JPH11506902A

JPH11506902A - イン・ビトロｔリンパ球生成系

Info

Publication number: JPH11506902A
Application number: JP8518948A
Authority: JP
Inventors: ティー．スカデン，デイビッド; フリードマン，アンドルー
Original assignee: ベスイズレイルディーコネスメディカルセンターインコーポレイテッド
Priority date: 1994-12-01
Filing date: 1995-11-27
Publication date: 1999-06-22
Also published as: CA2206449A1; EP0797450A4; EP0797450A1; WO1996016674A1; US6004812A

Abstract

(57)【要約】本発明は、Ｔ細胞集団がＣＤ３４を発現する前駆細胞から生成されるイン・ビトロＴリンパ球生成系を提供する。本発明のＴリンパ球生成系は、約１７〜７４％がＣＤ２を発現し、約１．５〜３４％がＣＤ３を発現し、そして約１６〜６１％がＣＤ４を発現し、そして約０〜１５％がＣＤ８を発現するＴ細胞集団を生成する。かかるＴ細胞集団をイン・ビトロで生成する方法並びに本発明のＴ細胞を含む種々の組成物をも提供する。

Description

【発明の詳細な説明】イン・ビトロＴリンパ球生成系発明の背景Ｔリンパ球即ちＴ細胞は、哺乳動物の免疫系の基礎であり、外来抗原に対する細胞性免疫の原因である。Ｔ細胞は、他のリンパ球と同様に、主として造血組織において（即ち、胎児の肝臓及び成人の骨髄において）生成される多能性の造血幹細胞から発生する。これらの前駆体幹細胞の幾つかは、血液を介して胸腺に移動し、そこで、Ｔ細胞分化が起きる。Ｔリンパ球の大部分は、他の白血球の免疫応答を促進し又は抑制するように作用する免疫系レギュレーター（ヘルパーＴ細胞及びサプレッサーＴ細胞として公知）である。他のＴリンパ球（細胞障害性Ｔ細胞という）は、ウイルス感染した細胞を殺すように作用する。これらの種々の型のＴ細胞は、それらの表面上の異なる抗原マーカーの存在によって互いに区別される。特に、ヘルパーＴ細胞は、ＣＤ４として知られる細胞表面糖蛋白質を発現し、細胞障害性Ｔ細胞は、異なる細胞表面糖蛋白質ＣＤ８を発現する。Ｔ細胞が成熟するにつれて、それらは、ＣＤ２細胞表面蛋白質を発現し、最終的には、ＣＤ３細胞表面蛋白質複合体を発現する。Ｔ細胞の発生は、イン・ビボで集中的に研究されてきた。証拠は、多能性造血幹細胞がＣＤ３４表面分子を発現する細胞（ＣＤ３４⁺細胞；例えばTerstappen 等、Blood,79:666-677,1992及びその中で参照されている文献を参照されたい）の集団中に存在するということを示している。かかるＣＤ３４⁺細胞は、有核骨髄細胞の約１％に相当する。ＣＤ３４⁺細胞は、照射された宿主の胸腺をＴ細胞で上首尾に再増殖させるために用いられてきたし（例えば、Exine 等、Nature 3 09:629-632,1984; Goldschneider 等、J.Exp.Med.163:1-17,1986; Berenson等、 J.Clin.Invest.81:951-955,1988 を参照されたい）、遺伝的に決定された重症複合型免疫不全を有するマウス（ＳＣＩＤマウス）中へのヒトＣＤ３４＋前駆細胞の移植は、それらのマウスにおける成熟Ｔリンパ球の発生を生じることが観察された（例えば、McCune等、Science 241:1632-1639,1988: Namikawa 等、J.Exp.Med .172:1055-1063,1990; Berenson等、Blood 77:1717-1722,1991を参照されたい）。努力は、イン・ビトロＴリンパ球生成系の開発にも向けられてきた（例えば、 Benveniste等、Cell.Immunol.127:92-104; Peault等、J.Exp.Med.174:1283-1286 ,1991; Toki等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:7548-7551,1991; Tjonnfjord 等、 J.Exp.Med.177:1531-1539; Hurwitz，J.Immunol.17:751-756,1987を参照されたい）。Peault等は、ヒトの胎児肝及び骨髄からのＣＤ３４＋細胞を、予め低温培養によって造血幹細胞を涸渇させたＨＬＡミスマッチの胎児胸腺断片にイン・ビトロでマイクロインジェクションする系を開発した。しかしながら、Peault等は、イン・ビトロでコロニー形成した胸腺をその後ＳＣＩＤマウスに移植して、Ｔ細胞の分化はイン・ビボで起きたので、完全なイン・ビトロＴ細胞発生を達成してはいない。 Tjonnfjord等は、胸腺間質細胞上清にて、組換えマウスｃ−ｋｉｔリガンドの存在若しくは不在にて培養した成人ＣＤ３４＋骨髄細胞からのイン・ビトロでのＴ細胞分化を報告した。