ES2250976T3 - Gen lgmd que codifica una proteasa dependiente del calcio. - Google Patents

Abstract

UNA SECUENCIA DE ACIDO NUCLEICO QUE COMPRENDE: 1) LA SECUENCIA REPRESENTADA EN LA FIGURA 8; O 2) LA SECUENCIA REPRESENTADA EN LA FIGURA 2; O 3) UNA PARTE DE LA SECUENCIA DE LA FIGURA 2 CON LA CONDICION DE QUE PUEDA CODIFICAR UNA PROTEINA QUE TENGA UNA ACTIVIDAD DE PROTEASA DEPENDIENTE DE CALCIO IMPLICADA EN UN LGMD2; O 4) UNA SECUENCIA DERIVADA DE UNA SECUENCIA DEFINIDA EN 1), 2) O 3) MEDIANTE SUSTITUCION, SUPRESION O ADICION DE UNO O MAS NUCLEOTIDOS CON LA CONDICION DE QUE DICHAS SECUENCIAS CODIFIQUEN TODAVIA A DICHA PROTEASA.

Description

Gen de LGMD que codifica para una proteasa dependiente de calcio.

La invención se refiere al gen aislado que codifica para una proteasa dependiente de calcio perteneciente a la familia de las Calpaínas que, cuando está mutado, es la causa de una enfermedad denominada Distrofia Muscular de Limb-Girdle (LGMD).

El término de distrofia muscular de Limb-Girdle (LGMD) fue propuesto inicialmente por Walton y Nattrass (1954) como parte de una clasificación de las distrofias musculares. La LGMD se caracteriza por una atrofia y una debilidad simétrica progresiva de los músculos proximales de las extremidades y por una elevada cinasa de creatina sérica. Las biopsias musculares muestran lesiones distróficas, y el electromiograma muestra unas características miopáticas. Los síntomas comienzan habitualmente durante las dos primeras décadas de vida, y la enfermedad empeora gradualmente, a menudo dando como resultado una pérdida de la capacidad de caminar 10 ó 20 años después de su inicio (Bushby, 1994). La definición nosológica precisa de la LGMD aún es ambigua. Consecuentemente, se han clasificado ocasionalmente bajo este diagnóstico varias enfermedades neuromusculares tales como la distrofia fascioescapulohumeral, la distrofia muscular de Becker y especialmente las atrofias musculoespinales. Por ejemplo, un estudio reciente (Arikawa y col., 1991) refirió que el 17% (de 41) de los pacientes con LGMD mostraban una distrofinopatía. Estas cuestiones destacan la dificultad de emprender un análisis del (los) defecto(s) genético(s) y molecular(es) implicado(s) en esta patología.

Los intentos de identificar la base genética de esta enfermedad se remontan a 35 años. Morton y Chung (1959) estimaron que "la frecuencia del portador heterocigótico... es de 16 por 1000 personas". Los mismos autores también afirman que "el análisis de segregación no proporciona ninguna prueba sobre si estos genes son alélicos o están en diferentes loci en familias diferentes". Se ha informado tanto de una transmisión autosómica dominante como recesiva, siendo más habitual esta última, con una prevalencia estimada de 10^{-5} (Emery, 1991). La localización de un gen de una forma recesiva en el cromosoma 15 (LGMD2A, MIM 253600; Beckmann y col., 1991) proporcionó la prueba definitiva de que la LGMD es una entidad genética específica. Los posteriores análisis genéticos confirmaron esta localización en el cromosoma 15 (Young y col., 1992; Passos-Bueno y col., 1993), demostrando el último grupo la heterogeneidad genética de esta enfermedad. Aunque un reciente estudio localizó un segundo gen mutante en el cromosoma 2 (LGMD2B, MIM 253601; Bashir y col., 1994), existen pruebas de que puede haber implicado al menos otro locus.

Los análisis genéticos de parientes con LGMD2 revelaron unos hallazgos inesperados. En primer lugar, se demostró la heterogeneidad genética en la altamente endogámica comunidad Amish de Indiana. En segundo lugar, aunque se pensaba que las familias de la Isla de la Reunión representan un aislado genético, se observaron al menos 6 haplotipos diferentes de la enfermedad, proporcionando pruebas contra la hipótesis de un único efecto instaurador (Beckmann y col., 1991) en esta población endogámica.

La inespecífica definición nosológica, la relativamente baja prevalencia y la heterogeneidad genética de esta alteración limita el número de familias que pueden usarse para restringir los límites genéticos del intervalo LGMD2A. Las anomalías citogenéticas, que podrían haber ayudado a concentrarse en una región en particular, no se han referido. Los estudios inmunogenéticos de las proteínas relacionadas con la distrofina (Matsumura y col., 1993) y las proteínas de la matriz citoesquelética o extracelular tales como una merosina (Tomé y col., 1994) no consiguieron demostrar ninguna deficiencia. Además, no hay ninguna característica fisiológica específica conocida ni un modelo animal que pudiera ayudar a identificar un gen candidato. Por lo tanto, no hay otra alternativa que una estrategia de clonación posicional.

Se establece que la región cromosómica LGMD2 está localizada en el cromosoma 15, como la región 15q15.1 - 15g21.1 (Fougerousse y col., 1994).

La construcción y el análisis de una contig YAC de 10-12 Mb (Fougerousse y col., 1994) permitió el cartografiado de 33 marcadores polimórficos dentro de este intervalo, y estrechar aún más la región LGMD2A a entre D15S514 y D15S222. Adicionalmente, un amplio análisis del desequilibrio de conexión sugirió una probable posición para el gen en la parte proximal de la contig.

La invención resulta de la construcción de un mapa de cósmido parcial, y el cribado mediante la selección con ADNc (Lovett y col., 1991; Tagle y col., 1993) de las secuencias expresadas en el músculo codificadas por este intervalo dio lugar a la identificación de varios genes candidatos potenciales. Uno de estos, clonado previamente por Sorimachi y col. (1989), codifica para una proteína muscular específica, la nCL1 (la nueva subunidad Mayor 1 de la Calpaína), que pertenece a la familia de las calpaínas (CANP, calcium-activated neutral protease - proteasa neutra activada por calcio -; EC 3.4.22.17), y surgió como un gen candidato funcional para esta enfermedad.

