UA63888C2 - Nucleotide sequence, able to inhibit activity of il-6, use thereof for therapy, plasmide vector and pharmaceutical composition (alternatives) containing this nucleotide sequence - Google Patents
Nucleotide sequence, able to inhibit activity of il-6, use thereof for therapy, plasmide vector and pharmaceutical composition (alternatives) containing this nucleotide sequence Download PDFInfo
- Publication number
- UA63888C2 UA63888C2 UA97126018A UA97126018A UA63888C2 UA 63888 C2 UA63888 C2 UA 63888C2 UA 97126018 A UA97126018 A UA 97126018A UA 97126018 A UA97126018 A UA 97126018A UA 63888 C2 UA63888 C2 UA 63888C2
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- nucleotide sequence
- plasmid
- sequence
- inhibitory
- cells
- Prior art date
Links
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 title claims abstract description 40
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 title claims abstract description 39
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims abstract description 27
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims abstract description 6
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 title claims abstract description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 title description 4
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 claims abstract description 15
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 14
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 63
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 29
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 8
- 230000009471 action Effects 0.000 claims description 4
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 claims description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 3
- 206010048998 Acute phase reaction Diseases 0.000 claims description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims 2
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 abstract 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 abstract 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 143
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 61
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 41
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 38
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 32
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 25
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 21
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 21
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 19
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 19
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 19
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 14
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 10
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 7
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 6
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 6
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 6
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 5
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 5
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 4
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 241000233803 Nypa Species 0.000 description 4
- 235000005305 Nypa fruticans Nutrition 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108050005077 Haptoglobin Proteins 0.000 description 3
- 101001078385 Homo sapiens Haptoglobin Proteins 0.000 description 3
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 3
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 238000006713 insertion reaction Methods 0.000 description 3
- 208000025113 myeloid leukemia Diseases 0.000 description 3
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 3
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 2
- 102000006580 General Transcription Factors Human genes 0.000 description 2
- 108010008945 General Transcription Factors Proteins 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000014702 Haptoglobin Human genes 0.000 description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 2
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 238000003571 reporter gene assay Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- HRGUSFBJBOKSML-UHFFFAOYSA-N 3',5'-di-O-methyltricetin Chemical compound COC1=C(O)C(OC)=CC(C=2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C=2)=C1 HRGUSFBJBOKSML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 108010074051 C-Reactive Protein Proteins 0.000 description 1
- 102100032752 C-reactive protein Human genes 0.000 description 1
- 208000005024 Castleman disease Diseases 0.000 description 1
- RGJOEKWQDUBAIZ-IBOSZNHHSA-N CoASH Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 RGJOEKWQDUBAIZ-IBOSZNHHSA-N 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N Dehydro-luciferin Natural products OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 101100369915 Drosophila melanogaster stas gene Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 1
- BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N Fivefly Luciferin Natural products OC(=O)C1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010018364 Glomerulonephritis Diseases 0.000 description 1
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 1
- 101000942118 Homo sapiens C-reactive protein Proteins 0.000 description 1
- 208000037147 Hypercalcaemia Diseases 0.000 description 1
- DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N Luciferin Natural products CCc1c(C)c(CC2NC(=O)C(=C2C=C)C)[nH]c1Cc3[nH]c4C(=C5/NC(CC(=O)O)C(C)C5CC(=O)O)CC(=O)c4c3C DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000034578 Multiple myelomas Diseases 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 235000006538 Opuntia tuna Nutrition 0.000 description 1
- 244000237189 Opuntia tuna Species 0.000 description 1
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- IDDMFNIRSJVBHE-UHFFFAOYSA-N Piscigenin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C=2C(C3=C(O)C=C(O)C=C3OC=2)=O)=C1 IDDMFNIRSJVBHE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 1
- 108091027981 Response element Proteins 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000004658 acute-phase response Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- RGJOEKWQDUBAIZ-UHFFFAOYSA-N coenzime A Natural products OC1C(OP(O)(O)=O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)OC1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 RGJOEKWQDUBAIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005516 coenzyme A Substances 0.000 description 1
- 229940093530 coenzyme a Drugs 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- KDTSHFARGAKYJN-UHFFFAOYSA-N dephosphocoenzyme A Natural products OC1C(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)OC1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 KDTSHFARGAKYJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N dihydrochrysin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C2)=C1 KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 1
- 230000001723 fibrinogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009454 functional inhibition Effects 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000002489 hematologic effect Effects 0.000 description 1
- 210000005096 hematological system Anatomy 0.000 description 1
- 230000011132 hemopoiesis Effects 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 102000050796 human HP Human genes 0.000 description 1
- 230000000148 hypercalcaemia Effects 0.000 description 1
- 208000030915 hypercalcemia disease Diseases 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000004324 lymphatic system Anatomy 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 238000013492 plasmid preparation Methods 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- BMCJATLPEJCACU-UHFFFAOYSA-N tricin Natural products COc1cc(OC)c(O)c(c1)C2=CC(=O)c3c(O)cc(O)cc3O2 BMCJATLPEJCACU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JLEXUIVKURIPFI-UHFFFAOYSA-N tris phosphate Chemical compound OP(O)(O)=O.OCC(N)(CO)CO JLEXUIVKURIPFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002268 wool Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
- C07K14/4705—Regulators; Modulating activity stimulating, promoting or activating activity
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Toxicology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
Опис винаходу
Даний винахід відноситься до нуклеотидної послідовності, яка здатна інгібувати активність 1-6, її 2 застосуванню в терапії, а також до фармацевтичних композицій, які її містять.
І/-6 є білком, що належать до групи цитокінів, які призначені виконувати основну роль в імунній реакції організму і стимуляції гематопоезу.
Дійсно, виявлено багато біологічних функцій І/-6б у гематологічній і лімфатичній системах, у печінці та інших мішених органах і тканинах. Деякі з цих функцій є сприятливими, у той час як інші відносять до 70 патологічних станів. До числа останніх відносять, як виявлено, те, що І/-б є фактором росту для клітин множинної мієломи; показано, що антитіла проти ІЇ/-6 тимчасово блокують проліферацію мієломних клітин у пацієнта з лейкемією (див., наприклад, Кіеїп еї аїІ.. Віооб, 78, (5), рр. 1198-1204, 1991, ї ги еї аї., 5Биг.
У. Іттипо)., 22, рр. 2819-24, 1992).
Знайдено взаємозв'язок оцінених рівнів І/-б з аутоїмунними і запальними захворюваннями, такими як 12 ревматоїдний артрит, гломерулонефрит, псоріаз і хвороба Кастлемена (див., наприклад, Сгаєме еї аї., Сіїп.
Іпмевіїд., 71, рр. 6664-71, 1993). Також показано, що 1/-6б відіграє значну роль в остеопорозі і гіперкальціємії (див., наприклад, Роїї еї а). Етбро .-., 13, (5), рр. 1189-96, і Мопеда еї аЇ.. Сапсег Кезв., 53, рр. 737-40, Герб. 1993).
Тому розробка інгібіторів активності ІЇ/-6 була предметом активних досліджень. Для цих цілей були обрані різноманітні підходи, в тому числі, застосування антитіл проти 1-6 др130 або одр80 (як повідомляють Кіевїп еї а!І., див. вище); застосування розчинного др130; або застосування мутеїнів для ІІ -6, або рецептору 1! -6.
Так як такі підходи можуть асоціюватися зі специфічними небажаними ефектами при клінічному застосуванні (як повідомляють І и еї аі., див. вище), може бути корисним висунення інших стратегій інгібування активності ІІ -6.
Тому Заявник здійснив дослідження при іншому підході до інгібування активності І/-6б, як-то, шляхом с блокування внутрішньоклітинних білків, що опосередкують сигнал ЇЇ -6. Ге)
Трансдукція сигналу 1-6 у відповідаючих клітинах старанно досліджена. Бом/ІКез еї ам. (РМАБ О5А, 81, рр. 2313-6, 1984) першими припустили, що існують відповідаючі елементи ДНК, специфічні для ІЇ-6, що фланкують фібріногенні гени пацюка.
Пізніше Кипл еї аЇ. (Мис Ас Кев., 17, (3), 1121-37, 1989) показали відповідаючий елемент із коровою со послідовністю, яка ідентична послідовності генів фібриногену пацюка (СТОСООА), що відповідає на ІІ -6 у гені с пацюкового-2-макроглобуліну.
Відповідаючі елементи ДНК із послідовностями, спорідненими вищезгаданим послідовностям, також со визначені в генах, що кодують людський С-реактивний білок (СКР) (див. Топіаці еї аїЇ., Мої. Віої. Меа., 7, со рр. 199-212, 1990), людський гаптоглобін (див. Оіїміего еї аіІ. Етбро .). 6, (7), рр. 1905-12, 1987), і в інших 325 генах, що кодують додаткові білки гострої фази, індуковані І/-6 (див. Неїпгісп еї а!., Віоспет. у., 265, рр. ке, 621-36, 1990), що призводить до визначенню корової консенсусної послідовності СТОССАМУ або СТООКАА, де
МУ представляє А або Т, і К представляє А або 0.