それにもかかわらず、Tjonnfjord等は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４及びＣＤ８等のＴ細胞特異的表面マーカーの存在により示されたように、それらの全細胞培養の少部分しか成熟Ｔ細胞に分化しなかったことを見出した（Tjonnfjord等の図３参照）。従って、培養した細胞の有意の部分が成熟Ｔ細胞に発生するイン・ビトロＴリンパ球生成系の開発の必要性がある。発明の要約本発明は、培養した細胞の有意の部分が成熟Ｔ細胞に発生するイン・ビトロＴリンパ球生成系を提供する。本発明のイン・ビトロＴリンパ球生成系で生成された細胞の約１７〜７４％は、Ｔ細胞特異的表面抗原ＣＤ２を発現し；１．５〜３４％は、ＣＤ３を発現し；１６〜６１％は、ＣＤ４を発現し、そして０〜１５％は、ＣＤ８を発現する。ＣＤ１５又はＣＤ５６の発現（ナチュラルキラー細胞の表現型）は、検出されなかった。それ故、本発明は、ＣＤ３４を発現する前駆細胞からイン・ビトロで生成されたＴ細胞の単離された集団を提供し、その集団中のＴ細胞の約１７〜７４％はＣＤ２を発現し、その集団中のＴ細胞の約１．５〜３４％はＣＤ３を発現し、そしてその集団中のＴ細胞の約１６〜６１％はＣＤ４を発現する。本発明のＴ細胞の集団は、リンパ球特異的なＲＡＧ−２遺伝子を発現する。更に、本発明のイン・ビトロ系で生成されたＴ細胞は、Ｔ細胞向性ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のＨＩＶ−１_IIIB株による感染に対して感受性である。それ故、本発明のＴ細胞は、発生中のＴ細胞のＨＩＶ感染に影響を与える薬物を同定するために利用することができる。本発明は又、ｉ）ＣＤ３４を発現する前駆細胞の集団を用意し；そしてii）その前駆細胞をインターロイキン１２（ＩＬ−１２）の存在下で培養するステップを含むＴ細胞をイン・ビトロで生成する方法をも提供する。好ましくは、これらの前駆細胞は、ヒト骨髄細胞、ヒト臍帯血液細胞、ヒト末梢血液細胞又はヒト胎児肝細胞である。これらの前駆細胞は、胸腺間質の集密的単層及びＩＬ−１２を含むサイトカイン又はサイトカインの組合せの存在にて（好ましくは、ｆ１ｋ２／ｆ１ｔ３リガンドと組合せて）培養することができる。本発明の方法の最も好ましい具体例において、ＩＬ−１２は、約１０ｎｇ／ｍｌの濃度で存在し、ｆ１ｋ２／ｆｌｔ３リガンドは、約１００ｎｇ／ｍｌの濃度で存在する。本発明のイン・ビトロで生成されたＴ細胞は、製薬組成物にて治療上有効な量で用いることができる。好ましくは、かかる組成物は、製薬上許容し得るキャリアー及び／又は製薬上許容し得る塩を含む。本発明のイン・ビトロで生成されたＴ細胞は、Ｔ細胞の発生に影響を与える薬物又は因子を同定するために用いることができる。この発明は又、ｉ）少なくとも約９５％の純度のＣＤ３４陽性の哺乳動物骨髄細胞集団；及びii）インターロイキン１２を含み、好ましくはiii)ｆｌｋ２／ｆｌｔ３リガンド；iv）胸腺間質細胞の集団；及び／又はｖ）薬物をも含む組合せをも提供する。図面の簡単な説明図１は、本発明の方法の好適具体例の概略図を示す。図２は、本発明のイン・ビトロＴリンパ球生成系の好適具体例において前駆細胞として用いた低密度骨髄単核細胞の種々の免疫表現型亜型の増殖能力を図解するものである。図３は、本発明のイン・ビトロＴリンパ球生成系で生成された細胞の典型的なフローサイトメトリー分析を示している。図４は、ＣＤ３４⁺細胞が、本発明のイン・ビトロＴリンパ球生成系における培養中にＲＡＧ−２発現を獲得することを示すＰＣＲ及びサザーンブロット結果を与えるものである。図５は、ＨＩＶ−１_IIIBにさらした１４日後のＨＩＶ抗血清及び抗ヒトＦＩＴＣで染色した本発明のＴ細胞を示す蛍光顕微鏡写真である。図６は、ＨＩＶ−Ｉ_IIIB又は熱不活化した（擬似）ウイルスにさらした後の間質のみ（パネルＡ）及びＣＤ３４⁺細胞を伴う間質（パネルＢ）の並行培養からの上清のＨＩＶｐ２４抗原レベルを示す２つのグラフを与えるものである。ＣＤ３４⁺細胞を含む培養における１１日後のｐ２４の増加は、胸腺間質単独では起こらず、発生中のＴ細胞の生産的ＨＩＶ感染の証拠である。図７は、本発明の培養細胞中のＩＬ−２のＥＬＩＳＡによる検出を示す棒グラフである。図８は、培養細胞によるＴＣＲ発現の獲得を図示している。２１日目の細胞を抗ＣＤ４−ＰＥ及び抗ＴＣＲα／β−１−ＦＩＴＣで染色した後にフローサイトメトリー分析した（Ａ）。２１日目のトリプシン処理した胸腺間質単独、培養ＣＤ３４⁺細胞又は対照のＣＤ２⁺細胞由来のＲＮＡを、ＴＣＲ発現についてＲＴＰＣＲにより分析した。図９は、培養細胞の免疫表現型を描写するものである。出力細胞集団を、示したフォワード及びサイドスキャッタークリテリアを用いてゲートで制御した（Ａ）。特定の時点における示した抗体で染色した細胞のフローサイトメトリー分析を示してある（Ｂ）。各時点は全細胞集団の分析を必要とし、それ故、示したデータは、独立した培養からのものであり、単一培養の連続的サンプリングを示すものではない。