器がそれらのパネル内に配置され、実質的に均等な熱伝導を可能にする、実質的に均等な間隔でそれらのパネルを保持するための手段を含んで成る。上記は、従来技術のいくつかの欠点及び本発明の利点の簡単な説明である。本発明の他の特徴、利点及び態様は、次の説明、添付図面及び請求の範囲から当業者に明らかになるであろう。図面の簡単な説明図１、低温保存方法の基本的な段階の図的な表示である。図２は、本発明に従って構成される低温保存用バッグ及びバッグホルダーの透視図であり、そして開放位置でのホルダーを示している。図３は、閉鎖位置での図２のホルダーの断面図である。図４は、塊状物が凍結される場合の融合の潜熱の開放を通して冷却される生物学的材料の４種の温度プロフィールを示す。それらのプロフィールは、その塊状物を通して実質的に均等な熱伝達及び温度低下を示す。３種のプロフィールが、図２及び３に示されるバッグ及びホルダーに従って構成されたフリーザーバッグ及びホルダーアセンブリーにおいて処理される生物学的材料の塊状物において分布される３種のサーモカップル又はプローブ(Ｐ₁，Ｐ₂、及びＰ₃)から得られた。４番目のプロフィール（比較プロフィール）は、バッグの外側に位置するサーモカップル又はプローブ(Ｐ₄)から得られた。図５は、本発明に従っての生物学的材料の塊状物の調節され、そして均等な温度低下を示す、約−40℃まで下がる低温保存の遅い冷却相を通しての同じプローブについての図４の温度プロフィールの連続を示す。（冷却速度は、約0.25℃／分であった。）図６は、２つの小さな区画を有する原型フリーザーバッグの図を示し、ここで小サンプルが生存性及び／又は無菌性の評価のために開放され得る。図７は、単一のフリーザーバッグ：◆又はガラスフリーザー管：▼のいづれかにおいて低温保存されたイヌ小島のグルコース刺激の後でのインスリン分泌を示す。好ましい態様の記載用語、凍結防止剤は、本明細書において使用される。次の定義が、本発明を限定するよりもむしろ開示を助けるために提供される。用語“凍結防止剤”は、氷結晶の形成を阻害し、そして細胞及び組織に対する浸透応力を最小にすることによって、凍結の間、生物学的損傷を防ぐ剤を言及する。生物学的材料の低温保存及び続く回収は一般的に３種の段階を包含する。図１を参照すれば、それらの段階は、（１）低温保存されるべき生物学的材料を含む溶液に凍結防止剤を添加する段階；（２）貯蔵のための予備選択された温度に段階１の溶液を冷却する段階；及び（３）段階２で生成される塊状物を融解した後、スクロースを用いて又は遅い段階的な希釈により前記凍結防止剤を除去する段階を包含する。大量低温保存を包含する本発明によれば、凍結防止剤、好ましくはジメチルスルホキシド（DMSO）が、興味ある生物学的材料（この後、“サンプル”と称す）、たとえばランゲルハンス島に添加される。小島が組織培養培地、たとえば当業者に明らかなように、血清及び抗生物質により補充された培地199 （Gibco，カタログ＃ 12340-022，Burlington，ON）に懸濁される。凍結防止剤が細胞に平衡化された後、その混合物は、−7.5℃に過冷却され、そして次に核形成される。時間の経過が、融合の潜熱の開放を可能にし、その結果、全混合物が完全に凍結される。次に凍結された塊状物が、約−40℃〜−80℃の範囲の中間温度に約0.25℃／分でゆっくり冷却される。混合物がこの温度に達した後、それは、一般的に−100℃以下及び好ましくは−196℃ぐらいである、生物学的活性がひじょうに遅い温度に急速に冷却される。中間温度から貯蔵温度、たとえば−19 6℃にサンプルを急速に冷却するために、サンプルは、貯蔵のためにサンプルをすばやく凍結する液体窒素中に沈められる。低温保存された材料が必要とされる場合、それは貯蔵から回収され、そして約150℃〜200℃／分で０℃まで急速に融解され、そして次に、氷スライスに置かれる。次に、凍結防止剤が、スクロース又は遅い段階的な希釈のいづれかにより除去され、その後、等張媒体に移され、そしてインビトロ生存性試験又は移植のために用意される。本発明の方法を実施する場合、サンプルは、好ましくは柔軟である容器又はプラスチックバッグ、たとえば約40℃〜−200℃までの温度変化を耐えることができ、そして従って、低温保存の間、温度の変動を耐えることができるフリーザーバッグに配置される。１つの適切なタイプのフリーザーバッグは、商品名Cryocy teフリーザーバッグとして、Baxter Healthcare Corporation，Fenwal Division ，Deerfield，IL，60015，USAから市販されている。広範囲の容器又はバッグサイズが用いられ得るが、本発明は例示目的のために、 500mlのバッグとして記載する。但し、これは本発明を限定するものではない。