JPH11505124A

JPH11505124A - 組換えヒレグリンおよび受容体活性化後のその生物学的機能

Info

Publication number: JPH11505124A
Application number: JP8534976A
Authority: JP
Inventors: キュルースクー，ジャン−ミシェル; カールトン，ゲイリー・ダブリュー; アルフォ，アレハンドロ・エイ
Original assignee: ブリストル−マイヤーズ・スクイブ・カンパニー
Priority date: 1995-05-16
Filing date: 1996-05-14
Publication date: 1999-05-18
Also published as: EP0828843A1; CA2217020A1; WO1996036720A1; MX9708529A

Abstract

(57)【要約】用途の広い組換えヒレグリンの製造およびこれらタンパク質が受容体活性化後に誘起する生物学的機能の幾つかおよび細胞内シグナル伝達経路を開示する。ＨＲＧ−α、−β２または−β３のＥＧＦ様ドメインをコードするｃＤＮＡ断片の真核細胞発現ベクター中へのクローニングおよび該ベクターの哺乳動物細胞中へのトランスフェクションをも開示する。組換えヒレグリンはＨＥＲ４受容体を活性化するのに有用である。

Description

【発明の詳細な説明】組換えヒレグリンおよび受容体活性化後のその生物学的機能本発明は、用途の広い組換えヒレグリン（ＨＲＧ）の生成およびこれらタンパク質が受容体活性化後に誘起する生物学的機能の幾つかおよび細胞内シグナル伝達経路に関する。ヒレグリン（ＨＲＧ）は、ＨＥＲ４／Ｐ１８０^erbB4受容体に結合してそのチロシンリン酸化を引き起こすモザイク状の糖タンパク質である。ヒレグリン（ＨＲＧ）［ホームズ（Ｈolmes,Ｗ.Ｅ.）ら（１９９２）、Ｓcience ２５６、１２０５−１２１０］、ニューディファレンシエーションファクター（neu differen tiation factor）（ＮＤＦ）［ペレス（Ｐeles,Ｅ.）ら（１９９２）、Cell ６９、２０５−２１６；ウェン（Ｗen,Ｄ.）ら（１９９２）、Cell ６９、５５９ −５７２およびウェンら（１９９４）、Ｍol.Ｃell Ｂiol.１４、１９０９−１９１９］、グリア増殖因子（ＧＧＦ）［マーチオニ（Ｍarchionni,Ｍ.Ａ.）ら（１９９３）Ｎature ３６２、３１２−３１８］、およびアセチルコリン受容体誘導活性（ＡＲＩＡ）［フォールズ（Ｆalls,Ｄ.Ｌ.）ら（１９９３）Ｃell ７２、８０１−８１５］は、相同な多機能タンパク質である。ＨＲＧイソ形は、選択的な（alternative）ＲＮＡスプライシングにより単一の遺伝子から生じる。ＨＲＧｃＤＮＡは複数のドメインを有する大きな膜貫通前駆体をコードしており、これらドメインには、免疫グロブリン様ドメイン、幾つかのグリコシル化部位を有するスペーサードメイン、ＥＧＦ様ドメイン、種々の長さの膜近傍ドメイン、膜貫通領域および細胞質ドメインが含まれる。可溶性の成熟ＨＲＧは、タンパク質加水分解開裂により細胞表面から放出される。ＧＧＦ［マーチオニら（１９９３）Ｎature ３６２、３１２−３１８］およびＡＲＩＡ［フォールズら（１９９３）Ｃell ７２、８０１−８１５］は脳組織から単離されたが、ＨＲＧおよびＮＤＦには存在しないクリングル様ドメインをも含む。αおよびβＨＲＧイソ形は、ＥＧＦ様ドメインの第三ループおよび膜近傍ドメインにおいて配列の相違を示す。ＨＲＧのＥＧＦ様ドメインは、成長因子のＥＧＦファミリー［ＥＧＦ、カーペンター（Ｃarpenter,Ｇ.）ら（１９７９）Ａnn.Ｒev.Ｂiochem.、４８、１９３−２１６、トランスフォーミング成長因子α、デリンク（Ｄerynck,Ｒ.）ら（１９８４）Ｃell ３８、２８７−２９７、ワクシニアウイルス成長因子、ブロンキスト（Ｂlomquist,Ｃ.Ｉ.）ら（１９８４）Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ８１、７３６３−７３６７、アンフィレグリン（amphiregulin）、ショヤブ（Ｓhoyab,Ｍ.）ら（１９８９）Ｓcience ２４３、１０７４−１０７６、ヘパリン結合ＥＧＦ様成長因子、ヒガシヤマ（Ｈigashiyama,Ｓ.）ら（１９９１）Ｓcien ce ２５１、９３６−９３９、およびベータセルリン（betacellulin）、シング（Ｓhing,Ｙ.）ら（１９９３）Ｓcience ２５９、１６０４−１６０７］の特徴である６つのシステイン残基を含む。ＨＲＧはＥＧＦ様モチーフを含有するが、ＥＧＦＲ／Ｐ１７０^erbB1［ホームズら（１９９２）、Ｓcience ２５６、１２０５−１２１０］には結合しない。ＨＲＧは、最近単離された上皮細胞成長因子受容体ファミリーの成員であるＨＥＲ４／ｐ１８０^erbB4に結合する［プローマン（Ｐlowman,Ｇ.Ｄ.）ら（１９９３）Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ９０、１７４６−１７５０；クルスク（Ｃul ouscou,Ｊ.Ｍ.）ら（１９９３）Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.２６８、１８４０７−１８４１０およびプローマンら（１９９３）Ｎature（ロンドン）３６６、４７３−４７５］。このファミリーの他の成員であるＨＥＲ３／Ｐ１８０^erbB3受容体もまたＨＲＧの受容体であることが報告されている［カラウェイ（Ｃarraway,Ｋ.Ｌ.）ら（１９９４）Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.２６９、１４３０３−１４３０６］。ＨＲＧは、最初に提唱されたように［ホームズら（１９９２）、Ｓcience ２５６、１２０５−１２１０およびペレスら（１９９２）、Ｃell ６９、２０５−２１６］、ＨＥＲ２／ｐ１８５^erbB2受容体とは直接相互作用はしない。ＨＥＲ２／ｐ１８５^erbB2は、リン酸基転移またはＨＥＲ４および／またはＨＥＲ３とのヘテロ二量体形成によりＨＲＧ媒体シグナル伝達に間接的に関与する［プローマンら（１９９３）Ｎature（ロンドン）３６６、４７３−４７５およびカラウェイら（１９９４）Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.２６９、１４３０３−１４３０６］。ＨＲＧ／ＮＤＦがその受容体に結合すると、その結果としてヒト乳癌腫瘍細胞が分化することが示されており［ペレスら（１９９２）、Ｃell ６９、２０５− ２１６およびバカス（Ｂacus,Ｓ.Ｓ.）ら（１９９３）、Ｃancer Ｒes.５３、５２５１−５２６１］、細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）の発現をアップレギュレーションする［バカスら（１９９３）、Ｃancer Ｒes.５３。５２５１−５２６１］。ＨＲＧの生物学的作用は内在性のチロシンキナーゼ活性を有する受容体により媒体され、ＨＲＧ結合により自己リン酸化される［プローマンら（１９９３）Ｎature（ロンドン）３６６、４７３−４７５］。受容体チロシンキナーゼ、たとえば、上皮細胞成長因子受容体、血小板由来成長因子受容体およびインスリン受容体について行われた研究は、リガンド結合後の細胞内シグナル伝達における受容体の自己リン酸化の重要な役割を示している［ウルリッヒ（Ｕllrich ,Ａ.）ら（１９９０）Ｃell ６１、２０３−２１２およびホワイト（Ｗhite,Ｍ. Ｆ.）ら（１９９４）Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.２６９、１−４］。受容体チロシンキナーゼ上の特定の自己リン酸化部位が、Ｓｒｃホモロジー２（ＳＨ２）ドメインを含有する標的分子の認識構造として働くことが示されている。ＳＨ２ドメインは、種々のシグナル伝達分子および癌遺伝子タンパク質中に認められる約１００アミノ酸の保存された非触媒配列である［コッホ（Ｋoch,Ｃ.