JPS61275223A - ヒト血清アルブミンの微生物学的調製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、蛋白質の合成に関する。

さらに詳しくは、生体外遺伝子操作にかけてチオキシリ
ポ核酸配列の協同転位させた。バクテリアによりヒト血
清アルブミンを合成する方法を提供する。

ヒト血清アルブミンは、関連するグルコシドを含有ぜす
、そして６６．０００程度の分子量を有する５８５アミ
ノ酸から成る蛋白質である。

遺伝的に、ヒト血清アルブミンは時間において２つの相
互優性の常染色体のアレリック遺伝子により暗号化（ｅ
ｎｃｏｄｅ）される、ヒト血清アルブミンの遺伝子は、
多形性であり、そして血清アルブミンの少なくとも２４
の変異型が知られており、そしてそれらの電気泳動の挙
動により差別される［シェル（Ｓｈｅｌｌ）およびブル
ンベルグ（Ｂｌｕｍｂｅｒｇ）、「ヒト血清アルブミン
の遺伝学（Ｔｈｅ　　ｇｅｎｅｔｉｃｓ　　ｏｆ　　ｈ
ｕｍａｎ　　ｓｅｒｕｍ　　ａｌｂｕｍｉｎ）、ｒアル
ブミンの構造１機能および使用（Ａｌｂｕｍｉｎ　　５
ｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｆｕｎｃｔｉｏｎ　　ａｎｄ　　Ｕ
ｓｅｓ）Ｊ、ロウゼノエル（Ｒｏｓｅｎｏｅｒ）、オラ
ン（Ｏｒａｔｚ）およびロスシルト（Ｒｏｔ　ｈｓｃｈ
ｉ　ｌｄ）編、パーガモ７ｅプレス（Ｐｅｒｇａｍｏｎ
　　Ｐｒｅｓｓ）、１９７７】。

血清アルブミンは間細胞中で合成され、次いで血清中に
分泌され、ここでそれは最も豊富な蛋白質を構成し、平
均濃度は４ｇ／１００ｍ１血清程度である。それは血漿
のフンコチック（ｃｏｎｃｏｔｉｃ）圧力を維持におい
て論理的役目をはたし、こうして内部（細胞）の環境と
外部（循環〕の環境との間の均衡の安定に寄与し、その
均衡は、なかでも、体の正常の生理学的機能に適含する
細胞の水利のレベルの維持を提供する。

ヒト血清アルブミンは、また、「自然」疎水相分子（ス
テロイド類および胆汁酸塩類）と薬物分子をそれらの作
用部位へ移動させる役目をする。

この説明はヒト血清アルブミンを血液量の疾患、例えば
、二次性出血の急性血液量減退症または広範囲にわたる
火傷の治療において、および一般の外科におけるいわゆ
る体積膨張溶液における支持治療、および脱水状態（例
えば、・ネフローゼ症候群）の処置において使用され、
これらの使用のすべてはかなりの量（数ｌＯｇＺ日／患
者〕の血液の供給を必要とする。

ヒト血清アルブミンは、現在、Ｅ、Ｊ、コーン（Ｃｏ　
ｈ　ｎ）ら、ジャーナル会オブ・アメリカンφケミカル
・ソサイアティ（Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、ｓｏｃ、）（１
９４６）、６旦、４５９ベージ　ｅｔ　　ｓｅｑ、の技
術により血清から、あるいはＪ、リアウタウド（Ｌｉａ
ｕｔａｕｄ）ら、第１３回国際ＩＡＢＳ（７）会議（１
３ｔｈ　　Ｉｎｔｅｒｎａｔ、Ｃｏｎｇｒｅｓｓ　　ｏ
ｆ　　Ｉ　　Ａ　ＢＳ、ブタベス）；Ａ：蛋白質の精製
、生物学的標準の発展（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　　ｏ
ｆ　　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）（１９７３）カーガー（Ｋａ
ｒｇｅｒ）、編、ペイル（Ｂａｌｅ）、２ヱ、１０７ペ
ージ　ｅｔ　　ｓｅｑ、の技術により胎盤から抽出され
る。これらの源は１世界の市場の要件をめったに満足せ
ず、いくつかの欠点、なかでも、それらのある種の性質
の悩まされる。その上、それらは汚染（肝炎１例えば、
より最近後天性免疫不全症候群）の危険を回避せず、そ
してこれは蛋白質を治療に使用したとき劇的な結果を生
ずるであろう。