発明の詳細な説明上記のように、本発明は、有効なイン・ビトロＴリンパ球生成系を提供する。本質的に、ＣＤ３４⁺細胞は、「フィーダー」細胞の集密的単層の上にプレートされ、Ｔ細胞分化を誘導するように選択した成長因子の存在下で培養される。このフィーダー細胞層の調製のための好適組織源は、ヒトの胎児の胸腺組織である（他の起源例えば非ヒト霊長類又は他の哺乳動物からの胸腺間質、又は上述の起源から誘導された不滅化細胞系統も別法として用いることはできるが）。このフィーダー層は、当業者に公知の標準的技術を用いて調製することができる（例えば、Tjonnfjord等（前出）を参照されたい）。このフィーダー層の調製の好適方法は、後述の実施例１に記載する。本発明における使用のためのＣＤ３４⁺細胞は、種々の異なる起源例えば骨髄、臍帯血液、末梢血液幹及び胎児肝から得ることができる。ＣＤ３４⁺細胞の好適起源は、幾分かその容易な利用可能性の故に、骨髄である。本発明で利用されるＣＤ３４⁺細胞は、任意の利用し得る方法例えば蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）分析、免疫磁気ビーズ精製（若しくは、他の免疫沈降法）又はサイトカインを抗代謝剤と共に用いる機能的選択を用いて精製することができ、少なくとも約９５％の純度であるべきである（即ち、これらの細胞の少なくとも約９５％がＣＤ３４を発現すべきである）。精製されたＣＤ３４⁺細胞を、フィーダー層上にプレートして、サイトカイン又はサイトカインの混合物（好ましくは、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）を含み、多分、ｆｌｋ２／ｆｌｔ３リガンドをも含む）の存在下で、少なくとも約２週間（典型的には、約３５日を超えない）培養する。すべてのサイトカイン標品が、本発明のイン・ビトロＴリンパ球生成系において等しく有効な訳ではない。特に、我々は、ＩＬ−２、ＩＬ−７及びＳＣＦが、細胞の有意の部分の成熟Ｔ細胞への発生の刺激において、ＩＬ−１２と同程度に有効ではないということを見出した。典型的には、細胞は、本発明のイン・ビトロ系において、１４日の培養で約２０〜２５倍に増殖する（図２参照）。培養期間後に、本発明のイン・ビトロ系で生成された細胞を、Ｔ細胞マーカーの発現につき及び／又はＴ細胞活性について、例えば、Ｔ細胞表面マーカー例えばＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ２５及びＣＤ４４を検出するためのＦＡＣＳ分析を含む利用できる任意の方法を用いて分析することができる。典型的には、本発明のイン・ビトロＴリンパ球生成系で生成される細胞の約１７〜７４％は検出可能なＣＤ２を発現し、約１．５〜３４％は検出可能なＣＤ３を発現し、そして約１６〜６１％は検出可能なＣＤ４を発現する。このイン・ビトロ系により生成される細胞培養は、ＣＤ８を発現する細胞は僅かしか有しない；即ち、本発明のイン・ビトロ系にて生成される細胞の約１５％以下がＣＤ８＋である。本発明の培養細胞は又、Ｔ細胞特異的遺伝子（例えば、ＲＡＧ−２又はＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）遺伝子）の発現につき及び／又はＴ細胞特異的蛋白質（例えば、ＩＬ−２）の産生について、分子生物学の公知の技術を用いて分析することもできる（例えば、Sambrook等、Molecular Cloning: A Laboratory Manual C old Spring Harbor Press，ニューヨーク、1989（参考として本明細書中に援用する）を参照されたい）。ＲＡＧ−２発現の獲得は、培養期間中検出可能である（図４参照）。更に、ＴＣＲβ発現の獲得は、培養期間中検出可能である（図８参照）。ＩＬ−２産生は、本発明のイン・ビトロＴリンパ球生成系において生成された培養細胞中で検出可能である（図７参照）。ＩＬ−２の検出は、これらの培養細胞が成熟Ｔ細胞であることを確実にする。本発明のイン・ビトロ系で生成されたＴ細胞は、有糸分裂促進物質例えばＰＨＡ、ＰＭＡ、抗ＣＤ３レセプター（ＩＬ−２を伴う）に対する増殖応答につき、又は抗原に対する増殖応答について、公知技術を用いて試験することができる。本発明の培養細胞は、リンパ向性病原体に感染し易い。特に、培養細胞は、ヒト免疫不全ウイルスのＴ細胞向性株、ＨＩＶ−１_IIIBに感染し易い。例えば、胸腺間質フィーダー層上での１４日間の培養の後に、ＨＩＶ−１_IIIBにさらされた本発明のＴ細胞は、ＨＩＶｐ２４抗原を産生し、それは細胞上清において検出可能である（図６参照）。擬似ウイルス標品即ち熱不活化したウイルスにさらした培養細胞は、検出可能なｐ２４を産生しない。ＨＩＶ−１_IIIBにさらした細胞は又、ＨＩＶ−１抗血清を用いてＨＩＶについて陽性に染色される（図５参照）。それ故、本発明は、有効なイン・ビトロＴリンパ球生成系を提供する。本発明のイン・ビトロ系を利用してＴ細胞発生を研究することができ、Ｔ細胞の分化及び／又は増殖の所定の段階を邪魔し又は促進する潜在的な薬物の候補を同定することもできる。