Las calpaínas son proteasas de cisteína intracelulares no lisosomales que requieren calcio para su actividad catalítica (como reseña, véase Croall D. E. y col., 1991). Las calpaínas de mamíferos incluyen dos proteínas ubicuas CANP1 y CANP2, así como proteínas específicas tisulares. Además de la nCL1 específica muscular, también se han descrito las proteínas específicas del estómago nCL2 y nCL2'; éstas proceden del mismo gen mediante un empalme alternativo. Las enzimas ubicuas están formadas por heterodímeros con subunidades mayores separadas asociadas con una subunidad menor común; la asociación de las subunidades mayores específicas tisulares con una subunidad menor todavía no se ha demostrado. Las subunidades mayores de las calpaínas pueden subdividirse en 4 dominios proteicos. Los dominios I y III, cuyas funciones permanecen desconocidas, no muestran ninguna homología con las proteínas conocidas. Sin embargo, el dominio I parece importante para la regulación de la actividad proteolítica. El dominio II muestra similitud con otras proteasas de cisteína, compartiendo residuos de histidina, cisteína y asparragina en sus sitios activos. El dominio IV comprende cuatro estructuras EF-hand, que son potenciales sitios de unión de calcio. Además, hay presentes tres regiones únicas con ninguna homología conocida en la proteína específica muscular nCL1, a saber, NS, IS1 e IS2, conteniendo la última una señal de translocación nuclear. Estas regiones pueden ser importantes para la función muscular específica de la nCL1.

Está generalmente aceptado que las distrofias musculares están relacionadas con un exceso o una desregulación de las calpaínas, y todas las metodologías conocidas para curar estas enfermedades son el uso de antagonistas de estas proteasas; algunos ejemplos se describen en el documento EP359309 o en el documento EP525420.

La invención resulta del hallazgo de que, al contrario que todas estas hipótesis, la enfermedad de la LGMD2 está fuertemente correlacionada con el defecto de una calpaína que se expresa en las personas sanas.

La invención se refiere a una secuencia aislada de un ácido nucleico, tal como la representada en la Figura 2, que codifica para una proteasa dependiente de Ca^{++}, o calpaína, que esta implicada en la enfermedad LGMD2, y más precisamente en la LGMD2A. También se refiere a parte de esta secuencia, siempre que sea capaz de codificar para una proteína con una actividad de proteasa dependiente de calcio implicada en la LGMD2, o una secuencia derivada de una de las anteriores secuencias por sustitución, deleción o adición de uno o más nucleótidos, siempre que dicha secuencia aún codifique para dicha proteína, dando lugar todos los ácidos nucleicos a una secuencia complementaria de la secuencia según se definió anteriormente.

Los inventores han determinado la organización genómica del gen nCL1 humano, y está formada por 24 exones y se extiende a lo largo de 40 kb según se representa en la Figura 8, y también es parte de la invención. Se han secuenciado aproximadamente 35 kb de este gen. Un cribado sistemático de este gen en familias con LGMD2A dio lugar a la identificación de 14 mutaciones diferentes, estableciendo que varios eventos mutacionales independientes en nCL1 son responsables de la LGMD2A. Adicionalmente, esta es la primera demostración de una distrofia muscular resultante de un defecto enzimático en lugar de estructural. La invención concierne consecuentemente a una secuencia aislada de un ácido nucleico representada en la Figura 8 que codifica para una proteína humana con una actividad de proteasa dependiente de calcio.

En la presente memoria descriptiva, CANP3 significa la proteína que es una proteasa dependiente de Ca^{++}, o calpaína, y que está codificada por el gen nCL1 o el cromosoma 15.

La invención se refiere también a una proteína, denominada CANP3, formada por la secuencia de aminoácidos según se representa en la figura 2 y que cuando está mutada, está implicada en la enfermedad LGMD2.

El ADNc del gen que codifica para la CANP3, que codifica para la proteína, también está representado en la Figura 2, y es parte de la invención.

La proteína codificada por este ADN es CANP3, una proteasa dependiente de calcio perteneciente a la familia de las Calpaínas.

También están incluidas en la presente invención las secuencias de ácidos nucleicos derivadas del ADNc de la Figura 2 mediante una o más sustituciones, deleciones, inserciones o mediante mutaciones en las regiones no codificantes 5' o 3', siempre que la proteína traducida tenga la actividad de proteasa dependiente del calcio, y que cuando esté mutada, induzca la enfermedad LGMD2.

La secuencia de ácidos nucleicos que codifica para la proteína podría ser ADN o ARN, y ser complementaria de la secuencia de ácidos nucleicos representada en la Figura 2.

La invención también se refiere a un vector recombinante que incluye una secuencia de ADN de la invención, bajo el control de un promotor que permita la expresión de la calpaína en una célula hospedadora apropiada.

Una célula hospedadora procariota o eucariota transformada por o transfectada con una secuencia de ADN que comprende toda o parte de la secuencia de la Figura 2 es parte de la invención.

Dicha célula hospedadora podría ser bien

-

una célula que es capaz de secretar la proteína, y esta proteína recombinante podría usarse como fármaco para tratar la LGMD2,

o bien

-

una línea celular de empaquetamiento transfectada por un vector vírico o retrovírico: las líneas celulares portadoras del vector recombinante podrían usarse como fármaco para la terapia génica de la LGMD2.

Todos los sistemas usados hoy en día para la terapia génica, incluyendo adenovirus y retrovirus, y otros descritos en, por ejemplo, "I'ADN medicament", (John Libbey, Eurotext, 1993), y que son portadores de una de las secuencias de ADN de la invención, están incluidos en este documento como referencia.

Los ejemplos, a continuación, y las figuras anexas, indican cómo se estableció la estructura del gen y cómo se estableció la relación entre el gen y la LGMD.

Leyenda de las figuras:

Figura 1

A) Organización genómica del gen nCL1

El gen cubre una región de 40 kb, de las cuales se secuenciaron 35 (número de acceso pendiente). Los intrones y los exones están dibujados a escala, estando indicado esto último por barras verticales numeradas. El primer intrón es el más grande y está a la espera de ser secuenciado completamente. Las posiciones de los microsatélites intragénicos están indicadas por asteriscos. Las flechas indican la orientación de las secuencias repetidas Alu (oscuras) y Mer2 (claras).

B) Mapa de restricción de EcoRI

Se estableció un mapa de restricción de EcoRI (E) de esta región con la ayuda de cósmidos de esta región. La localización del gen nCL1 está indicada como una barra negra. Los tamaños de los correspondientes fragmentos están indicados y subrayados cuando han sido determinados mediante el análisis de la secuencia.

C) Mapa de cósmido de la región del gen nCL1

Los cósmidos eran de una biblioteca de cósmidos construida subclonando YAC 774G4 (Richard en la preparación) y se presentan como líneas. Los puntos sobre las líneas indican STSs positivos (indicados en rectángulos enmarcados). Un mínimo de tres cósmidos cubren el gen completo. T3,T7.

Figura 2

Secuencia del ADNc del nCL1 (B) humano, y las regiones genómicas flanqueantes 5' (A) y 3' (C)

A) y C) Están enmarcadas la señal de poliadenilación y los supuestos sitios CAAT, TATAA. Los supuestos sitios de unión Sp1 (de la posición -477 a la -472), MEF2 (de -364 a -343) y la caja CArG (de -685 a -672) están en negrita. La secuencia Alu presente en la región 5' está subrayada.

