JPH11506334A

JPH11506334A - 遺伝子治療のためのアデノウィルスベクター

Info

Publication number: JPH11506334A
Application number: JP9500042A
Authority: JP
Inventors: エル．グラハム，フランク; アントン，マルティナ; エー．ルドニッキ，マイケル
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-07
Publication date: 1999-06-08
Anticipated expiration: 2016-06-07
Also published as: EP0832267A1; US5919676A; AU724161B2; US20010041173A1; CA2220997C; JP3492700B2; DE69619110D1; EP0832267B1; WO1996040955A1; CA2220997A1; ATE213022T1; AU5889796A; DE69619110T2

Abstract

(57)【要約】本発明は選定の外来タンパク質の挿入のための有用なリコンビナーゼ標的部位を含むアデノウィルスクローニング用ベクターを作製するための方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】遺伝子治療のためのアデノウィルスベクター発明の分野本発明は哺乳動物細胞への遺伝子導入のための高められた有用性を有するアデノウィルスベクターに関する。記載のベクター系は外来DNAの挿入のための高められた能力及び向上した安定性を有する。発明の背景 1994年５月31日提出の特許出願第08/250,885及びその原出願第08/080,727号は生存組換ワクチンとして及び遺伝子治療のための導入用ベクターとして優れた容量を有するアデノウィルス（Ad）由来細胞発現ベクター属を開示及び請求する。ヒトAdゲノムにおいて、早期領域１（Ｅ１），Ｅ３、及びＥ４の上流部位がアデノウィルス組換体を作製するための外来DNA配列の導入部位として利用されている。Ｅ１又はＥ３の欠失を補完しなければ活性ウィルス子孫を作り上げるのに最大約２kbをAdゲノムの中に挿入できる。Ｅ１領域は293細胞の補完におけるウィルス複製にとって必要でなく、そして5.0〜5.2kbの容量を有する条件ヘルパー依存性ベクターを作製するために3.2kbまでがこの領域において欠失させることができる。培養細胞におけるウィルス複製のために不要なＥ３領域において、様々なサイズの欠失が4.5〜4.7kbに至るまでの容量を存する非条件ヘルパー非依存性ベクターを作製するために利用されている。原出願に記載の如き現状有用なヘルパー非依存性Adベクターにおける外来DNA のインサートについての最大容量は約８kbである。この制約された容量は、Ｅ１及びＥ３配列の欠失を有するAdベクターの利用と、ウィルスベクターがヘルパーウィルスについてのニーズを必要とすることなく増幅し得るようにするためにウィルスゲノムのその他のほとんどの領域が保持されねばならないという事実として由来する。インサートDNAについてのこの制約された容量の他に、従来のベクターはウィルスゲノムのほとんどを保持しており、形質導入細胞又はヒトを含む接種動物における発現は毒性又はその他の好ましくない作用を供しうる。更に、従来のウィルスベクターはベクターの増殖のために利用される細胞の中に存在するAd配列又は接種動物の中に存在しうるAd配列と組換できうる。従って、本発明の目的は、全て又はほとんどのウィルス遺伝子を除去してよく、且つ現状有用なベクターと比べて安定性が高まり、しかも大きい挿入体のための容量を有するであろうAdクローニング用ベクターを提供することにある。発明の概要本発明の目標は、高容量Ad5クローニング用ベクターを開発できるようにしうる簡単、且つ有用なシステムの提供にある。同時に提出された出願第08/486,549 号（名称「Adenovirus for Control of Gene Expression」）に示されている通り、Ad感染細胞におけるCreリコンビナーゼの具備はCre媒介式部位特異的組換のための標的部位（lox Ｐ）を含むウィルスDNA配列の切除又は転移を触媒しうる。本発明において、Creの作用によりウィルスゲノムからウィルスDNAパッケージングシグナルを切除できうるAd5ゲノムを構築するのにこの知識が利用される。前記パッケージングシグナルの前記切除はビリオン粒子へとパッケージできないウィルスDNAを供する。かかるウィルスDNAは、ビリオンへとはパッケージングできないが、第二ウィルス「ベクター」であってウィルスゲノムの実体部分を欠くものの複製のための相補性機能を供するウィルス機能はコードし得るものであり、従って同時感染細胞においては、ヘルパー及びベクターDNAの双方が複製し得るが、ベクターDNAのみがビリオンへとパッケージし得る。本発明の一の態様は、Creとして知られる部位特異的リコンビナーゼにより認識且つそれにより作用され得る配列を含む環状改質ヒト５型アデノウィルス（Ad 5）ゲノムを含んで成る細菌プラスミドを提供する。この細菌プラスミドは、Cre により認識されうる配列を含む改質配列を担持する感染性Ad5を作製することができる。この細菌プラスミド及びこのプラスミドから作製したウィルスにおける改質配列の構造は、Creにより触媒される組換が、感染性ビリオン粒子に至るAd5 DNAのパッケージングのために必要とされるAd5ゲノムの左端付近にあるパッケージングシグナルとして知られる配列の切除を供するであろう。任意的に、プラスミド及び得られるウィルスの所定の領域、例えば感染性ウィルスの形態において前記ウィルスゲノムが複製できるような細胞の中でこのウィルスゲノムが複製することを妨げることなくウィルスゲノムから削除され得るＥ１又はＥ３由来の配列を欠失させてよい。本発明の第二の態様は、Ad5ゲノムの左末端反復配列及びそのパッケージングシグナル配列並びにAd5ゲノムの左末端反復配列を含むAd5ゲノムの左端から約34 0塩基対を含んで成る細菌プラスミドを提供する。左末端反復配列の左端は右末端反復と「ヘラド・トゥ・テール」形態で連結されている。このゲノムの左端付近のほぼ340番目のヌクレオチドとこのゲノムの右端付近のほぼ35,800番目のヌクレオチドとの間には外来DNA配列の挿入に適する置換化制限酵素部位がある。本発明の第三の態様はCreリコンビナーゼ酵素を供するヒト細胞系の如き哺乳動物細胞系を提供する。他方、Creは適当な細胞においてCreタンパク質を発現するAd5誘導ベクターより供されうる。本発明のその他の態様には、長さが20〜35kbの外来DNAの大型挿入により置換されたウィルスDNA配列の有意な欠失を含む「ベクター」として知られるAdゲノム構築体が含まれる。かかるゲノムは、以降「ヘルパー」ウィルスと呼ぶ、第二ウィルスにより供されるウィルス産物がないとウィルスとして複製できない。本発明の一の特定の態様はヘルパーウィルスであって、第二ウィルス、即ちウィルスゲノムの実体部分が欠失し且つ外来DNAで置換されたベクターの複製を支持するために採用したときに、この「ヘルパー」ウィルスのDNAが感染性ビリオンへとパッケージングできないようにデザイン、増幅及び使用されうるヘルパーウィルスを提供する。図面の簡単な説明図１はパッケージングシグナルにlox Ｐ部位が隣接しているウィルスベクターからのDNAのCre媒介式切除の模式図である。図２はヘルパーウィルスDNAのパッケージングを妨げるパッケージングシグナルのCre媒介式切除を利用してヘルパー依存性ウィルスベクターを作製する方法の模式図である。図３はlox Ｐ配列がパッケージングシグナルに隣接する位置において導入されたpBHG10由来のプラスミドの模式図である。図４は、左方及び右方ITR並びにパッケージングシグナルを除きウィルスDNAのほとんどが欠失したpBHG10由来のプラスミドの模式図である。