JPH11506335A

JPH11506335A - トランスフェリン受容体遺伝子

Info

Publication number: JPH11506335A
Application number: JP9500057A
Authority: JP
Inventors: エム．ルーズモア、シーナ; イー．ハークネス、ロビン; ビー．シュライヴァーズ、アンソニー; チョン、ペレ; グレイ−オーエン、スコット; ヤン、ヤン−ピン; ディー．マーディン、アンドリュー; エイチ．クライン、マイケル
Original assignee: コノートラボラトリーズリミテッド
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-07
Publication date: 1999-06-08
Anticipated expiration: 2016-06-07
Also published as: CA2223503C; US20030088086A1; DE69633179D1; BR9608482A; ATE274059T1; WO1996040929A3; WO1996040929A2; DE69633179T2; JP3516688B2; AU716506B2; EP0833920B1; CA2223503A1; US7118749B2; US6361779B1; AU6117796A; EP0833920A2

Abstract

(57)【要約】ヘモフィルス株のトランスフェリン受容体蛋白またはトランスフェリン受容体蛋白の断片もしくは類縁体をコードする精製・単離核酸が提供される。その核酸配列を用いて、診断および医学的治療のためのＴｂｐ１もしくはＴｂｐ２蛋白を通常含む細菌由来の汚染物のないペプチドを得ることができる。その核酸分子はさらに、感染の診断にも使用することができる。さらに、組換えＴｂｐ１またはＴｂｐ２と、それの精製方法が提供される。予防接種用のトランスフェリン受容体蛋白のエピトープを発現する生ベクターが提供される。

Description

【発明の詳細な説明】トランスフェリン受容体遺伝子発明の名称本発明は、トランスフェリン受容体をコードする遺伝子の分子クローニングに関するものであり、詳細には、インフルエンザ菌からのトランスフェリン受容体遺伝子のクローニングに関するものである。発明の背景被包性インフルエンザ菌ｂ型株は、若年小児における細菌性髄膜炎および他の侵襲性感染の主要な原因となっている。しかしながら、非被包性または分類できないインフルエンザ菌（ＮＴＨｉ）が、中耳炎、喉頭蓋炎、肺炎および気管気管支炎などの広範囲のヒト疾患の原因となっている。ジフテリアトキソイド（Berk owitz et al.，1987。本願においては、各種参考文献を括弧内に示して、本発明が関係する最新技術についてより詳細に説明するようにしている。各引例についての完全な文献情報は明細書末尾で請求の範囲の直前にある。それによって、これら参考文献の開示は、本開示に引用によって含まれるものである。）、破傷風トキソイド（Classon et al.，1989および米国特許４４９６３８号）または髄膜炎菌外膜蛋白（Black et al.，1991）に接合したインフルエンザ菌ｂ型莢膜多糖に基づくワクチンが、インフルエンザ菌ｂ型誘発髄膜炎の低減に有効であったが、ＮＴＨｉ誘発疾患には効果はなかった（Bluestone，1982）。中耳炎は若年小児において最も一般的な疾病であり、２歳未満の小児全体の６０〜７０％が１〜３回の耳感染を経験している。慢性中耳炎は、小児における聴覚、言語および認識力の障害の原因となっている。急性中耳炎の患者の約３０％および慢性中耳炎の約６０％の原因が、インフルエンザ菌であるとされる。米国のみで見ると、中耳炎治療の費用は、抗生物質ならびに扁桃摘除術、咽頭扁桃摘出術および鼓膜切開管の挿入などの外科的手術に対して、年間で１０〜２０億ドルとなっている。さらに、中耳炎の原因となる微生物の多くが、抗生物質治療に対して耐性である。そこで、中耳炎に対して有効な予防ワクチンが望まれる。分類できないインフルエンザ菌株は、高齢者および他の呼吸系感染に対して特に感受性の高い者における肺炎の原因ともなっている。そこで、多くの血清型のインフルエンザ菌に対する保護を提供する免疫原性製剤中での成分として有用なインフルエンザ菌からの抗原が必要とされている。鉄は、多くの細菌の成長において必須の栄養素である。インフルエンザ菌、カタル球菌、髄膜炎菌、淋菌および非病原性の共生ナイセリア菌株などのいくつかのヒト病原菌は、鉄源としてヒトトランスフェリンを利用することができる（Sc hryvers，1988; Schryvers and Lee，1989; Mickelsen and Sparling，1981）。細菌トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）は、２つの鎖Ｔｂｐ１およびＴｂｐ２から成る。インフルエンザ菌株では、Ｔｂｐ１の分子量は約１０００００であるのに対して、Ｔｂｐ２の分子量は６００００〜９００００の範囲で変動し、菌株ごとに異なる（Schryvers and Gray-Owen，1992; Holland et al.，1992）。インフルエンザ菌トランスフェリン受容体の発現は、鉄および／またはヘミン調節性であると考えられ（Morton et al.）、ｔｂｐ２の上流で、ｆｕｒ結合部位（Bra un and Hantke，1991）が確認されている。この配列は、髄膜炎菌ＴｆＲ（Legra in et al.，1993）などの鉄による負の調節を受ける遺伝子のプロモータ領域で認められる。そのプロモータの次には、ｔｂｐ２遺伝子およびｔｂｐ１遺伝子が来て、その配置は他のＴｆＲオペロンで認められるものである（Legrain et al. ，1993; Wilton et al.，1993）。トランスフェリン受容体の鉄源への接近を遮断する抗体は、細菌の成長を防止することができる。さらに、オプソニン作用性または殺細菌性であるＴｆＲに対する抗体も、別途の機序によって保護を行うことができる。そこで、トランスフェリン受容体、それの断片、それの構成鎖またはそれから誘導されるペプチドは、インフルエンザ菌疾患に対する予防を行う上でのワクチン候補となる。フロイントアジュバントで髄膜炎菌ＴｆＲ蛋白によって免疫感作されたマウスは、同種攻撃から保護され、抗ＴｆＲ抗血清は受身伝達アッセイにおいて殺細菌性であり、予防効果があった（Danve et al.，1993）。組換え牛肺疫菌Ｔｂｐ２によって免疫感作されたブタは、同種攻撃に対して保護されたが、異種攻撃については保護されなかった（Rossi-Campos et al.，1992 ）。これらのデータは、疾患からの保護におけるＴｆＲに基づくワクチンの効力を示すものである。診断、免疫感作および診断・免疫感作試薬の生成において、トランスフェリンの一部に相当するトランスフェリン受容体およびペプチドをコードするＤＮＡ分子の配列ならびにそのような配列を有するベクターを提供することが望ましいものと考えられる。ポリオウィルスは、ピコルナウイルス科の属であるエンテロウィルスである。そのウィルスには３つの異なる血清型があり、各血清型には複数の株がある。病毒性株は、麻痺性灰白髄炎の病原体である。麻痺性疾患を起こす能力を低下させた弱毒化株および失活させた病毒性株は、ワクチンとして有用である。そのウィルスに感染すると、長期間の保護的な粘膜の免疫が誘発される。不活化ポリオウィルスワクチンの接種によっても、粘膜免疫応答を誘発することができる。ポリオウィルスの構造は公知であり、菌株および血清型間で非常に高い保守性がある。いくつかの他のピコルナウィルス（ピコルナウィルス科の属に属するウィルス）の構造も決定されており、ポリオウィルスの構造と近い関係にあることが明らかになっている。ポリオウィルスのカプシドにおいて異種エピトープを発現することは可能であり（Murdin et al，1992）、その研究は他のピコルナウィルスに拡張されている。これまで発現されたエピトープは通常は、短く、明瞭で近接したエピトープであり、ほとんどが、ポリオウィルス中和抗原性部位Ｉ（ＮＡｇＩ）または他のピコルナウィルスの等価な部位内で発現されたものである。この部位には、ポリオウィルスカプシド蛋白ＶＰ１のβ鎖ＢおよびＣを連結するループ（ＢＣループ）がある。ＶＰ１のＢＣループは、アミノ酸９個の表面露出ループであり、それらのアミノ酸は２５個以上の異種アミノ酸によって置換および延長され得るものである（Murdin et al.，1991）。高力価まで成長し、免疫原性であるトランスフェリン受容体エピトープを発現するハイブリッドまたはキメラのポリオウィルスは、ワクチンとして、さらには免疫原性試薬製造の手段として有用であると考えられる。本発明者らのＷＯ９５／１３３７０では、ヘモフィルス株のトランスフェリン受容体蛋白をコードする精製・単離核酸分子の提供が記載されており、具体的には、インフルエンザ菌ｂ型ＤＬ６３株、ＭｉｎｎＡおよびＥａｇａｎのトランスフェリン受容体遺伝子についての核酸配列と、分類できないインフルエンザ菌株であるＰＡＣＫ１２０８５、ＳＢ１２、ＳＢ２９、ＳＢ３０、ＳＢ３２およびＳＢ３３についての核酸配列、ならびにコードＴｐｂ１およびＴｐｂ２蛋白の誘導アミノ酸配列を提供している。組換えによるものおよび細菌からのものの両方のＴｂｐ１およびＴｂｐ２蛋白の製造について記載されている。ＷＯ９５／１３３７０からのある種の記載および図面を本明細書においても繰り返してある。発明の概要全長のＴｂｐ２蛋白少量を、大腸菌で産生させる。本発明者らは、遺伝子の３ ’末端の切断によってＴｂｐ２の収量を高くできること、ならびにある種のそのような切断によって、菌血症の幼若ラットモデルで動物を保護する能力が保持されることを認めている。本発明は、ヘモフィルス株のトランスフェリン受容体の免疫原性切断類縁体をコードする精製・単離核酸分子を提供することを目的とする。本発明で提供される核酸分子は、ヘモフィルス株の特異的検出、ならびにヘモフィルスによる感染の診断に有用である。ＤＮＡなどの本発明で提供される精製・単離核酸分子は、組換えＤＮＡ手段によって切断ＴｆＲ遺伝子を発現することで、経済的な形で、トランスフェリン受容体蛋白の精製・単離切断類縁体を提供する上でも有用である。トランスフェリン受容体蛋白の切断類縁体、ならびにそれをコードする核酸分子およびそのような核酸分子を有するベクターは、ヘモフィルスによって起こる疾患に対する免疫原性組成物、ヘモフィルスによる感染の診断において、さらには免疫試薬の形成手段として有用である。本発明の態様に従って産生されるトランスフェリン受容体蛋白の切断類縁体に対して形成されたモノクローナル抗体または単一特異的抗血清（抗体）は、ヘモフィルスによる感染の診断、ヘモフィルスの特異的検出（例えば、in vitroおよびin vivoでのアッセイで）およびヘモフィルスによって生じる疾患の治療において有用である。本発明の１態様によれば、ヘモフィルス株、詳細にはインフルエンザ菌株、具体的にはインフルエンザｂ型ＤＬ６３株、ＥａｇａｎもしくはＭｉｎｎＡまたはインフルエンザ菌株ＰＡＫ１２０８５、ＳＢ３３、ＳＢ１２、ＳＢ２９、ＳＢ３０もしくはＳＢ３２などの分類できないインフルエンザ菌株のトランスフェリン受容体蛋白の免疫原性切断類縁体をコードする精製・単離核酸分子、あるいは該トランスフェリン受容体蛋白の断片もしくは類縁体が提供される。本発明の好ましい１実施態様において、核酸分子は、Ｃ末端から切断されたトランスフェリン受容体蛋白の切断類縁体、特にはヘモフィルス株の切断Ｔｂｐ２蛋白をコードすることができる。そのようなコードされた切断Ｔｂｐ２蛋白は、インフルエンザ菌ｂ型のＥａｇａｎ株について図３１に示したものまたは別のヘモフィルス株からの等価なＴｂｐ２蛋白のいずれかであることができる。本発明の別の態様においては、ヘモフィルス株のトランスフェリン受容体蛋白の免疫原性切断類縁体をコードする精製・単離核酸分子であって、該核酸分子が、（ａ）図３、４、５、６、７、８、９、１０もしくは１１に示したＤＮＡ配列（配列番号：１、２、３、４、１０５、１０８、１１０、１１２、１１４）のいずれかまたは前記配列のいずれかの相補的ＤＮＡ配列；（ｂ）図３、４、５、６、７、８、９、１０、１１もしくは３１に示したアミノ酸配列（配列番号：５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１０６、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５）のいずれかをコードするＤＮＡ配列またはそれに対する相補的ＤＮＡ配列；ならびに（ｃ）厳しい条件下に（ａ）もしくは（ｂ）で定義されたＤＮＡ配列のいずれかに対してハイブリッド形成するＤＮＡ配列からなる群から選択される切断型のＤＮＡ配列である分子が提供される。（ｃ）で定義されるＤＮＡは好ましくは、（ａ）および（ｂ）で定義されるＤＮＡ配列のいずれかと配列が約９０％以上同一である。別の態様において本発明には、宿主の形質転換に使用される発現ベクターであって、本発明で提供される核酸分子ならびにトランスフェリン受容体蛋白の免疫原性切断類縁体の宿主による発現を行うための核酸分子に効果的に結合された発現手段とを有してなるベクターが含まれる。発現手段は、トランスフェリン受容体蛋白の切断類縁体の宿主からの分泌のためのリーダー配列をコードする核酸部分を含むことができる。発現プラスミドは、免疫原性切断類縁体を発現する表８のクローンのいずれかから選択することができる。宿主は、例えば大腸菌、桿菌、ヘモフィルス、真菌、酵母またはバキュロウィルスから選択することができ、 Semiliki forestウィルス発現系を使用することができる。本発明のさらに別の態様では、本発明で提供される発現ベクターを有する形質転換宿主が提供される。本発明にはさらに、形質転換された宿主によって産生可能なトランスフェリン受容体蛋白の組換え免疫原性切断類縁体も含まれる。本発明は、さらに別のその態様において、ヘモフィルス株の免疫原性切断Ｔｂｐ２蛋白を提供するものである。Ｔｂｐ２蛋白は、そのＣ末端から切断することができ、特にはインフルエンザ菌ｂ型のＥａｇａｎ株について図３１に示した切断蛋白のいずれか、または別のヘモフィルス株からの等価なＴｂｐ２蛋白であることができる。本発明のさらに別の態様によれば、本発明で提供される１以上の核酸分子、本発明で提供される１以上の組換え蛋白、本発明で提供されるヘモフィルス株の１以上の免疫原性切断Ｔｂｐ２蛋白および本発明で提供される生ベクターから選択される１以上の活性成分と、該活性成分の担体または該活性成分のベクターを有してなる免疫原性組成物が提供される。その１以上の活性成分は、宿主に投与した際に、免疫応答を生じるものである。本発明で提供される免疫原生組成物は、in vivoで投与して、トランスフェリン受容体を産生する病原菌によって起こる疾患に対する保護を行うワクチンとして製剤することできる。そのような目的で、組成物は、微粒子、カプセルまたはリポソーム製剤として製剤することができる。別法として、免疫系の特異的細胞または粘膜表面への運搬のためのターゲティング分子との併用で組成物を提供することができる。免疫原性組成物は、複数の活性成分を含有して、複数種のトランスフェリン受容体産生細菌によって起こる疾患に対する保護を提供することができる。免疫原性組成物にはさらに、アジュバントを含有させることができる。本発明のさらに別の態様によれば、トランスフェリン受容体蛋白を産生するヘモフィルスその他の病原菌によって生じる感染もしくは疾患に対する保護を行う方法であって、ヒトなどの感受性宿主に、有効量の上記のような免疫原性組成物を投与する段階を有する方法が提供される。本発明のさらに別の態様によれば、組換え切断蛋白、切断Ｔｂｐ２蛋白または免疫原性組成物に対して特異的な抗血清または抗体が提供される。さらに別の態様では、宿主へのトランスフェリン受容体の運搬のための生ベクターであって、上記のような核酸分子を含むベクターを有してなる生ベクターが提供される。そのベクターは、サルモネラ、ＢＣＧ、アデノウィルス、ポックスウイルス、牛痘およびポリオウィルスから選択することができる。さらに別の態様において本発明は、ヘモフィルス株の免疫原性切断Ｔｐｂ２蛋白を製造する方法であって、制御配列に対して有効に結合したヘモフィルス株の免疫原性切断Ｔｂｐ２蛋白をコードする核酸分子を有する発現ベクターを構築する段階；前記発現ベクターを宿主に導入する段階；ならびに免疫原性切断Ｔｂｐ２蛋白を宿主から発現させる段階を有してなる方法を提供するものである。使用される発現ベクターは、表８に示した発現ベクターのいずれかであることができる。図面の簡単な説明図面を参照しながら、以下の説明によって、本発明についての理解を深めることができる。図１Ａは、インフルエンザ菌ｂ型ＤＬ６３株のトランスフェリン受容体オペロンの２個のプラスミドクローン（ｐＢＨＴ１およびｐＢＨＴ２）の制限マップを示す図である。図１Ｂは、インフルエンザ菌ｂ型Ｅａｇａｎ株からのＴｆＲ遺伝子を含むクローンＳ−４３６８−３−３およびＪＢ−９０１−５−３の制限マップを示す図である。図１Ｃは、インフルエンザ菌ｂ型ＭｉｎｎＡ株からのトランスフェリン受容体遺伝子を含むクローンＤＳ−７１２−１−３の制限マップを示す図である。図１Ｄは、分類できないインフルエンザ菌株ＰＡＫ１２０８５からのトランスフェリン受容体遺伝子を含むクローンＪＢ−１０４２−７−６の制限マップを示す図である、図２は、クローニングされたＴｂｐ１およびＴｂｐ２遺伝子の構造および制限マップと、単一プロモータの転写調節下にオペロンを形成する縦列での２個の遺伝子（ｔｂｐ１およびｔｂｐ２）を有するＴｆＲオペロンの遺伝子構造を示し、ヘモフィルス株からのＴｆＲ遺伝子についてのライブラリを調べるのに使用されるｐＢＨＩＴ２の３．