例えば、薬物を本発明の培養系に加えることができ、生成Ｔ細胞の数、免疫表現型、公知のＴ細胞刺激（例えば、ＰＨＡ、ＰＭＡ、抗ＣＤ３レセプター及びＩＬ２）に対する反応性、又は特定の病原体（例えば、ＨＩＶ若しくはＨＴＬＶ）による感染に対するそれらの薬物の効果を、薬物を加えてないか又は「偽薬」を加えた培養との比較によって測定することができる。「偽薬」は、測定するパラメーター（例えば、細胞数等）に有意に影響を与えない化合物である。所定の試験で用いる「偽薬」の特定の性質は、それと比較される薬物の特性に依存する。例えば、もし問題の薬物が蛋白質であるならば、適当な偽薬は、その蛋白質の変性バージョンであろう。当業者は、所定の薬物との比較のための適当な偽薬を容易に同定することができるであろう。本発明のイン・ビトロＴリンパ球生成系において試験することのできる典型的薬物には、Ｔ細胞の発生及び／又は増殖に対する効果を有すると思われる任意のすべての化合物（例えば、シクロフィリン）が含まれる。事実、本発明のイン・ビトロＴリンパ球生成系は又、試験すべき化合物の起源としても利用することができる。即ち、本発明のイン・ビトロＴリンパ球生成系又はその化合物は、公知の手順に従って分画することができ（例えば、Huang 等、Cell 63:225-233,1990 ;Zsebo 等、Cell 63:195-201,1990（各々を参考として本明細書中に援用する）を参照されたい）、個々の画分を、Ｔ細胞発生に対するそれらの効果について試験することができる。望ましい活性を有する画分（例えば、Ｔ細胞発生及び／又は増殖の１つ以上の面に影響を与える画分）を、更に、個々の活性因子が同定されるまで、公知の技術によって分画することができる。次いで、活性因子を精製することができ、蛋白質因子をコードする遺伝子を当分野において利用できる技術例えば Current Protocols in Molecular Biology（John Wiley & Sons）及びCurrent Protocols in Immunology （John Wiley & Sons）に開示されたものによってクローン化することができる。Ｔ細胞発生及び／又は増殖に影響を与える活性因子は、例えば、本発明のイン・ビトロＴリンパ球生成系の間質成分から導くことができる。不滅化してない又は不滅化した一次間質細胞を利用することができる。不滅化技術（例えば、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）ラージＴ抗原又はミドルＴ抗原を用いる形質導入）は、当分野で公知である（例えば、Williams等、Mol.Cell.Biol.8:3864,1988 を参照されたい）。本発明の培養系は、所定の薬物（又は薬物の組合せ）がその効果を発揮するＴ細胞個体発生中の時点を容易に決定することができるように、薬物を種々の時点で加えることができるという更なる利点を有する。本発明のイン・ビトロＴリンパ球生成系及びそれにより生成された細胞についての他の貴重な応用は、Ｔ細胞の遺伝的操作のための系としてである。外来性の遺伝物質を、遺伝子トランスファーの任意の利用可能な方法例えばトランスフォーメーション、トランスフェクション、感染（例えば、レトロウイルスベクター又はアデノウイルス若しくはアデノ随伴ウイルスを用いる）、形質導入、エレクトロポレーション等（例えば、Sambrook等、前出、参照）を用いて、例えばＣＤ３４⁺前駆細胞に導入した後に、サイトカインの存在下で培養することができる。Ｔ細胞を感染から保護する遺伝子例えば優性の負のＨＩＶ−１ｒｅｖ変異体又はＨＩＶ−１アンチセンス構築物を含むＴ細胞を、本発明のイン・ビトロ系を用いて生成することができる。望ましくは、本発明のイン・ビトロＴリンパ球生成系を用いて、Ｔ細胞に導入することのできる他の遺伝子には、例えば、公知の特異性の抗体をコードする遺伝子；レセプターリガンド遺伝子構築物、Ｔ細胞の反応性を促進する遺伝子（サイトカイン、サイトカインレセプター若しくは「共同刺激分子」例えばＣＤ２８、Ｂ７、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド等をコードする遺伝子等）が含まれる。幾つかの場合には、本発明の生成Ｔ細胞が、同様の遺伝的操作を受けていないＴ細胞と比較して増大した寛容を有するようにＴ細胞反応性を制限する遺伝子を導入することが望ましい。更に、本発明のイン・ビトロＴリンパ球生成系を利用して特定の反応性を有するＴ細胞を生成することができる。ペプチド等の抗原を、その抗原に対して反応性のＴ細胞のサブセットの増殖を誘導するためにこの培養系に加えることができる。幾つかの場合には、当業者には明らかであろうが、その抗原は抗原提示細胞例えばＴ２細胞、活性化Ｂ細胞、マクロファージ又は樹状細胞のコンテキストにて提示されるのが望ましい。かかる本発明の反応性Ｔ細胞は、例えば、病気例えば悪性又は感染性疾患の治療のための標的を定めた免疫学的反応を生成するための養子免疫療法で利用することができるであろう。