図５は293Cre細胞の同時トランスフェクションにより同時複製式ヘルパー及びヘルパー依存性ウィルスを獲得するための手段の模式図である。図６はpLC２及びpLC３プラスミドの構築の模式図である。図７はCre発現性293及び293N3S細胞系についての形質転換、選別及びスクリーニングプロトコールの模式概要である。図８はCre特異的ウサギ抗血清によるCreの発現についてスクリーニングしたＧ 418耐性クローンのウェスタンブロット分析である。図９は親細胞系についてのルシフェラーゼ発現アッセイの模式図である。図10Ａは形質転換細胞系についてのルシフェラーゼ発現アッセイの結果を示す写真である。図10Ｂは形質転換細胞系についてのルシフェラーゼ発現アッセイの模式図である。図11ＡはAdLC８ヘルパーウィルスの構築の模式図である。図11ＢはAdLC８由来のパッケージングシグナルの切除の効率を示すエチジウムブロミド染色結果を示す写真である。図11ＣはCre−媒介式組換の反応速度を示すサザンブロット分析結果を示す写真である。図12Ａは293Cre１細胞のpRP1001トランスフェクション及び18時間後のトランスフェクション細胞のAdLC３感染の模式図である。図12ＢはAdRP1001からAdLC８−感染293Cre１細胞に至る系列継代による力価上昇を示すグラフである。図13ＡはAdLC８clucによるAdRP1001の高力価に至る増幅の模式図である。図13ＢはAdRP1001からAdLC８cluc−感染234Cre１細胞に至る系列継代による力価上昇を示すグラフである。図14はルシフェラーゼ活性と夾雑ヘルパーウィルスとの関係を示すグラフである。発明の詳細な説明本明細書において参照する文献は全て引用することで本明細書に組入れる。本発明の理解のために、本明細書において用いる全ての技術及び科学用語は、何らかのことわりのない限り、当業者を一般に理解されている意味を有するつもりである。本明細書において採用している技術は、何らかのことわりのない限り、当業者にも公知である。特定のバッファー、培地、試薬、細胞、培養条件についての言及は、限定を意味するのではなく、その論述がなされている特定の背景において当業者により関心のもたられる又は有用と認識されているものに延縁する物質全てを含むものと解されるべきである。例えば、一のバッファー系又は培養培地を別のものと置換することが往々にして可能であり、従って異なりはするものの公知の手段を提唱の方法、材料又は組成物が担いとする用途と同じ目標を達成するのに利用できる。本明細書に用いる語は本発明を制約するつもりはない。例えば、「遺伝子」なる語にはcDNA，RNA又はその他のポリヌクレオチドであって遺伝子産物をコードするものが含まれる。「外来遺伝子」とは、それが発現されるべき生物又は細胞タイプとは異なる生物又は細胞タイプから得られる遺伝子を意味する、これはまた、ゲノムの中のその正常部位から転移したものと同じ生物に由来する遺伝子をも意味する。「核酸」、「RNA」、「DNA」等の語を利用するうえで、我々は特定の段階において利用できうる化学構造に限定するつもりはない。例えば、RNAはDNAに一般的に置換できうることが当業界に公知であり、従って、「DNA」なる語の利用はこの置換を含むものと解すべきである。更に、様々な核酸類似体及び誘導体を作ることができ、そしてそれは互いと並びに DNA及びRNAにハイブリダイズし、そしてかかる類似体及び誘導体の利用も本発明の範囲に属する。遺伝子又は核酸の「発現」は細胞遺伝子発現のみならず、クローニング系及び任意のその他のものにおける核酸の転写及び翻訳も包括する。「リコンビナーゼ」なる層は組換を誘導、媒介又は促進する酵素、並びに核酸配列の転移又は第二核酸配列からのもしくはそれへの第一核酸配列の切除もしくは挿入を及ぼす、媒介するもしくは促進する酵素を包括する。リコンビナーゼの標的部位はリコンビナーゼにより認識する（例えば、特異的に結合する）及び／又は作用する（切除、切断、又は組換を誘導する）配列又は領域である。「遺伝子産物」なる語は核酸によりコードされるタンパク質及びポリペプチドを主として意味するが、更にその他の核酸（例えば非コード及び調節RNA、例えばcRNA，sNRP）によりコードされる核酸を含む。「発現の調節」とは、所定の遺伝子産物の合成、分解、入手性又は活性を高める又は低める現象又は分子を意味する。本発明は本明細書における細胞タイプ及び細胞系の利用に限定されない。様々な組織（胸上皮細胞、結腸、リンパ球等）又は様々な種（ヒト、マウス、等）由来の細胞も本発明において有用である。本発明においては組換核酸の作製及び発現並びにそのコード遺伝子産物の検出が重要である。本明細書に開示の検出方法には、例えばクローニング及び配列決定、オリゴヌクレオチドのライゲーション、ポリメラーゼ連鎖反応及びその変異法の利用（例えば、クーデアザGTPを利用するPCR）、単一ヌクレオチドプライマーがイド式伸長アッセイ、所定のストリンジェンシー条件下で相補性配列に優先的に結合することの示されうる標的依存性オリゴヌクレオチドを利用するハイブリダイゼーション技術、並びにサンドイッチハイブリダイゼーション法を利用する。配列決定はラベル化プライマーもしくはターミネーターを利用して、又は配列決定用ゲルベース法を利用して市販の自動シーケンサーで実施し得る。配列分析は標的DNA又はRNA分子上のすぐ隣りにアニールするオリゴヌクレオチド配列のライゲーションに基づく方法によっても実施される（Wu and Wallace，Genomics４：560-569（1989）；Landren et al.，Science 241：1077-1080（1988）；Nicke rson et al.，Proc ．Natl．Acad．Sci．87：8923-8927（1990）；Barany，F.，P roc ．Natl．Acad．Sci． 88：189-193(1991)）。リガーゼ媒介式共有付加はオリゴヌクレオチドが適正に塩基対合したときのみ起こる。標的増幅のために熱安定性Tagリガーゼを利用するリガーゼ連鎖反応(LCR)は後期発症糖尿病突然変異座を探すのに特に有用である。高い反応温度は高いストリンジェンシーでライゲーション反応が行われることを可能にする（Barany，F.，PCR Methods and Applicat ions １：5-16(1991)）。このハイブリダイゼーション方式はフィルターベース方式で実施し得、それにおいては標的核酸をニトロセルロース又はナイロン膜の上に固定し、そしてオリゴヌクレオチドプローブでブロービングする。任意の公知のハイブリダイゼーション方式、例えばサザンブロット、スロットブロット、「逆」ドットブロット、溶液ハイブリダイゼーション、溶液支持体ベースサンドイッチハイブリダイゼーション、ビーズベース、シリコンベース及びマイクロタイターベースハイブリダイゼーション方式が利用されうる。検出オリゴヌクレオチドプローブは10〜1,000塩基のサイズに範囲する。検出オリゴヌクレオチドプローブを利用する必要たる標的区別を得るため、ハイブリダイゼーション反応は一般に20℃〜60℃、そして最も好ましくは30 〜50℃で行う。当業者を公知の通り、完璧と沈対含二置体との最適区別は温度及び／もしくは塩濃度の操作又はストンジェンシー洗浄液中のホルムアミドの組込みにより得られる。本明細書に記載のクローニング及び発現ベクターは当業界公知の様々な方法のいづれかにより細胞又は組織の中に導入する。かかる方法は例えば引用することで本明細書に組入れるSambrookら、Molecular Cloning：A Laboratory Manual， Cold Spring Harber Laboratory，New York（1992）、及びこれも本明細書に組入れるAusubelらCurrent Protocols in Molecular Biology ，John Wiley and So ns，Baltimore，MD（1989）に記載されている。この方法は、例えば組換ウィルスベクターによる安定式又は一時式トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション及び感染し含む。