０ｋｂＤＮＡ断片を描いた図である。図３は、インフルエンザ菌ｂ型ＤＬ６３株からのトランスフェリン受容体遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号：１）とその推定アミノ酸配列（配列番号：５ −Ｔｂｐ１および配列番号：６−Ｔｂｐ２）を示す図である。下線を施してあるアミノ酸配列は、アミノ酸配列決定によって確認されたＴｂｐ１のペプチドに相当する。推定信号配列は二重上線で示してあり、Ｔｂｐ２では１〜１７の残基およびＴｂｐ１では１〜２３の残基に相当する。図４は、インフルエンザ菌ｂ型Ｅａｇａｎ株からのトランスフェリン受容体遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号：２）とその推定アミノ酸配列（配列番号：７−Ｔｂｐ１および配列番号：８−Ｔｂｐ２）を示す図である。推定の−３５、 −１０およびリボソーム結合部位配列には上線が施してある。図５は、インフルエンザ菌ｂ型Ｍｉｎｎ株からのトランスフェリン受容体遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号：３）とその推定アミノ酸配列（配列番号：９ −Ｔｂｐ１および配列番号：１０−Ｔｂｐ２）を示す図である。推定の−３５、 −１０およびリボソーム結合部位配列には上線が施してある。図６は、分類できないインフルエンザ菌株ＰＡＫ１２０８５からのトランスフェリン受容体遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号：４）とその推定アミノ酸配列（配列番号：１１−Ｔｂｐ１および配列番号：１２−Ｔｂｐ２）を示す図である。推定の−３５、−１０およびリボソーム結合部位配列には上線が施してある。図７は、分類できないインフルエンザ菌株ＳＢ３３からのトランスフェリン受容体遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号：１０５）とその推定アミノ酸配列（配列番号：１０６−Ｔｂｐ１および配列番号：１０７−Ｔｂｐ２）を示す図である。図８は、分類できないインフルエンザ菌株ＳＢ１２からのＴｂｐ２遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号：１０８）とその推定アミノ酸配列（配列番号：１０９−Ｔｂｐ２）を示す図である。図９は、分類できないインフルエンザ菌株ＳＢ２９からのＴｂｐ２遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号：１１０）とその推定アミノ酸配列（配列番号：１１１−Ｔｂｐ２）を示す図である。図１０は、分類できないインフルエンザ菌株ＳＢ３０からのＴｂｐ２遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号：１１２）とその推定アミノ酸配列（配列番号：１１３−Ｔｂｐ２）を示す図である。図１１は、分類できないインフルエンザ菌株ＳＢ３２からのＴｂｐ２遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号：１１４）とその推定アミノ酸配列（配列番号：１１５−Ｔｂｐ２）を示す図である。図１２Ａは、インフルエンザ菌株Ｅａｇａｎ、ＭｉｎｎＡ、ＰＡＫ１２０８５およびＳＢ３３からのプロモータ領域のヌクレオチド配列とｔｂｐ２遺伝子の５ ’末端を示す図である（ぞれぞれ、配列番号：１１６、１１７、１１８および１１９）。ＰＣＲによってｔｂｐ２遺伝子を増幅するのに使用されるコード鎖プライマーには下線が施してある（配列番号：１２０）。図１２Ｂは、インフルエンザ菌株Ｅａｇａｎ、ＭｉｎｎＡ、Ｄｌ６３、ＰＡＫ１２０８５、ＳＢ１２、ＳＢ２９、ＳＢ３０およびＳＢ３２からの遺伝子間領域とｔｂｐ１遺伝子の５’末端を示す図である（それぞれ、配列番号：１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７および１２８）。ＰＣＲによってｔｂｐ２遺伝子を増幅するのに使用される非コード鎖プライマーには下線が施してある（配列番号：１２９）。図１３は、分類できないインフルエンザ菌株ＳＢ１２、ＳＢ２９、ＳＢ３０、ＳＢ３２およびＳＢ３３からのＰＣＲ増幅ｔｂｐ２遺伝子のアガロースゲル分析を示す図である。列１はＳＢ３３であり、列２はＳＢ１２であり、列３はＳＢ２９であり、列４はＳＢ３０であり、列５はＳＢ３２である。図１４は、インフルエンザ菌株Ｅａｇａｎ、ＤＬ６３、ＰＡＫ１２０８５およびＳＢ３３から、髄膜炎菌株Ｂ１６Ｂ６およびＭ９８２から、ならびに淋菌株ＦＡ１９からのＴｂｐ１のアミノ酸配列を比較した図である（それぞれ、配列番号：７、５、１１および１０６；配列番号：９４および９５；配列番号：９６）。図１５は、インフルエンザ菌株Ｅａｇａｎ、ＤＬ６３、ＰＡＫ１２０８５、ＳＢ１２、ＳＢ２９、ＳＢ３０およびＳＢ３２から（配列番号：８、６、１２、１０９、１１０、１１２、１１４）、髄膜炎菌株Ｂ１６Ｂ６およびＭ９８２（配列番号：９７および９８）から、淋菌株ＦＡ１９ならびにアクチノバチルス牛肺疫菌株ＡＰ２０５およびＡＰ３７（配列番号：９９および１００）からのＴｂｐ２のアミノ酸配列を比較した図である。図１６Ａは、インフルエンザ菌Ｔｂｐ１蛋白の予想２次構造を示す図であり、図１６Ｂは、インフルエンザ菌Ｔｂｐ２蛋白の予想２次構造を示す図である。図１７は、大腸菌からのインフルエンザ菌ｂ型ＥａｇａｎＴｂｐ１を発現するプラスミドＪＢ−１４６８−２９の構築図式を示す図である。図１８は、大腸菌からのインフルエンザ菌ｂ型ＥａｇａｎＴｂｐ２を発現するプラスミドＪＢ−１４２４−２−８の構築図式を示す図である。図１９は、プラスミドＪＢ−１４２４−２−８の構築に使用されるオリゴヌクレオチド対（配列番号：１３０および１３１）を示す図である。図２０は、Ｔｂｐ１およびＴｂｐ２発現プラスミドを構築するためのオリゴヌクレオチド対Ａ（配列番号：８６および８７）、Ｂ（配列番号：８８および８９）、Ｃ（配列番号：９０および９１）およびＤ（配列番号：９２および９３）の配列を示す図である。図２１は、大腸菌からのインフルエンザ菌ＳＢ１２Ｔｂｐ２を発現するプラスミドＪＢ−１６００−１の構築図式を示す図である。図２２は、大腸菌からのヘモフィルスｂ型ＥａｇａｎＴｂｐ１蛋白、ＥａｇａｎＴｂｐ２蛋白および分類できないインフルエンザ菌ＳＢ１２Ｔｂｐ２蛋白の発現からの生成物のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す図である。列１はｔ_oでのＪＢ−１４７６−２−１（Ｔ７／ＥａｇａｎＴｂｐ１）であり、列２はｔ＝４ｈ誘発でのＪＢ−１４７６−２−１であり、列３は、２００ｋＤａ、１１６ｋＤａ、９７．４ｋＤａ、６６ｋＤａ、４５ｋＤａおよび３１ｋＤａの分子量マーカーであり、列４はｔ_oでのＪＢ−１４３７−４−１（Ｔ７／ＥａｇａｎＴｂｐ２）であり、列５はｔ＝４ｈ誘発でのＪＢ−１４３７−４−１であり、列６はｔ_oでのＪＢ−１６０７−１−１（Ｔ７／ＳＢ１２Ｔｂｐ２）であり、列７はｔ＝４ｈ誘発でのＪＢ−１６０７−１−１である。図２３は、大腸菌から発現された組換えＴｂｐ１およびＴｂｐ２の精製図式を示した図である。図２４は、図２３の図式によって精製した組換えＴｂｐ１およびＴｂｐ２の純度分析を示す図である。列１には分子量マーカーがあり（１０６、８０，４９．５、３２．５、２７．５および１８．５ｋＤａ）、列２は大腸菌全細胞溶解物である。列３は、可溶化封入体である。列４は精製Ｔｂｐ１またはＴｂｐ２である。図２５は、マウスにおけるｒＴｂｐ１（上図）およびｒＴｂｐ２（下図）の免疫原性を示す図である。図２６は、ウェスタンブロッティングでの各種インフルエンザ菌株との抗ＥａｇａｎｒＴｂｐ１抗血清の反応性を示す図である。列１はＢＬ２１／ＤＥ３であり、列２はＳＢ１２−ＥＤＤＡであり、列３はＳＢ１２＋ＥＤＤＡであり、列４はＳＢ２９−ＥＤＤＡであり、列５はＳＢ２９＋ＥＤＤＡであり、列６はＳＢ３３−ＥＤＤＡであり、列７はＳＢ３３＋ＥＤＤＡであり、列８はＥａｇａｎ− ＥＤＤＡであり、列９はＥａｇａｎ＋ＥＤＤＡであり、列１０はカタル球菌４２２３−ＥＤＤＡであり、列１１はカタル球菌４２２３＋ＥＤＤＡであり、列１２は髄膜炎菌６０８−ＥＤＤＡであり、列１３は髄膜炎菌６０８＋ＥＤＤＡであり、列１４は組換えＥａｇａｎＴｂｐ１を発現する誘発ＪＢ−１４７６−２−１であり、列１５は分子量マーカーである。特異的な約９５ｋＤａの帯域は、インフルエンザ菌株ＳＢ１２、ＳＢ２９、ＳＢ３３およびＥａｇａｎに相当する列３、４、５、７、８および９で抗Ｔｂｐ１抗血清と反応し、約１１０ｋＤａの帯域は、カタル球菌株に相当する列１０および１１で反応し、約８０ｋＤａの帯域は、髄膜炎菌６０８に相当する列１２および１３で反応した。図２７は、ウェスタンブロッティングにおける各種インフルエンザ菌株との抗ＥａｇａｎｒＴｂｐ２抗血清の反応性を示す図である。列１は分子量マーカーであり、列２は組換えＥａｇａｎＴｂｐ２を発現する誘発ＪＢ−１４３７−４ −１であり、列３はＳＢ１２−ＥＤＤＡであり、列４はＳＢ１２＋ＥＤＤＡであり、列５はＳＢ２９−ＥＤＤＡであり、列６はＳＢ２９＋ＥＤＤＡであり、列７はＳＢ３０−ＥＤＤＡであり、列８はＳＢ３０＋ＥＤＤＡであり、列９はＳＢ３２−ＥＤＤＡであり、列１０はＳＢ３３−ＥＤＤＡであり、列１１はＳＢ３３＋ＥＤＤＡであり、列１２はＰＡＫ−ＥＤＤＡであり、列１３はＰＡＫ＋ＥＤＤＡであり、列１４はＥａｇａｎ−ＥＤＤＡであり、列１５はＥａｇａｎ＋ＥＤＤＡである。６０〜７０ｋＤａの特異的帯域は、列３、６、７、８、１３、１４および１５、すなわち株ＳＢ１２、ＳＢ２９、ＳＢ３０、ＰＡＫおよびＥａｇａｎでの抗Ｔｂｐ２抗血清と反応性であった。図２８は、トランスフェリン受容体を産生しないインフルエンザ菌株を得るのに使用されるプラスミドｐＵＨＩＴ１ＫＦＨおよびｐＵＨＩＴ１ＫＦＰの構築を示した図である。図２９は、トランスフェリン受容体蛋白を産生する細菌間で保存されるトランスフェリン受容体蛋白由来のエピトープを発現するキメラのポリオウィルスをコードするプラスミドの構築を示す図である。図３０は、トランスフェリン受容体蛋白を産生する細菌間で保存されるトランスフェリン受容体蛋白由来のエピトープを発現するポリオウィルスキメラによるウサギの免疫感作によって産生される抗血清の反応性を示すウェスタンブロッティングである。Ａ図は大腸菌で発現されたインフルエンザ菌株ＳＢ１２からの精製組換えＴｂｐ２（列１）、カタル球菌株４２２３からの精製Ｔｂｐ２（列２）、鉄制限カタル球菌株４２２３の全細胞溶解物（列３）、非鉄制限条件下に成長させた大腸菌ＪＭ１０９の全細胞溶解物（列５）を示すクマシー・ブリリアント・ブルー染色ゲルを示す図である。Ｂ図は、ＰＶ１ＴＢＰ２Ａで免疫感作したウサギから第２７日に採取した血清蓄積液を用いた複製ゲルのウェスタンブロッティングの結果を示す図である。Ｃ図は、同じものからの採血前血清の蓄積液についての結果であって、最小の特異的反応性を示したものの図である。図３１は、トランスフェリン受容体蛋白Ｔｂｐ２の多くの切断類縁体を示す図である。図３２は、トランスフェリンに対する切断Ｔｂｐ２蛋白の結合を示す図である。上記の図の一部においては、以下の略称を用いて、特定部位特異的な制限エンドヌクレアーゼを称している。すなわち、ＲはＥｃｏＲＩであり、ＰｓはＰｓｔＩであり、ＨはＨｉｎｄＩＩＩであり、ＢｇはＢｇ１ＩＩであり、ＮｄｅはＮｄｅＩであり、ＥａｒはＥａｒＩであり、ＳａｕはＳａｕ３ＡＩである。図２８において、以下の略称を用いて、特定部位特異的な制限エンドヌクレアーゼを称している。すなわち、ＡはＡｃｃＩであり、ＢはＢａｍＨＩであり、ＥはＥｃｏＲＩであり、ＯはＸｈｏＩであり、ＨはＨｉｎｄＩＩＩであり、ＰｓはＰｓｔＩであり、ＶはＥｃｏＲＶであり、ＸはＸｂａＩであり、ＧはＢｇｌＩＩであり、ＳはＳａｌＩであり、ＫはＫｐｎＩであり、Ｓ^*はＳａｃＩである。発明の詳細な説明ヘモフィルス株を適切に使用して、本発明の実施態様を代表とするトランスフェリン部分をコードする核酸の少なくとも一部を有してなるＤＮＡ分子の形態であることができる精製・単離核酸を提供することができる。そのような菌株は一般に、臨床的入手源および細菌培養収集（例：American Type Culture Collecti on）から入手することができる。本発明の１態様によれば、トランスフェリン受容体蛋白は、既報の方法（Schr yvers(1989)、Ogunnaviwo and Schryvers(1992)および米国特許５１４１７４３号（これのテーマは引用によって本明細書に含まれるものである））によってヘモフィルス株から単離することができる。適切な方法の詳細は米国特許５１４１７４３号に記載されているが、そのような方法の簡単な要旨を以下に説明する。トランスフェリン受容体の単離は、トランスフェリン結合活性を発現する細菌株から膜分画を単離し、膜分画中のトランスフェリン受容体に対してトランスフェリンを予め結合させる段階、膜を可溶化する段階、トランスフェリンを固定化する段階および固定化トランスフェリンからトランスフェリン受容体を分離する段階という一連の段階が関与するアフィニティ法によってトランスフェリン受容体を精製することで行われる。別法として、受容体蛋白は、予め結合させる段階を省略し、高濃度の塩を可溶化緩衝液に含有させて、既報の方法（Ogunnariwo and Schryvers(1992)）に従って固定化トランスフェリンによる直接単離を可能とする、上記の方法の変法によって単離することができる。本願において、「トランスフェリン受容体蛋白の切断類縁体」という用語は、全長蛋白と比較して切断されたＴｂｐ１および／またはＴｂｐ２蛋白類を定義するために用いられ、例えばヘモフィルスなどの各種菌株における天然のものなどの、それら蛋白のアミノ酸配列が変わったものも含まれる。トランスフェリン受容体の他の細菌源としては、ナイセリア属、ブランハメラ属、パストレラ属およびアクチノバチルス属などがあるが、これらに限定されるものではない。特定の実施態様において、トランスフェリンはインフルエンザ菌ｂ型ＤＬ６３株から単離され、既報の方法（例：Schryvers(1989)、Ogunnariwo and Schryver s(1992)および米国特許５１４１７４３号）に従ってアフィニティクロマトグラフィー法にて精製した。単離・精製トランスフェリン受容体を用いて、ウサギにおいて抗ＴｆＲ抗血清を得た。インフルエンザ菌ｂ型ＤＬ６３株からの染色体ＤＮＡを機械的に剪断し、ＥｃｏＲＩリンカーを加え、λＺＡＰ発現ライブラリを構築した。このライブラリを抗ＴｆＲウサギ抗血清でスクリーニングし、重複する制限マップを有する２つの陽性クローン（ｐＢＨＩＴ１およびｐＢＨＩＴ２）を得た（図１Ａおよび図２）。これらのクローンについて配列決定を行い、２つの大きい転写解読枠を確認した（図２）。インフルエンザ菌ＤＬ６３からのトランスフェリン受容体遺伝子Ｔｂｐ１およびＴｂｐ２のヌクレオチド配列（配列番号：１）ならびにそれらの推定アミノ酸配列（配列番号：５−Ｔｂｐ１および配列番号：６−Ｔｂｐ２）を図３に示してある。配列分析から、ＴｆＲオペロンが、縦列に配置され、単一のプロモータから転写された２個の遺伝子（Ｔｂｐ１およびＴｂｐ２）から成ることが明らかとなった（特には、図２および図３に示したもの）。Ｔｂｐ２蛋白は、菌種に応じて分子量が変動する傾向があるが、Ｔｂｐ１蛋白はそれより安定した分子量を持つ傾向があり、ＴｆＲ遺伝子を有する各種細菌でわずかに変動し得る。Ｔｂｐ１の分子量は通常、９４〜１０６０００の範囲であるのに対して、Ｔｂｐ２の分子量は５８〜９８０００までかなり変動する。インフルエンザ菌ＤＬ６３からのトランスフェリン受容体のＮ末端および臭化シアン断片のアミノ酸配列決定を行った。Ｔｂｐ２のＮ末端は遮断したが、Ｔｂｐ１の配列決定によってアミノ酸配列を確認し、それを図３の蛋白配列で下線を施して示してある。これらのペプチド配列は、Glu Thr Gln Ser Ile Lys Asp Th r Lys Glu Ala Ile Ser Ser Glu Val Asp Thr（図３に示した通り、配列番号：１０１）およびLeu Gln Leu Asn Leu Glu Lys Lys Ile Gln Gln Asn Trp Leu Th r His Gln Ile Ala Phe（図３に示した通り、配列番号：１０２）である。Ｔｂｐ１の信号配列およびＴｂｐ２の推定信号配列を図３で二重上線によって示してある。Ｔｂｐ１の推定信号配列は、Met Thr Lys Lys Pro Tyr Phe Arg Leu Ser Ile Ile Ser Cys Leu Leu Ile Ser Cys Tyr Val Lys Ala（配列番号：１０３）である。Ｔｂｐ２の推定信号配列は、Met Lys Ser Val Pro Leu Ile Ser Gly Gl y Leu Ser Phe Leu Leu Ser Ala（配列番号：１０４）である。Ｔｂｐ２のＮ末端領域の所望のアミノ酸配列は、それがリポ蛋白であることを示している。インフルエンザ菌ｂ型Ｅａｇａｎ株からの染色体ＤＮＡを得て、ライブラリを形成した。第１のライブラリは、Ｓａｕ３ＡＩで部分的に消化し、約５〜１０ｋｂ断片についての分子量分別を行い、ｐＵＣに基づくプラスミドにクローニングしたＤＮＡから構築した。第２のライブラリは、λＺＡＰにクローニングしたＥｃｏＲＩ制限染色体ＤＮＡ断片から構築した。