JPH11506320A

JPH11506320A - 豊富な細胞外産物、ならびにそれらを産生および使用するための方法

Info

Publication number: JPH11506320A
Application number: JP8535943A
Authority: JP
Inventors: エイ．ホーウィッツ，マーカス; ハース，グンダー
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 1995-05-23
Filing date: 1996-05-23
Publication date: 1999-06-08
Also published as: NZ309945A; WO1996037219A1; EP0828510A1; CA2222000C; BR9608894A; MX9709053A; CA2222000A1; AU6024596A

Abstract

(57)【要約】主に豊富な、病原体の細胞外産物の、一つ以上組み合わせに基づくワクチン、ならびに、それらの使用および産生のための方法が提示されている。標的病原体の、最も大量にあるか、または、主に豊富な細胞外産物が、それらの絶対的な分子的免疫原生とは無関係に選択され、そして哺乳動物宿主での、標的病原体による引き続く感染に対する防御的な免疫応答を刺激するためのワクチンとして用いられる。主に豊富な細胞外産物は、それらのそれぞれのＮ末端アミノ酸、アミノ酸、またはDNA配列によって特徴づけられ、そして区別され得る。ワクチンが、細胞外産物、それらのサブユニット、または、それらをコードする核酸の異なる組合せを含み得るため、本発明によって、広い範囲に有効な免疫治療用組成物が提供される。他の感染因子に加えて、このように産生されたワクチンを用いて、細胞内の病原体、特に、ヒト結核菌（Mycobacterium tuberculosis）に対する効果的な免疫応答を刺激することができる。

Description

【発明の詳細な説明】豊富な細胞外産物、ならびにそれらを産生および使用するための方法政府との関連本発明は、保険社会福祉省から交付された助成金番号AI-35275およびAI-31338 による、政府からの支援によって行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。発明の分野本発明は、一般的に、細菌、原生動物、ウイルス、および真菌のような病原性生物に対する免疫治療剤、およびワクチンに関する。より詳細には、最大、または最も特異的な分子的免疫原性を示す病原性サブユニット、または産物に基づいた、先行技術のワクチン、および免疫治療剤とは異なり、本発明は、哺乳動物宿主における効果的な免疫応答を刺激するために、Mycobacterium tuberculosisのような選択された病原体によって放出される、最も優勢であるか、または、主に豊富にある免疫原性決定因子を用いる。したがって、本発明によって作製される獲得免疫、および免疫治療活性は、投与された化合物の相対的、または絶対的な免疫原性とは特に関係なく、病原体が感染する過程で、感染した宿主細胞上に最も頻繁に提示される抗原マーカーに対して向けられる。発明の背景寄生微生物は、動物に感染し、それにより、宿主の疾患、およびしばしばその死をもたらす能力を有することが、長い間認識されている。病原性因子は、歴史を通じて、死亡の主な原因であり、そして測り知れない苦しみを与え続けている。この百年間で、多くの感染性疾患の予防および処置において、劇的な進歩が認められたが、複雑な宿主−寄生体相互作用のため、未だ治療的測定法の普遍的な有効性が限定されている。多くの病原性ベクターが示す精巧な侵入メカニズムを阻止することの難しさは、結核のような種々の疾患の復活、ならびに細菌およびウイルスの多数の薬物耐性株の出現により証明される。疫学的な関心の主な対象であるこれらの病原性因子のうち、細胞内細菌は、治療的測定法、または予防的測定法にもかかわらず、特に難治性であることが証明されてきた。Mycobacterium属およびLegionella属を含む、細胞内細菌は、その生活環の全部または一部を、細胞外よりもむしろ、感染した宿主生物の細胞内で完了する。世界中で、細胞内細菌は、毎年の何百万人もの死亡、および数え切れない苦痛の原因となる。Mycobacterium tuberculosisによって生じる結核は、世界的に、感染性疾患による死亡の主要な原因であり、毎年、一千万の新たな症例、および290万人の死亡を伴う。さらに、細胞内細菌は、何百万ものハンセン病の症例の原因となる。細胞内因子によって伝達される、他の消耗性の疾患には、皮膚および内臓のリーシュマニア症、アメリカトリパノソーマ症（シャーガス病）、リステリア症、トキソプラスマ症、ヒストプラスマ症、トラコーマ、オウム病、Ｑ熱、および、在郷軍人病を含むレジオネラ症が含まれる。今でも、これらの生物に曝露された感受性の個体における消耗性の感染を防ぐためにできることは比較的少ない。集団を結核から効果的に保護できないこと、および結核による、固有のヒトの病的状態および死のため、これは、人類が直面している最も重要な疾患の一つである。より詳細には、M．tuberculosisによって主に起こるヒトの肺結核は、発展途上国における主要な死亡原因である。マクロファージおよび単球の中で生存できるため、M．tuberculosisは、慢性的な細胞内感染を引き起こし得る。外来因子を検出し、続いて免疫系を活性化する責任を主に果たす細胞の中にそれ自体が隠れることにより、M．tuberculosisは、宿主生物の正常な防御の回避を比較的上首尾にしている。これらの同一の病原特性が、結核菌感染に対する効果的な免疫治療剤またはワクチンの開発をこれまで妨げてきた。同時に、結核菌（tube rcle bacilli）は、実験室の条件下での培養および観察が比較的容易である。従って、M．tuberculosisは、本発明の原理および利点を実証するのに、特によく適している。当業者は、M．tuberculosisに関する、以下の例示的な議論が、決して、M．tu berculosisを処置するための本発明の範囲を限定することは意図しないことを理解する。同様に、本明細書における教示は、決して、結核菌感染の処置に限定されない。反対に、本発明を用いて、細胞外産物を発現する任意の病原性因子の免疫原性決定因子に対する、安全かつ効果的なワクチンおよび免疫治療剤を有利に提供し、それによって、これらの生物の感染伝染を阻害し得る。現在、世界の人口の約半分がM．tuberculosisに感染し、毎年何百万症例の肺結核をもたらしていると考えられている。この疾患は、特に、ラテンアメリカ、アフリカ、およびアジアの発展途上国における深刻な健康問題である一方、第一世界においてもまた、より流行してきている。米国においては、特定の集団、特に、都市の貧しい免疫無防備状態の個人、および高い疾患罹患率の地域からの移民は危険性が増加している。主としてAIDSの流行により、先進国において結核の発生率が、しばしば、多剤耐性M．tuberculosisの形態で増加している。最近、米国の50の州のうち36の州で、１種以上の薬物に対して抵抗性の結核が報告された。ニューヨーク市では、1991年に試験されたすべての症例のうちの３分の１が、１種類以上の主要な薬物に抵抗性であった。非抵抗性の結核は、長期間の治療方針で抗生物質を用いて治癒され得るが、薬物抵抗性株に関する見通しは厳しい。２種類以上の主要な抗生物質に抵抗性の株に感染した患者は、ほぼ50 ％の致死率を有する。したがって、このような種々のM．tuberculosisに対する安全かつ効果的なワクチンが非常に必要とされる。 M．tuberculosisの初期感染は、ほぼ常に、エアゾール化した粒子の吸入によって起こる。なぜなら、この病原体は、湿った痰、または乾いた痰の中で、数週間または数カ月間生存可能なままであり得るからである。一次的な感染部位は肺の中にあるが、この生物はまた、骨、脾臓、髄膜、および皮膚の感染も引き起こし得る。特定の株の毒性、および宿主の抵抗性に依存して、組織に対する感染および対応する損傷は小さい場合もあり、もしくは大きい場合もある。ヒトの場合には、初期感染は、細菌の毒性株に曝露された、大多数の個人の中で制御される。最初の抗原投与後の獲得免疫の発達により、細菌の増殖が減少し、それによって、病変は回復し、そして被験体は、主に無症候のままであるが、あるいは感染性のままである。 M．tuberculosisが、感染した被験体によって制御されない場合、肺組織の広範な退化がしばしば生じる。結核菌が、肺胞または肺のマクロファージの中で繁殖する場合、感受性個体においては、通常、肺中で病変が形成される。この生物は繁殖すると、リンパ系を介して遠位のリンパ節に広がり得、血流を介して、肺の頂、骨髄、腎臓、および脳を囲む髄膜に広がり得る。主に、細胞媒介性の過敏性反応の結果として、感染の重篤度に比例して、特徴的な肉芽腫性の病変、または結節が生じる。これらの病変は、単球、リンパ球、および線維芽細胞に隣接した類上皮細胞からなる。ほとんどの症例において、病変または結節は最終的に壊死性になり、そして乾酪化をうける。 M．tuberculosisは、重要な病原体であるが、Mycobacterium属の別の種もまた、ヒトを含む動物の疾患の原因となり、そして明らかに本発明の範囲内に含まれる。例えば、M．bovisは、M．tuberculosisに密接に関連し、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、イヌ、およびネコのような家畜における結核菌感染の原因である。さらに、M．bovisは、腸管を介して、代表的には、生のミルクの摂取から、ヒトに感染し得る。局所的な腸感染は、最終的に気道に拡がり、続いてまもなく古典的な結核の症状を引き起こす。Mycobacterium属の別の重要な病原性ベクターは、古来からの疾患であるハンセン病の何百万の症例の原因となるM．lepraeである。動物およびヒトにおいて疾患の原因となるこの属の別の種には、M．kansasii 、M．avium intracellulare、M．fortuitum、M．marinum、M．chelonei、M．afr icanum、M．ulcerans、M．microti、およびM．scrofulaceumが含まれる。病原性のマイコバクテリウムの種は、しばしば、それらのそれぞれのDNAおよび対応するタンパク質配列において高度の相同性を示し、そしてM．tuberculosisおよびM ．bovisのようないくつかの種は、高度に関連している。明らかに実際的かつ倫理的な理由のため、このような苦痛をもたらすものに関する実験的組成物の効力を決定するためのヒトにおける最初の研究は、実行不可能である。したがって、任意の薬物またはワクチンの最初の開発において、安全性および費用の理由から、適切な動物モデルを用いることが、標準的な手順である。免疫優性エピトープが、しばしば異なる宿主種において活性であるという理解から、実験動物モデルの実行の成功が予測される。このように、一つの種（例えば、齧歯類またはモルモット）における免疫原性決定因子は、一般的に、ヒトのような異なる種においても免疫反応性である。適切な動物モデルが十分に開発された後にのみ、ヒトにおけるワクチンの安全性および効力をさらに実証するために、ヒトにおける臨床試験が行われる。 M．tuberculosisによる肺胞または肺の感染に関しては、モルモットモデルが、多くの点で、この疾患のヒトの病理と密接に類似している。したがって、ヒトおよび他の哺乳動物に対するこの疾患のモルモットモデルを外挿するのが適切であることが、当業者によく理解される。ヒトのように、モルモットは、低用量のエアゾール化したヒト病原体M．tuberculosisの結核菌感染に感受性である。初期感染が通常制御されるヒトとは異なり、モルモットは、エアゾール化した病原体に曝される際、散在性の疾患を一貫して発症し、その後の解析を容易にする。さらに、モルモットとヒトとは両方、稠密な単核細胞の硬化、または皮膚の試験部位の硬直した領域の発症によって特徴づけられる、皮膚性遅延型過敏性反応を示す。最後に、ヒトおよびモルモットの特徴的な結核性病変は、ラングハンス型巨細胞の存在を含む、類似の形態を示す。モルモットは、この疾患の初期感染および進行に対してヒトよりも感受性であるので、この動物モデルを用いる実験において付与される任意の防御は、ヒトまたは他のより感受性の少ない哺乳動物において、同じ防御免疫が生じ得るという強い示唆を提供する。従って、制限する目的ではなく、説明する目的のためにのみ、本発明を、哺乳動物宿主としてのモルモットの例示的な文脈において、最初に実証する。本発明が、ヒト、および家畜化された動物を含む、他の哺乳動物宿主を用いて実施され得ることは、当業者に理解される。病原性ベクター、および特に、細胞内生物に感染した動物またはヒトは、宿主免疫系に困難な挑戦を与える。多くの感染性因子は、体液性応答および対応する防御抗体の産生によって、効果的に制御され得るが、これらのメカニズムは、身体の細胞外体液中に位置するこれらの病原体に対してのみ主に有効である。詳細には、オプソニン作用を有する（opsonizing）抗体は、細胞外の外来因子に結合し、それにより、それらを食作用およびその後の細胞内殺傷に対して感受性にする。さらに、これは、他の病原体には当てはまらない。例えば、以前の研究では、液性免疫応答が、M．tuberculosisのような細胞内細菌による感染に対して重要な防御的役割を果たさないようであることを示していた。しかし、本発明は、標的病原体に対する有益な液性応答を生じさせ得、そしてそのこと自体、その有効性は、刺激された免疫応答の任意の特定の構成成分に限定されない。より詳細には、抗体に媒介される防御は、外見上、細胞内病原体の初期感染を阻止せず、そして一旦、細菌が宿主細胞の中に隔離されると効力がなくなる。水溶性タンパク質として、抗体は、細胞外の体液および血液に浸透し得るが、細胞の脂質膜を通って移動することは困難である。さらに、細菌の表面構造に対してオプソニン作用を有する抗体の産生は、実際、細胞内病原体が宿主細胞に侵入するのを補助し得る。したがって、Mycobacteriumのような細胞内因子に対する効果的な予防測定法は、無防備な食細胞を活性化するか、または、細胞傷害的にそれらを排除する、抗原特異的リンパ球の迅速な増殖をもたらす、攻撃的な細胞媒介性免疫応答成分を取り込むべきである。しかし、以下に詳細に議論するように、細胞媒介性免疫応答を誘導することは、防御免疫を誘導することと等しくはない。細胞媒介性免疫は、防御免疫の前提となる先行条件であり得るが、本発明の教示にしたがうワクチンの産生は、動物に基づいた抗原投与実験が必要である。この細胞媒介性免疫応答は、一般的に２つの工程を含む。細胞が感染したというシグナルを送る第一の工程は、細胞の表面に病原体の断片を送達する特別な分子（主要組織適合性分子、すなわちMHC分子）によって達成される。これらのMHC 分子は、感染細胞の中で分解された細菌タンパク質の小フラグメントに結合し、そしてそれらを細胞表面に提示する。Ｔ細胞に対するこれらの提示は、宿主の免疫系を刺激して、感染宿主細胞を除去するか、または、宿主細胞の中に存在している全ての細菌を根絶するように宿主細胞を誘導する。ほとんどの感染性細菌とは異なり、M．tuberculosisを含むMycobacteriumは、膜によって細胞の残りの部分から実質的に密封されている液胞の中で増殖する傾向がある。食細胞はこれらの防御的な液胞を自然に形成し、このことは、このクラスの病原体による感染に対して食細胞を特に感受性にする。このような液胞において、細菌は、分解から効果的に保護され、免疫系が、感染した細胞の表面に完全な細菌成分を提示するのを困難にする。しかし、感染細胞のMHC分子は、液胞に移動し、そして遊離の（解離した）細菌産物を収集するか、または、細胞表面における産物の正常な提示のために、外来の細胞外細菌産物が輸送された、宿主細胞の他の部位に移動する。以前に示されたように、外来細菌産物の提示は、宿主の免疫系による適正な応答を誘発する。免疫系に対して提出された問題の細胞内病原体はまた、ワクチン開発に対する特別な挑戦を構成する。これまで、ほとんどの研究者には、Mycobacterium感染、および特に、M．tuberculosisに対する効果的なワクチンの産生を見出さなかった。現在、細胞内病原体に対して広範に利用可能なワクチンは、M．bovisの無毒性株である、生菌弱毒化ワクチンのBCGのみであり、これは、結核菌に対する予防測定法として用いられる。さらに、1988年には、インドの世界保健機構の広範な研究によって、最良のBCGワクチンの効力は測定できないほど僅かであると決定された。この問題となり得る効果にも関わらず、世界中の結核の高発生地域で、BCGワクチンが広範に用いられてきた。問題をなおさらに複雑にしているのは、BCGでワクチン接種された個体が、しばしば、結核のスクリーニングおよびコントロールに関する最も一般的な皮膚試験の有効性を打ち消す、ツベルクリンに対する感受性を発生することである。 BCGのような生菌弱毒化ワクチンを用いることに関する別の深刻な問題は、免疫無防備状態の患者が、生命を脅かす疾患を起こす可能性があることである。迅速に増殖する誘導された感染と闘う能力が低下しているので、これらのワクチンは、細胞媒介性免疫が低下している人に特別の危険を与える。このような個体には、栄養不良および劣悪な生活状態によって弱っている個体、器官移植のレシピエント、ならびに、HIVに感染した人が含まれる。BCGワクチンの場合には、危険性の高い個体には、気腫、慢性気管支炎、塵肺、珪肺、および以前の結核のような肺疾患を患っている人も含まれる。したがって、弱毒化ワクチンの使用は、まさに、それらが最も高い潜在的有益性を有する集団に限られている。生菌弱毒化ワクチンの使用はまた、他の望ましくない副作用をもたらし得る。生ワクチンはレシピエント中で繁殖するので、非感染性ワクチンよりも広範な抗体および方向性のより少ない細胞媒介性免疫応答を誘発する。このショットガンアプローチは、細胞性の防御に最も関与する分子構造に向けられた免疫応答を妨害する傾向を有する。さらに、インタクトな膜を有する生ワクチンの使用は、効果的な食作用のため外来の物体（body）を調製するオプソニン作用を有する抗体を誘導し得る。したがって、宿主が標的生物の毒性株に曝される際、このような抗体の存在により、弱毒化されていない病原体が生存し、そして増殖し得る宿主細胞へのこれらの病原体の取り込みが実際に促進され得る。さらに、弱毒化ワクチンは、何千もの異なる分子種を含み、その結果、おそらく患者において毒性であるか、または、有害な免疫応答を誘発し得る分子種を含む。生ワクチンが有する他の問題には、毒性の復活、接触による自然の伝染、混入しているウイルス、およびウイルス干渉、ならびに標準化に伴う困難が含まれる。同様に、殺傷された生物、または強度に抗原性の膜結合構造に対する従来の第２世代サブユニットワクチン（second generation subunit vaccine）のような非感染性ワクチンは、細胞内細菌の阻害に関して限定される。弱毒化ワクチンと同様、死菌は、最も効果的な防御的決定因子を阻害し得る無差別の応答を誘発する。さらに、死菌ワクチンは、なお、免疫系に対して、多数の潜在的に抗原性の構造を提示し、それによって、免疫系による毒性反応、またはオプソニン化の可能性を増加させる。膜結合構造を取り込む伝統的なサブユニットワクチンはまた、合成されたものも、精製されたものもいずれも、細胞内病原体が繁殖する食細胞中への細胞内病原体の侵入を促進する強いオプソニン効果を誘導し得る。細菌の含有率を増加させることによって、細胞内表面抗原に対する死菌ワクチンは、病原性因子の相対的な毒性を増加させ得る。したがって、強い抗原性の細菌表面成分に対する従来の弱毒化または死菌ワクチンは、細胞内病原体の場合に禁忌を示し得る。伝統的なワクチンの使用に関連した問題を回避するために、特定の細胞内病原体に対する防御免疫を刺激するために、細胞外タンパク質、またはそれらの免疫原性アナログを用いて開発が行われてきた。例えば、本発明者らの1992年４月28 日発行の米国特許番号5,108,745は、Legionella pneumophila、およびM．tuberc ulosis、およびその他の細胞内病原体に対する防御免疫を生じるワクチンおよび方法を開示する。これらの先行技術によるワクチンは、インビトロでは、病原性細菌によってブロス培養液中に細胞外に放出され、そしてインビボでは、感染した宿主細胞の中に細菌によって細胞外に放出される、タンパク質性化合物に本来由来する細胞外産物に広く基づいている。その中で開示されているように、これらのワクチンは、哺乳動物宿主の中で、標的病原体に対して強い免疫応答を刺激する細胞外産物、またはそのアナログの同定に選択的に基づいている。より詳細には、目的の病原体に対して免疫された哺乳動物において、強いリンパ球増殖応答、または皮膚性遅延型過敏性反応のいずれかを誘発する能力を決定することによって、これらの先行技術による候補となる細胞外タンパク質をスクリーニングした。この開示された方法、および関連するワクチンは、伝統的なワクチンの使用に固有の不利益の多くを回避するが、交差反応による矛盾する免疫応答結果および宿主の変化によって、効果的な免疫化剤を選択するのを複雑にし得る。したがって、分子的免疫原性は、効果的なワクチンの１つの指標であるが、他の要素が、それをインビボでの効果的な免疫応答の誘導における使用を複雑にし得る。より重要なのは、驚くべきことに、特にM．tuberculosisに関して、効果的な防御免疫を誘導するワクチンを同定するための従来の先行技術の方法は、厄介でありかつ潜在的に効果的でないことが発見されたことである。例えば、最も免疫原性のあるこれらの細胞外成分を同定することを目的とした、大量のM．tubercu losisの細胞外タンパク質のSDS-PAGE解析および続く従来のウエスタンブロット技術は、矛盾した結果を生じた。反復試験は、どの細胞外産物が最も強い免疫原性応答を生じ、そして先行技術の見解に一致し、それにより、最も効果的なワクチンとして機能するのかを同定できなかった。M．tuberculosisの細胞外産物の多くは、当技術分野において周知であり、既に同定され、そしていくつかの場合配列決定されている。さらに、任意の外来タンパク質と同様に、これらの公知の化合物が、免疫応答を誘導することを示し得る。しかし、当該分野において、これらの公知の化合物のいずれかが、伝統的に同定されたような防御免疫を誘導することを直接的に示すものは何もない。したがって、高度に特異的で、強い免疫原性の実施可能性に基づく伝統的なワクチンの考察および選択技術に頼らない、感染性の細菌性病原体に対する効果的な免疫応答の増加において、ワクチンまたは免疫治療剤、ならびにそれらを産生および使用するための方法を提供することが本発明の主な目的である。哺乳動物宿主において、M．tuberculosis、M．bovis、M．kansasii、M．avium -intracellulare、M．fortuitum、M．chelonei、M．marinum、M．scrofulaceum 、M．leprae、M．africanum、M．ulcerans、およびM．mlcrotiを含む、細胞内病原体に対する獲得免疫性を付与するために、ワクチンまたは免疫治療剤を提供し、そしてそれらを使用するための方法を提供することが、本発明の別の目的である。死菌、または弱毒化ワクチンと比較して、弱い毒性を示す、容易に作製されたワクチンおよび免疫治療剤を提供することは、本発明のさらなる目的である。発明の要旨本発明は、ワクチンおよび/または免疫療法剤として使用するための化合物、ならびに哺乳動物宿主において病原体による感染に対して防御的または治療的免疫反応を生じさせるために、それらを産生および使用するための方法を提供することによって、上記の目的および他の目的を達成する。広範な局面において、本発明は、細胞外化合物を産生する感染性ベクターに対して、防御的または治療的免疫応答を誘導するための手段を提供する。本発明の化合物は、病原性細菌に対して特に効果的であるが、主に豊富な細胞外産物を産生するあらゆる病原体に対する、防御的または治療的免疫応答を生じさせるために用いられ得る。本発明の目的について、「主に豊富な」とは、目的の病原体によって、最も大量に放出されるそれらの細胞外産物を同定する相対的な用語として理解されるべきである。例えば、種々の培養条件下で、約0.5の最適密度まで増殖されたM．tu berculosisに関して、当業者は、主に豊富な細胞外産物が10μg/L以上のオーダーで得られると予想するべきである。従って、例示的な４mg/Lの全量（正常な条件下またはヒートショック条件下で培養したM．tuberculosisの細胞外産物の全産出量）のうち、100種類のまたは公知の細胞外産物の、約15〜20種類（単独または組み合わせて）で、全量の約90％を構成する。これらは、本発明の範囲内であることが意図される主に豊富な細胞外産物細胞外産物であり、およびSDS/PAGE ゲル中に現れる太いバンドとして容易に同定可能である。さらに、目的の細胞外産物は、アミノ酸配列決定によってさらに特徴づけられ得、そして区別され得る。