B) los correspondientes aminoácidos se muestran debajo de la secuencia. La secuencia codificante entre el codón de inicio ATG y el codón de terminación TGA es de 2466 pb, y codifica para una proteína de 821 aminoácidos. A la adenina del primer codón de metionina se le ha asignado la posición 1. Las localizaciones de los intrones dentro del gen nCL1 están indicadas por cabezas de flecha. Los nucleótidos que difieren de los publicados previamente están indicados por asteriscos.

Figura 3

Alineaciones de las secuencias de aminoácidos de las calpaínas específicas musculares

La proteína nCL1 humana se muestra en la primera línea. Las 3 secuencias específicas musculares (NS, IS1 e IS2) están subrayadas. La segunda línea corresponde a la secuencia de rata (acceso no P). La tercera y la cuarta línea muestran las secuencias de aminoácidos deducidas codificadas por las Secuencias Expresadas Marcadas porcinas y bovinas (nº de acceso del GenBank U05678 y U07858, respectivamente). Los residuos de aminoácidos que están conservados entre todos los miembros conocidos de las calpaínas están en letras invertidas. Un período indica que el mismo aminoácido está presente en la secuencia. Las letras se refieren a la variante del aminoácido encontrada en la secuencia homóloga. Las posiciones de las mutaciones de aminoácido se dan en forma de cifras encima del aminoácido mutado.

Figura 4

Distribución de las mutaciones a lo largo de la estructura de la proteína nCL1

A) Las posiciones de los 23 intrones están indicadas por barras verticales en relación con los correspondientes coordinados de aminoácidos.

B) Se describe la proteína nCL1 mostrando los cuatro dominios (I, II, III, IV) y las secuencias específicas musculares (NS, IS1 e IS2). La posición de las mutaciones de aminoácido dentro del dominio nCL1 está indicada por puntos negros. El efecto de las mutaciones terminadoras y del marco de lectura se ilustra cómo líneas truncadas, representando la extensión de la proteína sintetizada. Los nombres de las correspondientes familias están indicados a la izquierda de la línea. El ORF fuera de marco viene dado por líneas sombreadas.

Figura 5

Hibridación por transferencia Northern de un clon nCL1

Un transferido de ARNm (Clontech) que contenía 2 \mug de ARN poli(A)+ de cada uno de ocho tejidos humanos se hibridó con un clon genómico de nCL1 que abarcaba los exones 20 y 21. El último detecta un ARNm de 3,6 kb presente únicamente en una línea correspondiente al ARNm de músculo esquelético.

Figura 6

Mutaciones representativas identificadas mediante un análisis de heterodúplex

Ejemplos de cribado de mutaciones mediante un análisis de heterodúplex. El árbol genealógico B505 muestra la segregación de dos mutaciones diferentes en el exón 22.

Figura 7

Mutaciones homocigóticas en el gen nCL1

Detección mediante secuenciación de las mutaciones en los exones 2 (a), 8 (b), 13 (c) y 22 (d). Las secuencias de un control sano se muestran por encima de cada secuencia mutante. Los asteriscos indican la posición de los nucleótidos mutados. Las consecuencias sobre los codones y los residuos de aminoácidos están indicadas a la izquierda de la figura, junto con el nombre de la familia.

Figura 8

Estructura del gen nCL1

La Figura 8A representa la parte 5' del gen con el exón 1.

La Figura 8B representa la parte del gen incluyendo los exones 2 a 8.

La Figura 8C representa la parte del gen incluyendo el exón 9.

La Figura 8D representa la parte del gen incluyendo los exones 10 a 24, incluyendo la región no transcrita 3'.

Ejemplos Ejemplo 1 Localización del nCL1 dentro del intervalo LGMD2A

Se construyeron mapas detallados genéticos y físicos de la región LGMD2A (Fougerousse y col., 1994), tras la asignación de la conexión primaria a 15q (Beckmann y col., 1991). El locus de la enfermedad se acotó entre los marcadores D15S129 y D15S143, definiendo los límites citogenéticos de la región LGMD2A como 15g15.1-15g21.1 (Fougerousse y col., 1994). La construcción y el análisis de una contig YAC de 10-12 Mb (Fougerousse y col., 1994) nos permitió cartografiar 33 marcadores polimórficos dentro de este intervalo, y estrechar aún más la región LGMD2A a entre D15S514 y D15S222.

El gen nCL1 había sido localizado en el cromosoma 15 mediante hibridación con cromosomas clasificados y mediante hibridación Southern con un ADN de híbridos celulares hombre-ratón (Ohno y col., 1989). La captura del ADNc usando YACs del intervalo LGMD2A permitió la identificación de 13 genes posicionales candidatos. El nCL1 era uno de los dos transcritos identificados que mostraron una expresión específica muscular, según se evidenció mediante un análisis por transferencia Northern. La localización se confirmó adicionalmente mediante ensayos de STS (de Sequence Tagged Site -Sitio Marcado por Secuencia-). Los cebadores usados para la localización del gen nCL1 son P94in2, P94in13 y per6a3, según se muestra en la Figura 1, y estando definidas sus características en la Tabla 1.

TABLA 1 Cebadores de PCR usados para la localización del gen nCL1

1

Estos cebadores están diseñados a partir de partes diferentes de la secuencia de ADNc humano publicada (Sorimachi y col., 1989), y se usaron para un cribado del contenido de STS sobre el ADN de tres híbridos celulares somáticos del cromosoma 15 y YACs de la contig LGMD2A. Los resultados posicionaron el gen en una región definida previamente como 15g15.1-g21.1 y en 3 YACs (774G4, 926G10, 923G7) localizados en esta región. Las posiciones relativas de los STSs a lo largo de la contig LGMD2A permitió localizar el gen entre D15S512 y D15S488, en una región candidata sugerida por los estudios de conexión en desequilibrio.

Se usaron los mismos cebadores que anteriormente para cribar una biblioteca de cósmidos a partir de YAC 774G4. Se identificó un grupo de 5 cósmidos (Fig. 1). Los experimentos con otro par de cebadores de nCL1 (P94ex1ter; Tabla 1) establecieron que estos cósmidos cubren todos los exones de nCL1 excepto el número 1, y que un segundo grupo de 4 cósmidos contiene este exón (Fig. 1). Un conjunto mínimo de tres cósmidos superpuestos (2G8-2B11-1 F11) cubre el gen completo (Figura 1). Se usó el ADN de estos cósmidos para construir un mapa de restricción EcoRI de esta región (Figura 1 B).