いずれのライブラリも、図２に示したようにｐＢＨＩＴクローンの５’断片で調べ、Ｓ−４３６８−３−３およびＪＢ−９０１−５−３と称されるインフルエンザ菌のＴｆＲ遺伝子の部分クローンを得た。そこで図１Ｂおよび２について説明すると、本発明の別の態様によって、インフルエンザ菌ｂ型Ｅａｇａｎ株からのＴｂｐ１およびＴｂｐ２をコードするプラスミドクローンＳ−４３６８−３−３およびＪＢ−９０１−５−３が示してある。インフルエンザ菌ｂ型Ｅａｇａｎ株からのＴｂｐ１およびＴｂｐ２遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号：２）ならびにそれらの推定アミノ酸配列（配列番号：７および８）を図４に示してあり、Ｔｂｐ２配列がオペロンの最初の遺伝子となっている。図４において、推定−３５、−１０およびリボソーム結合部位配列には上線が施してある。インフルエンザ菌ｂ型ＭｉｎｎＡ株からの染色体ＤＮＡを得て、そのＤＮＡをＳａｕ３ＡＩで部分的に消化し、１０〜２０ｋｂ断片についての分子量分別を行い、ＥＭＢＬ３のＢａｍＨＩ部位にクローニングした。そのライブラリを、ｐＢＨＩＴクローンの５’断片で調べ（図２）、ＴｆＲをコードする全長クローン（ＤＳ−７１２−１−３）を得た。図１Ｃおよび２について説明すると、本発明の別の態様によって、インフルエンザ菌ｂ型ＭｉｎｎＡ株からのＴｂｐ１およびＴｂｐ２をコードするプラスミドクローンＤＳ７１２−１−３が示してある。インフルエンザ菌ｂ型ＭｉｎｎＡ株からのＴｂｐ１およびＴｂｐ２のＤＮＡ配列（配列番号：３）ならびにそれらの推定アミノ酸配列（配列番号：９−Ｔｂｐ１および配列番号：１０−Ｔｂｐ２）を図５に示してあり、この場合Ｔｂｐ２配列がオペロンの最初の遺伝子となっている。図５において、推定−３５、−１０およびリボソーム結合部位配列には上線が施してある。分類できないインフルエンザ菌株ＰＡＫ１２０８５からの染色体ＤＮＡを得た。そのＤＮＡをＳａｕ３ＡＩで部分的に消化し、１０〜２０ｋｂ断片についての分子量分別を行い、ＥＭＢＬ３のＢａｍＨＩ部位にクローニングした。そのライブラリを、ｐＢＨＩＴクローンの断片で調べ（図２）、ＴｆＲをコードする全長クローン（ＪＢ−１０４２−７−６）を得た。図１Ｄおよび２に、クローンＪＢ−１０４２−７−６の制限マップを示してあり、図６にはインフルエンザ菌ＰＡＫ１２０８５からのＴｂｐ１およびＴｂｐ２遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号：４）ならびにそれらの推定アミノ酸配列が示してあり（配列番号：１１および１２）、この場合Ｔｂｐ２配列が最初である。図６において、推定−３５、 −１０およびリボソーム結合部位配列には上線が施してある。中耳炎由来の分類できないインフルエンザ菌株ＳＢ３３からの染色体ＤＮＡを得た。そのＤＮＡをＳａｕ３ＡＩで部分的に消化し、１０〜２０ｋｂ断片についての分子量分別を行い、ＥＭＢＬ３のＢａｍＨＩ部位にクローニングした。そのライブラリを、ｐＢＨＩＴクローンの断片で調べ（図２）、ＴｆＲをコードする全長クローン（ＪＢ−１０３１−２−９）を得た。図２に、クローンＪＢ−１０３１−２−９の制限マップを示してあり、図７にはインフルエンザ菌ＳＢ３３からのＴｂｐ１およびＴｂｐ２遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号：１０５）ならびにそれらの推定アミノ酸配列が示してあり（配列番号：１０６および１０７）、この場合Ｔｂｐ２配列が最初である。ＳＢ３３ｔｂｐ２遺伝子は１個の塩基欠失を有し、そのために残基１２６でのフレームシフトおよび残基１６８での得られた蛋白の早期切断が生じる。中耳炎由来のＮＴＨｉ株ＳＢ１２、ＳＢ２９、ＳＢ３０およびＳＢ３２からのｔｂｐ２遺伝子のＰＣＲ増幅を行って、遺伝子の配列決定を行った。分類できないインフルエンザ菌ＳＢ１２株（配列番号：１０５）、ＳＢ２９（配列番号：１０８）、ＳＢ３０（配列番号：１１０）およびＳＢ３２（配列番号：１１２）からのｔｂｐ２遺伝子のヌクレオチド配列を図８、９、１０および１１にそれぞれ示してある。増幅ｔｂｐ２遺伝子はいずれも全長Ｔｂｐ２蛋白をコードすることが認められ、菌株ＳＢ３３の欠陥ｔｂｐ２遺伝子が非定型であることを示している。３つのインフルエンザ菌ｂ型株はいずれもｔｂｐ２とｔｂｐ１の間にわずか１３ｂｐの同じ短い遺伝子間配列を持つが、ＮＴＨｉ株ＰＡＫ１２０８５およびＳＢ３３は２７ｂｐのそれより長い遺伝子間配列を持っていた（図１２）。株ＳＢ１２は、インフルエンザ菌ｂ型株で認められるものと同じ１３ｂｐの遺伝子間配列を持っていたが、株ＳＢ２９、ＳＢ３０およびＳＢ３２は、他のＮＴＨｉ株ＰＡＫ１２０８５およびＳＢ３３で認められたものと同様のそれより長い遺伝子間配列（２７〜３０ｂｐ）を持っていた（図２Ｂ）。これら９種類の株のいずれも、そのｔｂｐ２遺伝子とｔｂｐ１遺伝子の間に共通の核が保存された１３ｂｐの配列を持っている。インフルエンザ菌Ｔｂｐ１のアミノ末端近くのペンタペプチド配列は同一であり（図１２）、ＴｏｎＢボックスと同様であった。インフルエンザ菌のｔｏｎＢ遺伝子は、最近クローニングされ、配列決定されている（Jarosik et al.，1994 ）。インフルエンザ菌株Ｅａｇａｎ／ＭｉｎｎＡ、ＤＬ６３、ＰＡＫ１２０８５およびＳＢ３３からのＴｂｐ１のアミノ酸配列を図１４で比較してある。ＥａｇａｎおよびＭｉｎｎＡのＴｂｐ１蛋白は同一であって長さは９１２アミノ酸であり、ＤＬ６３のものは９１４残基を持ち、ＰＡＫ１２０８５のものは９１４残基を持ち、ＳＢ３３のものは９１１残基を持つ。インフルエンザＴｂｐ１蛋白は、配列の一致率９５〜１００％でかなり保存されている。インフルエンザ菌株Ｅａｇａｎ／ＭｉｎｎＡ、ＤＬ６３、ＰＡＫ１２０８５、ＳＢ１２、ＳＢ２９、ＳＢ３０およびＳＢ３２からのＴｂｐ２のアミノ酸配列を図１５で比較してある。ＥａｇａｎおよびＭｉｎｎＡのＴｂｐ２蛋白は同一であって６６０アミノ酸を持ち、ＤＬ６３のものは６４４残基を持ち、ＰＡＫ１２０８５のものは６５４残基を持つ。ＳＢ３３のｔｂｐ２遺伝子には１個の欠失があり、そのために残基１２６でのフレームシフトおよび残基１６８での得られた蛋白の早期切断が生じている。失われた塩基は、ＰＣＲ増幅染色体ＤＮＡの直接配列決定によって確認した。同一であるＥａｇａｎおよびＭｉｎｎＡを例外として、Ｔｂｐ２蛋白配列は一致率わずか６６〜７０％と比較的保存率が低いが、図１５で確認することができるいくつかの短い保存配列部分がある。菌株ＳＢ１２、ＳＢ２９、ＳＢ３０およびＳＢ３２からのＰＣＲ増幅ｔｂｐ２遺伝子はいずれも、全長Ｔｂｐ２蛋白をコードすることが認められた。推定Ｔｂｐ２蛋白間で配列および大きさの不一致があり、ＳＢ１２は６４８アミノ酸を持ち、ＳＢ２９は６３１残基を持ち、ＳＢ３０は６３０残基を持ち、ＳＢ３２は６３１残基を持つ。ＥａｇａｎＴｂｐ１およびＴｂｐ２の推定二次構造を決定した（図１６Ａおよび１６Ｂ）。いずれの蛋白も、いくつかの膜横断ドメインを持ち、Ｔｂｐ１は膜を２０回横断し、Ｔｂｐ２はそれを１２回横断している。Ｔｂｐ１アミノ末端領域では、３つの露出した保存エピトープが同一であり（DNEVTGLGK−配列番号：４３、EQVLN/DIRDLTRYD−配列番号：１３９および１４０、GAINEIEYENVKAVEISK−配列番号：１４１）、Ｃ末端領域では一つであった（GI/VYNLF/LNYRYVTWE−配列番号：１４２および１４３）。ヒト病原体のＴｂｐ２蛋白では、一致していたのはわずか３つの小さい保存領域であった。すなわち、Ｎ末端でCS/LGGG(G)SFD−配列番号：７５、１４４および１４５であり、内部でLE/SGGFY/FGP−配列番号：７４および１４６であり、Ｃ末端でVVFGAR/K−配列番号：８３および８４であった。Ｔｂｐ２アミノ酸配列がヘモフィルス株間で変わるという発見から、ヘモフィルスを同じＴｂｐ２アミノ酸配列によって定義される小群に分けることができる。この発見によって、ヘモフィルス種からのＴｂｐ１およびＴｂｐ２と配列の類似性を有するトランスフェリン受容体を産生するヘモフィルスその他の細菌によって生じる疾患に対する免疫感作などのための免疫原性組成物で使用されるヘモフィルス株におけるそのようなサブタイプが共有するエピトープを代表する最少数のＴｂｐ１および／またはＴｂｐ２配列または合成ペプチドの合理的選択を行うことができる。そこで、最少数のトランスフェリン受容体、類縁体、断片および／またはペプチドを用いて、トランスフェリン受容体を産生するヘモフィルスおよび他の病原菌の多くまたは全ての菌株に対する免疫感作を行うことができる。さらに、広範囲の病原菌（インフルエンザ菌ｂ型、分類できないインフルエンザ菌、髄膜炎菌、淋菌およびアクチノバチルス（ヘモフィルス）牛肺疫菌）からのトランスフェリン受容体のアミノ酸配列を図１４および１５に示したように比較した。この分析から、これら細菌のいずれの間でも保存されているＴｂｐ１およびＴｂｐ２の領域が明らかになった。そのような保存配列の一部が、表２および表３のペプチドにある。詳細には、配列DNEVTGLGK（配列番号：４３）EQVLNIR DLTRYDPGI（配列番号：４４）、EQVLNIRDLTRYDPGISVVEQGRGASSGYSIRGMD（配列番号：４５）、GAINEIEYENVKAVEISKG（配列番号：４６）およびGALAGSV（配列番号：４８）がＴｂｐ１で保存されている（表１および図１４）。Ｔｂｐ１における特定の保存配列には、LEGGFYGP（配列番号：７４）、CSGGGSFD（配列番号：７５）、YVYSGL（配列番号：７６）、CCSNLSYVKFG（配列番号：７７）、FLLGHRT（配列番号：７８）、EFNVOF（配列番号：７９）、NAFTGTA（配列番号：８０）、VNG AFYG（配列番号：８１）、ELGGYF（配列番号：８２）、VVFGAR（配列番号：８３）およびVVFGAK（配列番号：８４）がある（表２および図１５）。広範囲の病原菌のトランスフェリン受容体で保存される配列の発見により、特定のアミノ酸配列を有する最少数の抗原（合成ペプチドの形のものを含む）を選択して、トランスフェリン受容体を有する病原体によって生じる疾患に対して免疫感作を行うことができる。上記のもの以外のそのような細菌には、淋菌などのナイセリア属およびカタル球菌などのブランハメラ属などがある。多くの病原菌間でのそのような保存アミノ酸により、全てではなくともほとんどのトランスフェリンを認識するモノクローナル抗体などのＴｆＲ特異的抗体を形成することができる。トランスフェリン受容体の保存部分に相当するペプチドに対して抗血清を形成した。この抗血清は、カタル球菌におけるトランスフェリン受容体を認識した。そのような抗血清は、全てではなくともＴｆＲ蛋白を産生するほとんどの細菌の検出および中和に有用であり、そのような病原体によって生じる疾患に対する受動免疫にも有用である。そのような保存アミノ酸配列を用いる診断アッセイおよびキットは、全てではなくともトランスフェリン受容体を産生する多くの細菌を検出するのに有用である。上記のアミノ酸配列を有するエピトープは、そのような配列を有する合成ペプチドの使用によって、またはそのような配列を発現する生ベクターの使用によって、またはそのアミノ酸配列をコードする核酸分子の直接投与によって免疫系の細胞に運搬することができる。インフルエンザ菌ｂ型株Ｅａｇａｎ、ＭｉｎｎＡ、ＤＬ６３および分類できない株ＰＡＬ１２０８５のＴｂｐ１蛋白内での保存アミノ酸配列を有するいくつかのペプチドを表２に示してある。これらのペプチドの一部に対する抗体をモルモットで形成した（表４）。インフルエンザ菌ｂ型株Ｅａｇａｎ、ＭｉｎｎＡ、ＤＬ６３および分類できない株ＰＡＫ１２０８５のＴｂｐ２蛋白内の保存アミノ酸配列を有するペプチドを表３に示してある。これらのペプチドの一部に対する抗体をモルモットで形成した（表４）。Ｔｂｐ１およびＴｂｐ２遺伝子のコード配列を適切な発現ベクターにクローニングすることで、組換え蛋白を産生することができる。組換え蛋白Ｔｂｐ１およびＴｂｐ２を、Ｔ７発現系を用いて、大腸菌から発現させた。成熟ＥａｇａｎＴｂｐ１蛋白をコードするｔｂｐ１遺伝子を、図１７に示したように、プラスミドＪＢ−１４６８−２９を形成するＴ７プロモータの背後でフレーム内でクローニングした。ＢＬ２１／ＤＥ３細胞に導入され、ＩＰＴＧまたは乳糖で誘発された場合、ＥａｇａｎＴｂｐ１蛋白は図２２に示すように発現された。成熟Ｔｂｐ２蛋白をコードするｔｂｐ２遺伝子を、図１８に示したように、プラスミドＪＢ−１４２４−２−８を形成するＴ７プロモータの背後でフレーム内でクローニングした。大腸菌細胞に導入され、上記のように誘発された場合、Ｔｂｐ２蛋白は図２２に示すように発現された。株ＮＴＨｉＳＢ１２からのｔｂｐ２遺伝子をＰＣＲによって増幅した。得られた増幅ＤＮＡは、成熟蛋白前に真正のインフルエンザＴｂｐ２信号配列がある。その信号配列および成熟蛋白をコードするＳＢ１２ｔｂｐ２遺伝子を、図２１に示すように、ｐＴ７−７発現系にクローニングした。得られたプラスミド（ＪＢ−１６００−１）を大腸菌ＢＬ２１／ＤＥ３細胞に導入し、誘発した場合、ＳＢ１２Ｔｂｐ２は図２２に示すように発現された。封入体として大腸菌で産生される組換え蛋白Ｔｂｐ１およびＴｂｐ２を図２３に示した図式によって精製した。精製蛋白は図２４に示したように、約７０％以上の純度であった。精製組換えＴｂｐ１およびＴｂｐ２蛋白を用いて、マウスにおける免疫原性試験を行った。いずれの蛋白も、３〜１０μｇの用量で、良好な免疫応答を引き起こした（図２５）。一つのインフルエンザ菌株由来の組換えＴｂｐ１またはＴｂｐ２に対して形成された抗血清は他の菌株と交差反応性であることから、有用な診断試薬となり得る（図２６および２７）。図２８に示したプラスミドｐＵＨＩＴ１ＫＦＨおよびｐＵＨＩＴＫＦＰは、トランスフェリン受容体オペロン内でクローニングされた選択可能な抗生物質抵抗性マーカーを有し、トランスフェリン受容体オペロンを挿入によって失活させるよう構築されたものである。これらのプラスミドを用いてヘモフィルスの形質転換を行って、実施例１９に記載した方法に従って、トランスフェリンＴｂｐ１および／またはＴｂｐ２を産生しない菌株を形成した。そのような菌株は、in vit roおよびin vivoでの検出および診断の実施態様において陰性対照として有用である（それらがＴｆＲを産生しないことから）。そのような菌株はさらに、in v ivo成長のために弱毒化されることが期待され、ヘモフィルスによって生じる疾患に対する保護を提供する生ワクチンとして有用である。以上述べたように、トランスフェリン受容体蛋白のエピトープは、アミノ酸配列などを発現する生ベクターを使用することで免疫系の細胞に運搬することができ、生ベクターはポリオウィルスとすることができる。図２９について説明すると、Ｔｂｐ２からの保存エピトープLEGGFYGP（配列番号：７４）を含むトランスフェリン受容体蛋白のエピトーブを発現するハイブリッドポリオウィルスの構築を図示してある。そのようなウィルスは、アミノ酸配列LEGGFYGP（配列番号：７４）を組み込んだペプチドに対して形成された抗体によって認識され（表５）、ウィルスが、抗原的に認識可能な形でこの配列を発現したことを示している。ＰＶ１ＴＢＰ２ＡおよびＰＶ１ＴＢＰ２Ｂも、インフルエンザ菌株ＤＬ６３ｔｂｐ２に対して形成されたウサギ抗血清によって中和することができ、少なくともこれら２つのウィルスが、蛋白に対して形成された抗体に対して認識可能な形でその配列を発現したことを示していた。いずれのウィルスも、抗ＰＶ１血清によって中和可能であって、ポリオ中和抗原部位Ｉにおける変化はウィルスにおける他の抗原部位に対してほとんど影響しなかったことを示している。さらに、ポリオウィルスキメラＰＶ１ＴＢＰ２ＡまたはＰＶ１ＴＢＰ２Ｂによる免疫感作によって産生されたウサギ抗血清は、アミノ酸配列LEGGFYGP（配列番号：７４）を組み込んだペプチドを認識した。これは、ＰＶ１ＴＢ２ＡおよびＰＶ１ＴＢＰ２Ｂによって発現される配列が免疫原性で、合成ペプチドの文脈で同じ配列を認識することができる抗体を誘発することを示している。図３０について説明すると、Ａ図には、大腸菌で発現されたインフルエンザ菌株ＳＢ１２からの精製組換えｔｂｐ２（列１）、カタル球菌株４２２３からのｔｂｐ２（列２）、鉄制限カタル球菌株４２２３の全細胞溶解物（列３）、鉄制限大腸菌ＪＭ１０９の全細胞溶解物（列４）、ならびに非鉄制限条件下で成長させた大腸菌ＪＭ１０９の全細胞溶解物（列５）を示すＳＤＳＰＡＧＥゲルを示してある。Ｂ図には、ＰＶ１ＴＢＰ２Ａで免疫感作したウサギからの血清の蓄積液を用いた複製ゲルのウェスタンブロッティングの結果を示してある。列１および２では、精製トランスフェリン結合蛋白との強力な反応があり、列３では同様の大きさの帯域があった。大腸菌蛋白とはほとんど反応はなかった（列４および５）。Ｃ図は、最少の特異的反応を示した同じウサギからの採血前血清の蓄積液についての結果を示してある。これらの結果から、ＰＶ１ＴＢＰ２Ａが、インフルエンザ菌およびカタル球菌からのトランスフェリン結合蛋白に特異的な抗血清を誘発できること、ならびにその抗血清が、等価な蛋白を発現しない大腸菌からのカタル球菌を識別できることが明らかである。モルモットの抗ＥａｇａｎｒＴｂｐ１、抗ＥａｇａｎｒＴｂｐ２および抗ＳＢ１２ｒＴｂｐ２抗血清を用いて、Ｔｂｐ１およびＴｂｐ２蛋白の抗原性保存について、一群のインフルエンザ菌のスクリーニングを行った。抗ＥａｇａｎｒＴｂｐ１抗血清を用いたウェスタンブロッティングによってスクリーニングした３３の株のうち、全てが約１００ｋＤａの反応性帯域を持っていた。抗ＥａｇａｎｒＴｂｐ２抗血清を用いたウェスタンブロッティングによってスクリーニングした８９の株のうち、８５の株が、６０〜９０ｋＤａの反応性帯域を持っていた。