Носке еї аї. (Мої. Сей. ВіоїЇ., 12, (5), рр. 2282-94, 1992) показали, що багато які споріднені корові « послідовності, подібні коровій послідовності, що згадана вище, можуть бути присутніми в регуляторних областях З генів дикого типу, що відповідають ІІ/-6б, і що ця множинність веде до ампліфікації відповіді, що аналізується с функціонально за допомогою аналізу репортерного гену.
Із» МУепепка еї аїЇ. (Мої. СеїІ. ВіоІ., 13, (1), рр. 276-88, 1993) нещодавно запропонували розширену версію корової консенсусної послідовності як елементу реакції гострої фази (АРКЕ), активного в клітинах гепатоми, яку можна уявити формулою КТМУКОКАА, де М представляє С або А, К представляє Т або б, У представляє С абот.
Ме Показано (Уцап еї аЇ., Мої. Сей. Віої., 14, (3), рр. 1657-68, 1994), що такі АРКЕ-подібні послідовності оз зв'язують білковий фактор транскрипції з молекулярною масою порядку 90 кД, названий АРКЕ, що нещодавно клонований (див. АКіга еї аї.. СеїЇ, 77, рр. 63-71, 1994). На практиці, зв'язування активованого АРКЕ з бо АРКЕ-послідовностями призводило б до активації ІІ -б-індуцибельних генів (що мають такі АРКЕ-послідовності) У о 20 відповідаючих на ІІ -6 клітинах.
Внаслідок цього, АРКЕ-елемент можна використовувати в якості енхансера гена-мішені у відповідаючих на со І/-6 клітинах у такий спосіб: у відповідаючих на І/-6 клітинах обробка 1-6 індукує синтез АРКРЕ-білків, що зв'язуються з АРКЕ-елементом, і таке зв'язування активує експресію гену-мішені.
Зепирі Сгевзсеп?і еї аїЇ. (повідомлення на 12-ій Європейській конференції по імунології, Барселона, 14-17 29 червня 1994) показали, що 8-кратний повтор ДНК-послідовності АРКЕ (М8) відповідає за 50-100-кратну індукцію
ГФ) за допомогою 1/-6 репортерного гену в клітинах гепатоми людини Нероб2. У випадку таких окремих транскрипційних факторів дійсно виявлені двуланцюгові олігонуклеотиди. о Основним предметом даного винаходу є нуклеотидна послідовність, здатна інгібувати активність ІЇ-6, що включає: 60 1) принаймні одну нуклеотидну послідовність, що є АРКЕ-елементом загальної формули 7-ХМУКОКАА, де 7 представляє Т або С, або може також бути відсутнім, Х представляє Т або також може бути відсутнім, М представляє С або А, У С або Т, і К представляє Т або о, в поєднанні з
І) принаймні однією нуклеотидною послідовністю, що складає сайт зв'язування транскрипційного фактору бо Інший, ніж АРЕЕ-елемент, такий, як сайти, що присутні у промоторних областях.
Прикладами нуклеотидних послідовностей останнього типу є блок ТАТА і сайти зв'язування факторів транскрипції, таких як АР-1 (див. Кіаромж/о! еї аі,, РМАБ О5А, 89, рр. 157-61, 1992), АР-2, НМЕ-Ї (див. Сіивеї его анІ Мис. Ас. Кев., 21 (15), рр. 3405-11), 5Р-ЇІ (див. МУ еї аЇ.. Сепе, 89, рр. 203-9, 1990), МЕ-КВ (див.
ВівїїпзКа еї а!.. Зсіепсе, 250, рр. 997-1000, 1990), Осі, Е-2 і факторів транскрипції КЕ.
У кращому варіанті здійснення даного винаходу як АРКЕ-елемент (1), так і/або нуклеотидна послідовність (І) приведеної вище загальної формули повторюються принаймні 2 рази, краще - від З до 10 разів, ще краще - 8 разів.
У іншому кращому варіанті здійснення цього винаходу елемент (1) містить принаймні два різних 7/0 АРКЕ-елементи, мМабо нуклеотидна послідовність (ІЇ) містить принаймні дві різні олігонуклеотидні послідовності, що складають сайт зв'язування фактору транскрипції інший, ніж АРКЕ-елемент.
Нуклеотидна послідовність (Ії) є, переважно, раннім промотором ЗМ40.
АРКЕ-елемент (1) містить, наприклад, нуклеотидну послідовність ТТІСТОСОАА.
На фіг. 2 подана нуклеотидна послідовність, яка входить в об'єм винаходу, відповідно до кращих варіантів його здійснення. Така послідовність також позначається як послід. Мо 1, і становить предмет даного винаходу.
Іншим предметом даного винаходу є плазмідний вектор, що містить нуклеотидну послідовність даного винаходу.
Додатковим аспектом даного винаходу є застосування нуклеотидної послідовності даного винаходу в якості терапевтичного засобу для інгібування дії ІІ -6 в умовах, коли ІІ -6 відіграє патологічну роль.
Даний винахід також відноситься до фармацевтичних композицій, що містять нуклеотидну послідовність або плазмідний вектор згідно з даним винаходом. Такі композиції можуть бути складені для перорального, ректального, внутрішньовенного або місцевого застосування. Суміші даного винаходу можуть включати використання будь-якого поєднання переносу вірусоопосередкованого гену, ліпосомні композиції, опосередкованої рецептором доставки ДНК і/або гантельних структур активної нуклеотидної |інгібуючої сч г послідовності згідно з даним винаходом.
Інгібуючу дію нуклеотидної послідовності даного винаходу визначають за допомогою аналізу репортерного і) гену.
Аналіз репортерного гену даного винаходу заснований на здатності АРКЕ-елементу функціонувати в якості енхансера будь-якого гену у відповідаючих на І/-б клітинах (як повідомлялося вище). У цьому випадку со АРКЕ-елемент використовують як енхансер репортерного гену-мішені (яким є, наприклад, ген люциферази) у відповідаючих на 1/-6б клітинах (якими є, наприклад, гепатоцити, такі як Нерс2). Потім клітини обробляють со
І/-6: якщо достатня кількість продукованих АРКЕ-білків захоплюється надлишком нуклеотидної послідовності со даного винаходу, ген-мішень не буде активуватися.
Відповідно до цього аналізу, будують інгибуючі плазміди, що містять нуклеотидну послідовність даного і) зв ВИНаходу. Приклад такої плазміди подається на фіг. 1 разом із стратегією її побудови. «о
Також мається на увазі, що ця й інші плазміди, що містять нуклеотидну послідовність даного винаходу, становлять інший варіант здійснення даного винаходу .
Надалі даний винахід буде описуватися за допомогою прикладів, які не варто розглядати як такі, що обмежують даний винахід у будь-якій мірі. В прикладах будуть подаватися посилання на креслення, описані тут « далі. з с Фіг. 1. Побудова плазміди рМ85М. РМ8ЗМІ. переварюють з заї 1 Ніпа І, і липкі кінці трансформують у тупі кінці за допомогою реакції Кленова. Фрагмент ДНК, що утворюється в результаті, в 3,2 т.п.н, очищають за ;» допомогою електрофорезу в агарозному гелі, і потім його аутолігують. Потім генерують плазміду РМ8ЗМ, що містить послідовність М8 (170 п.н.) і послідовність від раннього промотору вірусу 5М40 (190 п.н.), але таку, що не має гену люциферази.
Ге» Фіг. 2. Послідовність фрагменту ВатнН І-Ніпа ІІ інгібуючої ДНК плазміди рМ85М. Неперервна лінія над верхньою частиною приведеної нуклеотидної послідовності представляє послідовність М8. Чітка неперервна і лінія над нижньою частиною нуклеотидної послідовності представляє промоторну послідовність 5М40. Також
Го! вказані сайти рестрикції Ватн 1 і Ніпа ПІ.
Фіг. З. Аналіз репортерного гену в клітинах Т47О0 і М1. Дослідження різних плазмід, що містять М8. со Приведені величини світлового випромінювання є середніми значеннями дворазового визначення чос (срв) за с період 30 секунд (АОС - площа під кривою, ППК) з трансфектованих клітин. Кожний прямокутник є середнє трьох трансфекцій «5 ст. відх.
Фіг. 4. Залежність від часу люциферазної індуцибільності трансфектованих клітин Нер 02 після обробки дв 11-68. Плазміду РМ8ЗМІ. використовують у якості позитивної плазміди репортерного гену. Кожний прямокутник є середнє з двох трансфекцій хз ст.відх.. На кресленні показані результати двох експериментів.
Ф) Фіг. 5. Аналіз репортерного гену Нероа2 для ІІ -6. Дослідження рм8 як інгібуючої плазміди проти рМа5МІ. як ка плазміди репортерного гену. Кожний прямокутник є середнє з трьох трансфекцій х ст.відх.. На кресленні показані результати чотирьох експериментів. во Фіг. 6. Аналіз репортерного гену Неро2 для ІІ -6. Дослідження рМ85М як інгібуючої плазміди проти рМ8ЗМІ. як плазміди репортерного гену. Кожний прямокутник є середнє з трьох трансфекцій ж ст.відх.. Результати подаються у вигляді 95 інгібування по відношенню до клітин Нерб2, трансфектованим плазмідою-носієм рС без інгібуючої плазміди.
