JPH11506449A

JPH11506449A - 誘導物質としての結合組織増殖因子の使用および方法

Info

Publication number: JPH11506449A
Application number: JP8536723A
Authority: JP
Inventors: グロテンドースト，ゲーリー，アール．
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1995-06-02
Filing date: 1996-05-31
Publication date: 1999-06-08
Also published as: AU720268B2; EP0831885A4; AU722919B2; EP0831903A4; EP0831903B1; JPH11507332A; EP0831903A1; EP0831885A1; JP2007051150A; CA2222609A1; JP2004132974A; BR9608558A; US6150101A; CA2222509C; MX9709294A; AU5958296A; US6069006A; WO1996038172A1; CN1195295A; ATE464067T1

Abstract

(57)【要約】本発明は、骨、軟骨および皮膚を含めた結合組織の形成を誘導するために、結合組織増殖因子を単独で、または他の増殖因子、組成物もしくは化合物とともに、投与することに関係した新規な方法および組成物に係わるものである。

Description

【発明の詳細な説明】誘導物質としての結合組織増殖因子の使用および方法本明細書に開示する情報は、一部は、米国立衛生研究所から授与された認可番号GM 37223のもとで政府の支援により得られたものである。米国政府は本明細書に開示した発明に対しいくらかの権利を有する。１．関連出願の説明本出願は、1991年８月30日付けの米国特許出願第07/752,427号（放棄）の継続出願である、1993年12月14日付けの米国特許出願第08/167,628号（米国特許第5, 408,040 号として認可）の分割出願である、「結合組織増殖因子」と題する1995 年２月10日付けの米国特許出願第08/386,680号の一部継続出願である、同一の発明の名称を有する1995年６月２日付けの米国特許出願第08/459,717号の一部継続出願である。２．発明の利用分野本発明は一般的に増殖因子の分野に関し、さらに特定すると、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）およびその使用方法に関する。３．発明の背景Ａ．骨および軟骨の形成における増殖因子の役割骨および軟骨の形成：１個の受精卵から発生する全ての多細胞生物の組織および器官の形成には、分化していない幹細胞からの特殊な細胞型への分化が必要である。胚形成が進行するにつれて、より高度に特殊化した細胞型および複雑な構造が形成される。しかし、現在のところ、ヒトを含めた脊椎動物の骨格または軟骨形成に関与する特定の因子の同定またはこれら因子の作用メカニズムに関する具体的な情報はほとんど入手できない。哺乳動物系における骨形成には主に２つのタイプがある。すなわち、結合組織性骨化と軟骨内骨化である。頭蓋骨の形成が結合組織性骨化の例である。そこでは、神経冠由来の間葉細胞が頭蓋の上皮細胞の細胞外マトリックスと相互作用して骨を形成する(Hall，Amer．Sci.，1988，76174-181)。間葉細胞が結集して小島になり、骨芽細胞と毛細管に分化する。この骨芽細胞はカルシウム塩と結合することができる特殊なタイプの細胞外マトリックス（骨様）を分泌する。軟骨内骨化は体軸骨格（腕および脚）の長骨および脊椎と肋骨が形成される過程である（Hall，前掲）。この過程の間に、骨の形成が軟骨組織中間段階を経て起こる。哺乳動物では、長骨が胚肢芽のいくつかの間葉細胞から形成される。これらの細胞は軟骨細胞を形成し、軟骨質マトリックスを分泌する。その他の周囲の間葉細胞は軟骨膜（最終的には、骨膜）を形成する。幾つかの場合には、軟骨細胞が増殖および形成されつつある領域に隣接している軟骨細胞が肥大軟骨細胞に分化する。肥大軟骨細胞は異なるタイプのマトリックスを産生し、それらの組織の方向性を骨端軟骨を形成するように変える。骨端軟骨の構造は細胞の肥大、増殖、骨化および血管新生のゾーンから構成される多細胞柱(multiple cellular columns) に配列される(Hall，前掲; Gilbert，“Transcriptional regulation of geneex pression(遺伝子発現の転写調節)”，DEVELOPMENTAL BIOLOGY,第５版，SinaurAs soc.，p.387-390(1994))。これは、結果的に、軟骨細胞から骨芽細胞（無機化した骨を形成する）への細胞変換の漸次的移行をもたらす。軟骨内骨化は哺乳動物では小児から成体への成長の間に起こっている活発な進行中のプロセスである。間葉細胞から軟骨細胞への分化、それらの増殖および骨芽細胞による置換は増殖因子（ＴＧＦ−βファミリーを含む）とマトリックスの無機化に依存している(Tuan，1984，J．Exp．Zool．（suppl.）1:1-13(1984);Sy festad and Caplan，1984，Devel．Biol．104:348-386)。結合組織に関して、哺乳動物の全ての骨格要素は、筋肉、軟骨、骨および腱を構成する特殊な細胞型に分化する能力がある単一の幹細胞から誘導されると考えられる。これらの細胞はさらに脂肪組織への分化能もあるようである。増殖因子並びに骨および軟骨の形成に係わる関連技術：本発明以前には、増殖因子は、標的細胞を刺激してその細胞の増殖、分化、および発達しつつある組織の組織化を行わしめる一つのクラスの分泌ポリペプチドを含むことが一般に知られていた。典型的には、増殖因子の活性は特定の受容体へのその結合能に依存しており、その受容体に結合することで細胞内のシグナル伝達事象を刺激する。いくつかの明確に研究された増殖因子の例として、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ）、トランスフォーミング増殖因子 βファミリー（ＴＧＦ−β）、トランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦ−α）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）および繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）が挙げられる。軟骨細胞の増殖、分化および軟骨形成に及ぼすＴＧＦ−βの作用：ＴＧＦ−βは軟骨形成においてある役割を担っている。以前に報告されたように、ＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β２はラット胚の間葉細胞での軟骨形成を増加させ(S eyedin ら，1987，J．Biol．Chem．262: 1946-1947)、どちらのイソ型も培養下のマウス筋間葉細胞からの骨芽細胞の形成を誘導することができる（Seyedinら，1986，J．Biol．Chem．261:5693-5695）。ＴＧＦ−βをマウス胚の前軟骨様組織に適用すると、間葉細胞の分化、プロテオグリカンの生産および骨芽細胞の複製が増大する(Centrella ら，1994，Endocrine Reviews 15:27-38; Thorpand Ja kowlew，1994，Bone 15:59-64)。 in situ ハイブリダイゼーションを用いて、軟骨細胞が分化を中止する３つの別個の疾患をもつ動物の増殖プレートにおいてＴＧＦ−β３のレベルの低下が見られた。ウシの関節軟骨の器官培養では、ＴＧＦ−βの投与後にII型コラーゲンとプロテオグリカンの合成が増加した(Morales and Roberts，1988，J．Biol.Ch em．263:12828-12831)。対照的に、ＴＧＦ−βは培養軟骨様細胞においてII型およびＸ型軟骨特異的コラーゲンの発現、軟骨細胞のプロテオグリカンの合成およびアルカリホスファターゼの活性を低下させることが見いだされた(Mundy,“The effects of TGF-β on bone（骨に対するTGF-βの作用）”，Clinical Applica tions of TGF-β，1991，Wiley Chichester，Ciba Foundation Symposium 157:1 37-151)。ウサギの増殖プレートでの軟骨細胞の分化はＴＧＦ−βにより抑制されるが、増殖プレートの軟骨細胞の有糸分裂誘発は増加する(Katoら，1988，Pro c．Natl．Acad．Sci．USA85:9552-9556)。さらに、骨誘導モデルに高濃度のＴＧＦ−β１またはＴＧＦ−β２を添加すると、軟骨に有利に作用する。より少ない用量を使用するときには骨形成の方に有利に働く（Mundy, 前掲）。この明らかに相反するデータの蓄積により、軟骨形成におけるＴＧＦ− βの働きを規定する努力が妨げられてきた。骨形態形成タンパク質および骨形成：骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）と呼ばれるタンパク質のファミリーは、いくつかの哺乳動物種において異所性の骨形成を誘導することができる。メタロプロテアーゼをコードするＢＭＰ−１を除いて、これらのタンパク質は全てがＴＧＦ−βに関連した構造をもっている。しかし、存在するとしても、ＢＭＰのどれが正常な胚形成において骨形成の調節に関与しているのかは知られていない。ＢＭＰは骨格外の異所性部位で骨を誘導する因子として無機質脱落骨から最初に単離されたものである。当初は３種類のペプチドがＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２ＡおよびＢＭＰ−３として同定された（Celeste ら，1990，Proc．Natl．Acad.Sci ．USA 87:9843-9847; Kubler and Urist，1990，Clin．Orthopedics and Rel.Re s．258:279-294）。後の方の２つのＢＭＰはＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーである。その後、ＢＭＰグループの５つの密接に関連したメンバーが同定され、クローニングされた。ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６およびＢＭＰ−７はｖｇｒ／６０Ａに最も類似しており、一方ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−４はデカペンタプレジック（Decapentaplegic）に比較的類似している。ｖｇａ／６０Ａとデカペンタプレジックはどちらも背側／腹側の軸パターン形成を制御するショウジョウバエの遺伝子である(Hoffman，1992，Mol．Repro and Dev．32:173-178)。 in situ ハイブリダイゼーションによりＢＭＰの遺伝子転写が発生中の特定の時期における肢芽の骨形成領域に局在化しており、このことはＢＭＰの生理的役割を示唆する。ＢＭＰは胎児後の外膜間葉細胞を誘導して繊維形成パターンから軟骨骨形成パターンにスイッチする（Kubler and Urist，前掲）。いくつかのデータの情報から、ＢＭＰはＴＧＦ−βと相乗的に作用してin vivo で骨誘導のカスケードを開始させ得ることが示唆される。マウスの皮下脂肪組織では、ＴＧＦ −β１が大部分のＢＭＰによる異所性骨の形成を増強する。ＢＭＰ−６（ＶＧＲ −１としても知られる）はＴＧＦ−βと同時期にかつ同じ領域で肥大軟骨において発現され、Ｘ型コラーゲンの発現と関係がある（Celeste ら，前掲を参照のこと）。ＢＭＰ−２またはＢＭＰ−３で処理しておいた骨移植片にＴＧＦ−β２を添加すると、いずれかの因子を単独で用いたときと比べて、骨誘導活性が増加し、軟骨対骨の比率も増加する(Bentz ら，1991，Matrix 11:269-275)。