JPH11500603A - カルシウム依存性プロテアーゼをコードするｌｇｍｄ遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 以下を具備する核酸配列：１）図８に記載の配列；２）図２に記載の配列；３）図２に記載の配列の一部（ただし、LGMD2病に関わる、カルシウム依存性プロテアーゼ活性を有するタンパク質をコードすること）；または、４）１以上のヌクレオチドの置換、欠失、若しくは付加によって、１）、２）、若しくは３）で定義されている配列より派生した配列（ただし、該配列は該プロテアーゼをまだコードしていること）。

Description

【発明の詳細な説明】 カルシウム依存性プロテア−ゼをコ−ドするLGMD遺伝子 本発明は、カルパインファミリに属するカルシウム依存性プロテア−ゼであっ て、変異すると、いわゆるリム‐ガ−ドル（Limb-Girdle）筋ジストロフィ−（L GMD）とよばれる疾患を引き起こす上記プロテア−ゼをコ−ドする、単離された 遺伝子に関する。 リム−ガ−ドル筋ジストロフィ−（LGMD）は、最初にウォルトンとナットラス （Walton and Nattrass、1954）により、筋ジストロフィ−の分類の一部として 提案された。LGMDは進行性の対称性萎縮、及び近位の肢の筋肉の弱化と、上昇し た血清中のクレアチンキナ−ゼにより特徴付けられる。筋の組織診により、ジス トロフィ−病変部が証明され、また筋電図検査結果は筋障害を示している。症状 は通常、生まれてから最初の２０年間に始まり、該疾患は徐々に悪化し、発症後 １０年か２０年で歩行不能になることがほとんどである(Burshby，1994)。しか しながら、LGMDに関しての疾病分類学的な正確な定義はいまだ明確ではない。結 果的に、顔面肩甲上腕型や、ベッカ−（Becker）筋ジストロフィ−、特には脊髄 性筋萎縮などの、種々の神経筋疾患が、上記の診断の下にしばしば分類されてし まっている。例えば、最近の研究（Arikawa et al.，1991）によれば、LGMD患者 の１７％（４１人中）がジストロフィ−症（dystrophinopathy）を示している。 これらの問題は、この病理学に関わる分子的及び遺伝的欠陥の分析を行うことの 難しさを強調している。 この疾患の遺伝的基礎を同定する試みは、３５年間さかのぼる。モ−トンとチ ャン（Morton and Chung，1959）は、「異型接合型キャリア−の頻度は、・・・ １０００人当たり１６である」と推定した。この著者らは更に、「異なる家族中 で上記の遺伝子は、対立遺伝子であるのか、または異なる遺伝子座にあるのかに 関しては、分離分析法（segregation analysis）でも、判明しない」ことを述べ ている。常染色体性の優性、または劣性の伝播がともに報告されているが、後者 はより一般的であって、推定で１０^-5の普及度である(Emery，1991)。劣性型の 遺伝子が、第１５染 色体上に位置していることから（LGMD2A，MIM 253600; Bexkman et al.，1991） 、LGMDが特異的な遺伝的実体であることの明らかな証明になった。以後の遺伝的 分析により、第１５染色体に位置することが証明され(Young et al.，1992; Pas so-Bueno et al.，1993)、上記の後者のグル−プは、当該疾患の遺伝的異型接合 性を証明している。最近の研究により第二の変異遺伝子が第２染色体上に位置づ けられたが(GMD2A、MIM 253601; Bashir et al.，1994)、他の遺伝子座の少なく とも一つが関わっているという証拠がある。 LGMD2家系の遺伝的分析により、予期しなかったことが明らかになった。まず 、高度に純系であるインディアナ州のアンマン教徒において、遺伝的異型接合性 が証明された。次に、ラ・レユニオン（la Reunion）島の家系は、遺伝的に孤立 していると考えられていたが、少なくとも６つの異なる疾患のハプロタイプが観 察されて、これはこのポピュレ−ション中の単一創立者の仮説（Beckman et al. ，1991）に反する証拠を提供する。 この疾患に関しての、非特異的な疫病分類学的定義、相対的に低い普及度、及 び遺伝的異型接合性のために、LGMD2Aインタ−バルの遺伝的境界を制限するのに 使用可能な家族数は限定される。細胞遺伝的異常で特異的領域に焦点をあてるの に役立ったものは、これまでに報告されていない。ジストロフィン−関連タンパ ク質、及びメロシン（merosin）のような細胞骨格または細胞外マトリックスタ ンパク質の免疫遺伝学的研究（Matsumura et al.，1993）では、如何なる欠失も 証明できなかった。更に、候補の遺伝子を同定するのを助ける特異的生理学的特 徴や、動物モデルも全く存在していない。故に、位置付け（positioning）クロ −ニング法にとってかわる別の方法はない。 LGMD2染色体領域は、第１５染色体上で、15q15.1-15q21.1領域に位置している ことが確立されている（Fougerousse et al.，1994）。 10-12MbのYAC連続体（contig）の構築と分析（Fougerousse et al.，1994）に より、このインタ−バル内に、３３の多型性の標識のマッピングが可能になり、 更に LGMD2A領域をD15S514とD15S222との間にまで狭めることが可能になった。更に、 連鎖不平衡の徹底的な分析により、上記連続体の近傍に当該遺伝子が位置する可 能性が示唆された。 本発明は、パ−シャルなコスミドのマップの構築と、cDNA選択によるスクリ− ニング（Lovett et al.，1991; Tagle et al.，1993）に起因するが、これは、 このインタ−バルにコ−ドされている配列の筋発現により、数多くの候補遺伝子 が同定されたためでである。これらの一つで、ソリマチら（Sorimachi et al，1 989）によりクロ−ニングされたものは、カルパインファミリ（CANP，calcium- activatedneutral protease; EC 3.4.22.17）に属する筋特異的タンパク質、nCL 1（novel Calpain Large subunitl）をコ−ドしていて、また当該疾患の機能性 候補遺伝子であるようだ。カルパインは、非リソソ−ム性の細胞内システインプ ロテア−ゼであり、その触媒活性にはカルシウムを要求する（レビュ−としてCr oall，D.E．et al.，1991を参照）。哺乳類カルパインには、二つの遍在性タン パク質、CANP1及びCANP2と同様に、組織特異的タンパク質が含まれる。