JPH11505015A - 多毛管蛍光検出システム - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 複数の試料体積を連続的かつ繰り返し走査し、各試料体積から放出する電磁放射線を検出する検出システムが記載されている。このシステムは、それぞれが試料体積を含む、同一面において並列な複数の毛管と、電磁放射線線源と、電磁放射線を受け止めかつ反射するように整列されたミラーと、ミラーを移動させるための手段と、試料体積から集められた電磁放射線を受け入れるように整列された検出器とを含む。操作に際し、ミラーを移動するための手段が、電磁放射線源からの電磁放射線を受け止めかつ電磁放射線を連続的にかつ繰り返し、試料体積に反射するようにミラーの位置を調整する。試料体積から放出された電磁放射線は集められ、電磁放射線の試料との相互作用に応答して信号が発生される検出器に導かれる。

Description

【発明の詳細な説明】 多毛管蛍光検出システム 発明の分野 本発明は、分離された被検体を検出するための毛管電気泳動検出システムおよ び方法に関する。特に、本発明は、高感度で蛍光を迅速かつ連続的に検出するこ とができる高処理量型の多毛管蛍光検出システムに関する。 関連技術の説明 毛管電気泳動は分析および生物医学上の研究で広範な適用を見出し、また、毛 管電気泳動は、合成ポリヌクレオチド、ＤＮＡ塩基配列決定フラグメント、ＤＮ Ａ制限フラグメント、アミノ酸、ダンシルアミノ酸の光学異性体、および、タン パク質、ウイルスおよび細菌の分離を含む荷電種の高速分離および分析に用いら れている、ミセル界面動電毛管クロマトグラフィ、等電点電気泳動およびオンカ ラム誘導は全てＣＥカラムで実行することができる。 ＣＥの利点は、小さい内径（20-200μｍ）の毛管の使用により現れる。小径の 融解石英製毛管に沿って、非常に高い電場を印加することができる。前記荷電種 の電気泳動速度は、印加された電場に比例することから、ＣＥは迅速な高分離度 分離を実行することができる。ジュール熱により少なからぬ熱が発生する。しか し、冷却システムと関連して使用すれば、毛管内通路の容積に対する大きい表面 と、薄い毛管壁（50-150μｍ）の使用とが急速な熱の散逸を可能にする。 近年、自動ＤＮＡ塩基配列決定が広範な注目を引いている。塩基配列決定反応の 間に生じた生成ＤＮＡフラグメントを分離すべく、ＤＮＡの鎖を塩基配列決定す るための現在の方法は、典型的に、サンガー・クールソン型化学反応と電気泳動 法とを適用する。毛管電気泳動と、特にレーザ誘導蛍光と組み合わされたＣＥ（ ＣＥ-ＬＩＦ）の検出とは迅速な荷電種の被検体の分離と、高検出感度とを提供 するため、それは、ＤＮＡの塩基配列決定における分離技術として、特に興味深 いレーザ誘導蛍光を利用するため、今日のＤＮＡ塩基配列決定反応のあるものは 蛍光で標識をつけたフラグメントを必要とし、また、ＣＥ-ＬＩＦ技術を用いる 塩基配列決定反応生成物を分離し、検出する。 ＣＥ分離は迅速であるが、ＤＮＡ塩基配列決定に基づくＣＥに関連する処理量 は、一般に、単一の毛管が分離システムを形成する従来のスラブゲルの処理量よ り少ない。 この制限を解消すべく、所望の処理量を達成するために多数の毛管を平行にし て用いることが提案されている。もちろん、多数の別個の光源および検出器エレ メントの組み合わせにおいて使用されるときは、処理量を増大する多数の毛管の ＣＥシステムは高価で扱いにくいシステムとなる。さらに、多波長モニタリング の要求が追加されるとき、前記別個の光源／検出器エレメントを取り入れること は、また、さらに複雑なものとなる。 共焦点蛍光スキャナを利用する多毛管ＣＥ-ＬＩＦシステムが米国特許明細書 第5,091,652号および第5,274,240号に記載されている。これらのスキャナは、レ ーザの光路を横切る毛管の配列（アレイ）における各毛管を連続的に移動させる ことに依っている。選択的に、全光学ヘッドを「掃引」走査で毛管の配列を横切 らせることが提案されている（HPＣＥ Meeting，San Diego，1994）。これらの 方法は、１の毛管が前記光源から移動され、また、次の毛管が前記光源に移動さ れるように、比較的重いシステム要素の移動を必要とする。必然的に、前記シス テム要素の移動に多大の時間を浪費する。これらのシステムに固有の遅れ時間の 結果として、有益な分離情報を逃すおそれがある。さらに、前記光源は各毛管内 に含まれる試料体積の最適部分上に存しないが毛管を横切って連続的に走査され るため、蛍光システムに起因すると考えられる検出感度はいくぶん信頼性に欠け る。 さらに、前記従来の多毛管検出システムでは比較的重量のある構成要素が移動 されているため、機械を動かす勢いが前記光源または検出器に関して前記毛管を 次第に整列しないようにする可能性がある。時間遅れの問題と同様、誤った整列 は、情報の損失および/または感度の低減および検出限界の増大を導く。また、 前記毛管の移動に必要な前記モータおよび機構は、前記スキャナの製造に関する コストの追加をもたらす。 したがって、高処理量の分離システムに関して用いられる経済的で高感度、安 定性ある丈夫なシステムが提供されることが望まれる。また、多数の毛管のＣＥ -ＬＩＦシステムに関して用いられる自動検出システムが提供されることが望 まれる。このようなシステムは、多数の励起波長を提供し、また、単一の検出器 を用いて多数の放出波長を検出する能力を有する。 発明の概要 発明は次の発見、すなわち単一光源からの電磁放射線は、単一の検出器による 試料体積内の試料の連続的および反復的検出を許すように、複数の近接して配置 された毛管のそれぞれにおける試料体積に向けることができる、という発見に基 づく。試料体積を電磁放射源に対して連続的に移動させることを求める従来の多 試料検出システムと異なり、本発明は、電磁放射線をミラーから、階段方式で各 毛管と関連する試料体積に連続的に反射させることを含む。有利なことに、本発 明の検出システムは、大きいシステム要素を移動する必要性をなくし、また、予 め設定された時間、選択された試料体積上に前記電磁放射線を維持することを可 能とする、その結果、改良された検出感度と、より経済的なまた物理的に安定な システムが得られる。 したがって、本発明は、連続してかつ繰り返して複数の試料体積を走査し、ま た、各試料体積から放出する電磁放射線を検出するためのシステムを提供する。 このシステムは、それぞれが試料体積を含む、共通の平面内にある複数の並列試 料チャンネルと、電磁放射線源と、電磁放射線を受け止めかつ反射するように整 列されたミラーと、前記ミラーを移動するための手段と、前記試料体積から集め られた電磁放射線を受け入れるように整列された検出器とを含む。操作の際、前 記ミラーの移動手段は、前記ミラーが、前記電磁放射線源からの電磁放射線を受 け止めかつ前記電磁放射線を連続的にかつ繰り返し前記試料体積に反射するよう に位置決められるように、前記ミラーの位置を調整する。前記試料体積から放出 された放射線は検出器に集められかつ向けられ、ここで、前記試料との前記電磁 放射線の相互作用に応答して信号が発生される。 好ましい実施例では、前記試料チャンネルは、毛管アレイを形成するように共 面配列形態に整列された毛管電気泳動カラムからなる。各毛管カラム内の試料体 積は、電気泳動媒体上で分離される蛍光標識化試料を含む。