Ejemplo 2 Determinación de la secuencia del gen nCL1

La mayoría de las secuencias se obtuvo mediante una secuenciación shotgun (aleatoria) de digeridos parciales del cósmido 1F11 subclonado en vectores M13 y bluescript, y caminando con cebadores internos. El ensamblaje de las secuencias se realizó usando el programa informático XBAP del paquete Staden (Staden) y estaba de acuerdo con el mapa de restricción de los cósmidos. Las secuencias del exón 1 y de las regiones adyacentes se obtuvieron mediante secuenciación del ADN del cósmido o de los productos de la PCR a partir de ADN genómico humano. El primer intrón todavía no se ha secuenciado completamente, pero hay pruebas de que podría tener una longitud de entre 10 y 16 kb (basándonos en la hibridación de los fragmentos de restricción; datos no mostrados). El gen completo, incluyendo sus regiones 5' y 3', tiene más de 40 kb de longitud, y se muestra en la Figura 8.

a) La secuencia de ADN

La tecnología usada permite la implementación de la secuencia de ADNc humano publicada de nCL1 (Sorimachi 1989). Contiene las 129 bases ausentes correspondientes a los 43 aminoácidos N terminales (Figura 2). También difiere de este en 12 posiciones. Tres de las cuales se producen en las posiciones de la tercera base de los codones y conservan la secuencia de aminoácidos codificada. Las otras 9 diferencias dan lugar a cambios en la composición aminoacídica (Figura 2). Como estos diferentes exones se secuenciaron repetidamente en al menos 10 genomas distintos, confiamos en que la secuencia de la Fig. 2 represente una secuencia auténtica y no contenga variantes polimórficas menores. Adicionalmente, estas modificaciones aumentan la similitud local con la secuencia de aminoácidos de nCL1 de rata (Sorimachi), aunque la similitud global es todavía del 94%.

El ATG numerado como 1 en la Figura 2 es el sitio de inicio de la traducción basado en homología con el nCL1 de rata, y está dentro de una secuencia de sólo 5 nucleótidos de los 8 en común con la secuencia consenso de Kosak (Kosak M, 1984). Las supuestas cajas CCAAT y TATA se observaron 590, 324, (CCAAT) y 544 ó 33 pb (TATA) secuencia arriba del codón de inicio ATG, respectivamente (Bucher, 1990). Se identificó una caja GC de unión a la proteína Sp1 (Dynan y col., 1983) en la posición -477. Se identificaron secuencias consenso correspondientes a potenciales elementos reguladores específicos musculares (Fig. 2). Estos incluyen un sitio de unión del factor 2 mejorador de la unión específico de miocitos MEF2) (Cserjesi P. 1991); una caja CArG (Minty A. 1986) y 6 cajas E (sitio de unión de proteínas básicas en hélice-bucle-hélice encontradas frecuentemente en los miembros de la familia MyoD; Blackwell y Weintraub, 1990). La significación funcional de estos supuestos sitios de unión del factor de transcripción en la regulación de la expresión del gen nCL1 aún está por establecer.

Se identificaron dos potenciales señales de poliadenilación AAUAAA 520 y 777 pb secuencia abajo del codón de terminación TGA. La secuenciación de un ADNc parcial de nCL1 que contiene una cola poliA demostró que el primer AAUAAA es la señal de poliadenilación. Esta última está enclavada en una región bien conservada de la secuencia de nCL1 de rata, y está seguida, después de 4 pb, por un agrupamiento G/T, presente en la mayoría de los 3' del sitio de poliadenilación de genes (Bimstiel y col., 1985). La región 3' no traducida del ARNm de nCL1 tiene 565 pb de longitud. La longitud predicha del ADNc debería ser por tanto de aproximadamente 3550 ó 3000 pb.

b) Comparación con la calpaína

La secuencia del gen nCL1 humano se comparó con las de las otras calpaínas del mismo (Figura 3). Las comparaciones más convincentes son con las secuencias homólogas de rata (nº de acceso J05121), bovina (nº de acceso U07858) y porcina (nº de acceso U05678). Los números de acceso se refieren a los bancos genéticos internacionales, tales como GeneBank (N.I.H.) o la base de datos EMBL (EMBL, Heidelberg). Las altas similitudes locales entre las secuencias de ADN humanas y de rata se han observado incluso en las regiones 5' (75%) o incluso en partes diferentes de las 3' no traducidas (más del 60%) (datos no mostrados). La gran magnitud en homología de la secuencia manifestada por el gen nCL1 humano y de rata en sus regiones no traducidas sugiere presiones evolutivas en supuestas secuencias reguladoras comunes.

c) Organización genómica del qen nCL1

Una comparación de la secuencia del ADNc de nCL1 humano publicada (Sorimachi y col., 1989) con la correspondiente secuencia genómica condujo a la identificación de 24 exones que varían en longitud desde 12 pb (exón 13) hasta 309 pb (exón 1), con un tamaño medio de 100 pb (Figura 1). El tamaño de los intrones varía desde 86 pb hasta aproximadamente 10-16 kb para el intrón 1.

Los límites intrón-exón, según se muestra en la Tabla 2, muestran una cercana adhesión a las secuencias consenso de los sitios de empalme 5' y 3' (Shapiro y Senapathy, 1987).

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 2 Secuencias en las uniones intrón-exón. Se calculó una puntuación que expresaba la adhesión al consenso para cada sitio según Shapiro y Senapathy (1987). Las secuencias de los exones y los intrones están en mayúsculas y en minúsculas, respectivamente. Los tamaños de los exones se dan entre paréntesis

2

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Cuando se sometió la secuencia genómica a un análisis GRAIL (Uberbacher y col., 1991), se reconocieron correctamente 11 exones, 4 no se identificaron, 6 se definieron inadecuadamente y 2 eran demasiado pequeños para ser reconocidos (datos no mostrados).

Como ya se ha mencionado, el gen nCL1 tiene tres bloques únicos de secuencias; NS (residuos de aminoácidos 1 a 61), IS1 (residuos 267 a 329) e IS2 (residuos 578 a 653). Es interesante mencionar que cada una de estas secuencias, así como la señal de translocación nuclear dentro de IS2, están esencialmente flanqueadas por intrones (Fig. 4). La organización exón-intrón del nCL1 humano es similar a la referida para el CANP de pollo (el único otro gen de la subunidad mayor de la calpaína cuya estructura genómica es conocida; (Emori y col., 1986).

Se identificaron cuatro secuencias microsatélite. Dos de ellas están en la parte distal del primer intrón: una (AT)_{14} y una microsatélite de patrón mixto identificada previamente, S774G4B8, de la que se demostró que no era polimórfica (Fougerousse y col., 1994). Se identificó una (TA)_{7}(CA)_{4}(GA)_{13} en el segundo intrón, y el genotipado de 64 individuos CEPH no relacionados reveló dos alelos (con unas frecuencias de 0,10 y de 0,90). La cuarta microsatélite es una repetición mixta (CA)_{n}, (TA)_{m} presente en el 9º intrón. No se han investigado polimorfismos de esta última y de la repetición (AT)_{14}. Se identificaron catorce secuencias repetitivas de la familia Alu y una Mer2 en el gen nCL1 (Fig. 1 C), que estaba, por lo tanto, en una media de un elemento Alu por 2,5 kb.

Los experimentos de transferencia Southern (Ohno y col., 1989) y el cribado por STS (datos no mostrados) sugieren que sólo hay una copia por genoma de este miembro de la familia de las calpaínas.