Ａ.）ら（１９９１）Ｓ cience ２５２、６６８−６７４およびソンギャン（Ｓongyang,Ｚ.）ら（１９９３）Ｃell ７２、７６７−７７８］。ＳＨ２ドメイン含有タンパク質は、特定のフランキングアミノ酸との関連でホスホチロシン残基に高親和性で結合する。たとえば、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）３'キナーゼ（ＰＩ３−Ｋ）のｐ８５サブユニット、ｐ２１ｒａｓＧＴＰアーゼ活性化タンパク質（ＧＡＰ）、およびホスホリラーゼＣγ（ＰＬＣ−γ）はＳＨ２ドメインを含むことが示されている。さらに最近では、見かけの触媒ドメインを欠き、シグナル伝達に関与するアダプター連結タンパク質として機能すると思われるＳＨ２ドメイン含有タンパク質が記載されている［ローウェンシュタイン（Ｌowenstein,Ｅ.Ｊ.）ら（１９９２）Ｃell ７０、４３１−４４２；ペリッチ（Ｐelicci,Ｇ.）ら（１９９２）Ｃell ７０、９３−１０４；イーガン（Ｅgan,Ｓ.Ｅ.）ら（１９９３）Ｎature （ロンドン）３６３、４５−５１；スコルニク（Ｓkolnik,Ｅ.Ｙ.）ら（１９９３）Ｓcience ２６０、１９５３−１９５５；ロザキス−アドコック（Ｒozakis−Ａdcock,Ｍ.）ら（１９９３）Ｎature（ロンドン）３６３、８３−８５およびゲール（Ｇale,Ｎ.Ｗ.）ら（１９９３）Ｎature（ロンドン）３６３、８８−９２］。その中の一つであるＳｈｃは、ＳＨ２配列に対するホモロジーに基づいてヒトｃ−ｆｅｓ遺伝子から同定およびクローニングされた［ペリッチら（１９９２）Ｃell ７０、９３−１０４］。ＳｈｃｃＤＮＡは、単一のＣ末端ＳＨ２ドメインとグリシンおよびプロリンに富むコラーゲン相同領域とを含む４６ｋＤａおよび５２ｋＤａの２つのタンパク質をコードすることが予測された。Ｓｈｃでは触媒ドメインは同定されなかった。抗Ｓｈｃ抗体は、広範囲の哺乳動物細胞で４６ｋＤａ、５２ｋＤａおよび６６ｋＤａの３つのタンパク質を認識することが示されている。種々の成長因子およびサイトカインがＳｈｃタンパク質のリン酸化を誘発することが示されている［プロンク（Ｐronk,Ｇ.Ｊ.）ら（１９９３）Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.２６８、５７４８−５７５３；ヨコテ（Ｙokote,Ｋ.）ら（１９９４）Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.２６９、１５３３７−１５３４３；ショーブ（Ｓchorb,Ｗ.）ら（１９９４）Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.２６９、１９６２６−１９６３２；カットラー（Ｃutler,Ｒ.Ｌ.）ら（１９９３）Ｊ．Ｂiol.Ｃhem.２６８、２１４６３−２１４６５；バーンズ（Ｂurns,Ｌ.Ａ.）ら（１９９３）Ｊ.Ｂiol.Ｃhe m .２６８、１７６５９−１７６６１およびダメン（Ｄamen,Ｊ.Ｅ.）ら（１９９３）Ｂlood ８２、２２９６−２３０３］。Ｓｈｃタンパク質の過剰発現は線維芽細胞においてトランスフォーメーションした表現型［ペリッチら（１９９２）Ｃell ７０、９３−１０４］、およびＰＣ１２細胞のニューロン分化と関連しており［ロザキス−アドコックら（１９９２）Ｎature（ロンドン）３６０、６８９−６９２］、Ｓｈｃが細胞増殖制御に関与することを強く示唆している。本発明は、用途の広い組換えヒレグリン（ＨＲＧ）の生成およびこれらタンパク質が受容体活性化後に誘起する生物学的機能の幾つかおよび細胞内シグナル伝達経路に関する。受容体結合にはＨＲＧのＥＧＦ様ドメインで充分であるので、本発明はＨＲＧ −α、−β２または−β３のＥＧＦ様ドメインをコードするｃＤＮＡ断片の、トロンビン開裂部位をコードする配列、ついでヒトＩｇＧ１のＦｃ部分をコードする配列を含む真核細胞発現ベクター中へのクローニングに関する。本発明はまた、組換え融合タンパク質ｒＨＲＧ−Ｔ−Ｆｃの製造にも関し、該組換え融合タンパク質は、キメラタンパク質として、またはトロンビン開裂および該分子のＦｃ部分の除去後のＥＧＦ様ドメイン（ｒｅＨＲＧ）として用いることができる。本発明は、いずれかの形態の組換えＨＲＧがＨＥＲ４受容体に結合し該受容体を活性化すること、およびＳｈｃタンパク質がＨＲＧ刺激後にチロシンリン酸化されることを示す。本発明はまた、ｒＨＲＧ−α−Ｔ−ＦｃがＨＥＲ４受容体を発現するヒト乳癌細胞に結合し、細胞間接着分子−１の発現を誘発することをも示す。さらに、ｒｅＨＲＧ−β２はＳｈｃタンパク質のリン酸化をチロシン上で顕著に誘発することから、これらアダプター分子のＨＲＧ媒体シグナル伝達における役割が示唆される。図１は、ｒＨＲＧ−Ｔ−Ｆｃ刺激後のＨＥＲ４受容体のチロシン自己リン酸化を示す。図２は、ｒＨＲＧ−α−Ｔ−ＦｃのＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞への結合を示す。図３は、ｒＨＲＧ−α−Ｔ−Ｆｃに応答したＩＣＡＭ−１発現の誘発を示す。図４は、ｒＨＲＧ−β３−Ｔ−Ｆｃのトロンビン開裂を示す。図５は、ｒｅＨＲＧに応答したタンパク質リン酸化の刺激を示す。図６は、ＨＥＲ４活性化後のＳｈｃタンパク質のチロシンリン酸化を示す。図７は、ヒレグリンアルファ融合タンパク質のヌクレオチドおよびアミノ酸配列（配列番号８および９）を示す。この特別のタンパク質において、ヌクレオチド塩基の対応は下記のとおりである。塩基領域１−１７８ＣＤ５シグナル配列１７９−３７３ヒレグリンアルファＥＧＦ様結合ドメイン３７４−４２４トロンビン開裂部位４２５−１１２９ヒトＩｇ定常領域本発明は、ＨＲＧの組換えＥＧＦ様ドメインの製造および該ドメインによって誘発される生物学的作用並びにＨＥＲ４シグナル伝達に関与する細胞内分子の同定に関する。好ましい態様において、本発明は、ＨＲＧ−α、−β２および−β ３のＥＧＦ様ドメインの、トロンビン開裂部位をコードする配列、ついでヒトＩｇＧ１のＦｃ部分をコードする配列をインフレームで含む真核細胞発現ベクター中へのクローニングに関する。さらに好ましくは、該ベクターは、該タンパク質の効率的なプロセシングおよび分泌を可能とするＣＤ５タンパク質のシグナル配列をさらに含む。該ベクターは哺乳動物発現ベクターである。本発明は、組換え融合タンパク質、ｒＨＲＧ−Ｔ−Ｆｃの発現を指令するキメラ遺伝子の製造に関する。該組換え融合タンパク質は、該ベクターを適当な宿主中にトランスフェクションすることにより大量に発現される。好ましい宿主は哺乳動物ＣＯＳ細胞である。これらタンパク質は、ＨＥＲ４／Ｐ１８０^erbB4のリン酸化を刺激することが示されている。得られた２価融合タンパク質は成長因子として有用である。なぜなら、該融合タンパク質は成長因子受容体を活性化するからである。これら融合タンパク質はまた、抗体のようにそのＦｃドメインにより検出されるうえでも有用である。該組換え融合タンパク質はまた、ＨＥＲ３受容体およびＨＥＲ４受容体の低分子量アゴニストまたはアンタゴニストを同定するための高処理量スクリーニングアッセイにおいても使用できる。高処理量スクリーニングアッセイには、試薬を用いたマイクロリットルウエルプレートにおける短時間での数百の化合物のスクリーニングが含まれる。このアッセイは、ロボット工学および自動装置の助けをかりて行われる。このアッセイは、スクリーニングしようとする化合物に依存して結合アッセイまたは酵素アッセイなどであってよい。本発明はまた、他の組換え成長因子、たとえば、上皮細胞成長因子、トランスフォーミング成長因子α、アンフィレグリン、ベータセルリン、ヘパリン結合上皮細胞成長因子、ワクシニア成長因子、クリプト（cripto）、インスリン成長因子、インスリン様成長因子、トランスフォーミング成長因子β、血小板由来成長因子、線維芽細胞成長因子、および神経成長因子を大量に製造するのにも有用である。本発明はまた、ｒＨＲＧ−Ｔ−Ｆｃ融合タンパク質のトロンビンプロテアーゼ開裂後の精製ＥＧＦ様ドメイン（ｒｅＨＲＧ）にも関する。これらｒｅＨＲＧは、ＨＥＲ４発現細胞においてタンパク質リン酸化を刺激することが示されている。