しかしながら、ＴＧＦ−βによるこれらのタンパク質の相乗効果は普遍的なものではない。ＴＧＦ−β１はラット胎児の頭蓋冠培養物においてＢＭＰ−２の発現を直接低下させることが見いだされた（Harrisら，1994，J．Bone and Mineral Res．9:855-8 63）。ＢＭＰ−２は骨細胞の分化において重要であることが明らかであるから、ＴＧＦ−β１は軟骨芽前駆体または骨芽前駆体の分化運命をモニターするためのスイッチとして働いていると提起された。発達中の組織で発現されることがわかったその他の因子：Ｃｙｒ６１は発生中のマウス胚および胚体外組織において発現されることが判明した増殖調節物質である（O'Brien and Lau，1992，Cell Growth Differ．3:645-654）。Ｃｙｒ６１はＣＴＧＦと関係があるがＣＴＧＦとは明確に区別され、本発明以前にはＣｙｒ６１の詳しい活性は不明であった。Ｂ．損傷治癒における増殖因子の役割血小板由来増殖因子および損傷治癒：ＰＤＧＦはＡ鎖とＢ鎖から成るダイマー分子である。これらの鎖はヘテロダイマーまたはホモダイマーを形成し、これまでに単離されたあらゆる組合せは生物学的に活性である。この因子の活性に関して、ＰＤＧＦは循環している血小板のα顆粒中に存在するカチオン性の耐熱性タンパク質として特性づけられた。この分子はさらに繊維芽細胞や平滑筋細胞のような結合組織細胞のための走化性因子および分裂促進因子として特性づけられた。ＰＤＧＦの生物学的活性および損傷治癒の際のＰＤＧＦの放出のため、ＰＤＧＦはアテローム性動脈硬化症および繊維性疾患を含む結合組織の過剰生産の際に見られる病理的状態だけでなく、損傷治癒に関係した増殖因子として同定された。ＰＤＧＦ以外の増殖因子は、ヒト組織の正常な発達、増殖および修復においてある役割を担っていると推測されている。ＴＧＦ−βおよび損傷治癒：再生しつつある新しい組織の形成には、細胞増殖および組織編成の過程に関与する調節分子と構造分子の両方をもたらす各種遺伝子の協力的な調節が必要である。骨誘導の場合と同様に、ＴＧＦ−βはこの過程の中心的な調節成分を演じている。修復過程の初期に存在する血小板、マクロファージおよび好中球からＴＧＦ−βが放出される。ＴＧＦ−βは間葉細胞の増殖刺激因子として、また内皮細胞および上皮細胞の増殖抑制因子として働くことができる。ＴＧＦ−βの増殖刺激作用は、ＰＤＧＦのような増殖因子を含めて、他の遺伝子の誘導を巻き込んだ間接的なメカニズムにより媒介されているらしいことが提起された。ＴＧＦ−βスーパーファミリーのいくつかのメンバーは、癌のような細胞増殖性疾患の治療への適用可能性を示唆する活性をもっている。特に、ＴＧＦ−βは種々の細胞型の強力な増殖阻害剤であることが明らかになり（Massague，1987,C e11 49:437)、ＭＩＳはヌードマウスにおいてヒト子宮内膜癌腫の増殖を抑制することが明らかになり（Donahoe ら，1981，Ann．Surg．194:472）、そしてインヒビンは卵巣と精巣の両方の腫瘍の進行を抑制することが見いだされた(Matzuk ら，1992，Nature，360:313)。ＴＧＦ−βファミリーのメンバーの多くは組織修復の重要なメディエーターでもある。ＴＧＦ−βは新生児マウスにおいてコラーゲンの形成および血管形成応答の原因に著しい影響を及ぼすことがわかった(Roberts ら，1986，Proc．Natl. Acad．Sci.，USA 83:4167)。骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）は新たな骨増殖を誘導することができ、骨折や他の骨格欠損症の治療に有効である（Glowackiら， 1981 Lancet，1:959; Fergusonら，1988，Clin．Orthoped．Relat．Res.，227:2 65; Johnson ら，1988, Clin．Orthoped．Relat．Res.，230:257）。Ｃ．結合組織増殖因子ＰＤＧＦに関係があり、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）と呼ばれる、以前には知られていなかった増殖因子が関連特許において報告された。米国特許第5, 408,040 号を参照のこと。ＣＴＧＦは、ＴＧＦ−βによる活性化後に繊維芽細胞において選択的に誘導される、システインに富んだ分裂誘起タンパク質である(I garashiら，1993，Mol．Biol．Cell 4:637-645)。ＣＴＧＦは血清誘導遺伝子産物ｃｅｆ１０（Simmonsら，1989，Proc．Natl.Ac ad．Sci．USA 86:1178-1182)、ｃｙｒ６１（O'Brienら，1990，Mol．Cell. Biol．10:3569-3577)、fisp12/IG M1(Ryseckら，1993，Cell Growth & Differ.2 :225-233)、およびニワトリ・トランスフォーミング遺伝子ｎｏｖ(Joliot ら，1 992，Mol．Cell．Biol．12:10-21)を含むペプチドファミリーのメンバーである。また、ＣＴＧＦは胚において背側／腹側パターン形成の間の細胞の運命を決定するショウジョウバエの遺伝子産物、ねじれた原腸形成(twisted gastrulation: twg)との配列相同性を有する（Mason ら，1994，Genes & Develop．8:1489-1501 ）。上記の特許に報告されているように、ＣＴＧＦは他と区別される遺伝子の産物である。さらに米国特許第5,408,040 号に報告されているように、ＣＴＧＦは分裂促進活性を有する。in vivo でのこの分裂促進活性の最終的な結果は標的組織の増殖である。ＣＴＧＦはまた、特定分子との相互作用の結果としての、化学的に誘導される移動すなわち走化性活性を有する。この分子はＰＤＧＦと抗原的に関係があるものの、ＣＴＧＦとＰＤＧＦの間のペプチド配列相同性はあるにしてもごくわずかである。抗ＰＤＧＦ抗体はＰＤＧＦ異性体およびＣＴＧＦ分子の非還元型に対して高い親和性を有するが、生物学的活性がないこれらのペプチドの還元型に対しては１／１０の親和性しかもちあわせていない。「結合組織増殖因子−２」または「ＣＴＧＦ−２」として同定された第二のタンパク質も報告されている。ＰＣＴ出願第PCT/US94/07736号（国際公開番号WO96 /01896）を参照のこと。このＰＣＴ出願によると、ＣＴＧＦ−２も結合組織と支持組織の修復を促進するために使用することができる。結合組織増殖因子として同定されたが、ＣＴＧＦ−２は本発明のＣＴＧＦと密接な関係がない。具体的には、ＣＴＧＦファミリーは３つの明確に異なるタンパク質のグループ、すなわちＣＴＧＦ／Fisp12、ｃｙｒ６１およびｎｏｖから成る。特許請求された発明のタンパク質は第一のタンパク質グループに入り、これに対してＣＴＧＦ−２はｃｙｒ６１のグループに入る。ＣＴＧＦを含めて、さまざまなＰＤＧＦ関連増殖因子が同定されたにもかかわらず、本発明以前には、このような因子が骨および／または軟骨組織の誘導を含めてマトリックスの形成に有効な誘導物質であるということは証明されていなかった。４．発明の概要本発明は、骨および／または軟骨の形成を含めて、マトリックスおよび／または結合組織の形成が望まれる病気、障害または小疾患を治療するための新規な方法および組成物を提供する。本発明は同様に、損傷治癒の促進が望まれる病気、障害または小疾患を治療することに関する。より具体的には、本発明の組成物はＣＴＧＦおよび／またはその断片および／または誘導体（以後、総称的に「ＣＴＧＦ」という）を単独で、あるいは他の増殖因子との組み合わせで含有する。本組成物中で用いるＣＴＧＦは天然の供給源からの単離、合成的製造、または組換え遺伝子工学的手法による作製のいずれかで得ることができる。本発明の一態様において、本発明の方法は、有効量のＣＴＧＦを単独でまたは１以上の化合物と共に投与して、骨または軟骨の誘導が望まれる病気、障害または小疾患を治療することを含んでなる。この方法の好適な実施態様では、このような追加の化合物が増殖因子である。本発明のもう一つの態様において、本発明の方法は、有効量のＣＴＧＦを単独でまたは１以上の化合物（この場合も、好ましくは１以上の増殖因子）と共に投与して、損傷治癒の促進が望まれる病気、障害または小疾患を治療することを含んでなる。本発明の好適な実施態様では、ＣＴＧＦを含有する組成物を、骨または軟骨の誘導が望まれる部位上にまたは部位内に直接投与して、このような骨または軟骨の形成を誘導する。別の実施態様では、本組成物を標的化デリバリー用に製剤化するか、あるいはまた、関連部位（例えば、軟骨の形成が望まれる損傷部位）に新規組成物を放出するように設計する。いずれの場合にも、必要としている患者に投与するためにＣＴＧＦ含有組成物を適宜に製剤化する。５．定義本明細書中で用いるとき、「ＣＴＧＦ」という用語は次のことを意味する。すなわち、(1)図１Ｃに示したアミノ酸配列によりコードされるタンパク質、(2)図１Ｃに示したアミノ酸配列において１以上のアミノ酸の欠失、変異、置換または変更（誘導体）を有するアミノ酸配列によりコードされかつＣＴＧＦ活性を有するタンパク質であって、該タンパク質をコードするヌクレオチド配列がストリンジェントな条件下で図１Ｃの核酸配列にハイブリダイズすることができるタンパク質、または(3)ＣＴＧＦの断片またはその誘導体、を意味する。本明細書中で用いるとき、「誘導する」という用語は、生成する、形成する、生成させる、または形成させることを意味する。本明細書中で用いるとき、「誘導物質」という用語は、特定の最終結果の生成または形成（例えば、結合組織の生成）を引き起こすタンパク質または他の生物学的物質を含めた物質を意味する。本明細書中で用いるとき、「ポリヌクレオチド」という用語は、ＣＴＧＦをコードする構造遺伝子に隣接する非翻訳配列をコードするＤＮＡ、ｃＤＮＡおよび／またはＲＮＡを表す。例えば、本発明のポリヌクレオチドはＣＴＧＦ構造遺伝子と結合された5'調節ヌクレオチド配列および3'非翻訳配列を含む。5'および3' 非翻訳領域を含む本発明のポリヌクレオチドを図１Ｃに示す。プロモーターを含む5'調節領域を図１Ｂに示す。本発明で意図されるポリヌクレオチドのより詳細な記載は米国特許第5,408,040 号に見いだせる。本明細書中で用いるときの「ストリンジェントな条件」とは次のハイブリダイゼーション条件をさす。(1)洗浄のために低イオン強度と高温を使用する（例えば、50℃で0.015M NaCl/0.0015M クエン酸ナトリウム/0.1% SDS）、(2)ハイブリダイゼーションの間にホルムアミドのような還元剤を使用する（例えば、42℃で 0.1%ウシ血清アルブミンを含む50%(v/v)ホルムアミド/0.1% フィコール/0.1%ポリビニルピロリドン/750mM NaCl，75mM クエン酸ナトリウムを含む50mMリン酸ナトリウム緩衝液 pH6.5）、または(3)42℃で50% ホルムアミド、５×SSC(0.75M N aCl，0.075M ピロリン酸ナトリウム)，5×Denhardt溶液，音波処理サケ精子DNA( 50g/ml)，0.1% SDSおよび10% デキストラン硫酸を使用するとともに、0.2 ×SSC および0.1% SDS中42℃で洗浄する。本明細書中で用いるとき、「組換え発現ベクター」という用語は、ＣＴＧＦ遺伝子配列の挿入または組み込みにより操作された、当技術分野で公知のプラスミド、ウイルスまたは他の運搬体（ビヒクル）をさす。本明細書中で用いるとき、「治療上有効な」とは、骨もしくは軟骨の形成または損傷治癒を誘導するのに効果的なＣＴＧＦの量を意味する。６．図面の簡単な説明図１Ａは、ＣＴＧＦ遺伝子の構造がどのような編成となっているかを示す図である。エキソンは、矩形領域で示し、遺伝子中の黒色の部分は、オープン・リーディング・フレームに対応する。図１Ｂは、ＣＴＧＦプロモーターとｆｉｓｐ−１２プロモーターのヌクレオチド配列の比較を示す。同一のヌクレオチドには、＊印を付してある。