筋特異的 nCL1に加え、胃特異的nCL2及びnCL2′タンパク質もまた記載されている：これら はオルタナティブなスプライシングにより、同じ遺伝子に由来している。この遍 在性の酵素は、異なったラ−ジサブユニットと、共通のスモ−ルサブユニットと の、ヘテロダイマ−からなり、組織特異的なラ−ジサブユニットと、スモ−ルサ ブユニットとの会合はいまだ証明されていない。。カルパインのラ−ジサブユニ ットは４つのタンパク質ドメインに分類できる。ドメインIとIIIは、その機能が 分かっておらず、既知のタンパク質との相同性が全くないが、タンパク質分解活 性の制御には重要であるようだ。ドメインIIは、他のシステインプロテア−ゼと の相同性を示し、その活性部位でのヒスチジン、システイン、アスパラギン残基 を共有している。ドメインIVは、４つのEFハンド構造を具備していて、これは潜 在的なカルシウム結合部位である。更に、相同性が全くない３つのユニ−クな領 域が、筋特異的nCL1タンパク質、すなわちNS、IS1、及びIS2内に存在していて、 後者には核移行シグナルが含まれている。これらの領域は、nCL1の筋特異的機能 にとって重要である可能性がある。 筋ジストロフィ−は、過剰な、または制御を受けていないカルパインに関って い ることが、通常は受け入れられていて、当該疾患を直す既知の方法は全て、上記 プロテア−ゼの拮抗剤を使用することである（例ば、EP 359309またはEP 525420 に開示されている）。 本発明は、これら全ての仮説とは反対に、LGMD2病は、健常なヒトで発現して いるカルパインの欠失に、強く相関しているという発見に起因している。 本発明は、LGMD2病に関わるCa⁺⁺依存性プロテア−ゼ、またはカルパイン、よ り正確にはLGMD2Aをコ−ドしている、図２に示された核酸配列に関している。本 発明は更に以下のものに関する： ・上記配列の一部（ただし、LGMD2に関わるカルシウム−依存性プロテア−ゼ 活性を有するタンパク質をコ−ドするという条件付き）；あるいは、 ・１以上のヌクレオチドの置換、欠失、または付加によって変異した、上記配 列に由来するもの（ただし、変異後の配列が、上記タンパク質をコ−ドしている という条件付き）； ・上記の配列に相補的な配列をもたらす全ての核酸。 ヒトnCL1遺伝子のゲノム構成は、本発明者らにより決定されていて、２４のエ クソンからなり、図８に示してあるように４０kbを越えて伸長しているが、これ はまた、本発明の一部でもある。約３５kbのこの遺伝子は、配列決定されている 。LGMD2A家族における、この遺伝子の系統的なスクリ−ニングにより、１４の異 なる変異が同定されて、nCL1中の数多くの独立した変異イベントが、LGMD2Aの原 因になっていることが確立された。更にこれは、筋ジストロフィ−が構造的欠損 ではなくて、酵素的欠損に起因することの最初の証明である。 本願明細書中において、CANP3は、Ca⁺⁺依存性プロテア−ゼ、またはカルパイ ンであり、第１５染色体上のnCL1遺伝子によりコ−ドされているタンパク質を意 味する。 本発明は更に、図２に示されているアミノ酸配列からなり、変異するとLGMD2 病に関わる、CANP3と呼ばれるタンパク質に関する。 該タンパク質をコ−ドしている、CANP3をコ−ドする遺伝子のcDNAはまた、図 に示してあり、これはまた本発明の一部でもある。 このＤＮＡによりコ−ドされているタンパク質は、CANP3であり、カルパイン ファミリに属するカルシウム依存性プロテア−ゼである。 本発明に更に含まれるものには、１以上の置換、欠失、挿入、または5′、若 しくは3′非コ−ド領域、またはスプライス部位における変異により図２のcDNA から由来した核酸配列がある（ただし、翻訳されたタンパク質には、カルシウム 依存性活性のプロテア−ゼがあり、変異したときにはLGMD2病を誘導すること） 。 該タンパク質をコ−ドする核酸配列は、ＤＮＡでもＲＮＡでもよく、また図２ に示されている核酸配列に相補的であってもよい。 本発明はまた、適切な宿主細胞内でカルパインの発現を許容するプロモ−タ制 御下に、本発明のＤＮＡ配列を有している、組み換えベクタにも関する。 図２の配列の全て、または一部を具備したＤＮＡ配列により、形質転換、また は形質移入された、真核性、または原核性宿主細胞は、本発明の一部である。 このような宿主細胞は以下の何れかであってもよい： ・該タンパク質を分泌することが可能な細胞で、この組み換えタンパク質が、 LGMD2の処置用の薬剤として使用することが可能であるもの；または、 ・ウイルス性、またはレトロウイルス性ベクタにより形質転換された、パッケ −ジング細胞株で、組み換えベクタを有するこの細胞株が、LGMD2の遺伝子治療 用の薬剤として使用することができるもの。 アデノウイルス、及びレトロウイルス、並びに例えば記載されている他のもの （1′ADN medicament，John Libbey，Eurotext，1993）が含まれ、本発明のＤＮ Ａ配 列の一つを有している、今日の遺伝子治療に使用される全てのシステムを、参照 することにより本願に組み込む。 以下の例、及び添付した図は、該遺伝子の構造が如何に確立されたか、また如 何に該遺伝子とLGMDとの間の関係が確立されたかを示す。 図の説明。 図１： A)nCL1遺伝子のゲノム構成 この遺伝子は４０kbの領域にわたり、そのうちの３５kbが配列決定された（配 列番号は未決定）。イントロンとエクソンは一定の倍率で変換して描いてあり、 後者は番号をふった垂直の棒で示してある。最初のイントロンが最も大きく、完 全には配列決定されていない。遺伝子内ミクロサテライトの位置を、アスタリス クで示してある。矢印で、Alu反復配列(黒)、及びMer2（灰色）反復配列の向き を示してある。 B)EcoRI制限マップ この領域のEcoRI（E）制限マップは、この領域のコスミドを使用して確立され た。nCL1遺伝子の位置は、黒線で示してある。相当する断片のサイズを示し、配 列分析により決定されている場合には下線を引いてある。 C)nCL1遺伝子領域のコスミドマップ コスミドは、サブクロ−ニングYAC774G4(Richardson，準備中)より構築したコ スミドライブラリ由来であり、線で表示してある。線上の点は陽性のSTS(箱形の 長方形で表示)を示している。最小で３つのコスミドが、遺伝子の全領域をカバ −する。T3,T7 図２：ヒトnCL1 cDNA(B)の配列、及び５′(A)、及び3’(C)のフランキングゲ ノム領域 A)及びC)ポリアデニレ−ションシグナル、及び推定のCAAT，TATAA部位を、囲 っ てある。