Фіг. 7. Аналіз репортерного гену Нерс2 для ІІ/-6. Дослідження рам і рмезм як інгібуючих плазмід проти 65 рМаЗМІ як плазміди репортерного гену. Кожний прямокутник є середнє з трьох трансфекцій хз ст.відх..
Результати подаються у вигляді 9о інгібування по відношенню до клітин Нерб2, трансфектованим плазмідою-носієм рес без інгібуючої плазміди.
Фіг. 8. Дослідження інгібування активності І/-б інгібуючими плазмідами рМ8 і рмеа5М при аналізі репортерного гену Нерб2 на основі люциферазного гену під контролем індуцибельних регуляторних послідовностей І/-б6 із промотора гену людського гемоглобіну. Кожний прямокутник є середнє з трьох трансфекцій ж ст.відх.. Результати подаються у вигляді 95 інгібування по відношенню до клітин Нерс2, трансфектованим плазмідою-носієм рС без інгібуючої плазміди. Трансфекцію здійснюють 0О,1мкг репортерної плазмідної ДНК і вказаним молярним надлишком інгібуючої плазміди. Загальну кількість трансфектованої ДНК підтримують постійною за допомогою плазміди-носія. Трансфектовані клітини обробляють протягом 18 годин 7/0. нг/мл 1-6.
Приклад 1. Побудова плазмід. Плазміду репортерного гену люциферази, що відповідає на 1-6 конструюють, одержуючи, спочатку, шляхом хімічного синтезу двухланцюговий олігонуклеотид з 38 п.н. з невирізаним сайтом
Ватн І на його 5' тупому кінці, і формуючи виступ нижнього ланцюжка з 4 нуклеотидів, сумісних із сайтами Ва1
П ої Ватн і! на 3 -кінці Цей синтетичний олігонуклеотид називають М2, і він містить дві ідентичні 7/5 АРКЕ-послідовності з промоторної області гену пацюкового «2-макроглобуліну. Послідовність олігонуклеотиду (верхній ланцюжок, 5-3) має вигляд ОСАТССТТСТОООААТТСТОАТССО-ТТСТООСААТТСТО (послід. Мо 2). Цей олігонуклеотид клонують в сайтах та | - Во! ІЇ плазміди рої 2-рм (від Рготеда Согрогайоп), де експресія люциферазного репортерного гену провадиться раннім промотором вірусу 5М40, формуючи, таким чином, після аутолігування, плазміду РМ25МІ.
Синтетичний олігонуклеотид також лігують, через його 5 тупий кінець, з сайтом Зта ! тієї ж плазміди ро12-ру, і лінійний продукт лігування, що утворюється в результаті, потім розрізають Ніпа Ії. Отриманий в результаті лінійний вектор використовують у якості реціпієнта для клонування слідуючих фрагментів ДНК: 1) фрагменту Ватн І -Ніпа І із 238 п.н. з плазміди рРМ25МІ, з утворенням, таким чином, після аутолігування, плазміди рМ451! М; 2) фрагменту ВатН І-Ніпа І з 280 п.н із рМ451!М, з утворенням, таким чином, після с аутолігування, плазміди рМб5ІМ; і 3) фрагменту ВатнН І-Ніпа І з 322 п.н. із рМб5ІМ, з утворенням, таким чином, після аутолігування, плазміди рМ85І М. і)
Плазміду рмМ8Г!. конструюють шляхом перетравлення рма51І М з 51Тап 1 і шляхом конвертування липких кінців у тупі кінці за допомогою реакції вставки з ферментом Кленова. Після перетравлення ВатН І! отриманий в результаті фрагмент ДНК М8 в 163 п.н. лігують з синтетичним адаптером ВатН І-Крпі з 16 п.н.і клонуютьу о фрагменті ДНК в 5,6 т. п.н., що утворюється при перетравленні Зта | ї Крп | вектору ро 2-6 (від Рготеда
Согрогайоп). Плазміда рої! -26 ідентична вищезгаданій плазміді ро 2-ру, за винятком відсутності промоторної со послідовності ЗМ40 в рОІ 2-ю. Адаптер з 16 п.н. містить сайт множинного клонування, і його одержують шляхом Ге) хімічного синтезу з наступною послідовністю: верхній ланцюжок: ЗСОСООССОССТоОАСОЗ (послід. Мо 3); о нижній ланцюжок: З'ЗАТСССТООАСОСООССОСООТАСЗ! (послід. Мо4). Ге)
Плазміда, що утворюється з вищевказаної конструкції, являє собою рМві, і вона має послідовність ДНК М8 без промотору, яка вставлена в сайт множинного клонування, в зворотному напрямку люциферазного гену.
Плазміду люциферазного репортерного гену рМе8ТКІ одержують шляхом розрізування плазміди рРОЕМ-ТК-САТ (описаної в Сопеп еї аІ., ЕМВО ), 7(5), рр 1411-9, 1988) Хба І і Вої Ії. Одержаний в результаті « фрагмент в 181 п.н., що містить ТК-промоторну послідовність гену тимідинкінази вірусу НЗМ, лігують з ЩО с фрагментом МнНе І-ВаїЇ ІІ з 5,8 т.п.н. вектору рМ8/. між послідовностями М8 і ДНК люциферази. й Плазміду люциферазного репортерного гену РНРЗМІ конструюють спочатку шляхом РСК-ампліфікації 841 «» п.н. з промоторної області гену гаптоглобіну з людської геномної ДНК. Кінець 3' ампліфікованого РСК фрагменту відповідає позиції 36 від початку транскрипції гену людського гаптоглобіну (як повідомляється в Маеада еї аї.,
У. Віої. Спет., 260(ІІ), рр. 6698-709, 1985). Цей РСОК-продукт одержують із верхньою і нижньою приманками, що
Ге»! містять, відповідно, сайти рестрикції Мі / ї Ва! ІІ. ДНК-приманки, синтезовані для геномної ампліфікації промоторної області гаптоглобіну, мають слідуючу послідовність: о верхня приманка: БСТАСОСОТОСАСТАТТОАСССТТОСТОСТУ (послід. Мо 5); о нижня приманка: ВЗСОСАСАТСТАОССТСАСТТСТОССССТТСЗУ (послід. Мо 6).
Отриманий у такий спосіб РСК-фрагмент вставляють в сайти Мій І і Во1 Ії вказаної вище плазміди бо люциферазного репортерного гену ро! 2-рм, в зворотному напрямку раннього промотору 5М40. Утворена в со результаті плазміда являє собою РНРБОМІ.
Щоб сконструювати інгібуючу плазміду рМ8, вищевказану плазміду рРМ8І. перетравлюють з 5аї | і Во! Ії, і отримані в такий спосіб липкі кінці виправляють у тупі кінці за допомогою реакції Кленова. Отриманий в результаті фрагмент в 3,1 т.п.н., що не має послідовності гену люциферази, очищають за допомогою електрофорезу в агарозному гелі, потім його аутолігують, і генерують інгібуючу плазміду рм8. іФ) Інгібуючу плазміду РМ85М одержують так, як показано на фіг. 1. Перетравлюють РМ85ЗМІ. з заї | і Ніпа ПІ, і ко липкі кінці трансформують у тупі кінці за допомогою реакції Кленова. Отриманий в результаті фрагмент ДНК в 3,2 т.п.н, очищають за допомогою електрофорезу в агарозному гелі, потім його аутолігують. во Генерують, таким чином, плазміду рМе5М, що містить послідовність М8 (170 п.н.) і послідовність із раннього промотору вірусу 5М40 (190 п.н.), але таку, що не має люциферазного гену.
Інгібуючу плазміду рОМ конструюють за допомогою вирізання фрагменту За! І-Ніпа ПШ, що містить люциферазний ген, із вказаної вище плазміди рої 2-ру. Отриманий в результаті фрагмент в 3,1 т.п.н. піддають реакції вставки з ферментом Кленова, очищають за допомогою електрофорезу в агарозному гелі, і потім його б5 аутолігують, одержуючи, таким чином, плазміду р3М, що містить промотор 5М40, але не має люциферазного гену.
Плазміду-носій рС одержують шляхом розрізування вказаної вище плазміди рі 2-6 ферментами рестрикції за! І ї Ніпа Ії. Отриманий в результаті фрагмент в 2,9 т.п.н. піддають реакції вставки з ферментом Кленова, очищають за допомогою електрофорезу в агарозному гелі, і потім його аутолігують, одержуючи, таким чином, плазміду ро.