前記試料を励起させ るため、前記ミラーは、前記源からの特定の波長の励起放射線を受け止めかつ所 与の毛管の中心に前記励起放射線を反射するように整列される。この励起放射 線は、蛍光標識化試料を励起し、前記試料との前記励起放射線の相互作用に応答 して信号が形成される検出器に集められかつ向けられる蛍光放出を生じさせる。 この操作は、前記アレイ内の各毛管カラムに関して連続的にかつ繰り返して行わ れる。本発明は、多数の毛管の使用を通して高処理量が望まれるレーザ誘導蛍光 検出との組み合わせに用いられる毛管電気泳動システムにおける特別の適用を有 する。多くの適用が存在することは当業者において認識されているところである が、本発明は、ＤＮＡ塩基配列決定反応において得られる蛍光標識化ＤＮＡフラ グメントの分析に関連して、説明される。 本発明の他の特徴、観点および利点は、添付の図面および以下の詳細な説明に 関連して考慮されるとき、さらにより良く理解されよう。 図面の簡単な説明 図１は、本発明の多毛管検出システムの該略図である。図示のシステムは、単 一のレーザ励起放射線源と単一の蛍光放出を検出するための手段とに関連する。 図２は、走査ミラー、レンズおよび毛管アレイの向きの詳細図である。 図３は、放物面鏡およびアレイの概略図であり、また、毛管へ入る流体を制御 するための流体マニホルドを示す。 図４は、本発明の多毛管検出システムの概略図である。図示のシステムは、２ つのレーザ励起放射線源と、多数の蛍光放出を検出するための手段とに関連する 。 図５は、本発明の実施に有用なフィルタ輪の詳細を示す。 図６は、蛍光標識Ｄ₆₇₃の構造を示す。 図７は、本発明の検出システムを使用するための全体的なシステムのレイアウ トを示す。 図８は、ＤＮＡ塩基配列決定反応から得られたＤＮＡフラグメントを分析する ために本発明の検出システムを利用して得られた一組の電気泳動図である。 図９は、蛍光標識Ｄ₇₁₅の構造を示す。 図１０は、蛍光標識Ｄ₇₇₅の構造を示す。 図１１は、蛍光標識Ｄ₈₂₀の構造を示す。 図１２は、本発明の検出システムを用いて得られた４つの電気泳動図である。 これらの電気泳動図は、標識化プライマーを用いてＤＮＡ塩基配列決定反応で得 られた分離ＤＮＡフラグメントのものである。 図１３は、各蛍光標識からの放出についての複数組の並列データを得る間に４ つの異なる蛍光標識のそれぞれについて得られた蛍光の識別特性を示す。 図１４は、２Ｈzの走査速度での８毛管、４実験のタイミング図を示す。 発明の詳細な説明 本発明は、多数の分離チャンネルを含む高処理量電気泳動分離装置で使用する ための検出システムに向けられている。レーザ誘導蛍光検出は、典型的には、毛 管電気泳動分離に引き続く高感度検出を達成するための選択の方法であるため、 ここでの議論は、ＣＥ−ＬＩＦの実施例に限定する。紫外および可視検出を含む 多毛管検出システムの代案が等しく適用可能であることは当業者に明らかであろ う。 本発明の検出システムは、多数の毛管のアレイにおける各毛管に収容された試 料体積に、反射された励起放射線を連続的にかつ繰り返し移動させることを含む 。放出された蛍光は検出器に集められかつ届けられ、前記検出器は蛍光量によっ て定まる信号を発生する。前記励起放射線は、前記毛管を動かすことなしにすな わち前記放射線源を移動させて各毛管に向けられるため、大きいシステム要素は 移動されない。この特徴は、改良されたシステムの信頼性および検出感度を提供 する。 図１は、図２および図３と結合して、本発明の一実施例を示し、該実施例にお いては、毛管アレイ（配列）における各毛管内の試料体積中に含まれる分離され た試料を励起させるため、単一のレーザが使用されている。この実施例では、優 位な一の波長の放射線を提供するために単一の放射線源が用いられ、また、前記 一の波長で励起可能である単一の蛍光標識が前記試料に含まれている。図１を参 照すると、検出システム１０がレーザ放射線源１２と、走査手段１８上に据え付 けられたミラー１６と、集束レンズ２０と、同一平面上の８つの毛管の配列であ るアレイ２２と、検出器２８とを含む。レーザ光源１２は、走査手段１８によっ て位置決められるミラー１６に励起放射線１４を導き、その結果、励起放射線14 がミラー16から集束レンズ20へと反射される。図２において、集束レンズ 20が拡大して詳細に示され、該集束レンズが、前記アレイ内の選択された毛管の 中心の試料体積２１の内部に焦点を合わせるように反射励起光線17を導く。図１ に示す反射された励起放射線17は、前記試料体積内の蛍光標識化試料と相互作用 し、前記試料に放出蛍光放射線32の放出を生じさせ、該放出蛍光放射線は検出器 28に導かれまたは向けられる。検出器28は、放出放射線32の存在に応答して信号 を提供する。符号29で示す計算システムが、処理のために前記信号を受け取る。 放出放射線32の放出に引き続き、放射線１４が前記毛管アレイのそれぞれの毛 管の中心において前記試料体積に集中するように、スキャナ18がミラー16を介し て放射光線14を導く。このような方法で、前記アレイの各毛管の試料体積に励起 光線14が連続的に集中するように、スキャナ18と取り付けられたミラー16とが集 束レンズ20と結合して用いられる。 前記したところから、本発明の検出システムは、焦点を合わされた励起レーザ 光線を一方向に向けて、毛管アレイを横切るように走査し、ついで、前記ミラー をすぐに再配置し、これにより、前記ミラーが、前記励起光線が最初の毛管の中 心に集まるように整列される工程を含む走査原理を含む。ここで使用される「走 査工程」とは、前記励起光線源が、予め定められた時間、前記アレイの毛管上に 存し、次に、前記アレイにおける次の毛管へ急速に移動し、ここにおいてこれが 再び予め定められた時間、存することを意味する。前記予め定められた時間間隔 は、前記励起光線が前記アレイ中の毛管に焦点を合わされまた時間データが集め られる時間間隔または時間の計測を含む。データの収集は、各毛管の試料体積に ついての各予め定められた時間中に行われる。 ガルボ・スキャナの速度は、移動時間を最小にするとともに計測時間を最大に する。この分野の専門家は、この方法が、多数の毛管のアレイの全ての毛管が単 一のレーザ源と単一の検出器とのみを使用して扱われることを可能とすることを 理解するであろう。段階的走査モードが利用され、試料体積が焦点を合わされた 励起放射線を受けるため、最大のレーザ光量が各計測時間中に前記毛管の中心に 加えられる。 検出システム10は、優先的にまた追加的に、レーザ放射線源12とミラー16 との間に配置されたフィルタ34を含む。フィルタ34は、蛍光標識化試料の励起に 必要な波長以外の波長を有する、レーザダイオード放射線源12により与えられる 放射線を除くように機能する。フィルタ34は、加えて、望ましくない波長の放射 線により引き起こされる背景散乱を除去するのに役立つ。放出放射線32を集めか つ平行にし、放出放射線32を検出器28に導くため、本検出システムは、好ましく は、高補集率の放物面鏡36を含む。アレイ22の各毛管は、放物面鏡36の焦点の近 傍に配置されている。反射された励起放射光線17は、集束レンズ12から放物面鏡 36内に配置された開口38を通るように向けられる。各毛管からの蛍光放出放射線 32は放物面鏡36により集められ、放物面鏡36の出口開口39を通して、前記レーザ 光線が前記反射鏡に入る反対の側に向けられる。