推定のSp1（-477から-472）、MEF2結合部位（-364から-343）、及びCAr Gボックス（-685から-672）を太字で示してある。5’領域に存在するAlu配列は 、下線を引いてある。 B)相当するアミノ酸配列を、上記の配列の下に示してある。ATG開始コドンとT GAストップコドンとの間のコ−ド配列は2466bpであり、821アミノ酸のタンパク 質をコ−ドしている。最初のメチオニンコドンのアデニンを、部位１に指定した 。nCL1遺伝子内のイントロンの位置を矢印の先で示してある。以前報告されたも のとは異なるヌクレオチドをアスタリスクで示してある。 図３：筋特異的カルパインのアミノ酸配列の整列 ヒトnCL1タンパク質を、第一行目に示してある。３つの筋特異的配列（NS，IS 1，IS2）に下線を引いてある。第二行目はラットの配列に相当する（アクセス番 号はP）第三、及び第四行目は、コ−ドされた推定のアミノ酸配列で、ブタとウ シが発現したタグ付きの配列を示す（GenBnakアクセス番号はそれぞれ、UO5678 、UO7858である）。カルパインに関しての全ての既知のメンバ−で保存されてい るアミノ酸残基は、反転させた文字で示してある。ピリオドは、該配列に存在す る同じアミノ酸を示す。文字は相同性配列内に見られる変異アミノ酸を意味する 。ミスセンス変異の位置は、変異アミノ酸上の番号で示してある。 図４：nCL1タンパク質構造上の変異の分布 A)２３のイントロンの位置は、相当するアミノ酸座標との関係において、垂直 の棒で示してある。 B)nCL1タンパク質は、４つのドメイン（I，II，III，IV）と、筋特異的配列（ NS，IS1，IS2）を示すように描かれている。nCL1ドメイン内のミスセンス変異の 位置を、黒点で示してある。ナンセンス及びフレ−ムシフト変異の効果は、トラ ンケ−トした線で表示してあり、合成されるタンパク質の程度を示してある。相 当する家族名を、線の左側に示してある。ORFフレ−ムの外側を、ハッチングし た線で示してある。 図５：nCL1クロ−ンのノ−ザンブロットハイブリダイゼ−ション ヒトの組織８つのそれぞれからの、２μｇのポリ(A)＋ＲＮＡを含んでいるmRN A ブロット（Clontech）を、エクソン２０と２１にわたるnCL1ゲノムクロ−ンとハ イブリダイズさせた。後者は、骨格筋mRNAに対応するラインのみに存在する３. ６kbのmRNAを検出する。 図６：ヘテロ二重鎖分析により同定された代表的な変異 ヘテロ二重鎖分析による変異スクリ−ニングの例。家系B505は、エクソン２２ において、二つの異なる変異の分離を示している。 図７nCL1遺伝子内の同型接合体変異 配列決定によるエクソン２(a)、８(b)、１３(c)、及び２２(d)における変異の 検出。健常な対照に由来する配列をそれぞれの変異配列の上に示してある。アス タリスクは変異したヌクレオチドの位置を示している。コドン及びアミノ酸残基 のコンセンサスを、図の左側に家族名とともに示してある。 図８：nCL1遺伝子の構造 図８Aは、エクソン１を有する遺伝子の5’部分を示す。 図８Ｂは、エクソン２から８を含む遺伝子の一部を示す。 図８Ｃは、エクソン９を含む遺伝子の一部を示す。 図８Dは、エクソン１０から、3’非転写領域を含むエクソン２４までを含む遺 伝子の一部を示す。 例 例１ LGMD2Aインタ−バル内でのnCL１の局在化 １５ｑへの初期的連結割当（primary linkage assignment）の後に、LGMD2A領 域に関しての詳細な遺伝的、及び物理的地図を構築した（Fougerousse et al.， 1994）。疾患遺伝子座をD15S129標識とD15S143標識との間に括弧でくくり、LGMD 2A領域の細胞遺伝学的境界を、15q15.1-15q21.1と定義した（Fougerousse et al .，1994）。１０−１２MbのYAC連続体（contig）の構築と分析（Fougerousse et al.，1994）によ り、３３の多形性標識をこのインタ−バル内にマッピングし、更にLGMD2A領域を D15S514とD15S222との間に狭めることができた。 nCL1遺伝子は、ソ−ト済み染色体とのハイブリダイゼ−ションと、ヒト−マウ ス細胞ハイブリッド由来のＤＮＡに対するサザンハイブリダイゼ−ションとによ り、第１５染色体に位置付けられた（Ohno et al.，1989）。LGMD2Aインタ−バ ル由来のYACを使用した、cDNA捕獲物により、１３の潜在的候補遺伝子を同定す ることができた。nCL1は、ノ−ザンブロット分析により、筋特異的発現している と同定された二つの転写産物のうちの一つである。位置はさらに、STS（Sequenc e Tagged Siteの略）アッセイにより確認した。nCL1遺伝子の位置づけに使用し たプライマは、図１に示したP94in2，P94in13，及びpcr6a3であり、これらの特 徴は表１に示してある。 上記のプライマは報告されているヒトcDNA配列の異なる部分を使用して設計し てあり(Sorimachi et al.，1989)、第１５染色体の体細胞ハイブリッド３つより 由来したＤＮＡと、LGMD2A連続体由来のYACに関してのSTS含量のスクリ−ニング に使用 した。該遺伝子は、以前に15q15.1-q21.1と定義されていた領域内に位置づけら れ、３つのYAC（774G4，926G10，923G7）では、この領域に位置づけられた。LGM D2A連続体に対してのSTSの相対的位置により、該遺伝子がD15S512とD15S488との 間に位置づけられ、これは連結不平衡研究で示唆された領域候補である。 上記と同じプライマを使用して、YAC774G4のコスミドライブラリをスクリ−ニ ングにかけた。５つのコスミドの群を同定した(図１)。別のnCL1プライマ対を使 用して行った実験では、上記のコスミドがnCL1エクソンに関して、１以外のエク ソンをカバ−することが確立され、また４つのコスミドの第二群には、このエク ソンが含まれていることが確立された（図１）。重なり合う、３つのコスミドの 最小セット（2G8-2B11-IF11）は、全遺伝子をカバ−する（図１）。これらのコ スミド由来のＤＮＡを使用してこの領域のEcoRI制限マップを構築した（図１Ｂ ）。 例２ nCL1遺伝子の配列決定 該配列のほとんどは、Ｍ１３、及びブル−スクリプトベクタにサブクロ−ニン グしたコスミド１Ｆ11の部分消化した配列のショットガン配列シ−ケンシングと 、内部プライマ−でのウォ−キングにより得られたものである。配列の組み立て は、スタデンパッッケ−ジ（Staden package）のXBAPソフトウェアを使用して行 ったが、これはコスミドの制限マップと一致した。