生体外遺伝子組換え技術は、現在、微生物、例えば、エ
シェリヒア拳コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌ
ｔ）バクテリアが蛋白質またはポリペプチドを合成でき
るようにさせる可能性を提供し、そして、治療において
、これは制限されない量でなされている［例えば、Ｆ、
グロス（Ｇｒ。

Ｓ）ら、サイエンス番デ・う・ビニ・エト・ソシエテ（
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　　ｄｅ　　ｌａ　　Ｖｉｅｅｔ　　
５ｏｃｉ＆ｔ６）、ドキュメンテイション”７ランカイ
ズ（Ｄｏｃｕｍｅｎｔ　ａｔ　ｉ　ｏｎＦｒａｎｃａｉ
　ｓｅ）　１ｍ、１９７９］　。

Ｆ、ジャコブ（Ｊａｃｏｂ）らの古典的実験以来、ＤＮ
Ａは、一方において、１群のいわゆる「構造」遺伝子、
すなわち、所定の蛋白質の遺伝情報を指定する）（ｃｏ
ｄｅ　　ｆｏｒ）遺伝子を含有し、他方において、「調
節」遺伝子、すなわち、構造遺伝子の発現を調節するこ
とのできる遺伝子を含有し、これらの２つの型の組み合
わせは「オペロン」として知られている実在物を形成す
る。

分子生物学における研究およびＤＮＡ配列化（ｓｅｑｕ
ｅｎｃｉｎｇ）技術の発展［Ｆ、サンガー（Ｓａｎｇｅ
ｒ）およびＡ、Ｒ，コウルソン（Ｃｏｕｌｓｏｎ）、ジ
ャーナル拳オブー％Ｌ／キュラー・バイオロジー（Ｊ、
Ｍｏ１．Ｂｉ。

１、）（１９７５）、９４．４４１ページ　ｅｔｓｅｑ
、およびＡ、Ｍ、−’クサム（Ｍａｘａｍ）およびＷ、
ギルバート（Ｇｆ　ｌ　ｂｅ　ｒｔ）。

プロシーディンゲス会オプ・ナショナル・アカデミ−・
オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ　、Ａｃａｄ
、Ｓｃｉ　、）ＵＳＡ　（１９７７）、７４．５６０ペ
ージ　ｅｔ　　ｓｅｑ、］は、Ｆ。

ジャコブ（Ｊａｃｏｂ）およびＪ、モノド（Ｍ。

ｎ　ｏ　ｄ）　　［Ｆ　、ジャコブ（Ｊａｃｏｂ）およ
びＪ、モノド（Ｍｏｎｏｄ）、Ｃｏ１ｄ　　Ｓｐｒｉｎ
ｇ　　Ｈａｒｂｅｒ　　Ｓｙｍｐ、Ｑｕａｎｔ、Ｂｉｏ
１、（１９６１）、２６，１９３ページ　ｅｔ　　ｓｅ
ｑ、；Ｆ、ジャコブ（Ｊａｃｏｂ）およびＪ、モノド（
Ｍｏｎｏｄ）、ジャーナル壷オブ・モレ午ユラーーバイ
オロジー（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏ１、）（１９６１）、２
６．３１８ページｅｔ　　ｓｅｑ、］が認識したように
、オペロンの有機化を特定すること、および２つの型の
遺伝子の一次構造の特別な面を同定することを可能とし
た。

