JPH11504816A - Ｉｌ−６活性阻害剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ＩＬ−６の活性を阻害することができるヌクレオチド配列、治療におけるその使用、並びにそれを含む薬剤組成物に関する。特に本発明は、ｉ）一般式ＺＸＭＹＫＧＫＡＡ（式中ＺはＴまたはＧまたは欠損していてもよく、ＸはＴまたは欠損していてもよく、ＭはＣまたはＡであり、ＹはＣまたはＴであり、ＫはＴまたはＧである）で表されるＡＰＲＥ要素であるヌクレオチド配列を少なくとも一つ、ｉｉ）たとえばプロモーター領域内に存在する、ＡＰＲＥ要素以外の転写因子結合部位を構成するヌクレオチド配列を少なくとも一つ、これらを組み合わせて含むヌクレオチド配列に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 ＩＬ−６活性阻害剤 発明の分野 本発明は、ＩＬ−６の活性を阻害することができるヌクレオチド配列、その ヌクレオチド配列の治療への使用、およびそのヌクレオチド配列を含む薬剤組成 物に関する。 発明の背景 ＩＬ−６は、生物の免疫応答および造血作用を刺激する際に重要な働きをす ることが証明されている、サイトカインの一群に属するタンパク質である。 実際、造血系およびリンパ系において、肝臓、およびその他の標的器官や細 胞中において、ＩＬ−６についての多くの生物学的機能が見いだされた。これら の機能には有用なものがあるが、病理学的状態と関連しているものもある。後者 の機能の中で、ＩＬ−６は複数のミエローマ細胞にとっての成長因子であること がわかっている；抗ＩＬ−６抗体により、白血病の患者の体内で一時的にミエロ ーマ細胞の増殖が阻止されることが示された(たとえば、Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａ ｌ.，Ｂｌｏｏｄ，７８，(５)，ｐｐ．１１９８−１２０４，１９９１およびＬ ｕ ｅｔ ａｌ.，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ.，２２ｐｐ．２８１９−２８２ ４，１９９２を参照)。 ＩＬ−６濃度の増加は慢性関節リューマチ、糸球体腎炎、落屑、およびキャ ッスルマン病などの自己免疫疾患および炎症性疾患と相関性を有している(たと えば、Ｇｒａｅｖｅ ｅｔ ａｌ.，Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ.，７１，ｐｐ ．６６４−６７１，１９９３を参照)。ＩＬ−６は骨喪失および高カルシウム血 症においても直接的な働きを示した(たとえば、Ｐｏｌｉ ｅｔ ａｌ.，Ｅｍｂ ｏ Ｊ.，１３，(５)ｐｐ．１１８９−１１９６およびＹｏｎｅｄａ ｅｔ ａ ｌ.，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ.，５３，ｐｐ．７３７−７４０，Ｆｅｂ．１９９３ 参照)。 ＩＬ−６活性の阻害剤の作成はこのようなわけで活発な研究対象となってい る。このような目的に対して、ＩＬ−６に対する抗体(Ｋｌｅｉｎらにより上記 に報告されている)、ｇｐ１３０あるいはｇｐ８０に対する抗体を使用すること ；可溶性ｇｐ１３０を使用すること；またはＩＬ−６またはＩＬ−６受容体につ いての変異タンパク質を使用することを含む、様々なアプローチが行われた。 これらのアプローチは、臨床的応用（Ｌｕら、上記により報告）において特 異的な望ましくない効果が関連しうるため、ＩＬ−６活性を阻害するための別の 戦略を立てることが必要でありうる。 そのため出願人は、ＩＬ−６活性を阻害する別のアプローチ、すなわちＩＬ −６シグナルを媒介する細胞内タンパク質を阻害することによりＩＬ−６活性を 阻害することを研究した。 反応性の細胞におけるＩＬ−６のシグナル伝達は、詳細に研究されている。 Ｆｏｗｌｋｅｓら（ＰＮＡＳ ＵＳＡ，８１，ｐｐ．２３１３−２３１６，１９ ８４）は、ラットのフィブロネクチン遺伝子に隣接させたＩＬ−６に対して特異 的なＤＮＡ反応性要素に最初に着目した。 後にＫｕｒｚら（Ｎｕｃ．Ａｃ．Ｒｅｓ.，１７，(３)，１１２１−１１３ ７，１９８９）は、ラットα₂−マクログロブリン遺伝子中に、ＩＬ−６に対し て反応するための、ラットフィブロネクチン遺伝子中に存在するものと同一のコ ア配列（ＣＴＧＧＧＡ）を含む応答要素を含むことを示した。 上述した配列と関連する配列を含むＤＮＡ応答要素は、ヒトＣ反応タンパク 質（ＣＲＰ）をコードする遺伝子(Ｔｏｎｉａｔｔｉ ｅｔ ａｌ.，Ｍｏｌ．Ｂ ｉｏｌ．Ｍｅｄ.，７，ｐｐ．１９９−２１２，１９９０を参照)、ヒトハプトグ ロビンをコードする遺伝子(Ｏｌｉｖｉｅｒｏ ｅｔ ａｌ.，Ｅｍｂｏ Ｊ.， ６，(７)，ｐｐ．１９０５−１９１２，１９８７を参照)、そしてＩＬ−６によ り誘導される別の急性相タンパク質をコードするその他の遺伝子（Ｈｅｉｎｒｉ ｃｈ ｅｔ ａｌ.，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ.，２６５，ｐｐ．６２１−６３６，１ ９９０を参照）中においても見いだされ、ＣＴＧＧＧＡＷまたはＣＴＧＧＲＡＡ （ここでＷはＡまたはＴを意味し、ＲはＡまたはＧを意味する）のコアコンセン サス配列の定義を導いた。 Ｈｏｃｈｅら（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ.，１２，(５)，ｐｐ．２２８ ２−２２９４，１９９２）は、関連する複数のコア配列が上述したコア配列と同 様 にＩＬ−６に応答する野生型の遺伝子の調節領域に存在しうること、およびリポ ーター遺伝子アッセイにより機能について解析されたように、この複数性が応答 の増幅を導くことを示した。 Ｗｅｇｅｎｋａら（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ.，１３，(１)，ｐｐ．