事実、本発明のイン・ビトロ系で生成されたＴ細胞は、それらが特異的反応性を有するか否かによらず、種々の治療技術において利用することができる。特に、本発明の系で生成されたＴ細胞は、例えば養子免疫療法、ワクチン療法及び／又は遺伝子療法における製薬組成物において用いることができる。本発明のＴ細胞を含む典型的な製薬組成物は、適宜、製薬上許容でき且つ適合性のキャリアーと組合せた治療上有効な量のＴ細胞であり、それは、特定の遺伝子産物（上記参照）を発現することのできる遺伝子配列でトランスフェクト（又は、トランスフォーム若しくは感染）されていてもいなくてもよい。用語「製薬上許容でき且つ適合性のキャリアー」は、ここで用いる場合、下記で一層完全に記載するが、（ i）ヒト若しくは他の動物への投与に適した１つ以上の適合性充填希釈剤若しくは封入物質及び／又は(ii)Ｔ細胞を標的に送達することのできる系をいう。従って、本発明において、用語「キャリアー」は、この発明のＴ細胞と結合して投与を容易にする有機若しくは無機の成分（天然若しくは合成）を意味する。用語「治療上有効な量」は、所望の結果を生じ、治療される特定の状態に対して所望の影響力を発揮する本発明の製薬組成物の量をいう。種々の濃度を、同じ成分を取り込んでいる組成物の調製において用いて、治療を受ける患者の年齢、状態の重さ、治療の持続時間及び／又は投与の様式における変動に備えることができる。用語「適合性の」は、ここで用いる場合、製薬組成物の成分が、所望の製薬効果を実質的に損なう相互作用を生じることなく本発明のＴ細胞と及び互いに混合され得ることを意味する。本発明のＴ細胞は、それ自体（正味）で又は製薬上許容し得る塩と組合せて投与することができる。製薬上許容し得ない塩は、幾つかの場合には、製薬上許容し得る塩を調製するために便利に用いることができ、それ故、この発明の範囲から除かれない。製薬上許容し得る塩には、次の酸から調製されるものが含まれるが、これらに限られない：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、ｐ−トルエンスルホン酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、蟻酸、マロン酸、コハク酸、ナフタレン−２−スルホン酸及びベンゼンスルホン酸。製薬上許容し得る塩は又、カルボン酸基のアルカリ金属又はアルカリ土類塩例えばナトリウム、カリウム又はカルシウム塩として調製することもできる。本発明の製薬組成物は、非経口投与に最も適している。用語「非経口」は、皮下注射、静脈、筋肉、胸骨内注射又は点滴技術を含む。非経口投与に適した好適組成物は、好ましくはレシピエントの血液と等張であるこの発明のＴ細胞の無菌水性調製物を含んでよい。用い得る許容し得るビヒクル及び溶媒の内には、水、リンゲル溶液及び等張塩化ナトリウム溶液がある。この発明のＴ細胞は又、例えば、ワクチンにおける使用のための部分に結合させることもできる。このＴ細胞が結合される部分は、蛋白質、炭水化物、脂質等であってよい。カップリングは、Ｔ細胞と他の分子がそれぞれの活性を保持するならば、これらの２つの部分を結合する任意の化学反応によって達成することができる。この結合は、多くの化学的機構例えば共有結合、親和性結合、インターカレーション、配位結合及び複合体形成を含むことができる。好適な結合は、共有結合である。共有結合は、存在する側鎖の直接的縮合又は外部の架橋分子の組み込みによって達成することができる。多くの二価又は多価の結合剤は、例えば、蛋白質分子を他の分子（例えば、本発明のＴ細胞と結合した分子）にカップリングさせるのに有用である。例えば、代表的なカップリング剤には、有機化合物例えばチオエステル、カルボジイミド、スクシンイミドエステル、ジイソシアネート、グルタルアルデヒド、ジアゾベンゼン及びヘキサメチレンジアミンが含まれ得る。この一覧は、当分野で公知の種々のクラスのカップリング剤を網羅することを意図するものではなく、一層一般的なカップリング剤の例示である（例えば、Killen等、J.Immun.13 3:1335-2549,1984; Jansen等、Immunol.Rev.62:185-216,1982; 及びVitetta 等、前出を参照されたい）。Ｔ細胞が結合し得る部分は、アジュバントであってもよい。用語「アジュバント」は、患者における免疫応答を強化するＴ細胞に取込まれ又はＴ細胞と同時に投与される任意の物質を含むことを意図している。アジュバントには、アルミニウム化合物例えばゲル、水酸化アルミニウム及びリン酸アルミニウムゲル、及び完全若しくは不完全フロイントアジュバントが含まれる。パラフィン油は、種々の型の油例えばスクアレン又はピーナッツ油で置き換えることができる。アジュバント特性を有する他の物質には、ＢＣＧ（弱毒化Mycobacterium tuberculosis に他の微生物誘導体を加えたもの）、リン酸カルシウム、レバミソール、イソプリノシン、ポリアニオン（例えば、ポリＡ：Ｕ）、ルーティナン、百日咳毒素、脂質Ａ、サポニン及びペプチド例えばムラミルジペプチドが含まれる。