前記毛管アレイの軸線に直角な 平面内の毛管を取り巻く強烈なレーザ光線の散乱を遮るため、黒いバー４０（散 乱バー）が前記平面内に配置されている。前記蛍光放出線は一連のフィルタ３５ ，３７を通して導かれ、光電子増倍管28を用いて観察またはモニタされる。これ らのフィルタは、前記レーザ光源からのいかなる散乱または背景の励起放射線を も遮り、かつ、前記毛管内の励起された試料からの放出蛍光の伝導を可能とする 。 図３は、図１の前記放物面鏡をより詳細に示す。放物面鏡410内に配置された 毛管アレイ400が示され、また、散乱バー420の向きが示されている。フィルタ43 0,440と検出装置450とが、後に詳述する光子カウンタ460とスキャナ制御装置470 との関係において示されている。また、毛管電気泳動の流体マニホルド480を含 む流体管理システムの構成要素も後述する。 本発明によれば、放射線源12は、所望の放出波長または波長スペクトルを有す る電磁放射線の任意の源である。当業者は、所望の放出特性を得るために各蛍光 標識が異なる励起エネルギまたは励起波長を必要とすることを認識する。本発明 の目的のため、放射線源は、優先的に、前記試料中で蛍光を励起するのに適する 特徴的な励起波長を有するレーザダイオードである。スキャナ18は、ガルボスキ ャナ（galvo scanner）のような非常に小さい正確な運動が可能である装置とす ることができる。このようなスキャナは、これらが非常に急速で正確な運動が可 能である、定位置への回転運動サーボモータであるため、本発明の実施に特 に適する。ミラー16は、励起放射線14を受け止めかつ反射することができる平面 鏡である。 明確のためまた図１に示すように、この実施例は同一面上に並列に配置された ８つの毛管からなる毛管アレイを用いる。このアレイは、焦点を定められた励起 光線17が前記毛管の長さに対して直角であるように配置されている。前記毛管は シリカで形成されまた特定の適用に応じて変えることができる寸法を有する。適 切な毛管の寸法は毛管電気泳動方法で用いられる寸法に特有のものであり、20cm および500cm間の長さと、20μｍおよび500μｍ間の直径とを含む。好ましい毛管 は、50μｍの比較的大きい壁厚を有する。各毛管は、電気泳動領域にポテンシャ ルを与える単一の高電圧電源に接続されている。前記励起光線が前記試料体積に 入るためまた前記放出光線が前記試料体積を離れるため、各カラムは、ＣＥの適 用において用いられるシリカ製毛管に典型的である前記試料体積を取り巻く透明 な「窓」を含む。 本発明の実施に適する検出器は、限定されるものではないが、電荷結合素子、 電子なだれホトダイオード、ホトダイオードおよび光電子増倍管を含む、電磁放 射線から信号を発生するように使用される種々の装置のうちの任意のものからな る。好ましい検出器は、光子計数モードで操作される光電子増倍管である。選択 的に、直流平均化検出の形態を本検出システムにおいて用いることができる。直 流平均化検出は、ゲート時間で適当な信号割り当てを行うには十分早いが、実験 に基づく光電流からの正確なＤＣ光レベルの取り出しを可能とするに十分に長い 時間定数を未だ保つ増幅器バンド幅を含む。この検出モードは光子計数の成果を 提供しないが、多少のコスト削減を提供する。直流平均化は、また、ＤＮＡ塩基 配列決定より過度の要求が少ない適用について、高い光レベルでの優れた成果を 提供する。 本発明の他の実施例は、蛍光放出の波長により互いに異なる多数の試料を検出 することを含む。この実施例は、２以上の蛍光標識の使用と、２以上の波長の蛍 光放出を励起しかつ検出する能力とを含む、４つの異なる蛍光染料まで明確にす るため、異なる励起波長と放出波長とを有するこれらのそれぞれが前記検出シス テムに組み入れられている。予想されるように、多数の蛍光標識を励起させる 能力は、必要とされる全範囲の励起放射線波長を提供するために１以上の励起放 射線源を必要とする。同様に、多数の放出放射線波長を検出するための能力は、 特定の波長の放出放射線が特定の時間間隔で前記検出器において利用可能である ように、正確に計時されたフィルタ移動が必要である。 ここに記載した多毛管および多波長検出システムは、４つのヌクレオチド塩基 のそれぞれがその独自の蛍光標識の放出波長により特定されるＤＮＡ塩基配列決 定反応において得られるＤＮＡフラグメントを検出するための特定の適切なシス テムを提供する。４つの色のＤＮＡ塩基配列決定反応と、該反応から生じるＤＮ Ａフラグメントの次の分離は既知であり、ここではその詳細を議論しない。 ４色のＤＮＡ塩基配列決定反応における使用に適する検出システムを示す概略 が図４に示されている。図４の検出システム100は、異なる波長の２つの励起放 射光線130,132を提供するために２つのレーザ光線源110Ａ，110Ｂを必要とする ４つの異なる蛍光標識の検出を意図する。レーザ光線源110Ａは、第１および第 ２の蛍光染料に起因すると考えられる試料蛍光を励起させることができる。同様 に、レーザ光線源110Ｂは、第３および第４の蛍光染料に起因すると考えられる 試料蛍光を励起することができる。 操作の間、レーザ励起放射線源110Ａが作動され、結合ミラー134がレーザ励起 光線130を線源110Ａからミラー136上に導く。前記したように、反射された励起 光線137は集束レンズ138と放物面鏡160の開口139とを経て毛管アレイ140内の最 初の毛管の試料体積に至る。前記最初の毛管の試料体積からの蛍光放出放射線は 集められ、フィルタ輪120を通過する。図５は、フィルタ輪120の正面図を提供す る。図４および図５を参照すると、放出放射線は、レーザ光線源110Ａの波長で 光を遮るようにかつ前記最初の蛍光染料により放出された蛍光を伝導するように 選択された最初（第１）のフィルタ170に通される。前記第１のフィルタ170によ り伝導された蛍光は検出器150で検出され、処理のために計算手段160に伝えられ る。次に、モータ121がフィルタ輪120を回転させ、二番目（第２）のフィルタ17 2を蛍光放出光線中におく。第２のフィルタ172は、レーザ光源110Ａの波長の光 は遮るが、第２の蛍光染料により放出される蛍光は通すように設計されている。 第２のフィルタ172により伝導され た蛍光は検出器150により測定される。 検出器150が、前記アレイの最初の毛管内の前記第１および第２の蛍光染料に 起因すると考えられる蛍光放出を検出した後、レーザ光源110Ａの動作が停止さ れ、レーザ光線源110Ｂが稼動される。該レーザからの光線は、前記したように 、前記最初の毛管上に導かれる。励起された毛管からの蛍光が集められ、レーザ 光源110Ｂへの切り替えと同期して適所に回転されるフィルタ輪120に配置された 三番目（第３）のフィルタ174を通過する。第３のフィルタ174は、レーザ光源11 0Ｂの波長において励起放射線を遮るが、第３の蛍光染料の蛍光放出放射線を通 すように設計されている。前記第３のフィルタにより伝導された蛍光放出線は検 出器150で検出され、その検出信号が処理のために計算手段（図示せず）に伝え られる。次に、モータ121がフィルタ輪120を回転させ、四番目（第４）のフィル タ176を前記蛍光放出放射光線中におく。第４のフィルタ176は、レーザ光源110 Ｂの波長の光は遮るが、第４の蛍光染料による蛍光放出光線は通すように設計さ れている。