２ ７６−２８８，１９９３）は最近、式ＫＴＭＹＫＧＫＡＡ（ＭはＣまたはＡを意 味し、ＫはＴまたはＧを意味し、ＹはＣまたはＴを意味する）により示すことが できる、ヘパトーマ細胞（肝細胞癌）において活性である、急性相応答要素（Ａ ＰＲＥ）としてのコアコンセンサス配列の拡張版を示した。 このようなＡＰＲＥ様の配列が、最近クローニングされたＡＰＲＦと呼ばれ る分子量９０ＫＤのタンパク質転写因子（Ａｋｉｒａ ｅｔ ａｌ.，Ｃｅｌｌ ，７７，ｐｐ．６３−７１，１９９４を参照）と結合することを、Ｙｕａｎら（ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ.，１４，(３)，ｐｐ．１６５７−１６６８，１９ ９４）は示した。その結果実際上は、活性化されたＡＰＲＦがＡＰＲＥ配列に結 合することにより、ＩＬ−６応答細胞において（このようなＡＰＲＥ配列を含む ）ＩＬ−６誘導性遺伝子を活性化させることができる。 この結果、ＡＰＲＥ要素を以下のようにＩＬ−６応答細胞において標的遺伝 子のエンハンサーとして使用することができる：ＩＬ−６応答細胞において、Ｉ Ｌ−６により処理することがＡＰＲＦタンパク質の合成を誘導し、ＡＰＲＦタン パク質がＡＰＲＥ要素に結合し、このような結合により標的遺伝子が活性化する 。 Ｓｅｒｌｕｐｉ Ｃｒｅｓｃｅｎｚｉら（１９９４年６月１４−１７日にバ ルセロナで開催された、第１２回欧州免疫学会（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｉｍｍｕｎ ｏｌ．Ｍｅｅｔｉｎｇ）でのポスター発表）は、ＡＰＲＥのＤＮＡ配列を８回繰 り返したもの（Ｍ８）がＨｅｐＧ２ヒトヘパトーマ細胞において、ＩＬ−６によ るリポーター遺伝子の誘導を５０−１００倍にすることができることを示した。 二本鎖オリゴヌクレオチドは実際、一つの転写因子に対することを示した。 発明の概要 本発明の主要な対象物は、 ｉ）一般式ＺＸＭＹＫＧＫＡＡ（この中でＺはＴまたはＧまたは塩基が存在 しなくてもよいことを意味し、ＸはＴまたは塩基が存在しなくてもよいことを意 味し、ＭはＣまたはＡを意味し、ＹはＣまたはＴを意味し、ＫはＴまたはＧを意 味する）で表されるＡＰＲＥ要素であるヌクレオチド配列を少なくとも一つ、 ｉｉ）ＡＰＲＥ要素以外の、プロモーター領域に存在するような転写因子結 合部位を構成するヌクレオチド配列を少なくとも一つ、 これらを組み合わせて含む、ＩＬ−６活性を阻害することができるヌクレオ チド配列である。 後者のタイプのヌクレオチド配列の例としては、ＴＡＴＡボックス、そして ＡＰ−１(Ｒｉａｂｏｗｏｌ ｅｔ ａｌ.，ＰＮＡＳ ＵＳＡ，８９，ｐｐ．１ ５７−１６１，１９９２を参照)、ＡＰ−２、ＨＮＦ−１(Ｃｌｕｓｅｌ ｅｔ ａｌ.，Ｎｕｃ．Ａｃ．Ｒｅｓ.，２１(１５)，ｐｐ．３４０５−３４１１を参照 )、ＳＰ−１(Ｗｕ ｅｔ ａｌ.，Ｇｅｎｅ，８９，ｐｐ．２０３−２０９，１ ９９０を参照)、ＮＦ−κＢ(Ｂｉｅｌｉｎｓｋａ ｅｔ ａｌ.，Ｓｃｉｅｎｃ ｅ，２５０，ｐｐ．９９７−１０００，１９９０を参照)、Ｏｃｔ−１、Ｅ−２ 、およびＳＲＦ転写因子などの転写因子結合部位が含まれる。 本発明のより好ましい態様において、ＡＰＲＥ要素（ｉ）および／または上 記一般式で表されるヌクレオチド配列（ｉｉ）の両方が、それぞれ少なくとも２ 回、より好ましくは３回から１０回、さらにより好ましくは８回繰り返す。 本発明のさらにより好ましい態様において、要素（ｉ）は少なくとも２種類 の異なるＡＰＲＥ要素を含み、および／またはヌクレオチド配列（ｉｉ）はＡＰ ＲＥ要素以外の転写因子結合部位を構成する少なくとも２種類の異なるオリゴヌ クレオチド配列を含む。 ヌクレオチド配列（ｉｉ）は好ましくはＳＶ４０初期プロモーターである。 ＡＰＲＥ要素（ｉ）はたとえば以下のヌクレオチド配列、すなわちＴＴＣＴ ＧＧＧＡＡを含む。 図２は、より好ましい態様に従う、本発明の範囲に属するヌクレオチド配列 について報告する。このようなヌクレオチドは配列番号１としても報告し、それ は本発明の対象物の一つを構成する。 本発明のさらなる対象物は、本発明のヌクレオチド配列を含むプラスミドベ クターである。 本発明の別の観点は、ＩＬ−６が病原的な役割をしている疾患において、Ｉ Ｌ−６の活性を阻害するための治療における道具として本発明のヌクレオチド配 列を使用することである。 本発明は、本発明によるヌクレオチド配列またはプラスミドベクターを含む 薬剤組成物を提供する。このような組成物は、経口的な使用、直腸からの使用、 静脈からの使用あるいは局所的な使用として処方することができる。本発明の処 方は、ウィルス媒介性遺伝子導入、リポソーム処方、受容体媒介性ＤＮＡ送達お よび／または本発明による活性を有するヌクレオチド阻害配列のダンベル構造の 任意の組み合わせを使用することを含みうる。 本発明のヌクレオチド配列の阻害活性は、リポーター遺伝子アッセイにより 特定した。 本発明のリポーター遺伝子アッセイは、(上述した)ＩＬ−６応答細胞におい て、任意の遺伝子のエンハンサーとして機能するためのＡＰＲＥ要素の能力に基 づいている。この場合ＡＰＲＥ要素は、(たとえばＨｅｐＧ２のような肝細胞で ある)ＩＬ−６応答細胞において、(たとえばルシフェラーゼ遺伝子である)標的 となるリポーター遺伝子のエンハンサーとして使用する。細胞はその後ＩＬ−６ で処理する：もし多量の生成されたＡＰＲＥタンパク質が過剰量の本発明による ヌクレオチド配列によりとらえられれば、標的遺伝子は活性化されていないだろ う。 このアッセイにより、本発明のヌクレオチド配列を含む阻害プラスミドを構 築する。このようなプラスミドの例は、その構築戦略とともに図１に示している 。 本発明のヌクレオチド配列を含むこのプラスミドおよびその他のプラスミド も、本発明のさらなる態様を構成することを意図している。 本発明は、以下の実施例により記載されるだろうが、しかしいかなる場合で も本発明を限定するものとして構成すべきではない。