抗ＳＢ１２ｒＴｂｐ２抗血清を用いたウェスタンブロッティングによってスクリーニングした８６の株のうち、８２の株が、６０〜９０ｋＤａの反応性帯域を持っていた。抗ＥａｇａｎｒＴｂｐ２抗血清および抗ＳＢ１２ｒＴｂｐ２抗血清のいずれによっても認識されなかった株が１株だけあり、それは欠陥ｔｂｐ２遺伝子を有するＮＨＴｉ株ＳＢ３３であった。これらのデータは、トランスフェリン受容体蛋白はインフルエンザ菌株で非常に高い率で保存されることを示しており、これら蛋白が抗原として、さらにはインフルエンザ菌によって生じる疾患に対する免疫感作およびそれの診断のためのワクチンなどの免疫原性組成物においてのこれら蛋白の使用を支持するものである。菌血症の幼若ラットモデル（Loeb et al，1987）を用いて、抗ＥａｇａｎｒＴｂｐ１抗血清および抗ＥａｇａｎｒＴｂｐ２抗血清の保護能力を評価した。ウサギまたはモルモットのいずれかで形成した抗ＥａｇａｎｒＴｂｐ１抗血清はこのモデルでは保護効果を示さなかったが、ウサギまたはモルモットのいずれかで形成した抗ＥａｇａｎｒＴｂｐ２抗血清には保護効果があった（表７）。これらのデータは、インフルエンザ菌によって生じる疾患に対する保護抗原としてのｒＴｂｐ２の使用を示すものである。中耳炎のチンチラモデル（Barenkamp et al.,1986）を用いて、ＳＢ１２ｒＴｂｐ２の保護能力を評価した。データは、対照群と比較して、免疫感作した動物の疾患の重度が軽いことを示していた。本発明によれば、表８および図３１に示したようなトランスフェリン受容体蛋白Ｔｂｐ２の多くの切断類縁体、ならびにそれをコードする核酸分子が提供される。そのような切断類縁体の中には、組換え発現系（例：大腸菌）で非常に強く発現され、本発明の診断および予防接種の実施態様で適切な抗血清および免疫原を提供するものもある。本明細書に記載の実施態様を代表的なものとするヘモフィルス株のトランスフェリン受容体蛋白の免疫原性切断類縁体をコードする精製・単離ＤＮＡ分子は、次のものとして有利である。 −in vitroまたはin vivoでのヘモフィルス株の特異的識別のための核酸プローブ −ＤＮＡ分子によってコードされる免疫原性切断生成物は、ヘモフィルス株によって生じる疾患に対する予防接種および（例えば）ヘモフィルスによる感染の検出用のヘモフィルス特異的抗血清の製造のための診断試薬、抗原として有用である。本発明の核酸分子によってコードされるトランスフェリン受容体蛋白の切断類縁体は、トランスフェリン受容体を産生する細菌株によって生じる疾患の診断およびその疾患に対する免疫感作において有用である。そのような細菌には、ヘモフィルス属、ナイセリア属（髄膜炎菌および淋菌など）およびブランハメラ属（例：カタル球菌）の株などがあるが、これらに限定されるものではない。本発明の各種実施態様が、例えばヘモフィルス感染およびトランスフェリン受容体を産生する他の病原菌による感染の予防接種、診断、治療の分野および免疫試薬形成の分野で多くの利用場面を有することは当業者には明らかである。そのような用途についてのさらに詳細な考察を以下に行うが、これらに限定されるものではない。１．ワクチンの製造および使用ワクチンとしての使用に好適な免疫原性組成物を、トランスフェリン受容体蛋白の免疫原性切断類縁体から製造することができる。このワクチンは、抗トランスフェリン受容体抗体およびオプソニン作用性または殺細菌性である抗体などの抗体を産生する免疫応答を誘発する。予防接種対象者をヘモフィルスその他のトランスフェリン受容体を産生する細菌が攻撃したとしても、抗体がトランスフェリン受容体に結合し、それによって、生存のために必要な鉄源への細菌の接近が防止される。さらに、オプソニン作用性または殺細菌性の抗ＴｆＲ抗体は、別の機序によって保護を与える可能性もある。ペプチドを含むワクチンは、いずれも引用によって本明細書に含まれる米国特許４６０１９０３号、４５９９２３１号、４５９９２３０号および４５９６７９２号などのように、当業界では公知である。ワクチンを含む免疫原性組成物は、液剤や乳剤などの注射剤として製剤することができる。免疫原は、その免疫原と適合性である医薬的に許容される賦形剤と混合することができる。そのような賦形剤としては、水、生理食塩水、ブドウ糖、グリセリン、エタノールおよびそれらの組み合わせたものなどがあり得る。免疫原性組成物およびワクチンは、湿展剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤またはアジュバントなどの補助物質をさらに含有して、その有効性を高めることができる。免疫原性組成物およびワクチンは、皮下注射もしくは筋肉注射によって、非経口的に投与することができる。別法として、本発明によって得られる免疫原性組成物を、粘膜表面での免疫応答を誘発するような形で製剤および運搬することができる。そこで、免疫原性組成物を、例えば鼻腔または経口（胃内投与）投与によって粘膜表面に投与することができる。免疫原性組成物は、免疫系の特異的細胞または粘膜表面への運搬のためのターゲティング分子との併用で提供することができる。そのようなターゲティング分子には、ＷＯ９２／１７１６７（Biotech Australia Pty.Ltd.）に記載のようなＢ１２株および細菌毒素の断片、ならびに米国特許５１９４２５４号（Barber et al）に記載のようなモノクローナル抗体などがある。別法として、坐剤および経口製剤などの他の投与形態が望ましい場合がある。坐剤の場合、結合剤および担体には、例えばポリアルカレングリコールまたはトリグリセリドなどがあり得る。経口製剤には、例えば医薬用のサッカリン、セルロースおよび炭酸マグネシウムなどの通常使用されるインシピエント（incipient）などがあり得る。これらの組成物は、液剤、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル、徐放性製剤または粉剤の形態を取り、免疫原を１０〜９５％含有する。ワクチンは、その製剤に適合する方法にて、治療上有効で、保護効果があり、免疫原性であるような量で投与される。投与量は、治療を受ける対象者によって決まるものであり、例えば、抗体を合成し、必要に応じて細胞介在性免疫応答を生じるその対象者における免疫系の能力によって決まる。投与に必要な有効成分の正確な量は、医師の判断によって決まる。しかしながら、好適な用量範囲は、当業者であれば容易に決定し得るものであり、トランスフェリン受容体、それの類縁体および断片および／またはペプチドをμｇ単位とすることになると考えられる。初期投与および追加免疫投与における好適な投与法も変動し得るものであるが、初期投与とそれに続く投与を行うことになると考えられる。ワクチンの用量は投与経路によっても決まるものであり、宿主の大きさに応じて変動する。本発明の核酸分子は、例えば遺伝的免疫感作を行う注射によって、あるいはサルモネラ、ＢＣＧ、アデノウィルス、ポックスウィルス、ワクチニアまたはポリオウィルスなどの生ベクターを構築することによって、直接ＤＮＡを投与することで直接免疫感作を行うのに使用することもできる。免疫系に異種抗原を運搬するのに使用されているいくつかの生ベクターについての考察が行われている文献がある（例：O'Hagan，1992）。被験対象者へのＤＮＡの直接注射による遺伝的免疫感作の方法については報告がある（例：Ulmer et al.，1993）。通常は０．０５〜１．０％のリン酸緩衝生理食塩水溶液として使用される、アジュバントと抗原を同時投与すれば、免疫原性を大幅に向上させることができる。アジュバントは、抗原の免疫原性を高めるが、必ずしもそれ自体が免疫原性とは限らない。アジュバントは、抗原を投与部位付近に局所的に保持することで、免疫系の細胞への抗原の緩やかな徐放を促進する貯蔵効果を生じることで作用し得るものである。アジュバントはさらに、免疫系の細胞を抗原貯蔵部まで引き寄せ、そのような細胞を刺激して免疫応答を誘発することができる。免疫刺激剤またはアジュバントは、例えばワクチンに対する宿主の免疫応答を改善するために、長年にわたって使用されている。リポ多糖類などの内在性アジュバントは通常、ワクチンとして使用される死菌または弱毒化細菌の成分である。外因性アジュバントは、代表的には非共有結合的に抗原に結合する免疫調節剤であり、宿主の免疫応答を促進するよう製剤されている。そうして、非経口的に運搬される抗原に対する免疫応答を促進するアジュバントが確認されている。しかしながら、そのようなアジュバントの一部は有毒であり、望ましくない副作用を起こし得るものであることから、ヒトや多くの動物で使用するには不適なものとなっている。実際、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウム（総称して通常は、ミョウバンと称される）のみがヒトワクチンおよび動物ワクチンにおけるアジュバントとして常用される。ジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドに対する抗体応答上昇におけるミョウバンの効力は明らかになっており、ＨＢｓＡｇワクチンにミョウバンがアジュバントとして使用されている。ミョウバンの有用性は一部の利用分野で明らかになっているが、それには制限がある。例えば、ミョウバンはインフルエンザ予防接種には無効であり、必ずしも細胞介在性免疫応答を誘発するとは限らない。ミョウバンをアジュバントとする抗原によって誘発される抗体は、マウスにおいては主としてＩｇＧ１アイソタイプであり、一部のワクチン剤による保護には最適ではない可能性がある。広範囲の外因性アジュバントが抗原に対して強力な免疫応答を起こし得る。本発明での使用に好適なアジュバントには、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ＱＳ２１、ＱｕｉｌＡ、それらの誘導体および成分、ＩＳＣＯＭ基材、リン酸カルシウム、水酸化カルシウム、水酸化亜鉛、糖脂質類縁体、アミノ酸のオクタデシルエステル、ムラミルジペプチド、ポリホスファゼン、ＩＳＣＯＰＲＥＰ、ＤＣ−ｃｈｏｌ、ＤＤＢＡおよびリポ蛋白などがあるが、これらに限定されるものではない。アジュバントの有利な組み合わせについては、１９９４年６月１６日出願の同時係属中の米国特許出願０８／２６１１９４号（ＷＯ９５／３４３０８）に記載されている。体液性免疫応答（ＨＩＲ）および細胞介在性免疫（ＣＭＩ）を効果的に誘発するためには、免疫原をアジュバント中で乳化させる。多くのアジュバントが有毒であり、症状としては、肉芽腫、急性および慢性の炎症（完全フロイントアジュバント、ＦＣＡ）、細胞崩壊（サポニンおよびプルロニックポリマー）および発熱性、関節炎および前部ブドウ膜炎（ＬＰＳおよびＭＤＰ）などがある。ＦＣＡは優れたアジュバントであり、研究で広範囲に使用されているが、その毒性のために、ヒトワクチンや動物ワクチンでの使用には特許されていない。理想的なアジュバントの望ましい特性には次のものがある。（１）毒性がないこと（２）長期間の免疫応答を刺激する能力（３）製造が簡単で、長期保存において安定であること（４）必要に応じて、各種経路で投与される抗原に対してＣＭＩとＨＩＲの両方を誘発できること（５）他のアジュバントとの相乗作用（６）抗原提供細胞（ＡＰＣ）の群との選択的相互作用を行う能力（７）適切なＴ_H１またはＴ_H２細胞特異的免疫応答を特異的に誘発する能力（８）抗原に対して適切な抗体アイソタイプ濃度（例：ＩｇＡ）を選択的に上昇させる能力ロックホッフ（Lockhoff）らに対して１９８９年８月８日に与えられた米国特許４８５５２８３号（引用によって本明細書に含まれる）には、Ｎ−グリコシルアミド、Ｎ−グリコシル尿素およびＮ−グリコシルカーバメート（これらはそれぞれ、免疫調節剤またはアジュバントとしてのアミノ酸によって糖残基が置換されている）などの糖脂質類縁体が開示されている。そこで、ロックホッフらの報告（１９９１年）では、糖スフィンゴ脂質およびグリセロ糖脂質などの天然糖脂質と構造的に類似しているＮ−糖脂質類縁体が単純疱疹ウィルスワクチンおよび偽性狂犬病ウィルスワクチンの両方において強力な免疫応答を誘発できることが報告されている。糖脂質の中には、アノマー炭素原子を介して糖と直接結合する長鎖のアルキルアミンおよび脂肪酸から合成されて、天然脂質残基の機能を模倣するものもある。モロニー（Moloney）に対して与えられ、本願の譲受人に対して譲渡され、引用によって本明細書に含まれる米国特許４２５８０２９号には、オクタデシルチロシン塩酸塩（ＯＴＨ）が、破傷風トキソイドならびにホリマリンで失活させたＩ型、ＩＩ型およびＩＩＩ型小児麻痺ウィルスワクチンと複合させた場合に、アジュバントとして機能することが開示されている。さらに、ニクソン−ジョージら（Nixon-George et al，1990）は、組換えＢ型肝炎表面抗原と複合させた芳香族アミノ酸のオクタデシルエステルがＢ型肝炎ウィルスに対する宿主の免疫応答を促進したと報告している。２．イムノアッセイ本発明の免疫原性切断類縁体は、免疫原として、酵素結合抗体免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ＲＩＡおよび他の非酵素結合抗体結合アッセイなどのイムノアッセイまたは抗細菌性ヘモフィルスＴｆＲ抗体の検出に関して当業界で公知の方法の抗原として有用である。ＥＬＩＳＡアッセイでは、免疫原性切断類縁体を、選択された表面、例えばポリスチレン微量定量プレートのウェルなどの蛋白もしくはペプチドと結合することができる表面に固定化する。洗浄によって、吸着が不完全な切断類縁体を除去した後、被験サンプルに関して抗原的に中性であることが知られているウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはカゼインの溶液などの非特異的蛋白をその選択された表面に結合させることができる。これによって、固定化表面での非特異的吸着部位を遮断して、その表面での抗血清の非特異的結合によって生じるバックグラウンドを低減させることができる。固定化表面を次に、免疫複合体（抗原／抗体）形成を起こすような形で、検査対象の臨床材料または生物材料などのサンプルと接触させる。これには、ＢＳＡ、ウシγ−グロブリン（ＢＧＧ）および／またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）／Ｔｗｅｅｎなどの希釈剤によるサンプルの希釈などがあり得る。次にサンプルを室温（約２５℃〜３７℃のレベル）で約２〜４時間インキュベーションする。インキュベーション後、サンプルと接触する表面を洗浄して、免疫複合体形成していない材料を除去する。洗浄法には、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎなどの溶液またはホウ酸緩衝液による洗浄などがある。被験サンプルと結合した切断類縁体との間の特異的免疫複合体の形成とそれに続く洗浄後、第１の抗体に対する特異性を有する第２の抗体に対して免疫複合体を曝露することで、免疫複合体形成の発生とその量も測定することができる。被験サンプルがヒト起源のものである場合、第２の抗体は、ヒト免疫グロブリン（一般的にはＩｇＧ）に対する特異性を有する抗体である。検出手段を提供するためには、第２の抗体は、例えば適切な発色性物質とともにインキュベーションすることで発色する酵素活性などの関連する活性を有することができる。次に、例えば可視スペクトルの分光光度計を用いて発色の程度を測定することで定量を行うことができる。３．ハイブリッド形成プローブとしての配列の使用そこで、トランスフェリン受容体遺伝子の配列を有する本発明のヌクレオチド配列により、トランスフェリン受容体遺伝子を有するヘモフィルスおよび他の細菌種からのトランスフェリン受容体遺伝子の確認およびクローニングが可能である。本発明のトランスフェリン受容体遺伝子の配列を有して成るヌクレオチド配列は、他のＴｆＲ遺伝子の相補的延長部とともに選択的に二重鎖分子を形成する能力があることで有用である。利用分野に応じて、各種のハイブリッド形成条件を用いて、他のＴｆＲ遺伝子に対するプローブの各種程度の選択性を得ることができる。高い選択性を得るには、比較的厳しい条件を用いて、二重鎖を形成する。その条件としては例えば、約５０℃〜７０℃の温度での約０．０２Ｍ〜０．１５ＭのＮａＣｌのような低塩および／または高温条件などがある。利用分野によっては、約２０℃〜５５℃という範囲の温度で約０．１５Ｍ〜０．９Ｍの塩のような、それより緩やかなハイブリッド形成条件が必要となる場合がある。ホルムアミドの添加量を増やしてハイブリッド形成条件をさらに厳しくすることで、ハイブリッド二重鎖を不安定化させることができる。そこで、特定のハイブリッド形成条件を容易に操作することができ、所望する結果に応じた選択法となる。通常、５０％ホルムアミド存在下での適切なハイブリッド形成温度は、標的断片に対して９５〜１００％相同性であるプローブの場合には４２℃であり、９０〜９５％相同性の場合には３７℃であり、８５〜９０％相同性の場合には３２℃である。臨床的診断の実施態様においては、本発明の核酸配列を、標識などの適切な手段と併用して、ハイブリッド形成の測定を行うことができる。広範囲の適切な指示手段が当業界で公知であり、それには検出可能な信号を提供することができるアビジン／ビオチンなどの放射能、酵素その他のリガンドなどがある。一部の診断の実施態様では、放射能タグに代えて、ウレアーゼ、アルカリホスファターゼもしくはペルオキシダーゼなどの酵素タグを用いることができる。