しかしながら、容器又はプラスチックバッグは、約50ml〜約500mlの容積の範囲であり得る。典型的には、容器又はバッグの容積は、少なくとも約50mlであろう。凍結又は融解の間、フリーザーバッグ内の実質的にすべての領域への及び領域からの熱伝達は、温度傾斜を最少にし、そして従って、室温から４℃、４℃から −7.5℃、−7.5℃から中間温度（たとえば−40℃）、中間温度から−196℃までの均等且つ調節された冷却、及び−196℃から均等且つ調節された融解を確保するために、実質的に均等に維持されることが重要である。図２及び３を参照すれば、フリーザーバッグに配置される材料のすべての領域への及びその領域からの均等な熱伝達を促進するためのフリーザーバッグ及びホルダーアセンブリーが、本発明に従って示されている。図２を参照すれば、フリーザーバッグ２は、主要チャンバー部分４、材料が主要チャンバー部分４中に及びそれから移行され得る入口及び出口部分６及び８を包含する上方部分３ａ、及びバッグの取り扱いのための従来の低部タブ部分３ｂを包含する。入口６及び出口８は、当業界において知られているような閉鎖機構又はキャップ（示されていない）を供給される。上方部分３ａから個々に付随する１対の側部空間の小さな区画を有するバッグ２（図６）を供給することにも、また向けられる。個々の小さな区画は、主要チャンバー部分４における材料の、生存性試験のために及び生存性のインジケーターとして使用され得る補助低温保存貯蔵単位を供給する。フリーザーバッグは、使用フリーザーバッグから２つの小さな側部区画中への既知体積の組織調製物の逆流を可能にするよう特別に企画されている。２つの隔壁がその管に配置されるであろう。１つは、側部に侵入する管の上方に配置され、そして他の１つはその下方に配置される。スパイクを含む管は、主要フリーザーバッグ中に溶液を投入する場合、両隔壁を通して配置される。小島又は材料を含む溶液が側部区画中に投入される予定である場合、スパイクは一部、除去され、前記側部区画中への組織の逆流を可能にされる。側部区画への組織の投入が完結した後、スパイクは除去され、そして次に、主要フリーザーを側部バッグに連結する管が密封される。側部バッグは微生物学的及び生存性試験のために除去され得、そして調製物の残りは低温保存のまま存続する。フリーザーバッグは、下記で詳細に説明されるであろうホルダー 10に配置される。ホルダー10は、ヒンジ16を通して軸ピンでお互い結合される、フロントパネル 12及びリヤパネル14を含む。リヤパネル14は、側壁18ａ，18ｂ，18ｃ及び18ｄを含む。側壁18ａ及び18ｃは、開口部を含み、その結果、バッグ２の部分３ａ及び３ｂがそれらを通して拡張することができる。側壁18ａ−ｄはまた、フロントパネル18とかみ合うように形状化され、その結果、それぞれ、フロント及びリアパネルの実質的な平面の内面20及び22は、パネルが図３における側面図から示されるように閉鎖位置にある場合、実質的に平行に維持される。この態様においては、好ましくは均等な熱伝達のために均等な厚さを有する、バッグ２の前壁及び後壁は、実質的に平行して存続し、その結果、バッグの厚さは、そのバッグがホルダー10内に満たされ、そして固定される場合、バッグ２内の流体の温度又はその配向性に関係なく、均等又は一定して存続する。側壁18ａ−ｄの高さはまた、均等なバッグの厚さを達成するためにバッグサイズに従って選択される。均等なバッグの厚さは、図４−５に示されるように、バッグに配置される溶液のすべての領域への及びそれからの均等な熱伝達を促進する。好ましい態様においては、ホルダー10は、約５mm±10％の均等なバッグの厚さを維持するように構成される。バッグがホルダー形態に合致でき、そして満たされる場合、均等な厚さの一般的に平らな形状を有することを確保するためには、柔軟なバッグが使用される場合、バッグは好ましくは、単に部分的に満たされる。たとえば、500mlの容積のバッグは好ましくは、サンプル及び凍結防止剤を含んで成る約100mlの溶液により満たされる。容積まで満たされる場合、バッグの側壁がふくらみ、それにより、バッグの厚さを不均等にする。多くの均等に分配された開口部24は、バッグの前及び後壁の実質的な部分と、バッグへの及びそれからの熱伝達を高めるための冷媒との間に直接的な接触を提供するためにパネル12及び14に形成される。穴の均等な分布はまた、冷却及び加熱相の間、バッグ内の均等な熱伝達の維持を高める。さらに、ホルダーは好ましくは、高い熱伝導性を有する材料を含んで成り、その結果、バッグと環境との間の熱交換が容易に生じ得る。適切な材料の例は、たとえばアルミニウム、ステンレス鋼及び同様のものを包含し、そしてステンレス鋼が好ましい。ホルダー10はまた、パネルを一緒に固定し、そして閉鎖位置にホルダー10を維持するために供給されるラッチ26を含む。