エクソン１及び近傍領域の配 列は、コスミドＤＮＡ、またはヒトゲノムＤＮＡ由来のPCR産物の配列決定によ り得られた。最初のイントロンはいまだ、完全には配列決定されていないが、長 さは１０から１６kbの間であるという証拠が存在している（制限断片のハイブリ ダイゼ−ションデ−タに基づいたものであるが、デ−タは非掲載である）。全領 域（5’と3’領域を含んでいる）は長さが４０kbより長く、図８に示してある。 a)cDNA配列 従来技術により、報告済みのnCL1のヒトcDNA配列を実施することが可能である （Sorimachi 1989）。これにはN末端の４３アミノ酸に相当する１２９塩基が欠 失し ている（図２）。更にこれは１２の部位においても異なっている。このうちの３ つは、コドンの第三塩基部位で起きていて、コ−ドしているアミノ酸配列は保存 されている。他の９つの差異は、アミノ酸組成を変化させている（図２）。これ らの異なったエクソンは、少なくとも１０の別個のゲノムにおいて、繰り返し配 列決定されているので、図２に表示した配列は確かであり、またマイナ−な多形 性変異体は含まれていないと確信している。更にこれらの修飾は、全体での類似 度は依然として９４％であるが、ラットのnCL1のアミノ酸配列（Sorimachi）と の局部的類似度を上昇させている。 図２で１と表示されているATGは、ラットnCL1との相同性に基づくと、翻訳開 始部位であり、これは８ヌクレオチド中の５ヌクレオチドが、コザックのコンセ ンサス配列（Kosak M.，1984）と共通である配列内にある。推定のCCAAT及びTAT Aボックスが、開始ATGコドンの上流、５９０、３２４bp（CCAATに関して）、及 び５４４、３3bp（TATに関して）にそれぞれ観察された(Bucher，1990)。ＧＣ− ボックス結合Sp1タンパク質（Dynan et al.，1983）が−４７７位に同定された 。筋特異的制御配列の可能性のあるコンセンサス配列を同定した（図２）。これ らには筋細胞特異的エンハンサ結合因子２（MEF2）結合部位（Cserjesi P.，199 1）、CArGボックス（Minty A.，1986）、及び6E−ボックス（MyoDファミリ中に よく見られる塩基性ヘリックス・ル−プ・ヘリックスタンパク質の結合部位；Bl ackwell and Weintraub，1990）が含まれる。nCL1遺伝子発現の制御における、 これら推定の転写因子結合部位の機能的重要性は、まだ確立されていない。 潜在的AAUAAAポリアデニレ−ションシグナルが二つ、TGAストップコドンの下 流５２０bp,７７７bpに同定された。ポリAテイルを有するnCL1のcDNAの一部の配 列決定により、最初のAUAAAがポリアデニレ−ションシグナルであることが証明 された。後者は、ラットnCL1配列でよく保存されている領域に包埋していて、ポ リアデニレ−ション部位の3’側のほとんどの遺伝子に存在する、G／Tクラスタ −が４bp後に続く（Birnsiel et al.，1985）。nCL1のmRNAの3′非翻訳領域は長 さが565bpである。よって、予想されるcDNAの長さは、約３５５０bpか３０００b pであるはずである。 b)カルパインとの比較 ヒトnCL1遺伝子の配列を他のカルパイン配列と比較した（図３）。最も有効な 比較は、ラット（アクセス番号J05121）、ウシ（アクセス番号U07858）、及びブ タ（アクセス番号U05678）の相同性配列であった。アクセス番号は、GeneBank(N IH)、やEMBLデ−タベ−ス（EMBL，Heidelberg）のような国際的遺伝子バンクの ものである。ヒト及びラットのＤＮＡ配列の局所的高相同性が、５’（７５％） や、３’非翻訳領域（６０％を越える）においてさえも観察される（デ−タは非 掲載）。ヒト及びラットのnCL1遺伝子との間の顕著な、高い配列相同性は、共通 した推定の制御配列への進化圧を示唆している。 c)nCL1遺伝子のゲノム構造 報告されているnCL1ヒトcDNA（Sorimachi et al.，1989）の、対応するゲノム 配列との比較により、長さが１２bp（エクソン１３）から３０９bp（エクソン１ ）までの範囲で、平均のサイズが１００bpである、２４のエクソンが同定された （図１）。イントロンのサイズは８６bpから、イントロン１の約１０−１６kbま での範囲である。 表２に示されたイントロン−エクソンの境界は、５’及び３’のスプライシン グ部位のコンセンサス配列（Shapiro and Swnapathy，1987）にかなり近かった 。 ゲノム配列をGRAIL分析（Uberbasher et al.，1991）にかけると、１１のエク ソンが正しく認識され、４つは同定されず、６つは不適切に定義され、また２つ は小さすぎて認識されなかった（デ−タは非掲載）。 すでに述べたように、nCL1遺伝子には３つのユニ−クな配列ブロック、すなわ ちNS(アミノ酸残基で１から６１)、IS1(残基２６７から３２９)、そしてIS2(残 基５７８から６５３）がある。これらの配列のそれぞれが、IS2内の核移行シグ ナルと同様に、イントロンにより必然的にフランキングされているということに 注目するのは興味深い（図４）。ヒトnCL1のエクソン−イントロンの構成は、ニ ワトリのCANP（ゲノム構造の分かっている、唯一のカルパイン遺伝子ラ−ジサブ ユニット；Emori et al.，1986）に対して報告されているものと同様である。 ４つのミクロサテライト配列が同定された。このうち２つは、第一イントロン から離れた部分にあり、一つが(AT)₁₄で、もう一つが非多型であることが証明さ れ（Fougerousse et al.，1994）、すでに混合パタ−ンであると同定済みのミク ロサテライト、S774G4B8である。(TA)₇(CA)₄(GA)₁₃が、第二イントロン内に同定 され、CEPHに関連していない６４の個人の遺伝子型同定により、二つのアリ−ル が判明した（頻度0.10と0.90）。第四のミクロサテライトは、第９イントロンに 存在する、混合型の(CA)_n(TA)_m反復配列である。後者と(AT)₁₄反復配列は、多型 に関しては調べられていない。Aluファミリ−の１４の反復配列と、一つのMer2 反復配列とが、nCL1遺伝子に同定され、よって該遺伝子は平均して２.５kbに一 つのAlu配列があることになる。 サザンブロット実験（Ohno et al.，1989）、及びSTSスクリ−ニング（デ−タ は非掲載）により、カルパインファミリ−のこのメンバ−のゲノム一つ当たり、 １コピ−のみが存在していることが示唆される。 