組換及び非組換コード配列のタンパク質産物は免疫技術を利用して分析し得る。例えば、タンパク質又はそのフラグメントをアジュバントと共に宿主動物に注射し、免疫反応を作製させる。組換フラグメントに結合するイムノグロブリンを抗血清として回収し、そして任意的にアフィニティークロマトグラフィー又はその他の手段により精製する。更に、脾臓細胞は感作マウス宿主から回収し得、そして抗体分泌ハイブリドーマ細胞のバンクを作るためにミエローマ細胞に融合し得る。ハイブリドーマのバンクは組換生産したフラグメントに結合するイムノグロブリンを分泌するクローンのためにスクリーニングできる。より詳しくは、変異ポリペプチドに選択的に結合するか、野生型ポリペプチドにはほとんど又は全く結合しないイムノグロブリンを、野生型タンパク質との事前吸着により、又は変異体には結合するが野生型ポリペプチドには結合しない特異的なイディオタイプについてのハイブリドーマ細胞系のスクリーニングにより選択する。所望の変異ポリペプチドを最終的に発現できる核酸配列が多種多様なポリヌクレオチドから（ゲノム又はcDNA，RNA、合成オリゴヌクレオチド、等）並びに多種多様な技術より形成される。 DNA配列は発現コントロール配列に作用可能式に連結（即ち、その機能を確保するように配置）された後に宿主の中で発現される。これらの発現ベクターは一般にエビソーム又は宿主染色体DNAの必須部分のいづれかとして宿主生物において一般に複製可能である。一般に、発現ベクターは所望のDNA配列により形質転換された細胞の検出及び／又は選択を可能にする選択マーカー（例えば、テトラサイクリン耐性又はヒグロマイシン耐性を基礎とするマーカー）を含む。更なる詳細は米国特許第4,704,362号において見い出せうる。変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、コードされるポリペプチド産物が産生されるようにコード配列の転写（発現配列）及び翻訳を助長する。かかるポリヌクレオチドの構築は当業界公知である。例えば、かかるポリヌクレオチドにはプロモーター、転写終止部位（真核発現宿主におけるポリアデニル化部位）、リボソーム結合部位、及び任意的に真核発現宿主において利用するためのエンハンサー、及び任意的にベクターの複製のために必要な配列を含む。Ｅ．コリ（E．coli）は本発明のDNA配列をクローニングするのに極めて有用な一つの原核宿主である。使用に適するその他の微生物宿主には細菌、例えばバチルス・スブチルス（Bucillus subtilus）、及びその他の腸内細菌、例えばサルモネラ(Salmonella)、セラッチア（serrat ia）及び様々なシュードモナス（Psendomonas）種が含まれる。発現ベクターは宿主細胞に適合性な発現コントロール配列（例えば、複製起点）を一般に含むであろう原核宿主において作られる。更に、数多くの多種多様な公知のプロモーター、例えばラクトースプロモーター系、トリプトファン(Trp)プロモーター系、ベーターラクタマーゼプロモーター系、又はファージラムダ由来のプロモーター系が使用される。これらのプロモーターは任意的にオペレター配列により発現をコントロールし、そして例えば転写及び翻訳を開始及び完了させるためのリボソーム結合部位配列を有する。その他の微生物、例えば酵母が発現のために利用される。サッカロマイセス（ Saccharomyces）が適当な宿主であり、発現コントロール配列、例えば３−ホスホグリセリン酸キナーゼ又はその他の解糖系酵素に関与するプロモーター、及び複製起点、終止配列等を所望により有する。微生物の他に、哺乳動物組織細胞培養物が本発明のポリペプチドの発現及び産生のために利用される。真核細胞が好ましく、その理由はインタクトヒトタンパク質を分泌できる数多くの適当な宿主細胞系が当業界において開発され、そして CHO細胞系、様々なCOS細胞系、HeLa細胞、ミエローヌ細胞系、ジャーカット細胞、等が含まれる。このような細胞のための発現ベクターには発現コントロール配列、例えば複製起点、プロモーター、エンハッカー、及び必須情報プロセシング部位、例えばリボソーム結合部位、RNAスブライス部位、ポリアデニル化部位及び転写ターミネーター配列を含む。好適な発現コントロール配列はイムノグロブリン遺伝子由来のプロモーター、SV40、アデノウイルス、牛パピロマウィルス等である。注目のDNAセグメント（例えば変更ポリペプチドをコードするポリペプチド）を含むベクターを公知の方法により宿主細胞に導入する。それは細胞宿主のタイプに依存して変わる。例えば、塩化カルシウムトランスフェクションは一般に原核細胞に利用され、一方リン酸カルシウム処理又はエレクトロポレーションはその他の細胞宿主のために有用である。この方法は診断に利用するための検査キットの製造に容易に適用される。かかるキットは密接な区画の中に１又は複数個の容器を受容するように区切られた担体を含んで成り、ここで第一容器は適当にラベルされたDNAプローブを含む。その他の容器はラベル化プローブの位置決定において有用な試薬、例えば酵素基質を含む。その他の容器は制限酵素、バッファーを、使用のための仕様書と一緒に含む。本明細書記載の組換Adベクターは従来記述の構築体とは有意に相違する。これらはウィルス遺伝子の全て又はほとんどが欠失したベクターと、このベクターウィルスと共に同時感染において使用したときにベクターの増殖は補完できるがウィルスDNAを感染性ビリオンにパッケージングさせることのできないようにデザインされたヘルパーウィルスとの利用を組合せる。従って、ベクターウィルスは実質的にヘルパーウィルス抜きで調製できうる。ウィルスDNA複製及びウィルスDNAのビリオン粒子に至るパッケージングに関して、このウィルスDNAのうちcisである必要があるのは３つしか知られていない。これらは左方反転末端反復(left inverted terminal repeat)又はITR(bp1〜約10 3)、パッケージングシグナル(約194〜358bp)(Hearing and Shenk，1983，Cell 3 3：695-703；Gradable and Hearing 1992，J．Virol．64：2047-2056)及び右方I TRである。ウィルスゲノムのその他の全ての領域は、ウィルス複製及び感染性ウィルスの産生を可能にするようin tra nで作用するウィルス産物を産生するのにのみ必要とされるようである。即ち、全ての必須ウィルスタンパク質及びRNAがヘルパーウィルスにより供されることができるなら、ウィルスDNA複製及びパッケージングのためにin cisである必要がある上記の配列を除き、ウィルスDNAのほとんどが欠失されたベクターをデザイン及び構築できる。ヘルパー依存性ベクターについての問題は、かかるベクターの調製品がヘルパーウィルスにより常に汚染されることであり、そしてかかるヘルパーをベクターから分解するのは技術的に非常に困難である。本発明の主要な態様において、ヘルパーウィルスはゲノムの左端付近に２個のlox Ｐ部位を存し、一方はウィルスDNAの最左端から約189bpに挿入され、そして第二は第１lox Ｐと平行な方向において、パッケージングシグナルの右側に、即ち、bp358の右側に配置されている（図１に示す）。このウィルスはAd5を通常増殖させる細胞の中で複製できるであろう。しかしながら、Creリコンビナーゼを発現する細胞において、又はCreリコンビナーゼを発現する第二ウィルスの存在下で、ヘルパーウィルスDNAのlox Ｐ部位間での配列の切除はパッケージングシグナルを排除し、そして得られるウィルスDNAは感染性ウィルス粒子へとパッケージングしないであろう。従って、前記ヘルパーと、第二ウィルス、即ちベクターであってウィルス複製のためにin transである必要があるウィルス産物の発現のために通常必要とされるウィルスDNA配列の全て又はほとんどが欠失しているものとしてより同時感染された細胞において、ベクター及びヘルパーウィルスゲノムは共に複製するであろうが、ベクターDNAのみがビリオンにパッケージングされるであろうパッケージングシグナルを保持する（図２）。