ラッチ26は、ピン28を通してパネル22 に軸ピンで結合されているように示されているが、しかし他方においては、パネル12に結合され得る。閉鎖位置にホルダー10を固定するためには、パネル12及び 14はお互い直面するように軸ピンで取付けられる。次に、ラッチ26は矢印28の方向に軸ピンで取付けられ、その結果、ラッチの空間アーム28ａ及び28ｂはパネル 12及び14をかみ合す。特定のラッチが記載されて来たが、他の機構、たとえばフックラッチ、クランプラッチ、外部クランプ、等が、ホルダー10を閉鎖位置に固定するために使用され得る。さらに、特定のホルダーの形状がバッグのすべての領域からの実質的に均一な熱伝導を促進するために記載されて来たが、このような均一な熱伝導に好適な他の形状においてそのバッグを維持するホルダーを使用することもできる。図４及び５は、上記のようなホルダー10に従って構成されたホルダー内に封入される場合、500mlのフリーザーバッグにおける２ＭのDMSO溶液100mlの冷却の均等性を示す。ホルダーはステンレス鋼から加工された。それらの図における温度プロフィールは、４種の温度プローブから得られた。第１のプローブは、バッグの上部領域の上部端から約１／３の位置に配置された。第２プローブは、バッグの中間領域に配置された。第３プローブは、バッグの低部領域の下部端から上方に約１／３の位置に配置された。第４のプローブは、周囲温度、たとえば、バッグが冷却槽に配置される場合のその槽の温度を測定するためにバッグの外部上に配置された。前記第１、第２、第３及び第４プローブからのデータを表わす曲線は、それぞれ、参照特徴Ｐ₁，Ｐ₂，Ｐ₃及びＰ₄により表示される。図４及び５に示されるように、熱伝達は、過冷却を通しての初期冷却から約− 7.5℃までの（図４）及び約−40℃で完結される遅い冷却相（図５）を通してのバッグのすべての領域の実質的に均等な温度低下を伴って急速であった。過冷却の間、生物学的材料のすべての領域の均等な温度は、そのサンプルが−7.5℃から、サンプルに依存して約−40℃〜約−80℃の範囲であり得る中間温度までの遅い調節された冷却の間、完全に凍結されることを確保するために決定的である。中間温度に達した後すぐに、サンプルは、長期の貯蔵のために約−100℃以下及び好ましくは−196℃以下である貯蔵温度に急速に冷却される。島のためには、サンプルは、それが遅い冷却相の間、−40℃に達した後すぐに急速に冷却され得る。他の材料は、所望する回復性を提供するために急速な冷却の前、約−80℃までの遅い冷却を必要とする。しかしながら、いづれにせよ、遅い冷却相は−80℃ まで続けられ得る（急速な冷却の前、最少の細胞内氷を確保するために）。多量の溶液がフリーザーバッグ、たとえば200mlのバッグに使用される予定である場合、播種槽における長い平衡化期間が、フリーザーバッグ内の溶液の温度を、核形成の前、その播種槽の温度まで減じることを確保するために必要とされる。本発明の大量低温保存法は、広範囲の生物学的材料、たとえば島、たとえばヒトランゲルハンス島、ブタ小島、及びラット小島、並びに他の細胞型、たとえば肝細胞、神経内分泌細胞、増殖細胞、及びホルモン、サイトカイン、リンホカイン及び細胞増殖調節体を分泌する細胞系（但し、これらだけには制限されない）の低温保存のために使用され得る。当業者に明らかなように、それらの細胞及び組織は、哺乳類組織、一次培養細胞、生物学的生成物を生成する培養された細胞系、及び遺伝子的に構築された細胞系から得られる。バッグのサイズ、及び従って、極低温保存される材料の量はまた、臨床学的用途に依存して、変化することができる。一般的な低温保存法イヌ小島に関しての本発明の大量低温保存の一般的な方法が次に示される。しかしながら、他の材料、たとえば上記の材料もまた、上記と同じ方法を用いて保存され得る。上記の及び10％のウシ胎児血清及びペニシリン／ストレプトマイシンを含む組織培養培地199に懸濁されたイヌ小島のサンプルを、室温（約22℃）で500mlのバッグに置く。補充された培地199に調合された凍結防止剤DMSOを、フリーザーバッグ中に徐々に添加し、最終濃度を約0.5〜約2.0Ｍにする。２ＭのDMSO中、サンプル及び培地199の溶液約100mlを含むバッグを、上記のようにしてホルダー10に従って構成されたホルダーに置き、そしてホルダーを図３に示されるようにして閉じる。ホルダーはステンレス鋼製であり、そしてバッグの実質的に全主要部分を通して約５mm±10％の均等な内部断面のバッグを維持するよう加工される。次に、バッグ及びホルダーアセンブリーが氷槽に移され、サンプル培養培地及びDMSOを含む溶液の温度が約０℃に減じられる。次に、バッグ及びホルダーアセンブリーが播種槽に移され、ここでサンプルが約−7.5℃への過冷却を可能にされる。