酵素タグの場合、ヒトの肉眼による観察または分光測光法的に見ることができる手段を提供して、ＴｆＲ遺伝子配列を有するサンプルによる特異的ハイブリッド形成を確認するのに使用可能である比色指示物質が知られている。本発明の核酸配列は、溶液ハイブリッド形成および固相法を用いる実施態様でハイブリッド形成プローブとして有用である。固相法が関与する実施態様においては、滲出液、体液（例：血清、羊水、中耳滲出液、痰、細気管支肺胞洗浄液）または組織などの臨床検体のようなサンプルからの被験ＤＮＡ（またはＲＮＡ）を、選択された基材または表面に吸着その他の方法で固定する。次に、固定化した１本鎖核酸に対して、望ましい条件下に、本発明の核酸配列を有してなる特定のプロープで特異的ハイブリッド形成を行う。選択される条件は、例えばＧ＋Ｃ含有量、標的核酸の種類、核酸の入手源、ハイブリッド形成プローブの大きさなどによって決まる必要な特定の基準に基づく特定の環境によって決まるものである。ハイブリッド形成表面を洗浄して特異的に結合していないプローブ分子を除去した後、標識によって、特異的ハイブリッド形成を検出するか、もしくは定量も行う。４．トランスフェリン受容体遺伝子の発現宿主細胞と適合性の菌種由来のレプリコンおよび制御配列を有するプラスミドベクターを用いて、トランスフェリン受容体遺伝子の発現および発現系における本発明によるそれの切断を行うことができる。通常ベクターは、複製部位と、形質転換細胞において表現型選択を行うことができる標識配列を有する。例えば、アンピシリンおよびテトラサイクリン抵抗性の遺伝子を有することで、形質転換細胞識別の簡単な手段を提供するｐＢＲ３２２を用いて、大腸菌を形質転換することができる。ｐＢＲ３２２プラスミドまたは他の微生物プラスミドもしくはファージも、宿主細胞が使用してそれ自体の蛋白を発現させることができるプロモータを有するか、あるいはそれを有するように変性させることができる。さらに、宿主と適合するレプリコンおよび制御配列を有するファージベクターは、その宿主との関係で絵形質転換ベクターとして使用することができる。例えば、λ−ＧＥＭ（登録商標）−１１におけるファージを、組換えファージベクターの形成に使用し、そのベクターを使用して大腸菌ＬＥ３９２などの宿主細胞の形質転換を行うことができる。組換えＤＮＡ構築で通常使用されるプロモータには、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）および乳糖プロモータ系（Chang et al.，1978; Itakura et al.， 1977; Goeddel et al.，1979; Goeddel et al.，1980）ならびにＴ７プロモータ系（米国特許４９５２４９６号）などの他の微生物プロモータなどがある。プロモータのヌクレオチド配列に関する詳細については公知であり、当業者であればそれを効果的に遺伝子に結びつけることができる。使用される特定のプロモータは通常、所望の結果によって決まる選択事項である。本発明で行われる切断などのトランスフェリン受容体遺伝子の発現に適した宿主には、大腸菌、バチルス菌、ヘモフィルス、真菌、酵母などがあり、あるいはバキュロウィルス発現系を用いることができる。本発明によれば、トランスフェリン受容体蛋白の切断類縁体は組換え法によって得られる。異種系で組換え的に産生された切断類縁体は、精製物における汚染物の量を低減するような形で、宿主から単離することができる。この点で発現に特に望ましい宿主には、ＬＰＳを持たず、従ってエンドトキシンを持たないグラム陽性菌などがある。そのような宿主には、バチルス菌などがあり、トランスフェリン受容体蛋白の非発熱性の切断類縁体の製造に特に有用である。生物寄託本明細書に記載および言及されているインフルエンザ菌株からのトランスフェリン受容体をコードする部分を少なくとも有するある種のプラスミドを、本願出願に先だって、ブダペスト条約に従って寄託した（American Type Culture Coll ection(ATCC)，Rockville，Maryland，USA）。寄託プラスミドのサンプルは、本米国特許出願に基づく特許が賦与された時点で一般に入手可能となり、その入手可能性に対する全ての制限がその時点でなくなる。寄託した実施態様は本発明の例示を目的としたものであるに過ぎないことから、本明細書に記載および特許請求されている本発明は、寄託したプラスミドによる範囲に限定されるものではない。本願に記載のものと類似または等価な抗原をコードする等価もしくは類似のプラスミドは、本発明の範囲に含まれるものである。寄託の要旨ヘモフィルス株Ｈｉｂ株Ｅａｇａｎは市販されている（Connaught Laboratories Limited，17 55 Steeles Ave．W.，Willowdale，Ontario，Canada M2R 3T4）。Ｈｉｂ株ＭｉｎｎＡは収集品から入手した（Dr.Robert Munson，Department o f Microbiology and Immunology，Washington University School of Medicine ，Children's Hospital，St.Louis，Missouri 63110）。Ｈｉｂ株ＤＬ６３は収集品から入手した（Dr.Eric Hansen，Department of Mi crobiology，University of Texas Southwestern Medical Center，5323 Harry Hines Boulevard，Dallas，Texas 75235-9048）。ＰＡＫ１２０８５も上記の収集品から入手した（Dr.Robert Munson）。ＳＢ１２、２９、３０、３２および３３は、収集品から入手した（Dr.Stephen Barenkamp，Department of Pediatrics，School of Medicine，Saint Louis Un iversity Medical Centre，St.Louis，Missouri 63104）。実施例上記の開示内容は、本発明の全般を説明するものであるので、以下の具体的な実施例を参照することで、より完全な理解を得ることができる。これら実施例は単に説明を目的として記載されているものであって、本発明の範囲を限定するものではない。状況から見て示唆されるかあるいは好都合なものとなる可能性がある場合、等価なものの形態および置換に対して変更を加えることは想到されるものである。本明細書においては具体的な用語を用いているが、そのような用語は説明のためのものであって、本発明を限定するものではない。本開示およびこれらの実施例において使用されているが明瞭には説明されていない分子遺伝学、蛋白生化学、免疫学および発酵の技術は、科学文献に広く報告されているものであり、十分に当業者の能力の範囲内のものである。実施例１本実施例は、インフルエンザ菌株ＤＬ６３、Ｅａｇａｎ、ＭｉｎｎＡおよびＰＡＫ１２０８５ならびにＳＢ３３からの染色体ＤＮＡの製造を説明するものである。インフルエンザ菌株は、ハルクネスらの方法に従って（Harkness et al.，199 2）、ミュラー−ヒントン寒天（Mueller-Hinton agar）または脳心臓灌流肉汁で成長させた。Ａ．インフルエンザ菌ｂ型ＤＬ６３からの染色体ＤＮＡ抽出染色体ＤＮＡを以下のようにして得た。ベックマンＪ１４ローターで８０００ｒｐｍにて１５分間遠心することで、培地２５０ｍＬをペレット状とした。ペレットを５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）２００ｍＬで洗浄し、前述のように遠心し、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、５０ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）１２．５ｍＬに再懸濁させ、−２０℃で冷凍した。次に、１０ｍｇ／ｍＬのリゾチームの０．２５Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）溶液１．２５ｍＬを冷凍細胞ペレットに加えた。ペレットを解凍し、氷上で４５分間インキュベーションした。次に、１ｍｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫの０．５％ＳＤＳ、０．４ＭＥＤＴＡ、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）溶液２．５ｍＬを加え、混合物を時々攪拌しながら５０℃で１時間インキュベーションした。溶解物をトリス緩衝フェノール１５ｍＬで１回抽出し、次に３Ｍ酢酸ナトリウム１．５ｍＬおよびエタノール３０ｍＬを加えて、ＤＮＡを沈殿させた。ＤＮＡをガラス棒に巻き付け、終夜振盪することで、０．２ｍｇ／ｍＬのＲＮＡｓｅＡを含む５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）１２．５ｍＬに溶かした。サンプルを同量のクロロホルムで１回抽出し、上記と同様に沈殿・巻き付けを行った。ＤＮＡを５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）２ｍＬに溶かし、４℃で保存した。Ｂ．インフルエンザ菌ｂ型Ｅａｇａｎからの染色体ＤＮＡの抽出培地５０ｍＬを遠心によってペレットとし、ペレッットをＴＥ（１０ｍＭトリス、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）２５ｍＬに再懸濁させ、５ｍＬずつの少量サンプル２つを染色体ＤＮＡ製造に用いた。各少量サンプルに、１０％サルコシル（sarkosyl）０．６ｍＬおよび２０ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼＫ０．１５ｍＬを加え、サンプルを３７℃で１時間インキュベーションした。溶解物をトリス飽和フェノールで１回およびクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）で３回抽出した。水相を蓄積して、最終容量７ｍＬとした。次に、３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）０．７ｍＬおよびイソプロパノール４．３ｍＬを加えてＤＮＡを沈殿させ、それを巻き付け、７０％エタノールで洗浄し、乾燥し、水１ｍＬに再懸濁させた。Ｃ．インフルエンザ菌株Ｅａｇａｎ、ＭｉｎｎＡ、ＰＡＫ１２０８５およびＳＢ３３からの染色体ＤＮＡの抽出４℃で１５〜２０分間にわたり、５０００ｒｐｍでの遠心を行うことで、培地５０ｍＬから細胞をペレット化した。細胞ペレットをＴＥ（１０ｍＭトリス、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）１０ｍＬに再懸濁させ、プロナーゼおよびＳＤＳを加えて最終濃度をそれぞれ５００μｇ／ｍＬおよび１％とした。サンプルを３７℃で４時間インキュベーションして、透明溶解物を得た。溶解物を、トリス飽和フェノールで１回、トリス飽和フェノール／クロロホルム（１：１）で１回およびクロロホルムで１回抽出した。最終水相を、緩衝液を１回換えながら４℃で１ＭＮａＣｌ５００ｍＬに対して２回２４時間透析し、緩衝液を１回換えながら４℃でＴＥ５００ｍＬに対して２回２４時間透析した。最終透析液を小分けして使用に供した。実施例２本実施例は、染色体ライブラリの製造について説明するものである。Ａ．インフルエンザ菌ＤＬ６３−λＺＡＰライブラリインフルエンザ菌ＤＬ６３染色体ＤＮＡのＴＥ液１００μｇをゲージ２５の針を有する１ｍＬ注射器中で機械的に剪断した。剪断されたＤＮＡに水を加えて最終容量４０５μＬとし、１０×Ｓ１ヌクレアーゼ緩衝液（２ＭＮａＣｌ、５００ｍＭＮａＯＡｃ、ｐＨ４．５、１０ｍＭＺｎＳＯ₄、５％グリセロール）４５μＬおよび１００Ｕ／μＬのＳ１ヌクレアーゼ１．７μＬを加え、３７℃で１５分間インキュベーションすることで平滑末端とした。サンプルをフェノール／クロロホルムで１回およびクロロホルムで１回抽出し、エタノール１ｍＬを加えてＤＮＡを沈殿させた。サンプルを氷上で１０分間または−２０℃で終夜インキュベーションし、微量遠心装置で３０分間遠心することで、ＤＮＡを回収した。ＤＮＡを７０％エタノールで洗浄し、乾燥した。ＤＮＡ配列のＥｃｏＲＩ部位を標準的な方法を用いてメチル化した。このメチル化ＤＮＡに、１００ｍＭＭｇＣｌ₂５μＬ、ｄＮＴＰ混合液（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰを各２．５ｍＭ）８μＬおよび５Ｕ／μＬのクレノウ（Klenow）４μＬを加えた。混合物を１２℃で３０分間インキュベーションした。ＳＴＥ（０．１ＭＮａＣｌ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）４５０μＬを加え、混合物をフェノール／クロロホルムで１回、クロロホルムで１回抽出し、エタノール１ｍＬを加えてＤＮＡを沈殿させた。サンプルを氷上で１０分間または−２０℃で終夜インキュベーションした。微量遠心装置で３０分間遠心することで、ＤＮＡを回収し、７０％エタノールで洗浄し、乾燥した。ＤＮＡをＴＥ７μＬに再懸濁させ、その液にリン酸化ＥｃｏＲＩリンカー（２００ｎｇ／μL）１４μＬ、１０×連結緩衝液３μＬ、１０ｍＭＡＴＰ３μＬ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（４Ｕ／μＬ）３μＬを加えた。サンプルを４℃で終夜インキュベーションし、６８℃で１０分間インキュベーションして、リガーゼを失活させた。この混合物に、Ｈ₂Ｏ２１８μＬ、１０×ユニバーサル緩衝液（Un iversal buffer）４５μＬおよび３０Ｕ／μＬのＥｃｏＲＩ７μＬを加えた。３７℃で１．５時間インキュベーションした後、０．５ＭＥＤＴＡ１．５μＬを加え、混合物を氷冷した。ＤＮＡをショ糖勾配で分子量分別し、６〜１０ｋｂのＤＮＡを含む分画を蓄積した。蓄積ＤＮＡをエタノールで沈殿させ、ＴＥ緩衝液５μＬに再懸濁させた。挿入ＤＮＡ２００ｎｇを、最終容量５μＬでＺＡＰＩＩベクター１μｇで、４ ℃にて２〜３日間連結反応させた。連結混合物をパッケージ化し（Gigapack II Gold(Stratagene)使用）、ＮＺＹプレートの大腸菌ＳＵＲＥ細胞で平板培養した。ライブラリの力価測定を行い、増幅し、０．３％クロロホルム下に４℃で保管した。Ｂ．インフルエンザ菌Ｅａｇａｎ−ｐＵＣライブラリ実施例１Ｃの方法によってインフルエンザ菌Ｅａｇａｎから得た染色体ＤＮＡをＳａｕ３ＡＩによって２分間、５分間および１０分間消化し、サンプルについて分取アガロースゲルで電気泳動を行った。長さ約３〜１０ｋｂのＤＮＡ断片を有するゲルスライスを切り取り、標準的冷凍−解凍法によってＤＮＡを抽出した。ｐＵＣ８：２（多重クローニング部位での別のＢｇｌＩＩおよびＸｂａＩ制限酵素部位を有するｐＵＣ８）からのプラスミドＤＮＡをＢａｍＨＩおよびＢｇｌＩＩで消化し、ウシアルカリホスファターゼ（ＣＡＰ）で脱リン酸化を行った。インフルエンザ菌ＥａｇａｎＤＮＡの断片をｐＵＣに連結し、その混合物を用いて、大腸菌ＪＭ１０９細胞の形質転換を行った。Ｃ．インフルエンザ菌Ｅａｇａｎ−λＺＡＰライブラリ実施例１Ｂに記載の方法に従って得られたインフルエンザＥａｇａｎからの染色体ＤＮＡを、ＥｃｏＲＩによって消化し、分取アガロースゲルで分子量分割を行った。７〜２３ｋｂのＤＮＡ断片に相当するゲルスライスを切り取り、ＤＮＡを、ＴＡＥ（４０ｍＭトリス酢酸塩、１ｍＭＥＤＴＡ）３ｍＬの入った透析管中、１４Ｖで終夜電気泳動を行った。連結混合物をパッケージ化し（Gagapack I I包装キット（Stratagene））、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞で平板培養した。そのライブラリの力価を測定し、増幅し、０．３％クロロホルム下に４℃で保存した。Ｄ．ＥＭＢＬ３ライブラリ実施例１Ｃの方法によってインフルエンザ菌ＭｉｎｎＡ染色体ＤＮＡ（１０μ ｇ）を得て、それをＳａｕ３ＡＩ（４０単位）によって２分間、４分間および６分間消化し、ＴＮＥ（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、５ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８）緩衝液中１０〜３０％ショ糖勾配で分子量分別を行った。５ｋｂより大きいＤＮＡ断片を有する分画を蓄積し、沈殿させた。第２の実験で、染色体ＤＮＡ（２．６μｇ）をＳａｕ３ＡＩ（４単位）によって１分間、２分間および３分間消化し、分取アガロースゲル電気泳動で分子量分別を行った。１０〜２０ｋｂのＤＮＡ断片を有するゲルスライスを切り取り、ＤＮＡを、標準的な冷凍／解凍法によって抽出した。これら２つの実験からの分子量分別ＤＮＡを蓄積して、ＥＭＢＬ３（Promega）のＢａｍＨＩアーム（arm）による連結に供した。連結混合物をパッケージ化し（Gagapack IIパッケージキット（Stratagene ）使用）、大腸菌ＬＥ３９２細胞で平板培養した。そのライブラリの力価を測定し、増幅し、０．３％クロロホルム下に４℃で保存した。実施例１Ｃの方法によって得たインフルエンザ菌ＰＡＫ１２０８５またはＳＢ３３からの染色体ＤＮＡをＳａｕ３ＡＩ（０．５単位／１０μｇＤＮＡ）によって３７℃で１５分間消化し、アガロースゲル電気泳動によって分子量分別を行った。１５〜２３ｋｂのＤＮＡ断片に相当するゲルスライスを、１４Ｖで、ＴＡＥ３ｍＬの入った透析管中で、終夜電気溶離した。