本発明はまた、プロテインＡ−セファロースクロマトグラフィーにより融合タンパク質ｒＨＲＧ−Ｔ−Ｆｃを単一工程で精製する方法にも関する。本発明は、ｒｅＨＲＧ−β２がＳｈｃタンパク質のチロシン上でのリン酸化を顕著に誘発することを示す。このことは、これらアダプター分子のＨＲＧ媒体シグナル伝達における役割を示唆している。本明細書において使用する技術用語は、分子遺伝学の分野における当業者にはよく知られたものである。これら用語の定義は、分子生物学の分野における多くの教科書、たとえば、「遺伝子」、第２版、ベンジャミン・ルイス（Ｂenjamin Ｌewis）、１９８５、ジョン・ウイリー＆サンズ、ニューヨークに記載されている。本発明において用いた略語は以下のとおりである。略語の一覧表ＨＲＧヒレグリンＥＧＦ上皮細胞成長因子ＥＧＦＲＥＧＦ受容体ＨＥＲヒトＥＧＦ受容体ＮＤＦニューディファンレンシエーションファクターＡＲＩＡアセチルコリン受容体誘導活性ＧＧＦグリア増殖因子ｐ１８５^erbB2 ＨＥＲ２コードタンパク質ｐ１８０^erbB4 ＨＥＲ４コードタンパク質ＩＣＡＭ−１細胞間接着分子−１ＳＨ２Ｓｒｃホモロジー２ＣＨＯチャイニーズハムスター卵巣ＳＤＳ−ＰＡＧＥドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動ＢｅｓＮ,Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸ＰＢＳリン酸緩衝食塩水ｒＨＲＧ−Ｔ−Ｆｃ融合タンパク質を構築してＨＥＲ４／ＨＲＧ受容体／リガンドペアの生物学の種々の側面を研究するための用途の広い組換えＨＲＧを生成することは、以下のようにして行う：受容体結合にはＨＲＧ−β１のＥＧＦ様ドメインで充分であることが以前に示されているので［ホームズら（１９９２）、Ｓcience ２５６、１２０５−１２１０］、ＨＲＧ−α、−β２または−β３のＥＧＦ様ドメインがトロンビン開裂部位に結合し、ついでヒトＩｇＧ１抗体のヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域が結合し、タンパク質の分泌がＣＤ５のシグナル配列によって指令される可溶性タンパク質をコードする３つのキメラ遺伝子を構築する。ＨＲＧ−αのＥＧＦ様ドメインは成熟タンパク質の残基１７７〜２４１に対応し、一方、ＨＲＧ−β２のＥＧＦ様ドメインおよびＨＲＧ−β３のＥＧＦ様ドメインは、それぞれ残基１７７〜２３８および残基１７７〜２４１に対応する。これら３つの融合タンパク質、ｒＨＲＧ−Ｔ−ＦｃをＣＯＳ細胞中で一過性発現により調製し、培養上澄み液からプロテインＡ−セファロース上で精製し、３５０〜１９００μｇ／ｌの範囲の収量を得た。ＣＤ５シグナルペプチドは、ｒＨＲＧ−Ｔ−Ｆｃの効率的なプロセシングおよび分泌を可能にする。３つの融合タンパク質はすべて免疫グロブリンと同様のジスルフィド結合したホモ二量体として分泌され、それゆえ、それぞれ２つのＨＲＧ−ＥＧＦ様ドメインを提示することができる。ｒＨＲＧ−Ｔ−ＦｃがＨＥＲ４受容体に結合し該受容体を活性化するこができることを確立するため、ｒＨＲＧ−Ｔ−ＦｃがＨＥＲ４のリン酸化並びに形態学的変化およびＩＣＡＭ−１のアップレギュレーションを誘発する能力についての研究を行うのが好ましい。他の組換え成長因子をも大量に製造するため、他の成長因子、たとえば、上皮細胞成長因子、トランスフォーミング成長因子α、アンフィレグリン、ベータセルリン、ヘパリン結合上皮細胞成長因子、ワクシニア成長因子、クリプト、インスリン成長因子、インスリン様成長因子、トランスフォーミング成長因子β、血小板由来成長因子、線維芽細胞成長因子、および神経成長因子のキメラ遺伝子をｒＨＲＧ−Ｔ−Ｆｃと同様の仕方で構築し、発現させることができる。ｒＨＲＧ−Ｔ−ＦｃによるＨＥＲ４受容体の活性化は、組換えヒトｐ１８０ｅｒｂＢ４／ＨＥＲ４を高レベルで発現しＨＲＧに応答することが以前に示されているＣＨＯ／ＨＥＲ４細胞［プローマンら（１９９３）Ｐroc.Ｎatl. Ａcad.Ｓci．ＵＳＡ９０、１７４６−１７５０およびクルスクら（１９９３）Ｊ.Ｂiol.Ｃhem ．２６８、１８４０７−１８４１０］で調べる。ｒＨＲＧ−α− Ｔ−Ｆｃ，−β２−Ｔ−Ｆｃ、および−β３−Ｔ−ＦｃをＣＨＯ／ＨＥＲ４細胞に５０および２００ｎｇ／ｍｌにて３７℃で１０分間加える。ついで、細胞を溶解し、ついでチロシンリン酸化されたタンパク質のパターンを非処理の細胞と比較して抗ホスホチロシンウエスタンブロッティングにより分析する。図１Ａに示すように、３つのすべてのＨＲＧ−Ｔ−ＦｃはＨＥＲ４受容体の過剰リン酸化を誘発した。リガンドの活性化は受容体の自己リン酸化となるばかりでなく、分子量１００,０００の未同定バンド（図１Ａ）を含む幾つかの基質のチロシンリン酸化ともなった。組換えヒトＥＧＦＲを高レベルで発現するＣＨＯ／ＥＧＦＲ細胞で試験すると、ｒＨＲＧ−Ｔ−Ｆｃ（２００ｎｇ／ｍｌ）はＥＧＦＲを活性化しなかった（図１Ｂ）。ＥＧＦ（２００ｎｇ／ｍｌ）はＣＨＯ／ＥＧＦＲ細胞においてＥＧＦＲのリン酸化を顕著に誘発した（図１Ｂ、レーン２）。これらの結果は、ｒＨＲＧ−Ｔ−Ｆｃが活性な分子であり、ＨＥＲ４チロシンリン酸化を特異的に誘発しうることを示している。ＨＥＲ４発現細胞へのｒＨＲＧ−α−Ｔ−Ｆｃの結合は、ＨＥＲ４受容体を発現することが知られているＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞［プローマンら（１９９３）Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ９０、１７４６−１７５０］において並びに関連受容体であるＨＥＲ２およびＨＥＲ３［クラウス（Ｋraus,Ｍ.Ｈ.）ら（１９８７）ＥＭＢＯＪ.６、６０５−６１０およびクラウスら（１９８９）、Ｐro c.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ８６、９１９３−９１９７］において示すことができる。これら細胞を１または１０μｇ／ｍｌのｒＨＲＧ−ａ−Ｔ−Ｆｃとともに氷上でインキュベートする。結合した融合タンパク質は、ｒＨＲＧ−α−Ｔ−ＦｃのヒトＦｃ部分を認識するフルオレセイン結合抗ヒトＩｇＧ抗体を加えることにより検出する。図２に示すように、ｒＨＲＧ−α−Ｔ−ＦｃはＭＤＡ−ＭＢ− ４５３細胞に結合した（図２Ｂ、１０μｇ／ｍＬ；および２Ｄ、１μｇ／ｍＬ）。共焦顕微鏡により分析される蛍光は細胞の周辺に局在しており、氷上に保持した生きた細胞で染色を行ったという事実と一致する。融合タンパク質を加えない場合には、フルオレセイン結合抗ヒトＩｇＧはＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞への検出可能な結合を示さなかった（図２Ａ）。関連のないＴｅｋ−Ｆｃ融合タンパク質を１０μｇ／ｍｌで用いた場合には最小のバックグラウンド染色が観察される（図２Ｃ）。この結果は、ｒＨＲＧ−Ｔ−ＦｃがＨＥＲ４発現細胞に結合し、ＨＲＧ結合タンパク質を発現する細胞をモノクローナル抗体と同様の仕方で検出するのに用いることができることを示している。ｒＨＲＧ−Ｔ−Ｆｃは、細胞染色のために抗体に替わる手段を提供する。ＨＲＧのラットホモログであるＮＤＦは、ＡＵ５６５哺乳動物腫瘍細胞において形態学的変化を誘発すること［ペレスら（１９９２）、Ｃell ６９、２０５− ２１６］並びにＩＣＡＭ−１の発現を誘発することが示されている［バカスら（１９９３）、Ｃancer Ｒes.５３、５２５１−５２６１］。ｒＨＲＧ−α−Ｔ− ＦｃがＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞の表面でＩＣＡＭ−１の発現を誘発する能力を調べるため、これら細胞を該融合タンパク質（５０ｎｇ／ｍｌ）とともに３日間処理し、抗ＩＣＡＭ−１抗体で染色した。結合した抗ＩＣＡＭ−１抗体は、フルオレセイン結合抗マウスＩｇＧ抗体を用いて検出する。