本発明の一の態様において、ヘルパーウィルスは原出願に記載され、且つ図３及び４に示すものと類似のプラスミドに由来する。これらの実施例において、Ad5ゲノムは環状分子であって細菌プラスミド由来DNA複製起点（「ori」と表示）及び前記分子を担持する細菌にアンピシリンを耐性を授ける細菌抗生物質耐性コード配列（「Ap^r」）を含む分子として存在する。Ad5 ゲノムの前記環状形態をpBG17と表示した本実施例において、領域Ｅ１及びＥ３由来のウィルス配列はウィルスゲノムから欠失しているが、本実施例は限定を意味するつもりはなく、なぜなら原出願に記載の方法によりその他の欠失又は欠失抜きを環状分子の中において同等に操作し得るからである。pBG17と表示する分子はbp19（左ゲノム端）からbp341に至るAd5配列を含み、「ITR」とパッケージングシグナル「Ψ」との間にあり、且つウィルス複製を妨げるものとは知られていないAd5配列におけるほぼ188と189bpとの間に人工操作BamH1制限部位が挿入されている(Bett，A．J.，W．Haddara，L，Prevec及びF．L．Graham，1994，Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 91 ：8802-8806)。pBG17の中に存在するAd5配列はパッケージングシグナルの右方向に伸び、約341bpに至り、その位置にはXba１制限部位があり、それにほぼ3534bpからほぼ27864bpに至るAd5配列、次いでpUC19複製起点及びアンピシリン耐性遺伝子を含む1874bpのDNAを含んで成る配列、そして最後にAd5bp30996〜35934（右ゲノム端）が続く。当業者により容易に採用される技術により、約34bpのよく特定されたDNA配列であるlox Ｐ部位をAd5ゲノムの中にBamHI及びXbaＩ部位隣接「Ψ」にて導入できる。例えば、合成二本鎖オリゴヌクレオチドは、それらがCreにより認識されるlox Ｐ配列を含み、そしてBamHI 又はXbaＩ切断DNAへのライゲーションを可能にする一本鎖伸長体に隣接するように容易にデザイン及び合成されうる。即ち、当業者はnt 188にあるBamHI部位の中にlox Ｐ部位の導入されたpBG17lox 1と表示のプラスミド（図４）、次いでpB G17lox 1の XbaＩ部位に更なるlox Ｐ部位の導入されたpBG17lox2（図３）を容易に獲得できる。プラスミドpGB17は293細胞のトランスフェクションにより感染性ウィルスを作製するのに利用できうる。同等に、プラスミドpBG17lox１又はpBG17lox２は感染性ウィルス（例えば図３に示すAdBG17lox２）を供し、なぜなら271bpまでの挿入体がウィルス複製及びウィルスDNAパッケージングを妨害することなくITRとパッケージングシグナルとの間で操作し得るからである(Hearingら、Journal of V irology Vol 61，p2555，1987)。Cre酵素の存在下で、パッケージングシグナルを含む配列は２個のlox Ｐ部位（図３下）の間の分子内組換の結果として切除され、複製のために必要な全ての配列を保持するが、ビリオンに至るDNAのパッケージングのために必要な配列を欠くウィルスゲノムが供されるであろう。このゲノムは第二ウィルス、即ち図２に示すウィルス複製のために必要なウィルスゲノムの全て又はほとんどを欠くベクターの複製を支持する相補性ウィルスゲノムを担いうる。これらの実施例は限定を意味するものではなく、なぜなら図３のそれとDNA構造において類似の改質ウィルスがその他の手段により作製されうることが明らかであろうからである。例えば、当業者はlox Ｐ部位を図３に示すプラスミドの中のその他の部位、例えばBst B1もしくはPac Ｉ部位に、又は所望するならその他の位置、又はその他のAd配列含有プラスミド、又は所望されうるその他のウィルスゲノムの中に導入できうる。本実施例及びその他の実施例におけるCr eリコンビナーゼの利用は限定を意味するのではなく、なぜなら当業者はその他の酵素であってそれにより認識されるDNA配列間での部位特異的組換を触媒できるものがCreリコンビナーゼの代わりに同等に採用できうることを容易に理解するであろうからである。例えば、限定することなく、Creの代わりとなりうるかかる酵素は、その標的部位と組合せた酵母の「FLP」リコンビナーゼである(O’Gormanら、Science251，1351，1 991)。本発明の別の態様は、本発明のウィルス成分の複製を支持し、Creリコンビナーゼを発現し、そしてCreにより媒介される切除を介してパッケージングシグナルの除去されることのできるヘルパーウィルスを作製するための従来の実施例に記載のプラスミドによりトランスフェクションされうる点で適当と認められうる 293細胞又はその他の細胞の如きヒト細胞を提供する。当業者は、必須の細胞系がプロモーター及びポリアデニル化シグナルを含み、且つ更に例えばＧ418又はヒスチジノールに対する耐性の如きをコードする選択遺伝子を含む適当な調節配列のコントロール下でCreをコードする配列を含んで成るプラスミドによる293細胞又はその他の細胞をトランスフェクションすることにより作製できうることを理解するであろう。当業者は、識別のために用いる薬剤耐性遺伝子に加えてCre リコンビナーゼを発現するであろう薬剤耐性細胞を容易に得ることができうる。本発明の別の態様において、左方ITR、パッケージングシグナル及び右方ITRを含んで成る配列より成り、そして任意的に追加のウィルス配列を含むプラスミドが容易に得られうる。例えば、限定するつもりはないが、図４に例示されている。本実施例において、pBG17lox１DNAをXbaＩ及びSmaＩ制限酵素で消化し、それは図示する部位においてウィルスDNAを切断し、更にウィルスDNAのその他の部位を切断する。ウィルス末端の連結部（図４においてはち合わせ矢印で表示）並びにlox Ｐ部位及びパッケージングシグナルを含むフラグメントを精製でき、そしてpUC18又はpUC19の如き適当なクローニングプラスミドのポリクローニング部位に挿入してpPAD１と表示するプラスミドを作製できる。例示の実施例において、 pPAD １はpUCとAd5DNAとの連結部に存在する残りの制限酵素クローニング部位の一つにおいてサイズ約30kbまでの外来DNAの挿入のためのベクターを担うことができ、pADHDV１の如きプラスミドであってpADHDV１の開環セグメントが任意の起源及び配列組成の外来DNAであるプラスミドが作製される。プラスミドpADHDV１はウィルスDNA複製のため及びビリオンに至るウィルスDNAのパッケージングのために in cisである必要があるAd5配列の全てを含む。in transである必要があるウィルス機能がヘルパーウィルスにより供され、従ってpADHDV１は、ウィルスゲノムの左端及び右端由来のウィルスDNA配列が隣接している30kbまでの外来DNAを含むであろうヘルパー依存性ウィルスDNA分子として複製する能力を有するであろう。pADHDV１の中に挿入された外来DNAの一部として、その他の配列の他に容易に検出可能なリポーター遺伝子の発現を供することのできるDNA配列を含ませることが好都合であり得、このリポーター遺伝子はpADHDV１に由来するウィルスADHD V１により感染された細胞又は細胞群を同定する簡単な手段を供する。限定を意味しない実施例として、当業者はpADHDV１の中に、細菌性β−ガラクトシダーゼであって、その発現が細胞のＸ−galに対する曝露により容易に検出可能な酵素をコードする配列を含ませてよい。更に、図４に示すように、pPAD１及びpADHDV １はAd5nt189において単一のlox Ｐ部位を含み、それはpGB17 lox １＆２におけるlox Ｐ挿入体のいづれかと同じ部位である。