こうして、すべての構造遺伝子はいわゆる「翻訳開始」
コドン（ＡＴＧ）決定「停止」コドンにより取囲まれて
いる。開始コドンの機能は、ホルミルメチオニンを有す
る転位ＲＮＡを結含することである。蛋白質鋼はこのホ
ルミルメチオニンから構造遺伝子により暗号化されるア
ミノ酸の順次の結合により伸長するであろう：　「停止
」コドンは最後に伸長を停止トさせかつ新しく形成した
蛋白質を開放させるであろう。

調節遺伝子（プロモーター、リプレッサー）、例えば、
ＲＮＡポリメラーゼが結含するＤＮＡ断片として定義さ
れるプロモーター、に関すると、最も高度の保存される
配列を同定することが可能であった［Ｄ、プリプナウ（
Ｐｒｉｂｎｏｗ）、プロシーデインダス・オブｅナショ
ナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、Ｎ
ａｔ１、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）ＵＳＡ（１９７５）。

７２．７８４ページ　ｅｔ　　ｓｅｑ、］　　；同様に
、リボソーム結合部位のレベルで最も高度に保存された
ＤＮＡ配列を定義することが可能であった（Ｊ、シャイ
ｙ（Ｓｈｉｎｅ）およびり、ダルガル／　（Ｄａｌｇａ
ｒｎｏ）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）（１９７５）、
２５４．３４ページｅｔ　　ｓｅｑ、］、前記部位は転
写されたＤＮＡを蛋白質に翻訳するとき重要な役割を演
する。

こうして、バクテリアの調ｍ３１１伝子はそれゆえそれ
らの機能的性質によりおよびまたそれらの一次配列によ
り定義することができ、そして生体外遺伝子組換え技術
はそれらの制御のもとに構造遺伝子を配置するための良
好な説明を与え、これはＤＮＡを特定の点で切断する「
制限酵素」の存在の結果可能である［Ｈ、Ｏ、スミス（
Ｓｍｉｔｈ）およびに、Ｗ、ウィルコックス（Ｗｉｌｃ
。

ｘ）、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー
（Ｊ　、Ｍｏ　ｌ　、Ｂｉ　ｏ　ｌ　、）　　（１９７
０）、Σ↓、３７９ページ　ｅｔ　　ｓｅｑ、、Ｍ、メ
セルンｙ（Ｍｅｓｅｌｓｏｎ）およびＲ。

ユアン（Ｙｕａｎ）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）（１
９６８）、２１７．１１１０ページ　ｅｔ　　ｓｅｑ、
、）１．Ｊ、ｏパーツ（ＲｏｂｅｒｔＳ）、核酸の研究
（Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、（１９８２）
、↓、１３５７ページｅｔ　　ｓｅｑ、）。

用いる技術は、他の面において知られており。

これらの酵素を協同使用してＤＮＡを前もって訣ｉした
点で切断し、そして「リガーゼ」として知られている酵
素を使用して断片を一緒に結含するｌＰ、Ｅ、口へン（
Ｌｏｂａｎ）およびＡ、Ｅ。

カイザー（Ｋａｉｓｅｒ）、ジャーナル・オブｅモレギ
ュラー会バイオロジー（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏ１、）（１
９７３）、７８．４５３ページｅｔ　　ｓｅｑ、Ｊ。こ
のアセンブリーは１ベクター」　（プラスミドまたはバ
タテリオファージ）により運ばれ、他の面において知ら
れている方法により、バクテリア、例えば、Ｅ、ｃｏｌ
ｉにより導入されることができ、そして宿主バクテリア
の生Ｈの間そこに維持されることができる［Ｍ。

“１ンデル（Ｍａ　ｎ　ｄ　ｅ　１）およびＡ、ヒガ（
Ｈｉｇａ）、　ジャーナル・オブ１モレキュラー・バイ
オロジー（Ｊ　、ＭＯ１、Ｂｆ’ｏ　ｌ　、）　　（１
９７０）、５３．１５４ページ　ｅｔｓｅＱ、］。