図３Ｂに示すように、ｒＨＲＧ−α−Ｔ−Ｆｃは非処理細胞（図３Ａ）および関連のないＴｅｋ−Ｆｃ融合タンパク質で処理した細胞（図３Ｃ）に比べてＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞においてＩＣＡＭ−１発現の明らかなアップレギュレーションを誘発した。ＨｅｐＧ２細胞からのならし培地から精製したＨＲＧイソ形であるｐ４５［クルスクら（１９９３）Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.２６８、１８４０７−１８４１０］は、５０ｎｇ／ｍｌで正の対照として用い、ＩＣＡＭ−１のアップレギュレーションを誘発した（図３Ｄ）。この結果は、ｒＨＲＧ−Ｔ−Ｆｃが天然のＨＲＧによって引き起こされるのと同様の生物学的応答をＨＥＲ４受容体発現乳癌細胞において引き起こし、かかる細胞へのＨＲＧ結合後の生物学的変化を研究するのに用いることができることを示している。ＨＲＧのＥＧＦ様ドメインをコードするＤＮＡ断片は、ＰＣＲにより増幅し、精製し、ついでヒトＩｇＧ１抗体のＦｃ部分の配列の上流でインフレームにあるトロンビン開裂部位をコードする配列を含むＣＤＭ７由来発現ベクター中に挿入する。発現ベクター中にトロンビン開裂部位を加えるのは、細菌での組換えタンパク質発現のためにヘイクス（Ｈakes,Ｄ.）およびディクソン（Ｄixon）［ヘイクスら（１９９２）Ａnal.Ｂiochem.２０２、２９３−２９８］により開発された系に基づくものである。ｒＨＲＧ−Ｔ−Ｆｃ中にトロンビン開裂部位が存在することにより、融合タンパク質の２つの機能的ドメインの分離が可能となる。トロンビン開裂後、精製ＥＧＦ様ドメインが単量体タンパク質として回収される。なぜなら、トロンビン部位は融合タンパク質のＦｃドメインのヒンジ領域の上流に位置するからである。ｒＨＲＧ−β２−Ｔ−ＦｃおよびｒＨＲＧ−β３−Ｔ− Ｆｃをヒトトロンビンとともにインキュベートする。ついで、ＨＲＧの組換えＥＧＦ様ドメイン（ｒｅＨＲＧ）をプロテインＡ−セファロースクロマトグラフィーにより該分子のＦｃ部分から分離する。ｒｅＨＲＧをカラムフロースルー（fl ow-throughs）中で回収する。Ｆｃ部分は、プロテインＡ−セファロースから酸溶出により回収する。図４は、トロンビン開裂前のｒＨＲＧ−β３−Ｔ−Ｆｃの銀染色ポリアクリルアミドゲルを示す（レーン１）。完全な融合タンパク質は還元条件下で４０ｋＤａのみかけの分子量を示し、単量体に対応する。開裂後、プロテインＡ−セファロース前では（レーン２）、該融合タンパク質のＦｃ部分に対応する３４ｋＤａバンド、およびＨＲＧ−β３のＥＧＦ様ドメインに対応する６ｋＤａバンドが同定される。これら２つの断片をプロテインＡ−セファロースクロマトグラフィーにより分離する。ＨＲＧ−β３の６ｋＤａＥＧＦ様ドメイン（ｒｅＨＲＧ−β３）をカラムフロースルーにより回収し（レーン３）、該融合タンパク質の３４ｋＤａＦｃドメインをカラムから酸で溶出する（レーン４）。ｒｅＨＲＧに応答したタンパク質リン酸化の刺激は、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞中、ｒＨＲＧ−β２−Ｔ−ＦｃおよびｒＨＲＧ−β３−Ｔ−Ｆｃの精製ｒｅＨＲＧ−β２、ｒｅＨＲＧβ３、およびＦｃドメイン上で行う。処理なし（レーン１）またはＥＧＦ処理後（レーン２）に観察されるバックグラウンドレベルのリン酸化に比べ、完全なｒＨＲＧ−β２−Ｔ−ＦｃおよびｒＨＲＧ−β３−Ｔ−Ｆｃ（それぞれ、図６Ｂ、レーン３および６）は、１８０ｋＤａタンパク質のチロシンリン酸化の強力な刺激剤である。ｒｅＨＲＧ−β２（レーン４）およびｒｅＨＲＧ−β３（レーン７）はｒＨＲＧ−β２−Ｔ−ＦｃおよびｒＨＲＧ−β３− Ｔ−Ｆｃで得られるのと同様の１８０ｋＤａタンパク質のリン酸化レベルの増大を引き起こしたが、ｒＨＲＧ−β２−Ｔ−ＦｃおよびｒＨＲＧ−β３−Ｔ−ＦｃからのＦｃドメインはタンパク質リン酸化を誘発できなかった（それぞれ、レーン５および８）。融合タンパク質の開裂後、トロンビン開裂部位のグリシンに富む領域からの幾つかのアミノ酸残基が^reHRGのカルボキシ末端に残存する。開裂はトロンビン開裂部位のプロリン−アルギニン認識配列で起こる。ヘイクスら（１９９２）、Ａnal.Ｂiochem.２０２、２９３−２９８を参照。これら付加残基はｒｅＨＲＧの特性に影響を及ぼさなかった。複数のＨＲＧ／ＮＤＦイソ形のうち、ＥＧＦドメインに近接した領域（ＨＲＧ／ＮＤＦ前駆体中で膜近傍領域と称する）は、存在しなくてもよく（たとえば、ＨＲＧ−β２／ＮＤＦ−β２）、または２６アミノ酸までを含んでいてよい（たとえば、ＨＲＧ−β４／ＮＤＦ−β４）［ホームズら（１９９２）、Ｓcience ２５６、１２０５−１２１０およびウェンら（１９９４）、Ｍol.Ｃell Ｂiol.１４、１９０９−１９１９］。膜近傍領域を欠くＮＤＦ−αの切り出し形（truncated form）は、完全長のＮＤＦ−αイソ形と同じ受容体結合親和性を示し、このＥＧＦドメインに近接する領域は受容体結合に関与していないことを示唆している［ウェンら（１９９４）Ｍol.Ｃell Ｂiol. １４、１９０９−１９１９］。このことは、トロンビン開裂後にｒｅＨＲＧがｒＨＲＧ−Ｔ−Ｆｃ融合タンパク質によって示される活性を保持していることを示している。ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞はＨＥＲ３、ＨＥＲ４、および高レベルのＨＥＲ２をも発現するので、１８０ｋＤａのリン酸化バンドの正確な同定は知られていない。ＨＥＲ４とＨＥＲ３とはともにＨＲＧ受容体として同定されている［プローマンら（１９９３）Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ９０、１７４６−１７５０；クルスクら（１９９３）Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.２６８、１８４０７−１８４１０；プローマンら（１９９３）Ｎature（ロンドン）３６６、４７３−４７５およびカラウェイら（１９９４）Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.２６９、１４３０３−１４３０６］。試料は還元条件下で電気泳動しているので、リン酸化された分子種はＨＥＲ２を含む３つのすべての受容体の単量体の組み合わせに対応する。ＨＲＧ刺激に応答してＨＥＲ２は受容体のリン酸基転移により間接的に刺激される［プローマンら（１９９３）Ｎature（ロンドン）３６６、４７３−４７５］。さらに、ＨＲＧ−β１のＥＧＦ様ドメインの高親和性結合部位はＣＯＳ−７細胞中でのＨＥＲ２およびＨＥＲ３の同時発現によって再構築されうること、およびＨＲＧの結合によりＨＥＲ２およびＨＥＲ３の両者でのチロシンリン酸化という結果となることが示されている［スリウコウスキー（Ｓliwkowski,Ｍ.Ｘ.）ら（１９９４）、Ｊ.Ｂiol.Ｃhem .２６９、１４６６１−１４６６５］。観察された結果は明らかに、観察された生物学的作用がｒＨＲＧ−Ｔ−ＦｃのＥＧＦ様ドメインにより媒体されること、およびこれら作用は該融合タンパク質のＦｃ部分に帰することができないことを示している。ＨＥＲ４受容体活性化後のＳｈｃのリン酸化は以下のようにして行われる：受容体チロシンキナーゼ、たとえば、ＥＧＦ受容体、インスリン受容体、およびＰＤＧＦ受容体の活性化の結果、多くの細胞内シグナル伝達分子がリン酸化される［ウルリッヒら（１９９０）Ｃell ６１、２０３−２１２およびホワイトら（１９９４）Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.２６９、１−４］。ＨＲＧシグナル伝達に関与する分子を分析するため、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞を２００ｎｇ／ｍｌｒｅＨＲＧ −β２とともにまたはｒｅＨＲＧ−β２なしで刺激する。以下の抗体を用いて細胞溶解液を免疫沈降する：抗ＧＡＰ、抗ＰＬＣ−ｇ１、抗ＰＩ３−Ｋ、および抗Ｓｈｃ。沈降したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ついで抗ホスホチロシン抗体を用いてイムノブロッティングする。