サンプルが−7.5℃に達した後すぐに、それは、たとえば氷結晶により核形成され、又は過冷却された金属棒がフリーザーバッグの側面に対して配置され、そしてサンプル及びDMSOを含む溶液から融合の潜熱の開放を可能にされる。過冷却を通して上記のように冷却された前述の調製物のための温度プロフィールは、図４に示されている。融合の潜熱の開放を可能にする時間は、約15〜20分である。懸濁液が凍結された後、バッグ及びホルダーアセンブリーは、冷却装置、たとえばFTS Systems，Inc.，Stone Ridge，New Yorkにより製造された、Rex−P90温度プログラマーを備えた RT209 Multicool槽に配置され、ここで前記懸濁は約−40℃まで、0.25℃／分でさらに冷却される。このサンプルのこの相についての温度プロフィールは、図５に示されている。次に、バッグ及びホルダーアセンブリーは、材料が貯蔵される約−196℃まで急速に冷却するために、容器に含まれる液体窒素中に入れられる。バッグが液体窒素温度に達した後すぐに、ホルダーは除かれ、そしてフリーザーバッグが液体窒素貯蔵タンクに貯蔵される。溶液の体積が前述の例において論ぜられた量とは異なる場合、その方法は、当業者に明らかなようにわずかに変更される。より詳しくは、フリーザーバッグにおけるその体積が高められる場合、核形成が実施される前、２ＭのDMSO溶液を過冷却するためにより長い時間が必要とされる。さらに、融合の潜熱の開放のための持続時間は、融合の潜熱のすべてが、遅い冷却工程の前、開放されることを確保するために延長される。凍結された小島が移植のために必要とされる場合、１又は複数のバッグが液体窒素貯蔵容器から取り出され、そして急速に、すなわち約200℃／分で融解される。これは、たとえば約40℃での水槽にバッグを配置することによって達成され得る。すなわち、約−40℃まで0.25℃／分での遅い冷却が用いられる場合、次に、−196℃からの急速な融解が、この場合、小島であるサンプルの最大の生存性のために必要とされる。しかしながら、約−80℃まで0.25℃／分での遅い冷却が用いられる場合、−196℃からの遅いか又は早い融解が用いられ得；しかしながら、遅い融解が、Rajotteなど．、“Optimizing Cryopreservation of Isolated Islets,”Transplantation Proceedings Vol.21，＃１(1989)，2638-2640pに示されるように、最大の生存性のために良好であり得る。小島に対する浸透応力を最少にするために、DMSOは、懸濁液の温度が約０℃に達した後すぐに、ゆっくり除去される。これは、スクロース希釈又は遅い段階的希釈のいづれかにより達成される。スクロース希釈が用いられる場合、融解された小島を含むフリーザーバッグが水槽から取られ、そしてシリコーン処理された250mlの遠心分離管中に流し込まれ、そして遠心分離される。上清液が除去され、そして0.75Ｍのスクロース25ml がその250mlの遠心分離管に添加され、そしてその温度が約30間、約０℃で維持される。管を軽く、５分ごとに混合し、小島を再懸濁する。次に、前記スクロースを、25mlの補充された培地199を徐々に添加することによって希釈する。これらのスクロース希釈段階は、室温で実施される。追加の培地199溶液のアリコート、すなわち最初の25ml、次の50ml及び最後の100mlが、５分ごとに、前記管に添加される。100mlの培地199溶液の最終添加の後、管は遠心分離され、そして上清液が除去され、そして10％血清及びペニシリン／ストレプトゾトシンを含む組織培養培地により置換される。次に、小島は、インビボ移植のために準備できている。スクロース希釈法は使用され得るが、遅い段階的希釈法は特定の利点を有する。たとえば、遅い段階的希釈法は、サンプルに対して物理的に損傷を与え、そして低い回復性をもたらす遠心分離を必要としない。すなわち、遅い段階的希釈法は、小島に対してほとんど緊張を与えない。その遅い段階的希釈法は、２ＭのDM SOに小島を含むバッグへの生理学的媒体の添加を包含する。媒体がバッグに添加される場合、フリーザーバッグ中のDMSOの濃度が低下する。凍結防止剤の添加及び除去の工程をより標準化し、且つ単純にするために、コンピューター制御されたシステムは、バッグを振盪する制御された撹拌装置を通して十分に混合されたバッグ内の組織の懸濁液を維持しながら、特定の時点で作用するように仕組まれた順序に従って、凍結防止剤を添加するために使用され得る。上記のバッグ及びホルダーアセンブリー低温保存法を用いる場合、単一の容器における大量の生物学的材料の低温保存は、類似する量の材料を貯蔵するために 30〜40本の15mlのガラス製フリーザー管の使用を包含する従来の管低温保存法に比較して、実質的に類似するか又は改良された回復性を達成された。