前記第４のフィルタにより伝導された蛍光は測定される。 ４つの染料のそれぞれに対応する測定が行われた後、レーザ光源110Ｂの稼動 が停止され、ミラー135が、反射された励起放射光線137を前記アレイの二番目（ 第２）の毛管上に導くようにガルボ・スキャナ135がミラー136を移動し、前記第 １のレーザ光源が稼動を停止される。 前記４つの染料のそれぞれについての測定が前記第２の毛管において行われる まで、前記した順序が繰り返される。この順序は、前記アレイの毛管のそれぞれ について繰り返される。前記アレイの毛管のそれぞれにおける４つの染料のそれ ぞれについての測定が行われた後、前記ガルボ・スキャナが、ミラー136が反射 された光線を前記アレイの第１の毛管上に導くべく配置されるように、ミラー13 6を移動させる。次に、データの収集が完了するまで、全部の順序が繰り返され る。フィルタ輪120 当業者には、前記した説明が、毛管アレイに含まれる多数の毛管のそれぞれに おける多数の蛍光染料のそれぞれについての検出データを有利に提供することが 理解されよう。各蛍光信号は、前記ガルボ・スキャナの位置決めを前記光子カ ウンタのゲート周期と同期させることにより、そのそれぞれの毛管に割り当てら れる。この方法では、各試料体積中の前記蛍光試料の位置および同一性は、前記 分析順序の間のどの時間間隔においても確認することができる。ガルボ・スキャ ナ、ミラーおよび集束レンズの組み合わせは、急速な試料体積の励起および検出 を可能にする。実際、全４つの波長に関する各毛管におけるデータを集めるため に必要な時間の長さは1/1000秒より小さく、400/1000000秒のオーダにある。フ ィルタ輪の回転は、前記検出器に対し、予め定められた時間間隔における所望波 長の放射線を濾光しかつ通すための便利な手段を提供する。他のフィルタ手段は 、限定されるものではないが、本発明の実施には、調子を合わせることができる 液晶フィルタが適当である。このような調子を合わせることができる液晶フィル タは、これが伝導機能に対して変更および/または追加の便宜を図ることができ るため、興味ある濾光選択である。これは、また、前記光学システムの回転要素 を除去する。 光電子増倍管および回転フィルタは、ホトダイオードまたは電荷結合検出器（ ＣＣＤ）のいずれかと結合した回折格子と置き換えることができる。 また、光の発出および蛍光の補集についてのいくつかの代案もまた本発明にお いて使用されることに留意されるべきである。これらの代案は、専用のレーザお よび各毛管のための検出器の使用、画像光学、発散エレメントおよびＣＣＤ（電 荷結合素子）のアレイ検出器の使用、励起のための光ファイバ切替え装置の使用 、励起のためのバイナリ光学ビームスプリッタの使用、波長可変の液晶発光フィ ルタの使用、および、励起のための回転フェーセットミラーの使用を含む。 前記したように、試料成分がこれらの電気泳動分離に引き続いて容易に検出さ れ得るように標識として前記試料成分に付することができる蛍光染料は、本発明 における使用に有益である。所与の適用のための蛍光染料の選択は、関心のある 試料成分、検出システムの形態、特定のレーザおよび検出器の利用可能性等に依 存する。典型的には、蛍光標識はその励起要件および発光または放出特性に合う ように選択される。さらに、前記蛍光標識または標識の組み合わせの異なる特性 に合わせて、異なるレーザおよびフィルタまたはレーザおよびフィルタの異なる 組み合わせが求められることは、当業者には明らかであろう。理想的には、本 発明の多蛍光染料システムで利用される蛍光標識は、共通の励起放射線波長を利 用することができるものであり、また、これらの分析が可能であるように十分に 異なる波長の放出放射線を提供するものである。蛍光標識および標識付け化学は この分野で周知のことであり、また、ここではさらに詳説することはしない。種 々の蛍光染料および蛍光標識が商業的に入手可能であり、多くの場合、これらは 活性化形態で購入することができる。これは、試料の電気泳動分離に先立つ該試 料への付着のための調整手段を提供する。有利なことに、本発明の検出システム は、各毛管が前記レーザ励起光線および検出器に関して最適な位置にあるように 前記毛管を整列させるように使用することができる。参照によりここに組み入れ られている同時係属米国出願番号08/409,557がこのような整列方法を記載してい る。本発明において使用される毛管が前記参照特許出願において教示された方法 に従って整列されると、これらは十分な時間、整列を維持される。これは、前記 毛管を走査するために大きい構成要素を移動させることに依存しないためである 。このような大きい移動は構成部品の誤整列をしばしば生じさせ、これが、感度 の低下を招き、また信号の全損に導くことがある。 先に説明したように、本発明の好ましい適用は、サンガー・クールソンＤＮＡ 塩基配列決定反応化学から生じる蛍光で標識付けられたＤＮＡフラグメントの分 析である。ＣＥに基づく分離をＤＮＡ塩基配列決定への適用に成功裏に適用する ため、非常に低い検出限界が求められることは、当業者には理解されよう。本発 明は、これらの低検出限界を提供し、また、高い試料処理量の有利な結果に導く 。 ＤＮＡ塩基配列決定に基づくＣＥ／ＬＩＦを使用すると、10pＭ（１兆分の１ モル）内の範囲の蛍光標識濃度の検出限界を示し得る光学システムが、標準規模 の配列決定反応から引き出す順序を与えるのに十分な信号対雑音比を有する電気 泳動図を生じさせる。以下の実例において、信頼性のあるＤＮＡ塩基配列決定デ ータを提供する本検出システムの能力が示される。 実例 １ この実験では、本発明の多毛管検出システムの性能が、ＤＮＡサンガー・クー ルソン塩基配列決定反応から得られたＤＮＡフラグメントの分析において明ら かにされる。配列決定反応は、Ｄ₆₇₃として知られた標識化された蛍光を含むプ ライマのヌクレオチドを利用することを含む。Ｄ₆₇₃の構造は図６に示されてい る。この蛍光標識は、約639nmの励起放射線で励起され、その発光または放出放 射線の最大は673nmで生じる。 前記実験を行うために用いられるシステムは、図７に一般的なレイアウトの形 態で示されている。赤色ダイオードレーザ200(639nm、1.3mＷ、モデルＴＳＸ-1 、Ｕniphaseより購入)の出力光線がレーザ線路フィルタ210（640nm、７nmＦＷＨ Ｍ(全幅、最大の半分)Ｂarr Ａssociatesより供給）を介して方向付けられ、ま た、ガルバノメータスキャナ240（モデルＧ120ＤＴ、Ｇeneral Ｓcanning Ｉnc. により供給されている。）の回転制限駆動軸に固定された小さい鏡230（モデル Ｍ0540Ｖ、Ｇeneral Ｓcanning Ｉnc.により供給されている。）で９０°で反射 される。前記操作ミラーで反射された光線235は平凸レンズ240（モデル41340、 Ｏriel，Ｉnc.により供給されている。）を通るように方向付けられ、直径2．54 cm（１インチ）の放物面鏡250（モデル1587、カリフォルニア州 トーランスの Ｃarley,Ｉnc.により供給されている。）の側部にある開口245を通るように焦点 を合わせられている。この光線は、８つの融解石英製の毛管（ＴＳＰ100200、ア リゾナ州 フェニックスのＰolymicro Ｔechnologies,Ｉnc.により供給されてい る。）