Ｓｈｃ沈降物、および程度は低いがＰＩ３−Ｋ免疫沈降物が、ＨＲＧ刺激後にタンパク質リン酸化の増大パターンを示した。Ｓｈｃリン酸化の分析をさらに行った。Ｓｈｃタンパク質は、単一のＳＨ２ドメインを含有する偏在的に発現されるタンパク質である。３つの構造上関連するＳｈｃタンパク質、ｐ４６Ｓｈｃ、ｐ５２Ｓｈｃおよびｐ６６Ｓｈｃが、Ｒａｓ活性化に関連すると思われるアダプター分子として記載されている［ペリッチら（１９９２）Ｃell ７０、９３−１０４およびラザキス−アドコックら（１９９２）Ｎature（ロンドン）３６０、６８９−６９２］。ＣＨＯ／ＨＥＲ４細胞およびＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞をｒｅＨＲＧ−β２に暴露し、溶解する。等量の細胞溶解液を抗Ｓｈｃ抗体で免疫沈降し、抗Ｓｈｃ抗体か（図６Ａ）または抗ホスホチロシン抗体（図６Ｂ）のいずれかでブロッティングする。図６Ａは、刺激した細胞溶解液および刺激しない細胞溶解液からの等量のタンパク質を各レーンに負荷すると、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞（レーン１および２）はｐ４６Ｓｈｃおよびｐ５２Ｓｈｃのみを発現するのに対し（ｐ６６Ｓｈｃはアッセイで検出されない）、ＣＨＯ／ＨＥＲ４細胞（レーン３および４）では３つのすべてのＳｈｃイソ形が発現される。ｐ６６Ｓｈｃは他の２つのＳｈｃイソ形とは異なる転写物から翻訳され、あらゆる種類の細胞で発現されるわけではない、たとえば、ヒト造血細胞株には存在しない［ペリッチら（１９９２）Ｃell ７０、９３−１０４］。図６Ｂに示すように、ｒｅＨＲＧ−β２は両細胞タイプにおいてＳｈｃの過剰リン酸化を誘発した。ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞では、ｒｅＨＲＧ−β２刺激はｐ４６Ｓｈｃおよびｐ５２Ｓｈｃの両方においてチロシンリン酸化という結果となった（レーン１および２）。ｒｅＨＲＧ−β２刺激の後、ｐ５２Ｓｈｃのリン酸化はＣＨＯ／ＨＥＲ４細胞において顕著に増大する（レーン３および４）。ｐ４６Ｓｈｃは比較的高い内在レベルのリン酸化を示し、ＨＲＧ処理後にわずかしか影響を受けないと思われた。図６Ｂ、レーン３および４に示すようにブロッティングの暴露時間を長くすると、ｐ４６Ｓｈｃのバンドとｐ５２Ｓｈｃのバンドとの分離は失われたが、ｐ６６Ｓｈｃは非刺激細胞（レーン５）に比べてｒｅＨＲＧ−β２に応答して（レーン６）リン酸化されることが明らかとなった。本発明において示される結果は、ＨＲＧ−α、−β２および−β３の組換えＥＧＦ様ドメインがトロンビン開裂部位に融合し、ついで該部位がヒトＩｇＧ１のＦｃドメインに結合していることを示している。これら試薬は、融合タンパク質としてかまたは切り出された組換えＨＲＧの原料としてインビトロアッセイにおいて有用である。これら結果はまた、両形がインビトロでＨＥＲ４受容体を活性化することができ、公知のＨＲＧ生物学的応答を引き起こすことを示している。本発明は、ＨＲＧ刺激後に、Ｒａｓ活性化経路に関係しているＳｈｃタンパク質がチロシン上でリン酸化されることを初めて示す。組換えＨＲＧを入手しうることは、ＨＲＧ受容体シグナル伝達のメカニズムの詳細な解明並びにＨＥＲ４基質とチロシンキナーゼのＥＧＦＲファミリーの他の成員の基質との比較のためにさらに実験することを可能にするであろう。下記実施例において説明する本発明をさらに明確かつ実行可能とするため、開示した結果を得るのに利用される材料および方法を一般的に記載する。これら材料および方法は利用した技術を説明するものであり、本発明を限定することを意図するものではない。これら方法の他の変法および改変法はよく知られており、本発明によって予期される。抗体−ウエスタンブロッティング試験において使用したＲＣ２０組換え抗ホスホチロシン抗体（トランスダクション・ラボラトリーズ（Ｔransduction Ｌabor atories））およびＰＹ２０抗ホスホチロシン抗体（ＩＣＮバイオメディカルズ（ＩＣＮＢiomedicals,Ｉnc.））は、トランスダクション・ラボラトリーズおよびＩＣＮバイオメディカルズから購入した。ポリクローナル抗Ｓｈｃ抗体は、アップステイト・バイオテクノロジー・インコーポレイテッド（Ｕpstate Ｂiot echnology Ｉncorporated）から購入し、モノクローナル抗Ｓｈｃ抗体はトランスダクション・ラボラトリーズから購入した。抗ヒトＩＣＡＭ−１モノクローナル抗体であるＢＢＡ３は、Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｒ＆ＤＳystems）から購入した。細胞株−ＭＤＡ−ＭＢ−４５３ヒト乳癌細胞は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手した。ＣＨＯ／ＥＧＦＲ細胞は、ソーン（Ｂ.Ｔhor ne）博士（ブリストル−マイヤーズ・スクイブ、シアトル、ワシントン）により以下のようにして作成した：完全な組換えヒトＥＧＦ受容体コード配列を、ネオマイシン耐性遺伝子を含むＣＤＭ８発現ベクター中に挿入した。得られた構築物をチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−ＫＩ）中にトランスフェクションした。Ｇ４１８耐性クローンをＥＧＦＲ発現について分析した。ＣＨＯ／ＥＧＦＲ安定細胞での機能性のＥＧＦＲの発現レベルの評価は、該細胞をＥＧＦで刺激し、ＥＧＦＲを免疫沈降し、ホスホチロシンのウエスタンブロッティングによりそのリン酸化レベルを決定することにより行った［プローマンら（１９９３）Ｐ roc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ９０、１７４６−１７５０に報告されている］。高レベルの組換えヒトＨＥＲ４を発現するＣＨＯ／ＨＥＲ４細胞はこれまでに記載されている［プローマンら（１９９３）Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ９０、１７４６−１７５０；クルスクら（１９９３）Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.２６８、１８４０７−１８４１０およびプローマンら（１９９３）Ｎature（ロンドン）３６６、４７３−４７５］。実施例１ＨＲＧ−Ｔ−Ｆｃ発現プラスミドの構築ヒトＨＲＧのスペーサードメインの一部、ＥＧＦ様ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインの幾つかの残基をコードするＤＮＡ断片を、ＨｅｐＧ２細胞から単離した全ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲにより増幅した。オリゴヌクレオチドプライマーは、ヒトＨＲＧ−βの配列［ホームズら（１９９２）Ｓcience ２５６、１２０５−１２１０］に基づいてデザインした。使用したＰＣＲプライマーを合成したが、下記配列を有する：（フォワードプライマー、配列番号：１）および（リバースプライマー、配列番号：２）。増幅はＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（パーキン−エルマー・ロシュ（Ｐerkin−Ｅlmer Ｒoche））を用いて３５サイクル行い、各サイクルは９５℃で１分間の変性工程、６５℃で１分間のアニール工程、および７２℃で３０秒間の伸長工程からなっていた。得られたＰＣＲ生成物を大腸菌ポリメラーゼＩのクレノウ断片を用いて平滑末端とし、Ｓｍａ−１消化したｐＢluscriptIIベクター（ストラタジーン（Ｓtratagene））中にサブクローニングし、個々のクローンのヌクレオチド配列をジデオキシ媒体チェインターミネーション反応により決定した。この手順によりＨＲＧ−α、−β２、および− β３のＥＧＦ様ドメインが得られた。ＨＲＧ−α、−β２、および−β３のＥＧＦ様ドメインは、上記のようにして生成したＨＲＧ−α、または−β２鋳型プラスミドを用いたＰＣＲにより生成した。