本発明は、微生物中でヒト血清アルブミンを生物合成す
る方法を提供する。

この目的を達成するために、ヒト血清アルブミンのため
の構造遺伝トはそれが開始コドンを有するような方法で
生体外で修飾され、そして修飾された構造遺伝子は次い
で誘導調節遺伝子へ結合される。

この修ｍ１ｉｉ仏子を含有する宿主バクテリア、例えば
、Ｅ、ｃｏｌｉの培養は、規定された条件下で誘導後、
アルブミンを実質的なレベルで生産する。

以下において、分子生物学において使用する技術用語は
通常の意味を有する［例えば、［遺伝子の分子生物学（
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　　Ｂｉｏｌ。

ｇＹ　　ｏｆ　　ｔｈｅ　　Ｇｅ’ｎｅ）Ｊ、Ｊ、ワト
ソン（Ｗａｔｓｏｎ）著、（フランス語編、インターエ
ディシ、ｙ（Ｉｎｔｅｒｅｄｉｔｉｏｎ）１９７８）参
照］、以下において、ヒト血清アルブミンの構造および
その発現に使用方法を順次に説明する。

例えば、バイオプシーにより得た、肝細胞を使用し、そ
してメツセンジャーＲＮＡは記載されている方法、例え
ば、次の文献に記載されている方法により、前記肝細胞
から抽出する：ｖ、グリシン（Ｇ　１　ｉ　ｓ　ｉ　ｎ
）ら、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
）（１９７４）、１３．２６３３ページ　ｅｔ　　ｓｅ
ｑ、およびＲ。

ディーレイ（Ｄｅｅｌｅｙ）ら、ジャーナル曽オプ・バ
イロジカル会ケミストリー（Ｊ、Ｂｉ。

１、ｃｈｅｍ、）（１９７７）、２５２．８３１０　　
ｅｔ　　ｓｅｑ、、前記バイオプシー物質を６モルのチ
オシアン酸グアニジン溶液で処理し、そして合計のＲＮ
Ａを一２０℃におけるエタノール中の沈殿、遠心および
遠心沈殿物の復元のいくつかのサイクルにより精製する
。

調製をＨ，アビブ（Ａ　ｖ　ｉ　ｖ）およびＰ、レター
（Ｌｅｄｅｒ）、プロシーディンゲス・オブφナショナ
ル・アカデミ−・オプ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａ
ｔ　１　、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ　、）ＵＳＡ　（１９７２
）、６旦、１４０８ページ　ｅｔｓｅｑ　、の技術に従
いオリゴ（ｄＴ）−セルロースのカラムの親和クロマト
グラフィーのいくつかのサイクルにかけることにより、
調製物のメツセンジャーＲＮＡを濃縮する。このように
して単離されるメツセンジャーＲＮＡは、１〜２％のＲ
ＮＡを含有し、水溶液中に一７０℃で貯蔵する。

合計の集団内のヒト血清アルブミンに対して特異的なメ
ツセンジャーＲＮＡの集団は検出することが可能である
［例えば、ウサギ網状赤血球溶解物中のＲＮＡ溶液のア
リコートの生体外翻訳により］、１つの方法はアメルシ
ャム（Ａｍｅ　ｒ　ｓ　ｈａｍ）により供給される網状
赤血球溶解物をこの供給会社が推奨する方法に従い使用
することからなる。こうして、新しく形成した蛋白質の
分画を検出することが可能であり、これを新しく形成し
た蛋白質の全群内で抗アルブミン抗体により免疫沈殿さ
せる。