残りの細胞外産物は少量である。当業者はまた、特異的な主要細胞外産物の相対的な定量的豊富さは、培養条件に依存して変化し得ることを正しく認識する。しかし、ほとんどの場合、個々の主に豊富な細胞外産物を同定は変化しない。従って、本発明は、ウイルス病原体、細菌病原体、真菌病原体、または原生動物病原体による感染に対して、哺乳動物宿主を防御するために用いられ得る。ウイルス感染のような、いくつかの場合において、主に豊富な細胞外産物は、感染した宿主細胞によって産生され得る。主に豊富な細胞外産物を放出するすべての微生物に対して活性であるが、本発明のワクチンおよび方法は、Mycobacteria属の種々の種および血清型を含む、細胞内病原体に対する防御免疫を生じさせるのに特に効果的である。本発明のワクチンは、また、既存する疾患状態を処置するための免疫療法剤としても効果的である。驚くべきことに、細菌病原体またはそれらの免疫原性アナログによって細胞外に放出される、最もまたは主要に豊富な産物での免疫が、投与された化合物の絶対的な免疫原性に関わらず、効果的な免疫応答を誘発し得ることが、本発明者らにより見出された。生物からのそれらの放出に起因して、従って抗原プロセシングおよび抗原提示に関与する、宿主分子に対するそれらの利用可能性、および感染の間の組織において、それらが天然で高濃度であることに起因して、病原性因子の主に豊富な細胞外産物は、他の細菌性成分よりも頻繁にプロセスされ、そして宿主の免疫系に提示される。細胞内病原体の場合、主に豊富な細胞外産物は、感染した宿主細胞の表面に提示される主要な免疫原決定基であり、それゆえ、周囲の環境中により高い出現を示す。従って、病原性生物の主に豊富な細胞外産物に対して獲得される免疫性は、宿主の防御システムが、宿主細胞中に隔離された病原体を速やかに検出して、それらを効率よく阻害することを可能にし得る。より詳細には、病原性細菌によって放出される、主なまたは主要な豊富産物は、食細胞および他の宿主免疫系のメカニズムによって、それらそれぞれの免疫原性活性または特異性とは関係なく、優勢ではない病原性成分または膜結合した病原体の成分よりも速い速度でプロセスされるようである。この免疫プロセシングの不均衡性は、病原性因子が正常な免疫活性から隔離される細胞内細菌である場合、特に重要である。感染した宿主の免疫系に対して、豊富にかつ継続してそれらが提示されるため、ほとんどの豊富な細菌の細胞外産物またはそれらの免疫原性アナログは、個々の分子の免疫原性特徴とはほとんど無関係に、激しい免疫応答を誘発する。主に豊富な細胞外産物は、標的病原体によって、周囲の環境の中に放出されるタンパク質およびその他の分子実体の主な構成成分である。最近の研究により、単一の、主に豊富な細胞外産物は、微生物によって放出される産物の40重量％までを含み得ることが示された。より頻繁には、個々の主に豊富な細胞外産物は、感染性病原体によって放出される全産物の約0.5％〜約25％の間を占める。さらに、上位５種または６種の主に豊富な細胞外産物が、微生物により放出される全量の60％〜70％の間を含むことが見出され得る。もちろん、当業者は、細胞外産物の相対的なレベルが、産物の絶対的なまたは相対的な量が放出され得るように、経時的に変動し得ることを認識する。例えば、pH、酸化剤、浸透性、熱、および、生物に対する他のストレス条件、生活環の段階、生殖状態、および周囲の環境の組成物は、放出される産物の組成および量を変化し得る。さらに、細胞外産物の絶対的および相対的レベルは、種間ならびに種間でさえ菌株内で大きく異なり得る。細胞内病原体の場合、細胞外産物は、生菌を含むマクロファージに対する抗菌効果を検出および行使し得る、特異的免疫性のリンパ球の集団を拡張するようである。さらに、感染細胞の表面上でのそれらの反復提示により、主に豊富ななまたは主な細胞外産物は、効果的な抗原性マーカーとして機能する。従って、本発明の教示により、病原性細菌の主に豊富な細胞外産物またはそれらの免疫原的に等価な決定基に対して指向されるワクチン接種および防御免疫の誘導は、その後標的病原体により感染をされる場合、宿主の免疫系が、強力な細胞媒介性成分と、迅速で効果的な免疫応答とを備えるように促す。個々にスクリーニングした病原体成分の、高度に特異的な分子抗原性に基づくワクチンの産生および免疫応答の刺激に対して焦点が集められてきた先行技術の免疫化作用とは正反対に、本発明はあまり優勢ではない細胞外産物よりも低い免疫特異性を実際には示し得る化合物を用いて、防御免疫を確立または誘導するための細菌の細胞外産物またはそれらの免疫原性アナログの相対的な豊富さ（それらの免疫原的な特異性ではない）を有利に活用する。本開示の目的のために、免疫原性アナログは、標的病原体によって発現される、主に豊富な細胞外産物の少なくとも１つに十分に類似する任意の分子もしくは化合物、またはその任意の画分であり、標的病原体によるその後の感染の際に、ワクチン接種された哺乳動物宿主における防御免疫応答を刺激する能力を有する。簡単には、主に豊富な細胞外産物または特異的な病原体によって細胞外に放出される産物（または、実質的に等価な免疫応答を刺激し得る分子アナログ）を選択し、そしてそれらを比較的純粋な形態で分離した後、それらの合成的産生もしくは内因的産生を可能にするために、それらの産生を担うDNAまたはRNAを配列決定することによって、本発明のワクチンは同定または産生される。次いで、当該分野において周知の技術を用いて、一つ以上の単離された免疫反応性産物またはコード遺伝子物質を処方し、そして標的病原体による感染に先行して哺乳動物宿主を免疫することによって、標的病原体に対する所望の予防免疫応答が誘導され得る。本発明は、少なくとも１つ、２つ、または、潜在的に数個でさえある十分に規定された免疫原性決定基からなる。結果として、本発明により比較的簡易で迅速に、開発、試験、および投与され得る一貫した標準化ワクチンが産生される。さらに、主に豊富な分泌性産物または細胞外産物に対応する、いくつかの十分に規定された分子の使用により、従来のワクチンに関連する有害な副作用の危険が大いに減少され、そして効果的な免疫原性マーカーの潜在的な閉塞（occlusion）を排除する。同様に、本発明は、弱毒化ワクチンでもなく死菌ワクチンでもないので、製造、精製の間、または投与の際の感染の危険が効果的に排除される。従って、本発明のワクチンは、無症候性の結核患者およびHIV感染者を含む、免疫無防備状態の個体に安全に投与され得る。さらに、体液性免疫応答は、標的病原体によって放出される産物に排他的に指向されるので、有害なオプソニン免疫成分を生成する機会はほとんどない。従って、本発明は、抗体感受性領域からの標的病原体の除去を補助する刺激された体液性応答を可能にする。本発明の、別の有益な局面は、ワクチンの採集または産生、ならびにその後の精製および配列決定が容易なことである。例えば、優性豊富細胞外産物は、ほとんど努力することなく、M．tuberculosis、またはM．bovisを含む標的病原体の培養から得ることができる。増殖の間に、所望の化合物が培地の中に放出されるので、従来の技術を利用して、それらを容易に、標的病原体の菌内成分および膜結合成分から分離し得る。より好ましくは、本発明のワクチンの所望の免疫反応成分は、M．tuberculosis、M．bovis、M．leprae、または他の任意の目的の病原体の、特異的な細胞外産物を発現する遺伝子がクローン化されている、遺伝子操作された生物から産生および精製され得る。当該分野において知られているように、このように操作された生物は、選択された細胞外産物または改変された免疫原性アナログを高いレベルで産生するように改変され得る。あるいは、免疫防御産物、その一部分、またはそのアナログは、当該分野において周知の技術を用いて化学的に合成され得るか、またはそれをコードする裸の遺伝子を注入された宿主細胞において直接発現され得る。どのような産生供給源が用いられても、優勢豊富細胞外産物または主に豊富な細胞外産物の免疫原性成分は、分離され得、その後、分画、クロマトグラフィー、または他の精製方法論および従来の処方技術のような一般的な生化学的手順を用いて、輸送可能なワクチンに処方され得るか、または直接導入された、それをコードする遺伝子構築物を含む宿主細胞中で直接発現され得る。例えば、本発明の例示的な態様において、標的病原体は、M．tuberculosisであり、そしてM．tuberculosisによって細胞外からブロス培養液中に放出される主に豊富な産物は、他の細菌成分から分離され、そして哺乳動物宿主における免疫応答を誘発するために用いられる。次いで、個々のタンパク質、またはタンパク質の群を、動物ベースの抗原投与実験において利用して、本発明の教示に従ってワクチンとして用いるのに適するようにされる防御免疫を誘導するタンパク質またはタンパク質の群を同定する。より詳細には、細菌の増殖および回収後、それらの物理的豊富さにより、遠心分離および濾過によって、細胞内成分および他の成分から主な細胞外産物を分離する。所望である場合、次いで、得られた大量の濾液から、硫酸アンモニウム沈澱およびその後の透析を用いる分画に供して、一般的にEPと呼ばれる細胞外産物の混合液を得る。次いで、当該分野において既知の、およびより充分に以下に記載されている適切なクロマトグラフィー技術を用いて、透析された画分中の可溶化細胞外産物を実質的に均質になるまで精製する。これらの例示的な手段によって、110キロダルトン（KD）から12 KDの範囲の分子量を有する、14個の個々のタンパク質性の、M．tuberculosisの主な細胞外産物の産生がもたらされる。精製後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供される場合、個々の主に豊富な細胞外産物はそれぞれの分子量に対応する一本のバンドを示し、これによって、主に豊富な細胞外産物に対応する個々の産物または産物の群のそれぞれを、本発明の教示に従って、ワクチンとして用いるために、同定および調製することが可能になる。精製された主に豊富な細胞外産物は、当該分野において一般的な技術を用いて、それらのそれぞれのアミノ酸配列の全てまたは部分を決定することにより、特徴づけられ得、そして区別され得る。配列決定はまた、主に豊富な細胞外産物間の、可能な構造的関連性に関する情報を提供し得る。続いて、時間経過にわたる、精製された細胞外産物の連続した皮下または皮内注射を利用して、本発明の教示により、哺乳動物宿主系における免疫化および獲得される免疫性の刺激が達成される。例えば、精製された主に豊富な細胞外産物またはフロイント不完全アジュバント中の産物を用いて注射、約３週間後の同じアジュバント中の二回目の注射を用い、その後の病原性病原体を用いる抗原投与の際の防御応答を誘導し得る。本発明の範囲および教示の範囲内にある別の例示的な免疫化プロトコルは、精製した細胞外産物またはSyntex Adjuvant Formulat ion（SAF）中の産物またはそのアナログの、期間にわたる３回または４回の連続注射を包含し得る。連続注射が一般的により有効であることが証明され得、選択された主に豊富な細胞外産物またはその免疫原性サブユニットもしくはアナログの単回投与は、所望の免疫応答を付与し得、そして同様に本発明の範囲内にあることが意図される。このような例示的なプロトコルは、当該分野で受容されたモルモットのような実験モデルを用いて示され得る。例えば、詳細に考察されるように、数匹のモルモットの免疫は、５つの主に豊富な細胞外産物（以前に記載のように、M．tuber culosisから精製された）の組み合わせを用いる、SAFアジュバント中の細菌性産物の連続３回注射免疫化、および対応するコントロール動物の模擬免疫化を伴った。各タンパク質の例示的な投与量は、100μgから２μgの範囲であった。最後のワクチン接種後、すべての動物を同時に、感染性があり、潜在的に致死的な用量のエアゾール化M．tuberculosisに曝露して、そしてさらなる時間についてモニターした。M．tuberculosisの主に豊富な細胞外産物の組み合わせを用いて免疫化した動物と比較すると、免疫化された動物はいずれも結核で死亡しなかった。さらに、コントロール動物の半数がモニター期間中に死亡したが、コントロール動物は有意な体重の減少を示した。この実験の後の剖検により、非免疫化コントロール動物は、防御された動物よりも肺および脾臓における有意に高いコロニー形成単位（CFU）および対応する損傷を有した。さらに精製された主に豊富な細胞外産物の17個のさらなる組み合わせが試験された場合、免疫予防性を提供した。これにより、本発明の範囲およびその教示に従って処方され得るワクチンの広い範囲が示された。しかし、本発明が、分泌性産物または細胞外産物の組み合わせに限定されないことは強調されるべきである。例えば、いくつかの別の実験プロトコルにより、１つの豊富細胞外産物が、本発明の教示に従って、哺乳動物の防御免疫を誘導することが示される。各実験において、モルモットは、本明細書中で詳述されるクロマトグラフィープロトコルを用いてM．tuberculosis EPから精製された、単一の主に豊富な細胞外産物で免疫化された。一つの実施例において、複数の実験で、30 KDに対応する分子量を有する精製された豊富な分泌産物を含むアジュバント組成物を用いて、動物をワクチン接種した。本発明の別の実施例において、異なるモルモットが、71 KDに対応する分子量を有し、M．tuberculosisから単離された豊富細胞外産物を含むアジュバント組成物を用いてワクチン接種された。動物および適当なコントロールの両方のセットのそれぞれの免疫化後、致死的用量のエアゾール化M．tuberculosisに曝露して、ワクチンの有効性を決定した。より詳細には、一つの実験において、６匹のモルモットを、６週間にわたる期間中３回において、SAF中の100μgの30 KDタンパク質を用いて免疫化した。対応する用量の、細胞外タンパク質（EP）の模擬調製物または緩衝液を用いて、コントロール動物に同時にワクチン接種した。最後のワクチン接種の３週間後、致死的な用量のエアゾール化M．tuberculosisを用いて抗原投与して、14週間モニターした。30 KDで免疫化したモルモットおよび模擬細胞外調製物で免疫化したモルモットは、それぞれ、67％および50％の生存率を有した（主に豊富な細胞外産物対EPの予想外の優れた能力を示している）が、模擬免疫化された動物は、僅かに17％の生存率であった。実験を終了する際に、動物を屠殺し、そして生存能力のある結核菌について調べた。当然ながら、非免疫化動物は、肺および脾臓において、顕著に高い濃度のM．tuberculosisを示した。同様の実験を、71 KDタンパク質をワクチン接種した動物に対して行なった。１つの実験において、３週間にわたって２回、100μgの精製された71 KDタンパク質を含むSAFアジュバント組成物を用いて、６匹のモルモットをワクチン接種した。同様に、陽性コントロールとして使用するために未精製の細胞外タンパク質またはEPの模擬調製物を用い、陰性コントロールとして使用するために緩衝液を用いて、別の動物を免疫化した。致死用量のエアゾール化結核菌への曝露後、モルモットの体重を６ヶ月間モニターした。ここでも、精製形態の豊富な細胞外産物で免疫化した動物は、病原性のM．tuberculosisに関して、防御免疫を生じた。この期間の終了時まで、緩衝液で免疫化された動物は、免疫化された動物と比較する場合、有意な体重の減少を示した。さらに、陽性コントロールおよび71 KDで免疫化した動物は、それぞれ、63％と50％の生存率を有し、非免疫化動物は、観察期間が終了する前に全て死亡した。ワクチンの処方は、本発明に決定的でなく、そして投与を促進するために最適化され得ることを留意することは重要である。病原体の主に豊富な細胞外産物に由来する精製された免疫原性決定基の溶液は、防御的な免疫応答を生じるように設計された任意の様式において、単独でまたは組み合わせて投与され得る。精製タンパク質溶液は、単独で輸送され得るか、または投与される前にアジュバントと処方され得る。選択された免疫原性決定基の活性を増強するための、本発明で用いられる特異的な例示的アジュバントは、SAF、モノホスホリルリピドＡ（Mon ophosphoryl Lipid A: MPL）を含むアジュバント、フロイント不完全アジュバント、死菌を含むフロイント完全アジュバント、γインターフェロン（Radfordら、American Society of Hepatology 2008-2015，1991; Watanabeら、PNAS 86: 9 456-9460，1989; Gansbacherら、Cancer Research 50:7820-7825，1990; Maioら、Can．Immunol．Immunother.30: 34-42，1989; 米国特許第4,762,791号、および同第4,727,138号）、MF59、MF59プラスMTP、MF59プラスIL-12、MPLプラスTDM（トレハロース（Dimycolate））、QS-21、QS-21プラスIL-12、IL-2（アメリカンタイプカルチャーコレクション第39405号、同第39452号、および同第39516号；米国特許第4,518,584号）、IL-12、IL-15（Grabsteinら、Science 264: 965-968 ，1994）、ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ddA）、ddAプラスデキストラン、ミョウバン、Quil A、ISCOMS（免疫刺激性複合体）、リポソーム、脂肪キャリア、タンパク質キャリア、およびマイクロカプセル化技術である。本発明において有用であり得るさらなるアジュバントは、水中油乳化剤、無機塩（例えば、ミョウバン）、核酸、ブロックポリマー界面活性剤、および微生物細胞壁（ペプチドグリコリピド）である。本発明の範囲を制約しないが、アジュバントは、注射部位からの抗原の遅延放出に起因して、免疫応答を強化し得ると考えられる。あるいは、免疫原性決定基の内因性発現、およびその後の防御免疫を誘導するために、主に豊富な細胞外産物に由来する１つ以上の免疫原性決定基の遺伝子をコードする遺伝物質は、真核生物プロモーターおよび/または分泌配列と結合され得、そして哺乳動物宿主に直接注射され得る。本発明の他の目的、特徴、および利点は、最初に簡単に説明される図面と合わせて、その好ましい例示的な態様の以下の詳細な記載を考慮することにより、当業者には明白である。図面の簡単な説明図１は、クーマシーブルー染色した４枚のゲルの表示で、1a〜1dと分類されており、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）によって同定された、M．tuberculosisの例示的な主に豊富な細胞外産物の精製を示している。図２は、M．tuberculosisの、14個（配列番号：１〜14）の例示的な主に豊富な細胞外産物の５個のＮ末端アミノ酸を同定する表による表示である。図３は、M．tuberculosisの、図２で示されたＮ末端アミノ酸により区別できなかった、３個（配列番号：15〜17）の例示的な主に豊富な分泌産物の伸長されたＮ末端アミノ酸の表による表示である。図４は、致死用量のエアゾール化M．tuberculosisへの曝露後の、例示的に精製されたM．tuberculosisの30 KD主に豊富な分泌産物で免疫化したモルモットの生存率と、細胞外タンパク質の先行技術の模擬調製物で免疫化したポジティブコントロールおよび非免疫化ネガティブコントロールの生存率との、グラフによる比較である。図５は、致死用量のエアゾール化M．tuberculosisへの曝露後の、精製した71 KDの主に豊富な細胞外産物および非免疫化ネガティブコントロールで免疫化した動物のモルモット平均体重の、グラフによる比較である。図６は、致死用量のエアゾール化M．tuberculosisへの曝露後の、M．tubercul osisの71 KD主に豊富な細胞外産物で免疫化した図５のモルモットの生存率と、先行技術によるM．tuberculosisの細胞外タンパク質の全体調製物で免疫化した陽性コントロールおよび非免疫化ネガティブコントロールの生存率との、グラフによる比較である。図７は、第２の別個の実験において、致死用量のエアゾール化M．tuberculosi sへの曝露後の、例示的な精製した71 KDの主に豊富な細胞外産物で免疫化した動物、M．tuberculosisからの細胞外タンパク質の先行技術の模擬調製物で免疫化したポジティブコントロール、および非免疫化ネガティブコントロールの、モルモット平均体重の、グラフによる比較である。図８ａおよび８ｂは、PPD+（M．tuberculosisによる感染の指標）およびPPD- ヒト被験体における、例示的な精製した71 KD主に豊富な細胞外産物に対するリンパ球増殖応答のグラフによる比較である。図８ａは、この抗原とリンパ球とのインキュベーション後２日目に測定された値のグラフであり、一方、図８ｂはインキュベーション後４日目に測定された値のグラフである。図９は、致死用量のエアゾール化M．tuberculosisへの曝露後の、本発明の教示に従って産生された細胞外産物の組み合わせを含むワクチンで免疫化された動物、および非免疫化ネガティブコントロールで免疫化した動物のモルモット平均体重の、グラフによる比較である。図10は、致死用量のエアゾール化M．tuberculosisへの曝露後の、本発明の教示に従って産生された細胞外産物の組合せを含むワクチンの３つの異なる投与量で免疫された動物、および非免疫化ネガティブコントロールで免疫化した動物のモルモット平均体重の、グラフによる比較である。図11は、致死用量のエアゾール化M．tuberculosisへの曝露後の、本発明の教示に従って産生された細胞外産物の組み合わせを含むワクチンの６つの異なる投与量で免疫された動物、および非免疫化ネガティブコントロールで免疫化した動物のモルモット平均体重の、グラフによる比較である。図12ａおよびｂは、M．tuberculosisの30 KDのタンパク質の免疫優性エピトープのマッピングのグラフによる例示である。図12ａは、30 KDのタンパク質配列全体を覆う重複ペプチド（15マー）に対して応答する30 KDのタンパク質で免疫化した24匹のモルモットのパーセントを例示する。図12ｂは、19匹の模擬免疫化したモルモットの群に関して、データの対応のセットを例示する。各群の動物の、天然の30 KDタンパク質、精製タンパク質誘導体（PPD）、およびコンカナバリンＡ（con A）に対する応答を、各グラフの右側に示す。図13は、組換え30 kDaタンパク質の発現のために用いられた構築物の模式的表示を提供する。この図は、組換え30 kDaタンパク質の発現のために用いられたpE T22bを描く。このベクターは、それ自身のリーダー（30W-pET22b）、またはプラスミドがコードするpelBリーダー（30M-pET22b）に融合された成熟30 kDaタンパク質を発現する。使用する略語：Ori、ColE1型複製起点；F1 ori、F1ファージの複製起点；Amp、アンピシリン抵抗性遺伝子；30W/M、全長（30W）または成熟（3 0M）の30 kDaタンパク質；lacI、lacリプレッサー遺伝子；P_T7、ファージT7のRN Aポリメラーゼ特異的プロモーター；NdeIおよびNcoI、ベクター/インサートが接合部の制限酵素部位。図14は、E．coli BL21(DE3)pLysSにおける全長30 kDaタンパク質および成熟30 KDaタンパク質の発現を確認する,電気泳動試験の結果およびウエスタンブロット解析を示す。図15は、30 kDaタンパク質を発現するために用いた別の構築系の模式図を示しす。図16は、M．smegmatisにおける、M．tuberculosisの30 kDaタンパク質の発現を確認する電気泳動試験の結果を示す。図17は、M．smegmatisにおける、M．tuberculosisの30 kDaタンパク質の発現を確認するウエスタンブロット解析の結果を示す。詳細な説明本発明は、化合物およびその産生方法、ならびにワクチンおよび免疫療法剤としての、病原性生物に対する使用に関する。より特異的には、本発明は、病原性生物によって放出される主に豊富な細胞外産物、それらの免疫原性アナログ、またはワクチンもしくは免疫療法剤としてそれらをコードする関連した遺伝物質の産生および使用に関し、ならびに哺乳動物宿主における、感染に対する防御免疫を生じさせるための関連の方法に関する。これらの化合物は、簡便のために、本出願を通じてワクチンと呼ばれる。本発明の教示を説明する、例示的な態様において、M．tuberculosisの主に豊富な細胞外産物は、分画され、そして続いて精製された。個々の産物の特異的な分子免疫原性も決定を伴わないで、これらの主要優勢細胞外産物の精製形態を用いて、モルモットを免疫化した。さらに、精製した細胞外産物を、単独でまたは組み合わせて、そして種々の投与用量および投与経路を用いて、例示的な免疫を行なった。当業者は、本発明の方法を実施するための、任意の病原性生物または細菌を用いて前述の任意のさらなるストラテジーが利用され得、従って、本発明は、M．tuberculosisに関するワクチンおよび方法に特定して限定されないことを認識する。