TATAボックスや、他の共通配列は、その旨を付記し、影をつけてある。転写開始部位は、位置No.＋１にその旨を示唆してある。図１Ｃは、ＣＴＧＦ構造遺伝子の完全なヌクレオチド配列および想定アミノ酸配列、ならびに５’および３’の非翻訳配列を示す。図２は、新生マウスの長骨の生育プレートでのＣＴＧＦ転写物の発現に関連したinsituハイブリダイゼーション実験の結果を示す。このin situハイブリダイゼーション実験は、後述のアンチセンスＣＴＧＦＲＮＡプローブを使用することによって行った。増殖領域の軟骨細胞は、ＣＴＧＦ遺伝子の発現に対して強度に陽性であり、軟骨の成長部位でＣＴＧＦが産生されていることが示唆された。図３は、ＣＴＧＦプロモーターとβ−ガラクトシダーゼ構造遺伝子から構築された融合遺伝子を使用して構築されたトランスジェニックマウスでの、胚形成の間のＣＴＧＦ遺伝子の発現を示す。生殖系列に導入されたこの遺伝子は、ＣＴＧＦ発現部位でβ−ガラクトシダーゼを発現するので、発達中のトランスジェニック動物の切片を、β−ガラクトシダーゼ活性部位に青色を沈着させる基質Ｘ−ｇａ１に対して発現させることによって、組織化学的手段で検出することができる。パネルＡは、そうしたトランスジェニックマウスの１２日齢のマウス胚である。青色に染色された部分は、最初に形成される軟骨であるメッケル軟骨となる予定の領域である。パネルＢは、後肢ならびに脚の写真で、中足の生育プレートで、長骨の端部と脚が染色されていることを例証するものである。図４は、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２マウス胚幹細胞の培養で、軟骨ならびに骨が誘導されていることの根拠を提示する。Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞は、方法の項に記載する方法で培養した。細胞は、処理を行わないか（パネルＡ）、５−アザシトジン（パネルＢ）、５０ng/mlのＣＴＧＦ（パネルＣ）、あるいは、５−アザシトジンの後にＣＴＧＦ（パネルＤ）によって処理を行った。図５は、骨の再生部位に移植した創傷チャンバーでのＣＴＧＦ遺伝子の発現のノーザンブロット分析を示す。図６は、ヒト骨部細胞で、ＴＧＦ−βに対応してＣＴＧＦが発現されていることに関する証拠を説明する。図７Ａ−７Ｄは、軟骨形成分析の結果を説明する。図７Ａは、対照培養についての軟骨形成分析の結果を提供する。図７Ｂは、５ng/mlのＴＧＦ−β１を加えた培養についての軟骨形成分析の結果を提供する。図７Ｃは、５ng/mlのＴＧＦ−β１と１０ngのコレラ毒素を加えた培養についての軟骨形成分析の結果を提供する。図７Ｄは、５ng/mlのＴＧＦ−β１、１０ngのコレラ毒素培養、５ng/mlのＣＴＧＦを加えた培養についての軟骨形成分析の結果を提供する。図８Ａは、ＣＴＧＦのＮＲＫ細胞との結合についてのスキャッチャードプロットである。図８Ｂは、ＣＴＧＦのラット軟骨芽細胞との結合についてのスキャッチャードプロットである。７．発明の詳細な説明７．１．ＣＴＧＦの作製方法ＣＴＧＦをコードする核酸の配列本発明では、ＣＴＧＦをコードするヌクレオチド配列、あるいはその機能上の等価物を使用して、適当な宿主細胞中でこのタンパク質、あるいはその機能上の等価物の発現を誘導するような組換えＤＮＡ分子を生成することができる。また、ＣＴＧＦ配列の各種部分にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするようなヌクレオチド配列を、核酸ハイブリダイゼーション検定、サザンならびにノーザンブロット分析などに使用することもできる。さらに別の方法としては、発現ライブラリーの抗体スクリーニングを行うハイブリダイゼーション法によってＣＴＧＦをコードするＤＮＡ分子を単離し、その構造上共通な特徴を検出することもできる。遺伝コードは、その性質上縮重を有しているので、実質的に同じ、あるいは機能的に等価なアミノ酸をコードする別のＤＮＡ配列が単離され、このＤＮＡ配列が本発明の実施時にＣＴＧＦのクローニングならびに発現に使用されることもある。こうしたＤＮＡ配列としては、ストリンジェントな条件下でヒトＣＴＧＦ配列とハイブリダイズしうる配列がある。本発明で使用することのできる改変ＤＮＡ配列は、同一あるいは機能上等価な遺伝子産物をコードする配列を結果的に生じうるような、各種のヌクレオチド残基の欠失、付加、あるいは置換を含んでいる。遺伝子産物そのものも、ＣＴＧＦ配列内部のアミノ酸残基の欠失、付加、あるいは置換を、サイレントな変化を生じ、機能的に等価なタンパク質を生じるようなものであれば含んでいてよい。アミノ酸のこうした置換は、当該残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性、および／または両親媒性の性質に応じて生じさせることができる。たとえば、負に帯電したアミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸があり、正に帯電したアミノ酸としては、リシンおよびアルギニンがあり、同様の親水性の値を有する非帯電で極性の頭部基を有するアミノ酸には、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、フェニルアラニン、チロシンがある。本発明のＤＮＡ配列は、各種の目的で、タンパク質配列を改変すべく組換えを行うことができ、たとえば、遺伝子産物のプロセシングならびに発現を改善する改変を加えることができる。変異の導入は、当業界で周知の方法によって行うことができ、たとえば、制限部位を挿入する等の目的で部位依存性変異誘発を使用することができる。たとえば、酵母のような特定の発現系では、宿主細胞が遺伝子産物を過度にグリコシル化してしまう可能性があり、こうした発現系を使用する場合には、ＣＴＧＦコード配列を改変してＮ−結合グリコシル化部位を除いておくことが好ましい。ＣＴＧＦ配列は、異種配列とライゲーションさせて、融合タンパク質をコードさせるようにすることもできる。たとえば、ペプチドライブラリーをスクリーニングする際には、市販の抗体によって認識が可能な異種エピトープを発現するようなキメラＣＴＧＦタンパク質をコードさせるのが有用である。また、融合タンパク質は、ＣＴＧＦ配列と異種タンパク質配列（たとえば、ＰＤＧＦに関連した増殖因子をコードする配列）との間に切断部位が位置し、ＣＴＧＦが異種の部分から切断されうるようなものとすることもできる。ＣＴＧＦコード配列は、当業界で周知の化学的方法を使用することによって、その全体あるいは一部を合成することもできる。たとえば、Caruthersら，1980, Nucleic Acids Res．Symp．Ser．7:215-233; Crea and Horn，1980，Nucleic Ac ids Res．9(10):2331; Matteucci and Caruthers，1980，Tetrahedron Letters 21:719; ChowおよびKempe，1981，Nucleic Acids Res．9(12):2807-2817を参照されたい。また、タンパク質自体を化学的方法で生成して、ＣＴＧＦアミノ酸配列全体あるいはその一部を合成することもできる。たとえば、ペプチドを固相法によって合成し、樹脂から切断し、調製用高速液体クロマトグラフィーによって精製することができる。たとえば、Creighton,1983，Proteins，Structures And Molecular Principles，W.H．Freeman and Co.，N.Y．pp.50-60を参照されたい。合成ペプチドの組成は、アミノ酸解析あるいは配列決定によって確認することができる。たとえば、エドマン分解法については、Creighton，1983，Proteins Structures And Molecular Principles，W.H．Freeman and Co.，N.Y．pp.34-49 を参照されたい。本発明の核酸配列ならびにこの配列の識別方法についてのさらに詳細な記載については、米国特許第5,408,040号を参照されたい。なお、本明細書には、この文献を参考文献として組み込むものとする。ＣＴＧＦの発現生物学的活性を有するＣＴＧＦを発現する目的で、このタンパク質をコードするヌクレオチド配列、あるいは上述したようなその機能上の等価物を、適当な発現ベクター、すなわち、挿入を行ったコード配列の転写ならびに翻訳に必要な要素を含んでいるようなベクターに挿入した。より詳細には、ＣＴＧＦ配列ならびに適切な転写／翻訳調節配列を含む発現ベクターを構築するにあたっては、当業者に周知の方法を使用することができる。こうした方法としては、in vitroでの組換えＤＮＡ法、合成法、ならびにin viv oでの組換え／遺伝的組換え法がある。たとえば、Maniatisら，1989，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y．ならびにAusbelら，1989，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publi shing Associates and Wiley Interscience，N.Y．に記載された方法を参照されたい。ＣＴＧＦのコード配列を発現させるにあたっては、各種の宿主−発現ベクター系を使用することができ、その例としては、以下のものに限られるわけではないものの、ＣＴＧＦコード配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、あるいはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換した微生物、たとえば、細菌；組換え発現ベクターで形質転換した酵母、たとえばピキア・パストリス（Pichia pastoris）ならびにハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymor pha）；ＣＴＧＦコード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例、バキュロウイルス）に感染させた昆虫細胞系；ＣＴＧＦコード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例、カリフラワーモザイクウイルス、CaMV；タバコモザイクウイルス、TMV）に感染させた、あるいはＣＴＧＦコード配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例、Tiプラスミド）で形質転換した植物細胞系；またはＣＴＧＦコード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、ヒト腫瘍細胞（たとえばHT-1080））に感染させた動物細胞系がある。動物細胞系としては、安定的に増幅された（CHO/dhfr）、あるいは二重微小染色体中で非安定的に増幅された（例、マウス株化細胞）複数コピーのＣＴＧＦＤＮＡを含むよう組換えられた株化細胞を用いることができる。本明細書で使用する場合、「宿主−発現ベクター系」、そしてより一般的には、「宿主細胞」という用語は、この宿主細胞あるいは宿主−発現ベクター系の任意の子孫を含むものである。また、複製の間に突然変異が生じることもあるので、全ての子孫がその親細胞と同一であるとは限らないものの、そうした子孫も本発明に含まれるものと理解されたい。これらの系の発現要素は、強さや特異性がそれぞれに異なっている。発現ベクター中では、使用する宿主／ベクター系に応じ、数多くの適当な転写ならびに翻訳要素のうちの任意のもの、たとえば、定常的プロモーターあるいは誘導性プロモーターを使用することができる。