さらに、本発明の方法に従って低温保存された生物学的材料は、生存性の有意な低下を伴わないで、長期の貯蔵を、均等に又は良好に耐えることができる。本発明は、特定の例により一層詳細に記載されるであろう。次の例は、例示目的のために提供され、そして本発明をいづれの態様においても限定するものではない。特に、次の例は、上記の利点のいくつかを例示するために提供されるものである。実施例１：ラット小島の低温保存この一連の実験においては、小島の回復率が、凍結防止剤DMSOの添加の後及び除去の後に評価された。対の実験においては、500のラット小島のグループを、単一の500mlのフリーザーバッグ又は４本の標準のガラス製フリーザー管に分けた。それらの結果は、フリーザーバッグ又はガラス管からの小島の実質的に等しい％回復率を示した（管については90±2.3％、フリーザーバッグについては92 ±4.8％）。それらの実験の有意性は、それらの実験が凍結防止剤DMSOがフリーザーバッグにおける小島に、小島の回復率においてわずか８％以下の損失を伴って、安全に添加され、そして除去され得ることを示すことである。それらは、バッグの構成成分が小島を害しないことを示す。実施例２：イヌ小島の低温保存既知数のイヌ小島（５〜8000個に等しい小島）を、６本のガラス管の最初のグループ中に分けた。同じ分離からの同等の数の小島を、単一の500mlのフリーザーバッグに配分した。小島を、凍結防止剤DMSOの段階的な添加により２Ｍの最終濃度にすることを包含する上記技法を用いて、低温保存した。次に、管及びバッグを、−7.5℃に過冷却し、そして過冷却された金属棒により核形成した。核形成の前、バッグを、ホルダー10に構造的に対応するステンレス鋼製ホルダーに配置し、そして約100mlに満たされたバッグの内部の厚さを約５mmに維持するために遠心分離した。融合の潜熱の開放を可能にした後、個々のフリーザーバッグを、約−40℃まで約0.25℃／分でゆっくり冷却した。管を同じ速度でゆっくり冷却した。次に、管及びバッグを、低温貯蔵のために液体窒素中に入れた。この低温で、貯蔵時間は明確でない。−196℃での約１〜２週間の貯蔵期間の後、管及びバッグを、40℃の水槽において、−196℃から急速に融解し、この後、DMSOをスクロース希釈法を用いてゆっくり除去した。凍結−融解された小島を計数し、そして％回復率を、凍結前及び凍結後の計数から計算した。次の表は、この実験からの回復率のデータを示す。前述から明らかなように、管及びバッグからの回復率範囲は実質的に類似する。洗い流すことにおける生存性試験の前、残る凍結−融解されたイヌ小島を、10 ％ウシ胎児血清、25mMのHEPES及びペニシリン／ストレプトマイシンにより補充されたCMRL溶液において37℃で48時間、培養した。洗い流すことにおいては、既知の数の小島を、インスリン含有物の決定のために集められた流出液により、低い（50mg／dL）及び高い(500mg／dL)グルコース溶液に暴露した。単一のフリーザーバッグ又は６本のガラス製フリーザー管のいづれかにおいて低温保存された、凍結−融解されたイヌ小島の機能的応答が、図７に示される。両グループからの小島は、比較的低い初期の基本的インシュリン分泌レベルを示す。インシュリン分泌は、高いグルコース刺激相の間、両グループにおいて高まる。両グループからの小島は、高いグルコース溶液の停止に続いて予備−刺激レベルに戻るインシュリン開放の典型的な二相パターンを示す。低グルコースの両相の間のインシュリン分泌と高グルコースの間のインシュリン分泌とを比較する計算された刺激指数は２つの実験グループ間で比較でき、すなわちフリーザーバッグにおいて低温保存された小島において2.7倍の上昇率が観察され、そして標準のガラス管において低温保存された小島においては、2.0倍の上昇率が観察された。実施例３：精製されていないヒト小島の低温保存追加の実験を、精製されていないヒト小島単離からの膵臓組織を用いて行なった。10人の多器官ドナーからのヒト膵臓微小断片を含む精製されていない小島を、低温保存した。次の表２は、10回の実験から得られたデータを示す。個々の実験においては、ヒト膵臓組織を、上記のように、単一のフリーザーバッグ及びホルダーシステム、及び10本のガラス製フリーザー管のいづれかに分配し、そしてその材料を約１〜４週間、低温保存した。バッグにおける小島組織を上記で論ぜられた手段を用いて低温保存し、そして管における小島組織を従来の技法を用いて低温保存した。それらの実験において得られる回復率を、次の表２に示す。表２におけるデータから明らかなように、それらの実験は、従来の管技法（56 ±10.9％）に比較して、フリーザーバッグ手段（61.7±8.9％）による低温保存の後、改良された回復率をもたらした。