これらの例示的な態様において、M．tuberculosisの主に豊富な細胞外産物は、カラムクロマトグラフィーを用いて、分離および精製された。ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて、細胞外産物の相対的な豊富さ決定および精製が達成された。ワクチン成分の精製後、主に豊富な細胞外産物を、単独または組み合わせて、モルモットを免疫化し、そしてその後M．tuberculosisを用いて抗原投与した。詳細に記載するように、免疫後、これらの細胞外産物に対して、予測される測定可能な応答を生じさせたことに加えて、本発明のワクチンは、その後のエアゾール化した致死量のM．tuberculosisに対する効果的な免疫性を、予想外にこれらの実験動物に付与した。これらの例示的な態様は、精製形態の細胞外産物を用いたが、当業者は、当該分野において周知の技術を用いる組換え手段、または化学合成の別の形態によっり産生される免疫原性アナログを用いて、本発明は容易に実施され得ることを認識する。さらに、本発明の範囲および教示の範囲内で、天然に存在する産物の代わりに、免疫原性アナログ、ホモログ、または主に豊富な細胞外産物の選択されたセグメントを用い得る。本発明のさらなる理解は、ワクチンとして、主に豊富な細胞外産物を同定、単離、産生、および（単独、および組み合わせて）使用するための例示的プロトコルを示す、以下の制限されない実施例から、当業者に提供される。実施例実施例１ Mycobacterium tuberculosisからのバルク細胞外タンパク質（EP）の分離および生産 M．tuberculosis Erdman株（ATCC 35801）を、American Tissue Culture Coll ection（Rockville，Md.）から入手した。凍結乾燥細菌を、Middlebrook 7H9培地（Difco Laboratories，Detroit，Mich.）で溶解し、Middlebrook 7H11寒天上で維持した。7H11寒天を、Cohn（Cohn，M．l.，Am．Rev．Respir．Dis．98:295- 296）が以前記述し、本明細書中で参考として援用したように、Bacto Middlebro ok 7H10寒天（Difco）、OADC増菌培地（Difco）、0.1％カゼイン酵素水解物（Si gma）およびグリセロールを用いて調製した。高圧蒸気滅菌後、寒天を細菌用のペトリ皿（100×15 mm）に分けて、放冷した。次いでM．tuberculosisを、無菌法を用いてプレートし、５％CO₂-95％空気、湿度100％下で37℃で増殖した。7H11での7日間の培養後、コロニーをプレートからかき取り、7H9ブロスに懸濁して10⁸CFU／mlとし、1.8 ml Nuncクリオチューブ（Roskilde，Denmark）に等分した。本ブロスは１リットルにつき、Bacto Middl ebrook 7H9粉末4.7 gを蒸留水998 mlおよびグリセロール（Sigma Chemical Co., St．Louis，Mo.）２ mlで再水和して調製し、次いでこの混合物のpH値を6.75に調整し、このブロスを121℃で15分間高圧滅菌した。次いで、等分した細胞を徐々に凍結し、−70℃で保存した。これらの条件下で保存した細胞は無期限に生存可能であったため、必要に応じて用いた。バルク細胞外タンパク質（EP）調製物は、上述したように作製したMiddlebroo k 7H9ブロスにおいて増殖したM．tuberculosisの培養から得た。溶解後、ブロスの150 mlアリコートを121℃で15分間高圧滅菌し、通気孔付きCo-star 225 cm²組織培養フラスコに分けた。前段落に記述したように−70℃で保存したM．tubercu losis細胞を解凍し、そして7H11寒天プレートに接種するために用いた。７日間培養した後、コロニーをプレートからかき取り、7H9ブロス数mlに懸濁し、水浴中で超音波処理して単細胞懸濁液を作製した。M．tuberculosis細胞を、Perkin- Elmer Juniorモデル35分光光度計（Norwalk，Conn）によって測定したように、初期光学密度0.05において無菌150 mlアリコートに懸濁した。次いで、懸濁液が光学密度0.4〜0.5を呈するまで、細胞を５％CO₂-95％空気下で37℃で３週間インキュベートした。これらの培養はまた、7H9ブロスでの後続培養のためのストックボトルとして用いた。ストックボトルを水浴中で超音波処理し、単細胞懸濁液を作製した。次いで、M．tuberculosis細胞を、初期光学密度0.05まで7H9ブロスで希釈し、そして本懸濁液が光学密度0.4〜0.5を示すまで、細胞を５％CO₂-95％空気下で37℃で２ 1/2から３週間インキュベートした。次いで、培養上清をデカントし、連続的に0.8μmおよび0.2μm低タンパク質結合フィルター（Gelman Sci ences Inc.，Ann Arbor，Mich.）に通して濾過滅菌した。次いで、濾液は10 KD カットオフを有するOmega膜を用いてFiltron Minisetteで約35倍まで濃縮し、そして４℃で保存した。ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）によるバルク細胞外タンパク質調製物の分析により、複数のバンドを有するタンパク質組成を明らかにした。バルク細胞外タンパク質混合物（EP ）を、培養濾液の40％〜95％硫酸アンモニウム画分を得ることによって調製した。実施例２ Mycobacterium tuberculosisの主に豊富な細胞外産物の精製硫酸アンモニウム（グレードＩ、Sigma）を、０℃で10％〜95％の範囲の濃度で実施例１の無菌培養濾液に添加し、タンパク質を分画するためにゆるやかに攪拌した。次いで、懸濁液をプラスチック瓶に移し、そしてRC3B Sorvall Centrif ugeにおいてスイングローターで3,000 rpmで遠心分離し、得られた沈殿物をペレット状にした。上清をデカントし、そして目的の産物に依存して上清またはペレットをさらなる精製に供した。目的の生産物が上清液に含まれる場合、第２の硫安アンモニウム画分を、塩濃度を第１の画分の濃度以上に増加することによって達成した。おだやかな攪拌の期間後、次いで、溶液を、所望の生産物を沈殿させるために前述したように遠心分離し、そして第２の上清をさらなる精製に供した。遠心分離後、沈殿したタンパク質は適切な冷緩衝液で再可溶化し、そして塩を除去するために6,000〜8,000分子量カットオフのSpectrapor透析膜（Spectrum M edical Industries，Los Angeles，California）で広範に透析した。細胞外タンパク質濃度を、ビシンコニン酸タンパク質定量法（Pierce Chemical Co.，Rockf ord，Illinois）により測定し、そして分画成分をSDS-PAGEを用いて決定した。次いで、画分をさらなる精製のためにクロマトグラフィーカラムにアプライした。直前に概説した一般的なスキームを用いて、実施例１に詳述したプロセスによって得られたバルク細胞外タンパク質濾液から14種類の細胞外タンパク質を精製した。分離した各細胞外生産物に関する正確な硫酸アンモニウム沈殿の手順およびクロマトグラフィーのプロトコルを、以下に詳述する。Ａ．110 KD 細胞外産物１．50％〜100％硫安沈殿物を、上記で議論したように得た。２．再可溶化した沈殿物を透析し、そして10％ソルビトール、10 mMリン酸カリウム（pH７）、５mM ２-メルカプトエタノール、および0.2 mM EDTAからなるカラム緩衝液を用いてDEAE Sepharose CL-6BまたはQAE Sepharoseイオン交換カラムにアプライし、そして塩化ナトリウム勾配で溶出した。110 KDタンパク質を含む画分は、約550 mM塩で溶出し、回収した。３．回収した画分を、PBS（リン酸緩衝食塩水）緩衝液中、S200 Sepharoseサイズ分画カラムにアプライした。タンパク質は均一な110 KDタンパク質として溶出した。Ｂ．80 KD 細胞外産物１．0〜25％硫安画分（0℃で1時間）を廃棄し、25％〜60％硫安画分（0℃で一晩）は上記で議論したように保持した。２．DEAE CL-6Bカラム（Pharmacia）を１M NaClを含む25 mMトリス（pH 8.7）を充填し、25 mMトリス（pH 8.7）、10 mM NaClで平衡化し、そしてタンパク質サンプルを25 mMトリス（pH 8.7）、10 mM NaClに対して透析し、そしてカラムにアプライした。カラムを、同一の緩衝液で一晩洗浄した。25 mMトリス（pH 8. 7）中、10 mM〜200 mM NaClまでの最初の塩濃度勾配をカラムに流し、他のタンパク質を溶出した。第２の塩濃度勾配（200から300 mM NaCl）をカラムに流し、そして80 KDタンパク質が、約275 mM NaClで溶出した。３．Q-Sepharose HPカラムを、25 mMトリス（pH 8.7）、１ M NaClで充填し、そして25 mMトリス（pH 8.7）、10 mM NaClで再平衡化した。タンパク質サンプルを、25 mMトリス（pH 8.7）、10 mM NaClに対して透析し、そしてカラムにアプライした。カラムを同一の緩衝液で洗浄し、次いで25 mMトリス（pH 8.7）中、200〜300 mM NaClで溶出した。４．80 KDタンパク質を含有する画分を回収し、25 mMトリス（pH 8.7）、10 m M NaClに対して透析し、次いでSpeed-Vac濃縮器で１〜２mlまで濃縮した。タンパク質サンプルを、Superdex 75カラムにアプライし、25 mMトリス（pH 8.7）、 150 mM NaClで溶出した。80 KDタンパク質は、均一タンパク質として溶出した。Ｃ．71 KD 細胞外生産物１．40％〜95％硫酸アンモニウム沈殿物を、71 KD産物を０％CO₂下でpH 7.4の 7H9ブロスで培養し、そして週１回42℃で３時間ヒートショックした以外、上記で議論した通りに得た。沈殿物は、Initial Buffer（20 mM HEPES、２mM MgAc、 25 mM KCl、10 mM（NH₄）₂SO₄、0.8 mM DL-ジチオトレイトール（pH 7.0））に対して透析した。２．再可溶化した沈殿物を、Initial Bufferで平衡化したしたATPアガロースカラムにアプライした。溶出物を回収し、ATPアガロースカラムに再アプライした。71 KDタンパク質はカラムに結合した。３．その後、ATPアガロースカラムを、最初にInitlal Bufferで、次いで１M K Cl、次いでInitial Bufferで洗浄した。４．均一な71 KDタンパク質は10 mM APTを用いてカラムから溶出し、そしてリン酸緩衝液に対して透析した。Ｄ．58 KD 細胞外産物１．25％〜50％硫酸アンモニウム沈殿物を、上記で議論した通りに得た。２．再可溶化した沈殿物を透析し、そしてDEAE Sepharose CL-6BまたはQAE Se pharoseカラムにアプライし、そしてNaClで溶出した。回収した58 KDタンパク質を含有する画分は、約400 mM NaClで溶出した。３．次いで、回収した画分を、Sepharose CL-6Bサイズ分画カラムにアプライした。タンパク質は、約670〜700,000ダルトンで溶出した。４．溶出したタンパク質を、チオプロピル-セファロースカラムにアプライした。均一な58 KDタンパク質は、約250〜350 mM 2-メルカプトエタノールで溶出した。溶出したタンパク質を、SDS-PAGEを用いてモニターし、そして図1Aのカラム２に示した単一バンドを呈した。Ｅ．45 KD 細胞外産物１．ａ．0〜25％硫酸アンモニウム画分（０℃で１時間）を廃棄した。ｂ．25％〜60％硫酸アンモニウム画分（0℃で一晩）を保持した。２．ａ．DEAE CL-6Bカラム（Pharmacia）を、１M NaClを含有する2.5 mMトリス（pH 8.7）で充填し、そして25 mMトリス、10 mM NaCl（pH 8.7）で平衡化した。ｂ．タンパク質サンプルを、25 mMトリス、10 mM NaCl（pH 8.7）に対して透析し、そしてカラムにアプライした。次いで、カラムを同一の緩衝液で一晩洗浄した。ｃ．カラムを、25 mMトリス（pH 8.7）緩衝液中、塩濃度勾配（10 mM〜20 0 mM）で溶出した。45 KDタンパク質は、約40 mM NaClで溶出した。３．ａ．Q-Sepharose HPカラム（Pharmacia）を、１M NaClを含有する25 mMトリス（pH 8.7）で充填し、25 mMトリス、10 mM NaCl（pH 8.7）で再平衡化した。ｂ．タンパク質サンプルを、25 mMトリス、10 mM NaCl（pH 8.7）に対して透析し、そしてカラムにアプライし、その後続いて同一の緩衝液で洗浄した。ｃ．カラムを、25 mMトリス（pH 8.7）中、10〜150 mM NaClで溶出した。４．ａ．45 KD産物を含有する画分を回収し、プールし、そしてSpeed Vac濃縮器で１mlまで濃縮し、その後25 mMトリス、10 mM NaCl（pH 8.7）に対して透析した。ｂ．濃縮物を、25 mMトリス、150 mM NaCl（pH 8.7）で平衡化したSuperd ex 75カラムにアプライした。産物は、均一タンパク質として溶出した。溶出したタンパク質を、SDS-PAGEを用いてモニターし、そして図1Bのカラム２に示した単一バンドを呈した。Ｆ．32 KD 細胞外産物（Ａ）１．ａ．0〜25％硫酸アンモニウム画分（０℃で１時間）を廃棄した。ｂ．25％〜60％硫酸アンモニウム画分（０℃で一晩）を保持した。２．ａ．DEAE CL-6Bカラム（Pharmacia）を、１M NaClを含有する25 mMトリス（pH 8.7）で充填し、25 mMトリス、10 mM NaCl（pH 8.7）で平衡化した。ｂ．タンパク質サンプルを、25 mMトリス、10 mM NaCl（pH 8.7）に対して透析し、そしてカラムにアプライし、その後続いて同一の緩衝液で一晩洗浄した。ｃ．カラムを、25 mMトリス（pH 8.7）での塩濃度勾配（10 mM〜200 mM）で溶出した。32 KDタンパク質は、約70 mM NaClで溶出した。３．ａ．32 KD産物を含有する画分を、回収し、プールし、そして25 mMトリス、10 mM NaCl（pH 8.7）に対して透析し、Speed Vac濃縮器でタンパク質サンプルを１mlまで濃縮した。ｂ．次いで、濃縮物を、25 mMトリス、150 mM NaCl（pH 8.7）で平衡化したSuperdex 75カラムにアプライし、この緩衝液で溶出した。32 KD産物は均一なタンパク質として溶出した。４．ａ．Q-Sepharose HPカラム（Pharmacia）を、１M NaClを含む25 mMトリス（pH 8.7）を充填し、そして25 mMトリス、10 mM NaCl（pH 8.7）で再平衡化した。ｂ．タンパク質サンプルを、25 mMトリス、10 mM NaCl（pH 8.7）に対して透析し、そしてカラムにアプライし、その後続いて同一の緩衝液で洗浄した。ｃ．カラムを、100〜300 mM NaCl勾配で溶出した。均一タンパク質の標識 32Ａは約120 mM NaClで溶出し、図1Bのカラム４に単一バンドを示す。Ｇ．32 KD 細胞外産物（Ｂ）１．ａ．0〜25％硫酸アンモニウム画分（０℃で１時間）を廃棄した。ｂ．25％〜60％硫酸アンモニウム画分（０℃で一晩）を保持した。２．ａ．DEAE CL-6Bカラム（Pharmacia）を、１M NaClを含有する25 mMトリス（pH 8.7）で充填し、次いで25 mMトリス、10 mM NaCl（pH 8.7）で平衡化した。ｂ．タンパク質サンプルを、25 mMトリス、10 mM NaCl（pH 8.7）に対して透析し、カラムにアプライし、その後続いて同一の緩衝液で一晩洗浄した。ｃ．25 mMトリス（pH 8.7）中、10 mM〜200 mM NaClの予備の塩濃度勾配を流し、種々のタンパク質を溶出した。カラム平衡化後、第２の塩濃度勾配（20 0〜300 mM NaCl）を流した。32 KDタンパク質は、約225 mM NaClで溶出した。３．ａ．Q-Sepharose HPカラム（Pharmacia）を、１M NaClを含有する25 mMトリス（pH 8.7）を充填し、そして25 mMトリス、10 mM NaCl（pH 8.7）で再平衡化した。ｂ．タンパク質サンプルを、25 mMトリス、10 mM NaCl（pH 8.7）に対して透析し、カラムにアプライし、その後続いて同一の緩衝液で洗浄した。ｃ．カラムを、同一の緩衝液中、200〜300 mM NaCl勾配で溶出した。４．ａ．32 KD産物を含有する画分を回収してプールし、25 mMトリス、10 mM NaCl（pH 8.7）に対して透析し、その後Speed Vac濃縮器でタンパク質サンプルを１mlまで濃縮した。ｂ．次いで、濃縮物を、25 mMトリス、150 mM NaCl（pH 8.7）で平衡化したSuperdex 75カラムにアプライし、そして同一の緩衝液で溶出した。プロトコルＨを用いて分離した32 KDタンパク質と32KD産物とを区別するために、標識した32B生産物を、均一タンパク質として溶出し、そして図1Bのカラム３に単一バンドとして示す。Ｈ．30 KD 細胞外産物１．ａ．0〜25％硫酸アンモニウム画分（０℃で１時間）を廃棄した。ｂ．25％〜60％硫酸アンモニウム画分（０℃で一晩）を保持した。２．ａ．DEAE CL-6Bカラム（Pharmacia）を、１M NaCl含有25 mMトリス（pH 8 .7）を充填し、次いで25 mMトリス、10 mM NaCl（pH 8.7）で平衡化した。ｂ．タンパク質サンプルを、25 mMトリス、10 mM NaCl（pH 8.7）に対して透析し、そしてカラムにアプライし、その後続いて同一の緩衝液で一晩洗浄した。ｃ．カラムを、25 mMトリス（pH 8.7）緩衝液中、塩濃度勾配（10 mM〜20 0 mM）で溶出した。30 KDタンパク質は、約140 mM NaClで溶出した。３．ａ．30 KD産物を含有する分画を回収してプールし、25 mMトリス、10 mM NaCl（pH 8.7）に対して透析し、その後Speed Vac濃縮器でタンパク質サンプルを１mlまで濃縮した。ｂ．次いで、濃縮物を、25 mMトリス、150 mM NaCl（pH 8.7）で平衡化したSuperdex 75カラムにアプライし、そしてこの緩衝液で溶出した。30 KD産物は均一なタンパク質として溶出し、図IBのカラム５に単一バンドを示す。Ｉ．24 KD 細胞外産物１．ａ．0〜25％硫酸アンモニウム画分（０℃で１時間）を廃棄した。ｂ．25％〜60％硫酸アンモニウム画分（0℃で一晩）を保持した。２．ａ．DEAE CL-6Bカラム（Pharmacia）を、１M NaClを含有する25 mMトリス（pH 8.7）で充填し、次いで25 mMトリス、10 mM NaCl（pH 8.7）で平衡化した。ｂ．タンパク質サンプルを、25 mMトリス、10 mM NaCl（pH 8.7）に対して透析し、そしてカラムにアプライし、その後続いて同一の緩衝液で一晩洗浄した。ｃ．25 mMトリス（pH 8.7）中、10 mM〜200 mM NaClの予備の塩濃度勾配を流し、種々のタンパク質を溶出した。カラム平衡化後、第２の塩濃度勾配（20 0〜300 mM NaCl）を流した。24 KDが、約250 mM NaClで溶出した。３．ａ．Q-Sepharose HPカラム（Pharmacia）を、１M NaClを含有する25 mMトリス（pH 8.7）で充填し、そして25 mMトリス、10 mM NaCl（pH 8.7）で再平衡化した。ｂ．タンパク質サンプルを、25 mMトリス、10 mM NaCl（pH 8.7）に対して透析し、そしてカラムにアプライし、その後続いて同一の緩衝液で洗浄した。ｃ．カラムを、同一の緩衝液中、200〜300 mM NaCl勾配で溶出した。４．ａ．24 KD産物を含有する分画を回収してプールし、そして25 mMトリス、 10 mM NaCl（pH 8.7）に対して透析し、その後Speed Vac濃縮器でタンパク質サンプルを１mlまで濃縮した。ｂ．次いで、濃縮物を、25 mMトリス、150 mM NaCl（pH 8.7）で平衡化したSuperdex 75カラムにアプライし、同一の緩衝液で溶出した。24 KD産物は、均一なタンパク質として溶出し、図1Bのカラム７に単一バンドを示す。Ｊ．23.5 KD 細胞外産物１．ａ．0〜25％硫酸アンモニウム画分（０℃で１時間）を廃棄した。ｂ．25％〜60％硫酸アンモニウム画分（０℃で一晩）を保持した。２．ａ．DEAE CL-6Bカラム（Pharmacia）には１M NaClを含有する25 mMトリス（pH 8.7）で充填し、次いで25 mMトリス、10 mM NaCl（pH 8.7）で平衡化した。ｂ．タンパク質サンプルは25 mMトリス、10 mM NaCl（pH 8.7）に対して透析し、後続の同一の緩衝液による一晩洗浄の前にカラムにアプライした。ｃ．カラムを、25 mMトリス（pH 8.7）緩衝液での塩濃度勾配（10 mM〜20 0 mM）で溶出した。23.5 KDタンパク質は、約80 mM NaClで溶出した。３．ａ．Q-Sepharose HPカラムを、１M NaClを含有する25 mMトリス（pH 8.7 ）で充填し、25 mMトリス、10 mM NaCl（pH 8.7）で再平衡化した。ｂ．タンパク質サンプルを、25 mMトリス、10 mM NaCl（pH 8.7）に対して透析し、そしてカラムにアプライし、その後続いて同一の緩衝液で洗浄した。ｃ．カラムは、25 mMトリス（pH 8.7）中、100〜300 mM NaClで溶出した。ｄ．ステップ3a〜3cを繰返した。４．ａ．23.5 KD産物を含有する分画を回収してプールし、25 mMトリス、10 m M NaCl（pH 8.7）に対して透析し、その後そしてSpeed Vac濃縮器でタンパク質サンプルを１mlまで濃縮した。ｂ．次いで、濃縮物を、25 mMトリス、150 mM NaCl（pH 8.7）で平衡化したSuperdex 75カラムにアプライし、そして同一の緩衝液で溶出した。23.5 KD産物は均一なタンパク質として溶出した。溶出タンパク質を、SDS-PAGEを用いてモニターし、その結果として図IBのカラム６に示した単一バンドを生じた。Ｋ．23 KD 細胞外産物１．ａ．0〜25％（０℃で１時間）および25％〜60％（０℃で一晩）の硫酸アンモニウム画分を廃棄した。ｂ．60％〜95％硫酸アンモニウム画分を保持した。２．ａ．DEAE CL-6Bカラム（Pharmacia）を、１M NaClを含有する50 mMビス- トリス（pH 7.0）で充填し、次いで50 mMビス-トリス、100 mM NaCl（pH 7.0）で平衡化した。ｂ．タンパク質サンプルを、50 mMビス-トリス（pH 7.0）、100 mM NaCl 緩衝液に対して透析し、そして同一の緩衝液でカラムを一晩洗浄する前にカラムにアプライした。ｃ．カラムを、50 mMビス-トリス（pH 7.0）中、100〜300 mM NaClの直線勾配で溶出した。ｄ．約100〜150 mM NaClで溶出した23 KDタンパク質を含有する分画を回収した。３．ａ．タンパク質分画を、25 mMトリス（pH 8.7）、10 mM NaClに対して透析し、Savant Speed Vac濃縮器で１〜２mlまで濃縮した。ｂ．濃縮物を、25 mMトリス、150 mM NaCl（pH 8.7）で平衡化したSuperd ex 75カラムにアプライした。産物を、図1Bのカラム８に示される均一なタンパク質として溶出した。Ｌ．16 KD 細胞外産物１．ａ．0〜25％硫酸アンモニウム画分（０℃で１時間）を廃棄した。ｂ．25％〜60％硫酸アンモニウム画分（０℃で一晩）を保持した。２．ａ．DEAE CL-6Bカラム（Pharmacia）を、１M NaClを含有する2.5 mMトリス（pH 8.7）で充填し、次いで25 mMトリス、10 mM NaCl（pH 8.7）で平衡化した。ｂ．タンパク質サンプルを、25 mMトリス、10 mM NaCl（pH 8.7）に対して透析し、そしてカラムにアプライし、その後続いて同一の緩衝液で一晩洗浄した。ｃ．カラムを、25 mMトリス（pH 8.7）緩衝液での塩濃度勾配（10 mM〜20 0 mM）で溶出した。16 KDタンパク質は、約50 mM NaClで溶出した。３．ａ．16 KD生産物を含有する分画を回収してプールし、25 mMトリス、10 m M NaCl（pH 8.7）に対して透析し、そしてSpeed Vac濃縮器でタンパク質サンプルを１mlまで濃縮した。ｂ．次いで、濃縮物を、25 mMトリス、150 mM NaCl（pH 8.7）で平衡化したSuperdex 75カラムにアプライし、そして同一の緩衝液で溶出した。溶出タンパク質を、SDS-PAGEを用いてモニターし、その結果として図1Bのカラム９に示した単一バンドを生じた。Ｍ．14 KD 細胞外産物１．ａ．0〜25％硫酸アンモニウム画分（０℃で１時間）を廃棄した。ｂ．