たとえば、細菌系でクローニングを行う場合には、誘導性プロモーター、たとえばバクテリオファージλのｐＬ、plac、ptrp 、ptac（ptrp-lacハイブリッドプロモーター）などを使用することができ、昆虫細胞系でクローニングを行う場合には、バキュロウイルスポリヘドリンプロモーターのようなプロモーターを使用することができ、植物細胞系でクローニングを行う場合には、植物細胞のゲノムから誘導したプロモーター（たとえば、ヒートショックプロモーター、RUBISCOの小型サブユニットのプロモーター、クロロフィルa/b結合性タンパク質のプロモーター）あるいは植物ウイルスから誘導したプロモーター（たとえば、CaMVの３５ＳＲＮＡプロモーター、TMVのコートタンパク質プロモーター）を使用することができ、哺乳動物細胞系でクローニングを行う場合には、哺乳動物細胞のゲノムから誘導したプロモーター（たとえば、メタロチオネインプロモーター）あるいは哺乳動物ウイルスから誘導したプロモーター（たとえば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルスの７．５Ｋプロモーター）を使用することができ、複数コピーのＣＴＧＦＤＮＡを含む株化細胞を生成する際には、ＳＶ４０−、ＢＰＶ−、ならびにＥＢＶ−系ベクターを適切な選択性マーカーとともに使用することができる。細菌系では、発現されたＣＴＧＦの使途に応じて、数多くの発現ベクターを有利なかたちで選択することができる。たとえば、細菌中でので発現に適したベクターとしては、Rosenbergら，1987，Gene 56:125に記載されたＴ７系ベクターがある。また、大量のＣＴＧＦを生成してペプチドライブラリーをスクリーニングする場合には、精製が容易なタンパク質生成物の高レベルの発現を誘導するベクターが望ましい。こうしたベクターとしては、以下のものに限定されるものではないが、大腸菌発現ベクターpUR278（Rutherら，1983，EMBO J．2:1791）（このベクターでは、ＣＴＧＦコード配列をlacZコード配列と同一フレームにライゲーションして、ハイブリッドAS-lacZタンパク質が生成するようにすることができる）、pINベクター（InoueおよびInoue，1985，Nucleic Acids Res.13:3101-310 9; Van Heeke およびSchuster，1989，J．Biol．Chem．264:5503-5509）などがある。pGEXベクターを使用して、外来のポリペプチド、たとえばＣＴＧＦを、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）とともに発現させることもできる。こうした融合タンパク質は一般に可溶性で、グルタチオンアガロースビーズに吸着させ、その後遊離グルタチオンの存在下で溶離させることによって、破壊細胞から容易に精製することができる。pGEXベクターは、トロンビンあるいは第Ｘ a因子のプロテアーゼ切断部位を含むよう設計して、クローニングされた標的ポリペプチドがＧＳＴ部分から切断されうるようにしておく。さらに一般的には、宿主が原核細胞の場合には、指数成長後に回収し、その後ＣａＣｌ₂、ＭｇＣｌ₂ あるいはＲｂＣｌで処理しておいた細胞から、ＤＮＡを取り込みうるコンピテント細胞を調製することができる。この方法は、当業界で周知の手順を使用するものである。宿主細胞が真核細胞の場合は、各種のＤＮＡ導入法を用いることができる。こうした方法としては、リン酸カルシウム沈殿法によるＤＮＡのトランスフェクション、通常の機械的方法、たとえばマイクロインジェクション、リポソームに封入したプラスミドの挿入、あるいはウイルスベクターの使用がある。真核細胞は、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列と、選択性の表現型をコードする第２の外来ＤＮＡ分子、たとえば単純ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子とで、同時形質転換を行うこともできる。また別の方法として、真核ウイルスベクター、たとえば真猿類ウイルス４０（ＳＶ４０）あるいはウシパピローマウイルスを使用してタンパク質を発現させる方法もある。Eukaryotic Viral Vectors，1992 ，Cold Spring Harbor Laboratory，Gluzman編を参照されたい。真核宿主細胞としては、酵母、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞などがある。酵母中では、定常的あるいは誘導性プロモーターを含む各種のベクターを使用することができる。レビューに関しては、Current Protocols in Molecular Bio logy，第２巻，1988，Ausubelら編，Greene Publish．Assoc．& Wiley Intersci ence,１３章、Grantら，1987，Methods in Enzymology，WuおよびGrossman編，A cad．Press，N.Y.，153:516-544、Glover，1986，DNA Cloning,第II巻，IRL Pre ss，Wash．D.C.,３章、Bitter 1987，Heterologous Gene Expression in Yeast ，Methods in Enzymology，Berger およびKimmel編，Acad．Press，N.Y.，152:6 73-684、およびThe molecular Biology of the Yeast Saccharomyces，1982，St rathernら編，Cold Spring Harbor Press，第I、II巻を参照されたい。たとえば、酵母での外来遺伝子の発現に用いることのできる各種シャトルベクターも報告されている。Heinemannら，1989，Nature 340:205、Roseら，1987，Gene 60:237 を参照されたい。植物発現ベクターを使用する場合は、多数のプロモーターの任意のものによって、ＣＴＧＦコード配列の発現を誘導することができる。たとえば、ウイルスプロモーター、たとえばCaMVの３５ＳＲＮＡおよび１９ＳＲＮＡプロモーター（Br issonら，1984，Nature 310:511-514）、あるいはＴＭＶのコートタンパク質プロモーター（Takamatsuら，1987，EMBO J．6:307-311）を使用することができる。また、植物プロモーター、たとえばRUBISCOの小型サブユニット（Coruzziら， 1984，EMBO J．3:1671-1680、Brogilieら，1984，Science 224:838-843）、あるいはヒートショックプロモーター、たとえばダイズhsp17.5-Eあるいはhsp17.3-B （Gurleyら，1986，Mol．Cell．Biol．6:559-565)を使用することもできる。こうした構築物の植物細胞への導入は、Tiプラスミド、Riプラスミド、植物ウイルスベクター、直接的なＤＮＡ形質転換、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどを使用することによって行うことができる。こうした技術のレビューについては、たとえば、WeissbachおよびWeissbach，1988，Methods for Plant Molecular Biology，Academic Press，NY，Section VIII，pp．421-463、 GriersonおよびCorey，1988，Plant Molecular Biology,第２版.，Blackie，Lon don，７−９章を参照されたい。昆虫系では、また別の発現系を使用してＣＴＧＦを発現させることができる。こうした系の一つでは、外来遺伝子を発現させるためのベクターとして、バキュロウイルスが使用され、その結果、昆虫細胞中でウイルスが生育する。ＣＴＧＦコード配列は、ウイルスの非必須領域（たとえばポリヘドリン遺伝子）にクローニングして、バキュロウイルスプロモーターの制御下におくことができる。こうした組換えウイルスを使用して昆虫細胞を感染させ、挿入遺伝子を昆虫細胞中で発現させる。たとえば、Smithら，1983，J．Virol．46:584、Smithの米国特許第 4,215,051号を参照されたい。哺乳類宿主細胞中では、数多くのウイルス系の発現系を用いることができる。発現ベクターとしてアデノウイルスを使用する場合、ＣＴＧＦコード配列を、アデノウイルス転写／翻訳制御コンプレックス、たとえば、後期プロモータならびに三部分リーダー配列ににライゲーションし、このキメラ遺伝子を、in vitroあるいはin vivoでの組換えによってアデノウイルスのゲノムに挿入することができる。ウイルスゲノムの非必須領域（たとえば、領域E1あるいはE3）に挿入すると、感染宿主中で生存してＣＴＧＦを発現しうる組換えウイルスが得られる。たとえば、LoganおよびShenk，1984，Proc．Natl．Acad．Sci．（USA）81:3655-36 59を参照されたい。また、ワクシニア７．５Ｋプロモーターを使用することもできる。たとえば、Mackettら，1982，Proc．Natl．Acad．Sci．（USA）79:7415-7 419、Mackettら，1984，J．Virol．49:857-864、Panicaliら，1982，Proc．Natl ．Acad．Sci．79:4927-4931を参照されたい。別の実施態様では、リン酸カルシウム沈殿法ならびにネオマイシン耐性遺伝子によって安定的にトランスフェクションしておいたヒト腫瘍細胞、たとえばHT-1 080中で、ＣＴＧＦ配列を発現させる。さらに別の実施態様では、pMSXND発現ベクター等のベクターを使用して、各種哺乳動物細胞、たとえば、COS、BHK 293、ならびにCHO細胞中で発現を行う。LeeおよびNathans，1988，J．Biol．Chem．26 3:3521。挿入したＣＴＧＦコード配列の効率的な翻訳に、特定の開始シグナルが必要とされることもある。こうしたシグナルとしては、ATG開始コドンならびに隣接配列が挙げられる。ＣＴＧＦ遺伝子自体の開始コドンならびに隣接配列を含むＣＴＧＦ遺伝子全体が適切な発現ベクターに挿入されている場合には、それ以上の翻訳制御シグナルは不要である。しかし、ＣＴＧＦコード配列の一部のみが挿入されている場合には、異種由来の翻訳コントロール配列、たとえば、ATG開始コドンが存在するようにしておく必要がある。さらに、全挿入配列が確実に翻訳されるためには、開始コドンが、ＣＴＧＦコード配列のリーディングフレームと同一フェーズに存在している必要がある。こうした異種由来の翻訳制御シグナルと開始コドンは、天然、合成をとわず、各種の由来のものとすることができる。発現の効率は、適切な翻訳増強因子、翻訳ターミネーター等を含有させておくことによって増大させることができる。たとえば、Bitterら,1987，Methods in Enzymo l．153:516-544を参照されたい。また、宿主細胞の系統は、挿入配列の発現をモジュレートするか、あるいは遺伝子産物を所望の特定のかたちで修飾し、プロセシングするものを選ぶことができる。タンパク質生成物のこうした修飾（たとえばグリコシル化）ならびにプロセシング（たとえば切断）は、タンパク質の機能にとって重要でなこともあり、宿主細胞は、それぞれに、タンパク質の翻訳後のプロセシングならびに修飾のための特徴的かつ特異的なメカニズムを有している。適切な株化細胞あるいは宿主系を選択して、発現された外来タンパク質が確実に正しいかたちで修飾され、プロセシングされるようにすることができる。こうした目的に際しては、一次転写産物の適切なプロセシング、グリコシル化、遺伝子産物のリン酸化を行いうる細胞機械性状を有しているような真核宿主細胞を使用することができる。こうした哺乳動物宿主細胞としては、CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、WI38、HT -1080を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。組換えタンパク質を長期にわたって高収率で生産するうえでは、タンパク質が安定なかたちで発現されることが好ましい。たとえば、ＣＴＧＦが安定したかたちで発現される株化細胞を作出することが可能である。