さらに、フリーザーバッグにおいて低温保存された精製されていないヒト小島におけるアミラーゼ濃度の33.2±5.5％の低下及び管におけるそのような濃度の43.3±13％の低下が存在した。封入された材料本発明のもう１つの態様においては、生物学的材料を、低温保存する前、封入する。封入段階は、ひじょうに脆い細胞、たとえば単離工程の後又は培養の間、脆く、そして封入しない場合、低温保存の間、典型的には、ばらばらにこわれるブタ小島を凍結する場合、特に重要である。封入はまた、細胞又は組織の構造を保護し、その結果、物理的な外傷にゆだねられる場合、組織培養物の生存性は実質的に影響されない。さらに、低温保存の前の封入は、凍結された細胞が輸送される第２の場所での封入を行なう必要性を回避する。細胞又は生物学的材料の封入は、それらの物理的な安定性を改良し、それらの低温保存、貯蔵、培養及び／又は場所間の輸送をより容易にする。封入された材料は、封入されていない材料よりも、移植後、より代謝的に効果的であり、より高い生存性及び機能性をもたらす。さらに、封入された細胞は、封入されていない細胞よりも、培養物から及び／又は低温保存の後、より容易に回復せしめられる。それらの封入された材料は、移植に効果的に使用され得る。典型的には、移植のために使用される封入されていない小島の数は、腹腔内（ip）投与される場合、kg体重当たり約10,000〜約30,000個の小島である。封入された小島が用いられる場合、より少ない数の小島が、封入されていない小島と同じレベルの血漿グルコース（移植後）を達成し又は維持するためには必要とされる。封入は、組織、又は細胞懸濁液を封入することを一般的に包含する工程であり、その結果、封入された組織又は細胞は、保護膜又は被膜内で生存したまま存続する。前記膜又は被膜は、栄養物、イオン、酸素、及び組織を維持し、そしてその正常な代謝機能を支持するために必要とされる他の材料に対しては透過性であるが、しかし細菌、リンパ球及び拒絶をもたらす免疫反応を担当するタイプの大きなタンパク質に対しては不透過性である。良く知られている封入方法の次の論議は、本発明の低温保存の前、生物学的材料を封入するために使用され得る適切な封入方法を例示するために提供される。しかしながら、本発明は下記の特定の封入法に従って封入される、低温保存される材料に制限されるものではなく、それらの方法は、例示のために単に提供されるものである。典型的には、生存組織又は個々の細胞を、可逆的にゲル化できる材料、たとえばアルギン酸ナトリウムの水溶液に懸濁し、そしてこの懸濁液の液滴を形成し、そしてゲル化溶液、たとえば塩化カルシウム中に落とす。この一般的な方法の１つの例は、アメリカ特許第4,352,883号（Lim）(引用により本明細書に組込まれる)に開示される。次に、そのようにして形成される一般的なカプセルを、外部半透被膜を形成するために、架橋ポリマー、たとえばポリリシン及びポリエチレンイミンにより処理する。液滴は典型的には、多量の液体懸濁液が蓄積する第１の部位にアルギネート懸濁液を供給することによって形成される。次に、その多量の液体懸濁液が、小さな液滴に分解されるように撹拌される。振動、遠心分離力、空気流及び静電荷を用いる装置が、小さな液滴を生成するために前記液体を撹拌するために使用されて来た。たとえば、アメリカ特許第4,692,284号（Brade n）、第4,386,895号(Sodickson)、第4,789,550号(Hummelなど.)、及び第4,814,2 74号（Shioyaなど）を参照のこと。それらの開示は引用により本明細書に組込まれる。上記大量低温保存法に従って大量に低温保存される封入された及び封入されていない材料についての％回復率を得るための実験を行なった。実施例４：封入されたイヌ小島の低温保存特に、既知数のイヌ小島を、単一の500mlフリーザーバッグ又は６本のガラス製フリーザー管中に配置した。さらに、同じ単離物からの既知の数のイヌ小島を、封入し、そして２つのグループに分け；１つを単一のフリーザーバッグにおいて低温保存し、そして他の１つを６本のガラス管において低温保存した。すべての小島を上記方法に従って低温保存した。それらの実験からのデータは、次の表３に記載される。イヌ膵臓からの単離された小島を、上記技法を用いて封入した。次に、小島を、上記技法を用いて低温保存した。−196℃での貯蔵の期間に続いて、フリーザーバッグ及びガラス管を、上記技法を用いて融解した。次に、低温保存に続く平均％回復率を計算し、そして表３に示す。低温保存の前、封入された小島の平均回復率は、フリーザーバッググループにおいては89±５％であり、そしてガラス管において低温保存された封入された小島についての回復率は93±13％であった。実施例５：封入された及び封入されていない小島のヌードマウス中への移植次に、残る凍結／融解された小島を糖尿病のヌードマウス中に移植し、そしてそれらの移植片の結果が表４に示される。 