本例は限定を意味しないが、pPAD １，pADHDV１及び誘導体におけるこの位置でのlox Ｐ部位の配置は、図２及び５に示すように２つのウィルスの同時複製中のヘルパーウィルスとベクターとの組換の効率を引き下げるのを担いうる。本発明の別の態様において、pBG17 lox 2の如きプラスミド由来の配列を含んで成るヘルパーウィルス及びpADHDV１の如きプラスミド由来の配列を含んで成るヘルパー依存性ウィルスは複製ウィルスゲノムを作製するように前記プラスミドによる細胞の同時トランスフェクションにより達成し得る。限定を意味するつもりのない図５に示す本例において、Creリコンビナーゼの存在下で、AdBG17 lox２又はlox Ｐ部位で囲まれた配列の切除によりAdBG17 Ψ−へと変換されうる。ウィルスAdBG17Ψ−は、パッケージングシグナルの除去により、そのゲノムをビリオンへとパッケージングすることはできないが、その DNAを複製することができ、そしてウィルス複製のためにin transである必要があるウィルス機能を供し、それ故ヘルパー依存性ウィルスAdHDV１の複製のための相補性機能を供することができるであろう。AdHDV１はパッケージングシグナルを保持するため、このヘルパー依存性ウィルスのDNAはビリオンへとパッケージングされるであろう。このヘルパー依存性ウィルスAdHDV１は回収し得、そして任意的にCsCl勾配におけるイソピクニック遠心により精製及び濃縮し得、夾雑ヘルパーウィルスを実質的に含まない又は全体的に含まないヘルパー依存性ウィルス調製品が製造される。本発明の別の態様において、293細胞又はその他のヒト細胞であってCreを発現しないものは図３及び５においてpBG17 lox ２と表示されているものの如きプラスミドでトランスフェクションしてAdBG17 lox２と表示されているようなウィルスを製造できる。前記ウィルスはlox Ｐにより囲まれた配列の切除を受けることなく前記細胞の中で複製し得、それ故容易に増殖し得る。293Cre又は同等の細胞のAdBG17 lox２及びAdHDV１による同時感染はAdHDV１の増殖を補完するであろう AdBG17Ψ−の形成をもたらし、双方のウィルスゲノムの同時複製はもたらすが、ウィルス粒子へのAdHDV１ DNAのみのパッケージングが供される。実施例１．リコンビナーゼCreを発現する細胞系の製造及び特性決起プラスミドpLC２を、pCA14のXbaＩ/SalＩ部位の中にpSP13Creの1.6kbのXbaSa Ｉ/SalＩフラグメントをクローニングし、Cre遺伝子をHCMVプロモーターのコントロール下に置き、そしてSV40ポリアデニル化シグナル(pA)を遺伝子の３′末端に加えることにより作った。pSP13CreのXbaＩ/SalＩセグメントはSV40 pAを含むため、このクローニング工程はCreの３′側に２個のポリアデニルシグナルを供した。次いでpLC2の2.2kbのBalIIフラグメントをpPBdx４のBamHI部位の中にクローニングした。得られるプラスミドpLC３はSV40プロモーターのコントロール下でCre発現カセットとネオマイシン耐性遺伝子とを含む。図６はpLC２及びpLC３プラスミドの構築を示す。プラスミドpLC２及びpLC３の構造は制限分析を介して確認した。 293及び293N3S細胞をml当り100Ｕのペニシリン、ml当り100μｇのストレプトマイシン、2.５μｇ／mlのフンギゾン及び10％の胎児牛血清を感染用の５％の馬血清の維持のために添加してあるＦ11培地の中に維持した。細胞をリン酸カルシウム技術を利用してpLC２で形質転換した(McKinnon，R．D.，and F．R．Graham ，Microinjection and Organelle Transplantation Techniques 199-214(1986)) 。次いで細胞を形質転換の３日後に開始する完全Ｆ11中の400μｇ／mlのＧ418による選別にかけた。形質転換の４週間後、Ｇ418耐性コロニーをクローニングし、そして増殖させた。図７はCre発現性細胞系の形質転換、選別及びスクリーニングプロトコールをまとめる。細胞培養培地、及びフンギゾンを除く試薬はGibc o BRL(Burlington，Ontario，Canada)より購入した。フンギゾンはBristol-Myer s Squibb Canada(Montreal，Qyebec，Canada)より購入した。クローンをまずCre特異的ウサギ抗血清によるウェスタンブロット分析によりC reの発現についてスクリーニングした。単離された77個のＧ418耐性クローンのうち、７個の293クローン及び17個の293N3Sクローンが系間で異なるレベルにおいて適正サイズ(38KD)のCreタンパク質を発現した。10の代表的な系を図８に示す。系293Cre１〜６（レーン２〜７）並びに293N3S Cre７及び８（レーン９〜10 ）は高レベルのCreタンパク質を発現し（AdCre１感染細胞中のレベルと比較；Ad Cre１はＥ１欠失ベクター中のHCMVプロモーターのコントロール下のCre遺伝子を含む）、一方Creは親239及び293N3S細胞系においても（レーン１及び８）、又は 293N3S Cre９及び10（レーン11〜12）においても検出されなかった。少量のCre が後者の２つの細胞系において、それらのクローンを最初に単離したときには検出されたが、その後のアッセイでは発現は検出されなかった。ウェスタンブロットによるCre発現に関して陽性と評価された細胞系を次にCre 感受性分子スイッチのコントロール下のリポーター遺伝子発現Adベクターを利用して機能性リコンビナーゼ活性についてアッセイした(Anton，M．and F．L．Gra ham，J ．Virol，69：4600-4606(1995))。293Cre及び293N3S Cre細胞系をAdd 170 -3又はAdCre１との組合せでこのベクターにより、各ベクターについて細胞当り1 0PFUのMOIで感染せしめ、内生発現CreリコンビナーゼとAdCre１により産生されるものとの活性レベルを比較した。ウェスタンブロット分析によりCre発現について陽性と検査されたクローンを次にCre誘導性ウィルスAdMA19，AdMA23及びAdMA35を利用してCreリコンビナーゼ活性についてスクリーニングした。293Cre及び293N3S Cre細胞系をAdd 170-3又はAdCre１と組合せたこのベクターにより、各ベクターについて細胞当り10PFUのMOIにおいて感染せしめ、内生発現CreリコンビナーゼとAdCre１により産生されるものとの活性レベルを比較した。AdMA23を利用する一次スクリーニングは、Creリコンビナーゼの任意の外生起源の非存在下での特異的Cre-lox組換の媒介及びAdMA23由来のβ−ガラクトシダーゼ活性の発現をAdMA23及びAdCre１による複合感染を経て得られるレベルの50％以上において可能である６個の293Cre細胞系及び４個の239N3S Cre系を同定した。ルシフェラーゼ、対、β−ガラクトシダーゼアッセイの一層の高感度且つ広域性を理由に、「スペーサー」DNA配列のCre媒介式切除を経てルシフェラーゼを発現するベクターAdMA19を利用してこれらの系の一層詳細な特性決定を実施した。親293及び293N3S細胞系はCre発現の非存在下でのAdMA19由来のルシフェラーゼ発現レベルの陰性コントロールを担い、そして陽性コントロールとしてはAdMA19及びAdCre１による同時感染を利用し、なぜならかかる複合感染がHCMVプロモーターとルシフェラーゼcDNAとの間でのスペーサーの効率的な切除を供し、且つ高レベルのルシフェラーゼ発現を誘導することが事前に実証されているからである。 β−ガラクトシダーゼアッセイにおけるように、形質転換系におけるCreの内生発現のための機能性アッセイにおいてAdd 170-3をAdCre１に置換して、感染性 Ad5の総量を定常レベルに保持した。事前スクリーニングにおいて陽性と評価された親細胞及び10の形質転換系に関する典型的な分析の結果を図９に示す。