ウイルスの複製起点を含む発現ベクターを使用するのではなく、適切な発現制御要素（たとえば、プロモーター、エンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位等）で制御されたＣＴＧＦＤＮＡならびに選択性のマーカーで、ホスト細胞を形質転換する。外来ＤＮＡの導入後、組換え細胞を強化培養液中で１−２日生育させ、その後、選択性の培養液にとりかえる。組換えプラスミド中の選択性マーカーによって選択に対する耐性が付与されているので、細胞ではプラスミドが染色体に安定的に組み込まれ、細胞は生育してフォーカスを形成し、このフォーカスをクローニングして増やし、株化細胞とすることができる。数多くの選択系を使用することができ、たとえば、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Wiglerら，1977，Cell 11:223）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（SzybalskaおよびSzybalski，1962，Proc．Na tl．Acad．Sci．（USA）48:2026）、ならびにアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Lowyら，1980，Cell 22:817）遺伝子を、それぞれ、tk-、hgprt-、あるいはaprt-細胞中で用いることができる。また、メトトレキセートに対する耐性を付与するdhfr（Wiglerら，1980，Proc ．Natl．Acad．Sci．（USA）77:3567、O'Hareら，1981，Proc．Natl．Acad．Sci .（USA）78:1427）、ミコフェノール酸に対する耐性を付与するgpt（MulliganおよびBerg，1981，Proc．Natl．Acad．Sci．（USA）78:2072）、アミノグリコシドG-418に対する耐性を付与するneo（Colberre-Garapinら，1981，J．Mol．Biol ．150:1）、ヒグロマイシンに対する耐性を付与するhygro（Santerreら，1984， Gene 30:147）の選択の基礎として、代謝拮抗物質の抵抗性を利用することもできる。最近では、選択性遺伝子がさらに報告されており、すなわち、細胞がトリプトファンのかわりにインドールを利用することを可能とするtrpB、細胞がヒスチジンのかわりにヒスチドールを利用することを可能とするhisD（HartmanおよびM ulligan，1983，Proc．Natl．Acad．Sci．（USA）85:8047）、オルニチンデカルボキシラーゼ阻害物質２−（ジフルオロメチル）-DL-オルニチンDFMOに対する耐性を付与するODC（オルニチンデカルボキシラーゼ）（McConlogue，1987，Curre nt Communications in Molecular Biology，Cold Spring Harbor Laboratory所収）が報告されている。宿主細胞で発現された本発明のポリペプチドは、調製用クロマトグラフィーによる分離、モノクローナル抗体あるいはポリクローナル抗体を利用した免疫学的分離などの任意の通常の手段によって単離、精製することができる。７．２．ＣＴＧＦを発現するトランスフェクション細胞あるいは形質転換細胞の特定コード配列を含み、活性の遺伝子産物を発現する宿主細胞は、少なくとも４種の一般的なアプローチ、すなわち（ａ）ＤＮＡ−ＤＮＡあるいはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション、（ｂ）「マーカー」遺伝子機能の存否、（ｃ）宿主細胞中でのＣＴＧＦｍＲＮＡ転写産物の発現を利用した転写レベルの検定、ならびに（ｄ）何らかの検定法による遺伝子産物の直接の検出、あるいはその生物学的活性を利用した検出によって特定することができる。第１のアプローチでは、発現ベクターに挿入されたＣＴＧＦコード配列の存在を、ＣＴＧＦコード配列そのもの、その一部、あるいはその誘導配列とホモロジーを有するプローブを使用して、ＤＮＡ−ＤＮＡあるいはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションをによって検出することができる。第２のアプローチでは、組換え発現ベクター／宿主系の特定ならびに選択を、特定の「マーカー」遺伝子機能（例：抗生物質に対する耐性、メトトレキセートに対する耐性、形質転換の表現型、バキュロウイルスでの包合体の形成）の存否に基づいて行うことができる。たとえば、好適実施態様では、ＣＴＧＦコード配列をベクターのネオマイシン耐性マーカー遺伝子配列内に挿入し、ＣＴＧＦコード配列を含む組換え体を、マーカー遺伝子機能の不在によって検出することができる。あるいは、マーカー遺伝子をＣＴＧＦ配列と直列に配置させて、ＣＴＧＦコード配列の発現の調節に使用されているのと同一あるいは異なるプロモーターの調節下におくこともできる。誘導あるいは選択に応答してマーカーが発現されることによって、ＣＴＧＦコード配列が発現されていることが示唆される。第３のアプローチでは、ＣＴＧＦコード領域についての転写活性を、ハイブリダイゼーション検定によって調べることができる。たとえば、ＲＮＡを単離して、ＣＴＧＦコード配列あるいはその特定の一部とホモロジーを有するプローブを使用することによってノーザンブロットによって分析することができる。また、宿主の全核酸を抽出して、こうしたプローブとのハイブリダイゼーションについて調べることもできる。第４のアプローチでは、生物学的活性、あるいは免疫学的反応性を有するＣＴＧＦ遺伝子産物を検出する。ＣＴＧＦ活性の検出には数多くの検定法を使用することができ、たとえば、米国特許第5,408,040号に記載された検定法を使用することもできるが、この方法に限定されるものではない。７．３．治療適応例本発明の方法、化合物、ならびに処方は、いずれも、骨、軟骨、あるいはそれ以外にも皮膚や筋肉のような器官の結合組織の形成不全に関連した傷害、疾病、あるいは小疾患の治療、すなわち、骨あるいは軟骨を形成させることが望まれている傷害、疾病、あるいは小疾患に関するものである。こうした傷害、疾病、あるいは小疾患では、関節炎、骨粗しょう症をはじめとする骨格の傷害、過形成瘢痕、やけど、ならびに血管過形成などの各種の外傷性の損傷あるいは傷害の後に生じた軟骨あるいは骨の欠陥を修復させることになる。こうした問題は、傷害部位での繊維芽細胞、幹細胞、軟骨細胞、骨芽細胞あるいは繊維芽細胞の増殖応答が低いことに起因しているので、こうした細胞の増殖を刺激することのできる生物活性物質を加えることが有利なはずである。ＣＴＧＦのまた別の重要な使途としては、再移植にさきだって個体から取り出しておいた幹細胞あるいは軟骨細胞を増殖させるための培養系での使用が挙げられる。ＣＴＧＦは、幹細胞あるいは軟骨細胞を移植片として使用する場合でも、同様の過程で、これらの細胞の増殖、分化を促進させるために幹細胞あるいは軟骨細胞に加えることができる。ＣＴＧＦは、軟骨あるいは骨からなる移植片に、増殖を刺激する目的で移植部位で加えておくこともできる。別の治療適応例としては、創傷の治癒促進を必要としている患者へのＣＴＧＦの投与が挙げられる。ＰＤＧＦをはじめとする各種増殖因子、たとえばＣＴＧＦは、皮膚の創傷の正常な治癒に関与している。本発明のＣＴＧＦポリペプチドは、皮膚の創傷の治癒が思うように進まないケースや、火傷の場合のように正常な治癒メカニズムをさらに補う必要があるようなケースの治療薬として価値を有するものである。創傷の治癒の促進にＣＴＧＦタンパク質を使用することが有利なのは、一つには、この分子のシステイン残基の含有率が高いからである。ＣＴＧＦあるいはその機能的断片は、創傷の治癒に関連していることが既知のＰＤＧＦをはじめとする各種の増殖因子より安定性が高く、プロテアーゼによる分解を受けにくい。本発明の物質は、ＴＧＦ−βとＣＴＧＦの組み合わせとすることが好ましいものの、他のＴＧＦ−βファミリーの物質も、ＣＴＧＦを誘導することによって創傷の治癒を促進する際に有用である可能性が高い。本発明の組成物が創傷の治癒に役立つのは、この組成物が結合組織の増殖を促すことにもよるものである。本組成物は、精製ＣＴＧＦならびにＴＧＦ−βを、製剤上許容される担体物質、たとえば不活性のゲルあるいは液体と組み合わせることによって調製を行う。本発明で念頭に置いている治療適応例としては、創傷の治癒に関しては、予期された創傷（すなわち、外科的処置によって生じた創傷）、ならびに予期されざる創傷（すなわち、外傷によって生じた創傷）がある。７．４．医薬製剤化および投与法本発明の分子は、必要としている患者にそれ自体で、または１種以上の分子を適切な担体または賦形剤と混合した医薬組成物にして、種々の疾患を治療または改善する用量で投与することができる。あるいは、ＣＴＧＦは内皮細胞および繊維芽細胞によって産生され、その両方の細胞が、骨または軟骨の形成および損傷部位に存在するので、ＣＴＧＦの産生を刺激する物質を、骨または軟骨の誘導または損傷治癒の促進に使用される組成物に添加することができる。好ましくは、本発明のその物質は、形質転換増殖因子−βである。本発明の組成物は、損傷の治癒を助けるものであり、その一部は、結合組織の増殖を促進することによる。別の態様では、ＣＴＧＦを、結合組織の形成を促進すると考えられるタンパク質または化合物と組み合わせて投与することができる。組成物がＣＴＧＦ単独であろうと、ＣＴＧＦおよび活性成分としての他の物質で構成されようと、該組成物は、製剤上許容される担体物質、例えば不活性なゲルまたは液体中で、精製したＣＴＧＦおよびＴＧＦ−βを組み合わせることにより調製される。さらに、治療上有効な用量とは、症状の改善を得るのに十分な化合物の量を意味する。本発明の化合物の製剤化および投与法は、”Remington's Pharmaceutic al Sciences,”Mack Publishing Co.，Easton，PA，最新版に見ることができる。７．４．１．投与法適する投与法は、例えば、経口、直腸、経粘膜または腸内投与；筋肉内、皮下、骨髄内注射ならびに包膜内、直接心室内、静脈内、腹腔内、鼻腔内または眼内注射などの非経口投与が挙げられる。あるいは、例えば化合物を、しばしばデポー製剤または徐放性製剤にして、ＣＴＧＦを必要とする部位に直接注入することにより、全身的よりも局所的に化合物を投与することもできる。さらに、薬物を、例えば、軟骨を標的とする特定の抗体で被覆したリポゾームにおける標的化薬物デリバリー系で投与することもできる。リポゾームは、痛みのある組織の標的とされ、該組織によって選択的に吸収される。７．４．２．組成物／製剤化本発明の医薬組成物は、自体公知の方法、例えば、通常の混合、溶解、顆粒化、糖衣化、粉末化、乳化、カプセル化、捕獲または凍結乾燥プロセスによって製造できる。すなわち、本発明に従って使用するための医薬組成物は、活性分子の薬剤的に使用できる製剤への処理を容易にする賦系剤および補助剤を含む１種以上の生理学的に許容される担体を使用して、通常の方法で製剤化することができる。適切な製剤化は、選択される投与法に依存する。注射の場合、本発明の物質は、水溶液、好ましくは生理学的に相溶性のある緩衝液（ハンクス溶液、リンゲル溶液または生理学的食塩水など）において製剤化できる。経粘膜投与の場合、浸透されるべきバリヤに適する浸透剤を組成物に使用する。そのような浸透剤は、一般に、当技術分野では公知である。経口投与の場合、化合物は、活性化合物を当技術分野で周知の製剤上許容される担体と組み合わせることにより容易に製剤化できる。そのような担体は、本発明化合物を、治療すべき患者によって経口摂取される、錠剤、ピル、糖剤、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁物などとして製剤化することができる。経口用の医薬製剤は、固体賦形剤とともに得ることができ、所望により得られる混合物をすり砕き、その顆粒混合物を、所望するならば、錠剤または糖剤のコアを得るための適する補助剤を添加した後に処理する。