ＤＮＡを２回沈殿させ、水に再懸濁してから、ＥＭＢＬ３ＢａｍＨＩアーム（Promega）で終夜連結を行った。連結混合物を、製造業者の説明に従ってラムダ（Lambda）in vitroパッケージキット（Amersham）を用いてパッケージ化し、大腸菌ＮＭ５３９細胞で平板培養した。そのライブラリの力価を測定し、増幅し、０．３％クロロホルム存在下に４℃で保存した。実施例３この実施例は、ライブラリのスクリーニングについて説明するものである。Ａ．インフルエンザＤＬ６３−λＺＡＰ発現ライブラリＴｂｐ１およびＴｂｐ２蛋白を、固相ヒトトランスフェリン（ｈＴｆ）でアフィニティ精製した。すなわち、２０ｍＬのｈＴｆ−セファロースカラムを、ＣＮＢｒ活性化セファロース（Sigma）への蛋白リガンドの結合についての製造業者のプロトコールに従って得た。得られた基材を、カラムの３倍容量の５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ＭＮａＣｌ、６Ｍグアニジン−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で洗浄して、共有結合的に結合していないｈＴｆを除去した。カラムを５０ｍＭトリス −ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で平衡とし、クエン酸ナトリウムおよび重炭酸ナトリウムをそれぞれ１００ｍＭで含有するｐＨ８．６の緩衝液に入った１０ｍｇ／ｍＬのＦｅＣｌ₃１ｍＬと、次に２倍カラム容量の５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ＭＮａＣｌ（ｐＨ８．０）を用いて、結合したｈＴｆに鉄負荷を行った。総細菌膜（総蛋白３００ｍｇ）を、前述のような（Schryvers et al.，1989）鉄欠乏培地で成長させたインフルエンザ菌株ＤＬ６３から得た。膜を５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ＭＮａＣｌ（ｐＨ８．０）で２ｍｇ／ｍＬまで希釈し、ＥＤＴＡを１５ｍＭまで、サルコシルＬ９７を１．５％まで加えることで可溶化した。４００００ ×ｇで１時間遠心した後、上清をｈＴｆカラムに負荷し、カラムを１０倍カラム容量の５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ＭＮａＣｌ、１０ｍＭＥＤＴＡ、０．５％サルコシル（ｐＨ８．０）で洗浄した。受容体蛋白を２ＭＧｎＨＣｌの同じ緩衝液の溶液を用いて溶離し、溶出分画を２５ｍＭ重炭酸アンモニウム緩衝液に対して強力に透析し（緩衝液を５回交換）、凍結乾燥し、−２０℃で保存した。単離した蛋白を用いて、標準的方法にて、ニュージーランドホワイトラビットでトランスフェリン受容体特異的抗血清を得た。すなわち、最初の注射では完全フロイントアジュバントを用い、次の注射では不完全フロイントアジュバントを用いて、２週間の間隔を設けて、皮下注射にてウサギを３回免疫感作した。ＤＬ６３ λＺＡＰライブラリを大腸菌ＳＵＲＥ細胞で平板培養し、溶菌斑を、１０ｍＭＩＰＴＧに予め浸漬しておいたニトロセルロース膜に移して、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔｌａｃＺプロモータからの発現を誘発した。０．５％スキムミルクの５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１５０ｍＭＮａＣｌ（ｐＨ７．５）溶液を用いてフィルターを遮断してから、ポリクローナル抗ＴｆＲ抗血清および西洋ワサビペルオキシダーゼ接合ヤギ抗ウサギＩｇＧで調べた。溶菌斑を３回のスクリーニングによって精製し、組換えｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミド（ｐＢＨＩＴ１およびｐＢＨＩＴ２；図１Ａおよび２）を、in vivo切除法（Short et al .，1988）によって回収した。Ｂ．Ｅａｇａｎ、ＭｉｎｎＡおよびＰＡＫ１２０８５非発現ライブラリ（ｉ）インフルエンザ菌Ｅａｇａｎ−ｐＵＣライブラリのスクリーニング標準的方法を用いて、ニトロセルロース上のコロニー回収を行い、図２に示したトランスフェリン受容体遺伝子の５’ｐＢＨＩＴ２プローブを用いてフィルターを調べた。プローブは製造業者の説明に従って、ジゴキシゲニン（ｄｉｇ、Bo ehringer Mannheim）によって標識した。いくつかの推定クローンをニトロセルロース上にドットブロッティングし、同じ５’ｐＢＨＩＴ２プローブを用いて２回目のスクリーニングを行った。第２回の推定物を、制限酵素マッピングによって分析し、クローンＳ−４３６８−３−３（図１Ｂ、図２）を配列分析用に選択した。（ｉｉ）インフルエンザ菌Ｅａｇａｎ−λＺＡＰライブラリのスクリーニング標準的方法により、ＬＢプレートおよび０．７％アガロース被覆層を用いて、ファージライブラリをＸＬＩＢｌｕｅ細胞（Stratagene）で平板培養した。溶菌斑を、標準的なプロトコールを用いてニトロセルロースに取り、フィルターを減圧下に８０℃で２時間加熱して、ＤＮＡを固定した。トランスフェリン受容体遺伝子（図２）の５’ｐＢＨＩＴ２プローブをジゴキシゲニンで標識し、フィルターを４２℃で４時間予備ハイブリッド形成し、４２℃で標識プローブで終夜ハイブリッド形成した。フィルターを６８℃で洗浄し、オートラジオグラフィー後に、いくつかの溶菌斑を選択して、第２のスクリーニングに供した。第２回の推定物からのプラスミドＤＮＡのin vivoでの切り取りを、λＺＡＰ系（Promega）に添付のプロトコールに従って行った。同じ約２．５ｋｂのＥｃｏＲＩ挿入物との４つのクローンを得た。そのうちのＪＢ−９０１−５−３の例が図２の図Ｂにある。推定溶菌斑は増幅も行い、ファージＤＮＡを培地５００ｍＬから精製した。挿入物ＤＮＡを、ＸｂａＩによる消化によって切り取り、ＸｂａＩで消化し、脱リン酸化しておいたｐＵＣ８：２（多重クローニング部位に別のＢｇｌＩＩおよびＸｂａＩ部位を有するｐＵＣ８）にクローニングした。クローンＪＢ− ９１１−３−２（図１７）には、インフルエンザ菌ＥａｇａｎＴｆＲオペロンの３’側半分を有する。（ｉｉｉ）ＥＭＢＬの３つのライブラリのスクリーニングインフルエンザ菌ＭｉｎｎＡライブラリを、０．７％上層アガロースを含むＮＺＣＹＭを被覆として用いて、ＮＺＣＹＭプレートのＬＥ３９２細胞で平板培養した。ニトロセルロースフィルター上の溶菌斑回収を、標準法に従って行い、フィルターを処理し、ジゴキシゲニンで標識した５’ｐＢＨＩＴ２プローブ（図２）を用いて調べた。推定溶菌斑を平板培養し、同じ手順を用いて第２回のスクリーニングを行った。ファージＤＮＡを標準的方法によって培地５００ｍＬから得て、ＤＮＡ挿入物をＳａｌＩによる消化によって切り取り、ｐＵＣにクローニングして、クローンＪＢ−１０４２−７−６（図１Ｄおよび２）を得た。インフルエンザ菌ＳＢ３３ライブラリを、０．７％アガロースを含むＮＺＣＹＭを被覆として用いて、ＮＺＣＹＭプレートのＬＥ３９２細胞で平板培養した。溶菌斑をニトロセルロースフィルターで回収し、フィルターを処理し、ジゴキシゲニン標識５’ｐＢＨＩＴ２プローブ（図２）を用いて調べた。推定溶菌斑を平板培養し、同じ手順を用いて第２回のスクリーニングを行った。ファージＤＮＡを標準的方法によって培地５００ｍＬから得て、ＤＮＡ挿入物をＳａｌＩによる消化によって切り取り、ｐＵＣにクローニングして、クローンＪＢ−１０３１ −２−９（図２）を得た。実施例４本実施例は、ＴｆＲオペロンのＴｂｐ１およびＴｂｐ２遺伝子の配列決定を説明するものである。クローンｐＢＨＩＴ１、ｐＢＨＩＴ２、Ｓ−４３６８−３−３、ＪＢ−９０１ −５−３、ＤＳ−７１２−１−３、ＪＢ−１０４２−７−６およびＪＢ−１０３１−２−９からのプラスミドＤＮＡを、標準的方法を用いて得た。長さ１７〜２５塩基のオリゴヌクレオチド配列決定プライマーを、ＡＢＩ３８０Ｂ型ＤＮＡ合成装置で合成し、ＯＰＣカートリッジ（Applied Biosystems Inc.から入手。製造業者のプロトコールに従って使用）を用いるクロマトグラフィーによって精製した。ＤＬ６３株からのＴｆＲオペロンの配列を図３に示してあり、Ｅａｇａｎ株のものを図４に、ＭｉｎｎＡ株からのものを図５に、ＰＡＫ１２０８５株のものを図６に、ＳＢ３３のものを図７に示した。実施例５この実施例は、分類できないインフルエンザ菌株ＳＢ１２、ＳＢ２９、ＳＢ３０およびＳＢ３２からのｔｂｐ２遺伝子のＰＣＲ増幅を説明するものである。上記の方法に従って、インフルエンザ菌株ＳＢ１２、ＳＢ２９、ＳＢ３０およびＳＢ３２からの染色体ＤＮＡを得た。ｔｂｐ２とそれに続いてｔｂｐ１（図１２Ａおよび１２Ｂ参照）を有するオペロンとしてＴｆＲ遺伝子を配置した。ｔｂｐ２の５’末端およびｔｂｐ１コード配列の５’末端の逆補体にオリゴヌクレオチドを合成した。プライマーは、Ｔｂｐ２のリーダー配列からのMKSVPLISGS（配列番号：１４７）に相当するGGATCCATATGAAATCTGTACCTCTTATCTCTGGT（配列番号：１２０）およびＴｂｐ１のリーダー配列MTKK（配列番号：１３８）の逆補体であって遺伝子間配列の一部であるTCTAGAAGCTTTTTTAGTCATTTTTAGTATTCCAT（配列番号：１３７）であった（図１２Ａおよび１２Ｂ）。１０ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ塩化カリウムおよび１．５ｍＭ塩化マグネシウムを含む緩衝液でＰＣＲ増幅を行った。反応混合物各１００μＬには、染色体ＤＮＡ５ｎｇ、各プライマー１μｇ、アンプリタク（amplitaq）ＤＮＡポリメラーゼ（Perk in Elmer Cetus）５単位および０．４ｍＭのｄＮＴＰ（Perkin Elmer Cetus）を含有させた。繰り返し条件は、９４℃で１．０分、４５℃で２．０分間、７２℃ で１．５分間を２５回とした。特異的２ｋｂ断片を各サンプルについて増幅した（図１３）。Ｔｂｐ２遺伝子の増幅に使用した染色体ＤＮＡは、列１がＳＢ３３、列２がＳＢ１２、列３がＳＢ２９、列４がＳＢ３０、列５がＳＢ３２であった。断片をＴＡクローニングベクター（Invitrogen）にクローニングし、そのヌクレオチド配列を求めた。株ＳＢ１２（配列番号：１０８）、ＳＢ２９（配列番号：１１０）、ＳＢ３０（配列番号：１１２）およびＳＢ３２（配列番号：１１４）からのＴｂｐの核酸配列をそれぞれ、図８、９、１０および１１に示してある。実施例６本実施例は、トランスフェリンのアミノ酸配列の比較と、二次構造分析によるトランスフェリン受容体蛋白の露出エピトープの確認について説明するものである。図１４について説明すると、インフルエンザ菌ｂ型Ｅａｇａｎ、ＤＬ６３、分類できないインフルエンザ菌株ＰＡＫ１２０８５およびＳＢ３３、髄膜炎菌株Ｂ１６Ｂ６およびＭ９８２（Legrain et al.，1993）および淋菌ＦＡ１９（Cornel issen et al.，1992）からのＴｂｐ１のアミノ酸配列の比較を示してある。この分析から、これら全ての細菌で保存されているＴｂｐ１の領域が明らかになった。図１５について説明すると、インフルエンザ菌ｂ型Ｅａｇａｎ、ＤＬ６３、分類できないインフルエンザ菌株ＰＡＫ１２０８５、ＳＢ１２、ＳＢ２９、ＳＢ３０およびＳＢ３２、髄膜炎菌株Ｂ１６Ｂ６およびＭ９８２、淋菌ＦＡ１９ならびにアクチノバチルス（ヘモフィルス）牛肺疫菌（Gerlach et al.，1992）２０５および３７からのＴｂｐ２のアミノ酸配列の比較を示してある。この分析から、これら全ての細菌で保存されているＴｂｐ２の領域が明らかになった。蛋白の二次構造分析を、チョウ（Chou）およびファスマン（Fasman）のアルゴリズム（1978）を用いて行い、親水性／疎水性プロットを、ホップ（Hopp）のアルゴリズム（1986）を用いて行った。値は、ヘプタペプチドウィンドウの平均から誘導し、各断片の中間点でプロットした。図１６Ａには、インフルエンザ菌ｂ型ＥａｇａｎからのＴｂｐ１の予想二次構造を示してあり、図１６Ｂには、インフルエンザ菌ｂ型ＥａｇａｎからのＴｂｐ２の予想二次構造が示してある。図１６Ａおよび１６Ｂに描いた予想二次構造は、上記の方法を用いて得られたものである。しかしながら本発明者らは、二次構造がこれらの図によって正確に描けているかどうかを検証できていない。いくつかの異なる細菌からのＴｂｐ１およびＴｂｐ２蛋白の保存エピトープを、それぞれ図１４および図１５に示したような配列の位置合わせによって確認した。そのような保存エピトープの一部として以下の挙げたものがある。さらに、予想二次構造と組み合わせて、４つの保存露出エピトープがＴｂｐ１で確認され、２つがＴｂｐ２で確認された。これらは以下の通りである。上記の保存アミノ酸配列を有する蛋白、ポリペプチドまたはペプチドは、診断実施態様における検出手段として、ならびにトランスフェリン受容体蛋白を産生する細菌によって生じる疾患の検出もしくはその疾患からの予防のための免疫原として特に有用である。免疫感作を行うために、特に指定されたアミノ酸配列を、蛋白もしくはペプチドなどの免疫系に提供することができるか、あるいはサルモネラ、ＢＣＧ、アデノウィルス、ポックスウィルス、ワクチニアまたはポリオウィルスなどの生運搬媒体を使用することができる。実施例７本実施例は、大腸菌からのＥａｇａｎＴｂｐ１を発現するプラスミドＪＢ− １４６８−２９の構築を説明するものである。プラスミドＳ−４３６８−３−３（図１Ｂおよび２）およびＪＢ−９１１−３ −２（図１７）は、それぞれＥａｇａｎｔｂｐ１遺伝子の５’部分および３’ 部分を有する。図１７は、プラスミドＪＢ−１４６８−２９の構築図式を示してある。ＪＢ−１４６８−２９の構築で使用されるオリゴヌクレオチド配列を図２０に示してある（配列番号：８６および８７）。プラスミドＪＢ−１４６８−２９をエレクトロポレーションによって大腸菌株ＢＬ２１／ＤＥ３に導入して、ＪＢ−１４７６−２−１株を得た。ＪＢ−１４７６−２−１株をＹＴ培地で成長させ、標準的プロトコールに従ってＩＰＴＧで誘発した。免疫原性および他の試験のためのＴｂｐ１を得るために、ＪＢ−１４７６−２−１株を、３％グルコースを含むＮＺＣＹＭ培地で終夜成長させた。グルコースを含まない新鮮なＮＺＣＹＭ培地に１：４０接種物を加え、培地をＡ₅₇₈＝０．３まで成長させた。乳糖を１％まで加え、培地を４時間誘発した。ＪＢ−１４７６−２−１の全細胞溶解物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を図２２に示してある。列１はｔ_oでのＪＢ−１４７６−２−１（Ｔ７／ＥａｇａｎＴｂｐ１）であり、列２はｔ＝４ｈ誘発でのＪＢ−１４７６−２−１であり、列３は、２００ｋＤａ、１１６ｋＤａ、９７．４ｋＤａ、６６ｋＤａ、４５ｋＤａおよび３１ｋＤａの分子量マーカーであり、列４はｔ_oでのＪＢ−１４３７−４− １（Ｔ７／ＥａｇａｎＴｂｐ２）であり、列５はｔ＝４ｈ誘発でのＪＢ−１４３７−４−１であり、列６はｔ_oでのＪＢ−１６０７−１−１（Ｔ７／ＳＢ１２Ｔｂｐ２）であり、列７はｔ＝４ｈ誘発でのＪＢ−１６０７−１−１である。実施例８本実施例は、大腸菌からのＥａｇａｎＴｂｐ２を発現するプラスミドＪＢ− １４２４−２−８の構築を説明するものである。図１８について説明すると、インフルエンザ菌ｂ型Ｅａｇａｎからの全ｔｂｐ２遺伝子を有するプラスミドＳ−４３６８−３−３が示してある。図１８はプラスミドＪＢ−１４２４−２−８を示しており、図１９は使用したオリゴヌクレオチドを示している。プラスミドＪＢ−１４２４−２−８をエレクトロポレーションによって大腸菌株ＢＬ２１／ＤＥ３に導入して、大腸菌株ＪＢ−１４３７−４ −１を得た。ＩＰＴＧまたは乳糖による誘発で、図２２に示したように、Ｔｂｐ２を大腸菌ＪＢ−１４３７−４−１によって発現した。列１はｔ_oでのＪＢ−１４７６−２−１（Ｔ７／ＥａｇａｎＴｂｐ１）であり、列２はｔ＝４ｈ誘発でのＪＢ−１４７６−２−１であり、列３は、２００ｋＤａ、１１６ｋＤａ、９７．４ｋＤａ、６６ｋＤａ、４５ｋＤａおよび３１ｋＤａの分子量マーカーであり、列４はｔ_oでのＪＢ−１４３７−４−１（Ｔ７／ＥａｇａｎＴｂｐ２）であり、列５はｔ＝４ｈ誘発でのＪＢ−１４３７−４−１であり、列６はｔ_oでのＪＢ −１６０７−１−１（Ｔ７／ＳＢ１２Ｔｂｐ２）であり、列７はｔ＝４ｈ誘発でのＪＢ−１６０７−１−１である。実施例９本実施例は、Ｔｂｐ２配列前にリポ蛋白リーダー配列をコードするプラスミドの構築を説明するものである。Ｔｂｐ２の前にある大腸菌ｌｐｐ（配列番号：８８および８９）、ｒｌｐＢ（配列番号：９０および９１）およびｐａｌ（配列番号：９２および９３）由来のリポ蛋白リーダー配列を有するプラスミドの構築に使用したオリゴヌクレオチドを図２０に示してある。構築したプラスミドおよび得られた相当する菌株を以下の表１に示してある。実施例１０本実施例は、大腸菌からのＳＢ１２Ｔｂｐ２を発現するプラスミドＪＢ−１６００−１の構築を説明するものである。プラスミドＤＳ−１０４７−１−２（図２１）は、ＰＣＲ増幅ＳＢ１２ｔｂｐ２遺伝子を有する。このｔｂｐ２遺伝子は、ＥｃｏＲＩ制限断片に対するＮｄｅＩとして切り取られ、ｐＴ７−７発現ベクターに挿入されて、プラスミドＪＢ−１６００−１を形成している。ＢＬ２１／ＤＥ３細胞へのエレクトロポレーションによって、ＳＢ１２Ｔｂｐ２を発現する大腸菌株ＪＢ−１６０７−１ −１が得られた。ＩＰＴＧまたは乳糖による誘発で、図２２に示したように、ＳＢ１２Ｔｂｐ２を発現させた。列１はｔ_oでのＪＢ−１４７６−２−１（Ｔ７／ＥａｇａｎＴｂｐ１）であり、列２はｔ＝４ｈ誘発でのＪＢ−１４７６−２− １であり、列３は、２００ｋＤａ、１１６ｋＤａ、９７．