実施例は、本明細書で以下 に特定する図に言及する予定である。 図面の簡単な説明 図１：プラスミドｐＭ８ＳＶの構築戦略。 ｐＭ８ＳＶＬをＳａｌＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、接着末端はクレノ ー反応によりブラント末端に転換する。結果として得られた３．２ＫｂのＤＮＡ 断片をアガロースゲル電気泳動により精製し、その後自己ライゲーションさせた 。このようにＭ８配列（およそ１７０ｂｐ）およびＳＶ４０ウィルス初期プロモ ーター由来の配列（およそ１９０ｂｐ）を含み、ルシフェラーゼ遺伝子を含まな いプラスミドｐＭ８ＳＶを作成する。 図２：プラスミドｐＭ８ＳＶのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ阻害ＤＮＡ断片 の配列。 示したヌクレオチド配列の上半分の上部に引かれた実線は、Ｍ８配列を示し ている。ヌクレオチド配列の下半分の上部に引かれた太い実線は、ＳＶ４０プロ モーター配列を示している。ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩの制限酵素部位も 示してある。 図３：Ｔ４７Ｄ細胞中およびＭ１細胞中でのＩＬ−６リポーター遺伝子アッ セイ。種々のＭ８含有プラスミドの試験。 報告した光放射の値は、トランスフェクションした細胞から３０秒間にわた って積算したｃｐｓ（ＡＵＣ＝曲線下領域(Ａｒｅａ Ｕｎｄｅｒ Ｃｕｒｖｅ) を２種に分けて測定したもののそれぞれの平均値である。それぞれの棒グラフは 、３回のトランスフェクションの平均±ＳＥＭを示している。 図４：ＩＬ−６による処置後の、トランスフェクションされたＨｅｐＧ２細 胞の経時的ルシフェラーゼ誘導性。 プラスミドｐＭ８ＳＶＬを、陽性リポーター遺伝子プラスミドとして使用し た。それぞれの棒グラフは、２回のトランスフェクションの平均±ＳＥＭを示し ている。２回の実験を図中に示す。 図５：ＩＬ−６に対するＨｅｐＧ２リポーター遺伝子アッセイ。リポーター 遺伝子プラスミドとしてのｐＭ８ＳＶＬに対する阻害プラスミドとしてのｐＭ８ の試験。 それぞれの捧グラフは、３回のトランスフェクションの平均±ＳＥＭを示す 。４回の実験を図中に示す。 図６：ＩＬ−６に対するＨｅｐＧ２リポーター遺伝子アッセイ。リポーター 遺伝子プラスミドとしてのｐＭ８ＳＶＬに対する阻害プラスミドとしてのｐＭ８ ＳＶの試験。 それぞれの棒グラフは、３回のトランスフェクションの平均±ＳＥＭを示す 。結果を阻害プラスミドを含まない担体プラスミドｐＣをトランスフェクション したＨｅｐＧ２細胞に対する阻害の割合（％）で表す。 図７：ＩＬ−６に対するＨｅｐＧ２リポーター遺伝子アッセイ。リポーター 遺伝子プラスミドであるｐＭ８ＳＶＬに対する阻害プラスミドとしてのｐＳＶお よびｐＭ８ＳＶの試験。 それぞれの棒グラフは、３回のトランスフェクションの平均±ＳＥＭを示す 。結果を阻害プラスミドを含まない担体プラスミドｐＣをトランスフェクション したＨｅｐＧ２細胞に対する阻害の割合（％）で表す。 図８：ヒトハプトグロビン遺伝子プロモーター由来のＩＬ−６誘導性調節配 列の調節下における、ルシフェラーゼ遺伝子に基づくＨｅｐＧ２リポーター遺伝 子アッセイにおける阻害プラスミドｐＭ８およびｐＭ８ＳＶによる、ＩＬ−６活 性の阻害試験。 それぞれの捧グラフは、３回のトランスフェクションの平均±ＳＥＭを示す 。結果を阻害プラスミドを含まない担体プラスミドｐＣをトランスフェクション したＨｅｐＧ２細胞に対する阻害の割合（％）で表す。トランスフェクションは 、０．１μｇのリポータープラスミドＤＮＡと示されたモル数の過剰量の阻害プ ラスミドとを用いて行った。トランスフェクションされたＤＮＡの総量は、担体 プラスミドにより一定に保たれた。トランスフェクションされた細胞は、１ｎｇ ／ｍｌのＩＬ−６で１８時間処理された。 発明の詳細な説明 実施例１：プラスミドの構築 まず最初に未切断のＢａｍＨＩ部位を５’ブラント末端に、そして３’末端 にＢｇｌＩＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素部位を両立する４ヌクレオチドの一本鎖 突出部分を有する３８ｂｐの二本鎖オリゴヌクレオチドを化学合成することで調 製することにより、ＩＬ−６応答性ルシフェラーゼ遺伝子プラスミドを構築した 。この合成ヌクレオチドはＭ２と命名し、そしてこの合成ヌクレオチドはラット α₂−マクログロブリン遺伝子プロモーター領域由来の２個の同一なＡＰＲＥ配 列を含んでいた。オリゴヌクレオチドの配列は以下の通りである(上流側の鎖、 ５’末端から３’末端)： ＧＧＡＴＣＣＴＴＣＴ ＧＧＧＡＡＴＴＣＴＧ ＡＴＣＣＴＴＣＴＧＧ ＧＡ ＡＴＴＣＴＧ(配列番号２)。このオリゴヌクレオチドは、プラスミドｐＧＬ２− ｐｖ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製）のＳｍａＩ−ＢｇｌＩＩ 部位にクローニングされ、その中でルシフェラーゼリポーター遺伝子はＳＶ４０ ウィルスの初期プロモーターにより駆動され、その結果自己ライゲーションをし た後プラスミドｐＭ２ＳＶＬが作成される。 ５’末端がブラント末端である合成オリゴヌクレオチドは、上記と同一のプ ラスミドｐＧＬ２−ｐｖのＳｍａＩ制限酵素部位にもライゲーションされ、その 結果得られた直鎖状のライゲーション生成物はその後ＨｉｎｄＩＩＩで切断され た。