適する賦形剤は、特に、糖（乳糖、ショ糖、マンニトールまたはソルビトール）などの充填剤；例えばトウモロコシ澱粉、小麦澱粉、イネ澱粉、馬鈴薯澱粉、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などのセルロース製剤である。所望するならば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天またはアルギン酸もしくはその塩（アルギン酸ナトリウムなど）などの崩壊剤を添加することができる。糖剤のコアには、適切なコーティングがなされる。この目的に対しては、濃厚な糖溶液を使用することができる。これは、所望により、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー溶液および適する有機溶媒または溶媒混合物を含むことができる。同定のため、または活性化合物の用量の異なる組み合わせを特徴付けるために、染料または顔料を錠剤または糖剤コーティングに添加することができる。経口用に使用できる医薬製剤としては、ゼラチンでできたプッシュ−フィットカプセルならびにゼラチンおよびグリセロールまたはソルビトールなどの可塑剤でできた軟質密封カプセルが挙げられる。プッシュ−フィットカプセルは、活性成分を、乳糖などの充填剤、澱粉などの結合剤、および／またはタルクもしくはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、ならびに所望により安定剤との混合物で含み得る。軟質カプセルでは、活性化合物を、脂肪油、液体パラフィンまたは液体ポリエチレングリコールなどの適する液体に溶解または懸濁することができる。さらに、安定剤を添加してもよい。経口投与用の全製剤は、そのような投与に適する用量であるべきである。頬投与の場合、組成物は、常法で製剤化される錠剤またはロゼンジの形態をとることができる。吸入による投与の場合、本発明に従って使用するための化合物は、通常は、加圧パックまたはネブライザーから、適する推進薬（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適する気体）の使用により、エーロゾル噴霧剤の形態で放出される。加圧エーロゾルの場合、単位用量は、一定目盛りの量を放出するための弁を備えることにより、決定できる。例えば吸入器または注入器で使用するためのゼラチンのカプセルおよびカートリッジは、化合物および適する粉末ベース（乳糖または澱粉など）の粉末混合物を含んで製剤化できる。分子は、注射（例えば、ボーラス注射または連続注入）による非経口投与用に製剤化できる。注射用製剤は、保存剤を添加した単位投与形態（例えばアンプル）または多用量容器で提供することができる。組成物は、油性または水性ビヒクルにおける懸濁物、溶液またはエマルジョンなどの形態をとることができ、懸濁剤、安定剤および／または分散剤などの調製剤を含んでもよい。非経口用医薬製剤は、水溶性形態の活性物質の水溶液を含む。さらに、活性化合物の懸濁物は、適切な油性注射懸濁物として調製できる。適切な脂肪親和性溶媒またはビヒクルとしては、ゴマ油などの脂肪油、またはオレイン酸エチルまたはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、またはリポゾームが挙げられる。水性注射懸濁物は、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールまたはデキストランなどの、懸濁物の粘度を増加させる物質を含み得る。所望により、懸濁物は、化合物の溶解度を増加させて高濃度溶液の調製を可能にする、適切な安定剤または試薬も含み得る。あるいは、活性成分が粉末形態であって、使用前に適切なビヒクル（例えば、発熱物質を含まない滅菌水）で構成できるものであってもよい。化合物はまた、例えばココアバターまたは他のグリセリドなどの通常の座薬基剤を含む、座薬または停留浣腸などの直腸組成物に製剤化してもよい。前記した製剤の他に、化合物は、デポー製剤として製剤化することもできる。そのような作用時間の長い製剤は、植え込み（例えば、皮下または筋肉内）または筋肉内注射によって投与することができる。すなわち、例えば、化合物は、適切なポリマーまたは疎水性物質（例えば、許容される油におけるエマルジョンとして）またはイオン交換樹脂とともに、あるいはほんの少し可溶の誘導体、例えばほんの少し可溶の塩として製剤化できる。本発明の疎水性分子用の医薬担体は、ベンジルアルコール、非極性界面活性剤、水混和性有機ポリマーおよび水相を含む共溶媒系である。共溶媒系は、ＶＰＤ共溶媒系であってもよい。ＶＰＤは、無水エタノールにおいて調製した3 % w/v のベンジルアルコール8 % w/v の非極性界面活性剤ポリソルベート 80、および 65 % w/v のポリエチレングリコール 300の溶液である。ＶＰＤ共溶媒系（ＶＰＤ：５Ｗ）は、デキストロースの 5 % 水溶液で１：１に希釈したＶＰＤから成る。この共溶媒系は、疎水性化合物を十分溶解し、それ自体、全身投与に対して低い毒性を生じる。当然、共溶媒系の割合は、その溶解性および毒性に関する特徴を損なわないならば、かなり変えることができる。さらに、共溶媒成分の同一性も変えることができる。例えば、ポリソルベート 80 の代わりに、他の低毒性の非極性界面活性剤を使用することができ、ポリエチレングリコールの断片の大きさも変えることができる。また、ポリエチレングリコールを、他の生物相溶性ポリマー、例えばポリビニルピロリドンで変えることができ、他の糖または多糖類をデキストロースの代わりに使用してもよい。あるいは、疎水性分子用の他のデリバリー系を使用することができる。リポゾームおよびエマルジョンは、疎水性薬物のデリバリービヒクルまたは担体として周知の例である。ジメチルスルホキシドなどのある種の有機溶媒も使用できるが、通常は、毒性がより多く犠牲にされる。さらに、化合物は、治療薬を含む固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスなどの徐放系を使用して放出させることができる。種々の徐放性物質が確立されており、当業者には周知である。徐放性カプセルは、その化学性に応じて、化合物を数週間〜100 日までにわたって放出し得る。治療薬の化学性および生物学的安定性に応じて、タンパク質安定化のための別の方策を使用することもできる。医薬組成物はまた、適切な固体またはゲル相の担体または賦形剤を含むことができる。そのような担体または賦形剤の例としては、それらに限定されないが、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖、澱粉、セルロース誘導体、ゼラチンおよびポリマー（ポリエチレングリコールなど）が挙げられる。７．４．３．有効な用量本発明での使用に適する医薬組成物は、活性成分が、その意図する目的を達成するのに有効な量で含まれる組成物を含む。特に、治療上有効な量とは、治療すべき患者の既存の症状の進行を抑え、または改善するのに効果的な量を意味する。有効な量の決定は、特に本明細書にある詳細な開示の点では、十分、当業者の能力の範囲内である。本発明方法で使用するどの化合物も、治療上有効な量は、最初に、細胞培養アッセイから推定できる。例えば、ある用量を動物モデルで処方して、細胞培養で測定されるＩＣ₅₀（すなわち、最大の１／２のＣＴＧＦ活性を達成する試験化合物の濃度）を含む流動する濃度範囲を達成することができる。そのような情報を使用すると、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定することができる。治療上有効な量は、患者の症状を改善し、または生存を長くすることのできる分子の量を意味する。そような分子の毒性および治療効力は、細胞培養または実験動物での標準的医薬手順、例えばＬＤ₅₀（集団の50 %を死に至らしめる量）およびＥＤ₅₀（集団の50 %で治療上有効な量）を決定するための手順によって決定できる。毒性と治療効果との間の用量比が治療指数であり、ＬＤ₅₀とＥＤ₅₀との間の比として表すことができる。高い治療指数を示す分子が好ましい。これらの細胞培養アッセイおよび動物実験から得られるデータは、ヒトにおいて使用するための用量範囲の誘導に使用できる。そのような分子の用量は、好ましくは、ＥＤ₅₀を含む流動濃度の範囲内にあり、毒性はほとんど、または全くない。用量は、使用する投薬形態および使用する投与法に応じて、この範囲内で変わり得る。正確な製剤、投与法および用量は、個々の医師が患者の状態を鑑みて選択することができる。例えば、Fingl ら、1975，"The Pharmacological Basis of Therap eutics"，Ch．１p.１を参照。投薬量および間隔は、個々に調整して、活性部分の血漿レベルを、ＣＴＧＦの誘導効果または最少の有効濃度（ＭＥＣ）を維持するに十分であるようにすることができる。ＭＥＣは、各化合物に対して変わるが、in vitroデータ、例えば、本明細書に記載のアッセイを使用した、骨の増殖を誘導するためのＣＴＧＦの50 〜90 %の活性を達成するのに必要な濃度から推定することができる。ＭＥＣの達成に必要な用量は、個々の特徴および投与法に依存する。しかし、ＨＰＬＣアッセイまたはバイオアッセイを使用して、血漿濃度を決定することができる。投薬の間隔も、ＭＥＣ値を使用して決定できる。化合物は、その時間の10〜90 %、好ましくは30〜90 %、最も好ましくは50〜90 %において、血漿レベルをＭＥＣ以上に保持する処方を使用して投与すべきである。局所投与または選択的吸収の場合、薬物の効果的な局所濃度は、血漿濃度に関係しない。投与する組成物の量は、もちろん、治療を受ける患者、その体重、損傷の程度、投与法および処方する医師の判断に依存する。７．４．４．包装組成物は、所望するならば、活性成分を含む１単位以上の投薬形態を含み得るパックまたは分配器具で提供することができる。パックは、例えば、金属またはプラスチックのホイル（プラスチックの包みなど）を含み得る。パックまたは分配器具には、投与のための取扱説明書を添えることができる。相溶性のある医薬担体において製剤化された本発明の化合物を含む組成物は、調製して適切な容器に入れ、指示する症状の治療用としてラベルすることもできる。ラベル上に示される適応症としては、軟骨または骨の誘導および損傷治癒などが望ましい障害または疾患の治療が挙げられる。７．５．軟骨および骨でのＣＴＧＦの産生を誘導する化合物の同定ＣＴＧＦ遺伝子のプロモーター要素および、特にＴＧＦ−β応答／調節要素（ＴβＲＥ）（5'-GTGTCAACCCTC-3'；ヌクレオチド -157 および-145）の同定により、ＣＴＧＦの発現に影響を及ぼす化合物または組成物を同定するためのスクリーニング法に対する源が得られる。特に、ＣＴＧＦの活性を高め、それによって骨、組織および軟骨の誘導を高めるために使用できる組成物を同定することのできる方法は、（１）それらに限定されないが、組成物およびＣＴＧＦプロモーターのＴＧＦ−β応答要素を含むオリゴヌクレオチドなどの成分を、成分の相互作用を可能にするのに十分な条件下でインキュベートし、（２）組成物のＣＴＧＦ発現に対する効果を測定することを含む。好ましくは、本明細書に記載するスクリーニングアッセイで使用されるプロモーター領域は、ヌクレオチド-823〜+74 を含むが、ＴＧＦ−β応答要素を含むより小さい領域（例えば、-162〜-128、または-154〜-145）も、開示した方法において有用であると考えられる。別のアッセイでは、ＴβＲＥを含むこの領域のヌクレオチドをルシフェラーゼなどの受容体遺伝子に結合させ、哺乳類細胞にトランスフェクションすることにより、構成体を有し、ＴＧＦ−βとともにインキュベートすると活性を示す細胞系が誘導される。活性化を改変するライブラリーにおけるこれらの薬物、オリゴヌクレオチドおよび化学物質は、細胞アッセイで容易に検出することができる。８．実施例結合組織増殖因子の遺伝子は、繊維芽細胞で発現されるだけでなく、間葉的に誘導される結合組織細胞（すなわち、繊維芽細胞、平滑筋、軟骨細胞、骨芽細胞、大グリア細胞など）では、ＴＧＦ−βのみによって選択的に誘導される。