Ejemplo 3 Expresión del gen nCL1

Se investigó el patrón de especificidad tisular mediante hibridación por transferencia Northern con una sonda subclónica genómica que abarcaba los exones 20 y 21 del cósmido 1F11. No hay ninguna prueba de la existencia de una forma de empalme alternativa de nCL1, aunque esto no puede excluirse. Se detectó un transcrito de aproximadamente 3,4-3,6 kb en el ARNm de músculo esquelético (Figura 5). Este tamaño favorece por tanto que la posición -544 sea la caja TATA funcional.

Los estudios de transcripción sugirieron que es más bien un gen activo en lugar de un pseudogen, y que su patrón de expresión específico muscular es coherente con el fenotipo de esta alteración (Sorimachi y col., 1989, y Figura 5).

Ejemplo 4 Cribado de mutaciones

El nCL1 satisface ambos criterios posicionales y funcionales para ser un gen candidato de la LGMD2A. Para evaluar su papel en la etiología de esta alteración, el nCL1 se cribó sistemáticamente en 38 familias con LGMD2 para comprobar la presencia de cambios de nucleótidos, usando una combinación de análisis de heterodúplex (Keen y col., 1991) y análisis directos de la secuencia.

Se diseñaron cebadores de PCR para amplificar específicamente los exones y empalmar las uniones, y también las regiones que contenían las supuestas cajas CAT, TATA y la señal de poliadenilación del gen, según se muestra en la Tabla 3.

TABLA 3 Cebadores de PCR usados para el análisis del gen nCL1 en pacientes con LGMD

3

4

Los productos de la PCR realizados sobre el ADN de sangre de pacientes específicos con LGMD2A se sometieron entonces a un análisis de heterodúplex o a una secuenciación directa, dependiendo de si se esperaba que la mutación, en base al análisis del haplotipo, fuera homocigótica o heterocigótica, respectivamente. Ocasionalmente fue necesario clonar los productos de la PCR para identificar de forma precisa las mutaciones (es decir, para las microdeleciones o las inserciones y para algunos heterocigotos). Las mutaciones relacionadas con la enfermedad se resumen en la Tabla 4, a continuación, y su posición a lo largo de la proteína se muestra en la Fig. 4.

TABLA 4

5

La primera letra del código de la familia se refiere al origen de la población B = Brasil, M = Francia metropolitana, R = Isla de la Reunión, A= Amish.

Cada mutación se confirmó mediante un análisis de heterodúplex, secuenciando ambas hebras en varios miembros de la familia o mediante digestión enzimática cuando la mutación daba como resultado la modificación de un sitio de restricción. Los análisis de segregación de las mutaciones, realizados sobre los ADN de todos los miembros disponibles de las familias, confirmaron que estas variaciones en las secuencias están en el cromosoma parental portador de la mutación LGMD2A. Para excluir la posibilidad de que las sustituciones de aminoácido pudieran ser polimorfismos, se comprobó sistemáticamente su presencia en una población de control: no se observó ninguna de estas mutaciones entre 120 cromosomas de control de familias de referencia CEPH.

Ejemplo 5 Análisis de los genes de las familias, familias confirmadas con el cromosoma 15

Sobre las familias se realizó un cribado inicial de las mutaciones causantes, conteniendo cada una un gen LGMD localizado en el cromosoma 15. Estas incluían familias de la Isla de la Reunión (Beckmann y col., 1991), de la Antigua Orden de los Amish del norte de Indiana (Young y col., 1992) y 2 familias brasileñas (Passos Bueno y col., 1993).

a) Familias de la Isla de la Reunión

Los estudios genealógicos y el aislamiento geográfico de las familias de la Isla de la Reunión sugerían un único efecto instaurador. Sin embargo, los análisis genéticos no eran coherentes con esta hipótesis, ya que las familias presentan una heterogeneidad en el haplotipo. Se encuentran, al menos, seis cromosomas portadores diferentes (con individuos afectados en varias familias siendo heterocigotos combinados). Hasta ahora se han identificado mutaciones distintas correspondientes a cuatro de estos seis haplotipos.

En la familia R14, los exones 13, 21 y 22 mostraron signos de variaciones en la secuencia tras un análisis de heterodúplex (Fig. 6). La secuenciación de los productos de la PCR asociados reveló (i) un polimorfismo en el exón 13, (ii) una mutación de aminoácido (A -> G) en el exón 21 que transformaba el residuo Ser^{744} en una glicina en el bucle de la segunda EF-hand del dominio IV de la proteína (Figura 4), y (iii) una mutación del marco de lectura en el exón 22. La mutación del exón 21 y el polimorfismo en el exón 13 formaron haplotipo que también se encuentran la familia R17. Fue necesaria una subclonación de los productos de la PCR para identificar la mutación del exón 22. La secuenciación de varios clones reveló una sustitución de AG por TCATCT (datos no mostrados). Está mutación en el marco de lectura provoca una terminación prematura en el nucleótido 2400, donde aparece un codón de terminación en marco (Figura 4).

Los individuos afectados de la familia R12 son homocigóticos para todos los marcadores del intervalo LGMD2A (Allamand, propuesto). La secuenciación de los productos de la PCR del exón 13 reveló una transición de G a A en la base 1715 del ADNc que da como resultado una sustitución de glutamina por Arg^{572} (Figura 7) dentro del dominio III, un residuo que está altamente conservado en todas las calpaínas conocidas. Está mutación, detectable por la pérdida del sitio de restricción Mspl, sólo está presente en esta familia y no en ninguna otra familia con LGMD2A examinada o en controles no relacionados.

En la familia R27, el análisis de heterodúplex seguido de la secuenciación de los productos de la PCR de un niño afectado reveló una deleción de dos pares de bases en el exón 19 (Figura 6 y tabla 4). Falta un AC de los tres en esta posición de la secuencia, produciendo un codón de terminación en la posición 2069 de la secuencia de ADNc (Figura 4).

b) Familias Amish

Como se esperaba, debido a los múltiples lazos consanguíneos, los pacientes Amish con LGMD2A del norte de Indiana examinados eran homocigóticos para el haplotipo del cromosoma portador del alelo mutante (Allamand, propuesto). Se identificó una mutación de aminoácido (G -> A) en el nucleótido 2306 dentro del exón 22 (Fig. 7). El cambio resultante en el codón es de CGG a CAG, transformando la Arg^{769} en glutamina. Este residuo, que está conservado en todos los miembros de la familia de las calpaínas en todas las especies, está localizado en el dominio IV de la proteína dentro de la 3ª EF-hand en la unión hélice-bucle (ref). Está mutación se encontró en un estado homocigótico en todos los pacientes de 12 familias Amish relacionadas por el cromosoma 15, en concordancia con el análisis del haplotipo. También cribamos seis familias Amish del sur de Indiana con LGMD, para las que se excluyó el locus del cromosoma 15 mediante análisis de conexión (Allamand ESHG, propuesto, ASHG 94). Como se esperaba, este cambio de nucleótidos no estaba presente en ninguno de los pacientes de estas familias, confirmando así la heterogeneidad genética de esta enfermedad en este aislado relacionado genéticamente.