25％〜60％硫酸アンモニウム画分（０℃で一晩）を保持した。２．ａ．DEAE CL-6Bカラム（Pharmacia）を、１M NaCl含有25 mMトリス（pH 8 .7）で充填し、次いで25 mMトリス、10 mM NaCl（pH 8.7）で平衡化した。ｂ．タンパク質サンプルを、25 mMトリス、10 mM NaCl（pH 8.7）に対して透析し、そしてカラムにアプライし、その後続いて同一の緩衝液で一晩洗浄した。ｃ．カラムを、25 mMトリス（pH 8.7）緩衝液での塩濃度勾配（10 mM〜20 0 mMまで）で溶出した。14 KDタンパク質は、約60 mM NaClで溶出した。３．ａ．Q-Sepharose HPカラムを、１M NaCl含有25 mMトリス（pH 8.7）で充填し、25 mM NaCl（pH 8.7）で再平衡化した。ｂ．タンパク質サンプルを、25 mMトリス、10 mM NaCl（pH 8.7）に対して透析し、そしてカラムにアプライし、その後続いて同一の緩衝液で洗浄した。ｃ．カラムを、25 mMトリス（pH 8.7）中、10〜150 mM NaClで溶出した。ｄ．ステップ3a〜3cを繰返した。４．ａ．14 KD生産物を含有する分画を回収してプールし、25 mMトリス、10 m M NaCl（pH 8.7）に対して透析し、そしてSpeed Vac濃縮器でタンパク質サンプルを１mlまで濃縮した。ｂ．次いで、濃縮物を、25 mMトリス、150 mM NaCl（pH 8.7）で平衡化したSuperdex 75カラムにアプライし、この緩衝液で溶出した。14 KD産物は、均一タンパク質として溶出した。溶出タンパク質を、SDS-PAGEを用いてモニターし、その結果として図1Cのカラム２に示した単一バンドを生じた。Ｎ．12 KD 細胞外産物１．0〜10％硫安沈殿物を得た（4℃で一晩）。２．再可溶化した沈殿物を、S200 Sephacrylサイズ分画カラムにアプライし、 12 KD分子のタンパク質を溶出した。３．タンパク質画分を、DEAE-Sepharose CL-6BまたはQAE-Sepharoseイオン交換カラムにアプライし、そして上述のようにNaCl濃度勾配で溶出した。約12 KD の分子量を有する２つの相同なタンパク質を含有する画分を、約300〜350mM NaC lで溶出し、そして回収した。タンパク質は、12Aおよび12Bと標識し、図1D,カラム(col.)２に示したダブレットとして精製した。図１のSDS-PAGEプロフィールに示したように、M．tuberculosisの主要であるか、または豊富な細胞外タンパク質を、上記の実施例2A〜2Nに詳述したプロトコルを用いて均一になるまで精製した。より詳細には、図１にSDS-PAGEおよび標識した1A、1B、1C、および1Dを用いて展開した4つの典型的な12.5％アクリルアミドゲルを示す。ゲル1A〜1Cのレーン１の標準は、分子量66、45、36、29、24、20 および14 KDの分子量のタンパク質を含有した。ゲルIDでは、レーン１の標準は、分子量68、45、31、29、20および14 KDの分子量のタンパク質を含有した。各々の精製細胞外産物を含むレーンは、報告された個々のタンパク質の分子量で本質的に１つのバンドを示す。ゲル1Dでは、12 KDタンパク質がレーン２に見えるダブレットとして泳動することに注目されたい。配列決定分析では、より下部の 12 KD（または12B KDバンド）が、最初の3 Ｎ末端アミノ酸を欠陥することを除いて、より上部の12 KD（または12A KD）バンドと等価であることを示す。これらの個々の典型的な主に豊富な細胞外産物のさらなる分析を図２に示す。より詳細には、図２は、これらの精製細胞外産物から得たＮ末端配列データの表編集であり、単離された産物の大部分が実質的に異なることを示す（配列番号１〜14）。タンパク質32A、32Bおよび30のすべては５つのＮ末端アミノ酸が同じなので、これらのタンパク質を十分に特徴づけおよび識別するためにはさらなる配列決定が必須であった。図３は、これら３つの精製分泌産物（配列番号15〜17）の延長したＮ末端アミノ酸配列を示す。16位（配列番号17）、31位（配列番号16 ）および36位（配列番号16）でのアミノ酸の相違は、これらの単離されたタンパク質が、その分子量の類似性にもかかわらず互いに異なることを証明する。タンパク質30、32Aおよび32Bに加えて、他の主に豊富な細胞外産物の延長Ｎ末端アミノ酸配列を決定して一次構造データを提供し、そしてタンパク質間の潜在的な関係を明らかにした。配列決定を、実施例２に従って精製した細胞外産物について、当該分野で周知の技術を用いて行った。インタクトなタンパク質の見かけの分子量によって同定され、そして天然に生じるアミノ酸について標準一文字表記を用いて表される、各々の細胞外産物について決定した種々の長さのＮ末端アミノ酸配列を以下に示す。確立された表示法の規則を遵守して、Ｎ末端配列をアミノ末端からカルボキシ末端への方向で左から右へ記述する。決定したアミノ明または曖昧な場合には、配列における当該位置をダッシュで表わす。最後に、 2個のアミノ酸を斜線によって分離する場合には、正確な成分が明瞭に確認されていないか、どちらか一方がその配列の位置を占有し得ない。 DNA配列決定を、当該分野での周知の技法を用いて30、32A、16、58、23.5および24 KDタンパク質について行った。インタクトなタンパク質の見かけの分子量によって同定されたこれらのDNA配列と上流配列および下流配列を含む対応するアミノ酸を、標準略語および表記法の法則を用いて示す。この配列データは、SDS-PAGEを用いて確認した物理的特性と組み合わせて、本発明のこれらの代表的な主に豊富な細胞外産物の特徴づけおよび識別ことを可能にする。記載した分析は、これらのタンパク質が、全有効細胞外産物の約60％重量を含む71 KD、30 KD、32A KD、23 KDおよび16 KDを有するM．tuberculosisの細胞外産物の大多数を構成することを示す。さらに、30 KDタンパク質は、M．tu berculosisにより放出される全産物の25％（対重量）までを構成し得ることがさに推定される。従って、個々の典型的に主に豊富ななM．tuberculosisの細胞外産物は、細胞外産物の総重量の約0.5％〜約25％までのいずれかの範囲であり得る。先に議論されたように、従来のウエスタンブロット法が最も免疫学的に特定の細胞外産物を一貫して同定することができないことに続いて、本発明者は、豊富な細胞外産物の免疫原性を、その豊富さおよびその結果としての同定および単離の容易さに基づいて分析した。驚くべきことに、これらの主に豊富な細胞外産物は、意外に有効な免疫応答を誘導することが見出されたため、本発明者はこれらの細胞外産物がワクチンとして機能し得るという結論に至った。この驚くべき発見は、上述の本発明の関する非限定的な機能理論の発展をもたらした。本発明の有効性を証明するために、当該分野で認められている実験モデルにおいて、防御免疫を誘導する種々の典型的な用量で、複数の主に豊富な細胞外産物およびその組合わせを用いてさらなる実験を行った。より詳細には、精製した主に豊富な細胞外産物を用いて、モルモットで防御免疫を誘導し、次いでモルモットをM．tuberculosisで抗原投与した。これらのタンパク質が防御免疫を誘導することができたことを示す際に、５つの精製した主に豊富な細胞外産物の組合わせを、異なる投与経路を用いて同様に試験した。特に30 KDの豊富な細胞外産物を用いて、71 KD細胞外産物の精製型として認められている動物モデルで防御免疫を誘導した。個々の典型的な主に豊富な細胞外産物の場合と同様に、５つの主に豊富な細胞外産物の組み合わせワクチンは、致死量のM．tuberculosisでの抗原投与に対して防御を付与した。本発明のこれらの典型的ワクチンの種々の研究の結果を下記に示す。 M．tuberculosisによる免疫原性抗原投与またはエアゾール抗原投与を含むすべての実験で、特異的な病原性を有さない雄のHartley系モルモット（Charles R iver Breeding Laboratories，North Wilmington，Massachusetts）を使用した。動物を、ステンレス鋼のケージに２〜３匹ずつ飼育し、標準的なモルモット用飼料および水を自由摂取させた。動物施設に到着後、モルモットは健常であることを確認するために、各実験の開始に先立ち少なくとも１週間以上観察した。最初の実験は、通常存在する全細胞外タンパク質の３％〜25％を占めると考えられる主に豊富な細胞外産物を用いて行われた。これらの実験は、主に豊富な細胞外産物が恋おうか的な免疫応答を引き起こすことを実証する。より詳細には、単離した30 KDおよび71 KD細胞外産物は、以下の致死量のM．tuberculosisへの曝露の際にモルモットを防御する、細胞媒介性免疫応答を生じる能力が個別にあることが示された。実施例３ 30 KD免疫モルモットの細胞性免疫に関する精製30 KDタンパク質の皮膚試験豊富な細胞外産物の精製型により側底可能なの免疫応答を誘導し得ることを実証するために、皮膚過敏性試験を行った。モルモットは、実施例２にしたがって精製し、そしてM．tuberculosisの全細胞外産物の約25％を占めると考えられる典型的な主に豊富なM．tuberculosis 30 KD分泌産物で免疫化された。別々の３件の実験において、モルモットを、SAFアジュバントにて実質的に精製した100μ gの30 KDタンパク質で、３週間の間隔で３回免疫した。対照動物には、SAFにて調製した緩衝液を同様に注射した。最後の免疫化から３週間後、モルモットを、皮膚過敏性アッセイにおいて、典型的な30 KDタンパク質で抗原投与した。モルモットは背部を剃毛し、そして0.1、１および10μgの30 KDタンパク質の注射を皮下に投与した結果生じる紅斑（皮膚の発赤）および降下を、以下の表Ａに示されるように24時間後に測定した。データを、従来の法を用いて測定される、群の平均測定値±標準誤差（SE）について報告する。NDは、本発明のこの特定の局面を行わなかったことを示す。表Ａに示すように、典型的な30 KD分泌産物で免疫化されたモルモットは、顕著な紅斑および硬化によって証明されたように、強力な細胞媒介性免疫応答を示した。対照的に、対照動物は最小の応答を呈した。 30 KD分泌産物の免疫反応性を確認し、そしてその感染性の結核に対する適用性を示すために、非免疫化モルモットを、M．tuberculosisで感染し、そして以下のような本発明のタンパク質で抗原投与した。実施例４ M．tuberculosisで感染したモルモットの細胞媒介性免疫応答についての精製30 KDタンパク質試験モルモットの感染を必要とする実験で使用するための細菌を得るために、M．t uberculosisをまず7H11寒天上で培養し、そしてこれらの菌が毒性であることを確認するために、モルモット肺を1回通過させた。この目的のために、モルモットを、約５×10⁴細菌／mlを含有する7H9ブロース中の10 mlの細菌の懸濁液を有するエアゾールにより抗原投与した。モルモットが発病した後、この動物を屠殺し、そして顕著なM．tuberculosis病変を含む肺を取り除いた。各肺を粉砕し、7 H11寒天で７日間〜10日間培養した。細菌をプレートからかき取り、10％グリセロールを含有する7H9ブロースで希釈し、単一細胞懸濁液を得るために水浴中で超音波破砕し、そして約２×10⁷生存細菌／mlの濃度で−70℃でゆっくりと凍結した。凍結細胞の生存能を、細菌懸濁液を解凍し、そして7H11寒天上で本懸濁液の連続希釈物を培養することにより測定した。抗原投与の直前に、細菌細胞のバイアルを解凍し、そして7H9ブロスで所望の濃度まで希釈した。モルモットを、特別に設計したルサイト製エアゾールチャンバー中で、生存能力のあるM．tuberculosisのエアゾールに曝露した。エアゾールチャンバーは14 ×13×24インチで、相対する面にモルモットを導入または除去するための直径６インチの入口が２個含有する。エアゾール注入口は、チャンバーの天井の中央に位置した。真空ポンプ（Gast Mfg．Co.，Benton Harbor，Michigan）は、30 1b ／in²でネブライザー-ベンチュリユニット（Mes Inc.，Burbank，California）に空気を送達し、そしてエアゾールは10mlの細菌懸濁液から生成した。0.2μmの呼吸回路フィルターユニット（Pall Biomedical Inc.，Fajardo，Puerto Rico）は、このアセンブリの内外で圧力を平衡化するために、チャンバーの一方の端に位置した。安全性の考慮のため、エアゾール抗原投与はチャンバーを完全に層流フード内に配置して行った。動物を、ネブライザー中の細菌の懸濁液が完全に消費される30分間、病原菌エアゾールに曝露した。各エアゾールを、約１mlあたり5.0×10⁴の細菌を含有する 10 mlの懸濁液から生成した。先の研究は、この濃度の細菌へのモルモットの曝露が非防御動物において一貫して感染を引き起こすことを示している。エアゾール注入後、モルモットを層流バイオハザード安全囲い（Airo Clean Engineering Inc.，Edgemont，Pennsylvania）の中のステンレス鋼ケージ中で飼育し、そして感染の徴候を観察した。なお、動物には全実験期間を通じて標準的なモルモット用飼料および飲料水を自由摂取させた。本実験では、感染したモルモットを屠殺し、そして種々の濃度の30 KDタンパク質に応じて脾臓リンパ球増殖を測定した。より詳細には、脾臓リンパ球を採取し、そして本明細書中で参考として援用するBriemanおよびHorwitz（J．Exp．Me d．164:799-811）（これは本明細書中に参考として援用される）に記載されたように精製した。リンパ球を、ペニシリン（100 Ｕ／ml）、ストレプトマイシン（ 100μg／ml）、および10％ウシ胎児血清（GIBCO）を含有するRPMI 1640（GIBCO Laboratories，Grand Island，New York）で10⁷／mlの最終濃度に調整し、総容量100μlで、種々の濃度の精製30 KD分泌産物とともに、マイクロウェル（96-ウェル丸底組織培養プレート；Falcon Labware，Oxnard，California）中で、５％ CO₂-95％空気かつ湿度100％で37℃で2日間インキュベートした。非感染動物は陰性対照として用いた。インキュベーション期間の終了時、0.25μCiの［³Ｈ］チミジン（New England Nuclear，Boston，Massachusetts）を各ウェルに添加し、そして細胞を５％CO₂-95％空気かつ湿度100％下で37℃でさらに2時間インキュベートした。多サンプル自動細胞採取器(multisample automated cell harvester) （Skatron Inc.，Sterling，Virginia）を用いて各ウェルを洗浄し、そして溶出液をフィルターマット（Skatron）に通過させた。別々のマイクロテストウェルの標本を示すフィルターマット切片をシンチレーションバイアルに入れ、そして２mlのEcoscintＨ液体シンチレーションカクテル（National Diagnostics，Manv ille，New Jersey）を添加した。β粒子放出を、βシンチレーションカウンタ（ Beckman Instruments Inc.，Fullerton，California）で測定した。感染モルモットおよび非感染モルモット由来の組織サンプルを、１および10μ g／mlの単離された30 KD分泌タンパク質に対してアッセイした。次いで、サンプルを［³Ｈ］チミジンの取込み能力についてモニターした。これらのアッセイの結果を表にし、下記の表Ｂに示した。データは、本開示の目的のために、以下：抗原とともにインキュベートしたリンパ球の平均［³Ｈ］チミジン取込み／抗原なしでインキュベートしたリンパ球の平均［³Ｈ］チミジン取込み、を意味するものとして定義される刺激指数として報告する．表Ｂに示すように、主に豊富な分泌産物に対する曝露に応答する用量非依存的な脾臓リンパ球増殖により明らかなように、感染動物の細胞は、主要な30 KDのタンパク質に対する強力な応答を示した。逆に、非感染対照動物はリンパ球増殖をほとんど示さなかった。従って、30 KDの分泌産物は、M．tuberculosisに感染した哺乳動物において、細胞媒介性免疫応答を誘導する。本発明のワクチンの防御局面を例証するために、モルモットを精製30 KDタンパク質で免疫化し、そして以下のようにM．tuberculosisに曝露した。実施例５エアゾール化M．TUBERCULOSISでの 30 KD免疫化モルモットの抗原投与前述したように、動物はSAFにて100μgの典型的30 KDタンパク質で、３週間の間隔で３回免疫した。対照モルモットを、SAFにて120μgの大量のEP で免疫化するか、または同一アジュバントで調整した緩衝液で擬似免疫化された。最後の免疫化の３週間後、動物を実施例４に記載したようにエアゾール化M．tuberculosi sで抗原投与した。３つの群の動物の生存率をモニターし、図４に図表を用いて示す。絶対的な死亡率を、以下の表Ｃに示されるように抗原投与の14週間後に決定した。図４に示されるように、典型的な30 KDタンパク質で3回免疫化されたモルモットは死から防御された。30 KDタンパク質で免疫化されたモルモットの約67％が生存していたのに対し、対照の擬似免疫化されたモルモットではわずか17％しか生存しなかった。免疫動物の体重保持をまたモニターし（データ不記載）、そして本発明により教示されるように、病原菌により産生された主に豊富な細胞外産物を取込むワクチンの予防能力をさらに示す。免疫化された動物が体重を維持するようであるのに対して、擬似免疫化された動物の高い死亡率は免疫化された動物と対照動物とを図表で比較することができなかった。体重モニタリング試験の終了後、生存している動物を屠殺し、そして各動物の右肺および脾臓を生存能力のあるM．tuberculosisについてアッセイした。動物を２％ amphyl溶液（National Laboratories，Montvale，New Jersey）に浸漬し、そして肺および脾臓を無菌的に取り除いた。肺の肉眼的初期表面病変の数を、視検により計測した。右肺および脾臓におけるM．tuberculosisのコロニー形成単位（CFU）を、乳鉢ならびに乳棒および90-メッシュNorton Alundum（Fisher）を用いて、10 mlの7H9ブロスで各臓器をホモジナイズし、7H9中で組織ホモジネートを連続的に希釈することにより、そして0.1 ml／滴の滴下を用いることにより、希釈液を２連の7H11寒天プレート上で培養することにより測定した。すべてのプレートはモジュール調整したインキュベーターチャンバー内に置き、そして湿度 100％の５％CO₂-95％空気で、37℃で12〜14日間した。アッセイをこのプロトコールを用いて行い、計測の結果を、平均コロニー形成単位（CFU）±標準誤差（S E）に関して下記の表Ｄに示す。表Ｄに示すように、典型的な30 KD分泌タンパク質による免疫化は、肺および脾臓でのM．tuberculosisの増殖を制限した。１匹の生存している疑似免疫化動物からの１つのデータのみが比較の目的のために利用可能であったが、４匹の生存している30 KD免疫動物は、生存している擬似免疫化動物よりも、CFUが肺で0. 7ログ、脾臓で１ログ少なかった。CFU数と死亡率との高い相関関係を示す先の実証に基づいて、生存している動物は、CFU分析を実施し得る前に死亡した動物よりも肺および脾臓のCFUが少なかったようである。再び、免疫化動物の肺および脾臓におけるCFUのこの減少は、本発明の範囲および実施可能性を実証する。 71KD細胞外産物である、M．tuberculosis由来の別の主に豊富な細胞外産物の免疫防御の潜在性を、その単離型で試験して免疫防御能力を実証した。実施例６ EPの大量調製薬剤で免疫化したモルモットの精製71 KDタンパク質皮膚試験 71 KDタンパク質が動物において有効な免疫応答を引き起こす可能性を証明するために、この分離した主に豊富な細胞外産物を用いて、皮膚過敏性アッセイにおいてM．tuberculosis細胞外タンパク質（EP）の大量調製薬剤で免疫したモルモットに皮膚試験を行った。上記で議論したように、大量のEPは、本発明のワクチンより軽度であるが、M．tuberculosisによる感染に対する後天性免疫性を付与する。モルモットを、実施例１に詳述したように調製した120μgの大量のEP調製物により3週間の間隔で2回免疫化した。ワクチン接種は不完全Freundアジュバントで調製し、EPの代わりに緩衝液を投与した擬似免疫化動物に行った。最後のワクチン接種の３週間後、各群からのモルモットは背部を剃毛し、そして0.1、1.0および10μgの71 KDタンパク質の皮内注射により皮膚試験を行った。10.0μgの緩衝液を対照として用い、そしてすべての注射を0.1 mlの全容量を用いて行った。紅斑および硬化の直径を24時間後に測定し、下記の表Ｅに示すような結果となった。データは、従来の方法を用いて決定されたような群についての平均測定値±標準誤差（SE）に関して報告する。免疫化された動物の応答は、緩衝液のみで抗原投与したモルモットの応答のほぼ約２倍であり、動物の免疫化に用いたものと同一の容量のEPで抗原投与したモルモットのものと類似していた（データ不記載）。精製した典型的な71 KDの主に豊富な細胞外産物が細胞媒介性免疫応答を引き起こすことをさらに確認するために、大量のEPを免疫したモルモットを屠殺し、そして種々の濃度の71 KDタンパク質に応じて脾臓リンパ球増殖を測定した。非免疫動物を対照として用いた。実施例４のプロトコルに従って、リンパ球を71 K Dとともにおよび71 KDなしで２日間インキュベートし、そして次いで［³Ｈ］チミジンの取込み能力についてアッセイした。データは、実施例４のように計算した刺激指数に関して報告する。この71 KD 抗原投与の結果を、下記の表Ｆに示す。表Ｆに示すように、リンパ球増殖分析の刺激指数は、皮膚過敏性アッセイで得られた結果と比較できる。71 KDおよび大量のEP試験サンプルはともに、対照サンプルでの応答より２〜３倍高い応答を示したが、これは単離された典型的な71 KD主に豊富な細胞外産物がM．tuberculosis抽出物で免疫化した動物において細胞媒介性免疫応答を刺激し得ることを示した。しかし、精製された最多主に豊富な細胞外産物または主な細胞外産物は先行技術または容量の組成に関連する問題はなく、合成および商業産生により容易に適応できるため、本発明のワクチンの製造は先行技術より優れていることを再度、強調しなければならない。より詳細には、バルク調製は、近年の生体分子技法により容易に大規模製造し得ない。すべての細胞外産物を含有するこれらの未精製バルク調製物の商業的な生産はいずれも、標的病原体または緊密に関連する種の大量培養工程、および結果として得られた上清液の採集工程を包含する。このような生産方法論は、標的病原体、毒性副産物または他の寄生薬剤による汚染に高度に感受性である。さらに、こうした調製物に含まれる多数の免疫原性決定基は、免疫母化集団の感受性セグメントにおいて毒性免疫反応を誘発する可能性がはるかに高いようである。これらの未精製バルク調製物の使用はまた、結核のスクリーニングおよびコントロールに現在用いているもっとも一般の皮膚試験の使用を否定する。正反対に、本発明のワクチンは、高収率形質転換宿主を用いて比較的安全に大量生産され得る。同様に、本発明のワクチンは全く同じに産生され得、バルク細胞外産物の広範な種類の生産と反対にバッチを容易に標準化する。さらに、宿主免疫系に与えられる免疫原性決定基の数が比較的少ないため、毒性反応および一般的なスクリーニングテストを無効にする機会は大いに減少する。実施例７ 71KD免疫化モルモットの精製71KDタンパク質皮膚試験単離された典型的に71Kbの主に豊富な細胞外産物が、バルクEP免疫化動物において細胞性免疫応答を生じることを示した後、この主に豊富な産物の精製された形態が71KDで免疫化した動物に細胞性免疫応答を誘導し得ることが示された。 SAF中100μgの精製71KDタンパク質で、モルモットを３週間おきに２回ワクチン接種した。コントロール動物をSAF中緩衝液で、同一スケジュールで疑似免疫化した。最終免疫から３週間後、両方の組の動物に１および10μgの単離71KDタンパク質を経皮的に抗原投与した。24時間後に生じた紅斑および硬化を測定した。結果を以下の表Ｇに示す。硬化および紅斑の程度は非免疫化コントロール動物よりも免疫化動物の方が非常に大きく、71KDタンパク質に対する強い細胞性免疫応答が本発明のワクチン接種プロトコルで開始されたことを示す。この豊富細胞外生成物が、本発明の教示によりそれ自体の有効な免疫応答を誘導する能力をさらに確認するために、リンパ球増殖アッセイを行った。表Ｇにおける免疫化された動物を屠殺し、そして実施例４で確立されたプロトコルを用いて、脾臓リンパ球増殖アッセイを行った。71KD免疫化モルモット由来の組織サンプルおよびコントロールモルモット由来の組織サンプルに0.1、１および10μg/m lの単離71KDタンパク質を抗原投与し、そして［³H］チミジン取り込み能についてモニターした。