例３ nCL1遺伝子の発現 組織特異性のパタ−ンを、エクソン２０と２１にわたるコスミド1F11に由来す るゲノムサブクロ−ンプロ−ブを使用した、ノ−ザンブロットハイブリダイゼ− ションにより調べた。完全には排除できなかったが、nCL1のオルタナティブスプ ライシングが存在する証拠はなかった。約３.４から３.６kbの転写産物が、骨格 筋mRNAで検出された（図５）。よってこのサイズは、-544の部位が機能性のTATA ボックスであることを示唆する。 転写実験は、疑似遺伝子ではなくて活性遺伝子であり、また筋特異的発現パタ −ンは、この疾患の表現型と一致していることを示唆している（Sorimachi et a l.，1989,及び図５）。 例４ 変異スクリ−ニング nCL1は、部位及び機能に関しての基準を満たした、LGMD2Aの候補遺伝子である 。該疾患の病因論におけるその役割を評価するため、ヘテロデュプレックス（Ke en et al.，1991）及び直接的配列分析の組み合わせを利用して、３８のLGMD2A 家族を、ヌクレオチドの変化の存在に関してシステマティックにスクリ−ニング した。 PCRプライマは、エクソンとスプライシング連結部、及び該遺伝子の推定のCAT 、TATAボックスとポリアデニレ−ションシグナルを含む領域を特異的に増幅する ようにして、図３に示されているように設計した。 特異的LGMD2A患者の血液由来のＤＮＡで行ったPCRの産物を次いで、ハプロタ イプ分析に基づいた変異がそれぞれ同型接合であるか異型接合であるかに応じて 、ヘテロデュプレックス分析、または直接的配列決定にかけた。PCR産物をクロ −ン化して、変異の同定（すなわち、ミクロ欠失体または挿入体。及び幾つかの 異型接合体）を行う必要がしばしばあった。疾患に関わる変異を、以下の表４に 要約し、タンパク質上のその部位を図４に示してある。 ヘテロデュプレックス分析、家族の複数のメンバ−の両方の鎖の配列決定、ま たは制限部位で変異が起きている場合には酵素消化により、それぞれの変異を確 認した。変異の分離分析は、家族のメンバ−からの入手可能なＤＮＡで行って、 これらの配列変異は、LGMD2A変異を有する親の染色体上にあることを確認した。 シスセンス置換が多型である可能性を排除するために、それらの存在を、対照ポ ピュレ−ションで系統的に試験した：これらの変異は、CEPHレファレンス家族由 来の１２０の対照染色体では全く見られなかった。 例５ 家族遺伝子が、第１５染色体に確認されている、該家族遺伝子の分析 第１５染色体上にLGMD遺伝子を含んでいる家族で、原因となっている変異の初 期スクリ−ニングを行った。これらには、レユニオン島の家族(Beckman et al. ，1991)、北インディアナの旧戒律（Old Order）のアンマン教徒家族（Young et al.，1992）、及び２つのブラジルの家族（Passos Bueno et al.，1993）が含 まれていた。 a)レユニオン島家族 系統学的研究、及びレユニオン島の地理学的に隔離された家族であることは、 単一の設立者効果を示唆するものであった。しかしながら遺伝的分析は、この家 族がハプロタイプの異型接合性を示しているため、上記の仮説とは一致しない。 少なくとも６つの異なるキャリア−染色体がみられている(幾つかの家族内の発 症している人では、複雑な異型接合体である)。これまでに、これら６つのハプ ロタイプのうち４つと一致した、別個の変異が同定されている。 家族R 14において、エクソンの１３、２１、及び２２が配列多様性の証拠を示 すことが、ヘテロデュプレックス分析で示された（図６）。関連したPCR産物の 配列決定により、以下のことが明らかになった：(i)エクソン１３内の多型性、( ii)該タンパク質のドメインIV内の第二EF-ハンドのル−プにおける、エクソン２ １内でのミスセンス変異（A→G）による、Ser⁷⁴⁴残基のグリシンへのトランスフ ォ−ム（図４）、(iii)エクソン２２内でのフレ−ムシフト変異。エクソン２１ の変異及びエクソン１３の多型性は、家族R１７でも見られるハロタイプを形成 する。PCR産物のサブクロ −ニングは、エクソン２２の変異を同定するのに必要であった。幾つかのクロ− ンを配列決定して、AGがTCATCTで置換されていることが明らかになった（デ−タ は非掲載）。このフレ−ムシフト変異により、ヌクレオチドの２４００でフレ− ムの一致した未成熟な終結が引き起こされる（図４）。 家族R12で発症している人は、LGMD2Aインタ−バルの標識全てに対して同型接 合性である（Allamand，投稿済み）。エクソン１３のPCR産物を配列決定して、c DNAの塩基１７１５でのGからAへのトランジションにより、ドメインIII内のArg^{5 72} が、既知のカルパイン全てで高度に保存されている残基であるグルタミンで置 換されていることが明らかになった（図７）。MspI制限部位の消失により検出可 能であるこの変異は、この家族のみにおいて存在し、また他の試験したLGMD2A家 族または関連しない対照の何れでも存在していない。 家族R27では、発症している子供に関して、ヘテロデュプレックス分析と、そ れに続いて行った、PCR産物の配列決定により、エクソン１９に、２塩基対の欠 失が明らかになった（図６、及び表４）。３つのうち一つのACがこの配列のこの 部位で見られず、cDNA配列の部位２０６９で終止コドンを作りだしている（図４ ）。 b)アンマン教徒の家族 予想したとおり、マルチプルな血縁の連結のため、調べたLGMD2Aの北インディ アナのアンマン教徒の患者は、変異アリ−ルを有する染色体のハプロタイプに対 して同型接合性であった（Allamand，投稿済み）。一つのミスセンス変異（Ｇ→ A）がエクソン２２内のヌクレオチド２３０６に同定された（図７）。生じたコ ドンの変化はCGGからCAGであり、これによりArg⁷⁶⁹がグルタミンにトランスフォ −ムされる。この残基は全ての種でのカルパインファミリ−のメンバ−全てで保 存されていて、該タンパク質の、ヘリックス−ル−プ結合部の第三EF-ハンド内 のドメインIV内に位置している（参考文献）。この変異は、第１５染色体−連鎖 のアンマン教徒患者１２人において、同型接合性の状態で見られた。更に、第１ ５染色体遺伝子座が連結分析により排除されている、６組の南インディアナのア ンマン教徒の家族をスクリ−ニングした(Allamand ESHG，投稿済み、ASHG94)。 予想したとおり、このヌクレオチド の変異は、これらの家族の如何なる患者においても存在しておらず、よって、こ のように遺伝的に関連した単離体におけるこの疾患の遺伝的不均一性を確認して いる。 