c) Familias brasileñas

Como resultado de matrimonios consanguíneos, dos familias brasileñas (B501, B519) son homocigóticas para haplotipos portadores de LGMD2A extendidos (datos no mostrados). La secuenciación de los productos de la PCR de los individuos afectados de estas familias demostró que la familia B501 tiene la misma mutación en el exón 22 encontrada en los pacientes Amish del norte de Indiana (Figura 7), pero enclavado en un haplotipo completamente diferente. En la familia B519, los pacientes portan una transición de C a T en el exón 2; sustituyendo una Arg^{328} por un codón de terminación TGA (Figura 7), dando lugar por tanto, probablemente, a una proteína muy truncada (Figura 4).

d) Análisis de otras familias con LGMD

Habiendo confirmado el papel del gen candidato en el cromosoma 15 de las familias confirmadas, a continuación examinamos mediante análisis de heterodúplex las familias con LGMD para las que los datos de conexión no eran informativos. Estas incluían una brasileña (B505) y 13 árboles genealógicos metropolitanos franceses.

Se revelaron bandas heterodúplex para los exones 1, 3, 4, 5, 6, 8, 11, 22 de uno o más pacientes (Figura 6). De todas las variantes de la secuencia, 10 fueron identificadas como posibles mutaciones patógenas (5 de aminoácido, 1 terminadora y 4 mutaciones del marco de lectura) y 3 como polimorfismos, sin ningún cambio en los aminoácidos de la proteína. Todas las mutaciones causales identificadas se enumeran en la Tabla 4, a continuación. Se descubrieron mutaciones idénticas en familias aparentemente no relacionadas. Las mutaciones compartidas por las familias M35 y M37, y M2888 y M1394, respectivamente, son probablemente la consecuencia de eventos independientes, dado que están enclavadas en diferentes haplotipos marcadores. Por el contrario, parece probable que la mutación puntual en el exón 22 de los Amish y en los parientes de la M32 corresponda al mismo evento mutacional, ya que ambos cromosomas comparten un haplotipo común de cuatro marcadores (774G4A1 - 774G4A1O - 774G454D - 774G4A2) alrededor de nCL1 (datos no mostrados), que posiblemente refleja un antepasado común. Se cree que esto también es cierto para la mutación por sustitución de AG por TCATCT encontrada en el exón 22 de las familias B505 y R14. La transversión del exón 8 (T -> G) está presente en los dos cromosomas portadores de M2407, la única familia metropolitana homocigótica por haplotipo, reflejando posiblemente una consanguinidad no documentada. En algunas familias no se ha detectado hasta ahora una mutación causante de la enfermedad (la M40, por ejemplo).

Además del polimorfismo presente en el exón 13 de las familias R14 y R17 (posición 668) y en los microsatélites intragénicos, se detectaron cuatro variaciones adicionales neutras: una transición (T -> C) en la posición 96, que abolía un sitio de restricción DdeI en el exón 1 de M31; una transición (C -> T) en el exón 3 (posición 495) de M40 y de M37 que formaba un haplotipo con la mutación del exón 5 (en la primera familia, este polimorfismo no se cosegrega con la enfermedad); una transición (T -> C) en el promotor derivado por vía paterna de M42 en la posición -428, que también se evidenció en los controles sanos; y una poli(G) variable en el intrón 22 cerca del sitio de empalme en las familias R20, R11, R19, M35 y M37. Esta última también está presente en los miembros de las familias CEPH, pero no es útil como marcador genético ya que la visualización en la interpretación de alelos con mononucleótidos repetidos es difícil.

En total, se identificaron dieciséis eventos mutacionales independientes que representaban catorce mutaciones diferentes. Todas las mutaciones se cosegregaban con la enfermedad en las familias con LGMD2A. Los alelos de calpaína mórbidos caracterizados contenían cambios en nucleótidos que no se encontraron en los alelos de individuos normales. El descubrimiento de dos mutaciones terminadoras y cinco mutaciones del marco de lectura en el nCL1 apoya la hipótesis de que una deficiencia de este producto provoca la LGMD2A. Las siete mutaciones dieron como resultado un codón de terminación en marco prematuro, dando lugar a la producción de proteínas truncadas y probablemente inactivas (Figura 4). Las pruebas de la morbilidad de las mutaciones de aminoácidos proceden de (1) la relativa alta incidencia de dichas mutaciones entre los pacientes con LGMD2A; aunque en ausencia de ensayos funcionales es difícil diferenciar entre un polimorfismo y una mutación mórbida, la aparición de diferentes mutaciones "de aminoácidos" en este gen no pueden explicarse todas como raros polimorfismos particulares; (2) el fracaso en la observación de estas mutaciones en cromosomas de control; y (3) la aparición de mutaciones en residuos conservados evolutivamente y/o en regiones con una importancia funcional documentada. Cuatro de las siete mutaciones de aminoácidos cambian un aminoácido que está conservado en todos los miembros conocidos de la familia de las calpaínas en todas las especies (Figura 3). Dos de las mutaciones restantes afectan a residuos de aminoácidos menos conservados, pero están localizadas en importantes dominios funcionales. La sustitución V354G del exón 8 está 4 residuos antes de la asparragina del sitio activo, y la S744G del exón 21 está dentro del bucle de la segunda EF-hand y puede deteriorar la regulación dependiente de calcio de la actividad de la calpaína o la interacción con una subunidad menor (Figura 4). Varias mutaciones de aminoácidos cambian un residuo hidrófobo por uno polar o viceversa (Tabla 4) posiblemente desorganizando estructuras de un orden mayor.

Procedimientos Descripción de los pacientes

Las familias con LGMD2A analizadas eran de 4 orígenes geográficos diferentes. Incluían 3 familias brasileñas, 13 familias nucleares interrelacionadas de la Isla de la Reunión, 10 familias metropolitanas francesas y 12 familias Amish estadounidenses. Previamente se había confirmado que la mayoría de estas familias pertenecen al grupo del cromosoma 15 mediante análisis de relación (Beckmann; 1991; Young, Passos-Bueno y col., 1993). Sin embargo, algunas familias de la Francia metropolitana, así como una familia brasileña, la B505, no tenían una puntuación Lod significativa para el cromosoma 15. El ADN genómico se obtuvo a partir de linfocitos de sangre periférica.