Всі описані вище плазмідні конструкції використовують для трансформації штаму Е. Соїї ХІ І-Віпе звичайними способами (А!зире! К. еї аїЇ.. Сипепі Ргоїосоів іп Моїесшіаг Віоіоду. Сгеепе Рибіїзпіпуд Аззосіаїез апа Уміеу
Іпіегесіепсе, Мем ЖМогк). Плазмідну ДНК екстрагують із трансформованих клонів за допомогою мініпрепаративного методу лужного лізісу (по А!зиреї, цит. вище). Плазмідну ДНК перевіряють за допомогою 70 рестрикційного аналізу і електрофорезу в агарозному гелі. Відбирають клони з передбаченою картиною. Щоб одержати очищені плазмідні препарати для застосування при трансфекції клітин ссавців, одержують З0Омл культур відібраних трансформантів Е. Соїї ХІІ-Віпе. Потім плазміди очищують за допомогою іонообмінних мініколонок 500 з наконечником ОІАСЕМ відповідно до інструкцій виробника.
Приклад 2. Клітинні лінії і умови культивування
Клітини гепатоми людини Нерб2 (АТСС) культивують в мінімальному підтримуючому середовищі (МЕМ) із додаванням 1095 ЕС, 5ММ І -глутаміну, 20ММ НЕРЕБ, 100ЄЕ/мл пеніциліну/стрептоміцину. Клітини раку молочної залози людини Т47О0 (АТСС) культивують в модифікованому згідно із способом Дульбекко середовищі Ігла (ОМЕМ) із додаванням 1095 ЕС, 5ММ І-глутаміну, 20ММ НЕРЕЗ, 100Е/мл пеніциліну/стрептоміцину. Клітини мієлоїдного лейкозу миші МІ (АТСС) культивують в КРМІ із додаванням 1095 ЕС5, 5мММ І-глутаміну, 20мММ НЕРЕЗ, 100Е/мл пеніциліну/стрептоміцину. Культивування вищевказаних клітинних ліній здійснюють при або у відсутності відповідної дози 1-6 (похідний СНО П ЇЇ -6 від Іпіегрпагт І арогайгієв), як описано нижче.
Приклад 3. Проміжна трансфекція і аналізи люциферази і р-галактозидази. Проміжну трансфекцію клітин гепатоми людини Нерба і клітин раку молочної залози людини Т470 здійснюють із використанням преципітації
ДНК фосфатом кальцію в буфері НЕРЕЗ, згідно зі стандартними процедурами (А!йзибреї! К. еї а І.. Ситепі с
Ртоїосоїв іп Моїесшаг Віоіоду. Сгеєепе Рибіїзйіпуд Авззвосіаїев апа УМіеу Іпіегесіепсе, Мем/ Могк). Проміжну трансфекцію клітин мієлоїдного лейкозу миші М1 здійснюють із використанням ОСЕАЕ-декстрану звичайними о процедурами (згідно А!йзивбеї, цит.вище).
Щоб виявити активність люциферази і Др-галактозидази, клітини екстрагують іп зйи шляхом інкубації протягом 15 хвилин при кімнатній температурі з Тмл/105 клітин буфері для екстракції (25ММ тріс-фосфату, рН (ее) 7,8, 2мМ ОТ, 2мММ ЕДТК, 1095 гліцерину, 195 тритону Х-100). У випадку люциферазної активності безпосередньо со аналізують 20мкл клітинного екстракту з 100мкл буферу для аналізу люциферази (20ММ трицину, 1,07мММ (М9СО3); Ма (0Н)2»05 НьЬО, 2,67мММ Мо95О), 0 1мМ ЗДТК, 33,3мММ ОТТ, 0,27ММ коферменту А, 047мМ с люциферину, 0,53мММ АТФ). У випадку активності р-галактозидази ТОмкл клітинного екстракту інкубують с протягом 1 години при 37"С з 100мкл субстрату І итідаї! (від І итідеп). Зчитування даних із І штіда! і люциферази 3З5 здійснюють за допомогою люменметру Вегійоїд Аціоіштаї І 8953, причому випромінююча потужність є числом. (О відліків за секунди (чос), взяте за період ЗО секунд у випадку люциферази і за період 15 секунд у випадку р-галактозидази.
Показано, що репортерна плазміда рМ85Мі надає ІІ-6б-відповідаємість після проміжної трансфекції клітин «
Неро2, підвищуючи експресію люциферазної активності в 50-100 разів (Зегпіирі Стезсеп?і еї аі., повідомлення на 12-ій європейській конференції по імунологи, Барселона, 14-17 червня 1994). З с Цю плазміду також досліджують у клітинах раку молочної залози людини Т47О і в клітинах мієлоїдного з» лейкозу миші М1 Клітини М1 трансфектують 0,5мкг ДНК на 105 клітин із використанням ОЕАЕ-декстрану, у той час як для кальційфосфатної трансфекції клітин ТА7О використовують 2,5мкг ДНК на 105 клітин.
Тільки дуже обмежені ознаки розділяються цими двома клітинними лініями, крім їхньої звичайної реакції на б 15 людський 1-6. Результати (фіг.3) показують, що молекула ДНК М8 в плазміді рРМа5М!. істотно активна в обох клітинних лініях після обробки І/-6. Як показує фіг.3, значна реакція на І/-б6 також спостерігається в (95) клітинах М1 з плазмідою репортерного гену рМаТКІ,, де молекула М8 фланкована тимидинкіназним промотором, бо що відрізняється від промотору ЗМ40, що присутній в РМ85МІ..
Залежність від часу люциферазної індуцибельності трансфектованих клітин Нерс2 перевіряють після (ее) 50 обробки 1-6 (Інг/мл). Плазміду рРМ85МІ. використовують у якості позитивної плазміди репортерного гену (при «со О,2мкг/105 клітин). Клітини трансфектують протягом ночі, розщеплюють і потім піддають обробці ІІ -6.
Результати приводяться на фіг.4, і вони показують, що майже повної відповіді на ІЇ-6 можна досягти тільки через дві години після обробки І! -6.
Приклад 4. Випробовування інгібуючої плазміди рМ8. Інгібування активності І -б молекулами ДНК М8 вимірюють після котрансфекції в клітини Нерб2 (Ф) 1) плазміди репортерного гену РМ8ЗМІ, що відповідає на І! -6, і
ГІ І) молекули М8, вставленої в інгібуючу плазміду М8. Ця остання плазміда виступає в ролі хазяїна послідовності М8, але вона не здатна надавати відповідь на І/-6. Клітини Нерс2 трансфектують 2,Бмкг/105 во клітин відповідаючої на ІЇ-6 репортерної плазміди рМ85МІ (що містить М8 і ген люциферази) і 10- або 50-кратним молярним надлишком рМ8, при різноманітних дозах 1-6. Загальну кількість ДНК на трансфекцію підтримують постійною, використовуючи плазміду-носій рС, що ідентична рмМ8, за винятком відсутності в першій плазміді специфічного фрагменту ДНК М8 довжиною в 165 п.н.
Як видно з фіг.5, інгібуюча плазміда не показує суттєвого і відтворюємого специфічного інгібування 65 активності ІІ -6 у чотирьох експериментах, навіть при 50-кратному молярному надлишку інгібуючої плазміди рм8.
В цих експериментах відповідаючу на І/-6 плазміду репортерного гену використовують при дозі 0,1мкг/109 клітин, у той час як постійна кількість загальної ДНК, використованої при трансфекції , становить бмкг/10 ? клітин. Субоптимальна доза І/-б6, використана в цих експериментах, становить нг/мл. Як показує фіг.5, мінливість при цих умовах експерименту прийнятна, виходячи з факту, що різноманітні трансфекції самі по собі є неминучим джерелом мінливості.
Приклад 5. Випробовування інгібуючої плазміди рМе5М. Результати, наведені на фіг.5, є трохи несподіваними, оскільки активна інгібуюча ДНК-послідовність М8 інгібуючої плазміди рМа8 ідентична активній послідовності плазміди репортерного гену РМ85МІ. Тому після котрансфекції варто було б очікувати конкуренції між двома ідентичними М8 послідовностями, які присутні в різних плазмідах, що призводить до інгібування /о активності ІІ--6 при аналізі репортерного гену.
Крім того, описані вище результати не можна пояснити за допомогою присутності надлишку активованого
І -б-специфічного фактору (факторів) транскрипції, що недостатньо нейтралізовані молекулами інгибуючої ДНК
М8, тому що дані одержують при обмеженій кількості І/-б. Крім того, опубліковані дані про подібні експерименти з сайтами зв'язування ДНК для відомих факторів транскрипції (26-30) не сумісні з результатами, /5 приведеними на фіг.5.
Іншим поясненням результатів, показаних на фіг.5, може бути те, що відмінні від М8 послідовності в плазміді репортерного гену можуть робити внесок в ІІ-б-специфічну сигнальну трансдукцію. Ці послідовності повинні бути відсутні в інгібуючій послідовності рРМ8, але вони повинні бути присутніми в позитивній плазміді репортерного гену рРМ85М!. (наприклад, послідовності раннього генного промотору 5М40, що можуть зв'язувати 2о загальні фактори транскрипції). Інгібуюча плазміда рМ8 тому може бути неефективною при конкуренції з плазмідою репортерного гену РМ85МІ..