AdMA 19及びAdd170-3による感染後、形質転換系のほとんどがAdMA19及びAdCre１により二重感染した親239又は293M3S細胞において認められるものと同等レベルの効率性でルシフェラーゼを発現し、一方偽似感染系、又はAdMA19及びAdd 170-3で二重感染した親細胞系はバックグランドレベル以上にルシフェラーゼを発現しなかった。更に、AdMA19及びAdCre１による系293Cre１−６及び293N3S Cre７−８の感染は、AdMA19及びAdd 170-3による感染により誘導したものを超えてルシフェラーゼの量を有意に高めず、系10 8における内生発現CreのレベルがAdCre１感染293細胞において産生されたレベルと類似するということを示すウェスタンブロット分析の結果と一致する。他方、 293N3S Cre９及び10は最初はAdMA19及びAdd 170-3による感染を経て低レベルでのみルシフェラーゼを発現し、そしてAdd 170-3をAdCre１に置き換えると有意に高いレベル（それぞれ５倍及び12倍高い）を発現した。現状、これらの系はもはやAdCre１感染抜きではCre応答性ベクターを誘導することができない。これは、このような系におけるCre発現の欠如を示唆する本ウェスタンブロット分析（図８、レーン11〜12）と一致する。系293N3S Cre９及び 293N3S Cre 10は当初は機能性発現カセットを含み、それは細胞の継続継代により失われた。実施例２．Cre細胞系の安定性Ｇ418を含む又は含まない培地の中での多重継代を経たCre細胞系の安定性を決定した。293Cre１，293Cre３及び293Cre４、並びに293 Ｎ３ＳCre８由来のDNAをＧ418選択の有無で９回以上の継代を経て単離した。消化のため、pLC３内を切断しないEcoR１を、Cre遺伝子のコピー数の変化が容易に検出できるように選定した。ジゴキシゲニン−dUTPラベル化プローブをpSP13Creの1.6kbのXbaＩ/SalＩフラグメントを用いて作製し、そしてEcoR１限処理染色体DNAにハイブリダイゼーションした。プローブは293Cre１の約9.5kbのフラグメント及び293N3S Cre８の1 5kbのフラグメントにハイブリダイズし、Cre配列がこのような系のゲノムDNAの中に存在していることを示唆して（図10Ａ）。このプローブは293Cre１における約18kbにおいて非常に薄いバンドも検出せしめ、それはCre遺伝子のサブフラグメントの挿入又は不完全に消化したDNAのいづれかを示しうる。pLC内のCreの外側の部位を一箇所、そして隣接調節配列を切断するHindIII制限DNAのサザンブロット分析は、 Cre配列が293Cre１中で単一コピーにて存在し、且つ293NS Cre８において約３コピー存在することを示唆した。293Cre１の9.5kbのEcoRIフラグメント及び293N3S Cre８の15kbのフラグメントの双方共９回の継代に関してＧ418抜きで細胞の中でそのまま維持され、293Cre１についてのDNAは18回の継代後もCre配列を保持していた。Creプローブは293Cre３において23kb及び５kb上にて強いバンドを、そしてＧ318選別下で維持した293Cre４細胞のDNA由来の12.5，9.8及び6.6kbの強いバンドを検出せしめ、Cre配列がこれらの系の中に２及び３コピーでそれぞれ存在していることを示す（図10Ａ）。これらの結果はHindIII制限DNAに対するプローブのハイブリダイゼーションを確認した。293Cre３細胞において20，18及び15 kbにて検出された薄いバンドは部分的に制限処理されたDNAを示しうる。細胞をＧ418抜きで９回継代すると、293Cre３の６kbのフラグメント及び293Cre４の6.6 kbのフラグメントはもはや検出されず、このような細胞系中の対応のCreインサートが失われていることを示唆する。293Cre３及び294Cre４内の残留Cre特異的フラグメントは安定であることが認められた。系293Cre１，３及び４、並びに29 3N3S Cre８のプレート効率のアッセイは全て、細胞が選択的又は非選択的培地の中で維持されたか否かに関係なく、Ｇ418耐性が全ての系に関して安定な表現型であることを示唆した。Ｇ418選別の有無で増殖させたいくつかの293Cre系も機能性Cre活性について試験した。細胞を新規ガラクトシダーゼ発現ベクター AdMA35により、Add 170-3又はAdCre１と組合せて、前述の通り各ウィルスに関して細胞当り10pfuのMDIにおいて感染させた。細胞を感染後24時間にて回収し、そしてβ−ガラクトシダーゼレベルを決定した。図10Ｂに示す結果は、AdMA35からのβ−ガラクトシダーゼの発現を誘導する能力は一般にＧ418選別抜きで10回以上の継代を経てもそのままですることを示唆する。系293Cre１及び293N3S Cre８におけるCreの機能活性はサザンブロット分析におけるCreの安定存在と一致した。Cre配列はこれらの系の中に安定的に組込まれた。サザンブロットにより検出される系293Cre３における２種のCre特異的インサートの一方の損失は（図10Ａ）、Cre誘導性リポーター遺伝子によるアッセイによる決定に従い（図10Ｂ）このような細胞のCre機能の若干の低下と一致し得、一方293Cre４における一のCre 特異的バンドの損失は機能性Creのレベルに対して何らの作用がないと考えられる。この細胞系の中に導入された全てのlox Ｐ部位に結合するのに十分なCreが安定インサートから発現されることが可能である。他方、不安定なインサートは任意の機能性リコンビナーゼ発現しないことがあり、そして293Cre４細胞中のCr e発現レベルはそのままでありうる。実施例３．AdLC８及びAdLC8cヘルパーウィルスの構築プラスミドを標準のプロトコールに従って構築した（Sambrookら、1989）。Ad LC８（図11Ａ）ヘルパーウィルスを「フロックス」(floxed)パッケージングシグナル（Ψ）を有するpLC８及びpBHG10による293細胞の同時感染により救済（resc ue）した。Adパッケージングシグナル及びITRを含むアデノウィルスゲノムの大半を含むプラスミドpBG18(Bett and Graham未公開)から9.6kbのAscＩフラグメントを除去し、PLC４を作った。BumHI適合性末端を有する合成lox Ｐ部位を２本の一本鎖オリゴヌクレオチド：５′−GAT CCA ATA ACT TCG TAT AGC ATA CAT TAT ACG AAG TTA TAA GTA CTG AA T TCG-３′及び５′−GAT CCG AAT TCA GTA CTT ATA ACT TCG TAT AAT GTA TGC TAT ACG AAG TTA TTG−３′ をアニーリングすることにより得た。lox Ｐ部位を、Ad5ゲノムの左端からnt188 に位置する pLC４の固有BamHI部位にクローニングし、pLC５を作製した。この領域はウィルス複製に影響を及ぼすことなくDNAの類似の挿入を寛容することが予め示されている（Bautistaら1991）。第二lox Ｐ部位をpLC５の中に、まずlox ＰオリゴヌクレオチドをpABS．９のBamHI部位に導入してpLC７を作り、そしてl ox Ｐ部位及びneo細菌発現カセットを含む1.4kbのXbzＩフラグメントをpLC５の固有XbaＩ部位にサブクローニングすることにより挿入した。即ち、得られるプラスミドpLC８は1452bpで隔てられ、且つアデノウィルスパッケージングシグナル及びneoカセットに隣接する２個のlox Ｐ部位を含む。AdLC8clucヘルパーウィルスはAdLC８に類似するが、Ｅ１のneo発現カセットを欠き、そしてヒトサイトメガロウィルス（HCMV）主要即時−早期プロモーター（転写開始部位に対して− 299〜＋72bp）の調節下にあるホタルルシフェラーゼ遺伝子及びＥ３欠失領域の中に挿入されたサルウィルス40ポリアデニル化シグナル（pA）を含む。AdLC8clu cをpLC8C及びpUMA7Lによる293細胞の同時感染により救済した。