Secuenciación del cósmido c774G4-1 F11 y mapa de restricción de EcoRI de los cósmidos

El cósmido 1F11 (Figura 1 C) se subclonó tras la preparación del ADN mediante un procedimiento Qiagen (Qiagen Inc., EE.UU.) y la digestión parcial con Sau3A, con RsaI o con AluI. Se recuperaron los fragmentos de restricción elegidos por tamaño de la agarosa de bajo punto de fusión y finalmente se ligaron con vectores M13 o Bluescript (Stratagene, EE.UU.). Tras la electroporación en E. coli, las colonias recombinante se recogieron en 100 \mul de medio LB/ampicilina. Las reacciones de PCR se realizaron sobre 1 \mul de cultivo en Tris-HCl 10 mM, pH 9,0, KCI 50 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, Triton X-100 al 0,1%, 0,01 de gelatina, 200 \muM de cada dNTP, 1 U de Polimerasa Taq (Amersham) con 100 ng de cada cebador de vector. La amplificación se inició mediante una desnaturalización de 5 min a 95ºC, seguida de 30 ciclos de 40 s de desnaturalización a 92ºC y 30 s de apareamiento a 50ºC. Los productos de la PCR se purificaron mediante dispositivos Microcon (Amicon, EE.UU.) y se secuenciaron usando el método didesoxi de terminación de la cadena en un secuenciador ABI (Applied Biosystems, Foster City, EE.UU.). Se analizaron las secuencias, en los alineamientos se realizaron usando el programa informático XBAP del paquete Staden, versión 93.9 (Staden, 1982). Los huecos entre las contigs de la secuencia se rellenaron caminando con cebadores internos. El mapa de restricción EcoRI de los cósmidos se realizó esencialmente según se describe en Sambrook y col. (1989).

Análisis mediante transferencia Northern

Las sondas se marcaron mediante un cebado aleatorio con dCTP-(a^{32}P). La hibridación se realizó en transferencias Northern de múltiples tejidos humanos, según recomienda el fabricante (Clontech, EE.UU.).

Análisis de los productos de la PCR de familias con LGMD2A

Se usaron cien ng de ADN humano para la PCR con el tampón y las condiciones de ciclos descritas en Fougerousse (1994) (la temperatura de apareamiento se muestra en la Tabla 3). El análisis de heterodúplex (Keene y col., 1991) se realizó mediante electroforesis de diez \mul de los productos de la PCR en geles Hydrolink MDE de 1,5 mm de espesor (Bioprobe) a 500-600 V durante 12-15 h dependiendo de la longitud del fragmento. El perfil de migración se visualizó bajo luz UV tras una tinción con bromuro de etidio.

Para el análisis de la secuencia, los productos de la PCR se sometieron a una secuenciación de pigmento-didesoxi, tras la purificación a través de dispositivos Microcon (Amicon, EE.UU.). Cuando fue necesario, dependiendo de la naturaleza de las mutaciones (por ejemplo, una mutación en el marco de lectura o para algunos heterocigotos), los productos de la PCR se clonaron usando el kit de clonación TA de Invitrogen (Reino Unido). Se ligó un \mul de producto a 25 ng de vector a 12ºC hasta el día siguiente. Después de una electroporación en bacterias XL1-blue, se analizaron varios clones independientes mediante PCR y se secuenciaron según se describió anteriormente.

La invención resulta del hallazgo de que cuando el gen nCL1 está mutado, está implicado en la etiología de la LGMD2A. es exactamente lo contrario a lo que se establece en la bibliografía médica, por ejemplo, que la enfermedad está acompañada por la presencia de una calpaína desregulada. La identificación del nCL1 como el gen defectuoso de la LGMD2A representa el primer ejemplo de distrofia muscular causada por una mutación que afecta a un gen que no es un componente estructural del tejido muscular, al contrario que las distrofias musculares identificadas previamente, tales como la de Duchenne y la de Becker (Bonilla y col., 1988), grandes distrofias infantiles autosómicas recesivas (Matsumara y col., 1992), Fukuyama (Matsumara y col., 1993) y distrofias musculares congénitas deficientes en merosina (Tomé y col., 1994).

La comprensión del fenotipo LGMD2A requiere tener en cuenta el hecho de que en muchos pacientes no hay proteína activa nCL1, una pérdida compatible con la manifestación recesiva de esta enfermedad. Por lo tanto, los modelos simples en los que ésta proteasa estaría implicada en la degradación o en la desestabilización de los componentes estructurales del citoesqueleto, de la matriz extracelular o del complejo de distrofina pueden descartarse. Adicionalmente, no hay signos de dichas alteraciones mediante estudios inmunocitogenéticos sobre biopsias musculares de LGMD2 (Matsumara y col., 1993; Tomé y col., 1994). Asimismo, dado que las miofibras en la LGMD2A aparentemente no son diferentes de las otras fibras distróficas, parece poco probable que esta calpaína juegue un papel en la fusión de los mioblastos, tal y como se ha propuesto para las calpaínas ubicuas (Wang y col., 1989).

Todos los datos descritos en estos ejemplos confirman que el gen nCL1, cuando muta, es el principal gen implicado en la enfermedad.

El hecho de que la morbilidad resulte de la pérdida de una actividad enzimática levanta esperanzas para nuevas perspectivas farmacoterapéuticas. La disponibilidad de modelos transgénicos será una herramienta inestimable para estas investigaciones.

La invención también es relativa al uso de un ácido nucleico o de una secuencia de un ácido nucleico de la invención, o al uso de una proteína codificada por el ácido nucleico, para la elaboración de un fármaco para la prevención o el tratamiento de la LGMD2.

El hallazgo de que una calpaína defectuosa subyace en la patogénesis de la LGMD2A puede ser útil para la identificación de otros loci implicados en las LGMDs. De hecho, otras formas de la LGMD pueden estar causadas por mutaciones en genes cuyos productos son los sustratos de las CANP o en genes implicados en la regulación de la expresión de nCL1. Técnicas tales como el sistema de selección de híbridos dobles (Fields y col., 1989) podrían permitir el aislamiento del (los) sustrato(s) proteico(s) natural(es) de esta calpaína, y ayudar potencialmente por tanto a identificar otros loci de la LGMD.

La invención también se refiere al uso de toda o de una parte de la secuencia peptídica de la enzima, o de la enzima, producto del gen nCL1, para el cribado de los ligandos de esta enzima, que también podrían estar implicados en la etiología y en la morbilidad de la LGMD2.

Los ligandos que podrían estar implicados son, por ejemplo, sustrato(s), activadores o inhibidores de la enzima.

Los ácidos nucleicos de la invención también podrían usarse en un procedimiento de cribado para la determinación de los componentes que podrían actuar en la regulación de la expresión génica.

Un procedimiento de cribado usando la enzima o una célula hospedadora recombinante que contiene el gen nCL1 y que expresa la enzima también es parte de la invención.

Los procedimientos farmacológicos y el uso del ácido nucleico y de las secuencias peptídicas de la invención son aplicaciones muy potentes.

Los procedimientos usados para dichos cribados de los ligandos o de los elementos reguladores son los descritos, por ejemplo, para el cribado de los ligandos usando receptores clonados.