例えば、ランタン及びセリウムの稀土類塩も又、アジュバントとして用いることができる。必要とされるアジュバントの量は、患者及び用いる特定の治療に依存し、過度の実験を用いることなく当業者によって容易に決定することができる。それ故に、本発明の典型的な製薬組成物は、治療上有効な量のこの発明のＴ細胞を単独で又は免疫アジュバント及び／又はキャリアーと組み合わせて含むことができる。本発明のイン・ビトロ系で培養された細胞はＨＩＶ−１による感染を受け易いので、この系を用いて、特に発生中のＴ細胞におけるＨＩＶ−１感染及び／又は複製を阻止する薬物を同定することができる。本発明のイン・ビトロ系を用いてＨＩＶ感染した細胞の発生及び／又は増殖を阻止する薬物を同定することもできる。例えば、標準的なウイルス感染技術を用いて、本発明のイン・ビトロ培養中の細胞に、ＨＩＶ−１の実験室株（例えば、ＨＩＶ−１_IIIB）又はＨＩＶ−１感染した個人からの一次患者単離株を感染させることができる。可能性のある薬物を、感染中の種々の時点で培養に加えることができ、それらの薬物のウイルス感染に対する効果を、標準的ＨＩＶ−１検出系（例えば、ＨＩＶ−１ｐ２４抗原についてのアッセイ、逆転写酵素アッセイ、免疫蛍光アッセイ又はＰＣＲベースのアッセイ）を利用し且つ見出された結果を薬物で処理してない感染培養物又は上記の偽薬で処理した感染培養物と比較してアッセイすることができる。本発明の系を用いて分析することのできる幾つかの可能性のある薬物及びそれらの薬物のＨＩＶ感染に対する効果をアッセイする方法の例に関しては、例えば、Tsubot a 等、J.Clin.Invest.86:1684-1689,1990; Gao 等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90 :8925-8928,1993;及びMeyerhans 等、J.Virol.68:535-540,1994を参照されたい。この発明を、更に、下記の実施例によって説明するが、これらは、決して更に限定するものと解釈すべきではない。この出願中で引用されたすべての参考書類（参考文献、発行された特許、公開された特許出願及び同時係属中の特許出願を含む）を、明白に、参考として本明細書中に援用する。実施例実施例１：イン・ビトロで生成されたＴ細胞の調製及び分析胸腺間質培養胸腺を、告知に基づく母親の同意の後に選択的に流産した妊娠１８〜２４週目のヒト胎児から取り出して（メリーランド、Laurel在、Anatomic Gift Foundation）室温で培養培地中に移した。胸腺組織を、外科用ナイフを用いて小断片にミンスし、次いで、組織ふるいを通して単細胞懸濁液を得た。細胞を、リン酸緩衝塩溶液（ＰＢＳ）にて２回洗い、２０％ＦＣＳ（ミズーリ、St.Louis 在、Sigma）、グルタミン、ペニシリン及びストレプトマイシンを含むIscove改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）（Washington,DC 在、Mediatech）中に再懸濁させた（２×１０⁶／ｍｌの密度）。この細胞懸濁液を、２４ウェル組織培養プレートに、ウェル当り１ｍｌでプレートして、５％ＣＯ₂を含む加湿インキュベーター中で、１０〜１４日間３７℃で培養して集密的間質の単層を形成させた。直ちに使用しない胸腺細胞は、１０％ＤＭＳＯにて低温保存し、解凍後に培地で洗った後に上記のようにプレートした。成人骨髄及び胎児肝からのＣＤ３４±細胞の精製告知に基づく同意を得て、健康な成人志願者から腸骨稜吸引により骨髄試料を得た。胸腺について上記したように胎児肝（妊娠１８〜２４週目）を得て、単細胞懸濁液を同様にして調製した。単核細胞（ＭＮＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｃｑｕｅ（スウェーデン、Uppsala在、Pharmacia Biotechnology）上での遠心分離によって骨髄又は肝臓試料から分離し、２回洗って、ＩＭＤＭ中に懸濁させた。骨髄ＭＮＣを一晩培養して粘着細胞を除去してから更なる精製を行なった。ＣＤ３４⁺画分を単離するために、これらの細胞を先ずマウス抗ヒトＣＤ３４ＩｇＧ１モノクローナル抗体（メイン、Westbrook 在、Amac Inc.）と共に１時間４ ℃にインキュベートし、ＩＭＤＭにて２回洗ってから、抗マウスＩｇＧ（ニューヨーク、Great Neck在、Dynal Inc.）で被覆したＤｙｎａｂｅａｄｓＭ−４５０と共に１時間４℃で穏やかに撹拌しながらインキュベートした。選択した細胞をマグネットを用いて４回洗い、顕微鏡検査によってそれらの純度をチェックした。幾つかの実験において、骨髄ＭＮＣは又、負のビーズ選択により（マウス抗ＣＤ２モノクローナルＩｇＧ１抗体で被覆したＤｙｎａｂｅａｄｓＭ−４５０（Dynal In c.）を用いる負の選択の２ラウンドにより又は抗ＣＤ３４ＤＥＴＡＣＨＡＢＥＡＤＳ（商標）（Dynal,Inc.）の使用による）又はセルソーティングによって、Ｔ系列の細胞を涸渇させた。