Щоб перевірити цю гіпотезу, конструюють інгібуючу плазміду (РрРМ85М), що містить у якості інгібуючих 1-6
ДНК-послідовностей як послідовність М8, так і промоторну послідовність ЗМ40 (див. фіг.1). Цю інгібуючу плазміду перевіряють при аналізі репортерного гену 1-6 з клітинами Нерб2. Здійснюють чотири незалежних сч об експерименти, при дворазовому повторенні трансфекції на експеримент. Трансфекцію здійснюють 0,1мкг репортерної плазмідної ДНК і молярним надлишком інгібуючої плазміди як показано на фіг.б. Загальну кількість і) трансфектованої ДНК підтримують постійною за допомогою плазміди-носія. Трансфектовані клітини обробляють протягом 18 годин нг/мл ЇЇ -6.
Результати, приведені на фіг.б, показують чітке залежне від дози інгібування активності 1-6 інгібуючою со зо плазмідою рМ85ЗУ. Неопрацьовані дані для фіг.б приводяться в табл.1. При кожному експерименті здійснюють три повторних трансфекції на дозу інгібуючої плазміди. Для кожного експерименту величини у випадку со індукування і без індукування, приведені в окремій колонці, призводять до однієї і тієї ж трансфекції. Дані со значення світлового випромінювання представляють чос за період у 30 секунд. Як можна бачити з табл.1, спостерігається деяка мінливість у цих експериментах, особливо, при більш низьких дозах інгібуючої плазміди, і) зв але звичайно коеф. варіації повторних трансфекцій твердо становить ниж. 20965. Ге
Щоб виключити припущення, що інгібування активності ІЇ/-б6, забезпечене інгібуючою плазмідою рмМ85м, відбувається винятково завдяки ДНК-послідовності промотора 5М40, а не сполученню послідовностей М8 і 5М40, конструюють додаткову інгібуючу плазміду, і досліджують її при аналізі репортерного гену. Ця плазміда містить у якості інгібітора активності І/-б6 тільки ДНК-послідовність 5М40, без послідовності М8, а також « люциферазного гену. в с Трансфекцию здійснюють 0,1мкг репортерної плазмідної ДНК і молярним надлишком інгібуючої плазміди, як показано на фіг.7. Загальну кількість трансфектованої ДНК підтримують постійною за допомогою плазміди-носія. ;» Трансфектовані клітини обробляуть протягом 18 годин нг/мл ІІ-6. Результати, приведені на фіг.7, показують, що ця інгібуюча плазміда, (рРЗМ) демонструє тільки часткове інгібування активності І/-б6, що ніколи не перевищує 4095 і не залежить від дози. Це дозволяє зробити висновок, що однієї ДНК-послідовності 540
Ге» недостатньо для ефективного інгібування активності І/-6. З іншого боку, репортерна плазміда роі2-ру, що містить люциферазу, містить промоторну послідовність 5М40, але не містить послідовність М8, даючи, таким о чином, в результаті, основний рівень експресії люциферази, більше не індукований 1І/-6. В цій плазміді
Го! основний рівень експресії люциферази не інгібується інгібуючою плазмідою рМазУ, показуючи, таким чином, що фактори транскрипції, які специфічно зв'язуються тільки промоторною областю 5М40 рої 2-ру, не видаляються со ефективно інгібуючою плазмідою рМазу. В дійсності, при наявності останньої інгібуючої плазміди активність с люцеферази з репортерної плазміди ро! 2-ру навіть вище, ніж у відсутність вказаної інгібуючої плазміди (не показано).
Приклад 6. Інгібування рМа5М активності ІІ -6, наданої плазмідою репортерного гену РНРБЗМІ. Автори потім побажали перевірити інгібуючу плазміду рМ85М при додатковому аналізі репортерного гену для ІІ/-6, коли послідовність ДНК-мішені, що опосередкує сигнал І/-б6 в плазміді репортерного гену, не цілком відповідає
Ф) інгібуючій послідовності М8. Тому клітини Нерб2 трансфектують плазмідою РНР5МІ, що містить 841 пару основ ка з промоторної послідовності гену людського гаптоглобіну, рланковану промотором 5М40 і люциферазним геном.
В цій плазміді є присутнім один сайт АРКЕ із гаптоглобінової промоторної послідовності (відповідно до Маеда во ака. 9. Віої. Спет., 260 (ІІ), рр. 6698-709, дипе 10, 1985). Автори попередньо показали, що ця плазміда відповідає на І -6 6-8-кратним збільшенням експресії люциферази (Зипирі Сгевзсеп?і еї аї., повідомлення на 12-ій Європейській конференції по імунології, Барселона, 14-17 червня 1994).
Результати одного з експериментів при триразовому повторі трансфекції приводяться на фіг.8. Після котрансфекції плазміди репортерного гену рРНРБМІ з 50-кратним молярним надлишком плазміди-носія 65 індуцибельність за рахунок ІЇ/-б дає, в результаті, експресію люциферази в 4 рази вище основного рівня.
Навпаки, котрансфекція з 50-кратним молярним надлишком інгібуючої плазміди рМе85М цілком руйнує індуцибельність за рахунок 1ІІ/-6. Отже, інгібуюча плазміда рМа5М здатна інгібувати активність І/-б також тоді, коли досліджують відповідаючу на ІІ/-6 плазміду репортерного гену, що відрізняється від РМ85МІ. (наприклад, репортерну плазміду РНРБМІ).
Приклад 7. Дослідження інгібуючої плазміди рМ85М у клітинах Т470О0. Інгібуючу плазміду РМ8ЗМ також досліджують при аналізі репортерного гену рМ85МІ, використовуючи клітини раку молочної залози людини
Т470, де трансдукція сигналу ІЇ/-б6 може бути іншою, ніж в клітинах гепатоми. Як згадувалося раніше, аналіз репортерного гену І/-6 з плазмідою репортерного гену рМ8ЗЗМІ працює в цій клітинній лінії, хоча він не оптимізований. Тому що чутливість аналізу з клітинами Т47О іноді нижче, трансфекцію здійснюють із мкг 70 позитивної плазміди репортерного гену на 105 клітин, що є відносно високим рівнем плазмідної ДНК. Тому в цьому експерименті спостерігають неспецифічне інгібування при надлишку плазміди-носія або інгібуючої плазміди, що призводить, в результаті, до більш високої мінливості ІЇ -Є-специфічного інгібування.
Результати наводяться в табл.2. Показано середні (ср) і стандартні відхилення (ст. відх.) триразово повтореної трансфекції в двох експериментах.
Середні величини кратної індукції обчисляють із неопрацьованих значень кожної трансфекції. В експериментах 1 і 2 використовують 1 і 0,5мкг плазміди репортерного гену, відповідно, на 107 трансфектованих клітин.
У цих експериментах здійснюють окрему трансфекцію плазміди-носія і інгібуючої плазміди, причому обидві плазміди використовують при вказаному молярному надлишку по відношенню до репортерної плазміди.
Після трансфекції клітини індукують на протязі 18 годин нг/мл ІЇ/-6. Приведені величини світлового випромінювання є чос за період у 30 секунд. Специфічне інгібування ІІ -6 у цих експериментах оцінюють шляхом порівняння індукції, отриманої при надлишку інгібуючої плазміди і індукції, отриманої при відповідній дозі плазміди-носія.
Крім того, через неспецифічне інгібування основний рівень експресії люциферази наближається до кількісної СУ межі аналізу. Результати, наведені в табл.2 (див. експеримент 1), показують, що, після трансфекції, о повтореної тричі, релевантне специфічне інгібування активності І -6 одержують при 20-кратному молярному надлишку інгібуючої плазміди рМ85М, а не при 10-кратному молярному надлишку. В цьому експерименті не можна здійснити дослідження при 50-кратному молярному надлишку інгібуючої плазміди, оскільки неспецифічне інгібування стає занадто високим. (ее)
Ці результати не можна відтворити в додатковому експерименті, коли використовують 0,5мкг ДНК на 109 со клітин (табл.2, див. експеримент 2). Причиною такої відсутності відтворення може бути відносно висока мінливість і низька чутливість аналізу репортерного гену Т47О. З іншого боку, ці результати може пояснити (ее) різна селективність клітин-мішеней.