であって放物面鏡250の焦点に関して直線状のアレイ255に保持された毛管 の任意の一つの中心に焦点を合わされている。前記焦点を合わされた光線は前記 毛管の内径内を通り、前記反射鏡の反対の側部の第２の穴265を経て前記反射鏡 を励起する。 前記毛管の内径内で生じる蛍光の放出光線は、放物面鏡255により集められ、 平行にされる。前記放出光線は、符号260で一まとめにして示された一連の光学 フィルタ、すなわち（１）前記レーザ光の波長での高い拒絶性を有するロングパ スフィルタ（Ｂarr Ａssociates製の650nmロングパスカスタム）と、（２）バン ドパスフィルタ（Ｏriel，Ｉnc.製の680nm、10nm ＦＷＨＭ）とからなる光学フ ィルタを経て検出される。濾光された放出光は、次に、両凹レンズ（図示せず） を使用する縦形光電子増倍管270（Ｈamamatsuにより供給されるモデルナンバー Ｃ31034，ＲＣＡまたはモデル4632）上に焦点を合わされる。 光電子増倍管270は、光子計数モードで操作される。光電流パルスは、モデル ＳＲ445高速前置増幅器およびモデルＳＲ400弁別器（Ｓtanford Ｒesearch Ｓys tems,Ｉnc.により供給されている。）を用いて電圧に変換され、増幅され、識別 され、次に計数器(カウンタ)（Ｋinetic Ｓystemsにより供給されるモデル3615 ヘックススケール）に送られる。Ｄ/Ａ変換器の出力端（Ｋinetic Ｓystemsによ り供給されたモデル21112，12ビットＤＡＣ）を介した光子計数のゲートおよび ガルボ制御が、デジタル遅延/パルス発生器（Ｓtanfrd Ｒesearch Ｓystems Ｉn c.により供給されるモデルＤＧ535）を用いて同調または同期される。ＰＣコン ピュータとのコミュニケーションは、並列レジスタ(ＤＳＰ Ｔechnologies,Ｉnc .により供給されるモデルＰＲ-604）、ＣＡＭＡＣコントローラカード(ＤＳＰ Ｔechnologies,Ｉnc.により供給されるモデル6002)およびＰＣアダプタカード( ＤＳＰ Ｔechnologies,Ｉnc.により供給されるモデルＰＣ-004)を用いて行われ る。 ８毛管アレイ255が、放物面鏡250の下方に配置された高圧流体マニホルド（図 ７には図示せず）に接続されている。前記高圧流体マニホルドの配置は図３に示 されており、符号13で示されている。この流体マニホルドは、ゲル取り替えモー ドにおいて、ゲルシリンジポンプから前記毛管にポリアクリルアミド分離ゲルを 通し、あるいは、ゲル除去モードにおいて、前記毛管の端部を通して廃棄のため に出させる。また、流体マニホルド13は、ある意味では、高圧回路接地が前記マ ニホルド塊内の金属製フィッティングである「出口緩衝剤容器」としての役割を なす。前記毛管アレイの入口端部は、マイクロタイタ(microtiter)プレートの上 方に配置された毛管ハーネスに接続されている。高電圧電源285の出力端は、電 流モニタ室290内の８つの独立した通路に分けられている。データの取得は、周 波数を直接測定することにより、または、周波数−電圧変換を行い、次いで電圧 を測定することにより行われる。 前記検出システムは、2Ｈzのアレイ走査速度を得るために0.5秒ごとに毛管ア レイ走査を生じさせることにより操作される。パルス発生装置（図示せず）は、 ミラー230が新たな毛管に励起放射線を再び向けるように、前記ガルボスキャナ をトリガする各パルスで16Ｈzのパルス列を発する。前記パルス発生装置は、そ れぞれの新たなミラー位置に従う短時間の遅れを設定し、次に、各毛管のドエ ル時間について光子計数間隔をゲートする。表１にはこの実験のための適切なタ イミングパラメータが載っている。 ３つの理由から、操作の光子計数モードにおいて、近赤外線拡張光電子増倍管 270が用いられた。光子計数が、1000分の１秒当たりの光子のカウント数が100な いし400のオーダである分析システムで使用される光のレベルのための最良の結 果を与えるため、このモードが好ましい。また、光子計数が非常に早い検出モー ドであり、これが、検出信号が適当な毛管およびスペクトルチャンネルに迅速に 割り当て可能でなければならない走査の実行に容易に適合させる。第３に、光子 の計数は、ガルボ段階走査と同調させるために非常に都合のよい検出モードであ る。前記塩基配列決定反応から得られたＤ₆₇₃による標識化ＤＮＡフラグメント は、今説明したシステムに前記反応試料を入れることにより分離された。図８は 、前記ガルボ走査システムを用いて測定された８つの電気泳動図を示す。（毛管 ４は、電流がこの操作の早い時期に消失したため、このプロットに表示されてい ない。）これらの電気泳動図に示されたデータは、ＤＮＡ塩基配列決定フラグメ ントをサイズ範囲35ないし323塩基を超えて分離した結果を示す拡張されたスケ ールである。本発明の検出システムは優れた信号対雑音比を提供した。これらの 結果は、各毛管における試料体積に段階的に励起放射線を移動するための方法に 基づくガルボスキャナと組み合わされたこの実験に使用された走査パラメータが ＤＮＡ塩基配列決定フラグメントの高感度検出を提供することを示す。 この実験の経過の間、前記ガルボスキャナが、ここに記載された形態における １ないし８つの毛管の範囲を超えて非常に多目的に使用可能であることが証 明された。例えば、前記ガルボスキャナは、８つの全ての毛管または全ての特定 順番の任意数の毛管を走査することを必要としない。また、最適な使用率を維持 する間、任意数の毛管に向けるために順序のタイミングを変更することは簡単な 事項である。４つおよび８つの毛管の両アレイを提供することは、この方法を用 いる簡単な事項である。 ミラーの移動を正確に制御し、励起光線を毛管の試料体積に導く前記ガルボス キャナの能力は例外である。毛管から毛管への推移（200μｍの距離）に要する 時間は100万分の400秒であり、サイクルを繰り返すための帰還走査は1000分の１ 秒であった（毛管１から毛管８、または約１４００μｍ）。実際にガルボスキャ ナとミラーとを移動させるために使われる走査時間の割合は0.79％であり、これ に対し、試料のドエルとデータ収集とに使われる実際の時間の割合は99.24％で あった。 実例 ２ 次の実例は、本発明の検出システムを利用する４つの蛍光標識の検出を明示す る。重要なのは、この実験では、光子の計数検出のためのゲートする時間間隔が ４つのファクタのうちの少なくとも１つにおいて低減され、その結果、計測時間 の実質的な減少と、潜在的な性能低下とが生じた。前記４つの蛍光標識は、前記 のまた図６に示すＤ₆₇₃と、図９に示す、650nmのレーザラインで励起可能であり また715nmの放出放射線を有するＤ₇₁₅と、図10に示す、750nmのレーザ光で励起 可能でありまた775nmの放出放射線を有するＤ₇₇₅と、図11に示す構造を有し、75 0nmのレーザ光で励起可能でありまた820nmの放出放射線を有するＤ₈₂₀とを含む 。当業者には、これらの４つの蛍光標識の組み合わせが、２つのレーザ光源シス テムと単一の検出器とを用いて励起されまた検出される塩基配列決定反応から分 離されたＤＮＡフラグメントの検出を可能とすることは理解されよう。すなわち 、約650ないし750の範囲の励起放射を与える２つのレーザ光源を選択しかつ673n mから820nmまでの蛍光放出を検出することができる検出器を提供することにより 、本発明の検出システムは効果的に前記分離されたＤＮＡフラグメントを励起さ せかつ検出することができる。 