NODEマウスは、胸腺を欠いており、そして従っていづれのＴ細胞をも欠いており、そしてそれらは移植された組織を破壊する免疫応答を開始することができないので、小島組織の最適な受容体として働く、同系交配されたマウス株である。マウスは、アロキサン、すなわちβ細胞特異的トキシンの１回の静脈内注射により糖尿病にされた。腎被膜（KC）に創造された嚢中に移植された２千(2,000)個の封入されていない凍結−融解された小島は、基礎血液グルコースレベルを血糖正常まで戻すことに失敗した。低温保存の前、封入された2000又は4000個の凍結／融解された小島が糖尿病ヌードマウス中に腹腔内（IP）移植される場合、１匹を除いてすべての動物は、血糖正常レベルに血液グルコースレベルを戻した（ｎ_合計＝18）。それらの動物は、追従期間を通して血糖正常レベルを保持した。新しく単離された小島を移植する歴史的な対照はまた、比較目的のために表４に示されている。ガラス管又は単一のフリーザーバッグのいづれかにおいて低温保存された、封入された小島のインビボ小島機能における差異は存在しなかった。表４において、移植片生存結果が、“最初に列挙される日数”、次に“ｘ移植片の数”により提供される。実施例６：封入された小島対封入されていない小島の生存率低温保存の前、封入された小島の48時間の低温保存後の生存割合はまた、低温保存の前、封入されなかった小島に比較して高かった（表５）。低温保存に続く、37℃での48時間の組織培養後の小島の回復率は、フリーザーバッグにおいて低温保存された封入されていない小島については63.4％及びフリーザー管において低温保存された封入されていない小島については70.9％であった。低温保存の前、封入された小島に関しては、融解後の生存率は高く、そしてフリーザーバッグにおいて低温保存された封入された小島についての回復率は85.9 ％であり、そしてガラス管において低温保存された封入された小島についての回復率は72.2％であった。低温保存に続いて、37℃での24時間の組織培養後のブタ小島の回復率は、ガラス管において低温保存された封入されていない小島については３％であった。ガラス管における低温保存の前、封入されたブタ小島に関しては、融解後生存率は高く、平均53.5％の回復率を有した。表３，４，５及び５Ａから明らかなように、低温保存の後、改良された回復率、及び低温保存の前、封入された小島のより良好なインビボ機能が存在する。実施例７：ヌードマウスにおける、封入されていないイヌ小島及び封入されたイヌ小島の生存性の比較アルギネートの単一の被膜（SC）又は二重の被膜（DC）のいづれかにより封入されたイヌ小島、及び封入されていないか又は裸（NK）のイヌ小島を、ヌードマウス中に移植し、そしてそれらの移植片の結果が表６に示されている。封入されていないか又は裸の小島を、腎被膜に創造された嚢中に（TX）、又は腹腔内（IP ）に移植した。表６に示されるように、移植片生存能力の％は、封入されていない小島に関してよりも封入された小島に関してが高かった。実施例８：封入されていないイヌ小島及び封入されたイヌ小島の長期培養封入されていないか又は裸のイヌ小島（NK）及びアルギネートの単一被膜（SC ）により封入されたイヌ小島を、１，２、又は３週間、培養した。表７に示されるように、より高い％の封入された細胞が、ジチアゾン染色により検出されるように、裸の細胞よりも培養物から回復された。さらに、封入された培養細胞は、移植に続いて、糖尿病動物を支持するそれらの能力において卓越していた（表８を参照のこと）。上記は、本発明の特定の態様の詳細な記載である。開示される態様からの出発が本発明の範囲内で行なわれ、そして種々の変更が当業者により行なわれるであろうことは理解される。本発明の十分な範囲は、次の請求の範囲に示されている。従って、請求の範囲及び明細書は、本発明が権利を与えられる保護の十分な範囲を不正に狭ばめるものとして解釈されるべきではない。上記に引用される文献、特許及び特許文書は、引用により本明細書に組込まれる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ )，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ラケイ，ジョナサンアール．ティー. カナダ国，アルバータティー６イー１エス３，エドモントン，セブンティナインスアベニュ 10736 (72)発明者エーオー，ジーリアンカナダ国，アルバータティー６エイチ１ビー８，エドモントン，フィフティエイスアベニュ 10503 (72)発明者コルビー，シー．ブッドアメリカ合衆国，カリフォルニア 94022, ロスアルトスヒルズ，アリクレーン 26463 (72)発明者フラッシュナー，マイケルアメリカ合衆国，カリフォルニア 94526, ダンビル，ウィルシャーコート 128 (72)発明者コーブット，グレゴリーエス. カナダ国，アルバータティー６エイチ３アール５，エドモントン，116エーストリート 4903 (72)発明者ワーノック，ガースエル. カナダ国，アルバータティー６ジー１ティー８，エドモントン，ワンハンドレッドエイティーンスストリート 9207