pLC8cはSwaＩによる消化によりneoカセットが除去され、次いで再環化にかけられたpLC８の誘導体である。pUMA7Lはホタルルシフェラーゼ遺伝子をHCMV即時−早期プロモーター及びSV40pAの調節下で含むpBHG10の誘導体である（DeWetら、1987）。HCMV−ルシフェラーゼ発現カセットを含む2.2kbのBglIIフラグメントをpCA18（Addison a nd Graham未公開）から除去し、そしてpABS.10（Bett 1995）の固有BamHI部位にライゲーションしてpABS101ucrを作った。次いでpABS. 101ucrをPvuＩで部分消化してプラスミドを線形化し、そしてpBHG10のPacＩ部位に挿入し、pUMA7Lを作った。実施例４．ヘルパー依存性ベクターの構築Ｅ．コリβガラクトシダーゼ(lacＺ)オープンリーディングフレームをマウスサイトメガロウィルス（MCMV）即時−早期プロモーターのコントロールＦで含む pCA35をSaLIで消化し、DNAポリメラーゼのクレノウフラグメントで修復し、そして再環化し、pCA35KSを作った。MCMV−lacＺ発現カセットをXbaI／BamHIによる消化によりpCA35KSから切り出し、そしてXbaI／BamHI消化pABS．４に挿入し、 pABS.4MlacZを作った。次いでこのプラスミドをSalＩで線形にし、そしてAd5ゲノムの16.1と83.6マップ単位との間で配列の欠失したpFG140（Graham）の誘導体 pFG140dx3の固有XhoＩ部にライゲーションし、pUMA10Rを作った。pUMA10R由来の 1276kb SwaＩフラグメントを除去し、そしてバクテリオファージラムダDNA(慣用のラムダマップの31617〜39888bp)由来の8270bpのSmaＩフラグメントと交換し、 pRP1001を作った。実施例５．AdLC８からのパッケージングシグナルの切除の効率 293Cre１細胞系におけるCreリコンビナーゼによる切除の速度及び効率、並びにΨウィルスDNAの複製能力 293Cre１細胞、及びコントロールとしての293細胞を細胞当り10PFUのMOIにてA dLC８により感染せしめた。DNAを様々な感染経過時において精製し、PvuＩで消化し、0.8％のアガロースゲル上で分離し、そしてその産物をエチジウムブロミド染色により調べた。図11Ｂはlox Ｐ隣接フラグメントの切除が、親ウィルスAdLC８の左端を双方が構成する293Cre１細胞における1.1kbバンドの完全排除及び3.5kbバンドのほぼ完全な消失により示される通り、ほぼ完全であることを実証する。その代わり、その後12hrでは3.2kbのバンドが検出可能であり、それはフロックスカセットの切除により作られたウィルスバンドを示す。1.5kbの切除産物はアガロースチル上では検出できず、なぜならそれはDNA合成のための起源の欠如により複製されないまま残るからである。更に、図11Ｂは293Cre１系における組換ウィルス（AdLC８Ψ）が293細胞上の親A dLC８ウィルスと同様に複製することを示す。 Cre媒介式組換の速度を更に調べるためにサザンブロット分析を実施した。図1 1Ｂに示すアガロースゲルをナイロン膜に転写し、そして pLC８由来の部分精製4 .4kb BstXI-BgL IIラベル化フラグメントでプロービングした。このプローブはA dLC８の3489及び1123bpのフラグメント、並びに組換ウィルスの1452bp（切除環を占める）及び3160bpフラグメントとハイブリダイズした（図11Ｃ）。更に、このプローブは両ウィルスの右端を占めて9777bpフラグメントとハイブリダイズした。約4.6、2.2及び1.7kbの追加のバンドがこのプローブとpLC８の5.3kbのBstXI フラグメントとの夾雑により検出された。オートラジオグラフィーの際の膜の過剰曝露は、293Cre１系における感染後６時間までは組換産物が検出できないことを示した。このことは、ウィルスの最左端が感染後早期の間はCreがアクセスできず、それはたとえCreが293Cre１細胞系により構成的に作られ、且つ感染時に存在する場合もそうである。より短い曝露時間を利用するその後の分析は、感染後12hrで、約80％のウィルスDNAが組換し、そしてこの割合がその後上昇しないことを示す。1.5kbバンドである切除環は一層高感度なサザンブロット技術によりその９hr後に検出され、そして複製していないようであった。AdLC８による29 3細胞の感染後組換産物(3.2kb及び1.5kbバンド)は検出されず、感染293Cre１細胞において認められる組換産物がCre−特異的現象に由来することを示唆する。非組換ウィルス２DNAの量が全 DNAのそれと似た速度で経時的に上昇するため、このことはウィルスが細胞に入って複製したことを示し、そして細胞に感染しなかった残留ウィルスに原因しないものと考えた。我々はなぜこのようなウィルスゲノムがCre−媒介式組換を回避するかの理由はわからないが、それは293細胞系の中のCreタンパク質の飽和を反映しうる。にもかかわらず、このことはパッケージングシグナルが293Cre１細胞系の中のADLC８ウィルスの大半から効率的に切除され、そしてこの配列の除去がウィルスDNA複製に影響しないことを示す。実施例６．AdLC8及びAdLC8clucによるAdRP1001の増幅。 293細胞の半集密単層（60mm）をリン酸カルシウム沈殿（Graham and van der Eb 1973）により37℃にて４hr５μｇのpRP1001でトランスフェクションし、そのトランスフェクション細胞をAdLC８又はAdLC8clucにより10の感染多重度（MOI）にて感染せしめ、培地を交換し、そしてその細胞を単層が完全なCPEを示すまでインキュベーションした（48〜72時間）。細胞を培地の中にかき落とし、そしてウィルスを３回の凍結融解により遊離させた。得られる粗ウィルスリゼートのアリコート（500μｌ）を293Cre１又は293Cre４細胞の60mmの皿の上で系列継代した。ヘルパー依存性ベクターの各増幅ラウンドの間、293Cre細胞をAdLC8又はADL C8clucにより、最初の２ラウンドの増幅に関しては５のMOI、そしてその後の継代については１のMOIで同時感染せしめた。AdRP1001の増幅は293細胞上のlacZ− 発現性ウィルスの存在(青色形成単位、BFU)について各継代の後に担ウィルスリゼートのアリコートをアッセイすることによりモニターした。293単層をウィルス播種物（500μｌ）で30分感染し、そしてその感染単層を37℃で24時間インキュベーションした。感染単層をPBS²⁺で１回洗い、0.2％のグルタルアルデヒド、２％のパラホルムアルデヒド、２mMのMgCl₂0.5mlで37℃にて５分固定し、洗い、そしてＸ−gal（PBS中の５mMのK₄Fe(CN)₆,５mMのK₃Fe(CN)_6,２mMのMg Cl₂，１mg／mlの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド〔Ｘ−gal〕）で染色した。プレートを室温で一夜インキュベーションし、そして目視検査によりBFUの数を決定した。ウィルスリゼートをヘルパーウィルス及びRCAの存在について293リゼート上でのプラークアッセイによってもモニターし、またヘルパーウィルス及びRCAの存在について293及びＡ549単層上でのプラークアッセイによってもそれぞれモニターした。パッケージング可能な線形ゲノムに至るPRP1001のAdLC8−媒介式変換の頻度は約800BFU／１μｇのトランスフェクション化DNAであった。 293Cre１細胞を、アデノウィルス配列のほとんどが欠失しているプラスミドpR P1001（図12Ａ）でトランスフェクションせしめ、次いで18時間後にそのトランスフェクション細胞をAdLC8ヘルパーウィルスで感染させた。AdRP1001〜AdLC8感染化293Cre１細胞の系列継代の継代毎のヘルパー依存性ベクターの力価の上昇をもたらした（図12Ｂ）。５回の系列継代後、AdRP1001の力価は約10⁸BFU／mlとなった。