Приклад 8. Визначення мінімальної інгібуючої послідовності ДНК. Щоб ідентифікувати мінімальну о
ДНК-послідовність, яка зберігає здатність інгібувати зв'язування факторів транскрипції, релевантних для (Се)
І -6-індуцибельності, можна використовувати експериментальний підхід аналізу зсуву електрофоретичної рухомості (ЕМ5А) (по А!йзиреї). Випробовування на функціональне інгібування, передане цією мінімальною послідовністю, можна здійснити з використанням аналізу репортерного гену, вказаного в прикладі З і наступних « прикладах. Автори показали, що мінімальна ДНК-послідовність, що функціонально інгібує активність І/-6 при аналізі репортерного гену, є фрагментом Ват І-Ніпа ПШ в З50 п.н. інгібуючої плазміди рМе85М, що містить - с 8-кратний повтор АРКЕ-ДНК-послідовності і ранньої промоторної послідовності 5М40. Відомо, що ця остання а послідовність містить сайти зв'язування для загальних факторів транскрипції, такі як АР-1-подібний сайт (як "» повідомляють 7епКе еї аіІ., ЕМВА /, 5 (2), рр. 387-97, 1986), і б-кратний повтор сайту 5р-! (як повідомляють
Оупап еї аї.. СеїІї, 35, рр. 79-87, 1983). Фрагмент ДНК Ват І-Ніпа ІП може бути видалений із її 5- і/або 3 -кінців за допомогою звичайних методів, таких як РСК або обробка нуклеазою (по А!йзиреї), щоб послідовність
Ге) мала, наприклад, дві АРКЕ-поспідовності і тільки один або декілька сайтів зв'язування для специфічних с факторів транскрипції з раннього промотору 5ЗМ40. Отримані в результаті ДНК-послідовності можна використовувати для досліджень на інгібування при аналізі репортерного гену на основі рЗММ8І в клітинах (ее) Нероаг. бо 50 Крім того, мінімальний фрагмент ДНК, що зберігає повну здатність функціонально інгібувати сигнал ІІ -6, може бути використаний при ЕМ5ЗА, шляхом мічення цієї ДНК З?р-нуклеотидом за допомогою звичайних со способів, таких як кінцеве мічення або вставка при реакціях Кленова. Отриманий в результаті мічений
ДНК-фрагмент можна інкубувати з нуклеарними екстрактами з клітин Нерс2 після обробки ІІ -6.
Кількість конкуруючої ДНК-послідовності, що збільшується, також можна коінкубувати, як який-небудь із немічених ДНК-фрагментів, який утворився в результаті вищевказаних делецій фрагменту інгібуючої ДНК Ват
Ге! І-Ніпа 1. Після інкубації суміш можна піддати електрофорезу в неденатуруючому гелі. Зв'язування релевантних факторів транскрипції з досліджуємим міченим фрагментом ДНК буде виявлятися по зсуву в рухомості гелю де (уповільненню), очікуваному для незв'язаної міченої ДНК. Інгібування цього зв'язування при конкуруючих немічених ДНК-послідовностях буде виявлятися по специфічному зникненню зсунених смуг у гелі. 60 - 1-6 1-6 -1-6 1-6 -1-6 1-6 -1-6 1-6 б5 ре ісіі ой ай ві іні ой іній 34.760 1.711.000 | 91.560 1.754.000 | 49.670 | 3.239.000 | 31.130 1.362.000 : ВЕУ а вовни Подання Поні ання Ви ВАНЯ їх р іонні паніні ін Піо Пій 34.660 ри іа Бан банні іі Біо Боно 24.530 з ре ііі Бій сін вій війні 45.320 пн яв нов ню нн ння як 32.670 шт | т м тю о 60.110 п йон Бій ні Бо Бін ой 73.810
Молярний надлишок інгібітору або плазміди-носія см зв
Експер.1 |Репортерна плазміда плюс плазміда носій 932 58950 о порт ния ня Я кратн. індук. ее
Не визначалося
Репортерна плазміда плюс інгіб. плазміда рм8 (ее) винний їй кратн. індук.
Фо
Репортерна плазміда плюс інгіб. плазм. рМа8ЗУ со кратн. індук.
Експер.2 |Репортерна плазміда плюс плазміда-носій « : з с Не визначалося у » Репортерна плазміда плюс Інгіб. плазміда РМ8 кратн. індук. 4 (о) Репортерна плазміда плюс з ше З Ол 11
Інгіб. плазм. РМВЗМ (ее)
Перелік послідовностей со (І) Загальна інформація «со (1) ЗАЯВНИК: (А) ІМ'Я: АРРІЛЕО КЕЗЕАКСН 5УЗТЕМ5 АК НОЇ ВІМО М. М. (Б) ВУЛИЦЯ: 6 ХОНМ СОКЗІКАУМЕО (В) МІСТО: СОКАСАО (Д) КРАЇНА: МЕТНЕВІ АМО5 АМТІ Е5
Ф, (Е) ПОШТОВИЙ ІНДЕКС (7ІР): НЕМАЄ ко (ІЇ) НАЗВА ВИНАХОДУ: ІНГІБІТОР АКТИВНОСТІ 1-6 (НП) ЧИСЛО ПОСЛІДОВНОСТЕЙ: 6 во (М) ФОРМА КОМП'ЮТЕРНОГО ЗЧИТУВАННЯ: (А) ТИП СЕРЕДОВИЩА: дискета (Б) КОМП'ЮТЕР: сумісний із системою ІВМ РС (В) ОПЕРАЦІЙНА СИСТЕМА: РО-0О5/М8-005 (ГУ ПРОГРАМНЕ ЗАБЕЗПЕЧЕННЯ: Раїепіїп Кеїеазе 1.0, 65 версія 1.30 (ЕРО) (2) ІНФОРМАЦІЯ ПРО ПОСЛІД. Мо 1
() ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА: 356 пар основ (Б) ТИП: нуклеїнова кислота (В) Одноланцюгова (Г) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (І) ТИП МОЛЕКУЛИ: КДНК (І) ГІПОТЕТИЧНІСТЬ: НЕМАЄ (М) АНТИЗМІСТОВА: НЕМАЄ 70 (ХІ) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: ПОСЛІД. Мо 1
СССЛОБАТСС ТТСТОООдДАТ ТСТОАТОСТТ СТООСААТТС ТОАТССТІСТ БОбБААТТСТО 60 АТССТІСТОС бААТІСТОАТ ССТІСТООбА АТСТОАТОС 0 ТпеТООбААТ ів ТСТОАТССТІ 120 СТОббААТІС ТОАТССТІСТ бОСбААТТСТО 0 АТСТОСАТСТ
СААТАОТСА ОСлЛАССАТАЄО 160 ТОСССОССССТ ААСТОСОССС АТСССОСССС
ТААСТССОСС САСТТССОСС СА СТОСОоС 240 СССАТОССТО 0 АСТААТТІТ
М ТТАТПТАТС САбдАОобССоА бОосСсОоссТоо осстсТодОаС 300 ТАТ ССАОАА
СТАОТОАСОА БОСТТТ ТО САООССТАОО СТ ТОСААА дАОСТТ 356 (2) ІНФОРМАЦІЯ ПРО ПОСЛІД. Мо 2 (1) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА: 38 пар основ сч (Б) ТИП: нуклеїнова кислота о (В) Одноланцюгова (Г) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (11) ТИП МОЛЕКУЛИ: КДНК со (І) ГІПОТЕТИЧНІСТЬ: НЕМАЄ 3о (М) АНТИЗМІСТОВА: НЕМАЄ со (Х) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: ПОСЛІД. Ме 2
ССАТССТТСТ СОСААТТСТО АТОСТТСТОб СААТТСТо 38 со (2) ІНФОРМАЦІЯ ПРО ПОСЛІД. Мо З Ге) () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА: 16 пар основ ї-о (Б) ТИП: нуклеїнова кислота (В) Одноланцюгова (Г) ТОПОЛОГІЯ: лінійна « (І) ТИП МОЛЕКУЛИ: КДНК -о 70 (Ії) ГІПОТЕТИЧНІСТЬ: НЕМАЄ с (М) АНТИЗМІСТІОВА: НЕМАЄ :з» (ХІ) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: ПОСЛІД. МоЗ сосоассосс тосАСо 16 (2) ІНФОРМАЦІЯ ПРО ПОСЛІД. Мо 4 б» 15 () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА: 24 пари основ (95) (Б) ТИП: нуклеїнова кислота бо (В) Одноланцюгова (Г) ТОПОЛОГІЯ: лінійна со 7 (І) ТИП МОЛЕКУЛИ: КДНК со (І) ГІПОТЕТИЧНІСТЬ: НЕМАЄ (М) АНТИЗМІСТОВА: НЕМАЄ (ХІ) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: ПОСЛІД. Мо 4
САТСССТОбБА вОСОобССОоСОо СТАС 24 (2) ІНФОРМАЦІЯ ПРО ПОСЛІД. Мо 5
Ф! () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА: 29 пар основ де (Б) ТИП: нуклеїнова кислота (В) Одноланцюгова 60 (Г) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (І) ТИП МОЛЕКУЛИ: КДНК (І) ГІПОТЕТИЧНІСТЬ: НЕМАЄ (М) АНТИЗМІСТОВА: НЕМАЄ (ХІ) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: ПОСЛІД. Мо 5 65 стАСбОСТОС АСТАТТСАСС СТТОСТОСТ 29
(2) ІНФОРМАЦІЯ ПРО ПОСЛІД.
Мо 6 () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА: 28 пар основ (Б) ТИП: нуклеїнова кислота (В) Одноланцюгова (Г) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (І) ТИП МОЛЕКУЛИ: КДНК (І) ГІПОТЕТИЧНІСТЬ: НЕМАЄ 70 (М) АНТИЗМІСТОВА: НЕМАЄ (ХІ) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: ПОСЛІД.