c)ブラジルの家族 血縁結婚の結果として、２組のブラジルの家族（B519，B501）は、伸長した（ extended）LGMD2Aハプロタイプに対して同型接合性である（デ−タは非掲載）。 これらの家族で発症している人から得たPCR産物を配列決定して、家族B501は、 北インディアナのアンマン教徒の患者で見つかったエクソン２２の同じ変異を有 しているが（図７）、完全に異なるハプロタイプ内に包埋されていることが証明 された。家族B519では、患者はエクソン２においてCからTへのトランジションを 有していて、Arg³²⁸がTGA終止コドンにより置換されていて(図７)、よっておそ らくは非常にトランケ−トされたタンパク質になっている(図４)。 d)他のLGMD家族の分析 第１５染色体内において、候補の遺伝子の役割が確証されているので、次にヘ テロデュプレックス分析により、連鎖デ−タがあまり有益ではないLGMD家族を調 べた。これらには、ブラジル人一組（B505）と、フランスの都市に住む人１３組 の家系が含まれていた。 １またはそれ以上の患者で、エクソン１、３、４、５、６、８、１１、２２に 対してヘテロデュプレックスなバンドが現れた。配列の変異体全てのうち、１０ は病原性の可能性のある変異として同定され（ミスセンス５つ、ナンセンス１つ 、及びフレ−ムシフト４つ）、３つが該タンパク質のアミノ酸変異を有さない多 型性として同定された。同定した原因変異体を上の表４にリストした。同じ変異 が、明らかに無関係な家族で現れた。家族M３５とM37、M2888とM1394にそれぞれ 共通の変異は、独立したイベントの結果であると思われるが、それはそれらが異 なる標識のハプロタイプ内に包埋されているからである。対照的に、アンマン教 徒のエクソン２２及び家系M３２における点変異は、双方の染色体がnCL1の周り の共通した４つの標識ハプロタイプ（774G4A1-774G4A10-774G54D-774G4A2）を共 有するために、同じ変異イベントに対応していて、これは共通の祖先を反映して いる可能性がある。家族B505 とR14で見られる、エクソン２２内の同じAGからTCATCTへの置換に関しても同じ である。エクソン８の（Ｔ→Ｇ）トランスバ−ジョンが、ハプロタイプが同型接 合の唯一のフランスの都会住居人であるM2407の２つのキャリア−染色体内に存 在するが、これは記録に残っていない血族関係を反映している。幾つかの家族で は、これまでに疾患を引き起こす変異の欠失は起きていない（例：M40）。 家族R１４とR１７におけるエクソン１３内と、遺伝子内マイクロサテライト内 の多型性（部位６８８）に加えて、別の４つの中性な変異体が検出された:M３１ のエクソン１内のDdeI部位を壊す、部位９６の（T→C)トランジションが一つ； エクソン５変異とハプロタイプを形成する、M40とM３７内のエクソン３（部位４ ９５）における（C→T）トランジションが一つ（前者の家族ではこの多形性は疾 患と同時分離しない）;M４２内で、父親より由来したプロモ−タにおける、部位 -４２８での（T→C）のトランジションが一つ（これはまた、健常な対照でも証 明されている）；及び、家族R20、R11、R19、Ｍ３５、及びM３７における、スプ ライシング部位に近いイントロ２２内の一定しないポリ（G）が一つ。最後のも のはまた、CEPH家族のメンバ−においても存在しているが、遺伝的標識としては 有益ではなく、それはモノヌクレオチドの繰り返しアリ−ルを可視化して評価す るのが難しいからである。 全部では、１４の異なる変異を現わす、１６の独立した変異イベントが同定さ れた。変異体は全て、LGMD2A家族内での該疾患と同時分離する。特徴付けした病 的カルパインアリ−ルには、正常な人のアリ−ルでは見られないヌクレオチドの 変化が含まれている。nCL1内でのナンセンス変異２つと、フレ−ムシフト変異５ つは、この産物の欠乏がLGMD2Aを引き起こすという仮説を支持する。７つの変異 は全て、未成熟な、フレ−ムのあった終止コドンでおわり、トランケ−トされた ものが産生されて、おそらく不活性のタンパク質になる(図４)シスセンス変異の 不健全さの証拠は、以下のものより得られる： （１）LGMD2A患者では、このような変異が比較的高い割合でおきる；多形性と 病的変異との間の差異をつける機能アッセイなしでは難しいが、この遺伝子内で の異なる「ミスセンス」変異がおきることで、まれな、目立たない多型性をすべ て説明することはできない。 （２）これらの変異は対照の染色体では観察されていない。 （３）進化で保存されている残基、及び／または記録されている機能の重要性 の領域において、変異が起きている。 ７つのシスセンス変異のうち４つは、全ての種で知られているカルパインファ ミリ−のメンバ−で保存されているアミノ酸を変化させる（図３）。残りの変異 の二つは保存されているアミノ酸残基を余り影響しないが、重要な機能ドメイン に位置している。エクソン８内のS354Gの置換は活性部位のアスパラギンの４残 基前にあり、第二EF−ハンドのル−プ内にあり、さらにカルシウム依存性のカル パイン活性の制御、またはスモ−ルサブユニットとの相互作用に障害を与える（ 図４）。幾つかのミスセンス変異は疎水性残基を極性のものに変化させるか、ま たはその逆であり（表４）、おそらくは高次元の構造を乱す。 方法 患者の説明 分析したLGMD2A家族は、地理的に異なる４つの起源より得た。これらには、ブ ラジルの家族３組、相互関係にあるレユニオン島の核家族１３組、フランスの都 会住居人である家族１０組、及び米国のアンマン教徒の家族１２組が含まれてい た。これらの家族の大部分は、連鎖分析により以前、第１５染色体グル−プに属 することが確認されている（Beckaman，1991; Young，Passos-Bueno et al.，19 93）。しかしながら、フランスの都会住居人の家族の幾つかと同様にブラジルの 家族一組B505は、第１５染色体に対する、顕著なロッドスコア（lodscores）を 有さなかった。ゲノムＤＮＡは末梢血液リンパ球より得た。 コスミドc774G4-IF11の配列決定、及びコスミドのEcoRI制限地図 キアゲン（Qiagen）法（Qiagen Inc.，USA）にそってＤＮＡを調製して、Sau3 A、RsaI、またはAluIでの部分消化後に、コスミド1Ｆ11（図１Ｃ）をサブクロ− ニングした。サイズで選択した制限断片を、低融点アガロ−スより回収した後に 、M13またはブル−スクリプト（Stratagene，USA）ベクタと連結した。大腸菌（ E.coli）の電 気穿孔後に、組み換えコロニ−をピックアップして、１００μlのLB/アンピシリ ン培地にうえた。