パッケージングシグナルの切除及びRCAの形成を回避したAdLC8の量を293 及びＡ549細胞系上でのプラークアッセイによりそれぞれモニターした。各継代後に存在するAdLC8のレベルは５×10⁵PFU／mlにおいて比較的一定であり続け（図12Ｂ）、そしてサザンブロット分析の際に観察される非組換AdLC8DNAの相対量に匹敵した（図11Ｃ）。RCAは293Cre１を介する２回目の増幅を経て検出され、そしてRCA力価はその後の継代により上昇し続けた。従って、RCAをいくつかのプラーク単離体のDNA含量の分析により決定した。塩化セシウム精製ウィルス由来のDNAの制限酵素分析は、最終ウィルス調製品が３種のウィルス集団、AdRP1001 ，AdLC８及びＥ３ −欠失RCAの存在に位置する制限パターンを含むことを示した。 AdLC８について概略したのと同じ増幅戦略を利用し、AdRP1001ベクターをAdLC 8clucにより高力価にまで増幅させた（図13Ａ）。パッケージング可能な線形ゲノムに至るpRP1001のAdLC8cluc−媒介式変換の頻度はAdLC8のそれと類似であった(AdLC8cluc感染293細胞中のトランスフェクション化DNA １μｇ当り約1400BFU )。AdRP1001からAdLC8cluc感染234Cre１細胞に至る系列継代は、１継代当り約10 倍のAdRP1001の力価の上昇を供した。類似の増幅速度がその他のベクターについて観察され、27.7kbから33.6kbのサイズに範囲した。更に、ストック中に存在するAdLC8clucの量は低くあり続け、そして７回の継代にわたり、全ウィルスの１％未満を占めていた。最後に、RCAは検出されなかった。図13Ｂに示すデーターはAdLC8clucがAdRP1001の高力価ストックを産生するためのヘルパーウィルスとして採用し得ることを明確に示した。実施例７．AdRP1001の大量スケールウィルス調製。 AdRP1001の大量スケールウィルス調製は293Creの150mmの皿を、２×10⁷PFUのヘルパーウィルスを添加した150mmの皿当り１mlの粗AdRP1001ストック（MOI＝〜１）で感染させることにより実施した。CPE完了後、AdRP1001の精製を前述の通りCsCl乳遊密度遠心分離により実施した。遠心後、画分をウィルスバンドを介して回収し、そしてルシフェラーゼ発現性ウィルスの存在についてアッセイした。各画分を１：1000に希釈し、アリコート（500μｌ）を293単層の感染のために用いた。感染の24時間後、粗タンパク質抽出物を感染細胞から調製し、そして市販のキット(Promega)及びBertholdモデルLB9501ルミノメーターを用いてルシフェラーゼ活性についてアッセイした。ルシフェラーゼ活性(Ｒ²＝0.963)はAdLC8clu cの相対力価とよく相関し、ルシフェラーゼ活性が夾雑ヘルパーウィルスのレベルの良好な指標であることを示唆する。図14に示す関係を利用し、１PFU AdLC 8clucは10⁶個の感染細胞当りにつき〜2.6×10⁵pgのルシフェラーゼに相当する。 AdRP1001及びヘルパーウィルス力価物もCsCl遠心分離の後に低密度バンドから単離した。我々は293Cre細胞の20-150mm皿から8.6×10⁹のBFU／ml又は総収量6.5 ×10⁹個のAdRP1001ビリオンを得た。このストック中のAdRP1001、対、AdLC8cluc の比は〜１：16,000、又は精製において用いた粗ストックよりも30倍のAdRP1001 の純度の増大であった。これを、「精製」ベクターの主要成分がヘルパーウィルスであり、ベクターよりもヘルパーウィルスが100〜1000倍多い先に開発したヘルパー依存性系と比べた（Mitaniら、1995，Fischerら、1996）。更に、ほぼ10¹ ⁰ ビリオンの我々の収量はこのようなその他の系を利用して得られるものよりも約1000倍多かった。更に、このような系におけるベクターは高頻度においてDNA 組換し、モノマー、ダイマー、及び一層複雑なDNA構造より成るベクターの異種集団を作製する。他方、精製AdRP1001の制限分析は、ベクターのDNA構造が受動ベクター及び所期トランスフェクション用プラスミドpRP1001の配列から推定される制限地図と同一であることを示した（図４Ｂ）。我々は上記のヘルパー依存性系が非常に少量のヘルパーウィルスを含む高力価ベクター調製品を製造可能であると考えた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者グラハム，フランクエル. カナダ国，オンタリオエル８ピー２シー４，ハミルトン，アメリアストリート 34 (72)発明者アントン，マルティナカナダ国，オンタリオエル８エス１エー９，ハミルトン，メインストリートウエスト 1001 (72)発明者ルドニッキ，マイケルエー. カナダ国，オンタリオエル９エイチ４イー８，ダンガス，シャーウッドライズ 14

Claims

【特許請求の範囲】１．外来遺伝子を発現するための組換アデノウィルスベクター系であって：（ａ）リコンビナーゼにより認識される標的部位がウィルスのパッケージングシグナルの両側に隣接する改質早期領域１（Ｅ１）を有する第一アデノウィルスベクター、並びに（ｂ）前記１．（ａ）のウィルスの複製を変換でき、且つlox Ｐ部位の間での部位特異的組換を触媒できる組換Creを更に発現する細胞系、並びに（ｃ）（ｉ）ウィルスゲノムの約35,000bpまでの大型領域の欠失を有するが、ウィルスDNAの複製のため及びウィルス核酸のビリオンに至るパッケージングのためにin cisである必要のあるAdウィルス配列、即ち、左方及び右方ITR並びにパッケージング配列は保持し、且つ（ii）サイズ約35,000bpの外来核酸の１又は複数のフラグメントを有する、第二ベクター、を含んで成る組換アデノウィルスベクター系。２．前記リコンビナーゼがCreであり、そして前記標的部位がlox Ｐである、請求項１記載の組換アデノウィルスベクター系。３．請求項１の（ａ）に記載のベクター（ヘルパーウィルス）を作製するために利用するプラスミドであって、改質環状アデノウィルスゲノムを含んで成り、ここで前記ウィルスゲノムの領域Ｅ３由来の配列は（ａ）リコンビナーゼのための標的部位により囲まれたウィルスゲノム由来のパッケージングシグナル、（ｂ）細菌性複製起点、及び（ｃ）抗生物質耐性遺伝子、により置換されている、前記プラスミド。４．前記リコンビナーゼがCreであり、前記標的部位がlox Ｐであり、そして前記抗生物質がアンピシリンである、請求項３記載のプラスミド。５．請求項１の（ｃ）に記載のベクター（ヘルパー依存性ウィルス）を作製するために利用するプラスミドであって、ウィルスゲノムの左方及び右方ITR並びにパッケージングシグナル、プラスミド複製起点及び抗生物質耐性遺伝子、並びに長さ35,000bpまでの外来核酸を含んで成る前記プラスミド。６．前記抗生物質がアンピシリンである、請求項５記載のプラスミド。７．その核酸をビリオンへとパッケージングすることができず、またウィルス遺伝子の全て又はほとんどが欠失され、且つ外来核酸で置換されている第二ヘルパー依存性ベクターの複製を補完するようin trasで作用できるウィルス機能を保持するようなヘルパーウィルスゲノムを製造する方法であって：アデノウィルスベクターの複製を支持する細胞系を、（ａ）Creリコンビナーゼにより認識されるlox Ｐ部位がウィルスのパッケージングシグナルの両側に隣接するようにして改質早期領域１（Ｅ１）を有する第一ベクター及び（ｂ）（ｉ）ウィルスゲノムの約35,000bpまでの大型領域の欠失を有するが、ウィルスDNAの精製のため及びウィルス核酸のビリオンに至るパッケージングのために又はcisである必要のあるAdウィルス配列、即ち、左方及び右方ITR並びにパッケージング配列は保持している第二ベクター、により同時感染せしめ、前記細胞の中で発現されたCreリコンビナーゼが前記第一ベクターのパッケージングシグナルに隣接するlox Ｐ部位に作用して前記パッケージングシグナルの切除を誘導せしめることを含んで成る方法。