Мо 6
Claims (11)
1. Нуклеотидна послідовність, здатна інгібувати активність ІІ -6, що містить: ї) восьмиразовий повтор нуклеотидної послідовності, яка являє собою послідовність елемента реакції гострої фази (АРКЕ-елемент) загальної формули 4-ХМУКОКАА, де 7 - Т або б, або може бути відсутнім; Х - Т або може бути відсутнім; М - С або А; уУ-Сабот;і К-Табо с, у сполученні з сч ї) принаймні однією нуклеотидною послідовністю, що становить сайт зв'язування фактора транскрипції, відмінний від АРКЕ-елемента, причому вказаний сайт знаходиться у промоторній області. о
2. Нуклеотидна послідовність за п.1, де (ї) є нуклеотидною послідовністю ТТСТОСОАА.
3. Нуклеотидна послідовність за будь-яким з попередніх пунктів, де (ії) вибирають з групи, що складається з блоку ТАТА і сайтів зв'язування для таких факторів транскрипції: АР-1, АР-2, НМЕ-1, 5Р-1, МЕ-КВ, Осі-1, Е-2 со зо і ЗКЕ.
4. Нуклеотидна послідовність за будь-яким з попередніх пунктів, де послідовність (ії) містить, принаймні, г) два різних АРКЕ-елемента. со
5. Нуклеотидна послідовність за будь-яким з попередніх пунктів, де послідовність (ії) містить, принаймні, дві різні олігонуклеотидні послідовності, що становлять сайт зв'язування фактора транскрипції. со
6. Нуклеотидна послідовність за п. 5, де послідовність (ії) є раннім промотором 5МУ40. со
7. Нуклеотидна послідовність за п. 1, що має вигляд ЗЕО ІЮ МО:1.
8. Нуклеотидна послідовність за будь-яким з пп. 1-7 для інгібування дії ІІ -6 при терапії.
9. Плазмідний вектор для трансфекції у клітини ссавців, що містить нуклеотидну послідовність за п.1, що функціонально зв'язана з регуляторними ділянками. « 20
10. Фармацевтична композиція для інгібування дії /-б6, що містить ефективну кількість нуклеотидної з с послідовності за будь-яким з пп. 1-7 разом з одним або декількома фармацевтично прийнятними носіями та/або наповнювачами. :з»
11. Фармацевтична композиція для інгібування дії І/-6, що містить ефективну кількість плазмідного вектора за п. 9 разом з одним або декількома фармацевтично прийнятними носіями та/або наповнювачами. (22) (95) (ее) о 50 ІЧ е) Ф) іме) 60 б5
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/EP1995/001778 WO1996035782A1 (en) | 1995-05-11 | 1995-05-11 | Il-6 activity inhibitor |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA63888C2 true UA63888C2 (en) | 2004-02-16 |
Family
ID=8166014
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UA97126018A UA63888C2 (en) | 1995-05-11 | 1995-11-05 | Nucleotide sequence, able to inhibit activity of il-6, use thereof for therapy, plasmide vector and pharmaceutical composition (alternatives) containing this nucleotide sequence |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6004813A (uk) |
| EP (1) | EP0824588B1 (uk) |
| JP (1) | JP4173539B2 (uk) |
| KR (1) | KR100449677B1 (uk) |
| AT (1) | ATE271128T1 (uk) |
| AU (1) | AU715125B2 (uk) |
| CA (1) | CA2220433C (uk) |
| DE (1) | DE69533264T2 (uk) |
| DK (1) | DK0824588T3 (uk) |
| ES (1) | ES2220929T3 (uk) |
| IL (1) | IL118158A (uk) |
| MX (1) | MX9708663A (uk) |
| RU (1) | RU2205874C2 (uk) |
| UA (1) | UA63888C2 (uk) |
| WO (1) | WO1996035782A1 (uk) |
| ZA (1) | ZA963593B (uk) |
Families Citing this family (49)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6727230B1 (en) | 1994-03-25 | 2004-04-27 | Coley Pharmaceutical Group, Inc. | Immune stimulation by phosphorothioate oligonucleotide analogs |
| US6239116B1 (en) | 1994-07-15 | 2001-05-29 | University Of Iowa Research Foundation | Immunostimulatory nucleic acid molecules |
| US6429199B1 (en) | 1994-07-15 | 2002-08-06 | University Of Iowa Research Foundation | Immunostimulatory nucleic acid molecules for activating dendritic cells |
| US6207646B1 (en) | 1994-07-15 | 2001-03-27 | University Of Iowa Research Foundation | Immunostimulatory nucleic acid molecules |
| US7935675B1 (en) | 1994-07-15 | 2011-05-03 | University Of Iowa Research Foundation | Immunostimulatory nucleic acid molecules |
| CA2237114A1 (en) * | 1995-11-07 | 1997-05-15 | Kaneka Corporation | Autoantigens |
| EP0855184A1 (en) * | 1997-01-23 | 1998-07-29 | Grayson B. Dr. Lipford | Pharmaceutical composition comprising a polynucleotide and an antigen especially for vaccination |
| WO1998037919A1 (en) | 1997-02-28 | 1998-09-03 | University Of Iowa Research Foundation | USE OF NUCLEIC ACIDS CONTAINING UNMETHYLATED CpG DINUCLEOTIDE IN THE TREATMENT OF LPS-ASSOCIATED DISORDERS |
| US6406705B1 (en) | 1997-03-10 | 2002-06-18 | University Of Iowa Research Foundation | Use of nucleic acids containing unmethylated CpG dinucleotide as an adjuvant |
| EP1003531B1 (en) | 1997-05-20 | 2007-08-22 | Ottawa Health Research Institute | Processes for preparing nucleic acid constructs |
| AU760549B2 (en) | 1998-04-03 | 2003-05-15 | University Of Iowa Research Foundation, The | Methods and products for stimulating the immune system using immunotherapeutic oligonucleotides and cytokines |
| EP0972780A1 (en) * | 1998-05-18 | 2000-01-19 | Applied Research Systems ARS Holding N.V. | Il-6 antagonist peptides |
| BR9913562A (pt) | 1998-09-11 | 2001-05-22 | Ajinomoto Kk | Derivados de benzeno, inibidor de ativação de ap-1 e nf-capa b, inibidor de produção de citoquina inflamatória, inibidor de produção de metaloprotease matricial ou inibidor de aparecimento de fator de adesão de célula inflamatório, e, agente antiinflamatório, anti-reumático, imunossupressor, inibidor de metástase cancerosa, remédio para arterioesclerose e agente antiviral |
| US6977245B2 (en) | 1999-04-12 | 2005-12-20 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Oligodeoxynucleotide and its use to induce an immune response |
| AU7078200A (en) | 1999-08-27 | 2001-03-26 | United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services, The | Polypeptides, comprising il-6 ligand-binding receptor domains and related nucleic acids, antibodies, compositions, and methods of use |
| US6949520B1 (en) | 1999-09-27 | 2005-09-27 | Coley Pharmaceutical Group, Inc. | Methods related to immunostimulatory nucleic acid-induced interferon |
| AU2001227889A1 (en) | 2000-01-14 | 2001-07-24 | The United States of America, represented by The Secretary, Department of Health & Human Services | Oligodeoxynucleotide and its use to induce an immune response |
| US7585847B2 (en) | 2000-02-03 | 2009-09-08 | Coley Pharmaceutical Group, Inc. | Immunostimulatory nucleic acids for the treatment of asthma and allergy |
| EP1296714B1 (en) | 2000-06-22 | 2009-08-26 | University Of Iowa Research Foundation | Combination of CpG and antibodies directed against CD19,CD20, CD22 or CD40 for the treatment or prevention of cancer. |
| WO2003020884A2 (en) | 2001-08-14 | 2003-03-13 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of Health And Human Services | Method for rapid generation of mature dendritic cells |
| WO2003054161A2 (en) | 2001-12-20 | 2003-07-03 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | USE OF CpG OLIGODEOXYNUCLEOTIDES TO INDUCE ANGIOGENESIS |
| AU2003216585A1 (en) * | 2002-04-10 | 2003-10-20 | Orchid Chemicals And Pharmaceuticals Limited | Pyrimidinedione derivatives useful for the treatment of inflammation and immunological diseases |
| US6794401B2 (en) * | 2003-01-17 | 2004-09-21 | Bexel Pharmaceuticals, Inc. | Amino acid phenoxy ethers |
| US7521465B2 (en) * | 2003-01-17 | 2009-04-21 | Bexel Pharmaceuticals, Inc. | Diphenyl ether derivatives |
| US7781464B2 (en) * | 2003-01-17 | 2010-08-24 | Bexel Pharmaceuticals, Inc. | Heterocyclic diphenyl ethers |
| US7087576B2 (en) * | 2003-10-07 | 2006-08-08 | Bexel Pharmaceuticals, Inc. | Dipeptide phenyl ethers |