以下に記載するオリゴヌクレオチドプライマーは、クローニングの目的のために増幅生成物の５'末端にＳｐｅＩ部位および３'末端にＢａｍＨ１部位が存在するようにデザインした。ヒトＨＲＧ−ａの上皮細胞成長因子様ドメインは下記配列を用いて増幅した：（フォワード、配列番号：３）および（リバース、配列番号：４）。ＰＣＲ条件は，Ｐｆｕポリメラーゼおよび製造業者（ストラタジーン）が推薦する試薬を用い、９４℃で３０秒間、５５℃で１分間および７２℃で２分間からなる４０サイクルであった。ＰＣＲ生成物はＨＲＧ −αの残基１７７−２４１に対応する相補的配列をコードしていた。ヒトＨＲＧ −β２および−β３の上皮細胞成長因子様ドメインの増幅は、ＨＲＧ−ββ２クローンを鋳型として用いて行った。フォワードプライマーは上記に示す（配列番号：３）。ＨＲＧ−β２リバースプライマーは下記配列を有する：（配列番号：５）。増幅はＰｆｕポリメラーゼを用いて上記ＨＲＧａと同じ温度条件で行った。このＰＣＲ生成物は、ＨＲＧ−β２の残基１７７〜２３８に対応する配列をコードしていた。ＨＲＧ−β３リバースプライマーは、診断目的のためにＨｉｎｄIII部位を導入するサイレント点変異を含んでおり、下記配列を有していた：（配列番号：６）。ＰＣＲ条件は、Ｐｆｕポリメラーゼを用い、９４℃で１分間、５０℃で２分間および７２℃で３分間からなる４０サイクルであった。このＰＣＲ生成物は、ＨＲＧ−β３の残基１７７〜２４１に対応する配列をコードしていた。すべてのＰＣＲ生成物をＢａｍＨ１およびＳｐｅＩで消化し、発現タンパク質の適切な分泌のためにクローニング部位の５'側にあるＣＤ５シグナルペプチドをコードするｃＤＮＡ配列並びにトロンビン開裂部位（アミノ酸配列ＤＰＧＧＧＧＧＲＬＶＰＲＧＦＧＴＧ；配列番号：７）をコードするｃＤＮＡ配列およびクローニング部位の３'側にあるヒトＩｇＧ１のヒンジ領域および定常領域をコードするｃＤＮＡ配列を含むＢａｍＨ１−ＳｐｅＩ切断ＣＤＭ７由来ベクターにライゲートした。すべての構築物をジデオキシ媒体チェインターミネーション反応により配列決定してＥＧＦ様ドメインの配列を確認し、それらの配列がトロンビン配列およびＦｃコード配列とインフレームにあることを確かめた。この手順の結果、構築物すなわちＨＲＧ−Ｔ−Ｆｃの発現プラスミドが製造された。ｒＨＲＧ−Ｔ−Ｆｃの配列は図７ＡおよびＢに示してある。実施例２構築物のＣＯＳ細胞中へのトランスフェクション上記構築物を以前に記載されたようにして［シード（Ｓeed,Ｂ.）ら（１９８７）Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ８７、３３６５−３３６９］ＣＯＳ細胞中にトランスフェクションし、得られた融合タンパク質をプロテインＡ−セファロース（レプリゲン（Ｒepligen））を用いて培養上澄み液から回収した。精製したタンパク質を還元条件下および非還元条件下で８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で視覚化した。タンパク質濃度はタンパク質アッセイキット（バイオ−ラド・ラボラトリーズ（Ｂio-Ｒad Ｌabs））を用いて決定した。この実験の結果、融合タンパク質、ｒＨＲＧ−α−Ｔ−Ｆｃ、ｒＨＲＧ−β２−Ｔ−ＦｃまたはｒＨＲＧ−β ３−Ｔ−Ｆｃが得られた。実施例３融合タンパク質のトロンビン開裂融合タンパク質をヒトトロンビン（シグマ（Ｓigma）、セントルイス、ミズーリから購入）とともに１：５０（ｗ／ｗ）トロンビン：融合タンパク質比にて室温にて３０分間インキュベートした。ついで、開裂したタンパク質をプロテインＡ−セファロースカラムに負荷した。ＨＲＧの組換えＥＧＦ様ドメインを含むカラムフロースルーを−２０℃で貯蔵した。この手順により組換えタンパク質、ｒｅＨＲＧ−α、ｒｅＨＲＧ−β２またはｒｅＨＲＧ−β３が得られた。実施例４チロシンリン酸化されたタンパク質のウエスタンブロッティングによる検出ＣＨＯ／ＨＥＲ４細胞（５×１０４）、ＣＨＯ／ＥＧＦＲ細胞（２×１０４）、およびＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞（４×１０５）を４８ウエルプレート中に播種した。２４時間後、細胞を８時間血清飢渇させ、ついで種々の試料で３７℃にて１０分間刺激した。上澄み液を廃棄し、沸騰電気泳動試料緩衝液を加えて細胞を溶解した。溶解液を８％ポリアクリルアミドゲル（ノベックス（Ｎovex）より購入）上のＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ついでニトロセルロースに電気的にブロッティングした。ＰＹ２０モノクローナル抗ホスホチロシン抗体（ＩＣＮより購入）および西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧＦ(ａｂ')₂（カッペル（Ｃappel）より購入）を、それぞれ一次および二次プローブ試薬として用いた。免疫反応性のバンドを化学ルミネセンス（アマーシャム（Ａmersham Ｃor p.）より購入）の増大を用いて視覚化した。得られた結果は、ＨＥＲ４受容体におけるチロシンリン酸化タンパク質のパターンを示し、これは図１に示してある。実施例５免疫沈降ＣＨＯ／ＨＥＲ４細胞を１００ｍｍ皿に播種した。８０−９０％コンフルエントな単層を洗浄し、種々の組換えＨＲＧとともに３７℃で１０分間インキュベートした。単層を氷冷ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳＴＤＳ溶解緩衝液（１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７.３、１５０ｍＭＮａＣｌ、１％トリトン−Ｘ１００、０. ５％デオキシコール酸ナトリウム、０.１％ＳＤＳ）（１ｍＭＥＤＴＡ、２ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオライド、１ｍＭＮａ３ＶＯ４、２０μｇ／ｍｌアプロチニン、２０μｇ／ｍｌロイペプチン、２０μｇ／ｍｌペプスタチンを含有）中、氷上で１０分間可溶化した。清澄化した抽出物のタンパク質濃度をＢＣＡタンパク質アッセイキット（ピアス（Ｐierce）から購入）を用いて決定した。溶解液（免疫沈降当たり１ｍｇ）をウサギ抗Ｓｈｃ抗体（ＵＢＩより購入）とともに４℃で一夜インキュベートした。懸濁液にプロテインＧ−プラス／プロテインＡ−アガロース（オンコジーン・サイエンスィズ（Ｏncogene Ｓciences ））を加えて免疫複合体を沈降させた。４℃で１時間インキュベートした後、免疫沈降物をＰＢＳＴＤＳで３回洗浄し、還元条件下で８％ポリアクリルアミドゲル（ノベックスより購入）上で分離した。タンパク質をニトロセルロースに電気的にブロッティングし、ＲＣ２０組換え抗ホスホチロシン抗体（トランスダクション・ラボラトリーズより購入）または抗Ｓｈｃモノクローナル抗体（トランスダクション・ラボラトリーズより購入）を用いてプローブした。免疫反応性のバンドを化学ルミネセンス（アマーシャムより購入）の増大を用いて視覚化した。得られた結果は、Ｓｈｃタンパク質の沈降を示し、これらタンパク質がタンパク質ｒｅＨＲＧ−β２に応答してリン酸化されることを示していた。実施例６免疫組織化学染色ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞を８−ウエルのホウ珪酸装填（chambered）スライド（ラブ−テク（Ｌab−Ｔek）より購入）中に播種した。受容体結合を視覚化するため、４８時間培養した後、細胞を氷上に１０分間置き、氷冷結合緩衝液（４４ｍＭ重炭酸ナトリウム、５０ｍＭＢｅｓ、ｐＨ７.０、０.１％ウシ血清アルブミンを添加したＤＭＥＭ）で２回洗浄し、ついで氷上でｒＨＲＧ−ａ−Ｔ−Ｆｃとともに、または負の対照として、ｒＨＲＧ−Ｔ−Ｆｃと同様にＴｅｋ受容体［デュモン（Ｄumont,Ｄ.Ｊ.）ら（１９９３）Ｏncogene ８、１２９３−１３０１］の細胞外ドメインをトロンビン開裂部位に融合させ、ついでＩｇＧのＦｃ領域に結合させた関連のない融合タンパク質とともに２時間インキュベートした。