先に記載のように、刺激指数を計算した。これらのアッセイの結果を以下の表Ｈに示す。皮膚過敏性アッセイと同じく、71KD免疫化動物は疑似免疫化コントロールよりも精製71KDに対してきわめて大きい応答を示した。外来タンパク質で予想されることではあるが、そのような結果は、主に豊富な細胞外産物に細胞性免疫応答を誘導する能力を有することを明らかに示す。単離された主に豊富な細胞外タンパク質が有効な細胞性免疫応答を誘導することを確立した後、このような反応のいづれもが結核菌に対し交差反応性であることを確認するため以下の様にさらに実験を行った。実施例８ M．TUBERCULOSIS感染モルモットの精製71KDタンパク質抗原投与試験非免疫化モルモットを実施例４に報告されるように、エアゾル化したM．tuber culosisに感染させた。感染動物が、M．tuberculosisを示唆する細胞性免疫応答を示すことを確実にするために、精製タンパク質誘導体（PPD-CT68、Connaught Laboratories Ltd.）をポジティブコントロールとして使用した。結核の暴露に対するマントー試験（Mantoux test）で広く用いられるPPDは、一般に硫酸アンモニウム分画によって調製され、平均分子量約10KDを有する小さなタンパク質の混合物を含む。PPDに対する免疫応答は、実施例１で単離されたバルクEP画分で誘発されるものと実質的に相同である。感染の3週間後、モルモットに0.1、１および10μgの典型的な精製主に豊富な7 1KD細胞外タンパク質を経皮的に抗原投与した。コントロールとして使用した非感染動物にも同様に単離タンパク質で抗原投与した。紅斑および硬化の程度を24 時間後に測定し、結果を以下の表Ｉに報告する。表Ｉに示すように、本発明の典型的な精製主に豊富な細胞外タンパク質で抗原投与した感染動物に強い免疫応答が存在する。これらの応答は、紅斑に関して3 〜4倍程度、硬化について10倍を超えて、非感染動物よりも強く、主な71KD細胞外タンパク質は、M．tuberculosis感染動物において強い細胞性免疫応答を誘導することが確認されている。これらの結果をさらに確認するために、感染動物および非感染動物を屠殺し、実施例４のプロトコルに従ってリンパ球増殖アッセイに供した。両方の組のモルモット由来の組織サンプルを、0.1、１および10μg/mlの単離された71KDタンパク質およびPPDに対しアッセイした。次いで、先に記載のような[³H]チミジン取り込み能についてサンプルをモニターし、これらのアッセイの結果を以下の表Ｊに示す。皮膚過敏性アッセイと同じく、表Jは非感染サンプルよりも感染組織で刺激指数がはるかに大きいことを示す。より具体的には、感染動物の平均ピーク刺激指数は、非感染コントロールに対する指数よりも、典型的な71KDタンパク質に対し２倍高く、PPDに対し３倍高く、このことから、本発明の典型的な主に豊富な細胞外タンパク質ワクチンによりM．tuberculosis感染動物において強い細胞性免疫応答が誘導されることが確認された。典型的な精製71KD主に豊富なタンパク質とM．tuberculosisとの間の交差反応性の実証に続いて、本発明に開示されるように主に豊富な細胞外産物のこれらの典型的な精製サンプルにより有効な免疫応答が刺激され得ることを実証するため、さらなる実験を行った。実施例９エアゾル化M．TUBERCULOSISによる71KD免疫化モルモットの抗原投与典型的な主に豊富なまたは主に豊富な細胞外タンパク質ワクチンの免疫防御能を示すため、実施例２に従って精製した100μgの典型的な主に豊富な71KDタンパク質で、モルモットを3週間おきに２回免疫した。コントロール動物は、実施例１由来のバルクEP120μg、または緩衝液で免疫化した。すべての動物をアジュバントSAFを用いて免疫化した。最後の免疫の３週間後、典型的な71KDタンパク質で免疫化したモルモットに10μgのサンプルで皮膚試験を行い、細胞性免疫応答を生じたかどうかを評価した。次にコントロール動物および71KD免疫化モルモットを実施例４に詳述したようにエアゾル化M．tuberculosisに感染させた。感染後、動物をモニターし、そして６ヶ月間体重を測定した。図５のグラフは、疑似免疫グループに生じた体重減少と、71KDおよびバルクEP 免疫化動物によって示される比較的正常な体重増加とを対比する。各グループでデータは平均体重±SEである。同じ動物に対する致死率曲線を図６のグラフに示す。検討した絶対致死率比を以下の表Ｋに示す。体重減少曲線および致死率の両方とも、明らかに、本発明の主に豊富な細胞外タンパク質は予防免疫応答を付与することを示す。このことは非免疫化動物の10 0％がモニター期間の終了までに死亡したという事実からも裏付けられる。実施例10 エアゾル化M．TUBERCULOSISによる71KD免疫化モルモットの抗原投与先の実施例の結果を確認し、そして典型的な主に豊富な細胞外タンパク質の投与が動物における防御免疫応答を与え得ることを示すため、同様の実験を行った。この実験では、モルモットを３回、３週間おきに100μgのSAF中の71KD細胞外タンパク質で再度免疫化した。コントロールモルモットをSAF中の緩衝液で疑似免疫化した。最後の免疫から3週間後、動物にエアゾル化M．tuberculosisで抗原投与し、毎週１回、13週間体重を測定した。６モルモットの各グループの平均体重±SEを計算し、そして図７にグラフを示す。この曲線は、免疫化した動物はほとんど同じ体重を維持したが、疑似免疫化動物はモニター期間中にわたってかなりの体重を減少させたことを示す。体質量の減少または「消耗」は、結核の古典的な副作用の１つであり、これらの結果は、免疫化された動物中の結核菌の成長と増殖が本発明の典型的なワクチンによって阻害されたことを示す。単離形態の豊富細胞外産物によるワクチン接種を介して、モルモットに防御免疫性が発現したので、本発明のワクチンの種間免疫反応性を実証し、モルモットモデルの妥当性および適用性をさらに確認するために実験を行った。実施例11 精製71KDタンパク質によるPPDポジティブのヒト細胞性免疫試験典型的な71KD主に豊富なタンパク質に対するヒト免疫応答の細胞性成分を評価するために、実施例４で報告されたようにタンパク質に対するPPDポジティブ個体およびPPDネガティブ個体の抹消血リンパ球の増殖を、標準リンパ球増殖アッセイで研究した。ポジティブPPD、またはツベルクリン反応は、過去にM．tuberc ulosisに感染したことを示すものとして当業者に周知である。増殖応答およびそれに対応する［³H］チミジン取り込みを２日目および４日目に測定した。これらの研究データを図8Aおよび8Bに示す。図8Aは2日後の種々のレベルの71KDに対する応答を、図8Bは４日目の同じ応答を示す。図8Aおよび8Bに示すように、PPDポジティブ個体の平均ピーク刺激指数はPPDネガティブ個体のそれよりも、71KDタンパク質に対して２倍高く、PPDに対して３倍高かった。PPDポジティブ個体の間でも、典型的な71KDタンパク質とPPDに対するピーク刺激指数の間に直線的相関関係があり、先にM．tuberculosisに曝されたヒトにおけるM．tuberculosisの主成分または主に豊富な細胞外産物により強い細胞性反応が刺激されることを実証する。このデータはモルモットで見られる反応性プロフィルに相当し、モルモットモデルを感染しやすい他の哺乳動物に応用できることが確認される。従って、先に議論した30KDの典型的なタンパク質のように、主に豊富な71KD細胞外産物に対する強い免疫応答の発現は、71KD生成物はヒトにおける細胞性免疫を刺激するのにも有効であるという事実で証明されるように本発明の広い範囲を実証する。また、本発明はM．tuberculosisの細胞外産物、または典型的な71KDタンパク質の使用に限定されるものではないことも強調されなけらばならない。むしろ、本発明の教示は実施例に実証されるように、いずれの主に豊富な細胞外産物にも応用できる。 M．tuberculosisの主に豊富な細胞外産物の組合せも防御免疫を提供するかどうかを確かめるため、さらなる研究を行った。一般にこれらの研究は、M．tuber culosisの５つの精製された細胞外タンパク質の組合せを含むSAF中のワクチンの種々の経皮または皮下のいずれかの免疫化で３回、３〜４週間おきに免疫化されたモルモットを利用した。組合せＩとラベルされた免疫手順に使用した第１のタンパク質の組合せは実施例２のプロトコルにより精製された71KD、32A KD、30KD、23KDおよび16KDタンパク質含んだ。この組合せは、M．tuberculosis培養上清中に通常存在する細胞外総タンパク質の60％までを含むと思われる。組合せＩに使用するために選択されたこれらのタンパク質は、図２でアスタリスクで示される。各タンパク質の100 μg、20μgおよび2μgを含有する組合せＩワクチンを、アジュバントSAFと共に経皮的に投与した。また各タンパク質20μgを含有する組合せワクチンＩを皮下的に類似の実験で投与した。ネガティブコントロールモルモットを同じスケジュールで等容量のSAFおよび緩衝液で疑似免疫化し、一方、ポジティブコントロールをSAF中、実施例１由来の120μgのバルク細胞外タンパク質調製物で免疫化した。全ての注入容積は緩衝液を用いて標準化した。実施例12 組合せＩワクチンに対する組合せＩ免疫化モルモットの応答主要細胞外産物の組合せＩ混合物によるワクチン接種後に動物が測定可能な免疫応答を発現したかどうかを決定するために、皮膚過敏性アッセイを行った。モルモットの背中を剃毛し、５つの精製細胞外タンパク質の同じ組合せを1.0μgおよび10.0μgを皮下注射した。10.0μgの緩衝液をコントロールとして使用し、そしてすべての注射は全容積0.1mlを用いて行った。皮膚の試験部位での紅斑および硬化の直径を、注射後24時間に測定した。測定結果を以下の表Ｌに示す。データは従来の方法を用いて決定される、群についての平均測定値±標準誤差（SE）で報告される。NDはこの特定の局面の実験が行われなかったことを示す。データは明らかに、組合せＩ細胞外タンパク質に対する強い細胞性免疫応答がワクチン接種した動物によって作製されたことを示す。免疫化モルモットは、コントロール動物よりもほとんど３倍大きい紅斑および硬化の測定値を示した。実施例13 エアゾル化M．TUBERCULOSISに対する組合せＩワクチンの免疫防御性分析最後の免疫から3週間後、先の過敏性アッセイに用いたモルモットをエアゾル化したエアゾル化M．tuberculosis、Erdman株で抗原投与し、そして10週間、毎週体重測定した。このエアゾル抗原投与は実施例４のプロトコルを用いて行った。100μｇの主要細胞外産物の組合せＩで免疫化した6匹の動物を、ポジティブおよびネガティブコントロールの等サイズのグループと共に、同時に、エアゾル化したM．tuberculosisを抗原投与した。ポジティブコントロールはSAF中の120μg のEPで３回免疫化した。観察期間終了前に死亡したモルモットを剖検し、結核病巣の塊があることを検査した。このような病巣は実験中に死亡したすべての動物に見い出された。エアゾル抗原投与後の、免疫化動物とコントロール動物との間の平均体重の差を、偏差の繰り返し測定分析（ANOVA）により解析した。抗原投与後の免疫化モルモットとコントロールモルモットとの間の生存率の差を両側フィッシャー（Fi sher）試験（two-tailed exact test）で解析した。データは６匹のモルモットの各グループに対する平均体重±標準誤差（SE）である。抗原投与後の週毎の体重測定の結果を図９に示す。細胞外産物の組合せで免疫化したモルモットと比べて、疑似免疫化動物は全体重の15.9％を失った。ポジティブコントロールの体重は、５つの精製細胞外タンパク質の組合せで免疫化した動物の体重と同様であった。体重は抗原投与直前の体重で正規化した。組合せＩで免疫化した動物と疑似免疫化コントロールとの間の差は繰り返し測定ANOVAによるp<.0000001で高度の有意性があった。抗原投与から10.5週後に致死率を測定した。疑似免疫化動物のすべての３匹は、抗原投与から10週と10.5週の間に互いに３日以内の間隔で死亡した。実験の致死率の結果を以下の表Ｍに示す。体重モニター研究の結論後、生存した動物を炭酸過剰で屠殺し、個々の動物の右肺と脾臓を実施例５のプロトコルを用いて、生存M．tuberculosisについてアッセイした。実験の最後の週に死亡した３匹の動物を含む計数の結果を、平均コロニー形成単位（CFU）±標準誤差（SE）で以下の表Ｎに示す。精製タンパク質の組合せで免疫化した動物と疑似免疫化動物との間の肺中の細菌濃度の差の対数は1.4であり、一方、脾臓中の細菌の差の対数は0.9であった。これと並んで、免疫化動物剖検全体を観察すると、疑似免疫化動物と比べて結核との肺の関連性は顕著に減少していた。実施例１のバルク細胞外調製物（EP）で免疫化したポジティブコントロール動物は、精製細胞外タンパク質の組合せＩ混合物による免疫化動物より肺中に0.7log、脾臓中に0.5logだけ多い細菌を示した。実施例14 皮下および経皮送達による低用量での組合せＩワクチンの免疫防御分析実施例13は、組合せＩタンパク質が100μgの個々のタンパク（30+32A+16+23+7 1）で3回、4週間、皮下的に免疫した動物で免疫防御を示したが、組合せＩタンパク質のより低い抗原投与量、特に各タンパク質20μgまたは2μgの免疫防御能を示すために別の実験を行った。実施例13のように、モルモット（１グループあたり６匹）を組合せタンパク質（30+32A+16+23+71）でSAF中で皮下的に４回、3 週間おきに免疫化した。動物は免疫毎に20μgまたは2μgの個々のタンパク質を投与された。コントロール動物は先のプロトコルを用いて疑似免疫化された。３週間後、動物をエアゾル化M．tuberculosisで抗原投与し、体重を毎週、9週間測定した。すべての免疫化した動物は実験終了まで生存したが、疑似免疫化動物の１匹は実験終了以前に死亡した。以下の結果に示すように、実施例13より５倍、および50倍低い用量においても免疫化動物をエアゾル化M．tuberculosisから保護し、経皮および皮下経路の両方による送達が有効であった。組合せＩタンパク質のそれぞれ20μgで免疫化したモルモットと比べて、疑似免疫化動物は実験９週間中に全体重の12％を失った（体重は抗原投与直前に対して正規化された）。組合せＩタンパク質のそれぞれ２μgで免疫化したモルモットに比べて、疑似免疫化動物は全体重の11％を失った。従って、低用量の組合せＩタンパク質で経皮免疫化したモルモットは、M．tuberculosisでのエアゾル化抗原投与後も体重減少から防御された。同様に、低用量の組合せＩタンパク質で経皮免疫化したモルモットも、M．tub erculosisの脾臓への播種に関連する脾腫から防御された。表Ｏに示すように、組合せＩのそれぞれのタンパク質20μgまたは2μgで免疫化した動物でそれぞれ脾臓の重さは4.6±1.2gおよび4.0±0.8g（平均±SE）であったが、疑似免疫化動物では脾臓の重さは平均9.6±1.8g（表１）、もしくは2倍大きかった。低用量の組合せＩタンパク質で経皮免疫化したモルモットはまた、脾臓中に、より少量のM．tuberculosisのCFUを有していた。表Ｐに示すように、疑似免疫化動物と比較すると、20μgまたは2μgのそれぞれの組合せＩタンパク質で免疫化したモルモットは脾臓中にそれぞれ平均0.6〜0.4log少ないCFUを有していた。さらに、組合せタンパク質で皮下的に免疫化したモルモットは体重減少、脾腫、および脾臓中のM．tuberculosisの繁殖から保護された。実施例14に記載と同じ実験でも、モルモットは皮下免疫化でなく、20μgの組合せＩタンパク質で4回、3週間おきに経皮免疫化された。これらの動物は20μgの組合せＩタンパク質で皮下的に免疫化された動物とほとんど同じ量の抗原投与で防御された。実施例15 組合せＩおよび組合せIIによる抗原投与に対する組合せＩおよび組合せII免疫化モルモットの反応 M．tuberculosisの主に豊富な細胞外産物の他の組合せも防御免疫を提供するかどうかを確かめるために、別の実験を行った。１つの実験では、２つの組合せ −組合せＩ（71、32A、30、23および16）および組合せII（32A、30、24、23および16）−を含むワクチンで免疫化されたモルモットを利用した。組合せIIは、M ．tuberculosis上清に通常存在する全細胞外タンパク質の62％までで構成されると考えられる。動物（グループ当たり6匹）をSAF中の組合せＩおよびIIの個々のタンパク質100μgで４回、３週間おきに免疫化した。ネガティブコントロールも同じスケジュールで、同じ容積のSAFおよびバッファーで疑似免疫化した。実施例12と同様、動物がワクチン接種後測定可能な免疫応答を発現するかどうかを決定するために、動物を皮膚遅延型過敏性について試験した。組合せIIで免疫化した動物は組合せIIによる皮膚試験に応答して16.8±1.3mm（平均±SE）の紅斑と12.8±1.2mmの硬化を有し、一方、疑似免疫化動物は組合せIIに応答してわずか1.3±0.8mmの紅斑と0.3±3mmの硬化を有した。従って、組合せIIで免疫化した動物はコントロールより12倍大きい紅斑と40倍大きい硬化を有した。比較として、組合せＩで免疫化した動物は組合せＩによる皮膚試験に応答して21.3±2. 0mmの紅斑および15.8±0.1の硬化を有し、一方、疑似免疫化動物は組合せＩに反応してわずか6.4±0.8mmの紅斑および2.6±0.7mmの硬化を有した。従って、従って組合せＩで免疫化した動物はコントロールより3倍大きい紅斑および６倍大きい硬化を有した。組合せIIタンパク質に対するコントロールとの差は、組合せＩのタンパク質のそれより大きかった。同じ実験で、より低い用量（各タンパク質20μg対100μg）の組合せIIタンパク質で免疫化した動物も、組合せIIに対し強い皮膚過敏性を発現した。上記のように、それらは組合せIIに応答して21.0±2.0mmの紅斑および15.3±0.9mmの硬化を有し、一方、疑似免疫化動物はわずか1.3±0.8mmの紅斑および0.3±0.3mmの硬化を有した。従って組合せIIタンパク質のより低い用量で免疫化した動物はコントロールより16倍大きい紅斑および50倍大きい硬化を有し、その差はより高い用量の組合せIIタンパク質で免疫化した動物よりむしろ大きい。実施例16 エアゾル化M．TUBERCULOSISに対する組合せＩおよびIIワクチンの免疫防御性分析最終免疫の3週間後、先の過敏性アッセイに使用されたモルモットをエアゾル化M．tuberculosis、Erdman株で抗原投与し、週１回、７週間体重測定した。実施例13と同様、各グループ６匹であった。抗原投与後の最初の7週間の間、疑似免疫化動物は平均19,5ｇの体重が減少した。それに対し、組合せII（各タンパク質100μg）で免疫化した動物は体重が52.4g増加し、より低い用量（各タンパク質20μg）で免疫化した動物は平均67.2gの体重が増加した。対照的に、組合せＩで免疫化した動物は体重が68g増加した。従って、組合せII（100μg）で免疫化したモルモットと比較して、疑似免疫化動物は全体重の11％を失った。より低い用量（20μg）の組合せIIで免疫化したモルモットと比べて、疑似免疫化動物は全体重の14％を失った。組合せＩで免疫化した動物に比べ、疑似免疫化動物はまた全体重の14％を失った。実施例17 同じワクチンまたはその組合せの抗原投与に対する組合せIII〜XIIで免疫したモルモットの応答 M．tuberculosis主に豊富な細胞外産物の様々な組合せの有効性を示すため、さらに実験を行った。これらの実験では、ハートレー型モルモットを実施例２と同様に精製した２つ以上の主に豊富な細胞外産物を含むワクチンで皮内で免疫化した。精製した細胞外産物を、SDS-PAGEで測定した見かけの分子量を用いて同定する。モルモットを以下の組合せの主に豊富な細胞外産物で免疫化した。組合せタンパク質組成 III 30＋32A＋32B＋16＋23 IV 30＋32A Ｖ 30＋32B VI 30＋16 VII 30＋23 VIII 30＋71 IX 30＋23.5 Ｘ 30＋12 XI 30＋24 XII 30＋58 組合せワクチンはそれぞれ、表に挙げたタンパク質のそれぞれを100μg含んでいた。組合せワクチンの容量を調節し、アジュバントSAF中で皮内に注射した。前と同様に、モルモットを４回、３週間ごとに免疫した。皮膚過敏性アッセイを、組合せIII〜XIIによるワクチン接種後、動物が測定可能な免疫応答を発現するかどうかを調べるために行った。６匹のモルモットからなる群は背中を剃り、そしてそれらが免疫された精製細胞外産物の同じ組合せを経皮に注射した。この抗原投与に関して、組合せ中の10μgの各タンパク質を注射した。注射はすべて、0.1mlの全容量で行った。SAFのみで免疫化した疑似免疫化コントロールもまた、個々の組合せで各10μgのタンパク質を再使用して、組合せIII〜XIIで皮膚試験を行った。皮膚試験部位での紅斑と硬化の直径を、実施例３の記載と同様に注射後24時間に測定した。これらの測定の結果を以下の表Ｑに示す。データを、従来の方法を用いて決定された群の平均測定値±標準誤差（SE）に関して報告する。結果は、精製された細胞外タンパク質の組合せのそれぞれに対して、強い細胞媒介免疫応答が生じたことを明らかに示す。免疫化モルモットは、すべての組合せに対し、コントロールよりも少なくとも２倍、そして通常３倍以上の紅斑を示した。さらに免疫化モルモットは、すべての組合せに対して、コントロールよりも少なくとも3倍の硬化を示した。実施例18 エアゾル化M.TUBERCULOSISに対する組合せIII〜XIIの免疫防禦性分析精製した細胞外産物のこれらの典型的な組合せの予防効率を示すために、実施例４のプロトコルを用いて最終免疫化から３週間後に、組合せIII〜XIIで免疫化モルモットにM.tuberculosisを抗原投与した。先の結果と一致して、組合せIII〜XIIで免疫化したモルモットはすべて、抗原投与後の死から防禦された。抗原投与後４週で、組合せIV〜XIIで免疫化した群の動物は０匹、そして組合せIIIで免疫化した群では６匹の動物の内１匹（17％）に比べ、６匹の疑似免疫化動物のうち２匹が死亡した（33％）。抗原投与後10 週で、組合せIXおよびXIIで免疫化した群の動物では死亡０（0％）、組合せIII 、IV、Ｖ、VI、Ｘ、およびXIで免疫化した群の動物では６匹のうち死亡１匹（17 ％）、組合せVIIIで免疫化した動物の５匹のうち死亡１匹（20％）、および組合せVIIで免疫化した動物の６匹のうち死亡２匹（33％）に比べ、疑似免疫化動物の50％が死亡した。観察期間終了以前に死亡したモルモットを剖検し、そして肥大した結核病巣の形跡を調べた。研究中に死亡したすべての動物で病巣が見つかった。死亡率研究の結論に従い、生存した動物を炭酸過剰で屠殺し、実施例５のプロトコルを用いて各動物の脾臓を生存M.tuberculosisについてアッセイした。結果を疑似免疫化動物に由来する対数の減少と共に、平均コロニー形成単位（CFU）により以下の表Ｒに示す。CFU値の隣のアステリスクは、各群の１匹の動物で脾臓計数がゼロであったことを示す。計算の目的で、計数ゼロは、脾臓あたり10³C FUまたは３logとして扱った。組合せIII、IV、VI、VII、IX、Ｘ、XIおよびXIIで免疫化した動物は、疑似免疫化コントロールよりも、平均して少なくとも0.5 log少ないコロニー生成単位のM.tuberculosisを脾臓中に有していた。特に、組合せIVおよびVIIは、コロニー形成単位の平均数がほぼ10倍減少し、特に有効であることが分かった。組合せＶおよびVIIIで免疫化した動物は、疑似免疫コントロールよりも、平均してそれぞれ0.3および0.1 log少ないコロニー形成単位（CFU）を脾臓中に有していた。本発明の教示に従って免疫化動物におけるコロニー形成単位のこの劇的な減少は、本発明が免疫防禦に実施できることを、再度示す。実施例19 組合せXIIIでの抗原等よに対する組合せXIIIの３つの異なる投与量で免疫化したモルモットの応答本発明の実施可能性および範囲をさらに定義すると共に、精製細胞外産物のさらなる組合せるの効率を示すために、別のワクチン接種投与量を用いて、前と同じようにモルモットを免疫化した。特に、３つの主に豊富な細胞外産物の別な組合せの50μg、100μgおよび200μgが、組合せXIIIと同定され、そして30KD、32( A)KDおよび16KDのタンパク質を含んだ。先の実施例と同じく、動物群を、４回、３週間毎に、SAF中の組合せXIIIで別の投与量で皮下で免疫化した。動物が、ワクチン接種後、測定可能な免疫応答を発現するかどうかを決めるために、皮膚過敏性アッセイを行った。動物の背中を剃り、そして精製した細胞外産物の10.0μgのそれぞれを含む組合せXIIIで皮内に注射した。注射はすべて、0 .1mlの全容量を用いて行った。疑似免疫化コントロールもまた、組合せXIIIの同じ投与量で試験した。皮膚の試験部位の紅斑と硬化の直径を注射後24時間で測定した。結果を、従来の方法を用いて決定した群の平均測定値±標準誤差（SE）で以下の表Ｓに示す。