ａ、　第−鎖の合成 Ｇ、Ｎ、ブエル（Ｂｕｅ　ｌ　１）ら、ジャーナル番オ
ブ・バイロジカルΦケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｆ−Ｃｈ
ｅｍ、）（１９７ｇ）、２５３．２４７１　　ｅｔ　　
ｓｅｑ、の変更法を用いて出発し、例えば、５終ｇの合
計のメツセンジャーＲＮＡを次の成分を含有する合計５
０−１の容積中で使用する：１００ミリモルのトリス・
ＨＣＩ　　ｐ　　Ｈ８，３，１０３９モルのＭｇＣ１２
，０，４ミリモルのＤＴＴ、２０ミリモルのＫＣ１、０
．４ミリモルのＮａピロホスフェート、各ヌクレオチド
トリホスフェート（ｄＮＴＰ）に関して１ミリモル、１
００ｇｇ／ｍｌのオリゴ（ｄＴ）１２−１８．０．５Ｕ
／ｍｌのリポヌクリアーゼ阻害剤、５０ピコモルの放射
性トレーサーおよび４０１位の逆トランスクリプターゼ
（ライフ・サイエンス・インコーホレーテッド）。

相補的ＤＮＡ　（ｃＤＮＡ）へのメツセンジャーＲＮＡ
の逆転写の反応は４２℃で１時間実施する。

ｃＤＮＡの合成の程度は、既知の技術に従い、酸沈澱性
分子中に組込まれたレベルを測定することによって計算
する。

１時間後、この反応をＥＤＴＡ　（２０ミリモル）の添
加により停止させ、そしてメッセンジ＋−ＲＮＡを５０
ミリモルのＮａＯＨ中テ４２℃で３時間アルカリ消化す
ることによって破壊する。

新しく形成したｃＤＮＡを組込まれなかったｄＮＴＰお
よびＲＮＡのアルカリ消化生成物からクロマトグラフィ
ー、例えば、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ１
００　（ファーマシア”７フイン・ケミカルズ）のカラ
ムのクロマトグラフィーにより分離する。　５Ｊｊ−ｇ
の全体のメツセンジャーＲＮＡから１．５ルｇの一本釦
ｃＤＮＡが得られる。

ｂ、　第二鎖の合成 一本釦ｃＤＮＡをＤＮＡポリメラーゼエの「フレナラ（
Ｋｌｅｎｏｗ）」断片の作用により二本鎖ＤＮＡに転化
する。

反応条件は、次の通りである：ｌＯＯミリモルのへペス
（Ｈｅｐｅｓ）ｐＨ７，１０３９モルのＭｇＣｌ２．２
．５ミリモルのＤＴＴ、７０ミリモルのＫＣＩ、各ｄＮ
ＴＰに関して０．５ミリモルおよび５（１位のＤＮＡポ
リメラーゼＩ「フレナラ」断片（例えば、ニュー・イン
グランド・バイオラプス・インコートレーテッドから入
手可能）。

この反応を１５℃において１５時間実施し、そして二本
鎖ＤＮＡを再びセファデックスＧ１００のカラムのクロ
マトグラフィーにより組込まれなかったｄＮＴＰから分
離する。

Ｃ１二本鎖のＤＮＡのクローニング −末鎖ＤＮＡ分子を排除しかつプラント末端（ｂｌｕｎ
ｔ　　ｅｎｄｅｄ）二本ｆｉＤＮＡを得るため、不対配
列をＡ、エフストアジアチス（Ｅｆｓｔｒａｄｉａｔｉ
ｓ）ら、細胞（Ｃｅｌｌ）（１９７６）、ヱ、２７９ペ
ージ　ｅｔ　　ｓ　　ｅｑ、に記載される技術に従いＳ
１ヌクレアーゼで処理する。二本鎖の新しく形成したＤ
ＮＡをスクロース勾配の遠心により大きさによって分離
する。一般に、５０ミリモルのトリス・Ｈｅ　ｌ　ｐＨ
８，５中のスクロースの５％〜２０％の勾配を使用し、
２０℃で２１０．０００ｇにおいて１５時間遠心し、そ
して勾配を遠心後アリコートに分画する。