結果として得られた直鎖状のベクターは、以下のＤＮＡ断片、すなわち１） プラスミドｐＭ２ＳＶＬ由来の２３８ｂｐであるＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断 片であり、自己ライゲーションの後プラスミドｐＭ４ＳＶＬを形成するもの；２ ）プラスミドｐＭ４ＳＶＬ由来の２８０ｂｐであるＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ 断片であり、自己ライゲーションの後プラスミドｐＭ６ＳＶＬを形成するものお よび３）プラスミドｐＭ６ＳＶＬ由来の３２２ｂｐであるＢａｍＨＩ−Ｈｉｎｄ ＩＩＩ断片であり、自己ライゲーションの後プラスミドｐＭ８ＳＶＬを形成する ものをクローニングするために、レシピエントとして使用した。 プラスミドｐＭ８ＳＶＬをＳｆａｎＩにより酵素消化することにより、そし て接着末端をクレノー酵素を用いた埋め込み反応によりブラント末端に転換する ことにより、プラスミドｐＭ８Ｌを構築した。ＢａｍＨＩ消化の後、得られた１ ６３ｂｐのＭ８ＤＮＡ断片には１６ｂｐのＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩ合成アダプター 配列をライゲーションし、その後ｐＧＬ２−ｂベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏ ｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製）をＳｍａＩおよびＫｐｎＩで消化して得られた５．６ ＫｂのＤＮＡ断片中にクローニングした。プラスミドｐＧＬ−２ｂは、ｐＧＬ− ２ｂ中にＳＶ４０プロモーター配列が存在しないこと以外は上述したｐＧＬ−２ ｐｖプラスミドと同一である。１６ｂｐのアダプター配列はマルチクローニング 部位を含み、以下の配列を含むように化学合成により調製した： 上記構築物から得られたプラスミドはｐＭ８Ｌであり、そしてそのプラスミ ドはルシフェラーゼ遺伝子の上流部にあるマルチクローニング部位に埋め込まれ た、プロモーターを伴わないＭ８ＤＮＡ配列であった。 ルシフェラーゼリポーター遺伝子プラスミドｐＭ８ＴＫＬは、プラスミドｐ ＧＥＭ−ＴＫ−ＣＡＴ（Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ.，ＥＭＢＯ Ｊ.，７(５)，ｐ ｐ．１４１１−１４１９，１９８８中に記載）をＸｂａＩおよびＢｇｌＩＩで切 断することにより調製した。ウィルス性ＨＳＶチミジンキナーゼ遺伝子のＴＫプ ロモーター配列を含む得られた１８１ｂｐの断片は、Ｍ８とルシフェラーゼＤＮ Ａ配列の間にあるｐＭ８Ｌベクターの５．８ＫｂのＮｈｅＩ−ＢｇｌＩＩ断片に ライゲーションした。 ヒトゲノムＤＮＡ由来のハプトグロビン遺伝子プロモーター領域から得た８ ４１ｂｐのＰＣＲ増幅物により、ルシフェラーゼリポーター遺伝子プラスミドｐ ＨＰＳＶＬを最初に構築した。増幅されたＰＣＲ断片の３’末端は、ヒトハプト グロビン遺伝子の転写開始部位の−３６の位置に対応していた(Ｍａｅｄａ ｅ ｔ ａｌ.，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ.，２６０(１１)，ｐｐ．６６９８−６７０ ９，Ｊｕｎｅ １０，１９８５に報告されている)。このＰＣＲ産物は、それぞ れＭｌｕＩおよびＢｇｌＩＩ制限酵素部位を含む上流側プライマーと下流側プラ イ マーにより調製した。ハプトグロビンのプロモーター領域をゲノム増幅すること で合成したＤＮＡプライマーには以下の配列が含まれる： このように得られたＰＣＲ産物は、上述したルシフェラーゼリポーター遺伝 子プラスミドｐＧＬ２−ｐｖのＳＶ４０初期プロモーターの上流にあるＭｌｕＩ およびＢｇｌＩＩ制限酵素部位に挿入した。得られたプラスミドはｐＨＰＳＶＬ であった。 阻害プラスミドｐＭ８を構築するために、上記プラスミドｐＭ８ＬをＳａｌ ＩおよびＢｇｌＩＩで消化し、その結果できた接着末端をクレノー反応によりブ ラント末端に修復した。ルシフェラーゼ遺伝子配列を含まない得られた３．１Ｋ ｂの断片は、アガロースゲル電気泳動により精製し、その後自己ライゲーション させることにより阻害プラスミドｐＭ８を生成した。 阻害プラスミドｐＭ８ＳＶは、図１に示したように調製した。ｐＭ８ＳＶＬ をＳａｌＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、できた接着末端をクレノー反応によ りブラント末端に転換した。得られた３．２ＫｂのＤＮＡ断片は、、アガロース ゲル電気泳動により精製し、その後自己ライゲーションさせた。このようにして Ｍ８配列（およそ１７０ｂｐ）およびＳＶ４０ウィルス由来初期プロモーター（ およそ１９０ｂｐ）を含むがルシフェラーゼ遺伝子を含まないプラスミドｐＭ８ ＳＶを生成した。 阻害プラスミドｐＳＶは、上述したプラスミドｐＧＬ２−ｐｖから得られた ルシフェラーゼ遺伝子を含むＳａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を切り出すことによ り構築した。得られた３．１Ｋｂの断片は、クレノー酵素による埋め込み反応を 行い、アガロースゲル電気泳動により精製し、その後自己ライゲーションさせ、 その結果ＳＶ４０プロモーターを含むがルシフェラーゼ遺伝子は含まないプラス ミドｐＳＶを得た。 担体プラスミドｐＣを上述したプラスミドｐＧＬ２−ｂをＳａｌＩおよびＨ ｉｎｄＩＩＩ制限酵素で切断することにより調製した。得られた２．９Ｋｂの断 片は、クレノー酵素による埋め込み反応を行い、アガロースゲル電気泳動により 精製し、その後自己ライゲーションさせ、その結果プラスミドｐＣを得た。 上述したすべてのプラスミド構築物は、標準的手法（Ａｕｓｕｂｅｌ Ｒ． ｅｔ ａｌ.，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａ ｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔ ｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に 従い、Ｅ．ｃｏｌｉの系統であるＸＬ１−Ｂｌｕｅをトランスフォームするため に使用した。