脊椎動物において骨格要素を形成する結合組織細胞の遺伝子の発現は、ＣＴＧＦが、脊椎動物における軟骨、骨の腱および筋肉の形成において役割を果たしていることを示す。下記実施例の結果は、ＣＴＧＦが、ヒトを含めた脊椎動物において軟骨および骨の両方を形成する細胞の誘導、分化および増殖を調節し得ることを示す。特に、それらの結果は、（１）ＣＴＧＦ転写産物が成体ラットおよび新生マウスの長骨の増殖プレートに存在し、（２）ＣＴＧＦ遺伝子がマウス胚での軟骨の誘導・増殖部位で発現され、（３）ＣＴＧＦ受容体がラット軟骨細胞上に存在し、（４）ＣＴＧＦ遺伝子が成体ウサギでの外傷を受けた後の骨の再生部位で発現され、（５）ＣＴＧＦタンパク質が多能性のマウス胚の幹細胞系を誘導して軟骨細胞および骨芽細胞に分化させることができ、（６）ヒト骨芽細胞が培養においてＣＴＧＦを産生することを示す。８．１．生物学的アッセイ方法：ミトゲンおよび固定非依存性増殖アッセイ：ミトゲンアッセイは、Grot endorst ら、1991，J．Cell Physiol．149:235-243に先に記載されているように、48ウェルプレートおよび標的細胞としてのＮＲＫ繊維芽細胞を使用した、単層培養物で行った。固定非依存性増殖アッセイは、本質的には、Guadagno および Assoian，1991，J．Cell Biol．115:1572-1575 に記載されているように行った。方法：細胞外マトリックスタンパク質ｍＲＮＡ誘導アッセイ：ＮＲＫラット繊維芽細胞を、5 % ウシ胎仔血清を含むダルベッコ改良イーグル培地で増殖させて融合させ、次いで、血清を、1 % のウシ血清アルブミンを含むＤＭＥＭで24時間、餓死状態においた。その細胞培養物に増殖因子を添加し、24時間後に全細胞ＲＮＡを抽出し、Igarashiら、1993，Mol．Biol．Cell 4:637-645 に記載されているように、ノーザンブロット分析を行った。全ＲＮＡの等量をゲル上の各レーンに確実に添加するために、ＲＮＡをＡ_260/ ₂₈₀ 比によって定量し、臭化エチジウムで染色した後の各レーンのリボソーム 2 8Sおよび 18SＲＮＡバンドを比較することにより、等量の転移を確かめた。別の対照として、ブロットをアクチンｃＤＮＡプローブで再び探った。プローブ用に使用する二本鎖ｃＤＮＡ断片を、ランダムプライム標識キット(Boehringer Mann heim，Indianapolis，IN)を使用して³²Ｐ−ｄＣＴＰで標識した。ＣＴＧＦプローブは、ＣＴＧＦ転写産物のオープンリーディングフレームを包含する 1.1 kb ヒトｃＤＮＡ断片から誘導した。ＴＧＦ−β１プローブは、2.0 kbのヒトＴＧＦ −β１ｃＤＮＡから誘導される 1.0 kb の Nar I断片であった(G.I．Bell，H. H．Medical Institute，University of Chicago)。αＩ−型１ヒトコラーゲンプローブは、1.5 kbのＯＲＦ断片の３’端から誘導した（ＡＴＣＣ No．61323）。 α５インテグリンプローブは、R．Associan（マイアミ大学）によって得られた、オープンリーディングフレームを含むヒトｃＤＮＡの一部を含むｃＤＮＡ挿入物から作製した。ヒトフィブロネクチンプローブは、F．Woessner（同じくマイアミ大学）によって提供される、オープンリーディングフレームの３’領域を含む 2.2 kb のｃＤＮＡクローンから誘導される 0.9 kb の EcoRI/HindIII断片であった。対照のＲＮＡプローブとして使用されるヒトアクチンプローブは、Onco r，Co．（Gaithersberg，MD）から購入した。８．２．新生マウスにおけるＣＴＧＦ転写産物の位置ＣＴＧＦ転写産物が新生マウスの長骨の増殖プレート存在するかどうかを調べるために、Favaら、1990、Blood，76:1946-1955 に従って実験を行った。方法：in situ ハイブリダイゼーション。組織サンプルを直ちに、4.0 % のパラホルムアルデヒドに1.5 時間入れた後、フラッシュ凍結し、包埋した。5 μm の切片を切り取り、ＴＥＳＰＡ被覆スライド上に置いた（Oncor，Gathersburg， MD）。ＣＴＧＦｍＲＮＡに対するin situ ハイブリダイゼーションを標準的方法を使用して行った。簡単に述べると、試料を載せたスライドを、gradedアルコールで水和し、50 mM のトリス−HCl pH7.4 、5 mMのＥＤＴＡにおける20μg/ml のプロテイナーゼＫで処理し、4.0 % パラホルムアルデヒドに再固定して、0.1 M のトリエタノールアミンおよび1 ml の無水酢酸に漬けた後、逐次gradedアルコールで脱水した。センスおよびアンチセンスの両ＣＴＧＦＲＮＡプローブを、リボプローブキット(Promega，Madison，WI)を、各々Ｔ７およびＳｐ６プロモーターとともに使用して構成した。プローブの特定の活性は、1 x 108 cpm/μg ＲＮＡであった。スライドは、50 %の脱イオンホルムアミド、10 %の硫酸デキストラン、50 mM のＤＴＴ、0.3 M の NaCl 、0.01 Mのトリス pH7.5、5 mMのＥＤＴＡ、10 mM の Na₂HPO₄、0.02 %のフィコール、0.02 %のＰＶＰ、0.02 %のＢＳＡ、0.2 mg/ml の酵母ｔＲＮＡおよびリボプローブ(5 x 104 cpm/μl)中、カバーグラス下、54℃で一夜、ハイブリダイズした。スライドは、250 mlの 5X ＳＳＣ、10 mM のβメルカプトエタノール（50℃で30分間）、2XＳＳＣ、100 mMのβ −メルカプトエタノール、50 %のホルムアミド（65℃で20分間）および３回のＴＥＮ緩衝液（1 M のトリス、0.5 M のＥＤＴＡ、5 M のNaCl）（10分）で洗浄した。２回目のＴＥＮ洗浄には、10μg のＲＮアーゼＡを含めた。最後の２回の洗浄は、各々、2XＳＳＣ中、65℃で15分であった。0.3 M の酢酸アンモニウムを含む graded アルコールで再び脱水した後、スライドを写真用エマルジョン(Ilfor d K-5，Polyscience)に浸し、４℃で８日間インキュベートした。次いで、スライドを現像し、切片を Mayerのヘマトキシリンおよびエオシンで逆染色した。結果：これらの実験の結果は、ＣＴＧＦ遺伝子が増殖プレートの増殖ゾーンで発現されることを示す。このゾーンは、骨の長さを増加させるために能動的に複製している軟骨細胞を含む。この部位でのＣＴＧＦの発現は、軟骨細胞に対する増殖因子として機能することと一致する。８．３．マウス胚での軟骨誘導および増殖部位でのＣＴＧＦ遺伝子発現軟骨誘導および増殖におけるＣＴＧＦの役割を確認するために、マウス胚の軟骨および骨を形成するだろうが、まだ形成していない部位でのＣＴＧＦ遺伝子の発現を研究した。この研究のために、導入遺伝子を含むトランスジェニックマウス系を、細菌β−ガラクトシダーゼ遺伝子の発現を調節しているヒトＣＴＧＦプロモーター要素で構成した。この遺伝子を発現する細胞は、酵素活性の部位で青色沈殿を形成するＸ−gal を使用して染色することにより、容易に同定できる。この方法を使用して、トランスジェニックマウスの胚を染色し、ＣＴＧＦ遺伝子の発現を局所にとどめた。図４パネルＡに示すように、軟骨も骨も形成されなかった。これは、ＣＴＧＦが骨格形成の前に発現され、軟骨および骨の誘導物質として機能し得たことを示す。これらの結果はさらに、導入遺伝子の発現が、ＣＴＧＦプローブを使用した in situハイブリダイゼーションによって検出される発現と一致することを示す。これらの研究はまた、遺伝子が長骨、前軟骨ゾーンおよびメッケル軟骨の増殖プレートで発現され、第一の軟骨は哺乳類の発達中に形成されることを示す。これらの領域は、前軟骨形成性間葉と言い、細胞の凝縮によって区別される。ＣＴＧＦ遺伝子は、これらの部位で発現されるが、隣接組織では発現されない。さらに、ＣＴＧＦ遺伝子は、軟骨の実際の形成の１日前に生じる凝縮の１日前にこれらの部位で発現される。これらの発見は、ＣＴＧＦが、真の軟骨形成表現型を有する軟骨または細胞の形成前に存在し、未分化幹細胞で軟骨表現型を誘導するように作用するＣＴＧＦと一致することを示している。重要なことは、これらの研究により、ＣＴＧＦが、胚の膜性または内軟骨性のいずれかの経路によって骨を形成する部位で発現されることが示されることであり、そのことは、ＣＴＧＦが、四肢の骨を形成する未分化の間葉幹細胞またはメッケル軟骨の軟骨および頭蓋骨を形成する神経性陵細胞のいずれかからの軟骨の発達に対するシグナルとして機能し得ることを示す。８．４．ラット軟骨細胞上のＣＴＧＦ受容体の位置細胞がＣＴＧＦなどのペプチド因子に応答するためには、それらの細胞は、特定のペプチド因子に対するコグネイト受容体を表面上に発現しなければならない。平衡アッセイ：平衡結合アッセイを、ＮＲＫ−４９Ｆラット繊維芽細胞および原発性ラット関節性軟骨芽細胞の融合性単層に対して行って、これらの細胞上でのＣＴＧＦ受容体の数および親和性を測定した。結合は、ヨウ素化組換えヒトＣＴＧＦ（ｒｈＣＴＧＦ）の濃度を変えながら、冷所で４時間行った。非特異的結合は、未標識リガンドを200 倍モル過剰に含めることにより測定した。代表的なスキャッチャードプロットを図８Ａ（ＮＲＫ細胞を使用して行った平衡結合アッセイに関する）および図８Ｂ（ラット軟骨芽細胞を使用して行った平衡結合アッセイに関する）に示す。競合アッセイ：正常なラット腎臓繊維芽細胞、マウス繊維芽細胞、ミンク肺上皮細胞およびラット関節性軟骨細胞を含むいくつかの細胞型を、ＣＴＧＦ受容体の発現に対して試験した。ＣＴＧＦは、¹²⁵Ｉでヨウ素化することにより標識し、放射性標識したＣＴＧＦを競合結合アッセイで使用して、種々の細胞型でのＣＴＧＦ受容体を測定した。下記表１に示すように、ＮＲＫ繊維芽細胞およびラット関節性軟骨細胞のみがＣＴＧＦに対して高い親和性の受容体を発現した。マウス繊維芽細胞は、あったとしても高い親和性の受容体は非常に少なく、ミンク肺上皮細胞では結合は検出されなかった。これらのデータは、軟骨細胞がＣＴＧＦおよびその受容体の両方を発現し、従って、増殖刺激因子としてＣＴＧＦに応答可能であることを示す。８．５．軟骨細胞および骨芽細胞へ分化するための多能性マウス胚幹細胞系の誘導におけるＣＴＧＦ活性細胞培養物での未分化幹細胞におけるＣＴＧＦの軟骨細胞および骨芽細胞表現型の誘導能を評価した。特定的には、細胞系C3H10T1/2 を使用してこの生物学的活性を評価した。これらの細胞は、これらの型の研究には標準的で十分確立された系である。C3H10T1/2 は、培養物において未分化状態を維持することができ、次いで、骨格筋細胞、軟骨細胞、骨芽細胞および脂肪細胞への分化を誘導することができる。ＣＴＧＦで処理した細胞は、軟骨細胞および軟骨小結節のコロニーを形成した。５−アザサイトジンで一夜処理した後、ＣＴＧＦで処理した細胞は、骨芽細胞および骨状体に分化した。これらの培養物の筋および脂肪細胞への分化は、ＣＴＧＦの存在により抑制された。より特定的には、細胞を５−アザサイトジンで一夜処理した後、10〜14日間インキュベートして分化させた。次いで、これらの細胞に対する５−アザサイトジンおよびＣＴＧＦの単独および併用の効果を比較した。どちらの試薬でも処理しなかった対照培養物は、未分化細胞として単層のままであった。図４に示すように、５−アザサイトジンのみで処理した培養物は、主に骨格筋細胞（筋管）および脂肪細胞に分化した。培養物に軟骨細胞は認められなかった。培養物（50 ng/ ml）をＣＴＧＦで10日間処理すると、軟骨小結節が誘導された。これらの小結節は、他の条件下では認められなかった。培養物のＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＥＧＦまたはＴＧＦ−βによる処理は、これらの小結節を誘導しなかった。このことは、ＣＴＧＦが未分化間葉幹細胞において軟骨を独自に誘導することができることを示している。細胞を５−アザサイトジンで処理し（一夜）、次いでＣＴＧＦ（50 ng/ml）に 10日間暴露すると、培養物に対して有意な影響があった。第一に、骨格筋管が存在しなかった。このことは、ＣＴＧＦにより、細胞の骨格筋細胞への分化が妨げられたことを示す。