ＣＤ２⁺ＣＤ３４^-及びＣＤ２⁺ＣＤ３４⁺画分を、対照実験での使用のために、ＦＡＣＳにより精製した。蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）分析による骨髄細胞画分の精製骨髄ＭＮＣを、下記のように、ＦＩＴＣ結合した抗ＣＤ３４及びＰＥ結合した抗ＣＤ２抗体を用いて染色した。染色した細胞を、ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅセルソーター（カリフォルニア、San Jose在、Becton Dickinson）を用いてソートした；２色蛍光をＦＬ１及びＦＬ２チャンネルでログ増幅を用いて定量し、ＣＤ３４⁺ ＣＤ２⁺及びＣＤ３４⁺ＣＤ２^-画分を別々に集めた。ＣＤ３４±培養ウェル当り５×１０⁴〜１０⁵の上記のように精製したＣＤ３４⁺を、最初に多数回洗ってすべての非粘着細胞を除去した胸腺間質単層上にプレートした（幾つかの実験では１５Ｇｙで照射した）。次いで、これらの細胞を、下記のように、追加のサイトカインを有するか又は有しないＩＭＤＭ／２０％ＦＣＳにて、更に２〜４週間培養した。骨髄間質単層又は胸腺間質の代りに間質を有しない空のウェルの何れかを用いて対照用培養を行なった。培養には、各ウェルから培地の大部分を注意深く取り除いて１ｍｌの新鮮な培地及び適当なサイトカインで置き換えることによって毎週２回培地を供給した。サイトカイン次のヒトのサイトカインを組合せて加えて、Ｔ系列分化を促進するための最適条件を達成した：５％、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）、１０ｎｇ／ｍｌ（ニューメキシコ、Minneapolis 在、R&D Systems）及びｆｌｋ２／ｆｌｔ３リガンド、１００／ｎｇ（ワシントン、Seattle 在、ImmunexのS.Lyman 博士提供）。フローサイトメトリーによる培養細胞の免疫表現型分類細胞を、プレートしてから２〜４週間の種々の時点で、培養プレートから、間質細胞を後に残すように、穏やかな吸引によって採集した。これらの細胞を計数し、トリパンブルー染色によりそれらの生存力を評価した。２〜５×１０⁵細胞のアリコートをＰＢＳ中で２回洗い、ヒト表面抗原に直接結合した（ＦＩＴＣ又はＰＥ）マウスモノクローナル抗体を用いて染色した。用いた抗体は、次のものであった：ＦＩＴＣ−抗ＣＤ３４（Amac Inc．）、ＦＩＴＣ−抗ＣＤ２及び抗ＣＤ７、ＰＥ−抗ＣＤ２、抗ＣＤ３、抗ＣＤ４、抗ＣＤ７及び抗ＣＤ８（マサチューセッツ、 Boston 在、Exalpha Corp.）、ＦＩＴＣ−抗ＴＣＲα／β１（Becton Dickinson ）、ＦＩＴＣ−抗ＣＤ５６＋抗ＣＤ１６。ＦＩＴＣ及びＰＥ結合したマウスイソ型対照抗体を各培養について用いた。染色を製造者の指示に従って行ない、細胞を１％パラホルムアルデヒドにて固定してからフローサイトメトリーにより分析した。フローサイトメトリー分析を、各試料からの１０，０００細胞について、ＦＡＣＳｃａｎサイトメーター（Becton Dickinson）を用いて行なった。二重色彩免疫蛍光を、ＦＬ１及びＦＬ２チャンネルでログ増幅を用いて定量し、ヒューレットパッカード９０００シリーズコンピューター用のＬＹＳＹＳII （Becton Dickinson）ソフトウェアを用いて分析した。図３は、ｆｌｋ２／ｆｌｔ３リガンド及びＩＬ−１２を補った本発明のＣＤ２涸渇したＣＤ３４⁺細胞培養の典型的なフローサイトメトリー分析（２１日目に採集）を示す。培養間でかなりの変動があったが、ｆｌｋ２／ｆｌｔ３リガンドとＩＬ−１２の組合せは、一貫して、Ｔ細胞マーカーを発現する細胞の最高画分を生じた。精製ＣＤ３４⁺細胞のこれらのサイトカインとの１４〜３５日間の培養は、１７〜７４％のＣＤ２発現、１．５〜３４％のＣＤ３発現及び１６〜６１％のＣＤ４発現を生じた。ＣＤ７の発現は、殆どの実験において、ＣＤ２の発現より低かった。ＣＤ８発現は、殆どの培養において低く（≦１５％）、ＣＤ１６又はＣＤ５６（ナチュラルキラー細胞のマーカー）の検出可能な発現はなかった。図９は、内部の指示について記載した系で培養したＣＤ３４⁺、ＣＤ２^-骨髄細胞の他の典型的フローサイトメトリー分析を示している。培養細胞によるＰＭＡ／ＰＨＡ刺激されたＩＬ−２産生採集した細胞中の比較的成熟したＴ細胞の存在を確認するために、２００μｌのＩＭＤＭ／２０％ＦＣＳ中の１０⁵のアリコートを、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）、３μｇ／ｍｌ及びホルボールミリスチン酸（ＰＭＡ）、５０ｎｇ／ｍｌ（両方ともSigma 社製）の添加を伴って又は伴わないで培養した。上記のように分離した骨髄ＭＮＣのＣＤ２⁺画分を陽性対照として用いた。４８時間後に培養上清を採集し、ＥＬＩＳＡ（R & D System ）によりインターロイキン２（ＩＬ−２）濃度をアッセイするまで−２０℃に保存した。低いが検出可能なレベルのＩＬ−２が、これらの培養上清中に認められた。