予備的には、多数の蛍光標識を励起し、検出することは、各毛管のドエルの ための測定時間の低減を必要とするため、信号対雑音比に依存する、低減された 測定時間の効果が実例１で述べた単一の蛍光標識を用いて詳細に調べられた。こ れは、単一の蛍光標識実験と関連するゲートする時間間隔を、４つの蛍光標識実 験（約1000分の10秒）のそれを真似るために単に減少させることにより行われた 。 前記４つの蛍光標識試験システムは、図４に示すような光学レイアウトを有す る２つのダイオードレーザが励起放射線源として使用されたことを除き、図７に 示すものと類似のシステムにおいて行われた。加えて、図７に符号260で集合的 に示された前記フィルタは、図５に示すようなフィルタ輪で置き換えた。前記２ つのダイオードレーザは、Ｕniphaseにより供給された６５０nm、1.3mＷレーザ および同様にＵniphaseにより供給された７５０nm、1.3mＷレーザである。 実例１で説明したように、前記毛管の内径内で発生する蛍光放出線は、前記放 物面鏡により集められ、平行にされる。この放出線は、フィルタ輪に含まれた光 学フィルタを介して方向づけられる。前記フィルタ輪は４つの象限を含む。前記 象限のそれぞれは、次のように、異なるフィルタからなる。 象限１のフィルタは650nmのレーザ波長で高い除去性を有し、また、Ｄ₆₇₃によ り放出された蛍光の範囲で高い伝導性または透過性を有する。 象限２のフィルタは、650nmのレーザ波長で高い除去性を有し、また、Ｄ₇₁₅に より放出された蛍光の範囲で高い透過性を有する。 象限３のフィルタは、750nmのレーザ波長で高い除去性を有し、また、Ｄ₇₇₃に より放出された蛍光の範囲で高い透過性を有する。 象限４のフィルタは、750nmのレーザ波長で高い除去性を有し、また、Ｄ₈₂₀に より放出された蛍光の範囲で高い透過性を有する。 操作上、650nmレーザが毛管を照らすために作動され、また、前記フィルタ輪 がレーザ光線中に象限１をおくために回転される。次に、濾光された放出線が両 凸レンズを用いる縦形光電子増倍管の光電陰極に焦点を合わせられ、Ｄ₆₇₃に対 応する読み取りが行われる。次いで、前記フィルタ輪が、象限２が前記レーザ光 線中におかれるように回転され、Ｄ₇₁₅に対応する読み取りが行われる。次に、 前記650nmレーザがそのスイッチを切られ、750nmレーザがそのスイッチを入れら れる。次いで、前記フィルタ輪が、象限３が前記レーザ光線中におかれるように 回転され、Ｄ₇₇₅に対応する読み取りが行われる。次に、前記フィルタ輪が、象 限４が前記レーザ光線中におかれるように回転され、Ｄ₈₂₀に対応する読み取り が行われる。前記ガルボスキャナの操作のためのタイミングダイアグラムが図４ に示されている。 前記光電子増倍管は実例１で説明した光子計数モードで操作され、 また、全ての他の点において、前記毛管システムおよびマニホルドの操作は前記 したとおりである。 ＤＮＡフラグメントは、前記した４つの蛍光標識のそれぞれでオリゴヌクレオ チドプライマに標識付けを行うことにより、サンガー・クールソン型の塩基配列 決定反応において生じる。塩基配列決定をされたＤＮＡ鋳型はmＭ13mp18であっ た。分離されたフラグメントは、前記したシステム上にある。図12は、単一の毛 管から４つのチャンネルのそれぞれから得られた電気泳動図を示す。そのデータ は、本発明の検出システムが多数の蛍光標識の励起を生じさせることができ、ま た、これらの効果的な電気泳動分離と同時の同じ多数の蛍光標識の放出を検出す ることができることを明示する。 実例 ３ 多数の蛍光標識された被検体の識別における本発明の検出システムの性能を評 価するため、前記４つの蛍光標識（Ｄ₆₇₄，Ｄ₇₁₅，Ｄ₇₇₅，Ｄ₈₂₀）のそれぞれの 「識別特性」が得られた。前記識別特性は、本発明のシステムの前記フィルタ輪 が、残りの３つの蛍光標識に起因すると考えられる蛍光放出を除去する程度を示 す。前記実験は、2.6nＭのＤ₆₇₃、4.3nＭのＤ₇₁₅、6.9nＭのＤ₇₇₅および2.9nＭ のＤ₈₂₀の溶液を分析することを含む。 したがって、図13を参照すると、データが象限１における前記フィルタ輪での 測定時間の間に集められるとき、Ｄ₆₇₃が測定される。図13 は、象限１に集めら れたデータが優位的にＤ₆₇₃の信号であることを示す。同様に、象限２において 、前記信号が、優位的に、該データにより支持されるＤ₇₁₅信号である。1000分 の10.6秒当たりの高いカウント数から、この実験がこれらの蛍光標識の効果 的識別を明示し、また、Ｄ₆₇₃、Ｄ₇₁₅、Ｄ₇₇₅について１兆分の１モルの検出限 界を明示している。 明らかに、本発明の検出システムでのこれらの使用を伴う高感度検出は、これ らの蛍光標識が多毛管ＣＥ−ＬＩＦに基づく分離での使用に適していることを示 す。 ＤＮＡ塩基配列決定反応における共通の標識化方法は、蛍光標識でジデオキシ ターミネータを標識化することを含む。塩基配列決定反応から生じるＤＮＡフラ グメントは、次に、これらの終末において標識化される。前記４つ蛍光標識につ いて得られた前記データは、(Ｄ₆₇₃-ddＡＴＰ、Ｄ₇₁₅-ddＵＴＰおよびＤ₇₇₅-dd ＧＴＰ)のような標識化ジデオキシターミネータがＤ₆₇₃-ddＡＴＰおよびＤ₇₁₅-d dＵＴＰについて１兆分の１の検出限界で観察することができ、また、Ｄ₇₇₅-dd ＧＴＰについての20pＭ検出限界を達成することができる。有利なことに、これ らの蛍光標識が、サンガー・クールソン塩基配列決定反応に組み入れるジデオキ シターミネータに組み入れられ得ることは知られている。したがって、本発明の 検出システムにおけるこれらの使用を伴う前記高感度検出は、これらの蛍光標識 が、多毛管ＣＥ-ＬＩＦに基づく、本発明の検出システムを使用するＤＮＡフラ グメントの分離での使用に適することを示す。 本発明は、先に示しまた説明したおよび単に図示した特定の実施例に限定され ない。種々のまた多数の他の配列または装置が、当業者により、この発明の精神 および範囲から離れることなく工夫されよう。例えば、本発明の検出システムは 、燐光を発する標識、化学発光標識または電気化学発光標識に基づく検出に適用 可能である。 本発明の検出システムには、ＤＮＡ塩基配列決定反応から生じるＤＮＡフラグ メントの分離および検出に加えて、多数の適用における有用性がある。次の議論 において、多数の適用例が説明され、これらの全ては本発明の高い処理量および 検出感度特性により利益を受ける。 ここで説明した検出システムを備える高処理量のＣＥ−ＬＩＦのための１適用 例は、ＤＮＡ増幅生成物（例えば、ＰＣＲ生成物）の分析を含む、増幅されたＤ ＮＡの存在についての簡単な検定は、非特定のＤＮＡ増幅の可能性のため、受 け入れられない。 増幅されたＤＮＡの存在について分析するための最近の１方法は、ハイブリッ ド形成プローブの使用を含む。その多くの有利なハイブリッド形成にもかかわら ず、骨の折れる洗浄工程に時間を要し、また、液体操作のような自動化は精巧な 装置を必要とする。加えて、それらに与えられている前記プローブおよびフォー マットのコストはこのやり方を高価なものにする。本発明の高処理量検出システ ムを用いる自動化されたＣＥ−ＬＩＦによる直接のＤＮＡサイズの分析は、ハイ ブリッド形成に基づく検定より迅速であり、安く上がる。