| AU2005235811B2 (en) * | 2004-02-06 | 2011-11-03 | Morphosys Ag | Anti-CD38 human antibodies and uses therefor |
| EP1858845A2 (en) * | 2005-03-18 | 2007-11-28 | Orchid Chemicals and Pharmaceuticals Limited | Novel tyrosine derivatives |
| US20080267888A1 (en) * | 2005-05-26 | 2008-10-30 | Pandey Surendrakumar Satyanara | Heterocyclic Derivatives |
| JP2008543968A (ja) * | 2005-06-28 | 2008-12-04 | オーキッド リサーチ ラボラトリーズ リミテッド | 新規なピラゾロピリミジノン誘導体 |
| CA2625681C (en) | 2005-10-12 | 2016-08-02 | Morphosys Ag | Generation and profiling of fully human hucal gold-derived therapeutic antibodies specific for human cd38 |
| PL1973884T3 (pl) * | 2006-01-19 | 2017-05-31 | Orchid Pharma Limited | Nowe związki heterocykliczne |
| US7863446B2 (en) * | 2006-01-19 | 2011-01-04 | Orchid Research Laboratories Limited | Heterocycles |
| WO2008110891A2 (en) * | 2007-03-09 | 2008-09-18 | Orchid Research Laboratories Limited, | New heterocyclic compounds |
| US7943591B2 (en) * | 2007-05-11 | 2011-05-17 | Adynxx, Inc. | Gene expression and pain |
| BRPI0912029A2 (pt) | 2008-02-01 | 2020-06-30 | Orchid Research Laboratories Limited | novos heterociclos |
| CN102282155B (zh) | 2008-12-02 | 2017-06-09 | 日本波涛生命科学公司 | 磷原子修饰的核酸的合成方法 |
| RU2612521C2 (ru) | 2009-07-06 | 2017-03-09 | Онтории, Инк. | Новые пролекарства нуклеиновых кислот и способы их применения |
| JP5868324B2 (ja) | 2010-09-24 | 2016-02-24 | 株式会社Wave Life Sciences Japan | 不斉補助基 |
| CN103796657B (zh) | 2011-07-19 | 2017-07-11 | 波涛生命科学有限公司 | 合成官能化核酸的方法 |
| PT2846839T (pt) | 2012-05-10 | 2019-05-29 | Adynxx Inc | Formulações para a administração de ingredientes ativos |
| CA2879066C (en) | 2012-07-13 | 2019-08-13 | Shin Nippon Biomedical Laboratories, Ltd. | Chiral nucleic acid adjuvant |
| PL2872485T3 (pl) | 2012-07-13 | 2021-05-31 | Wave Life Sciences Ltd. | Asymetryczna grupa pomocnicza |
| KR102213609B1 (ko) | 2012-07-13 | 2021-02-08 | 웨이브 라이프 사이언시스 리미티드 | 키랄 제어 |
| JPWO2015108048A1 (ja) | 2014-01-15 | 2017-03-23 | 株式会社新日本科学 | 抗腫瘍作用を有するキラル核酸アジュバンド及び抗腫瘍剤 |
| US10322173B2 (en) | 2014-01-15 | 2019-06-18 | Shin Nippon Biomedical Laboratories, Ltd. | Chiral nucleic acid adjuvant having anti-allergic activity, and anti-allergic agent |
| JPWO2015108047A1 (ja) | 2014-01-15 | 2017-03-23 | 株式会社新日本科学 | 免疫誘導活性を有するキラル核酸アジュバンド及び免疫誘導活性剤 |
| BR112016016400A2 (pt) | 2014-01-16 | 2017-10-03 | Wave Life Sciences Ltd | Composições de oligonucleotídeos quiralmente controlados, seu uso, sua composição farmacêutica, e métodos |
| RU2017108238A (ru) | 2014-08-15 | 2018-09-17 | Эйдинкс, Инк. | Олигонуклеотиды-приманки для лечения боли |
-
1995
- 1995-05-11 AT AT95919438T patent/ATE271128T1/de active
- 1995-05-11 MX MX9708663A patent/MX9708663A/es unknown
- 1995-05-11 US US08/945,726 patent/US6004813A/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-05-11 KR KR1019970708022A patent/KR100449677B1/ko not_active Expired - Lifetime
- 1995-05-11 ES ES95919438T patent/ES2220929T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-05-11 WO PCT/EP1995/001778 patent/WO1996035782A1/en not_active Ceased
- 1995-05-11 JP JP53368396A patent/JP4173539B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1995-05-11 AU AU25267/95A patent/AU715125B2/en not_active Expired
- 1995-05-11 CA CA2220433A patent/CA2220433C/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-05-11 DE DE69533264T patent/DE69533264T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-05-11 DK DK95919438T patent/DK0824588T3/da active
- 1995-05-11 EP EP95919438A patent/EP0824588B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-05-11 RU RU97120584/13A patent/RU2205874C2/ru active
- 1995-11-05 UA UA97126018A patent/UA63888C2/uk unknown
-
1996
- 1996-05-06 IL IL11815896A patent/IL118158A/en not_active IP Right Cessation
- 1996-05-07 ZA ZA963593A patent/ZA963593B/xx unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ZA963593B (en) | 1996-11-25 |
| DE69533264T2 (de) | 2004-11-25 |
| US6004813A (en) | 1999-12-21 |
| CA2220433C (en) | 2010-02-16 |
| DE69533264D1 (de) | 2004-08-19 |
| JPH11504816A (ja) | 1999-05-11 |
| EP0824588A1 (en) | 1998-02-25 |
| AU2526795A (en) | 1996-11-29 |
| ES2220929T3 (es) | 2004-12-16 |
| ATE271128T1 (de) | 2004-07-15 |
| IL118158A (en) | 2004-07-25 |
| WO1996035782A1 (en) | 1996-11-14 |
| EP0824588B1 (en) | 2004-07-14 |
| CA2220433A1 (en) | 1996-11-14 |
| JP4173539B2 (ja) | 2008-10-29 |
| DK0824588T3 (da) | 2004-08-16 |
| MX9708663A (es) | 1998-02-28 |
| KR100449677B1 (ko) | 2004-11-20 |
| RU2205874C2 (ru) | 2003-06-10 |
| KR19990014681A (ko) | 1999-02-25 |
| AU715125B2 (en) | 2000-01-20 |
| IL118158A0 (en) | 1996-09-12 |
| HK1016213A1 (en) | 1999-10-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| UA63888C2 (en) | Nucleotide sequence, able to inhibit activity of il-6, use thereof for therapy, plasmide vector and pharmaceutical composition (alternatives) containing this nucleotide sequence | |
| Goldberg et al. | Activation of protein kinase C or cAMP‐dependent protein kinase increases phosphorylation of the c‐erbA‐encoded thyroid hormone receptor and of the v‐erbA‐encoded protein. | |
| Kappler et al. | Insect immunity. Two 17 bp repeats nesting a kappa B‐related sequence confer inducibility to the diptericin gene and bind a polypeptide in bacteria‐challenged Drosophila. | |
| MXPA97008663A (en) | Activity inhibitor i | |
| KR0148782B1 (ko) | 유전자 발현에 영향을 주는 다수의 표적반응요소를 가진 벡터 | |
| JP2011225571A (ja) | Ｍｄｍ２タンパク質の腫瘍原活性のアンタゴニスト及び癌治療におけるその使用 | |
| JP2001299373A (ja) | ｅｒｂＢ−３ポリペプチドをコードするＤＮＡセグメント、前記ポリペプチドを検出するための抗体及びバイオアッセイ | |
| Cameron et al. | Inhibition of gene expression by a short sense fragment | |
| Hillman et al. | Fragile XE-associated familial mental retardation protein 2 (FMR2) acts as a potent transcription activator | |
| JPH09510346A (ja) | 哺乳動物細胞における新生物形質転換の制御に関連する遺伝子および遺伝学的因子 | |
| Falzon et al. | Multiple protein-binding sites in an intracisternal A particle long terminal repeat | |
| KR102092981B1 (ko) | 조절된 유전자 발현 방법 | |
| Nakamura et al. | Cytokine receptor common β subunit-mediated STAT5 activation confers NF-κB activation in murine proB cell line Ba/F3 cells | |
| Piatak et al. | Sequences locating the 5'ends of the major simian virus 40 late mRNA forms | |
| Mehra-Chaudhary et al. | Msx3 protein recruits histone deacetylase to down-regulate the Msx1 promoter | |
| US5981188A (en) | Method for identifying agents that modulate transcription of human cytomegalovirus polymerase | |
| US20030083482A1 (en) | Compositions and methods for p53-mediated repression of gene expression | |
| Jacquemin-Sablon et al. | Organization of the unrl N-ras locus: characterization of the promoter region of the human unr gene | |
| Shore et al. | Structural alterations in the carboxyl-terminal domain of the BCRABL gene product activate its fibroblastic transforming potential. | |
| Nakshatri et al. | Activity and enhancer binding factors for BK virus regulatory elements in differentiating embryonal carcinoma cells | |
| US20060257367A1 (en) | Tumour-cell specific gene expression and its use in cancer therapy | |
| Son et al. | ATF is important to late S phase-dependent regulation of DNA topoisomerase IIα gene expression in HeLa cells | |
| CA2227306A1 (en) | Manipulation and detection of protein phosphatase 2c - pp2c.alpha. - expression in tumor cells for cancer therapy, prevention and detection | |
| Canalis et al. | https://www. jbc. org/cgi/doi/10.1074/jbc. RA119. 011440 The latest version is at | |
| DiPietro et al. | 332. Routes of Ligand Administration That Give Efficient and Robust In Vivo Induction with the RheoSwitch® Therapeutic System |