４ｋＤａ、６６ｋＤａ、４５ｋＤａおよび３１ｋＤａの分子量マーカーであり、列４はｔ_oでのＪＢ− １４３７−４−１（Ｔ７／ＥａｇａｎＴｂｐ２）であり、列５はｔ＝４ｈ誘発でのＪＢ−１４３７−４−１であり、列６はｔ_oでのＪＢ−１６０７−１−１（Ｔ７／ＳＢ１２Ｔｂｐ２）であり、列７はｔ＝４ｈ誘発でのＪＢ−１６０７− １−１である。実施例１１本実施例は、Ｔｂｐ１およびＴｂｐ２の抽出および精製を説明するものである。Ｔｂｐ１およびＴｂｐ２の精製図式を図２３に示してある。いずれの組換え蛋白も、大腸菌における封入体として発現され、精製図式は同じである。Ｔｂｐ１については実施例７で、Ｔｂｐ２については実施例８で記載した方法に従って得られた培地５００ｍＬからの細胞を、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）５０ｍＬに懸濁させ、超音波照射によって粉砕した（１０分間３回、７０％全体効率（duty circle））。抽出物を２００００×ｇで３０分間遠心し、９５％未満で可溶性の大腸菌蛋白を含む取得上清は廃棄した。得られたペレット（図２３、ＰＰＴ₁）をさらに、０．５％トリトンＸ−１００および１０ｍＭＥＤＴＡを含む５０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）５０ｍＬに抽出した。２００００×ｇで３０分間遠心した後、残留する可溶性蛋白および膜蛋白の大部分を含む上清を廃棄した。上記の抽出後に得られた取得ペレット（図２３、ＰＰＴ₂）は、封入体を含んでいた。Ｔｂｐ１およびＴｂｐ２蛋白を、０．１％ＳＤＳおよび５ｍＭＤＴＴを含む５０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）に溶解させた。遠心後、得られた上清をさらに、０．１％ＳＤＳおよび５ｍＭＤＴＴを含む５０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）で平衡としたスーパーデックス（Superdex）２００ゲル濾過カラムで精製した。得られた分画をＳＤＳＰＡＧＥで分析し、精製Ｔｂｐ１またはＴｂｐ２を含む分画を、５０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）に対して４℃で終夜透析し、２００００×ｇで３０分間遠心した。蛋白はこの条件で可溶性を保っており、精製Ｔｂｐ１およびＴｂｐ２を−２０℃で保存した。精製工程のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を図２４に示してある。列１は、予め染色した分子量蛋白マーカーであり（１０６、８０、４９．５、３２．５、２７．５および１８．５ｋＤａ）、列２は大腸菌全細胞溶解物であり、列３は、可溶化封入体であり、列４は精製Ｔｂｐ１またはＴｂｐ２である。組換えｒＴｂｐ１およびｒＴｂｐ２の抽出および精製の別法においては、Ｔｂｐ１について実施例７で、Ｔｂｐ２について実施例８で記載した方法に従って得られた培地５００ｍＬからの細胞を、５ｍＭＡＥＢＳＦ（４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオライド）を含む５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）４０ｍＬに懸濁させ、超音波照射によって粉砕した（１０分間３回、７０％全体効率（duty circle））。抽出物を２００００×ｇで３０分間遠心し、得られたペレットをさらに、１０ｍＭＥＤＴＡおよび０．５％トリトンＸ−１００を含む５０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）４０ｍＬに室温で１時間抽出した。上記の方法に従って遠心した後、得られたペレットはｒＴｂｐ１またはｒＴｂｐ２封入体を含んでいた。次に、ｒＴｂｐ１またはｒＴｂｐ２を、６Ｍグアニジンおよび５ｍＭＤＴＴを含む５０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）に溶解させた。遠心後、得られた上清をさらに、２Ｍグアニジンおよび５ｍＭＤＴＴを含む５０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）で平衡としたスーパーデックス２００ゲル濾過カラムで精製した。得られた分画をＳＤＳＰＡＧＥで分析し、精製ｒＴｂｐ１またはｒＴｂｐ２を含む分画を蓄積した。蓄積液にトリトンＸ−１００を加えて最終濃度を０．１％とし、溶液を５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に対して４℃で終夜透析した。蛋白はこの条件で可溶性を保っており、精製ｒＴｂｐ１およびｒＴｂｐ２を４℃で保存した。実施例１２本実施例は、マウスにおける組換えＴｂｐ１およびＴｂｐ２の免疫原性試験を説明するものである。Ｂａｌｂ／ｃマウス５匹ずつの群に、ＡｌＰＯ₄存在下で（用量当たり１．５ｍｇ）、実施例１１に記載の方法で得られたｒＴｂｐ１またはｒＴｂｐ２（１μ ｇ〜１０μｇ）を、第１日、第２９日および第４３日に皮下（ｓ．ｃ．）注射した。ＥＩＡによる抗ｒＴｂｐ１および抗ｒＴｂｐ２抗体力価の分析のために、第１４日、第２８日、第４２日および第５６日に採血を行った。免疫原性試験の結果は図２５に示してある。実施例１３本実施例は、マウス血清における抗ｒＴｂｐ１および抗Ｔｂｐ２抗体の測定のためのＥＩＡ開発について説明するものである。抗ｒＴｂｐ１および抗ｒＴｂｐ２の抗体力価は基本的に、パネズッチら報告の方法（Panezutti et al.，1993）に従って求めた。微量定量ウェルを、室温で実施例１１の方法に従って得られたｒＴｂｐ１またはｒＴｂｐ２０．５μｇにて１６時間被覆し、０．１％（重量／容量）ＢＳＡのＰＢＳ液で遮断した。血清を連続希釈し、ウェルに加え、室温で１時間インキュベーションした。酉洋ワサビペルオキシダーゼに接合したヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ特異的）のアフィニティ精製したＦ（ａｂ’）₂断片を第２の抗体として用いた。テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ／Ｈ₂Ｏ₂）を用いて反応を展開し、４５０ｎｍで吸光度を測定した（参照波長として５４０ｎｍを使用。Flow Multiskan MCC微量平板読取装置）。抗血清の反応性力価は、免疫前血清サンプルで得られた値に対して吸光度に常に２倍の上昇を示す希釈度の逆数として定義した。実施例１４本実施例は、組換えＥａｇａｎＴｂｐ１による免疫感作によって得られた抗Ｔｂｐ１抗血清と各種インフルエンザ菌株との交差反応性を説明するものである。ＮＡＤおよびヘム（Harkness et al.，1992）±ＥＤＤＡを捕給したＢＨＩ培地で成長させたインフルエンザ菌株の全細胞溶解物を、ＳＤＳＰＡＧＥゲルによって分離し、ニトロセルロース膜に移し、精製組換えＥａｇａｎＴｂｐ１に対して形成したモルモット抗Ｔｂｐ１抗血清で調べた（図２６）。列１はＢＬ２１／ＤＥ３であり、列２はＳＢ１２−ＥＤＤＡであり、列３はＳＢ１２＋ＥＤＤＡであり、列４はＳＢ２９−ＥＤＤＡであり、列５はＳＢ２９＋ＥＤＤＡであり、列６はＳＢ３３−ＥＤＤＡであり、列７はＳＢ３３＋ＥＤＤＡであり、列８はＥａｇａｎ−ＥＤＤＡであり、列９はＥａｇａｎ＋ＥＤＤＡであり、列１０はカタル球菌４２２３−ＥＤＤＡであり、列１１はカタル球菌４２２３＋ＥＤＤＡであり、列１２は髄膜炎菌６０８−ＥＤＤＡであり、列１３は髄膜炎菌６０８＋ＥＤＤＡであり、列１４は組換えＥａｇａｎＴｂｐ１を発現する誘発ＪＢ−１４７６−２−１であり、列１５は分子量マーカーである。特異的な約９５ｋＤａの帯域は、インフルエンザ菌株ＳＢ１２、ＳＢ２９、ＳＢ３３およびＥａｇａｎに相当する列３、４、５、７、８および９で抗Ｔｂｐ１抗血清と反応し、約１１０ｋＤａの帯域は、カタル球菌株に相当する列１０および１１で反応し、約８０ｋＤａの帯域は、髄膜炎菌６０８に相当する列１２および１３で反応した。実施例１５本実施例は、組換えＥａｇａｎＴｂｐ２による免疫感作によって得られた抗Ｔｂｐ２抗血清と各種インフルエンザ菌株との交差反応性を説明するものである。ＮＡＤおよびヘム（Harkness et al.，1992）±ＥＤＤＡを補給したＢIIＩ培地で成長させたインフルエンザ菌株の全細胞溶解物を、ＳＤＳＰＡＧＥゲルによって分離し、ニトロセルロース膜に移し、精製組換えＥａｇａｎＴｂｐ２に対して形成したモルモット抗Ｔｂｐ２抗血清で調べた（図２７）。列１は分子量マーカーであり、列２は組換えＥａｇａｎＴｂｐ２を発現する誘発ＪＢ−１４３７−４−１であり、列３はＳＢ１２−ＥＤＤＡであり、列４はＳＢ１２＋ＥＤＤＡであり、列５はＳＢ２９−ＥＤＤＡであり、列６はＳＢ２９＋ＥＤＤＡであり、列７はＳＢ３０−ＥＤＤＡであり、列８はＳＢ３０＋ＥＤＤＡであり、列９はＳＢ３２−ＥＤＤＡであり、列１０はＳＢ３３−ＥＤＤＡであり、列１１はＳＢ３３＋ＥＤＤＡであり、列１２はＰＡＫ−ＥＤＤＡであり、列１３はＰＡＫ＋ＥＤＤＡであり、列１４はＥａｇａｎ−ＥＤＤＡであり、列１５はＥａｇａｎ＋ＥＤＤＡである。約６０〜７０ｋＤａの特異的帯域は、インフルエンザ菌株ＳＢ１２、ＳＢ２９、ＳＢ３０、ＰＡＫおよびＥａｇａｎに相当する、列３、６、７、８、１３、１４および１５における抗Ｔｂｐ２抗血清と反応性であった。実施例１６本実施例は、Ｔｂｐ２およびＴｂｐ１における保存領域に相当する合成ペプチドの合成について説明するものである。Ｔｂｐ１およびＴｂｐ２の推定アミノ酸配列をそれぞれ、図１４および１５に示してある。この比較は、上記のトランスフェリン受容体内でのアミノ酸配列保存の領域を確認するものであり、表２および表３に示したように、トランスフェリン受容体の一部を有するペプチドを合成した。そのような合成は、前記ペプチドをコードする核酸を含む組換えベクターの好適な宿主における発現または標準的なペプチド合成によって行うことができる。すなわち、ＡＢＩ４３０Ａペプチド合成装置と、製造業者推奨の条件を用いる至適化ｔ−Ｂｏｃ化学を用いてペプチドを合成し、フッ化水素酸（ＨＦ）を用いて樹脂からペプチドを剥離させた。流量２ｍＬ／分で４０分間にわたって１５〜５５％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の勾配溶離による展開を用いて、ＶｙｄａｃＣ４半分取カラム（１×３０ｃｍ）での逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって、ペプチドを精製した。生化学試験および免疫学試験で使用した合成ペプチドはいずれも、分析ＨＰＬＣによる測定で、９５％を超える純度のものであった。アミノ酸組成分析を、ウォーターズＰｉｃｏ−Ｔａｇシステムで行い、理論的組成と良好な一致があった。実施例１７本実施例は、被験動物における合成ペプチドの免疫原性について説明するものである。第０日、実施例１６に記載の方法で製造し、フロイントの完全アジュバントに乳濁させたペプチド１００μｇを筋肉注射してモルモットを免疫感作し、次に、フロイントの不完全アジュバントに乳濁させた同量のペプチドを用いて第１４日および第２８日に追加免疫を行った。第４２日に血清検体を得て、抗体力価を酵素結合抗体免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって測定した。すなわち、微量定量ウェル（Nunc-Immunoplate，Nunc，Denmark）を、特定のペプチド５００ｎｇのコーティング緩衝液（１５ｍＭＮａ₂ＣＯ₃、３５ｍＭＮａＨＣＯ₃、ｐＨ９．６）（５０μＬ）溶液で室温にて１６時間被覆した。プレートを、０．１％（重量／容量）ＢＳＡのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）液で、室温にて３０分間遮断した。抗血清を連続希釈し、ウェルに加え、室温で１時間インキュベーションした。抗血清除去後、０．１％（重量／容量）Ｔｗｅｅｎ−２０および０．１％（重量／容量）ＢＳＡを含むＰＢＳでプレートを５回洗浄した。酉洋ワサビペルオキシダーゼ（Jacjson ImmunoResearch Labs Inc.，PA）に接合したヤギ抗モルモットＩｇＧ抗体からのＦ（ａｂ’）₂を、洗浄緩衝液で希釈し（１／８０００）、微量定量プレートに加えた。室温で１時間インキュベーションした後、プレートを洗浄緩衝液で５回洗浄した。基質テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）のＨ₂Ｏ₂液（ADI，Toronto）を用いてプレートを展開し、１ＮＨ₂ＳＯ₄で反応を停止し、４５０ｎｍで光学密度を測定した（Titretek Multiskan II，Flow Labs .，Virginiaを使用）。これらのＥＬＩＳＡでは、陰性対照として、３２アミノ酸残基の２つの無関係なペプチドを含有させた。アッセイは３連で行い、各抗血清の反応性力価は、陰性対照から得られた値に対して吸光度値に常に２倍の上昇を示す希釈度として定義した。モルモットにおいて形成した抗血清は、免疫感作で使用したペプチドについて単一特異的であった。免疫感作後に得られた血清の力価を表４に示してある。本発明のペプチドは、表２および表３に示したものの１個のコピーまたはそれらの類縁体の複数のコピーを有するペプチドを有して成るものである。ペブチドはさらに、表２および表３に示したものから選択される異なるペプチドまたはそれらの類縁体を複数有することができ、好適な担体分子を含む。免疫その他の種類の結合アッセイを用いていくつかの種類のヘモフィルスを検出できることから、保存される領域からのペプチドを用いて抗体を形成することが好ましい。従って、表２および３には、診断、免疫感作および医学的治療において有用であると考えられる他のペプチドを確認するためのトランスフェリン受容体の他のいくつかの保存領域を示してある。モルモット抗ＥａｇａｎｒＴｂｐ１、抗ＥａｇａｎｒＴｂｐ２および抗ＳＢ１２ｒＴｂｐ２抗血清を用いて、Ｔｂｐ１およびＴｂｐ２蛋白の抗原性保存について、インフルエンザ菌株群のスクリーニングを行った。抗ＥａｇａｎｒＴｂｐ１抗血清を用いたウェスタンブロッティングによってスクリーニングした３３の株のうち、全てが約１００ｋＤａの反応性帯域を持っていた。抗ＥａｇａｎｒＴｂｐ２抗血清を用いたウェスタンブロッティングによってスクリーニングした８９の株のうち、８５の株が、６０〜９０ｋＤａの反応性帯域を持っていた。抗ＳＢ１２ｒＴｂｐ２抗血清を用いたウェスタンブロッティングによってスクリーニングした８６の株のうち、８２の株が、６０〜９０ｋＤａの反応性帯域を持っていた。抗ＥａｇａｎｒＴｂｐ２抗血清および抗ＳＢ１２ｒＴｂｐ２抗血清のいずれによっても認識されなかった株が１株だけあり、それは欠陥ｔｂｐＢ遺伝子を有するＮＨＴｉ株ＳＢ３３であった。これらのデータは、トランスフェリン受容体蛋白はインフルエンザ菌株で非常に高い率で保存されることを示しており、これら蛋白が抗原として、さらにはインフルエンザ菌によって生じる疾患に対する免疫感作およびそれの診断のためのワクチンなどの免疫原性組成物においてのこれら蛋白の使用を支持するものである。実施例１８本実施例は、トランスフェリン受容体の保存部分に相当するペプチドに対して形成された抗血清が、カタル球菌のトランスフェリン受容体を認識する能力について説明する。トランスフェリン受容体の保存部分に相当するペプチドでモルモットを免疫感作し、得られた抗血清については実施例１７に記載してある。カタル球菌の全細胞抽出物を、この細菌からのトランスフェリン受容体を特異的に認識するペプチド特異的抗血清で免疫ブロッティングした。Ｔｂｐ２Ｎ末端ペプチドおよびペプチドＴＢＰ２−２５で免疫感作したモルモットからの抗ペプチド抗血清は、カタル球菌からのＴｂｐ２蛋白および大腸菌のプラスミドクローンｐＢＨＩＴ２によって発現された組換えＴｂｐ２を特異的に認識した。クローンｐＢＨＩＴ２は、アミノ酸８０で開始するＴｂｐ２の切断したもの（すなわち、NKKFYSG配列番号：１０５）を発現する。従って、ｐＢＨＩＴ２からのＴｂｐ２蛋白は、第２のエピトープLEGGFYGP（ＴＢＰ２−２５）に対して形成された抗体によってのみ認識することができる。この分析から、トランスフェリン受容体間での保存配列に相当するペプチドは、全てではないが、トランスフェリン受容体を産生するほとんどの細菌を検出する上で有用であり、トランスフェリン受容体に対する免疫応答を生じさせ、そのような細菌によって生じる疾患に対する予防を行うワクチンなどの免疫原性組成物における成分として有用である。これらウサギからの血清を、配列LEGGFYGP（配列番号：７４）を組み込んだペプチドまたはインフルエンザ菌株ＤＬ６３Ｔｂｐ２に対するＥＬＩＳＡによって調べた。ＥＬＩＳＡプレートをペプチドまたは蛋白で被覆し、次に５％スキムミルクで遮断した。リン酸緩衝生理食塩水、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０および１％乾燥ミルクでの血清の連続２倍希釈液を、プレートで３７℃にて２時間インキュベーションし、その後プレートを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むリン酸緩衝生理食塩水で５回洗浄した。洗浄したプレートを、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）接合ロバ抗ウサギＩｇＧで室温にて３０分間調べ、次に０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むリン酸緩衝生理食塩水で５回洗浄した。