La identificación de mutaciones en el gen nCL1 proporciona un medio de diagnóstico directo prenatal o presintomático y para la detección de portadores en familias en las que se han identificado ambas mutaciones. La clasificación precisa basada en los genes de las familias LGMD2A debería confirmar su utilidad para el diagnóstico diferencial de esta de alteración.

La invención se refiere a un procedimiento para la detección de una predisposición a la LGMD2 en una familia o en un ser humano, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:

- seleccionar uno o más exones o secuencias flanqueantes que son susceptibles en dicha familia;

- seleccionar los cebadores específicos para el o los exones o sus secuencias flanqueantes, siendo un ejemplo específico los cebadores de PCR de la Tabla 3, o un híbrido de los mismos,

- amplificar la secuencia de ácidos nucleicos, siendo el sustrato de esta amplificación el ADN del ser humano cuya predisposición se va a comprobar, y

- comparar la secuencia amplificada con la correspondiente secuencia derivada de la Figura 2 o de la Figura 8.

La Tabla 2 indica las secuencias de las uniones intrones-exones, y los cebadores que comprenden en su estructura estas uniones también están incluidos en la invención.

Todos los demás cebadores adecuados para dicha amplificación de ARN o de ADN pueden usarse en el procedimiento de la invención.

Del mismo modo, podría usarse cualquier procedimiento de amplificación adecuado: PCR (de Polymerase Chain Reaction® - Reacción en Cadena de la Polimerasa®-, NASBA® (de Nucleic acid Sequence Based Amplification - Amplificación Basada en la Secuencia de Ácidos Nucleicos-), u otros.

Los procedimientos usados habitualmente para la detección de una mutación supresora, tales como ASO (PCR específicas de alelos), LCR o ARMS (Amplification Refactory Mutation System - Sistema de Amplificación de Mutaciones Refractarias) pueden ser implementados con los cebadores específicos de la invención.

Los cebadores, tales como los descritos en las Tablas 1 y 3, o que incluyen las uniones de la Tabla 2.

El kit para la detección de una predisposición a LGMD2 mediante la amplificación de ácidos nucleicos también está en el ámbito de la invención, dicho kit comprende al menos cebadores de PCR elegidos de grupo de

a)

los descritos en la tabla 1

b)

los descritos en la tabla 3

c)

los que incluyen las uniones intrones-exones de la Tabla 2.

La secuencia de ácidos nucleicos de las reivindicaciones 1 a 3 podría ser insertada en un vector vírico o retrovírico, siendo dicho vector capaz de transfectar una línea celular de empaquetamiento.

La línea celular de empaquetamiento transfectada podría usarse como un fármaco para la terapia génica de la LGMD2.

El tratamiento de la enfermedad LGMD2 mediante terapia génica se implementa mediante una composición farmacéutica que contiene un componente elegido del grupo de

a)

una secuencia de ácidos nucleicos según las reivindicaciones 1 a 4,

b)

una línea celular según la reivindicación 24,

c)

una secuencia de aminoácidos según las reivindicaciones 5 a 9.

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Claims (16)

1. Una secuencia aislada de un ácido nucleico representada en la Figura 8 que codifica para una proteína humana con una actividad proteasa dependiente de calcio.

2. Una secuencia de un ácido nucleico aislada, que codifica para una proteína con una actividad proteasa dependiente de calcio, que comprende la secuencia representada en la Figura 2.

3. Un ácido nucleico aislado derivado de la secuencia según la reivindicación 2, mediante sustitución, deleción o adición de uno o más nucleótidos, siempre que dicha secuencia codifique para una proteína CANP3 de 821 aminoácidos.

4. Un ácido nucleico aislado complementario de una secuencia de ácidos nucleicos según las reivindicaciones 1 a 3.

5. Una secuencia aislada de un ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 bajo el control de elementos reguladores, e implicada en la expresión de la actividad de la calpaína en una enfermedad LGMD2.

6. Un ácido nucleico aislado según la reivindicación 2, que está mutado en cualquiera de las siguientes posiciones numeradas según la Figura 2B y provoca una distrofia muscular de Limb Girdle de tipo 2A (LGMD2A):

Posición del nucleótido Cambios de nucleótido 328 CGA -> TGA 545 CTG -> CAG 550 Deleción de A 701 GGG -> GAG 945 CGG -> CG 1061 GTG -> GGG 1079 TGG -> TAG 1468 CGG -> TGG 1715 CGG -> CAG 2069-2070 Deleción de AC 2230 AGC -> GGC 2306 CGG -> CAG 2313-2316 Deleción de AGAC 2362-2363 AG -> TCATCT

7. Una célula hospedadora que, cuando es transformada o transfectada con una secuencia de ácidos nucleicos que comprende la secuencia de ácidos nucleicos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, expresa una actividad de la enzima calpaína.

8. Uso de un ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o de una célula hospedadora según la reivindicación 7 para la elaboración de un fármaco para la prevención o el tratamiento de una enfermedad LGMD2.

9. Uso de una secuencia de aminoácidos codificada por un ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para la elaboración de un fármaco para la prevención o el tratamiento de una enfermedad LGMD2.

10. Uso según las reivindicaciones 8 ó 9, caracterizado porque la LGMD2 es LGMD2A.

11. Un procedimiento para detectar una predisposición a la enfermedad LGMD2, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:

-

seleccionar uno o más exones o sus secuencias flanqueantes de los genes;

-

seleccionar los cebadores específicos para estos exones, o sus secuencias flanqueantes, o un híbrido de los mismos,

-

amplificar las secuencias de ácidos nucleicos con estos cebadores, siendo el sustrato de esta amplificación el ADN de un ser humano, y

-

comparar la secuencia amplificada con la correspondiente secuencia derivada de la Figura 2 o de la Figura 8.

12. El procedimiento según la reivindicación 11, caracterizado porque los cebadores son aquellos elegidos del grupo de:

a)

aquellos descritos en la Tabla 1;

b)

aquellos descritos en la Tabla 3, y

c)

aquellos que incluyen las uniones intrones-exones de la Tabla 2.

13. El procedimiento según la reivindicación 11 ó 12 caracterizado porque la LGMD2 es la LGMD2A.

14. Un kit para la detección de una predisposición a la enfermedad LGMD2 mediante la amplificación de ácidos nucleicos caracterizado porque dicho kit comprende cebadores elegidos del grupo de:

a)

aquellos descritos en la Tabla 1;

b)

aquellos descritos en la Tabla 3; y

c)

aquellos que incluyen las uniones intrones-exones de la Tabla 2.

15. Uso de una célula hospedadora según la reivindicación 7 en la elaboración de un fármaco para la terapia génica de una enfermedad LGMD2.

16. Composición farmacéutica para el tratamiento de una enfermedad LGMD2 caracterizada porque contiene un componente elegido del grupo de:

a)

una secuencia de ácidos nucleicos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5,

b)

una célula hospedadora según la reivindicación 7,

c)

una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácidos nucleicos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.