ＲＡＧ−２及びＩＬ−２遺伝子発現についての逆転写とカップルしたポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）１０³〜１０⁴のソートし培養した細胞から、グアニジニウムイソチオシアネート抽出及び塩化セシウム中での超遠心分離によって全ＲＮＡを調製した。ランダムプライマー及びモロニー逆転写酵素（Gibco-BRL）を用いる逆転写によりｃＤＮＡを調製し、リンパ球分化を受けている細胞によってのみ一時的に発現されるヒトＲＡＧ−２遺伝子の４１５塩基対（ｂｐ）領域に特異的なプライマーを用いて増幅した。ＰＣＲ産物を２％アガロースゲル電気泳動により分析して、エチジウムブロミド染色後にＵＶ光下で写真を撮った（図４参照）。³²Ｐ標識した３２塩基のプローブを用いるサザーンブロットハイブリダイゼーションとその後のオートラジオグラフィーにより、特異性を確認した。実施例２：イン・ビトロで生成されたＴ細胞のＨＩＶ−２_IIIB感染無細胞のＨＩＶ−１_IIIB又は擬似ウイルス標品をイン・ビトロＴ細胞培養に加えて、ＨＩＶ−１感染に対する感染性を測定した。３〜４日間隔で上清を集めてＨＩＶｐ２４抗原レベルをＥＬＩＳＡにより測定した。同等物前述したことは、本発明のある好適具体例の詳細な説明に過ぎないということは理解されるべきである。それ故、この発明の精神及び範囲から離れることなく種々の改変及び同等物が為され得るということは、当業者には明白である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ (72)発明者フリードマン，アンドルーイギリス国２エフ１７エヌビーカーディフ，グレインジタウン，ウィンステイクロース４

Claims

【特許請求の範囲】１．ＣＤ３４を発現しインターロイキン１２で刺激された前駆細胞からイン・ビトロで生成されたＴ細胞集団であって、該集団中のＴ細胞の約１７〜７４％がＣＤ２を発現し、該集団中のＴ細胞の約１．５〜３４％がＣＤ３を発現し、該集団中のＴ細胞の約１６〜６１％がＣＤ４を発現し、そして該集団中のＴ細胞の約０〜１５％がＣＤ８を発現する、上記のＴ細胞集団。２．前記の集団中の少なくとも１つの細胞が外来の遺伝物質を含む、請求項１に記載のＴ細胞集団。３．前記の集団中の少なくとも１つの細胞がＨＩＶに感染している、請求項１に記載のＴ細胞集団。４．下記を含む、イン・ビトロでＴ細胞を生成する方法：ＣＤ３４を発現する前駆細胞の集団を用意し；そして該前駆細胞をインターロイキン１２（ＩＬ−１２）の存在下で培養する。５．前駆細胞の集団を用意するステップが、骨髄細胞、胎児肝細胞、臍帯血液細胞又は末梢血液細胞よりなる群から選択するヒト細胞の集団を用意することを含む、請求項４に記載の方法。６．用意するステップが、少なくとも約９５％の純度である前駆細胞の集団を用意することを含む、請求項４に記載の方法。７．９５％の純度の前駆細胞の集団を用意するステップが下記を含む、請求項６に記載の方法：該前駆細胞を含む細胞集団を用意し；粘着細胞を該細胞集団から除去し；該９５％の純度の前駆細胞の集団を、該細胞集団から、免疫磁気ビーズ単離又は蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）により単離する。８．９５％の純度の前駆細胞の集団を用意するステップが、更に、下記を含む、請求項７に記載の方法：前記の免疫磁気ビーズ又はＦＡＣＳにより単離した細胞の集団から、負のビーズ選択及び細胞ソーティングよりなる群から選択する方法によって、Ｔ細胞系列を涸渇させる。９．胸腺間質の集密単層を前記の前駆細胞に対して用意するステップを更に含み、培養のステップが、該前駆細胞をインターロイキン１２の存在下で該集密単層と接触させて培養することを含む、請求項４に記載の方法。１０．集密単層を用意するステップが下記を含む、請求項９に記載の方法：ヒト胎児の胸腺組織を用意し；該集密単層を該組織からの細胞から調製する。１１．培養のステップが、前記の前駆細胞をインターロイキン１２及びｆ１ｋ２／ｆ１ｔ３リガンドの存在下で培養することを含む、請求項４に記載の方法。１２．培養のステップが、前記の前駆細胞を約１０ｎｇ／ｍｌのインターロイキン１２及び約１００ｎｇ／ｍｌのｆ１ｋ２／ｆ１ｔ３リガンドの存在下で培養することを含む、請求項１１に記載の方法。１３．治療上有効な量の請求項１に記載のＴ細胞集団を含む製薬組成物。１４．製薬上許容し得るキャリアーを更に含む、請求項１３に記載の組成物。１５．製薬上許容し得る塩を更に含む、請求項１４に記載の組成物。１６．組み合わせた、少なくとも約９５％の純度のＣＤ３４陽性の哺乳動物骨髄細胞集団及びインターロイキン１２。１７．ｆ１ｋ２／ｆ１ｔ３リガンドを更に含む、請求項１６に記載の組合せ。１８．胸腺間質細胞の集団を更に含む、請求項１６に記載の組合せ。１９．胸腺間質細胞の集団を更に含む、請求項１８に記載の組合せ。２０．薬物を更に含む、請求項１９に記載の組合せ。２１．前記の集団の少なくとも１つの細胞がＨＩＶに感染している、請求項２０に記載の組合せ。