第二に、軟骨性小結節がいくつか存在したが、それらの小結節のほとんどは、骨状（骨）であるように見えた。すなわち、ＣＴＧＦは、軟骨細胞および骨芽細胞の両方の形成を未分化間葉細胞から誘導することができる。これらの結果は、この因子が、所望する場合は、軟骨および骨の分化の刺激に使用できることを示す。８．６．成体ウサギの外傷後の骨の再生部位でのＣＴＧＦ遺伝子の発現損傷治癒の間の種々の調節およびマトリックスタンパク質遺伝子の発現を調べるための実験モデルを開発した。このモデルでは、エーテルで麻酔しておいた雄のニュージーランド白ウサギ(10 kg)の骨盤の腸骨にメッシュナイロンの円柱を植え込んだ。その骨盤の腸骨に、骨穿孔器を使用して直径 1.1 cm の穴を開け、その穴にchamber を圧入した。chamber は、隣接する筋系および靭帯の組織弁を使用して正しい位置に置いた。12匹の動物の各々に二つのchamber を植え込んだ。動物は、chamber の植え込みの９、14、21、24、28、31、35、42および56日後に屠殺した。chamber を取り出し、chamber の外側の組織を注意深く、完全に取り除いた。次いで、chamber を切り開き、chamber 内に含まれる組織を集めた。全ＲＮＡを、グアニジン−イソチオシアネート抽出(Chomcaynskiおよび Sacch i，1987，Anal．Biochem．162:156-159)およびＣｓＣ１遠心分離(Chirgwin ら、 1979，Biochemistry 18:5294-5299)によって、 6〜18個の chamber（１〜３匹の動物からプールした）から得た組織から抽出した。回収したＲＮＡの量は、異なる採集日の間で 100〜300 μg の範囲であった。全ＲＮＡをアガロース／ホルムアルデヒドゲル上で電気泳動させ、ニトロセルロースに移した。等量のＲＮＡを、ニトロセルロースフィルター上の各サンプルに存在するリボソームＲＮＡの染色から判断して移した。ＣＴＧＦプローブは、ＣＴＧＦｃＤＮＡのオープンリーディングフレームを表す 900塩基対の断片であった。ハイブリダイゼーションは、ランダムプライマーＤＮＡ標識キット(Boehringer Mannheim Biochemicals ， Indianapolis，IN)を使用し、［Ｐ³²］ｄＣＴＰで標識した 1 x 10⁶ cpm/ml のこれらのプローブを使用して行った。オートラジオグラフィーは、Ｘ−線フィルムおよび増感板を使用して−70℃で24〜72時間行った。組織は、血液凝固の後に炎症、次いで、結合組織の増殖が続く規則的なカスケード修復によって生じた。骨に植え込んだ chamberでは、形成された密な結合組織は、軟質組織移植片で形成されるものと区別できなくはないとしても、類似していた。図５に述べるように、ＣＴＧＦ遺伝子発現は、14〜42日から明らかである。これは、chamber 内での骨の最初の組織学的出現の４日前であり、chamber 内での骨の形成の時間的経過と一致する。しかし、図５にも示されるように、17〜18日の後移植頃は、結合組織の領域の形態学に何らかの変化があった。これらの領域は次いで、20〜21日の後移植までに骨を形成し始めた。このことは、これが骨の再生実験の機能的モデルであることを示す。 chamber でのＣＴＧＦｍＲＮＡの発現はわずかに先行し、次いで、そのcham ber 内の骨形成領域の形成および増殖と一致した。このことは、ＣＴＧＦが哺乳類の骨再生部位で発現されることを示す。８．７．ＣＴＧＦの投与によるヒト骨芽細胞の形成細胞培養：ヒト骨芽細胞は、ヒトの骨の外植片から増殖させた。細胞は、10 % のＣＯ₂ および90 %の空気の大気中、37℃で、10 %のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含むダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養した。ウェスタンブロット分析：条件付けした培地でのＣＴＧＦ含量を、12 %のアクリルアミドゲル上でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、次いで、電気ブロット法を使用してニトロセルロースフィルターに移した。ブロットは、2 % の脱脂粉乳（ＴＢＳ−ミルク）を含むトリス−緩衝食塩水（100 mMのNaCl、50 mM のトリス−HCl pH7.4 ）で１時間インキュベートした後、ＴＢＳ−ミルクで希釈した 2 g/ml のニワトリ抗−ヒトＣＴＧＦＩｇＹに一夜暴露した。フィルターをＴＢＳ−ミルクで５回洗浄し（各５分）、ＴＢＳ−ミルク中で90分間、アルカリホスファターゼ−結合アフィニティー精製ウサギ抗−ニワトリＩｇＹ(1:1,000 の希釈度、Organon Teknika-Cappel，West Chester，Pa.)とともにインキュベートした。フィルターをＴＢＳ−ミルクで３回洗浄した後、ＴＢＳで２回洗浄し、抗原を、市販のアルカリホスファターゼ基質キット(Sigma，St．Louis，MO)を使用して検出した。結果：ヒト骨芽細胞は、骨腫瘍の除去または結合交換のための処置を行う間、骨の外科的除去の後にドナーから得た。骨芽細胞は、骨から培養し、基準物質を使用して同定した。細胞は、10 %のウシ胎仔血清を含む完全培地で増殖して融合させ、培地を一夜、血清を含まない培地に変えることにより、休止させた。いくつかの培養物は、ＴＧＦ−βで処理し、未処理培養物と比較した。ＴＧＦ−βで処理した骨芽細胞を刺激すると、特異的抗−ＣＴＧＦ抗体で検出されるＣＴＧＦが産生した。図５に示すように、培地を集めて、ＣＴＧＦ特異的抗体を用いたＣＴＧＦの免疫精製によるＣＴＧＦ産生および分泌ならびに同じ抗体を使用したウェスタンブロットによる検出および定量の分析を行った。繊維芽細胞、平滑筋細胞および軟骨細胞で認められるように、ＴＧＦ−βは、ヒト骨芽細胞によるＣＴＧＦの産生を誘導する。対照の未処理細胞は、検出可能な量のＣＴＧＦを合成しなかった。この実験で明らかなように、骨芽細胞は、ＣＴＧＦ産生に関して、他の結合組織細胞と同様にＴＧＦ−βに応答する。８．８．トランスジェニックウサギモデル全てのマウス実験を"Guidelines for Care and Use of Experimental Animals （実験動物の医療および使用のための指針）”に概説されている原理および手順に従って行った。トランスジェニックモデルの作製は、標準的技術を使用して、マイアミ大学のトランスジェニックマウスコア施設で行った。簡単に述べると、注入すべき遺伝子（導入遺伝子）を、制限酵素による消化によって線状化し、ＤＮＡ断片を、低融点アガロースゲル電気泳動によって単離し、GENECLEAN を使用して精製した。トランスジェニックマウスは、線状化ＤＮＡを、約 100〜300 個の最近受精したマウス卵子の前核の一つに注入することにより作製した(Hoganら、1986，Mani pulating the Mouse Embryo，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spr ing Harbor，NY)。注入後に生存している卵を偽妊娠マウス（精管切除した雄に交配させた）の卵管に移した。誕生の１〜３週後に、尾の生検材料をそれらのマウスの子から採取し、ゲノムＤＮＡをサザンブロット法によって分析して、導入遺伝子の有無を測定した。導入遺伝子の有無が陽性であるマウスを対照のマウスと交配させて、トランスジェニックマウス系を確立した。これらの実験の結果、ＣＴＧＦプロモーターの制御下でβ−ガラクトシダーゼを発現するトランスジェニックマウスの独立した２つの系が作製された。これらの両方の系は、同様の発現パターンを示す。８．９．軟骨形成アッセイＣＴＧＦおよびＴＧＦ−βを、Seydinら、1983，J．Cell Biology 97:1950-53 に記載されているように、軟骨形成アッセイで試験した。簡単に述べると、胚の筋肉の一次培養物を、19〜20日齢の Sprague-Dawley 胎児の四肢から切り取った細切れの筋組織の細胞派生物から得た。軟骨形成アッセイのために、細胞をトリプシン処理し、アガロースに包埋し、因子を含まない培地（図７Ａ）、ＴＧＦ− βのみ（図７Ｂ）、ＴＧＦ−βおよびコレラ毒素（図７Ｃ）またはＴＧＦ−β、コレラ毒素およびＣＴＧＦ（図７Ｄ）を含む培地で覆った。各アッセイに対して、培地を２〜３日ごとに変え、培養の21日後に、Horwitz および Dorfman，1970 ，J．Cell Biol．45:434-438に記載されているように、トルイジンブルーで染色した。図７Ａ〜７Ｄに示されるように、培地にＣＴＧＦを添加した場合は、顕著な軟骨細胞増殖が認められた。このことは、ＣＴＧＦが軟骨細胞の増殖、および結合組織マトリックスの産生を刺激することを示す。例示した態様は、本発明の一つを説明するためのものであり、本発明は、それらの態様によって範囲が限定されるものではなく、機能的に同等の方法は、本発明の範囲内である。実際、本明細書に記載した以外の本発明の種々の変形が、当業者には、前記説明および添付の図面から明らかになるであろう。そのような変形は、添付したクレームの範囲内であるとする。本明細書の本文内で引用した参考文献は全て、それらの全体を参考として本明細書に組み入れる。生物学的寄託本発明のＣＴＧＦの配列は、1990年７月26日に Genebank，Los Alamos Nation al Laboratory，Los Alamos，New Mexico，87545，USA に受理番号 M36965 で寄託された。このＣＴＧＦ配列の寄託は、例示の目的のためのみであり、クレームの主題の実施に該寄託が必要であることの出願人による承認として扱うべきではない。そのような処置が指定国の法の下で法的に許可され得る程度に可能である全指定国に関しては、寄託した微生物のサンプルは、関係する特許法、例えば EPC規則 28(4)、英国特許法1982規則17(3)、オーストラリア法 3.25(3)および他の指定国に対する必要な変更を加えた大体において同様の条項に従って、その分譲によってのみ、独立した専門家に利用可能にされることが要請される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）を含有する医薬組成物。２．必要としている患者に、ＣＴＧＦと製剤上許容される担体を含有する組成物を投与することを含んでなる、骨形成を誘導する方法。３．前記組成物が第二の増殖因子をさらに含有する、請求項２に記載の方法。４．第二の増殖因子がＴＧＦ−βである、請求項３に記載の方法。５．前記組成物が少なくとも１種のコラーゲンをさらに含有する、請求項２に記載の方法。６．患者が骨の形成を冒す苦痛を抱えている、請求項２に記載の方法。７．前記苦痛が骨粗しょう症、骨関節炎および骨軟骨炎よりなる群から選択される、請求項６に記載の方法。８．必要としている患者に、ＣＴＧＦと製剤上許容される担体を含有する組成物を投与することを含んでなる、組織形成を誘導する方法。９．前記組成物が第二の増殖因子をさらに含有する、請求項８に記載の方法。 10．第二の増殖因子がＴＧＦ−βである、請求項９に記載の方法。 11．前記組成物が少なくとも１種のコラーゲンをさらに含有する、請求項８に記載の方法。 12．必要としている患者に、ＣＴＧＦと製剤上許容される担体を含有する組成物を投与することを含んでなる、軟骨形成を誘導する方法。 13．前記組成物が第二の増殖因子をさらに含有する、請求項12に記載の方法。 14．第二の増殖因子がＴＧＦ−βである、請求項13に記載の方法。 15．前記組成物が少なくとも１種のコラーゲンをさらに含有する、請求項12に記載の方法。 16．必要としている患者に、ＣＴＧＦと製剤上許容される担体を含有する組成物を投与することを含んでなる、損傷治癒を誘導する方法。 17．前記組成物が第二の増殖因子をさらに含有する、請求項16に記載の方法。 18．第二の増殖因子がＴＧＦ−βである、請求項17に記載の方法。 19．前記組成物が少なくとも１種のコラーゲンをさらに含有する、請求項16に記載の方法。