Ｔｅｋ−Ｆｃ融合タンパク質を構築し生成するのに使用した試薬、クローニングベクターおよび哺乳動物細胞はｒＨＲＧ−Ｔ−Ｆｃを製造するのに用いたものと同一であった。細胞を２回洗浄し、フルオレセイン結合ヤギ抗ヒトＩｇＧＦ(ａｂ')₂（タゴ（Ｔago）より購入）とともに氷上で４５分間インキュベートした。細胞をＰＢＳで２回濯ぎ、ＰＢＳ、２％ホルムアルデヒド中で２０分間固定した。その結果は、ＨＥＲ４受容体を発現する細胞を染色するのに上記組換え融合タンパク質を用いることができることを示した。実施例７ＩＣＡＭ−１発現試験ＩＣＡＭ−１発現試験を行うため、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞を２４時間培養した後、５０ｎｇ／ｍｌのｒＨＲＧ−α−Ｔ−Ｆｃ、ｐ４５［クルスクら（１９９３）Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.２６８、１８４０７−１８４１０］、負の対照としてＴｅｋ−Ｆｃ融合タンパク質とともに、または培地単独で３日間インキュベートした。ついで、生きた細胞に染色を行った。細胞を洗浄し、結合緩衝液中に１：５００に希釈した抗ＩＣＡＭ−１抗体（Ｒ＆Ｄシステムズより購入）とともに氷上で１時間インキュベートした。細胞を洗浄し、フルオレセイン結合ヤギ抗マウスＩｇＧＦ(ａｂ')₂（タゴより購入）とともに氷上で４５分間インキュベートした。細胞をＰＢＳで２回濯ぎ、上記のようにして固定した。受容体染色およびＩＣＡＭ−１発現のレベルをライカ（Ｌeica）共焦顕微鏡を用いて分析した。その結果は、上記融合タンパク質がＨＥＲ４受容体を発現する乳癌細胞でＩＣＡＭ− １の発現を誘発することを示し、図３に示してある。実施例８ｒＨＲＧ−Ｔ−Ｆｃ刺激後のＨＥＲ４受容体のチロシン自己リン酸化−図１Ａ．ＣＨＯ／ＨＥＲ４細胞を、ｒＨＲＧ−α−Ｔ−Ｆｃ（レーン２および３）、ｒＨＲＧ−β２−Ｔ−Ｆｃ（レーン４および５）、およびｒＨＲＧ−β３− Ｔ−Ｆｃ（レーン６および７）の５０ｎｇ／ｍｌ（レーン２、４および６）または２００ｎｇ／ｍｌ（レーン３、５および７）存在下、または不在下（レーン１）でインキュベートした。細胞を溶解し、タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロースに移し、抗ホスホチロシン抗体でイムノブロッティングした。結合した抗体を可視化するため、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体および化学ルミネセンス試薬を用いた。その結果は、図１Ａに示すように、３つのすべてのｒＨＲＧ−Ｔ−ＦｃがＨＥＲ４受容体の過剰なリン酸化を誘発することを示した。また、リガンド活性化の結果、受容体の自己リン酸化および幾つかの基質のチロシンリン酸化が引き起こされた。Ｂ．ＣＨＯ／ＥＧＦＲ細胞を、ＥＧＦ（レーン２）、ｒＨＲＧ−α−Ｔ−Ｆｃ（レーン３）、ｒＨＲＧ−β２−Ｔ−Ｆｃ（レーン４）、およびｒＨＲＧ−β ３−Ｔ−Ｆｃ（レーン５）の２００ｎｇ／ｍｌ存在下、または不在下（レーン１）でインキュベートした。細胞溶解液をＡと同様にして処理した。ＨＥＲ４およびＥＧＦＲの位置を示す。その結果は、図１Ｂに示すように、ｒＨＲＧ−Ｔ−ＦｃはＥＧＦＲを活性化することができないことを示した。図１Ｂ（レーン２）は、ＥＧＦがＣＨＯ／ＥＧＦＲ細胞においてＥＧＦＲのリン酸化を顕著に誘発することを示した。実施例９ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞へのｒＨＲＧ−α−Ｔ−Ｆｃの結合−図２細胞を８−ウエルのラブ−テク（ヌンク（Ｎunc））チャンバスライド中に２ ×１０５細胞／ウエルにて播種した。２日後、細胞を氷上に置き、１０μｇ／ｍｌ（パネルＢ）および１μｇ／ｍｌ（パネルＤ）のｒＨＲＧ−α−Ｔ−Ｆｃで、または１０μｇ／ｍｌで使用した関連のない融合タンパク質（パネルＣ）で染色した。パネルＡに示す実験では融合タンパク質を加えなかった。結合した融合タンパク質を視覚化するため、フルオレセイン標識ヤギ抗ヒトＦｃ抗体を用いた。蛍光染色を共焦顕微鏡により分析した。図１Ａに示す結果は、融合タンパク質を加えなかった場合には細胞への結合を示さなかった。図２Ｂに示す結果は、ｒＨＲＧ−α−Ｔ−ＦｃがＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞に結合することを示した。図２Ｃに示す結果は、関連のないＴｅｋ−Ｆｃ融合タンパク質を用いた場合の最小のバックグラウンド染色を示した。この実験で得られた結果は、ｒＨＲＧ−α−Ｔ −ＦｃがＨＥＲ４発現細胞に結合し、ＨＲＧ結合タンパク質を発現する細胞を検出するのに用いることができることを示した。実施例１０ｒＨＲＧ−α−Ｔ−Ｆｃに応答したＩＣＡＭ−１発現の誘発−図３ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞を８ウエルのラブ−テク（ヌンク）チャンバスライド中で２４時間培養した。細胞を５０ｎｇ／ｍｌのｒＨＲＧ−ａ−Ｔ−Ｆｃ（パネルＢ）、関連のない融合タンパク質（パネルＣ）、ｐ４５［クルスクら（１９９３）Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.２６８、１８４０７−１８４１０］（パネルＤ）で処理するか、または処理しなかった（パネルＡ）。さらに３日間のインキュベーションの後、細胞を抗ＩＣＡＭ−１モノクローナル抗体で染色した。結合した抗ＩＣＡＭ−１抗体を視覚化するため、フルオレセイン標識ヤギ抗マウスＦｃ抗体を用いた。染色を共焦顕微鏡により分析した。図３Ｂは、ｒＨＲＧ−α−Ｔ−Ｆｃが、未処理の細胞（図３Ａ）および関連のないＴｅｋ−Ｆｃ融合タンパク質で処理した細胞（図３Ｃ）に比べてＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞においてＩＣＡＭ−１発現の明らかなアップレギュレーションを誘発することを示した。図３Ｄは、ｐ４５がＩＣＡＭ−１のアップレギュレーションを誘発することを示した。それゆえ、これら実験の結果は、ｒＨＲＧ−Ｔ−Ｆｃが、ＨＥＲ４受容体を発現する乳癌細胞において天然のＨＲＧによって引き起こされるのと同様の生物学的応答を引き起こすことを示した。実施例１１ｒＨＲＧ−β３−Ｔ−Ｆｃのトロンビン開裂−図４融合タンパク質をヒトトロンビンとともに室温で３０分間インキュベートし、プロテインＡ−セファロースカラム上に負荷した。ＨＲＧ−β３のＥＧＦ様ドメイン（ｒｅＨＲＧ−β３）をカラムフロースルー中に回収し、一方、融合タンパク質のＦｃ部分はカラムから溶出した。得られた生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、銀染色した。レーン１、未処理のｒＨＲＧ−β３−Ｔ−Ｆｃ；レーン２、トロンビン開裂後のｒＨＲＧ−β３−Ｔ−Ｆｃ；レーン３、プロテインＡ− セファロースカラムフロースルー（ｒｅＨＲＧ−β３）；レーン４、プロテインＡ−セファロースカラム溶出液（融合タンパク質のＦｃ部分）。図４（レーン１）は、トロンビン開裂前のｒＨＲＧ−β３−Ｔ−Ｆｃの銀染色したポリアクリルアミドゲルを示した。図４（レーン２）は、融合タンパク質のＦｃ部分に対応する３４ｋＤａのバンドおよびＨＲＧ−β３のＥＧＦ様ドメインに対応する６ｋＤａのバンドを示した。このＨｒＧ−β３の６ｋＤａＥＧＦ様ドメイン（ｒｅＨＲＧ−β３）をカラムフロースルー中に回収し（レーン３）、融合タンパク質の３４ｋＤａＦｃドメインをカラムから酸で溶出した（レーン４）。実施例１２ｒｅＨＲＧに応答したタンパク質リン酸化の刺激−図５ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞を、２００ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ（レーン２）、ｒＨＲＧ−β２−Ｔ−Ｆｃ（レーン３）、ｒｅＨＲＧ−β２（レーン４）、ｒＨＲＧ−β２−Ｔ−Ｆｃ融合タンパク質のＦｃ部分（レーン５）、ｒＨＲＧ−β３ −Ｔ−Ｆｃ（レーン６）、ｒｅＨＲＧ−β３（レーン７）、ｒＨＲＧ−β３−Ｔ −Ｆｃ融合タンパク質のＦｃ部分（レーン８）の存在下、または不在下（レーン１）でインキュベートした。