各分画中の分子の大きさを既知の大きさのＤＮＡ標準を
使用して並行して実施する試料の電気泳動により監視し
、モして５００塩基対より大きい鎖から成るＤＮＡを含
有する分画を合わせる。

このＤＮＡをクローニングする目的で、Ｆ、ロウゲオン
（Ｒｏｕｇｅｏｎ）ら、ジャーナル・オブΦバイロジカ
ル会ケミストリー（Ｊ、Ｂｉ。

１、Ｃｈｅｍ、）（１９７７）、２旦２．２２０９　　
ｅｔ　　ｓｅｑ、の技術に従い、その３−末端をオリゴ
（ｄＣ）で伸張し、そして、並行して、プラスミドベク
ターｐＢＲ３２２のＰｓｔＩ部員の３′末端をオリゴ（
ｄＧ）で伸張する。

次いで、前述の二本鎖ＤＮＡを、例えば、Ｌ。

ビラ−コマ口ｙ　（Ｖｉ　Ｉ　ｌａ−Ｋｏｍａｒｏｆｆ
）ら、プロシーディンゲス・オブ・ナショナル・アカデ
ミ−・オプ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔ１、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）ＵＳＡ（１９７８）、
ムｊ、３７２７ページ　ｅｔ　　ｓｅｑ、の技術に従い
、前記プラスミドベクターと交雑させる。

Ｍ、ｆ７デル（Ｍａｎｄｅｌ）およびＡ、ヒガ（Ｈｉｇ
ａ）、ジャーナル・オプ・モレキュラー・バイオロジー
（Ｊ　、Ｍｏ　１　、Ｂ　ｉ　ｏ　１．、）　　（１９
７０）、５３．１５４ページ　ｅｔ　　ｓｅｑ。

およびＭ、ディゲルト（Ｄａｇｅｒｔ）およびｓ、ｎ、
ｚ−リッヒ（Ｅｒｌｉｃｈ）、遺伝子（Ｇｅｎｅ）（１
９７９）、５３．２３ページｅｔ　　ｓｅｑ、に記載さ
れる方法に従い、旦ユＡｌ±１バクテリアをこの交雑さ
せたＤＮＡで形質転換することにより、肝ｃＤＮＡのク
ローンの「ライブラリー（ｌｉｂｒａｒｙ）Ｊをつくる
。

ｄ、　アルブミンｃＤＮＡクローンの同定その配列がヒ
トアルブミンの蛋白質配列から推論される合成オリゴヌ
クレオチドを使用した、コロニーの交雑技術を用いる［
Ｂ、メロラン（Ｍｅｌ　ｏ　ｕ　ｎ）ら、ＦＥＢＳレタ
ーズ（１９７５）、５８．１３４ページ　ｅｔ　　ｓｅ
ｑ、；Ｍ、グルンステイン（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ）およ
びり、ホグネス（Ｈｏｇｎｅｓｓ）、プロシーディンゲ
ス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシ
ズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、ｓｃｉ　、）Ｕ
ＳＡ　（１９７５）、７２．３９６１ベージ　ｅｔ　　
ｓｅｑ、；Ｒ，Ｂ、ワレス（Ｗａｌｌａｃｅ）ら、核酸
の研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅｓ、（
１９８１）、９．８７９ページ　　ｅ、ｔ　　　ｓｅｑ
、］。

２５　ｐ、　ｇ　／　ｍ　ｌのテトラサイクリンを含有
するルリア（Ｌｕｒｉａ）培地中で９６の系列で、直接
ニトロセルロースのフィルター上の四角形の皿の中で前
記クローンを培養する。３７℃で生胃させ、２５０ｇｇ
／ｍｌのクロランフェニコールの存在下に増幅させた後
、コロニーを水酸化ナトリウムで溶解し、次いで次の成
分を含有する溶液中において、キナーゼ処理により５′
位置においで放射線標識したオリゴヌクレオチドと交雑
させる：　５ＸＳＳＣ１１００μｇ／ｍｌの沸騰および
氷中の急冷により変性したサケ精子ＤＮＡ、および０．
５ｎｇ／ｍｌのキナーゼ処理したオリゴヌクレオチド、
交雑を３７℃で１８時間実施する０次いでフィルターを
５ＸＳＳＣで２５℃、次いで３７℃および次いで４５℃
で洗浄し、これを各段階で１５分間４回実施する。