プラスミドＤＮＡは、少量調製アルカリ融解法（Ａｕｓｕｂｅｌ、 上述による）によりトランスフォームしたクローンから抽出した。プラスミドＤ ＮＡは、制限酵素解析およびアガロースゲル電気泳動により調節した。予想した パターンを示したクローンを選択した。ホ乳類細胞をトランスフェクションする ときに使用する精製したプラスミド調製物を得るために、選別したトランスフォ ームＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅの３００ｍｌの培養液を調製した。その後 プラスミドは、ＱＩＡＧＥＮチップ５００イオン交換ミニカラムにより、製造者 による解説書に従って、精製した。 実施例２：細胞株および培養条件 ＨｅｐＧ２ヒトヘパトーマ細胞細胞（ＡＴＣＣより入手）は、１０％ＦＣＳ 、５ｍＭのＬ−グルタミン、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリ ン／ストレプトマイシン添加ＭＥＭ培地で培養した。Ｔ４７Ｄヒト乳癌細胞（Ａ ＴＣＣより入手）は、１０％ＦＣＳ、５ｍＭのＬ−グルタミン、２０ｍＭのＨＥ ＰＥＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン添加ＤＭＥＭ培地で 培養した。Ｍ１マウス骨髄性白血病細胞（ＡＴＣＣより入手）は、１０％ＦＣＳ 、５ｍＭのＬ−グルタミン、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリ ン／ストレプトマイシン添加ＲＰＭＩ培地で培養した。上記細胞株の培養は、適 切な濃度のＩＬ−６（Ｉｎｔｅｒｐｈａｒｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓより入 手したＣＨＯ細胞由来ヒトＩＬ−６）の存在下および非存在下において、以下に 詳述したように行った。 実施例３：一過性トランスフェクションとルシフェラーゼおよびβ−ガラク トシダーゼアッセイ ＨｅｐＧ２ヒトヘパトーマ細胞およびＴ４７Ｄヒト乳癌細胞の一過性トラン スフェクションは、標準的手法（Ａｕｓｕｂｅｌ Ｒ．ｅｔ ａｌ.，Ｃｕｒｒ ｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｇ ｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅ ｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に従い、ＨＥＰＥＳ緩衝液 中でのリン酸カルシウム−ＤＮＡ沈殿法を利用して行った。マウスＭ１骨髄性白 血病細胞の一過性トランスフェクションは、標準的手法（Ａｕｓｕｂｅｌ、上記 による）に従い、ＤＥＡＥ−デキストランを使用して行った。 ルシフェラーゼおよびβ−ガラクトシダーゼの活性を検出するために、細胞 を１０⁶細胞あたり１ｍｌの抽出緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−リン酸 ｐＨ７ ．８、２ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、１％Ｔｒｉｔ ｏｎ Ｘ−１００）で、室温で１５分間インキュベーションすることによりｉｎ ｓｉｔｕで抽出した。ルシフェラーゼ活性を測定するために、２０μｌの細胞 抽出液を、１００μｌのルシフェラーゼアッセイ緩衝液（２０ｍＭトリシン、１ ．０７ｍＭ （ＭｇＣＯ₃）₄Ｍｇ（ＯＨ）₂−５Ｈ₂Ｏ、２．６７ｍＭ ＭｇＳＯ₄ 、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、３３．３ｍＭ ＤＴＴ、０．２７ｍＭコエンザイム Ａ、０．４７ｍＭルシフェリン、０．５３ｍＭ ＡＴＰ）で、直接アッセイした 。β−ガラクトシダーゼ活性を測定するために、１０μｌの細胞抽出液を、１０ ０μｌのルミガル（Ｌｕｍｉｇａｌ）基質（Ｌｕｍｉｇｅｎ社製）と３７℃で１ 時間インキュベーションした。ルミガルおよびルシフェラーゼの読みとりは、Ｂ ｅｒｔｈｏｌｄ Ａｕｔｏｌｕｍａｔ ＬＢ９５３光測定器を用いて行い、カウ ント／秒（ｃｐｓ）で表される出力は、ルシフェラーゼに関しては３０秒間、β −ガラクトシダーゼに関しては１５秒間の測定値を積算して求めた。 リポータープラスミドｐＭ８ＳＶＬは、ＨｅｐＧ２細胞の一過性トランスフ ェクションの後、ルシフェラーゼ活性の発現が５０−１００倍に上昇するほどＩ Ｌ−６反応性を付与することが示された(Ｓｅｒｌｕｐｉ Ｃｒｅｓｃｅｎｚｉ ら、１９９４年６月１４−１７日にバルセロナで開催された、第１２回欧州免疫 学会（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ.Ｍｅｅｔｉｎｇ）でのポスター発表) 。 このプラスミドはＴ４７Ｄヒト乳癌細胞においておよびマウスＭ１骨髄性白 血病細胞においても試験された。Ｍ１細胞は１０⁶細胞あたり０．５μｇのＤＮ Ａで、ＤＥＡＥ−デキストランを使用してトランスフェクションし、Ｔ４７細胞 は１０⁵細胞あたり２．５μｇのＤＮＡで、リン酸カルシウムを使用してトラン スフェクションした。 これら２種の細胞株間では、ヒトＩＬ−６に対する共通の反応以外では非常 に限定された特徴しか共通していない。結果（図３）は、ｐＭ８ＳＶＬプラスミ ド中のＭ８ＤＮＡ分子がＩＬ−６での処置後にどちらの細胞株においても顕著に 活性化していることが示された。図３に示したように、ＩＬ−６に対する顕著な 応答は、ｐＭ８ＳＶＬ中に存在しているＳＶ４０プロモーターとは異なるチミジ ンキナーゼプロモーターとＭ８分子が隣接しているリポーター遺伝子プラスミド ｐＭ８ＴＫＬでトランスフェクションしたＭ１細胞中でも、ＩＬ−６に対する顕 著な応答が観察された。 ＩＬ−６（１ｎｇ／ｍｌ）で処理した後、トランスフェクションしたＨｅｐ Ｇ２細胞の経時的ルシフェラーゼ誘導性を試験した。