細胞を溶解し、タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロースメンブランに移し、抗ホスホチロシン抗体でブロッティングした。免疫反応性のバンドを強化（enhanced）化学ルミネセンス試薬で可視化した。その結果は、未処理（レーン１）またはＥＧＦ処理後（レーン２）に観察されたバックグラウンドレベルのリン酸化と比較して、ｒＨＲＧ−β２− Ｔ−Ｆｃおよび−β３−Ｔ−Ｆｃ（それぞれ、レーン３および６）が１８０ｋＤａタンパク質のチロシンリン酸化の強力な刺激剤であることを示した。図５（レーン４および７）は、ｒｅＨＲＧ−β２およびｒｅＨＲＧ−β３が１８０ｋＤａタンパク質のリン酸化レベルの増大を引き起こすのに対して、ｒＨＲＧ−β２− Ｔ−ＦｃおよびｒＨＲＧ−β３−Ｔ−ＦｃのＦｃドメインはタンパク質リン酸化を誘発することができなかった（図５、レーン５および８）。実施例１３ＨＥＲ４活性化後のＳｈｃタンパク質のチロシンリン酸化−図６Ａおよび６ＢＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞（レーン１および２）およびＣＨＯ／ＨＥＲ４細胞（レーン３および４）を２００ｎｇ／ｍｌのｒｅＨＲＧ−β２で３７℃にて１０分間処理するか（＋）または処理せず（−）、可溶化した。等量のタンパク質（１ｍｇ）を含有する細胞溶解液をポリクローナルウサギ抗Ｓｈｃ抗体で沈降させた。免疫複合体を洗浄し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロースに移した。Ａ．モノクローナル抗Ｓｈｃ抗体を用いたイムノブロッティングによりＳｈｃタンパク質を検出した。Ｂ．抗ホスホチロシン抗体を用いたイムノブロッティングによりＳｈｃタンパク質のチロシンリン酸化を分析した。３つのＳｈｃイソ形の位置を示す。図６Ａに示す結果は、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞（レーン１および２）がｐ４６Ｓｈｃおよびｐ５２Ｓｈｃのみを発現するのに対して、ＣＨＯ／ＨＥＲ４細胞（レーン３および４）は３つのすべてのＳｈｃイソ形を発現することを示した。図６Ｂは、ｒｅＨＲＧ−β２が両細胞タイプにおいてＳｈｃの過剰なリン酸化を誘発することを示した。ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞では、ｒｅＨＲＧ−β２刺激はｐ４６Ｓｈｃおよびｐ５２Ｓｈｃの両方のチロシンリン酸化という結果となった（レーン１および２）。ｒｅＨＲＧ−β２刺激の後、ｐ６６Ｓｈｃのリン酸化はＣＨＯ／ＨＥＲ４細胞で顕著に増加した（レーン３および４）。ブロットを長い時間暴露しておくと（図６Ｂ、レーン３および４）、ｐ４６Ｓｈｃのバンドとｐ５２Ｓｈｃのバンドとの間の分離が失われるという結果になったが、ｐ６６Ｓｈｃは未処理の細胞（レーン５）に比べてｒｅＨＥＲ−β２に応答してリン酸化されることがわかった（レーン６）。実施例１４他の成長因子の発現プラスミドの構築他の成長因子、たとえば、上皮細胞成長因子、トランスフォーミング成長因子アルファ、アンフィレグリン、ベータセルリン、ヘパリン結合上皮細胞成長因子、ワクシニア成長因子、クリプト、インスリン成長因子、インスリン様成長因子、トランスフォーミング成長因子ベータ、血小板由来成長因子、線維芽細胞成長因子または神経成長因子の発現プラスミドは、これら成長因子のｃＤＮＡから実施例１に従って同様に構築でき、実施例２に従って発現することができる。上記の記載および実施例は本発明を説明するためのものであるが、本発明を限定することを意図するものではない。本発明の範囲から逸脱することなく、多くの改変および修飾を施すことができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/24 ＡＥＤ (72)発明者アルフォ，アレハンドロ・エイアメリカ合衆国98020ワシントン州エドモンズ、スプルース・ストリート1012番

Claims

【特許請求の範囲】１．（ａ）成長因子ドメイン、（ｂ）トロンビン開裂部位、および（ｃ）ヒトＩｇＧ１抗体のＦｃ部分、をコードするｃＤＮＡを含む、真核細胞ベクター。２．該成長因子が、ヒレグリン、上皮細胞成長因子、トランスフォーミング成長因子アルファ、アンフィレグリン、ベータセルリン、ヘパリン結合上皮細胞成長因子、ワクシニア成長因子、クリプト、インスリン成長因子、インスリン様成長因子、トランスフォーミング成長因子ベータ、血小板由来成長因子、線維芽細胞成長因子または神経成長因子である、請求項１に記載のベクター。３．該成長因子ドメインがヒレグリン−α、−β２または−β３の上皮細胞成長因子様ドメインである、請求項１に記載のベクター。４．ヒレグリン−α、−β２または−β３の上皮細胞成長因子様ドメインをコードするｃＤＮＡが、該トロンビン開裂部位および該ヒトＩｇＧ１抗体のＦｃ部分をコードするｃＤＮＡ配列とインフレームにある、請求項３に記載のベクター。５．クローニング部位の５'側にＣＤ５シグナルペプチドをコードするｃＤＮＡ配列をさらに含む、請求項３に記載のベクター。６．該Ｆｃ部分をコードするｃＤＮＡ配列がヒトＩｇＧ１抗体のヒンジ、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域をコードする、請求項３に記載のベクター。７．ＣＤＭ７由来である、請求項５に記載のベクター。８．請求項５に記載のベクターを含む宿主細胞。９．該宿主細胞が哺乳動物細胞である請求項８に記載の宿主細胞。１０．該哺乳動物細胞がＣＯＳ細胞である請求項９に記載の宿主細胞。１１．ヒレグリン−α、−β２または−β３の上皮細胞成長因子様ドメインおよびヒトＩｇＧ１抗体のＦｃ部分を含む融合タンパク質の製造方法であって、（ａ）請求項５に記載のベクターを該融合タンパク質の製造を可能にする条件下でＣＯＳ細胞中にトランスフェクションし、ついで（ｂ）かくして製造された融合タンパク質を回収することを含む方法。１２．培養上澄み液から回収した該融合タンパク質をプロテインＡ−セファロースを用いて単一工程で精製する、請求項１１に記載の方法。１３．回収した該融合タンパク質が、ｒＨＲＧ−α−Ｔ−Ｆｃ、ｒＨＲＧ−β ２−Ｔ−Ｆｃ、またはｒＨＲＧ−β３−Ｔ−Ｆｃである、請求項１２に記載の方法。１４．組換えタンパク質ｒｅＨＲＧ−α、ｒｅＨＲＧ−β２またはｒｅＨＲＧ −β３の製造方法であって、（ａ）融合タンパク質ｒＨＲＧ−α−Ｔ−Ｆｃ、ｒＨＲＧ−β２−Ｔ−ＦｃまたはｒＨＲＧ−β３−Ｔ−Ｆｃをヒトトロンビンで開裂し、ついで（ｂ）該タンパク質ｒｅＨＲＧ−α、ｒｅＨＲＧ−β２またはｒｅＨＲＧ−β３を回収することを含む方法。１５．ヒレグリン−α、−β２または−β３の上皮細胞成長因子様ドメインおよびヒトＩｇＧ１抗体のＦｃ部分を含む融合タンパク質の製造方法であって、（ａ）請求項１に記載のベクターを該融合タンパク質の製造を可能にする条件下でＣＯＳ細胞中にトランスフェクションし、ついで（ｂ）かくして製造された融合タンパク質を回収することを含む方法。１６．ヒレグリン−α、−β２または−β３の上皮細胞成長因子様ドメインおよびヒトＩｇＧ１抗体のＦｃ部分を含む融合タンパク質の製造方法であって、（ａ）請求項３に記載のベクターを該融合タンパク質の製造を可能にする条件下でＣＯＳ細胞中にトランスフェクションし、ついで（ｂ）かくして製造された融合タンパク質を回収することを含む方法。１７．組換え融合タンパク質ｒＨＲＧ−α−Ｔ−Ｆｃ、ｒＨＲＧ−β２−Ｔ− ＦｃまたはｒＨＲＧ−β３−Ｔ−Ｆｃ。１８．ヒレグリン結合タンパク質を発現する細胞の同定方法であって、（ａ）被験細胞を請求項１７に記載の融合タンパク質とともにインキュベートし、ついで（ｂ）該細胞に結合した該融合タンパク質を検出することを含む方法。１９．使用した細胞が、ヒト上皮細胞成長因子受容体４を発現するＭＤＡ−ＭＢ−４５３である、請求項１８に記載の方法。２０．組換えタンパク質ｒｅＨＲＧ−α、ｒｅＨＲＧ−β２またはｒｅＨＲＧ −β３。