次いで、フィルターを一７０℃において増強スクリーン
をもツコダック（Ｋ　ｏ　ｄ　ａ　ｋ）　Ｘ−ＯＭＡＴ
フィルムに１５〜２４時間露出する。プローブと交雑す
るクローンを再単離し、次いで溶解する。血漿ＤＮＡを
既知の技轡に従い塩化セシウム／臭化エチジウム媒質中
で遠心により精製する。

挿入のＤＮＡをマクサム−ギルバート（Ｍａｘａｍ−Ｇ
ｉ　１ｂｅｒｔ）の技術［Ａ、マクサム（Ｍａｘａｍ）
およびＷ、ギルバート（Ｇｉｌｂｅｒｔ）、Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ　　　Ｅｎｚｙｍｏ　　１　　。

（１９８０）、６５．４４９ページ　ｅｔ　　ｓｅｑ、
］により配列化して、このヌクレオチド配列から誘導さ
れる蛋白買配列をヒト血清アルブミンのそれと比較する
。

この方法において、１系列のクローンを同定し、ここで
インサージョン（ｉｎｓｅｒｔｉ。

ｎ）は全ヒト血清アルブミン遺伝子に相当する。

第１図は、血清アルブミン遺伝子の制限地図、ならびに
３つの最も代表的なインサージョン、ｒｐＴＩＢＩＩＪ
、ｒｐＡＡ３８Ｊおよびｒｐ６ｄ８」と表示する、の位
置を示す。

ｅ、　開始コドンの構　伝　中への組゛み（１８２図） ａ）プラスミドｒｐＴＩＢｎＪ　（７）ＤＮＡを酵素Ｐ
ｓｔＩおよびｐＴＩＢＩＩで消化し、そして血清アルブ
ミン遺伝子の５°末端の配列に相当する１２塩基対のＤ
ＮＡ断片を単離する（アミノ酸番号１〜６２）、ｐＴＩ
ＢＩＩ末端において、酵素ＢａｍＨＩの認識のための部
位から成る接合配列（ｊｕｎｃｔｔｏｎ　　５ｅｑｕｅ
ｎｃｅ）を結含する。Ｐｓｔ　Ｉ−ＢａｍＨＩ断片がこ
れにより得られる。

長さ２１塩基対の合成オリゴヌクレオチドを別々に調製
し、このオリゴヌクレオチドはヒト血清アルブミンのア
ミノ酸の遺伝情報を指定するヌクレオチドの前にｒＡＴ
ＧＪ　　）リプレットを有し。

そしてまたＮｃｏＩ制限部位を有し、そしてその配列は
次の通りである： ５　’　ＧＡＡＴＣＣＡＴＧＧＡＴＧＣＡＣＡＣＡＡＧ
３′ ＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断片を変性し、そして合成オリゴ
ヌクレオチドと交雑させる。交雑は前記５’　、、、、
、ＧＡＴＧＣＡＣＡＣＡＡＧ３’を通して達成され、そ
して相補的ＤＮＩＩの３′は不対である。不対末端を消
化し、次いでＨ，ジャコブソン（Ｊａｃｏｂｓｏｎ）ら
、ユーロピアン・ジャーナル・オブーバイオケミストリ
−（Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、）（１９７４）、４
河、６２３ページ　ｅｔ　　ｓｅｑ、の技術に従０１゛
重合を５°・・・・・、３′の方向にＤＮＡポリメラー
ゼエクレナウ断片を使用して実施する。