培養物１μlを使用して、PCR反応を、１０mlM Tris-HCl(pH9.0 )、５０mM KCl、１.５mM MgCl₂、0.1％トリトンX-100、0.01ゲラチン、それぞれ が２００μMのdNTP、１UのTaqポリメラ−ゼ（Amersham）、それぞれのベクタプ ライマ１００ngで行った。増幅を９５℃、５分による変性で開始し、続いて９２ ℃４０秒の変性と５０℃３０秒のアニ−リング、を３０サイクル行った。PCR産 物をマイクロコン（Microcon）装置（Amicon，USA）で精製し、ジデオキシ鎖終 結法をABI配列決定機（Applied Biosystems，Foster City，USA）上で利用して 、配列を決定した。配列を分析して、スタデン・パッケ−ジ、バ−ジョン93.9（ Staden，1982）のXBAPソフトウェアを使用して、整列させた。配列連続体（cont igs）間のギャップを、内部プライマによるウォ−キングで埋めた。コスミドのE coRI制限地図は、サンブルック（Sambrook）ら（1989）に記載のものと必須的に 同じにして行った。 ノ−ザンブロット分析 プロ−ブは、dCTP-(a³²P)でのランダムプライミングにより標識した。ハイブ リダイゼ−ションは、製造業社（Clontech，USA）が推奨するようにして、ヒト のマルチプルな組織のノ−ザンブロットを行った。 LGMD2A家族に由来するPCR産物の分析 １回当たり１００ngのヒトＤＮＡを使用して、フォウゲラッセ（Fougerousse ，1994）が記載した緩衝液とサイクル条件下でPCRを行った（アニ−リング温度 は表３に記載）。ヘテロデュプレックス分析（Keene et al.，1991）は、１０μ lのPCR産物の電気泳動を、１.５mmの厚さのハイドロリンクMDEゲル（Bioprobe） を使用して、断片の長さに応じて５００−６００ボルトで１２−１５時間で行っ た。泳動プロファイルを臭化エチジウム染色後のUV下で可視化した。 配列の分析は、マイクロコン装置（Amicon，USA）での精製後に、PCR産物をダ イ・ジデオキシ配列決定にかけた。必要時には、変異の性質に応じて（例えばフ レ−ムシフト変異または幾つかの異型接合体）、TAクロ−ニングキット（Invitr ogen，UK） を使用してPCR産物をクロ−ニングした。産物のうち１μlを、２５ngのベクタと １２℃で一晩連結した。XL-1−ブル−バクテリアへ電気穿孔した後、複数の独立 したクロ−ンをPCRで分析して、上記したように配列決定した。 本発明は、nCL1が変異するとLGMD2Aの病因に関与するという発見に由来してい る。文献で述べられていること、例えば該疾患が制御の解かれたカルパインの存 在を伴っているということとは反対である。nCL1が、LGMD2Aにおいて欠損してい る遺伝子であると同定されたことは、筋組織の構造的構成物ではない遺伝子に対 する変異によって引き起こされる、筋ジストロフィ−の最初の例であり、これは 以前同定された、デュシェンヌ(Duchenne)及びベッカ−（Becker）のような筋ジ ストロフィ−（Bonilla et al.，1988）、重度の幼少期常染色体劣性（Matsumar a et al.，1992;）、フクヤマ（Matsumara et al.，1993）、及びメロシン欠損 先天性筋ジストロフィ−（Tome et al.，1994）とは対照的である。 LGMD2Aの表現型を理解するには、複数の患者においては活性型のnCL1タンパク 質がないという事実を考慮に入れる必要がある。よって、このプロテア−ゼが、 細胞骨格、細胞外マトリックス、またはジストロフィン複合体の構造的構成物の 分解、若しくは不安定化に関わるという単純なモデルは、排除される。更に、LG MD2A の筋の生検を使用した免疫細胞遺伝学的研究では、そのような変化の兆候 は全くない（Matsumara et al.，1993; Tome et al.，1994）。同様に、LGMD2A の筋原線維（myofibers）は明らかに、他のジストロフィ−性のものとは異なっ ているので、このカルパインが、遍在性のカルパインに対して提案されたように 、筋芽細胞融合でも役割を演じてはいないようである。 これらの例で開示されたデ−タは全て、nCL1遺伝子は、変異すると該疾患に関 わる主要遺伝子であることを確認している。 罹患率が酵素活性の喪失に由来するという事実により、新規の薬理学−治療的 な見込みに関する希望が高まる。遺伝子導入のモデルが手に入ることは、これら の研究にとって貴重な道具となるであろう。 本発明は、本発明の核酸若しくは核酸配列の使用、または該核酸にコ−ドされ るタンパク質の、LGMD2Aの予防若しくは治療における薬剤の製造のための使用に も関する。 欠損したカルパインが、LGMD2Aの基礎となるという発見は、LGMDに関わる他の 遺伝子座の同定に対して有益であるかもしれない。実際に、LGMDの他の形態が、 CANP基質である産物となる遺伝子の変異や、nCL1発現の制御に関わる遺伝子の変 異により引き起こされる可能性がある。２−ハイブリッド選択系（Fields et al .，1989）のような技術により、このカルパインの天然のタンパク質基質を分離 して、よって潜在的には他のLGMD遺伝子座を同定するのに役立つであろう。 本発明は更に、該酵素のペプチド配列の全て、または一部、該酵素、nCL1遺伝 子産物を、LGMD2の病因と罹患率とにも関わる可能性のある、該酵素のリガンド のスクリ−ニングへ使用することに関している。 関与する可能性のあるこのリガンドは、例えば該酵素の、基質、活性化剤、ま たは阻害剤である。 本発明の核酸は、遺伝子発現の制御に作用する可能性のある構成物を決定する ためのスクリ−ニング方法において使用してもよい。 該酵素、またはnCL1遺伝子を含でいて該酵素を発現する宿主組み換え細胞の何 れかを使用するスクリ−ニング方法もまた、本発明の一部である。 本発明の、薬理学的方法、並びに核酸及びペプチド配列の使用は、非常に強力 な適用である。 このような、リガンドまたは制御配列のスクリ−ニングのために使用する方法 は、例えばクロ−ン化した受容体を使用した、リガンドスクリ−ニングに対して 記載さ れているものである。 nCL1遺伝子の変異を同定することにより、直接的な、出生前または前駆症状性 の診断と、双方の変異が同定されている家族でのキャリア−の検出のための方法 が提供される。遺伝子−ベ−スの、LGMD2A家族の正確な分類は、この疾患の異な った診断にとって、有益であることが証明されるはずである。 