これらの結果は、組合せXIIIの３つの投与量のそれぞれで免疫化した動物で、組合せXIIIに対する強い細胞媒介免疫応答が生じたことを、再度、明らかに示す。免疫化動物は、コントロールの紅斑の約２〜３倍の紅斑を示した。さらに衝撃的なことに、すべての場合で最低限の応答を示したコントロール動物に対し、免疫化動物は少なくとも35倍の硬化を示した。実施例20 エアゾル化M.TUBERCULOSISに対する３つの異なる投与量での組合せXIIIの免疫防禦分析様々の投与量における本発明のワクチンの防禦免疫特性をさらに示すために、先の皮膚過敏性アッセイに用いた免疫化モルモット（群あたり６匹）に、最終免疫化から３週間後にエアゾル化M.tuberculosisを抗原投与した。エアゾル化抗原投与は実施例４に詳細に記したプロトコルを用いて行った。コントロール群の12 匹の疑似免疫化動物にも同時に抗原投与した。抗原投与後の各週の体重測定の結果を図10に示す。これは、組合せXIIIの３つの投与量のそれぞれで免疫化したモルモットは、明らかに体重減少から防禦されたことを示す。組合せXIIIのより高い投与量（100および200μg）で免疫化した動物は、実際、正味の体重が増加し、そしてより低い投与量（50μg）で免疫化した動物は体重減少が比較的少ないことを示した。対照的に、疑似免疫化動物は、抗原投与直後の数週間でその全体重が約22％減少し、そして10週の観察期間中、平均して182gの減少であった。以下の表Ｕは、抗原投与終了後の平均体重を測り、抗原投与開始時の平均体重を差し引き、そしてその結果を抗原投与開始時の体重で割った、免疫化動物およびコントロール動物に対する体重変化パーセントを示す。同様に、防禦パーセントを、コントロールの平均体重減少パーセントを免疫化動物の平均体重の増加または減少パーセントから差し引いて求めた。表Ｕは、疑似免疫化動物は、モニター期間中、免疫化動物に比べて、相当量の体重の減少（18〜29％）を示す。図10は、10週間のモニター期間にわたる１週間毎の間隔でプロットした、疑似免疫化動物に対する免疫化動物の各群の正味の体重減少のより図式化された表示を提出する。体重減少または「消耗」は結核の古典的な副作用の一つであるので、これらの結果は、免疫化動物での結核菌の成長および増殖が、本発明の典型的な組合せワクチンの３つの異なる投与量で阻害されたことを示す。実施例21 組合せXIV〜XVIIIの抗原投与に対する組合せXIV〜XVIIIの免疫防禦分析本発明の範囲と、その教示により調合され得る有効ワクチンの広い範囲を示すため、さらに５つの組合せワクチン（組合せXIV〜XVIII）をモルモットで試験した。SDS-PAGEを用いて決定した精製細胞外産物の見かけの分子量により同定し、各組合せワクチンの組成を以下の表に示す。組合せタンパク質組成 XIV 30、32A、16、32B、24、23、45 XV 30、32A、16、32B、24、23、45、23.5、12 XVI 30、32A、16、32B、24、23 XVII 30、32A、16、32B、24、71 XVIII Ｉ 30、32A、16、23、71 新しい組合せワクチンおよび適切なコントロールに加えて、組合せＩもまた、このシリーズの実験に用いた。モルモットを、組合せXIVまたはXVの各タンパク質50μg、および組合せＩ、XVI、XVIIおよびXVIIIの各タンパク質100μgで、すべてSAFアジュバント中、皮内で免疫化した。動物は、合計４回、各注射を３週間おきに免疫化した。皮膚過敏性アッセイを、先に議論したプロトコルを用いるワクチン接種後、動物が測定可能な免疫応答を発現するかどうかを決めるために行った。モルモットの背中を剃り、そして免疫される精製細胞外タンパク質の同じ組合せを皮内に注射した。各抗原投与について、10μgの各タンパク質を含有する適切な組合せワクチンを注射した。注射はすべて、0.1mlの全容量を用いて行った。疑似免疫化コントロールもまた、各組合せの同じ抗原投与量で皮膚試験した。実施例３の記載の通りに、皮膚試験部位での紅斑および硬化の直径を注射後24時間で測定した。これらの測定結果を以下の表Ｖに示す。これは、従来の方法を用いて決定される群の測定値±標準誤差（SE）で報告される。これらの結果は、明らかに、組合せXIV〜XVIII、および前述のように組合せＩに対して強い細胞媒介免疫応答が生じたことを示す。免疫化動物は、コントロールの紅斑の約２倍の紅斑を示した。さらに衝撃的なことに、免疫化動物は、すべての場合で最低限の応答を示した疑似免疫化コントロールよりも少なくとも10倍大きい硬化を示した。実施例22 エアゾル化M.TUBERCULOSISに対する組合せXIV〜XVIIIおよび組合せＩの免疫防禦分析実施例21の組合せワクチンの免疫応答性を確認し、そして感染性結核への適用性を示すために、先の皮膚過敏性アッセイに使用した免疫化モルモットに、最終免疫化から３週間後にエアゾル化M.tuberculosisを抗原投与し、そして実施例４のプロトコルを用いてモニターした。実施例20で用いたと同じ12匹の疑似免疫化動物のコントール群にも同様に抗原投与した。これらの抗原投与の結果を図11にグラフで示し、以下の表Ｗに直接示す。抗原投与終了後の平均体重を測り、抗原投与開始時の平均体重を差し引き、そしてその結果を抗原投与開始時の体重で割った、免疫化動物およびコントロール動物に対する体重変化パーセントを示す。同様に、防禦パーセントを、コントロールの平均体重減少パーセントを免疫化動物の平均体重の増加または減少パーセントから差し引いて求めた。表Ｗに示すように、各組合せワクチンで免疫化したモルモットは体重減少から防禦された。疑似免疫化動物は、全合計体重の約22％を失った。対照的に、組合せワクチンの予防効果は、試験群の一つで実際に体重が増加し、そしてその他では体重が減少する結果となった。特に、組合せXIVで免疫化した動物は、３％の体重増加を示し、一方、他の組合せで免疫化した動物は、その全合計体重のわずか4〜15％を失った。結果をグラフで図11に示す。これは、エアゾル抗原投与後、各群の動物の正味の体重の増加および減少に関して、週毎の体重測定をプロットする。図11に示された、免疫化動物と疑似免疫化コントロールとの統計的に有意な差は、本発明の組合せワクチンにより発現した免疫予防応答に対するさらなる証拠を提供する。実施例23 ３つの異なるアジュバントで免疫化したモルモットにおける細胞媒介免疫本発明のワクチン処方の広い適用性および多様性をさらに示すために、異なるアジュバントを用いて免疫原性研究を行った。特に３つの異なる免疫原（精製された30KDタンパク質、組合せＩ（30、32A、16、23、71）および組合せXIII（30 、 32A、16））を、それぞれ、３つの異なるアジュバント（シンテックス（Syntex ）アジュバント製剤Ｉ（SAF）、不完全フロイントアジュバント（IFA）およびモノホスホリルリピッドＡ含有アジュバント（MPL））を用いて処方した。このようなアジュバントは、一般に、免疫原と一緒に投与された場合、生物の免疫応答を増強することが知られている。モルモットを、100μgの各タンパク質含有の組合せＩおよびXIII、および３つの異なるアジュバント処方物において、約100μgの精製した30KDタンパク質で免疫化した。モルモットを、各処方物で３回、３週間おきの注射で免疫化した。免疫化後、モルモットが測定可能な免疫応答を発現したかどうかを決めるため、皮膚過敏性アッセイを行った。モルモットの背中を剃り、そして免疫したものと同じ免疫原を皮内に注射した。抗原投与のため、組合せＩおよびXIII中の各タンパク質I0μg、または精製した30KDタンパク質10μgを、100μlの全容量で注射した。３つのアジュバントのうちの１つで疑似免疫化したモルモットを、同じアジュバントを含むそれぞれの免疫原製剤で皮膚試験した。皮膚試験部位での紅斑と硬化の直径を、実施例３の記載の通りに、抗原投与後24時間に測定した。これらの測定の結果を以下の表Ｘに示す。先に議論したように、データは認められた統計的手法を用いて群の測定値±標準誤差で報告される。表Ｘに提示されたデータが示すように、本発明の組合せワクチンおよび精製細胞外産物は、異なるアジュバントで処方された場合、強い細胞媒介免疫原応答を提供する。さらに、３つのアジュバントのそれぞれは、それぞれの免疫原に対し同じ免疫原性応答を提供する。一般に、免疫モルモットは疑似免疫モルモットのそれの約7〜10倍の紅斑直径を示したが、硬化はコントロール動物で測定されたものより約4〜6倍大きかった。異なるアジュバントと組合せて強い免疫原性応答を誘発する本発明の能力は、ワクチンの最適化を促進する。すなわち、本明細書の教示に従って有効なワクチン処方物を製造するために使用されるアジュバントは、主として、例えば、安定性、副作用がないこと、コストおよび貯蔵し易さの２次的な基準の考慮に基づいて選択される。免疫応答の刺激に直接関連しない、これらおよび他の基準は、比較的初期の条件で広範囲に使用されるワクチン製剤を開発する場合、特に重要である。実施例24 組み合せXIX〜XXVIIIの抗原投与に対する組み合せXIX〜XXVIIIの免疫防御性分析本発明の広い適用範囲は、さらに10種の組み合せワクチン、組み合せXIX〜XXV IIIを用いる免疫応答の発生によって示される。新しい組み合せワクチンと適切なコントロールに加えて、モルモットに免疫応答を誘起するための陽性対照として組み合せIVとXIIIも使用された。SDS-PAGEを用いて測定された精製細胞外産物の見かけの分子量で同定して、組み合せワクチンそれぞれの組成は以下のようになる。組み合わせタンパク質構成物 XIX 30,32A,23 XX 30,32A,23.5 XXI 30,32A,24 XXII 30,32A,71 XXIII 30,32A,16,23 XXIV 30,32A,16,23.5 XXV 30,32A,16,24 XXVI 30,32A,16,71 XXVII 30,32A,16,32B XXVIII 30,32A,16,45 IV 30,32A XIII 30,32A,16 モルモットを合計4回、それぞれの注射を3週間間隔で免疫化した。動物を免疫するために使用された各組み合せワクチンは、SAFアジュバント中で各タンパク質100μgでなり、全容積0.1mlであった。実施例3で議論されたプロトコルを用い、選ばれた組み合せワクチンを用いたワクチン接種後に動物が測定可能な免疫応答を生じたかどうか決めるために皮膚過敏性アッセイを行った。モルモットの背中を剃り、それらを免疫したものと同じ精製細胞外タンパク質の組み合せで経皮注射を行った。動物に抗原投与するために用いられたタンパク質の組み合せは、各タンパク質10μｇで構成された。疑似免疫対照も、各組み合せの同じ投与量で皮膚試験された。実施例3と同様、皮膚試験部位での紅斑と硬化の直径を、注射後24時間で測定した。これらの測定の結果を以下の表Yに示すが、各グループの動物に対する平均測定値±標準誤差で表されている。表Yに示された結果は同じ免疫原を抗原投与した場合、組み合せXIX〜XXVIIIに対し強い細胞媒介免疫応答が生じたことを明らかに示している。前と同様、組み合せIVおよびXIIIによっても強い細胞媒介免疫応答が誘発された。免疫モルモットが示す紅斑は、対応する疑似免疫対照動物で引き起こされる反応よりも少なくとも2倍、一般には４倍およびそれ以上であった。同様に、免疫動物が示す硬化は非免疫対照のそれより少なくとも2倍、一般には3〜4倍大きかった。本発明の教示に従って免疫された動物で生じた相当強い免疫応答は、再び本発明の組み合せワクチンの免疫防御の有用性を示す。当業者はまた、本発明のワクチンと方法のさらなる利点を理解する。例えば、高度に精製された分子種のそれぞれの化合物または選ばれた組み合せは、バクテリア全体またはその成分よりもむしろ目的のワクチンに使用され、従来技術の弱毒化または殺したバクテリアのワクチンと比較すると、本発明のワクチンは毒性反応をより誘起しにくいと考えられる。その上、本発明の分子ワクチンは免疫無防備の個体に対して生命の危険がない。実際、本発明の組成物は感染個体で病原体に対し、指向された免疫応答を刺激するために治療目的で使用される。主に豊富な細胞外産物またはその免疫的アナログを選択的に使用することはまた、細胞内バクテリアの病原性を増加させ得るオプソニン化体液性反応の発症を防止する。本発明で生じる防御的免疫は非結合タンパク質を指向しているので、寄生バクテリアの包含を促進するよりもむしろ、オプソニン反応は単に食菌作用と主に豊富な細胞外産物の分解となる。その上、精製細胞外産物を選択的に使用することは、免疫原性試薬の宿主認識に基づいた広く使用されているスクリーニングおよびコントロール手法の使用を排除する反応の発生可能性を低減する。従来技術のワクチンと異なり、病原体で発現しているが本発明により製造されたワクチンには含まれていない免疫応答性分子を用いてスクリーニング試験をなお行うことができる。このような免疫原決定因子を用いることは、標的病原体に曝されたこれらの個体で応答を誘起するのみであり、適切な対抗策を取ることを可能にする。本発明の別な利点は、従来技術のワクチンの弱毒化バクテリアまたはバクテリア成分と対照的に、精製された細胞外産物は大量に容易に得られ、そして周知の技術を用いて容易に単離されることである。本発明のこのような免疫応答産物は、ほとんどの目的の生物の周辺媒体中へ自然に放出されるため、細胞内不純物および細胞破片の除去は簡単になる。さらに最も重要または主に豊富な細胞外産物、またはその免疫的アナログは所望の免疫応答を刺激するために使用されるので、収穫できる産物の発現レベルおよび培養濃度は一般に、ほとんどの生産システムで上昇する。従って、どのような形式の生産を採用しても、所望の生成物の大スケールの単離は、クロマトグラフィーまたは超濾過等の日常的な生化学手法で容易に行われる。本発明で使用される免疫原決定因子の固有の属性および分子の特性は、大スケールで用いるための調和、標準化、高品質の組成物の製造を大いに促進する。あるいは、標的病原体の最も重要な、または主に豊富な細胞外産物の免疫的性質に基づく精製分子化合物を使用することはまた、本発明の免疫活性ワクチン成分の大スケール合成を比較的容易にする。例えば、目的の細胞外産物またはその免疫的アナログは組換えDNA技術を用いて非病原性宿主バクテリア中にクローンされ得、そして安全に収穫され得る。当該分野で周知の分子クローニング技術を、Escherichia coli等の宿主バクテリア中に挿入するための選択された高度発現ベクター中の目的の細胞外産物、そのアナログまたは任意のセグメントに対応するDNAを単離し発現するのに用いることができる。代表的な技術は、II R．Anon 、合成ワクチン（Synthetic Vaccines）31〜77頁、1987年；Tamら、「化学的に定義された抗マラリア合成ワクチン中のサーカムスポロゾイトタンパク質のTおよびBエピトープの取り込み（Incorporation of T and B Epitopes of the Circum sporozoite Protein in a Chemically Defined Synthetic Vaccine Against Mal aria）」、J．Exp．Med.，171:299〜306、1990；およびStoverら、「外表面タンパク質A（OspA）リポタンパク質を発現する組換えカルメット-ゲラン型結核菌（ BCG）で誘発される防御免疫性：ライム病ワクチンの候補物（Protective Immuni ty Ellcited by Recombinant Bacille Calmette-Guerin（BCG）Expressing Oute r Surface Protein A（OspA）Lipoprotein: A Candidate Lyme Disease Vaccine ）」、J．Exp．Med．178:197〜209、1993に見出される。同様に、細胞外タンパク質、そのアナログ、ホモログ、または免疫応答性タンパク質サブユニットを普通の実験室技術および自動配列決定技術を用いて、比較的純粋な形で、大スケールで化学的に合成できる。この生産法は細胞外産物の抗原決定因子のペプチドサブユニットまたは低分子量アナログの構築に特に魅力的である。タンパク質の小さいサブユニット製造のための典型的な技術は当該分野で周知であり、II R．Anon、「合成ワクチン」、15〜30頁、1987年、およびA．Str eitwieser，Jr.,「有機化学入門（Introduction to Organic Chemistry）」、953 〜55頁、1985年（第3版）に見出される。別の技術は、Grossら、「ペプチド結合の非酵素的切断：ウシ膵臓リボヌクレアーゼ中のメチオニン残基（Nonenzymatic Cleavage of Peptide Bonds: The Methionine Residues in Bovine Pancreatic Ribonuclease）」、The Journal of Biological Chemistry、237(6)1962；Maho ney、「o-ヨードソ安息香酸によるトリプトファンペプチド結合の高収率切断（Hi gh-Yield Cleavage of Tryptophanyl Peptide Bonds by o-Iodosobenzoic Acid ）」、Biochemistry 18(17)1979; およびShoolnikら、「Gonococcal Pili」、Journ al of Experimental Medicine 159，1984に見出される。ペプチド、ヌクレオチドまたは擬体等の他の分子を用いる抗イディオタイプまたは指向性分子進化等の免疫原技術も、所望の予防反応を生じる有効な免疫応答性化合物を生成するために用いることができる。本発明の実施に有用な核酸分子は、種々のベクターにより発現され得る。これらのベクターには、例えばヘルペスウイルスベクター（例えば米国特許第5、288、 641号）、レトロウイルス（例えばEPO、415、731号；WO第90/07936号；WO第91/028 5号；WO第94/03622号；WO第93/25698号；WO第93/25234号；米国特許第5、219、740 号；WO第89/09271号；WO第86/00922号；WO第90/02797号；WO 90/02806号；米国特許第4,650,764号；米国特許第5、124、263号；米国特許第4、861、719号；WO第93/ 11230号；WO第93/10218号；VileおよびHart、Cancer Res.、53:3860〜3864、199 3；VileおよびHart、Cancer Res．53:962〜967、1993；Ramら、Cancer Res．53: 83〜88、1993年；Takamiyaら、J．Neurosci．Res．33:493〜503、1992；Babaら、J．Neurosurg．79:729〜735，1993）、プソイドタイプウイルス、アデノウイルス（例えばWO第94/26914号；WO第93/9191号；Kollsら、PNAS 91(1):215〜219 、1994；Kass-Eislerら、PNAS 90(24):11498〜502、1993；Guzmanら、Circulati on88(6):2838〜48頁、1993年；Guzmanら、Cir．Res．73(6):1202〜1207、1993； Zabnerら、Cell 75(2)：207〜216、1993；Liら、Hum．Gene．Ther．4(4)：403〜 409、1993；Caillaudら、Eur．J．Neurosci．5(10)：1287〜1291，1993；Vincen tら、Nat．Genet．5(2)：130〜134、1993；Jaffeら、Nat．Genet．1(5)：372〜3 78、1992；およびLevreroら、Gene 101(2)：195〜202、1991）、アデノウイルス関連ウイルスベクター（Flotteら、PNAS 90(22)：10613〜10617、1993）、パルボウイルスベクター（Koeringら、Hum．Gene Therap．5：457〜463、1994）およびポックスウイルスベクター（PanicaliおよびPaoletti、PNAS 79:4927〜4931、 1982）が挙げられる。核酸分子（またはベクター、すなわち関連するシーケンスの発現を指向し得るアセンブリ）は、様々な機構で宿主細胞中に導入され得る。これらの構造には、例えば、トランスフェクション(例えば、死滅アデノウイルスに連結したDNA(Mic haelら、J．Biol．Chem．268(10):6866〜6869、1993；およびCurielら、Hum．Ge ne Ther．3(2):147〜154、1992)、シトフェクチン媒介導入(DMRIE-DOPE、Vical 、Calif.)、直接DNA注入(Acsadiら、Nature、352:815〜818、1991)、DNAリガンド(Wuら、J．Biol．Chem．264:16985〜16987、1989)を含む）；リポフェクション(Felgnerら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84:7413〜7417、1989）；リポソーム(Pickeringら、Circ．89(1):13〜21、1994；およびWangら、PNAS 84:7851〜78 55、1987)；ミクロ弾丸爆撃(Williamsら、PNAS 88:2726〜2730、1991)；および酵素それ自体をコードする核酸を単独(VileおよびHart、Cancer Res．53:3860〜 3864、1993）またはPEG−核酸複合体を利用する直接送達(WO第93/18759号；WO第 93/04701号；WO第93/07283号およびWO第93/07282号参照）が挙げられる。さらに別な方法として、本発明の1個以上の細胞外産物、アナログ、ホモログ、またはサブユニットの発現を誘発し得る1個以上の遺伝子をコードするDNAまたは他の遺伝物質を、いわゆる「裸のDNA」手法を用いて哺乳動物宿主中へ直接注入し得る。インビボ導入とその結果の宿主細胞による遺伝構成の取り込み後、宿主は、1個以上のコードされた免疫応答産物の内因性生産を開始し、その後の抗原投与に対し有効な免疫応答を引き起こす。当業者が認識するように、遺伝構築物を眞核プロモーター配列および／または分泌シグナルとカップリングすることにより、コードされた免疫応答産物（単数または複数）の内因性発現およびその結果としての分泌を促進する。裸のDNAをワクチンとして利用するための典型的な技術は、国際特許WO第9421797号（Merck & Co．Inc.およびViCal Inc.）、国際特許出願WO第9011092号（ViCal Inc.）、およびRobinson、「ヘマグルチニン発現プラスミドDNA免疫による致死インフルエンザウイルス抗原投与に対する防御（P rotection Against a Lethal Influenza Virus Challenge by Immunization wit h a Hema gglutinin-Expressing Plasmid DNA）」、Vaccine 11:9、1993、およびUlmerら、「ウイルスタンパク質をコードするDNAの注射によるインフルエンザに対する異種防御（Heterologous Protection Against Influenza by Injection of DNA Enco ding a Viral Protein）」、Science 259、1993（本明細書に参考として援用される）に見出される。あるいは、強い免疫原性タンパク質末尾の融合技術がTaoら、「B−Ceoリンパ腫ワクチンとしてのイディオタイプ／顆粒球−マクロファージコロニー刺激基因子融合タンパク質（Idiotype/Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Facto r Fusion Protein as a Vaccine for B-Ceo Lymphoma）」、Nature 362,1993に開示されており、そしてT細胞エピトープマッピングの技術については、Goodら、「Plasmodium falciparumサーカムスポロソイトタンパク質のヒトT細胞認識：分子の多形領域の免疫優性T細胞ドメインマップ（Human T-Cell Recognition of t he Circumsporozoite Protein of Plasmodium falciparum: Immunodominant T-C ell Domains Map to the Polymorphic region of the Molecule）」Proc．Natl ．Acad．Sci．USA 85、1988およびGaoら、「インフルエンザAウイルス中のヌクレオプロテインヘルパーエピトープの同定とキャラクラリゼーション（Identifi cation and Characterization of T Helper Epitopes in the Nucleoprotein of Influenza A Virus）」J．Imm．143(9)、1989に開示されている。