プラスミドｐＭ８ＳＶＬを 陽性リポーター遺伝子プラスミド（１０⁵細胞あたり０．２μｇ）として使用し た。細胞は一晩トランスフェクションし、それらを分割し、そしてその後ＩＬ− ６処理で感作した。結果は図４に示し、それによりＩＬ−６に対するほとんど完 全な応答性を、わずか２時間のＩＬ−６の処理の後に得ることができた。 実施例４：阻害プラスミドｐＭ８の試験 Ｍ８ＤＮＡ分子によるＩＬ−６活性の阻害は、ＨｅｐＧ２細胞中にｉ）ＩＬ −６応答性のｐＭ８ＳＶＬリポーター遺伝子プラスミドおよびｉｉ）ｐＭ８阻害 プラスミド中に挿入されたＭ８分子をコトランスフェクションした後に測定した 。この後者のプラスミドにはＭ８配列が存在するが、それによりＩＬ−６に対す る応答性を付与することはできなかった。ＨｅｐＧ２細胞は、ＩＬ−６応答性リ ポーター遺伝子プラスミドｐＭ８ＳＶＬ（Ｍ８およびルシフェラーゼ遺伝子を含 む） を１０⁵細胞あたり最大で２．５μｇで、そして１０または５０倍過剰量のｐＭ ８を、様々な濃度のＩＬ−６の存在下でトランスフェクションした。一回トラン スフェクションあたりの総ＤＮＡ量は、ｐＭ８プラスミド中には存在する１６５ ｂｐの長さのＭ８ＤＮＡ断片が存在しない以外はｐＭ８と同一である担体プラス ミドｐＣを使用することで一定に保った。 図５に報告したように、阻害プラスミドは４回の実験で、５０倍過剰量のｐ Ｍ８阻害プラスミドでさえも、ＩＬ−６活性に対する顕著で再現性のある特異的 な阻害効果を示さなかった。これらの実験で、ＩＬ−６応答性リポーター遺伝子 プラスミドｐＭ８ＳＶＬをの１０⁵細胞あたり０．１μｇの濃度で使用したが、 トランスフェクションに使用した一定にした総ＤＮＡ量は１０⁵細胞あたり５μ ｇであった。これらの実験に使用した近最適量（ｓｕｂｏｐｔｉｍａｌ ｄｏｓ ｅ）は、１ｎｇ／ｍｌであった。図５に示したように、これらの実験条件におい ては可変性が許容され、その可変性は別個のトランスフェクション自体が可変性 の不可避な要素であるという事実から引き起こされる。 実施例５：阻害プラスミドｐＭ８ＳＶの試験 阻害プラスミドｐＭ８の活性型Ｍ８阻害ＤＮＡ配列がｐＭ８ＳＶＬリポータ ー遺伝子プラスミドの活性型配列と同一であるため、図５に報告された結果はや や驚くべきものであった。コトランスフェクションの後、これら別々のプラスミ ド中に存在する二つの同一なＭ８配列の競争があることが予想され、その結果リ ポーター遺伝子アッセイにおいてＩＬ−６の活性を阻害すると予想できた。 さらに上述した結果は、データが制限した量のＩＬ−６の存在下で得られた ものであるため、Ｍ８阻害ＤＮＡ配列により十分に中和されていない活性化した ＩＬ−６特異的転写因子（群）が過剰に存在することによっては説明することは できない。さらに既知の転写因子群（２６−３０）のＤＮＡ結合部位での同様な 実験について報告されたデータが図５で報告した結果と一致していない。 図５で示した結果に対する別の説明としては、リポーター遺伝子プラスミド 中に存在するＭ８以外の配列がＩＬ−６特異的シグナル伝達に寄与しうるという ものがあり得る。これらの配列はｐＭ８阻害プラスミドからは取り除くべきであ るが、陽性リポーター遺伝子プラスミドｐＭ８ＳＶＬ中では（たとえば一般的転 写因子と結合しうるＳＶ４０初期遺伝子プロモーターの配列）存在するべきであ る。阻害プラスミドｐＭ８はこのように、リポーター遺伝子プラスミドｐＭ８Ｓ ＶＬと競争するときには効力がないようである。 この仮説を検証するために、ＩＬ−６阻害ＤＮＡ配列としてＭ８配列および ＳＶ４０プロモーター配列の両方を含む阻害プラスミド（ｐＭ８ＳＶ）を構築し た(図１参照)。この阻害プラスミドは、ＨｅｐＧ２細胞によるＩＬ−６リポータ ー遺伝子アッセイにおいて検証した。４回の別個の実験を行い、それぞれに実験 で２つの同一のトランスフェクションを行った。トランスフェクションは図６に 示したように、０．１μｇのリポータープラスミドＤＮＡおよび過剰量の阻害プ ラスミドとで行った。トランスフェクションした総ＤＮＡ量は、担体プラスミド により一定に保った。トランスフェクションした細胞は１ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６ で１８時間処理した。 図６に示した結果は、ｐＭ８ＳＶ阻害プラスミドによる明らかなＩＬ−６の 濃度依存的阻害を示した。図６の生データは、表１に示した。それぞれの実験に おいて、阻害プラスミドの濃度あたり３回のトランスフェクションを反復して行 った。それぞれの実験に対して、一つの列に示された誘導された値および誘導さ れたものではない値は、同一のトランスフェクションから得られた値である。光 放射の報告された値は、３０秒間にわたって積算されたｃｐｓである。このよう な表１において示し得るように、いくらかの可変性がこれらの実験において観察 され、特に阻害プラスミドの濃度が低い場合に観察されたが、トランスフェクシ ョンを反復して行った場合のＣＶは通常、おそらく２０％以下である。 ｐＭ８ＳＶ阻害プラスミドにより提供されるＩＬ−６活性の阻害が、もっぱ らＳＶ４０プロモーターのＤＮＡ配列によるものなのかそしてＭ８とＳＶ４０配 列の組み合わせによるものではないのかということを除外するために、別の阻害 プラスミドを構築しリポーター遺伝子アッセイで試験した。このプラスミドはＩ Ｌ−６活性の阻害のためにはＳＶ４０ＤＮＡ配列のみを含み、Ｍ８阻害配列だけ でなくルシフェラーゼ遺伝子も持たないものである。 トランスフェクションは、０．１μｇのリポータープラスミドＤＮＡおよび 過剰量の阻害プラスミドを図７に示したように行った。トランスフェクションし たＤＮＡの総量は担体プラスミドにより一定に保った。トランスフェクションし た細胞は１ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６で１８時間処理した。