本発明は、家族内、またはヒトがLGMD2になりやすいか（素因）を決定する方 法に関し、以下の工程を具備している： ・当該家族内で感受性のある、一つ以上のエクソン、またはフランキング配列 を選択する工程； ・上記エクソンまたは上記フランキング配列に対して特異的なプライマ（この 特異的な例が表３のプライマまたはそのハイブリッドである）を選択する工程； ・核酸配列を増幅する工程（この増幅の基質は素因を調べる人のＤＮＡである ）； ・図２または図８に由来の、対応する配列と、上記増幅配列とを比較する工程 。 表２はイントロン−エクソン結合部の配列を示していて、構造内にこの結合部 を有するプライマはまた、本発明に含まれる。 ＲＮＡまたはＤＮＡ増幅に適する他のプライマ全ては、本発明の方法において 使用することが可能である。 同じようにして、如何なる適切な増幅法（PCR,ポリメラ−ゼ鎖反応（登録商標 ）、NASBA，核酸配列ベ−ス増幅（登録商標））や、他のものも使用することが 可能である。 ASO(アリ−ル特異的 ＰＣＲ)、LCR、またはARMS（増幅反映変異システム）の ような、一部位変異の検出で使用される本方法は通常、本発明の特異的なプライ マとともに実行される。 表１及び３に記載されているようなプライマ、表２の結合部を含んでいるもの 、またはより一般的には２４のエクソンのうちの一つのフランキング配列を含ん でいるものもまた、本発明の一部である。 核酸増幅によりLGMD2への素因を決定するキットもまた、本発明の範囲であり このキットは、少なくとも以下の群より選択するPCRプライマを具備している： a)表１に記載のもの； b)表３に記載のもの； c)表２のイントロン−エクソン結合部を含んでいるもの； d)a)，b)，またはc)に定義されているプライマより由来するもの。 請求項１乃至３の核酸配列は、ウイルス性またはレトロウイルス性のベクタで 、パッケ−ジング細胞株に形質導入できるものに挿入してもよい。 形質導入されるパッケ−ジング細胞株は、LGMD2の遺伝子治療用の薬剤として 使用してもよい。 LGMD2疾患の、遺伝子治療による治療は、以下の群より選択した構成物を含む 、薬学的組成物により実行される： a)請求項１乃至４に記載の核酸配列； b)請求項２４に記載の細胞株； c)請求項５乃至９に記載のアミノ酸配列。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ // Ｃ０７Ｋ 14/81 Ａ６１Ｋ 37/54

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １.以下を具備する核酸配列： １）図８に記載の配列；または ２）図２に記載の配列；または ３）図２に記載の配列の一部（ただし、LGMD2病に関わる、カルシウム依存性 プロテア−ゼ活性を有するタンパク質をコ−ドすること）；または、 ４）１以上のヌクレオチドの置換、欠失、若しくは付加によって、１）、２） 、若しくは３）で定義されている配列より派生した配列（ただし、該配列は該プ ロテア−ゼをまだコ−ドしていること）。 ２.請求項１の核酸配列に対して相補的である核酸配列。 ３.制御配列の下にありLGMD2病のカルパイン活性の発現に関わっている、請求 項１、または２に記載の配列を、自身の構造内に具備した核酸配列。 ４.図２に記載のアミノ酸配列をコ−ドしている核酸配列。 ５.LGMD2の病因に関わる、カルパインファミリ−に属したカルシウム依存性プ ロテア−ゼ酵素であることを特徴とする、請求項１乃至４に記載の核酸配列によ りコ−ドされているアミノ酸配列。 ６.図２に記載されるような配列、または、変異後のアミノ酸配列が、LGMD2病 に関わるカルパイン活性を有するという条件のもとに、１以上のアミノ酸の欠失 、挿入、及び／または置換により修飾した、図２のアミノ酸配列、の何れかを含 むことを特徴とする、請求項５、または６に記載のアミノ酸配列。 ７.LGMD2がLGMD2Aであることを特徴とする、請求項５、または６に記載のアミ ノ酸配列。 ８.請求項１乃至４の何れか一項に記載の核酸全て、またはその一部を具備し た核酸配列により形質転換、若しくは形質移入されることを特徴とする、カルパ イン酵素活性を発現できない宿主細胞。 ９.LGMD2病の予防、または治療のための薬剤の製造における、請求項１乃至４ の一つに記載の核酸、または請求項８に記載の宿主の使用。 １０.LGMD2病の予防、または治療のための薬剤の製造における、請求項５また は６に記載のアミノ酸配列の使用。 １１.LGMD2がLGMD2Aであることを特徴とする、請求項１０または１１に記載の 使用。 １２.請求項５乃至７に記載のアミノ酸配列のリガンドのスクリ−ニングのた めの該アミノ酸配列であって、該リガンドが、基質（一つまたは複数）、補助因 子または制御成分からなる群より選択されることを特徴とする、上記アミノ酸配 列。 １３.カルパインの遺伝子発現の制御に作用する可能性のある、成分の決定の ためのスクリ−ニング方法における、請求項１乃至４の一つに記載の核酸配列の 使用。 １４.カルパインの発現に活性である成分の決定のためのスクリ−ニング方法 における、請求項８に記載の宿主細胞の使用。 １５.家族内で、または人においてLGMD2病になりやすい傾向を検出するための 、以下の工程を具備した方法： ・当該遺伝子の１以上のエクソン、またはそのフランキング配列を選択する工 程； ・上記のエクソン、フランキング配列、またはそのハイブリッドに特異的なプ ライマを選択する工程； ・基質がヒトのＤＮＡである、上記プライマによる核酸配列の増幅工程； ・増幅された配列を、図２、または図８から派生する対応した配列に対して比 較 する工程。 １６.上記のプライマが、以下の群より選択されるものであることを特徴とす る、請求項１５に記載の方法： a)表１に記載のもの； b)表３に記載のもの；及び、 c)表２の、イントロン−エクソン結合部を含むもの； d)a)，b)，またはc)のプライマに派生するもの。 １７.LGMD2がLGMD2Aであることを特徴とする、請求項１５、または１６に記載 の方法。 １８.以下の群より選択するプライマを具備することを特徴とし、核酸増幅に よりLGMD2になりやすい傾向を検出するためのキット： a)表１に記載のもの； b)表３に記載のもの；及び、 c)表２の、イントロン−エクソン結合部を含むもの； d)a)，b)，またはc)のプライマに派生するもの。 １９.LGMD2病の遺伝子治療用の薬剤の製造における、請求項８に記載の宿主細 胞の使用。 ２０.以下の群より選択した成分を含むことを特徴とする、LGMD2病の治療用の 薬学的組成物： a)請求項１乃至４に記載の核酸配列； b)請求項８に記載の宿主細胞； c)請求項５乃至７に記載のアミノ酸配列。