多くのバクテリア属は相同性を示すので、先に述べた実施例は説明のために提供されるものであって、本発明の範囲と内容を制限したり、本発明をMycobacter ium属、または特定の種またはその血清グループまたは結核ワクチンのみに限定するものではない。微生物のDNAおよび対応するタンパク質における種間相同性が一般的であることは、本発明のワクチンが交差反応免疫を誘導し得ることを再度強調しておく。主に豊富な細胞外産物の免疫優性エピトープは、他の血清グループおよび選ばれた属の抗原投与に対して交差防御免疫を与えるので、ある種を指向するワクチンを細胞外産物または他の種の免疫原性同族体を用いて開発し得ることは、当業者が認めるところである。例えば、M．bovisはM．tuberculosisと90〜100％の間で相同であり、免疫応答を誘起する点で高度に交差応答性を有する。従って、M．bovisまたは他のMycoba cteriumの主に豊富な細胞外産物に基づくワクチンは、M．tuberculosisによる感染に対し種々の程度の防御を提供し、またその逆でもある。従って、適切な主に豊富な細胞外産物の高度に相同である免疫原性決定因子を用いて、同じ属の数種のバクテリア種に対する免疫防御反応を提供することは、本発明の範囲内にあることが意図される。本発明を実施するために選ばれた免疫原性決定因子は、有効な防御性または免疫診断免疫応答を誘発するために多くの異なった形で使用され得ることもまた強調されるべきである。従って、宿主免疫系に対する選ばれた主に豊富な細胞外産物の１個以上の免疫原性決定因子の提示法は重要でなく、生産または投与を促進するために変更し得る。例えば、本発明のワクチンは全細胞外生成物またはペプチド、タンパク質サブユニット、上記免疫原性アナログおよびホモログを含む任意の免疫刺激性分画を用いて製剤してもよい。本発明の教示によれば、M．tuber culosisの主に豊富な細胞外産物の有効なタンパク質サブユニットは、哺乳動物種の遺伝的に多様な分布中に同定できる。その結果、同定された免疫優性T細胞エピトープはヒトおよびウシを含む他の哺乳動物で認識されなければならない。これらの免疫優性Ｔ細胞エピトープは従って免疫診断試薬のみならずワクチンとしても有用である。M．tuberculosisの30KD主要分泌タンパク質の免疫優性T細胞エピトープを同定する典型的な研究は、以下のように行われた。実施例25 30KDタンパク質の免疫優性エピトープマッピング未変性30KDタンパク質全体をカバーし、そして10アミノ酸でオーバーラップしている55個の合成ペプチド（15量体）を、M．tuberculosis 55の30KD主要分泌タンパク質の免疫優性T細胞エピトープを同定するための脾臓リンパ球増殖アッセイに用いた。使用したそれぞれの15量体合成ペプチドの配列を、図12aおよびbの抗原ペプチド配列番号、およびアミノ酸残基の同定および各配列の相対位置に対応する同定番号（1−55）と組み合せて以下に示す。 SAF中にエマルジョン化した100μgの精製30KDタンパク質で3〜4回、経皮免疫した非近交系オスハートレ（Hartley）系モルモット（Charles River Breeding Laboratories）から脾臓リンパ球を得た（AllisonおよびByars，1986年）。対照動物にはSAF中のリン酸緩衝液−生理食塩水を投与した。上記のように細胞媒介免疫応答を皮膚試験で評価した。リンパ球を96ウェル組織培養プレートに接種し（Falcon Lanware）、そして20μg・ml^-1の合成15量体ペプチド、20μg・ml^-1の精製30KDタンパク質、20μg・ml^-1の精製タンパク質誘導体[（PPD）；Connaught La boratories LTD]、または10μｇ・ml^-1のコンカナヴァリンAと、I0UのポリミキシンBの存在下に２日間、３重でインキュベートした。続いて細胞を16時間、１μC iの[³H]チミジン(New England Nuclear)で標識し、その後収穫した（BreimanおよびHorwitz、1987年）。陽性増殖反応を以下のように定義した：（抗原のdpm） −（培地のdpm）≧1500および（抗原のdpm）／（培地のdpm）≧1.2。精製M．tub erculosisの30KDタンパク質で免疫したモルモットの25％以上に認識された免疫優性エピトープを以下の表Zに示し、そして図12aおよび12bにグラフ表示する。表Zに示す結果は、M．tuberculosisの30KD主要分泌タンパク質の免疫優性T細胞エピトープを同定する。当業者は、先行研究者がM．tuberculosisタンパク質と高度に関連するM．bovisの30KDタンパク質を研究していたことを理解するであろう。しかしながら、これらのM．bovisタンパク質の先行研究は、先行技術が実際のタンパク質、BCGワクチン、結核患者、またはPPD陽性個体を研究していた点で、従来技術の研究と明らかに異なる。このような個体でのこのタンパク質に対する反応はしばしば弱いので、従来技術のエピトープマッピング研究は困難で、精度に疑問がある。対照的に、実施例25の研究は精製タンパク質で免疫した非近交系モルモットを利用しており、そのため免疫系はこの単一タンパク質に集中しており、極めて強い細胞性免疫応答を生じる。その上、これらのモルモットは免疫から数週間以内 − T細胞反応性のピーク時 − に調べられた。本発明の教示によれば、上記同定された免疫優性エピトープの一つ、またはそれ以上は、結核に対するワクチンに取り込まれ得る。例えば、個々の免疫優性エピトープを、多重抗原ペプチド系中で単独または組み合せて合成し使用することができる。あるいは、２つ以上の免疫優性エピトープを化学的に連結することもできる。連結されていても単独であっても。ペプチドは、適切なアジュバントと組み合せることができ、そしてヒトまたは他の哺乳類に対するサブユニットワクチンで使用することができる。その上、免疫優性エピトープを新規皮膚試験等の新規免疫診断試薬に使用することもできる。当業者はまた、ペプチドをコードするDNAを単独または集合でペプチドを発現するために合成し使用することができ、またはヒトまたは他の哺乳類に直接注射されたDNAワクチンと組み合せることもできることを理解するであろう。免疫原性エピトープ（またはそれをコードするＤＮＡ）のみでなる構築物は、分子の保護部位上の免疫応答に集中する。無関係または免疫抑制エピトープを避けることで、このような構築物はより強く、かつうより防御的な免疫応答を誘発し得る。主に豊富な細胞外産物のより小さいサブユニット、そのアナログ分子、それをコードする遺伝子、およびそれらのそれぞれの組み合せは、それらが有効な免疫防御性または免疫診断試薬としての機能を発揮するかぎり本発明の範囲にある。さらに、融合タンパク質または公知の分子組換え技術で修飾された細胞外産物等の組換えタンパク質産物は、本発明の教示と完全に両立し得る。その上、選ばれた免疫活性決定因子またはペプチドの免疫原性的に生成したアナログ、および指向性進化を用いて誘導されたヌクレオチドも、本発明の範囲内である。さらに、選ばれた免疫活性決定因子を、ヒトまたは他の種の特異的MHC分子とより強固に結合する様に、または抗体表示細胞によりより有効に表現される様に修飾することができる。そのうえ、選択された免疫活性決定因子を、ワクチン接種宿主の分解に抵抗する様に修飾することもできる。同様に、免疫原性試薬の調剤と宿主免疫系への表示は、アジュバント中のタンパク質またはそのアナログの溶液に限られない。例えば、適切な細胞外タンパク質から誘導される免疫原性決定因子は、非病原性であり組換え技術で修飾されたＭ．tuberculosis、Mycobacteriaの異なった株、バクテリア、ファージ、マイコプラズマまたはウイルスの異なった株で発現され得る。この場合、所望の反応を刺激するために生き微生物全体を製剤し使用することができる。逆に悪環境中での大量ワクチン接種計画には、面倒なアジュバントまたは添加剤なしできわめて安定な製剤が要求される。さらにワクチン製剤は、凍結乾燥、経口投与、カプセル化等の過酷な条件に曝される場合、活性成分の安定性または免疫応答性を促進することを目的とすることができる。従って、本発明は、製品の意図される使用に依存して、目的のワクチンを含む免疫原性決定因子のきわめて異なった製剤を包含する。当業者は、ワクチンの投与量が日常の実験を用いて各病原体と宿主について決められなければならないることを理解するであろう。現在のところ、実際的な最低投与量は0.1μg〜2.0μgであり、20.0μg、100μgおよび1mgでさえ適切な系では最適であり得る。適切な投与量を、当該分野で公知の従来の免疫技法および手順で投与することができる。実施例26 組み換え30kDaタンパク質の発現成熟30kDaタンパク質の発現のために、30kDaタンパク質をコードする遺伝子を、成熟タンパク質のイニシエーターであるフェニルアラニンを、pET22b中のNcoI 部位またはpelBリーダ配列のカルボキシル末端に人工的に挿入されたグリシン残基に融合するように操作した（Novagen，Madison，WI）；図13を参照のこと）。このストラテジーは、成熟30kDaタンパク質が容易に放出され得る融合分子を提供し、そして４時間にわたって比較的に大量の組み換え30kDaタンパク質の発現を誘導する。その後、組み換えタンパク質の発現はプラトーに達した。組み換え分子の発現は、細菌培地に重要な有害な影響を示すことなく８時間まで持続した。 1リットルのE．coli培養物からの代表的な収量は約50mgであり、全菌体タンパク質の25％に達した。組み換え30kDaタンパク質のその全長または切り出しバージョンでの発現を達成するために、pET22b中の構築物を1mMのイソプロピル-b-D-チオガラクトピラノシド（IPTG）での誘導の際にE．coli BL21（DE3）pLysS中で発現させた。誘導培養物中のサンプルを１時間毎に８時間まで採取し、培地上清のアリコートおよび細胞ペレットを12.5％変性ポリアクリルアミドゲル上に展開し、そしてクマシーブリリアントブルーRで染色した。全てのクロマトグラフィー工程で緩衝液に８Ｍの尿素を加えた以外はHorwitzら（「Mycobacterium tuberculosisの主要細胞外タンパク質でのワクチン接種により誘導される、結核に対する防御免疫」、Proc ．Natl．Acad．Sci．USA.92：1530-1534，1995）により記載されるように、組み換えタンパク質を精製した。精製した組み換えタンパク質をリン酸緩衝化生理食塩水に対し透析し、可溶性のまま保持した。成熟30kDaタンパク質を、それ自体のまたはpelBリーダーペプチドをコードするプラスミドでのいずれかでpET22bベクター中で発現させた。細胞ペレットの電気泳動の結果を図14に示す。レーンＡおよびＢは、pelBリーダーDNA配列（A）に融合された成熟30kDaタンパク質遺伝子を有するpET22ベクター、および全長30kD aタンパク質遺伝子（B）を含むpET22bを有する細菌のIPTG誘導の際のクマシー染色タンパク質抽出物を示す。レーンＣは対照として、M．tuberculosis培地濾過液から単離した成熟30kDaタンパク質を示す。レーンＤ、Ｅ、およびＦは、抗30/ 32A-BkDa複合体特異性抗体でプローブしたＡ、Ｂ、およびＣと同様に、同じタンパク質のウエスターンブロット分析を示す。レーンＧは、pET22bベクターのみを有するE．coli培養物からのタンパク質抽出物を、同じ抗体でプローブした。全長および成熟30kDaタンパク質の位置はそれぞれ30Ｗおよび30Ｍで示され、これらの組み換えタンパク質はそれらの最初の５または７個のＮ末端アミノ酸によりさらに同定される。左側の番号はkDa単位の分子量標準である。実施例27 MYCOBACTERIUM SMEGMATISおよびMYCOBACTERIUM VACCAE中のプラスミドpSMT3を用いる、可溶性のプロセスされた細胞外M．TUBERCULOSIS 30kDa主要分泌タンパク質の発現この実施例は、Mycobacterium中のM．tuberculosis 30kDa主要分泌タンパク質の発現および分泌を示すことを目的とする。本発明者らは、pSMT3プラスミド（D ouglas B．Young博士、Dept．Medical Microbiology、St．Mary's Hospital Med ical School、Norfolk Place、London、W21PG、英国）、E．coli（カラムEl ori ）およびmycobacterium（Mycobacterium fortuitum プラスミドpAL5000 ori）の両方の複製起点を有する5.7kb（キロベース対）プラスミド、ハイグロマイシン耐性マーカー、hps60プロモーター（Mycobacterium bovis BCGヒートショックタンパク質プロモーター配列）、およびhsp60プロモーターのマルチクローニング部位下流を使用した。発現系を図15に図示する。インサートは30kDaタンパク質の配列を含むM．tuberculosis Erdman株由来の4 .7kb HinDIII-BamHIゲノムDNAフラグメントからなる。インサートをE．coli DH5 a中でpSMT3中でクローン化し、組み換えプラスミドDNAをM．smegmatis 1-2cおよびM．vacce R877R（ナショナルコレクション・オフ・タイプカルチャー（NCTC ）11659）中に、6250V／cmおよび25mファラッドの条件でエレクトロポーレーションにより形質転換した。M．smegmatis 1-2cはM．smegmatis mc²6の治療した単離体であり、Zhangら（Molecular Microbiology、５(2)：381-391、1991）により記載される手順によりM．smegmatis mc²6から調製されたATCC 607（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション）の単細胞単離体である。M．smegmatis mc²6はATCC607から、Jacobsら（Nature、327：532-535、1987）により記載される手順により単離された。１mgの組み換えプラスミドDNAおよび約4×10⁹CFUのMycobacteriaを用いて、この方法で100−200ハイグロマイシン耐性形質転換体を得た。この形質転換体はブロス培地中で安定であり、そしてM．tuberculosisの30kDaタンパク質を構成的に発現して、約10mgのプロセスされたタンパク質／Ｌを産生した。最も重要なことは、タンパク質は可溶性であり、そして発現されたタンパク質の約90％が培地上清中に分泌されたことである（図16を参照のこと）。図16に示される電気泳動の結果は、以下のようにして得られた。M．tuberculo sisの30kDa遺伝子を有するpSMT3構築物を含む５つの組み換えM．smegmatisクローンそれぞれからの上清液をSDS-PAGE（ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動）分析を行った（５本の右側のレーン）。主なタンパク質（図16中の矢印）は組み換えM．tuberculosisの30kDa主要分泌タンパク質である。最も左側のレーンは分子量標準を示す（66、45、36、29、24、20、14kDa）。組み換えタンパク質は29kDaマーカーのすぐ上に移動する。培地上清中の主要細胞外タンパク質が組み換えM．tuberculosisの30kDa主要分泌タンパク質であることを確認するために、ウエスターンブロット分析を用いた。結果を図17に示す。図17では、図16の右側の４本にレーンで示されるタンパク質は、SDS-PAGEに供し、そしてニトロセルロース上にブロットした（４本の右側レーン）。ブロットを、M．tuberculosis 30/32kDaタンパク質複合体特異的ウサギポリクローン抗体でプローブした。組み換えM．tuberculosisの30kDaタンパク質のみが染色される（矢印）。左側のレーンはあらかじめ染色された分子量マーカーを含む（106、80、49.5、32.5、27.5、および18.5kDa）。組み換えタンパク質は32.5と27.5kDa分子量標準との間に移動する。さらに最初の６つのＮ末端アミノ酸のＮ末端配列はFSRPGLを示し、このＮ末端配列は成熟M．tuberculosis 30kDaタンパク質のそれと同一であることを確認する。 pET20（Novagen、Madison、WI）中の2つの構築物（１つは30kDaタンパク質のためであり、そしてもう１つは32AkDaタンパク質のためである）はいずれも、E. coli中で発現しなかった。pKK233の単離体は、AmannおよびBrosius（Gene、40、 183-190、1985）により記載されている。pTrc99A（Pharmacia Biotech、Sweden ）をpKK233ベクターの代わりに使用し得る。pKK233中の３個の異なる構築物−１つは全長30kDaタンパク質のため、１つは全長32kDaタンパク質のため、そして１つは成熟30kDaタンパク質のため−はE．coli中で全てのタンパク質を発現しなかった。成熟30kDaタンパク質のためのpRSET-A中の１つの構築物はE．coli中で融合タンパク質を産生したが、30kDaタンパク質はエンテロキナーゼでこの融合タンパク質がなくなる様には切断され得なかった。同様に、pTrx-Fus中の２つの構築物 −１つは成熟30kDaタンパク質のため、そして１つは成熟32kDaタンパク質のため −はE．coli中で融合タンパク質を産出したが、この融合タンパク質からのM．tu berculosisタンパク質はエンテロキナーゼで効率よく切り出され得なかった。多様な発現系の適用性の要約を表AAに示す。すべてのインサートは32A kDaタンパク質用である。表AAに見られ得るように、すべての構築物がタンパク質を発現する結果とはならなかった。構造遺伝子の前のリーダー配列が発現のために必要であった。従って、成熟30kDaタンパク質遺伝子を含む１つのpET22b構築物と、成熟32AkDaタンパク質遺伝子を含む１つの構築物はどちらのタンパク質も発現しなかった。タンパク質のそれぞれのリーダー配列を構造遺伝子の前に加えることによって、30および32A kDaのM．tuberculosisタンパク質のpET22b中での発現の成功が得られた。両方のタンパク質について、これは全長およびプロセスされたタンパク質の発現をもたらした。これらの構築物はE．coli中で比較的安定であった。すなわち、これらは２回または３回の継代培養後に発現したが、それ以上の継代培養後には発現しなかった。各タンパク質の構造遺伝子の前にE．coli由来pelBリーダー配列を加えることにより、30および32A kDaのM．tuberculosisタンパク質のpET22b中での発現の成功が得られた。これらの構築物における発現レベルは、30または32A kDaタンパク質のそれぞれのリーダー配列を利用するものより高かった。しかし、pelB構築物の欠点はその不安定性であった。これらの構築物は１回の継代培養後に全ての組み換えタンパク質を発現するそれらの能力を失った。所望のタンパク質を発現するための一般的なアプローチの簡単な説明を、上記実施例24に示す。主に豊富な細胞外産物とそれらの分子アナログのより小さいタンパク質サブユニットは、それらが有効な免疫防御を誘導するかぎり本発明の範囲内である。さらに、公知の分子組み換え技術で修飾された融合タンパク質または細胞外産物のような組み換えタンパク質産物は、本発明の教示と完全に適合する。さらに、抗イディオタイプ抗体、または直接進化を用いて誘導されたペプチドおよびヌクレオチドのような選択された免疫活性決定因子の免疫原性的に発生したアナログもまた、本発明の範囲内である。同様に、宿主免疫系に対する免疫原性薬剤の処方および提示は、アジュバント中のタンパク質またはそれらのアナログの溶液に限定されない。例えば、適切な細胞外タンパク質由来の免疫原性決定因子は、病原性でなく、かつ組み換え技術を用いて修飾された細菌、ファージ、マイコプラズマ、またはウイルスの異なる種でも発現され得る。このような場合、所望の応答を刺激するために、全ての存在している生物が処方され、そして使用され得る。逆に、不適切な環境中での大量ワクチン接種計画では、複雑なアジュバントまたは添加剤を含まないきわめて安定な処方物が必要とされる。さらに、凍結乾燥または経口投与またはカプセル化などの過酷な条件に曝された場合、ワクチンの処方物は活性成分の安定性または免疫応答性を促進することを目的とし得る。従って本発明は、産物の目的の用途により目的のワクチンを含む免疫原性決定因子の極めて多様な処方物を含む。当業者は、ワクチン用量が、日常的な実験を用いて、個々の病原体および宿主について決定されるはずであることを理解する。現在のところ、最小実用用量は 0.1mg〜2.0mg、20.0mg、100mgの程度であり、そして１mgでも適切な系では最適であり得る。当該分野で公知の任意の通常の免疫化技術および手順を用いて、適切な用量が投与され得る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:32） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:32） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (31)優先権主張番号０８／５５１，１４９ (32)優先日 1995年10月31日 (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号０８／５６８，３５７ (32)優先日 1995年12月６日 (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ハース，グンダーアメリカ合衆国カリフォルニア 90025, ロスアンジェルス，ソーテルブールバードナンバー16 1525

Claims