図７に報告した結果は、 この阻害プラスミド（ｐＳＶ）が阻害効果として４０％以上になるということは 決してなく、そして濃度依存的でない、部分的なＩＬ−６活性の阻害効果しか示 さないことを示す。これにより、ＳＶ４０ＤＮＡ配列単独ではＩＬ−６の活性を 効果的に阻害するには不十分であることが結論づけられる。これとは対照的に、 ルシフェラーゼ含有リポータープラスミドｐＧＬ２−ｐｖはＳＶ４０プロモータ ー配列は含むもののＭ８配列を含まないが、結果として基礎レベルのルシフェラ ーゼの発現はＩＬ−６によりさらに誘導的になるということはなかった。このプ ラスミドにおいては、基礎的レベルのルシフェラーゼの発現はｐＭ８ＳＶ阻害プ ラスミドによっては阻害されず、その結果ｐＧＬ２−ｐｖのＳＶ４０プロモータ ー領域にのみ特異的に結合する転写因子はｐＭ８ＳＶ阻害プラスミドにより効率 よく取り除かれないことを示している。実際、後者の阻害プラスミドの存在下に おけるリポータープラスミドｐＧＬ２−ｐｖから得られるルシフェラーゼ活性は 、阻害プラスミドの非存在下においてよりもずっと高かった(結果は示していな い)。 実施例６：リポーター遺伝子プラスミドｐＨＰＳＶＬにより付与された、Ｉ Ｌ−６活性のｐＭ８ＳＶによる阻害 我々は、ＩＬ−６に対する別のリポーター遺伝子アッセイにおいて、リポー ター遺伝子プラスミド中にあるＩＬ−６シグナルを媒介する標的ＤＮＡ配列は、 Ｍ８阻害配列とは完全には適合しない阻害プラスミドｐＭ８ＳＶを試験しようと した。ＨｅｐＧ２細胞はその結果、８４１ｂｐのヒトハプトグロビン遺伝子由来 のプロモーター配列がＳＶ４０プロモーターとルシフェラーゼ遺伝子と隣接した ものを含むプラスミドｐＨＰＳＶＬでトランスフェクションした。ハプトグロビ ンプロモーター配列由来の一つのＡＰＲＥ部位（Ｍａｅｄａ ｅｔ ａｌ.，Ｊ ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ.，２６０(１１)，ｐｐ．６６９８−６７０９，Ｊｕｎｅ １０，１９８５による）が、このプラスミド中に存在する。我々は以前に、こ のプラスミドが実際にＩＬ−６に応答しルシフェラーゼの発現が６−８倍に増加 す ることを示した（Ｓｅｒｌｕｐｉ Ｃｒｅｓｃｅｎｚｉら、１９９４年６月１４ −１７日にバルセロナで開催された、第１２回欧州免疫学会(Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｅｔｉｎｇ）でのポスター発表)。 ３回繰り返したトランスフェクションの一つの実験の結果を図８に示した。 リポーター遺伝子プラスミドｐＨＰＳＶＬと５０倍過剰量の担体プラスミドをコ トランスフェクションした後、ＩＬ−６による誘導性は、結果として基礎レベル に対しておよそ４倍のルシフェラーゼの高発現となった。これとは対照的に、リ ポーター遺伝子プラスミドｐＨＰＳＶＬと５０倍過剰量の阻害プラスミドｐＭ８ ＳＶをコトランスフェクションした場合には、ＩＬ−６による誘導性は完全に消 失した。ｐＭ８ＳＶ阻害プラスミドはこのように、ｐＭ８ＳＶＬ以外のＩＬ−６ 応答性リポーター遺伝子プラスミド（たとえばリポータープラスミドｐＨＰＳＶ Ｌ）を試験したときにも、ＩＬ−６活性を阻害することができた。 実施例７：Ｔ４７Ｄ細胞中での阻害プラスミドｐＭ８ＳＶの試験 ｐＭ８ＳＶ阻害プラスミドは、ＩＬ−６シグナル伝達系がヘパトーマ細胞と 異なる可能性があるＴ４７Ｄヒト乳癌細胞を使用して、ｐＭ８ＳＶＬリポーター 遺伝子アッセイにおいても試験した。以前に述べたように、ｐＭ８ＳＶＬリポー ター遺伝子プラスミドを用いたＩＬ−６リポーター遺伝子アッセイは、最適化は されていないが、この細胞株で行っている。アッセイの感度はＴ４７Ｄ細胞を用 いた場合にはやや低いので、トランスフェクションは１０⁵細胞あたりに、比較 的高レベルのプラスミドＤＮＡである、１μｇの陽性リポーター遺伝子プラスミ ドを使用して行った。その結果本実験においては、過剰量の担体プラスミドまた は過剰量の阻害プラスミドの存在下では非特異的阻害がみられ、結果としてＩＬ −６特異的阻害には高い可変性が認められた。 結果は表２に示す。２回の実験から得られた、３回繰り返したトランスフェ クションについての平均（ＡＶＧ）および標準偏差（ＳＤ）を示す。 誘導倍率の平均値はそれぞれのトランスフェクションの生の値から計算する 。１０⁵のトランスフェクションした細胞あたり、１および５μｇのリポーター 遺伝子プラスミドを、実験１および２のそれぞれで使用した。 これらの実験において担体プラスミドおよび阻害プラスミドは別々にトラン スフェクションを行い、プラスミドはどちらもリポータープラスミドに対して示 された過剰量で使用した。 トランスフェクションの後、細胞を１ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６で１８時間誘導 した。光放射の報告された値は、３０秒間にわたって積算したｃｐｓである。こ れらの実験におけるＩＬ−６特異的阻害は、過剰量の阻害プラスミドの存在下に おいて得られる誘導と対応する濃度の担体プラスミドの存在下において得られる 誘導とを比較することにより評価した。 さらに、非特異的阻害のため、ルシフェラーゼの発現の基礎レベルはアッセ イの定量限界に近かった。表２に報告した結果は(実験１を参照)、３回のトラン スフェクションの後のＩＬ−６の活性と関連するそして特異的な阻害は２０倍過 剰量の阻害プラスミドｐＭ８ＳＶをトランスフェクションした時には得られたが 、１０倍過剰量の時には得られなかった。非特異的阻害が非常に高くなったため 、５０倍過剰量の阻害プラスミドをこの実験で試験することはできなかった。 これらの結果は、１０⁵細胞あたり０．５μｇのＤＮＡを使用したときには( 表２、実験２参照)、別の実験においても再現することができなかった。再現性 がなかったことの理由としては、Ｔ４７Ｄリポーター遺伝子アッセイが比較的高 い可変性を有すること、および感度が低いことを挙げることができる。