ＨＲＰＯ基質を全てのウェルに加えて、暗所にて室温で３０分間経過させ、次に、１Ｍ硫酸５０μＬを加えて発色を停止させた。４５０ｎｍでの吸光度を測定することで、色を測定した。実施例１９本実施例は、トランスフェリン受容体を産生しないインフルエンザ菌株の形成について説明するものである。ｐＢＨＩＴ１からの挿入物の２．５５ＥｃｏＲＩ断片を、ｐＵＣ４ＫのＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングし、このベクターからＴｎ９０３カナマイシン耐性（ｋａｎ）カセットを取り出した。いずれもこの構築において特有の部位であって、ｐＵＨＩＴ１ＫＦＨおよびｐＵＨＩＡＴ１ＫＦＰ（図２８）を産生することから、このサブクローニング段階により、ｋａｎカセットを有するＨｉｎｃＩＩまたはＰｓｔＩｐＵＣ４Ｋ断片のいずれかのその後のｐＵＨＩＴ１のＨｉｎｄＩＩＩまたはＰｓｔＩ部位への挿入が容易となった。ＥｃｏＲＩによる消化によって中断された遺伝子配列を除去した後、既報の方法（Barcak et al..，19 91）に従ってＭ−ＩＶ培地を用いる形質転換によって構築物をインフルエンザ菌野生型ゲノムに導入し、２０μｇ／ｍＬカナマイシンを含有するＢＨＩＮＨ寒天で、形質転換体を選抜した。実施例２０本実施例は、トランスフェリン受容体のエピトープを発現するポリオウィルスの構築を説明するものである。ポリオウィルス１型マホーニー（Mahoney）株（ＰＶ１−Ｍ）ゲノムの塩基１１７５〜２９５６のｃＤＮＡクローンを、制限酵素ＳａｕＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断した。これらの酵素は、塩基２７５４〜２７８６を有する断片を切り取り、その断片は図２９に示したように、ＰＶ１−Ｍアミノ酸１０９４〜１１０２をコードしている。本願において本発明者らは、ポリオウィルスアミノ酸に対して４文字の符号を用いている。例えば、１０９５は、カプシド蛋白ＶＰ１のアミノ酸９５である。切り取った断片をインフルエンザ菌Ｔｂｐ２からのアミノ酸をコードする合成オリゴヌクレオチドに代えることで、ポリオウィルスおよびトランスフェリン受容体の両方のアミノ酸配列をコードする新たなハイブリッドｃＤＮＡクローンを構築した。その新たなハイブリッドｃＤＮＡクローンを制限酵素ＮｈｅＩおよびＳｎａＢＩで切断した。これらの制限酵素は、ポリオウィルス塩基２４７１〜２９５６からトランスフェリン受容体ＤＮＡ配列などのハイブリッド断片を切り取るものである。ＰＶ１−Ｍの全ゲノムの例えばｐＴ７ＸＬＤまたはｐＴ７ＣＭＣＢのようなｃＤＮＡクローンを、ＮｈｅＩおよびＳｎａＢＩで切断して、ポリオウィルス塩基２４７１〜２９５６からの断片を切り取った。次にこれを、トランスフェリン受容体ＤＮＡ配列を有するハイブリッド断片に代えて、図２９に示したように、トランスフェリン受容体アミノ酸を有するハイブリッドＢＣループをコードする塩基によって置換された塩基２７５４〜２７８６を有するＰＶ１−ＭのゲノムのハイブリッドｃＤＮＡクローンを得た。プラスミドｐＴ７ＸＬＤｐｙｐのｐＴ７ＣＭＣＢなどのｐＴ７ＸＬＤ由来のクローンは、ＰＶ１−ＭｃＤＮＡの５’末端に酵素Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのプロモータ配列を有する。既報の方法（van der Werf et al）に従って、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて、トランスフェリン受容体アミノ酸をコードする塩基などのＰＶ１−ＭｃＤＮＡのＲＮＡ転写体を得た。これらＲＮＡ転写体によるベロ細胞のトランスフェクションによって、ＰＶ１ＴＢＰ２Ａ、ＰＶ１ＴＢＰ２Ｂ、ＰＶ１ＴＢＰ２ＣおよびＰＶ１ＴＢＰ２Ｄと称される４つの生ハイブリッドウィルスが得られた。ｐＴ７ＣＭＣＢの転写物によるトランスフェクションによって、ＰＶ１ＸＬＤと称されるトランスフェクション由来の野生型ポリオウィルスが得られた（図２９）。ＰＶ１ＴＢＰ２Ａ、ＰＶ１ＴＢＰ２Ｂ、ＰＶ１ＴＢＰ２ＣおよびＰＶ１ＴＢＰ２Ｄの抗原特性を表５に示してある。これらはいずれも、配列LEGGFYGP（配列番号：７４）を組み込んだペプチドに対して形成されたモルモット抗血清によって中和され、ウィルスが抗原的に認識できる形でこの配列を発現したことを示している。この抗血清を得るために、雌モルモットを、リン酸アルミニウム（３ｍｇ／ｍＬ）で製剤したペプチド２００μｇを含む容量５００μＬのＩＭで免疫感作した。動物は第１日、第１４日、第２８日および第４２日に免疫感作し、第０日、第２８日、第４２日および第５６日に採血した。血清は第５６日の採血からのものとした。ＰＶ１ＴＢＰ２ＡおよびＰＶ１ＴＢＰ２Ｂも、インフルエンザ菌ＤＬ６３株Ｔｂｐ２に対して形成したウサギ抗血清によって中和され、少なくともこれら２つのウィルスはその蛋白に対して生じた抗体に対して認識可能な形で配列を発現していることが示された。全てのウィルスが抗ＰＶ−１血清によって中和可能であり、ポリオ中和抗原部位Ｉにおける変化がウィルスにおける他の抗原性部位にはほとんど影響しなかったことを示している。実施例２１本実施例は、ポリオウィルスハイブリッドを用いたＴｂｐ２に対する高力価抗血清の誘発について説明するものである。ウサギに、ＣｓＣｌ精製ＰＶ１ＴＢＰ２Ａを接種した（ウサギ番号４０、４１および４２）。使用したウィルスは生存ウィルスであったが、ポリオウィルスははウサギでは複製せず、認められる反応は実際には失活抗原に対する反応であることは留意すべき点である。第１日に、ウサギの背中に、ウィルスの不完全フロイントアジュバント液１μｇを皮下注射にて接種し、第１４日に、ウサギの背中に、ウィルスの不完全フロイントアジュバント液１μｇを皮下注射して追加免疫を行った。第０日（接種前採血）および第２７日にウサギから採血した。接種当たりのウィルスの用量は、２．５×１０⁸ｐｆｕであり、これはＡ₂₆₀値から求めたところ約３．０×１０¹¹ビリオンであった。各ビリオンはエピトープ６０コピーを発現することから、これはウィルス０．５ｐｍｏｌまたはLEGGFYG（配列番号：７４）エピトープ３０ｐｍｏｌに相当する。実施例２２本実施例は、インフルエンザ菌によって生じる疾患からの関連する動物モデルの予防について説明するものである。菌血症の幼若ラットモデル（Loeb et al，1987）を用いて、抗ＥａｇａｎｒＴｂｐ１および抗ＥａｇａｎｒＴｂｐ２抗血清の予防能力を評価した。ウサギまたはモルモットのいずれかに対して形成した抗ＥａｇａｎｒＴｂｐ１抗血清はこのモデルでは予防効果を示さなかったが、ウサギまたはモルモットのいずれかに対して形成した抗ＥａｇａｎｒＴｂｐ２抗血清には予防効果があった（表７）。これらのデータは、保護抗原としてのｒＴｂｐ２蛋白の使用を示すものである。組換えＴｂｐ２（ｒＴｂｐ２）の鼻咽頭コロニー形成防止能力をチンチラで求めた。インフルエンザ菌株１２を、ストレプトマイシン１０〜１００μｇ／ｍＬ含む補足ミュラー・ヒントン寒天（Mueller Hinton agar）で成長させて、自然ｓｔｒ^Rコロニーを得た。１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンに対して耐性の菌株１２をコロニー形成で使用して、鼻洗浄液からのインフルエンザ菌の特異的培養を行うことができた。ミョウバン中のｒＴｂｐ２３０μｇ、またはミョウバン中の２×１０９ｃｆｕの失活菌株１２全細胞、またはミョウバン単独のいずれかによって、第０日、第１４日および第２８日にチンチラ（３〜４ヶ月齢または１〜２歳）の免疫感作を行った。第４４日に、ケタミンＨＣｌを用いて動物に軽く麻酔を施した。ヘミンおよびニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）を補給したＢＨＩ培地に入った培養したばかりのストレプトマイシン耐性ＮＴＨｉ株１２の受動吸入（鼻孔当たり５０μＬ、動物当たり総量０．１ｍＬ）によって鼻腔内接種を行った。細菌負荷の用量は、動物当たり１×１０⁸ｃｆｕとした。鼻咽頭洗浄を、接種後第５日および第９日に実施した。無菌希釈液（希釈液：ＢＨＩ５０ｍＬ、生理食塩水１００ｍＬ、ＮＡＤ２００μｇおよび１％ヘミン２５μＬ）１ｍＬで鼻咽頭を洗浄し、反対側の鼻孔から出てくる液体を回収することで、麻酔を施したチンチラから分泌物を得た。通常は、各動物から液体５００μＬを回収し、サンプル２５μＬを、ストレプトマイシン１ｍｇ存在下にチョコレート寒天平板で平板培養した。結果を表１０に示してある。負荷後第５日および第９日の両方について、未希釈の鼻洗浄液を、ストレプトマイシン存在下に平板培養した。２つの陽性対照群（全細胞免疫感作および回復期）の数匹の動物が負荷後第５日に鼻咽頭コロニー形成が陽性であったが、第９日までにはこれら動物で、いずれの細菌も消失し、これら２群の動物において耳感染を起こした動物はなかった。そこで、ｒＴｂｐ２が、ＮＴＨｉコロニー形成に対してチンチラを部分的に保護したことが明らかである。実施例２３本実施例は、本発明の１実施態様によるトランスフェリン受容体蛋白Ｔｂｐ２の切断類縁体の形成について説明する。大腸菌によって、インフルエンザ菌Ｔｂｐ２を少量得る。塩基消去キット（Er ase-a-base kit）を用いて、ＥａｇａｎｔｂｐＢ遺伝子をその３’末端から切断した。切断遺伝子を、Ｔ７プロモータからの大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）で発現させた。図３１および表８に示したようなＴｂｐ２の多くの切断類縁体が得られた。残っている成熟ＥａｇａｎｒＴｂｐ２のパーセントを示してあり、切断クローンの発現レベルを、全長ＥａｇａｎｒＴｂｐ２クローンのものと比較した（表８）。ヒトトランスフェリン（Ｔｆ）への切断クローンの結合を、モートンらの報告（Morton and Williams，1990）に記載のアッセイを用いて測定した。データは、蛋白のカルボキシ領域の切断によって、ＥａｇａｎｒＴｂｐ２の収量を大幅に向上させることができることを示している。そのデータはさらに、トランスフェリン結合部位が、成熟ＥａｇａｎＴｂｐ２蛋白の残基３４８および４４６の間にある可能性のあることを示している（表３および図３２）。しかしながら、切断ｒＴｂｐ２におけるＴｆ結合部位の保存は、それを保護免疫原として使用する上で必要ではないと考えられる。菌血症の幼若ラットモデル（Loeb et al.，1987）を用いて、モルモットおよびウサギで形成された抗血清のトランスフェリン受容体蛋白Ｔｂｐ２の切断類縁体に対する保護能力を評価し、結果を表９に示した。動物が血液２μＬ中に＜１０ｃｆｕを有している場合、その動物は保護されたものと考えられる。開示の要旨本開示内容をまとめると、本発明は、トランスフェリン受容体蛋白の免疫原性切断類縁体をコードする精製・単離核酸分子およびその切断類縁体、特にはＴｂｐ２を提供するものである。その核酸分子および切断類縁体は、診断、免疫感作および診断・免疫感作試薬の形成において有用である。発現組換え切断Ｔｂｐ２に基づくワクチンを製造して、トランスフェリン受容体を産生する病原菌によって生じる疾患の予防を行うことができる。本発明の範囲内においての変更は可能である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ハークネス、ロビンイー. カナダ国エム２ケー１ビー８オンタリオ州ウイロウデイルシェパードアヴェニューイースト 640 アパートメント 1706番 (72)発明者シュライヴァーズ、アンソニービー. カナダ国ティー３エー３ヴイ８アルバータ州カルガリーエヌ．ダブリュ. エドフォースロード 39 (72)発明者チョン、ペレカナダ国エル４シー０ビー９オンタリオ州リッチモンドヒルエストリルストリート 32 (72)発明者グレイ−オーエン、スコットカナダ国ティー３ビー５エイチ４アルバータ州カルガリーエヌ．ダブリュ．シルヴァーグローヴドライヴ 2210 −142 (72)発明者ヤン、ヤン−ピンカナダ国エム２アール３エヌ７オンタリオ州ウイロウデイルトレスデイルアヴェニュー 120 アパートメント 1709 (72)発明者マーディン、アンドリューディー. カナダ国エル３エックス１ヴイ２オンタリオ州ニューマーケットローデスサークル 146 (72)発明者クライン、マイケルエイチ. カナダ国エム２ピー１ビー９オンタリオ州ウイロウデイルムンロブールヴァード 16

Claims

【特許請求の範囲】１．ヘモフィルス株のトランスフェリン受容体蛋白の免疫原性切断類縁体をコードする精製・単離核酸分子。２．前記切断類縁体が、トランスフェリン受容体蛋白のＣ末端から切断されている請求項１記載の核酸分子。３．ヘモフィルス株の切断Ｔｂｐ２蛋白のみをコードする請求項２記載の核酸分子。４．インフルエンザ菌ｂ型のＥａｇａｎ株について図３１に示した切断Ｔｂｐ２蛋白または別のヘモフィルス株からの等価な切断Ｔｂｐ２蛋白をコードする請求項３記載の核酸分子。５．ヘモフィルス株のトランスフェリン受容体蛋白の免疫原性切断類縁体をコードする精製・単離核酸分子であって、前記核酸分子が、（ａ）図３、４、５、６、７、８、９、１０もしくは１１（配列番号：１、２、３、４、１０５、１０８、１１０、１１２、１１４）に示したＤＮＡ配列のいずれかまたは該配列のいずれかの相補的ＤＮＡ配列（ｂ）図３、４、５、６、７、８、９、１０、１１もしくは３１（配列番号：５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１０６、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５）に示したアミノ酸配列のいずれかをコードするＤＮＡ配列または該配列に対する相補的ＤＮＡ配列；ならびに（ｃ）（ａ）または（ｂ）で定義されるＤＮＡ配列のいずれかに対して厳しい条件下にハイブリッド形成するＤＮＡ配列から成る群から選択される切断型ＤＮＡ配列である核酸分子。６．（ｃ）で定義のＤＮＡ配列が、（ａ）または（ｂ）で定義のＤＮＡ配列のいずれかと約９０％以上の配列一致率を有する請求項５記載の核酸分子。７．宿主の形質転換を行うための発現ベクターであって、請求項１または５記載の核酸分子ならびに前記核酸分子に有効に結合して宿主にヘモフィルス株のトランスフェリン受容体蛋白の前記免疫原性切断類縁体を発現させる発現手段とを有してなる発現ベクター。８．前記免疫原性切断類縁体を発現する表８のクローンのいずれかから選択される請求項７記載の発現ベクター。９．請求項７記載の発現ベクターを有する形質転換宿主。１０．請求項９記載の形質転換宿主によって産生可能なトランスフェリン受容体蛋白の組換え免疫原性切断類縁体。１１．ヘモフィルス株の免疫原性切断Ｔｂｐ２蛋白。１２．Ｃ末端から切断されている請求項１１記載のＴｂｐ２蛋白。１３．インフルエンザ菌ｂ型のＥａｇａｎ株について図３１に示した切断蛋白のいずれか、または別のヘモフィルス株からの等価な切断Ｔｂｐ２蛋白である請求項１２記載のＴｂｐ２蛋白。１４．（Ａ）ヘモフィルス株のトランスフェリン受容体蛋白の免疫原性切断類縁体をコードする精製・単離核酸分子；（Ｂ）ヘモフィルス株のトランスフェリン受容体蛋白の免疫原性切断類縁体をコードする精製・単離核酸分子であって、前記核酸分子が、（ａ）図３、４、５、６、７、８、９、１０もしくは１１（配列番号：１、２、３、４、１０５、１０８、１１０、１１２、１１４）に示したＤＮＡ配列のいずれかまたは該配列のいずれかの相補的ＤＮＡ配列（ｂ）図３、４、５、６、７、８、９、１０、１１もしくは３１（配列番号：５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１０６、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５）に示したアミノ酸配列のいずれかをコードするＤＮＡ配列または該配列に対する相補的ＤＮＡ配列；ならびに（ｃ）（ａ）または（ｂ）で定義されるＤＮＡ配列のいずれかに対して厳しい条件下にハイブリッド形成するＤＮＡ配列から成る群から選択される切断型ＤＮＡ配列である核酸分子；（Ｃ）（Ａ）または（Ｂ）で定義の核酸分子ならびに前記核酸分子に有効に結合して宿主にトランスフェリン受容体蛋白の組換え免疫原性切断類縁体を発現させる発現手段とを有してなる発現ベクターを有する形質転換された宿主で産生可能なトランスフェリン受容体蛋白の組換え免疫原性切断類縁体；（Ｄ）ヘモフィルス株の１以上の免疫原性切断Ｔｂｐ２蛋白；（Ｅ）トランスフェリン受容体蛋白の免疫原性切断類縁体の宿主への運搬のための生ベクターであって、（Ａ）または（Ｂ）の核酸分子を有するベクターを有してなる生ベクター；からなる群から選択される１以上の活性成分、ならびに該活性成分用の医薬的に許容される担体を有してなり、前記１以上の活性成分が宿主への投与時に免疫応答を起こすものである免疫原性組成物。１５．トランスフェリン受容体を産生する病原菌によって生じる疾患に対する保護を誘発する方法において、感受性宿主に有効量の請求項１４記載の免疫原性組成物を投与する段階を有する方法。１６．ヘモフィルス株の免疫原性切断Ｔｂｐ２蛋白の製造方法において、制御配列に有効に結合したヘモフィルス株の免疫原性切断Ｔｂｐ２蛋白をコードする核酸分子を有してなる発現ベクターを構築する段階；前記発現ベクターを宿主に導入する段階；ならびに宿主から、免疫原性切断Ｔｂｐ２蛋白を発現させる段階を有してなる方法。１７．前記発現ベクターが、表８に示した発現ベクターのいずれかである請求項１６記載の方法。