【特許請求の範囲】１．哺乳動物宿主での、Mycobacterium属に由来する感染性病原体に対する有効な免疫応答の促進における使用のためのワクチン接種用薬剤であって： M．tuberculosis 110KDタンパク質、80KDタンパク質、71KDタンパク質、58KD タンパク質、45KDタンパク質、32A KDタンパク質、32B KDタンパク質、30KDタンパク質、24KDタンパク質、23.5KDタンパク質、23KDタンパク質、16KDタンパク質、14KDタンパク質、12KDタンパク質、ならびにそれらのそれぞれのアナログ、ホモログ、およびサブユニットからなる群より選択される少なくとも１つの主に豊富な細胞外産物の少なくとも一部、を含有する、ワクチン接種用薬剤。２．前記少なくとも１つの主に豊富な細胞外産物がM．tuberculosis 58KDタンパク質である、請求項１に記載のワクチン接種用薬剤。３．M．tuberculosis 58KDタンパク質、ならびにそれらのフラグメントおよび誘導体のアミノ酸配列の少なくとも一部のコード配列を含む、DNA分子。４．真核生物プロモーター配列に作動可能に連結される、請求項３に記載のDNA 分子。５．前記コード配列が以下の配列の少なくとも一部を含む、請求項３に記載のDN A分子：６．請求項５に記載のDNA分子によってコードされる、アミノ酸配列。７．哺乳動物宿主での、Mycobacterium属に由来する感染性病原体に対する有効な免疫応答の促進における使用のためのワクチン接種用薬剤であって： M．tuberculosis 110KDタンパク質、80KDタンパク質、71KDタンパク質、58KD タンパク質、45KDタンパク質、32A KDタンパク質、32B KDタンパク質、30KDタンパク質、24KDタンパク質、23.5KDタンパク質、23KDタンパク質、16KDタンパク質、14KDタンパク質、12KDタンパク質、ならびにそれらのそれぞれのアナログ、ホモログ、およびサブユニットからなる群より選択される少なくとも１つの主に豊富な細胞外産物の少なくとも一部をコードするDNA構築物を包含し、かつ該哺乳動物宿主細胞へのインビボの形質導入の際に該細胞外産物の発現を誘導し得、そしてその結果、該細胞に取込まれる、ワクチン接種用薬剤。８．前記DNA構築物が以下の式のDNA配列の少なくとも一部を含む、請求項７に記載のワクチン接種用薬剤：９．Mycobacterium属に由来する感染性病原体に対して哺乳動物宿主を免疫化する方法であって、該方法は以下の工程： M．tuberculosis 110KDタンパク質、80KDタンパク質、71KDタンパク質、58KD タンパク質、45KDタンパク質、32A KDタンパク質、32B KDタンパク質、30KDタンパク質、24KDタンパク質、23.5KDタンパク質、23KDタンパク質、16KDタンパク質、14KDタンパク質、12KDタンパク質、ならびにそれらのそれぞれのアナログ、ホモログ、およびサブユニットからなる群より選択される少なくとも１つの主に豊富な細胞外産物の少なくとも一部をコードする核酸を包含し、かつインビボで導入され、その結果、哺乳動物宿主細胞により取込まれる際に該少なくとも１つの主に豊富な細胞外産物の発現を誘導し得る核酸構築物を提供する工程；および該構築物を該哺乳動物宿主に導入して、該感染性病原体による引き続く感染に対して有効な免疫応答を誘導する工程、を包含する、方法。１０．前記少なくとも１つの主に豊富な細胞外産物がM．tuberculosis 58KDタンパク質である、請求項９に記載の方法。１１．前記核酸構築物が以下の式のDNA配列の少なくとも一部を含む、請求項１０に記載の方法：１２．前記少なくとも１つの主に豊富な細胞外産物がM．tuberculosis 23.5KDタンパク質である、請求項１に記載のワクチン接種用薬剤。１３．M．tuberculosis 23.5KDタンパク質、ならびにそれらのフラグメントおよび誘導体のアミノ酸配列の少なくとも一部のコード配列を含む、DNA分子。１４．真核生物プロモーター配列に作動可能に連結される、請求項１３に記載の DNA分子。１５．前記コード配列が以下の配列の少なくとも一部を含む、請求項１３に記載のDNA分子：１６．請求項１５に記載のDNA分子によってコードされる、アミノ酸配列。１７．前記DNA構築物が以下の式のDNA配列の少なくとも一部を含む、請求項７に記載のワクチン接種用薬剤：１８．前記少なくとも１つの主に豊富な細胞外産物がM．tuberculosis 23.5KDタンパク質である、請求項９に記載の方法。１９．前記核酸構築物が以下の式のDNA配列の少なくとも一部を含む、請求項１８に記載の方法：２０．前記少なくとも１つの主に豊富な細胞外産物がM．tuberculosis 24KDタンパク質である、請求項１に記載のワクチン接種用薬剤。２１．M．tuberculosis 24KDタンパク質、ならびにそれらのフラグメントおよび誘導体のアミノ酸配列の少なくとも一部のコード配列を含む、DNA分子。２２．真核生物プロモーター配列に作動可能に連結される、請求項２１に記載の DNA分子。２３．前記コード配列が以下の配列の少なくとも一部を含む、請求項２１に記載のDNA分子：２４．請求項２３に記載のDNA分子によってコードされる、アミノ酸配列。２５．前記DNA構築物が以下の式のDNA配列の少なくとも一部を含む、請求項７に記載のワクチン接種用薬剤：２６．前記少なくとも１つの主に豊富な細胞外産物がM．tuberculosis 24KDタンパク質である、請求項９に記載の方法。２７．前記核酸構築物が以下の式のDNA配列の少なくとも一部を含む、請求項２６に記載の方法：２８．M．tuberculosis 30KDタンパク質、ならびにそれらのフラグメントおよび誘導体のアミノ酸配列のコード配列を含む、DNA分子。２９．前記少なくとも１つの主に豊富な細胞外産物がM．tuberculosis 16KDタンパク質である、請求項１に記載のワクチン接種用薬剤。３０．M．tuberculosis 16KDタンパク質、ならびにそれらのフラグメントおよび誘導体のアミノ酸配列の少なくとも一部のコード配列を含む、DNA分子。３１．真核生物プロモーター配列に作動可能に連結される、請求項３０に記載の DNA分子。３２．前記コード配列が以下の配列の少なくとも一部を含む、請求項３０に記載のDNA分子：３３．請求項３０に記載のDNA分子によってコードされる、アミノ酸配列。３４．前記DNA構築物が以下の式のDNA配列の少なくとも一部を含む、請求項７に記載のワクチン接種用薬剤：３５．前記少なくとも１つの主に豊富な細胞外産物がM．tuberculosis 16KDタンパク質である、請求項９に記載の方法。３６．前記核酸構築物が以下の式のDNA配列の少なくとも一部を含む、請求項３５に記載の方法：３７．哺乳動物宿主での、Mycobacterium属に由来する感染性病原体に対する有効な免疫応答の促進における使用のためのワクチン接種用薬剤であって： M．tuberculosis 110KDタンパク質、80KDタンパク質、71KDタンパク質、58KD タンパク質、45KDタンパク質、32A KDタンパク質、32B KDタンパク質、30KDタンパク質、24KDタンパク質、23.5KDタンパク質、23KDタンパク質、16KDタンパク質、14KDタンパク質、12KDタンパク質、ならびにそれらのそれぞれのアナログ、ホモログ、およびサブユニットからなる群より選択される少なくとも１つの主に豊富な細胞外産物の少なくとも１つの免疫優性エピトープ、を包含する、ワクチン接種用薬剤。３８．前記少なくとも１つの主に豊富な細胞外産物がM．tuberculosis 30KDタンパク質である、請求項３７に記載のワクチン接種用薬剤。３９．前記少なくとも１つの免疫優性エピトープが、アミノ酸配列を有するM．tuberculosis 30KDタンパク質サブユニット、ならびに単一または複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、および反転を含むそれらのそれぞれのアナログ、ホモログ、およびサブユニットからなる群より選択される、請求項３８に記載のワクチン接種用薬剤。４０．前記少なくとも１つの免疫優性エピトープがアミノ酸配列FSRPGLPVEYLQVP S（配列番号37）を有し、該アミノ酸配列がそれらの単一または複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、反転、アナログ、ホモログ、およびサブユニットを含む、請求項３９に記載のワクチン接種用薬剤。４１．前記少なくとも１つの免疫優性エピトープがアミノ酸配列LPVEYLQVPSPSMG R（配列番号38）を有し、該アミノ酸配列がそれらの単一または複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、反転、アナログ、ホモログ、およびサブユニットを含む、請求項３９に記載のワクチン接種用薬剤。４２．前記少なくとも１つの免疫優性エピトープがアミノ酸配列LQVPSPSMGRDIKV Q（配列番号39）を有し、該アミノ酸配列がそれらの単一または複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、反転、アナログ、ホモログ、およびサブユニットを含む、請求項３９に記載のワクチン接種用薬剤。４３．前記少なくとも１つの免疫優性エピトープがアミノ酸配列DIKVQFQSGGNNSP A（配列番号41）を有し、該アミノ酸配列がそれらの単一または複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、反転、アナログ、ホモログ、およびサブユニットを含む、請求項３９に記載のワクチン接種用薬剤。４４．前記少なくとも１つの免疫優性エピトープがアミノ酸配列FQSGGNNSPAVYLL D（配列番号42）を有し、該アミノ酸配列がそれらの単一または複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、反転、アナログ、ホモログ、およびサブユニットを含む、請求項３９に記載のワクチン接種用薬剤。４５．前記少なくとも１つの免疫優性エピトープがアミノ酸配列YYQSGLSIVMPVGG Q（配列番号49）を有し、該アミノ酸配列がそれらの単一または複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、反転、アナログ、ホモログ、およびサブユニットを含む、請求項３９に記載のワクチン接種用薬剤。４６．前記少なくとも１つの免疫優性エピトープがアミノ酸配列LTSELPQWLSANRA V（配列番号57）を有し、該アミノ酸配列がそれらの単一または複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、反転、アナログ、ホモログ、およびサブユニットを含む、請求項３９に記載のワクチン接種用薬剤。４７．前記少なくとも１つの免疫優性エピトープがアミノ酸配列SMAGSSAMILAAYH P（配列番号62）を有し、該アミノ酸配列がそれらの単一または複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、反転、アナログ、ホモログ、およびサブユニットを含む、、請求項３９に記載のワクチン接種用薬剤。４８．前記少なくとも１つの免疫優性エピトープがアミノ酸配列SAMILAAYHPQQFI Y（配列番号63）を有し、該アミノ酸配列がそれらの単一または複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、反転、アナログ、ホモログ、およびサブユニットを含む、請求項３９に記載のワクチン接種用薬剤。４９．前記少なくとも１つの免疫優性エピトープがアミノ酸配列ALLDPSQGMGPSLI G（配列番号67）を有し、該アミノ酸配列がそれらの単一または複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、反転、アナログ、ホモログ、およびサブユニットを含む、請求項３９に記載のワクチン接種用薬剤。５０．前記少なくとも１つの免疫優性エピトープがアミノ酸配列PSLIGLAMGDAGGY K（配列番号69）を有し、該アミノ酸配列がそれらの単一または複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、反転、アナログ、ホモログ、およびサブユニットを含む、請求項３９に記載のワクチン接種用薬剤。５１．前記少なくとも１つの免疫優性エピトープがアミノ酸配列AADMWGPSSDPAWE R（配列番号72）を有し、該アミノ酸配列がそれらの単一または複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、反転、アナログ、ホモログ、およびサブユニットを含む、請求項３９に記載のワクチン接種用薬剤。５２．前記少なくとも１つの免疫優性エピトープがアミノ酸配列GPSSDPAWERNDPT Q（配列番号73）を有し、該アミノ酸配列がそれらの単一または複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、反転、アナログ、ホモログ、およびサブユニットを含む、請求項３９に記載のワクチン接種用薬剤。５３．前記少なくとも１つの免疫優性エピトープがアミノ酸配列VANNTRLWVYCGNG T（配列番号77）を有し、該アミノ酸配列がそれらの単一または複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、反転、アナログ、ホモログ、およびサブユニットを含む、請求項３９に記載のワクチン接種用薬剤。５４．前記少なくとも１つの免疫優性エピトープがアミノ酸配列GANIPAEFLENFVR S（配列番号81）を有し、該アミノ酸配列がそれらの単一または複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、反転、アナログ、ホモログ、およびサブユニットを含む、請求項３９に記載のワクチン接種用薬剤。５５．前記少なくとも１つの免疫優性エピトープがアミノ酸配列QDAYNAAGGHNAVF N（配列番号85）を有し、該アミノ酸配列がそれらの単一または複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、反転、アナログ、ホモログ、およびサブユニットを含む、請求項３９に記載のワクチン接種用薬剤。５６．前記少なくとも１つの免疫優性エピトープがアミノ酸配列THSWEYWGAQLNAM K（配列番号89）を有し、該アミノ酸配列がそれらの単一または複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、反転、アナログ、ホモログ、およびサブユニットを含む、請求項３９に記載のワクチン接種用薬剤。５７．Mycobacterium属に由来する感染性病原体を同定する哺乳動物宿主の検出可能な免疫応答の促進における使用のための免疫診断薬剤であって： M．tuberculosis 110KDタンパク質、80KDタンパク質、71KDタンパク質、58KD タンパク質、45KDタンパク質、32A KDタンパク質、32B KDタンパク質、30KDタンパク質、24KDタンパク質、23.5KDタンパク質、23KDタンパク質、16KDタンパク質、14KDタンパク質、12KDタンパク質、ならびにそれらのそれぞれのアナログ、ホモログ、およびサブユニットからなる群より選択される少なくとも１つの主に豊富な細胞外産物の少なくとも１つの免疫優性エピトープ、を包含する、免疫診断薬剤。５８．前記少なくとも１つの主に豊富な細胞外産物がM．tuberculosis 30KDタンパク質である、請求項５７に記載の免疫診断薬剤。５９．前記少なくとも１つの免疫優性エピトープが、アミノ酸配列を有するM．tuberculosis 30KDタンパク質サブユニット、ならびに単一または複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、および反転を含むそれらのそれぞれのアナログ、ホモログ、およびサブユニットからなる群より選択される、請求項５８に記載の免疫診断薬剤。６０．前記少なくとも１つの免疫優性エピトープがアミノ酸配列FSRPGLPVEYLQVP S（配列番号37）を有し、該アミノ酸配列がそれらの単一または複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、反転、アナログ、ホモログ、およびサブユニットを含む、請求項５９に記載の免疫診断薬剤。６１．前記少なくとも１つの免疫優性エピトープがアミノ酸配列LPVEYLQVPSPSMG R（配列番号38）を有し、該アミノ酸配列がそれらの単一または複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、反転、アナログ、ホモログ、およびサブユニットを含む、請求項５９に記載の免疫診断薬剤。６２．前記少なくとも１つの免疫優性エピトープがアミノ酸配列LQVPSPSMGRDIKV Q（配列番号39）を有し、該アミノ酸配列がそれらの単一または複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、反転、アナログ、ホモログ、およびサブユニットを含む、請求項５９に記載の免疫診断薬剤。６３．前記少なくとも１つの免疫優性エピトープがアミノ酸配列DIKVQFQSGGNNSP A（配列番号41）を有し、該アミノ酸配列がそれらの単一または複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、反転、アナログ、ホモログ、およびサブユニットを含む、請求項５９に記載の免疫診断薬剤。６４．前記少なくとも１つの免疫優性エピトープがアミノ酸配列FQSGGNNSPAVYLL D（配列番号42）を有し、該アミノ酸配列がそれらの単一または複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、反転、アナログ、ホモログ、およびサブユニットを含む、請求項５９に記載の免疫診断薬剤。６５．前記少なくとも１つの免疫優性エピトープがアミノ酸配列YYQSGLSIVMPVGG Q（配列番号49）を有し、該アミノ酸配列がそれらの単一または複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、反転、アナログ、ホモログ、およびサブユニットを含む、請求項５９に記載の免疫診断薬剤。６６．前記少なくとも１つの免疫優性エピトープがアミノ酸配列LTSELPQWLSANRA V（配列番号57）を有し、該アミノ酸配列がそれらの単一または複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、反転、アナログ、ホモログ、およびサブユニットを含む、請求項５９に記載の免疫診断薬剤。６７．前記少なくとも１つの免疫優性エピトープがアミノ酸配列SMAGSSAMILAAYH P（配列番号62）を有し、該アミノ酸配列がそれらの単一または複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、反転、アナログ、ホモログ、およびサブユニットを含む、、請求項５９に記載の免疫診断薬剤。６８．前記少なくとも１つの免疫優性エピトープがアミノ酸配列SAMILAAYHPQQFI Y（配列番号63）を有し、該アミノ酸配列がそれらの単一または複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、反転、アナログ、ホモログ、およびサブユニットを含む、請求項５９に記載の免疫診断薬剤。６９．前記少なくとも１つの免疫優性エピトープがアミノ酸配列ALLDPSQGMGPSLI G（配列番号67）を有し、該アミノ酸配列がそれらの単一または複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、反転、アナログ、ホモログ、およびサブユニットを含む、請求項５９に記載の免疫診断薬剤。７０．前記少なくとも１つの免疫優性エピトープがアミノ酸配列PSLIGLAMGDAGGY K（配列番号69）を有し、該アミノ酸配列がそれらの単一または複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、反転、アナログ、ホモログ、およびサブユニットを含む、請求項５９に記載の免疫診断薬剤。７１．前記少なくとも１つの免疫優性エピトープがアミノ酸配列AADMWGPSSDPAWE R（配列番号72）を有し、該アミノ酸配列がそれらの単一または複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、反転、アナログ、ホモログ、およびサブユニットを含む、請求項５９に記載の免疫診断薬剤。７２．前記少なくとも１つの免疫優性エピトープがアミノ酸配列GPSSDPAWERNDPT Q（配列番号73）を有し、該アミノ酸配列がそれらの単一または複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、反転、アナログ、ホモログ、およびサブユニットを含む、請求項５９に記載の免疫診断薬剤。７３．前記少なくとも１つの免疫優性エピトープがアミノ酸配列VANNTRLWVYCGNG T（配列番号77）を有し、該アミノ酸配列がそれらの単一または複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、反転、アナログ、ホモログ、およびサブユニットを含む、請求項５９に記載の免疫診断薬剤。７４．前記少なくとも１つの免疫優性エピトープがアミノ酸配列GANIPAEFLENFVR S（配列番号81）を有し、該アミノ酸配列がそれらの単一または複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、反転、アナログ、ホモログ、およびサブユニットを含む、請求項５９に記載の免疫診断薬剤。７５．前記少なくとも１つの免疫優性エピトープがアミノ酸配列QDAYNAAGGHNAVF N（配列番号85）を有し、該アミノ酸配列がそれらの単一または複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、反転、アナログ、ホモログ、およびサブユニットを含む、請求項５９に記載の免疫診断薬剤。７６．前記少なくとも１つの免疫優性エピトープがアミノ酸配列THSWEYWGAQLNA MK（配列番号89）を有し、該アミノ酸配列がそれらの単一または複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、反転、アナログ、ホモログ、およびサブユニットを含む、請求項５９に記載の免疫診断薬剤。７７．Mycobacterium属の感染性病原体に対して哺乳動物宿主を免疫化する方法であって、該方法は以下の工程： M．tuberculosis 110KDタンパク質、80KDタンパク質、71KDタンパク質、58KD タンパク質、45KDタンパク質、32A KDタンパク質、32B KDタンパク質、30KDタンパク質、24KDタンパク質、23.5KDタンパク質、23KDタンパク質、16KDタンパク質、14KDタンパク質、12KDタンパク質、ならびにそれらのそれぞれのアナログ、ホモログ、およびサブユニットからなる群より選択される少なくとも１つの主に豊富な細胞外産物の少なくとも１つの免疫優性エピトープを提供する工程；および該少なくとも１つの免疫優性エピトープを該哺乳動物宿主に導入して該感染性病原体による引き続く感染に対して有効な免疫応答を誘導する工程、を包含する、方法。７８．前記少なくとも１つの主に豊富な細胞外産物がM．tuberculosis 30KDタンパク質である、請求項７７に記載の方法。７９．前記少なくとも１つの免疫優性エピトープが、アミノ酸配列を有するM．tuberculosis 30KDタンパク質サブユニット、ならびに単一または複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、および反転を含むそれらのそれぞれのアナログ、ホモログ、およびサブユニットからなる群より選択される、請求項７８に記載の方法。８０．Mycobacterium属の病原体に対する哺乳動物における免疫応答の存在を検出する方法であって、該方法は以下の工程： M．tuberculosis 110KDタンパク質、80KDタンパク質、71KDタンパク質、58KD タンパク質、45KDタンパク質、32A KDタンパク質、32B KDタンパク質、30KDタンパク質、24KDタンパク質、23.5KDタンパク質、23KDタンパク質、16KDタンパク質、14KDタンパク質、12KDタンパク質、ならびにそれらのそれぞれのアナログ、ホモログ、およびサブユニットからなる群より選択される少なくとも１つの主に豊富な細胞外産物の少なくとも１つの免疫優性エピトープを提供する工程；該少なくとも１つの免疫優性エピトープを該哺乳動物に投与する工程；およびその結果生じる免疫応答を測定する工程、を包含する、方法。８１．前記少なくとも１つの主に豊富な細胞外産物がM．tuberculosis 30KDタンパク質である、請求項８０に記載の方法。８２．前記少なくとも１つの免疫優性エピトープが、アミノ酸配列を有するM．tuberculosis 30KDタンパク質サブユニット、ならびに単一または複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、および反転を含むそれらのそれぞれのアナログ、ホモログ、およびサブユニットからなる群より選択される、請求項８１に記載の方法。８３．M．tuberculosis 110KDタンパク質、80KDタンパク質、71KDタンパク質、5 8KDタンパク質、45KDタンパク質、32A KDタンパク質、32B KDタンパク質、30KD タンパク質、24KDタンパク質、23.5KDタンパク質、23KDタンパク質、16KDタンパク質、14KDタンパク質、12KDタンパク質、ならびにそれらのそれぞれのアナログ、ホモログ、およびサブユニットからなる群より選択される主に豊富な細胞外産物を産生するプロセスであって、該プロセスは以下の工程：ベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換細胞を形成する工程であって、該ベクターは、該主に豊富な細胞外産物のうちの１つをコードする核酸分子を含む、工程；および該形質転換細胞を培養し、それにより該主に豊富な細胞外産物を産生する工程、を包含する、プロセス。８４．前記形質転換細胞を培養することによって産生される前記主に豊富な細胞外産物を回収するさらなる工程を包含する、請求項８３に記載のプロセス。８５．前記ベクターがpET22bを包含する、請求項８３に記載のプロセス。８６．前記宿主細胞がE．coli、M．smegmatis、またはM．vaccaeである、請求項８３に記載のプロセス。８７．前記核酸分子が、30KDタンパク質、32A KDタンパク質、または32B KDタンパク質からなる群より選択されるM．tuberculosis タンパク質をコードする、請求項８３に記載のプロセス。８８．前記形質転換細胞の培養の間に産生される前記タンパク質を回収するさらなる工程を包含する、請求項８３に記載のプロセス。８９．前記ベクターがpSMT3またはpET22bを包含する、請求項８８に記載のプロセス。９０．前記宿主細胞がE．coli、M．smegmatis、またはM．vaccaeである請求項８８に記載のプロセス。９１．M．tuberculosis 110KDタンパク質、80KDタンパク質、71KDタンパク質、5 8KDタンパク質、45KDタンパク質、32A KDタンパク質、32B KDタンパク質、30KD タンパク質、24KDタンパク質、23.5KDタンパク質、23KDタンパク質、16KDタンパク質、14KDタンパク質、12KDタンパク質、ならびにそれらのそれぞれのアナログ、ホモログ、およびサブユニットからなる群より選択される主に豊富な細胞外産物をコードする核酸分子を含む、ベクター。９２．前記核酸分子が、30KDタンパク質、32A KDタンパク質、または32B KDタンパク質からなる群より選択されるM．tuberculosis タンパク質をコードする、請求項９１に記載のベクター。９３．前記ベクターがpET22bを包含する、請求項９１に記載のベクター。