別の言葉 で言えば、独特の標的細胞の選択性によりこれらの結果を説明しうる。 実施例８：最小ＤＮＡ阻害配列の決定 ＩＬ−６による誘導性に対して関与する転写因子の結合を阻害する能力を保 持している最小ＤＮＡ配列を特定するために、電気泳動移動性シフトアッセイ（ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ Ｍｏｂｉｌｉｔｙ Ｓｈｉｆｔ Ａｓｓａｙ 、ＥＭＳＡ）を用いた実験のアプローチを使用することができる(Ａｕｓｕｂｅ ｌによる)。この最小配列により与えられた機能的阻害のための試験は、実施例 ３および以下の実施例において述べるリポーター遺伝子アッセイを使用すること により、行うことができる。リポーター遺伝子アッセイにおいてＩＬ−６活性を 機能的に阻害することを我々が示した最小ＤＮＡ配列は、阻害プラスミドｐＭ８ ＳＶ 由来の３５０ｂｐのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片であり、これにはＡＰＲＥ ＤＮＡ配列の８回繰り返し配列およびＳＶ４０初期プロモーター配列が含まれ る。この後者の配列は、ＡＰ−１様部位（Ｚｅｎｋｅ ｅｔ ａｌ.，ＥＭＢＯ Ｊ.，５(２)，ｐｐ．３８７−３９７，１９８６に記載されている）およびＳ ｐ−１部位の６回繰り返し配列（Ｄｙｎａｎ ｅｔ ａｌ.，Ｃｅｌｌ，３５， ｐｐ．７９−８７，１９８３に記載されている）などの一般的転写因子に対する 結合部位を含むことが知られている。ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩのＤＮＡ断片 は、たとえば２つのＡＰＲＥ配列およびＳＶ４０初期プロモーター由来の特異的 転写因子に対する一つだけあるいはいくつかの結合部位を含むため、ＰＣＲまた は核酸分解酵素処理（Ａｕｓｕｂｅｌによる）などの従来からの方法により、そ の５’末端および／または３’末端を切断することができる。結果として得られ たＤＮＡ配列は、ＨｅｐＧ２細胞におけるｐＳＶＭ８Ｌを基礎としたリポーター 遺伝子アッセイの阻害試験のために使用することができる。 さらにＩＬ−６シグナルを機能的に阻害する完全な能力を有する最小ＤＮＡ 断片は、このＤＮＡを末端標識法あるいはクレノー反応などの従来の方法で³²Ｐ ヌクレオチドで標識することにより、ＥＭＳＡおいて使用することができる。結 果として得られた標識ＤＮＡ断片は、ＩＬ−６処理の後ＨｅｐＧ２細胞から得ら れた核抽出物とインキュベートすることができる。 競争ＤＮＡ配列が増加することにより、ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ阻害Ｄ ＮＡ断片を上述した様に欠損させることにより得られた非標識ＤＮＡ断片のいず れかなどと共にインキュベートすることができる。インキュベーションの後、混 合物は非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけることができる。試験した 標識ＤＮＡ断片に対する関連する転写因子の結合は、結合していない標識ＤＮＡ について予想されるゲル移動度のシフト（遅延）により示しうる。競争物である 非標識ＤＮＡ配列の存在下におけるこの結合の阻害は、ゲル中のシフトしたバン ドが特異的に消失することにより示しうる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ＩＬ−６活性を阻害することができるヌクレオチド配列であって、 ｉ）一般式ＺＸＭＹＫＧＫＡＡ（式中ＺはＴまたはＧまたは欠損していても よく、ＸはＴまたは欠損していてもよく、ＭはＣまたはＡであり、ＹはＣまたは Ｔであり、ＫはＴまたはＧである）で表されるＡＰＲＥ要素であるヌクレオチド 配列を少なくとも一つ、 ｉｉ）ＡＰＲＥ要素以外の転写因子結合部位を構成するヌクレオチド配列を 少なくとも一つ、 これらを組み合わせて含むヌクレオチド配列。 ２．(ｉ)がヌクレオチド配列ＴＴＣＴＧＧＧＡＡである、請求項１記載のヌ クレオチド配列。 ３．(ｉｉ)がＴＡＴＡボックスおよび以下の転写因子、すなわちＡＰ−１、 ＡＰ−２、ＨＮＦ−１、ＳＰ−１、ＮＦ−κＢ、Ｏｃｔ−１、Ｅ−２そしてＳＲ Ｆに対する結合部位を構成する群から選択される、請求項１および請求項２のい ずれか一項に記載のヌクレオチド配列。 ４．ＡＰＲＥ要素（ｉ）が少なくとも２回繰り返される、請求項１から請求 項３までのいずれか一項に記載のヌクレオチド配列。 ５．ＡＰＲＥ要素が３から１０回繰り返される、請求項４に記載のヌクレオ チド配列。 ６．ＡＰＲＥ要素が８回繰り返される、請求項４または請求項５に記載のヌ クレオチド配列。 ７．配列（ｉ）が少なくとも２種類の異なるＡＰＲＥ要素を含む、請求項１ から請求項６のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列。 ８．配列（ｉｉ）が転写因子結合部位を構成する少なくとも２種類の異なる オリゴヌクレオチド配列を含む、請求項１から請求項７のいずれか一項に記載の ヌクレオチド配列。 ９．配列（ｉｉ）がＳＶ４０初期プロモーターである、請求項８記載のヌク レオチド配列。 １０．配列番号１に報告した、請求項１に記載のヌクレオチド配列。 １１．請求項１から請求項１０のいずれか一項に記載されたヌクレオチド配 列を含むプラスミドベクター。 １２．請求項１から請求項１０までのいずれか一項に記載されるヌクレオチ ド配列の、ＩＬ−６の活性を阻害するための治療における使用。 １３．請求項１から請求項１０までのいずれか一項に記載されるヌクレオチ ド配列と１またはそれ以上の薬学的に許容される担体および／または賦形剤とを 組み合わせて含む、薬剤組成物。 １４．請求項１１に記載のプラスミドと１またはそれ以上の薬学的に許容さ れる担体および／または賦形剤とを組み合わせて含む、薬剤組成物。