このような適用のため の本発明の検出システムの利用は、試料および標準が、これらを区別するために 異なる蛍光標識を用いて、並列に共に処理されることを可能にする。 本発明の高処理量の多毛管検出システムの他の有用な魅力ある適用は、ＨＬＡ タイピング(ＨＬＡ typing)に関する。ＨＬＡタイピングは、器官および骨髄の 移植と、配列特異プライマ(ＳＳＰ)がドナー当たり60ＰＣＲほどの反応を必要と することにより一般に特徴づけられた座の間の最適な識別とのために求められる 。したがって、分離、サイズの決定および遺伝子型の帰属を自動化することが大 いに望まれている。ＨＬＡ多形性も、また、法医学上の父性の決定および個の特 定のための有用なマーカーを提供する。 ＨＬＡタイピングに関する他の適用は、ハイブリッド植物分析において共通の 、多形性遺伝地図作成を経る遺伝子型である。この適用において、高多形性（異 なる固体間で長さがしばしば変わり得る）でありまたゲノム（例えば、好ましい 特質）の関心ある部分と関連する短い部分が特定され、また、前記可変部分の側 にある高度に保護された順序（全ての固体において同じである順序）にハイブリ ッド形成するプライマが前記可変部分を増幅するために用いられる。一組の多形 性位置から得られたサイズ情報は、雑種内の異なる遺伝子の親の起源についての 情報を提供し、また、さらなる分析のための個体の選定を可能にする。前記一組 の多形性位置は、並列に、高処理量を求めて、または異なる蛍光標識が各プライ マ対に用いられている場合は同時に（多重通信されて）、多色能力を求めて、分 析することができる。 法上の特定および遺伝スクリーニングにおけるＤＮＡ増幅の適用増大の趨勢 がある。しかし、これらのテストの多くの重大な関連は、結果の正確性に対する 過度の要求をならべる。増幅技術の有用性を確立する導入局面において、第２の 技術によりスクリーニングを介して得られる結果の確認が求められる。ＤＮＡ増 幅生成物のスクリーニングを介して得られる結果の最終確認は、問題の試料のＤ ＮＡの順序を直接に決定する。しかし、ＤＮＡの塩基配列を決定することは労働 集約的であり、日常の作業のために基礎的研究所を除き必要な多くの工程の自動 化が必要とされる。自動ゲル取り替えを有し、ここで説明した高処理量システム と結合された毛管を基礎とする装置は、これらの要求の多くを満たす。 研究利用に対する診療検定にＤＮＡを導入する利点の一つは、一般に、増幅生 成物が選別される通常の順序が既知であることである。これは、自動化された装 置に委ねられた要求を非常に少なくする。前記装置内にＤＮＡ配列の基準パター ンであって、後にスクリーニングにより選択されたＤＮＡ試料の塩基配列決定か ら選ばれるパターンと自動的に比較される基準パターンを作ることができること が期待される。２つのパターンにおける相違を認識するタスクは、未知の配列を 呼び出すことより困難は少ない。加えて、本質的に 同一である配列が繰り返し検査されるため、標識化プライマを使用することがで き、これが典型的に、他の標識化方法に比べて優れた配列決定結果を生じさせる 。 ＣＥ−ＬＩＦ検出を利用する同種の競合する免疫検定は、本発明の検出システ ムから潜在的利益をもつ他の適用である。競合する免疫検定は、次の式により一 般的に表わすことができる。 Ａg＋Ａg^★＋ＡＢ→Ａg-ＡＢ＋Ａg^★-ＡＢ＋Ａg^★ Ａg＝血清試料内の抗原（標本のためのジゴキシン） Ａg^★＝プローブ試薬として合成された標識化抗原 ＡＢ＝抗原に対する抗体（制限された量） より詳細には、また、ＣＥ−ＬＩＦ、ジゴキシン標識化テトラメチルローダミ ン（蛍光分子）による同種の競合する免疫検定の標本としてジゴキシン検定を使 用して、電荷搬送媒体としてオリゴヌクレオチドを使用して、免疫化学反応を精 査するための種として用いられる。ジゴキシンに対する抗体の付加が、Ａg^★-Ａ Ｂ複合体の形成物を生じさせる。ＬＩＦシステムを用いると、検出することがで き る２つの種、すなわち自由な蛍光標識化ジゴキシン（Ａg^★）と、蛍光標識化ジ ゴキシンに結合された抗体（Ａg^★-ＡＢ）とが存在する。医療環境では、多数の 試料が同時に分析され、本発明の高処理量特性により分析時間が低減され、また 、感度が高められる。 有利なことに、本発明は、モデルシステムとしてジゴキシンおよびテオフィリ ンを使用して例示することができる多数の被検体の免疫検定システムにおいて特 に有用である。生物学的流体中にジゴキシン(Ｄ)とテオフィリン(Ｔ)とを含む試 料は、ジゴキシン(Ｆab)とテオフィリン(Ｍ-Ａb)とに対する限定量の抗体を有す る蛍光標識化ジゴキシン(Ｄ^★)と蛍光標識化テオフィリン(Ｔ^★)に対して競合す る。Ｄ^★およびＴ^★の量は、前記生物学的流体中に存在するジゴキシンとテオフ ィリンとの量に直接関連する。当業者には、本発明の検出システムが、ＣＥ−Ｌ ＩＦ分離および検出を使用する多数の被検体検定において要求される高感度と高 い試料処理量とを提供することができることが理解されよう。 前記した本発明の特定の実施例の説明は、明確にするためまた記述のために表 わされている。これらは、完全であることまたは開示された正確な形態に本発明 を限定することを意図するものではなく、さらに、前記の教示に照らして多くの 変更および種類が有り得る。本発明の範囲はここに添付の請求の範囲およびこれ と均等のものにより規定される。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 複数の分析試料からの電磁放射線を検出するためのシステムであって、 それぞれが試料チャンネルの一部に閉じ込められた複数の試料体積と、 電磁放射線源と、 前記電磁放射線源からの電磁放射線を受け止めかつ該電磁放射線を前記試料体 積に反射するためのミラーと、 前記ミラーに取り付けられたスキャナと、 前記試料体積からの試料電磁放射線を検出するための検出器であって、前記試 料電磁放射線が前記試料と前記反射された電磁放射線との相互作用の結果として 生じたものである、検出器とを含む、検出システム。 ２ 前記試料のチャンネルが毛管カラムを含む、請求項１に記載のシステム。 ３ 前記毛管カラムが、同一平面内の複数の並列な毛管カラムを含む毛管アレ イを形成する、請求項２に記載のシステム。 ４ 前記電磁放射線源がレーザである、請求項１に記載のシステム。 ５ 前記スキャナがガルボスキャナである、請求項１に記載のシステム。 ６ さらに、前記試料体積からの前記試料電磁放射線を集めるための手段であ って、前記試料電磁放射線が前記試料体積と前記反射された電磁放射線との相互 作用の結果として生じたものである、集めるための手段を含む、請求項１に記載 のシステム。 ７ 前記集めるための手段が放物面鏡である、請求項６に記載のシステム。 ８ 前記放物鏡が、各試料体積と接触させるための前記反射された電磁放射線 の第１の入口開口を含む、請求項７に記載のシステム。 ９ 前記検出器が、光電子増倍管、電荷結合素子およびホトダイオードからな るグループから選ばれる、請求項１に記載のシステム。 １０ 蛍光標識を含む複数の分析試料からの電磁放射線を検出するためのシス テムであって、 それぞれが毛管カラムの一部内に閉じ込められた複数の試料と、 励起放射線源と、 前記励起放射線源からの前記励起放射線を受け止めかつ前記励起放射線を前記 試料体積に反射するためのミラーと、 前記ミラーに取り付けられたガルボスキャナと、 蛍光放出を集めるための手段であって、前記蛍光放出が前記蛍光標識と相互作 用する前記励起放射線の結果として生じたものである、集めるための手段と、 前記集めるための手段により伝導された前記蛍光放出を検出するための検出器 とを含む、検出システム。 １１ 前記毛管カラムが、空間に同一平面内で並列な関係で整列され毛管アレ イを形成する、請求項１０に記載のシステム。 １２ 前記励起放射線源がレーザである、請求項１０に記載のシステム、 １３ 前記集めるための手段が、前記反射された励起放射線を受け入れるため の第１の開口と前記蛍光放出を伝導するための第２の開口とを含む放物面鏡から なり、該放物面鏡が前記毛管アレイの周囲に位置する、請求項１０に記載のシス テム。 １４ さらに、選択された波長の励起放射線を前記ミラーに伝導するためのフ ィルタ手段を含む、請求項１０に記載のシステム。 １５ さらに、選択された波長の放出放射線を前記検出器に伝導するためのフ ィルタ手段を含む、請求項１０に記載のシステム。 １６ さらに、前記毛管アレイにより散乱された散乱電磁放射線を遮るための 手段を含む、請求項１０に記載のシステム。 １７ 蛍光標識を含む複数の分析試料からの電磁放射線を検出するためのシス テムであって、 同一平面内に並列関係に配置され毛管アレイを形成する複数の毛管カラムの一 部内にそれぞれ閉じ込められた複数の試料体積と、 少なくとも１つの励起放射線源と、 前記励起放射線源からの前記励起放射線を受け止めかつ前記励起放射線を前記 試料体積に反射するためのミラーと、 前記ミラーに取り付けられたガルボスキャナと、 前記毛管アレイを取り巻く放物面鏡であって、該放物面鏡が反射された励起放 射線を受け入れるための第１の開口と蛍光放出を伝導するための第２の開口とを 含み、前記蛍光放出が、前記蛍光標識と相互作用する前記励起放射線の結果とし て生じる、放物面鏡と、 それぞれが選択波長の放出放射線を伝導することができる複数のフィルタ手段 を含むフィルタ輪と、 前記放物面鏡により伝導された前記蛍光放出を検出するための検出器とを含む 、検出システム。 １８ さらに、前記毛管アレイの軸線に対して直角な平面内に配置された散乱 バーを含む、請求項１７に記載の検出システム。 １９ 前記検出器が光電子増倍管を含む、請求項１７に記載の検出システム。 ２０ さらに、前記検出器から受け入れた信号を処理するための計算手段を含 む、請求項１７に記載の検出システム、 ２１ それぞれが試料体積内に含まれる複数の試料の存在を検出する方法であ って、 検出システム、すなわちそれぞれが試料チャンネルの一部内に閉じ込められた 複数の前記試料体積と、電磁放射線源と、該放射線源からの電磁放射線を受け入 れかつ前記電磁放射線を前記試料体積に反射するためのミラーと、該ミラーに取 り付けられたスキャナと、前記試料体積からの試料電磁放射線を検出するための 検出器であって前記試料電磁放射線が前記試料と前記反射された電磁放射線との 相互作用の結果として生じる、検出器とを含む検出システムを準備すること、 前記電磁放射線源から前記ミラーに電磁放射線を送ること、 前記電磁放射線が前記ミラーから反射され、第１の試料体積上に焦点を合わせ るように前記ミラーを整列させるべく前記スキャナを操作すること、 前記反射された電磁放射線と前記試料との間の相互作用の結果として生じる試 料電磁放射線を前記検出器において検出することを含む、検出方法。 ２２ 前記検出工程に引き続き、さらに、前記電磁放射線が前記ミラーから反 射され、第２の試料体積に焦点が合わされるように前記ミラーを整列させるべく 前記スキャナを操作すること、 前記反射された電磁放射線と前記第２の試料体積内の試料との間の相互作用の 結果として生じる試料電磁放射線を前記検出器において検出することを含む、請 求項２１に記載の方法。 ２３ 一度にひとつが連続的に、前記電磁放射線が前記ミラーから反射され、 前記試料体積上に焦点を合わされ、また、前記試料電磁放射線が検出されるよう に前記ミラーを連続して繰り返されるように整列すべく、前記ガルボスキャナを 操作する、請求項２１に記載の方法。 ２４ さらに、前記電磁放射線が前記ミラーから反射され、前記試料体積上で 焦点を合わせるように前記ミラーを整列させるべく前記スキャナを操作する工程 を含む、請求項２３に記載の方法。 ２５ 試料体積内に含まれる各蛍光標識化試料の存在を検出するための方法で あって、 検出システム、すなわち同一面内に配列され毛管アレイを形成する複数の毛管 カラムの一部内にそれぞれ閉じ込められた複数の試料体積と、少なくとも１つの 励起放射線レーザ源と、前記励起放射線源からの励起放射線を受け入れ、該励起 放射線を前記試料体積に反射するためのミラーと、該ミラーに取り付けられたガ ルボスキャナと、前記毛管アレイを取り巻く放物面反射鏡と、前記試料と前記反 射された励起放出との相互作用の結果として生じる、前記試料体積からの蛍光放 出を検出するための検出器と、前記放物面反射鏡から前記検出器に選択波長の放 出放射線を伝導するための複数のフィルタを含むフィルタ輪とを含む検出システ ムを準備すること、 前記ミラーに励起放射線を送るために第１のレーザ光源を作動させること、 前記励起放射線が前記ミラーから反射され前記第１の毛管内の第１の試料体積 上で焦点を合わせるように前記ミラーを整列させるべく前記ガルボスキャナを操 作すること、 第１の波長を有しかつ前記反射された電磁放射線と前記試料との間の相互作用 の結果として生じる前記放出放射線を前記検出器において検出すること、 前記フィルタ輪を回転させること、 第２の波長を有しかつ前記反射された電磁放射線と前記試料との間の相互作用 の結果として生じる前記放出放射線を前記検出器において検出すること 励起放射線を前記ミラーに送るように第２の励起放射線源を作動させること、 および、 第３の波長を有しかつ前記反射された電磁放射線と前記試料との間の相互作用 の結果として生じる放出放射線を前記検出器において検出することを含む、検出 方法。 ２６ 毛管電気泳動システムであって、 毛管電気泳動アレイと、 蛍光標識化試料を励起させるための第１および第２の励起光源であって、前記 標識化試料が第１、第２、第３および第４の励起可能の標識を含み、前記標識化 試料が前記毛管電気泳動アレイの毛管内に含まれている、第１および第２の励起 光源と、 前記アレイ内の各毛管を連続的に照らすために前記励起光源からの反射光線を 移動させるためのスキャナに取り付けられたミラーと、 前記第１の励起光源の波長での妨害を示し、また、前記第１の励起可能の標識 から放出された信号のスペクトル領域での伝導を示す第１のフィルタと、 前記第１の励起光源の波長での妨害を示し、また、前記第２の励起可能の標識 から放出された信号のスペクトル領域での伝導を示す第２のフィルタと、 前記第２の励起光源の波長での妨害を示し、また、前記第３の励起可能の標識 から放出された信号のスペクトル領域での伝導を示す第３のフィルタと、 前記第２の励起光源の波長での妨害を示し、また、前記第４の励起可能の標識 から放出された信号のスペクトル領域での伝導を示す第４のフィルタと、 前記異なる毛管からの信号を受け入れるための手段であって、前記信号が前記 反射された光線と前記異なる毛管内に含まれた試料との相互作用の結果として生 じる、受け入れ手段とを含む、毛管電気泳動システム。