Claims

【特許請求の範囲】１．生物学的材料の大量低温保存方法であって、（ａ）生物学的材料及び凍結防止剤の溶液を含む柔軟な容器を供給し；（ｂ）前記生物学的材料の温度を約−100℃又はそれ以下に低め；そして（ｃ）段階（ｂ）の間、前記材料のすべての領域からの実質的に均一な熱伝達を維持する、段階を含む方法。２．前記容器の形状が段階（ｂ）を通して実質的に一定して維持される、請求の範囲第１項記載の方法。３．段階（ｂ）の間、前記容器の横断面積が、前記容器の実質的に全体の長さにそって、実質的に一定して維持される、請求の範囲第１項記載の方法。４．段階（ｂ）の間、前記容器の厚さが、前記容器の実質的に全体の長さにそって約５mmで維持される、請求の範囲第１項記載の方法。５．段階（ａ）が、少なくとも約50mlの容積を有する容器に生物学的材料を供給することを含んで成る、請求の範囲第１項記載の方法。６．前記生物学的材料が、小島、肝細胞、神経内分泌細胞、増殖細胞、及びホルモンを分泌する細胞系、サイトカイン、リンホカイン及び細胞成長レギュレーターから成る群から選択される、請求の範囲第１項記載の方法。７．前記段階（ａ）の生物学的材料が封入される、請求の範囲第１項記載の方法。８．生物学的材料の大量低温保存方法であって、（ａ）凍結防止剤により処理される封入された生物学的材料を含む容器を供給し；（ｂ）前記封入された生物学的材料の温度を−100℃以下に低め；そして（ｃ）段階（ｂ）の間、実質的にすべての前記材料の実質的に均等な熱伝達を維持する、段階を含んで成る方法。９．生物学的材料の大量低温保存方法であって、（ａ）生物学的材料及び凍結防止剤の溶液を含む柔軟な容器を供給し；（ｂ）前記生物学的材料を、前記溶液の凝固点以下の温度に過冷却し；（ｃ）段階（ｂ）の後、前記生物学的材料の実質的にすべてを核形成により凍結し；（ｄ）段階（ｃ）の後、前記生物学的材料の温度を約−40℃又はそれ以下に、調節された速度でさらに低め；（ｅ）段階（ｃ）及び（ｄ）の間、前記材料の実質的にすべての領域からの実質的に均等な熱伝達を維持する、段階を含んで成る方法。 10．前記生物学的材料の温度が変化するにつれて、前記容器の形状を実質的に一定に維持する段階を包含する、請求の範囲第９項記載の方法。 11．段階(ｂ)，（ｃ）及び（ｄ）の間、前記容器の形状を実質的に一定に維持する硬質ホルダーに前記柔軟な容器を配置する段階を含む、請求の範囲第９項記載の方法。 12．前記段階（ａ）の生物学的材料が封入される、請求の範囲第９項記載の方法。 13．柔軟な容器から熱の均等な抜き取りを促進するためのその柔軟な容器のためのホルダーであって、第１の冷却表面を有する第１の実質的に平面のパネル；第２の冷却表面を有する第２の実質的に平面のパネル；及び前記柔軟な容器の向かい合った側間の実質的に均等な分離を確立するために、前記第１パネル及び前記第２パネルに並列して前記柔軟な容器の配置に基づいて前記第２パネルの前記第２表面の反対側に前記第１パネルの前記第１表面を保持するための手段を含んで成り；前記第１パネル及び前記第２パネルが前記第１表面及び前記第２表面を通して熱を実質的に均等に抜き取るための手段を含むことを特徴とするホルダー。 14．小島を安定化するための方法であって、ゲル化できる材料により前記細胞を封入することを含んで成る方法。 15．小島を輸送のために調製するための方法であって、ゲル化できる材料により前記細胞を封入することを含んで成る方法。 16．小島の移植片生存時間を高めるための方法であって、封入された細胞を形成するために前記細胞をゲル化できる材料により封入し、そして糖尿病動物に前記封入された細胞を移植することを含んで成る方法。 17．前記ゲル化できる材料がアルギン酸塩である請求の範囲第14，15又は16項記載の方法。 18．主要チャンバー部分及び一対の側部空間に別々の及び分離可能な区画を含んで成る柔軟な容器であって、前記個々の区画が前記主要チャンバー部分に連結される区画口及び前記区画口を開口し、そして閉鎖するための手段を包含し、ここで前記主要チャンバー部分が、材料が前記主要チャンバー部分中に及びそれから移行され得るチャンバー口及び前記チャンバー口を開口し、そして閉鎖するための手段を有することを特徴とする容器。 19．前記区画口が前記チャンバー口を横切り、そして前記区画口及び前記チャンバー口を閉鎖するための手段がヒートシールである、請求の範囲第18項記載の容器。