これによりＮｃｏ１、次いで５°末端にＡＴＧトリプレ
ー２トおよび３”末端にＢａｍＨＩ部位を含有する断片
が得られる。

ｂ）３つのＤＮＡ断片の結合を実施する：ｌ）プラスミ
ドｒｐＬＧ２００Ｊ　ｆ）ＥＣＯＲＩ−ＢａｍＨＩ断片
［Ｌ、グアレンチ（Ｇｕａｒｅｎｔｅ）ら、細胞（Ｃｅ
　ｌ　１）（１９８０）２０．５４３］抗体に抵抗性の
遺伝子、複製起源およびβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の
３゛末端を有する、 ２）プラスミドｒｐＧＬｌｏＩＪ　のＥｃｏＲＩ−ｐＴ
ＩＢＩＩ断片［Ｇ、ラウレル（Ｌａｕｅｒ）ら、Ｊ、Ｍ
ｏ１．Ａｐｐ１、Ｇｅｎｅｔ、（１９８１）、↓、１３
９ページ　ｅｔ　　ｓｅｑ、ｌ　ＰＩａｃプロモーター
およびＥ、ｃｏｌｉ　　１ａｃＺ遺伝子のリボソーム結
合部位（ＲＢＳ）を有する、 ３）ヒトアルブミンの最初の６２アミノ酸の遺伝情報を
指定する前述の突然変異誘発させたＤＮＡ断片。

ヒト血清アルブミン遺伝子の５′末端とＥ、ｃ−免ユ」
工β−ガラクトシダーゼ遺伝子との融合が達成されたプ
ラスミド（ｐＸＬ５２）が単離される。

ｆ、　主成」ＩＪ像υ町（工匠１困Σ プラスミド「２６ｄ８」のＤＮＡを、すでに述べた技術
に従い、ＥｃｏＲＩおよび部分的にＢｇＩＩＩで消化す
る。ヒト血清アルブミンの最後の４０５アミノ酸の遺伝
情報を指定する配列、引続いてこのプラスミドの複製起
源およびテトラサイクリン抵抗性遺伝子を含有する大き
いＥｃｏＲＩ−ＢｇｌＴｌ断片が単離される。

前述のプラスミドｒｐＸＬ５２ＪのＤＮＡをＥｃｏＲＩ
および５ａｕ３Ａで消化し、そしテ２００に！４基対を
含有する断片を単離する。

プラスミドｒｐＡＡ３８Ｊ　（７）ＤＮＡを５ａｕ３Ａ
で消化し、モして５４０塩基対を含有する断片をｌ離す
る。

５ａｕ３Ａ部位とＢｇ１１１部位との間の適合性を利点
を考慮して、３つの断片を結含する（［ＥｃｏＲＩ−５
ａｕ３Ａ］　−［ｐＡＡ３８　５ａｕ３Ａ−［ｐ６ｄ８
　　ＢｇＩｎ−ＥｃｏＲＩ］　（７）順序で）、ｒｐＸ
Ｌ５３」として知られるプラスミドが得られ、その構成
の品質をインサージョンとプラスミドベクターとの間の
接合に相当するＥｃｏＲ１部位とＰｓｔＩ部位との間の
断片の完成配列化により監視する。

完成ヌクレオチド配列を、誘導された蛋白質配列と一緒
に、第３図および第４図に示す。

この配列と文献に方向される蛋白質配列［Ｂ。

メロラン（Ｍｅｌｏｕｎ）ら、ＦＥＢＳレターズ（１９
７５）、５８，１３４ページ　ｅｔ　　ｓｅｑ、；Ｍ−
タイホー／　７　（Ｄ　ａ　ｙ　ｈ　ｏ　ｆ　ｆ　）　
、蛋白質の配列および構造の地図（Ａｔｌａｓ　　ｏｆ
Ｐｒｏｔｅｉｎ　　５ｅｑｕｅｎｃｅ　　ａｎｄ　　５
ｔｒｕｃｔｕｒｅ）（１９７８）、５、補充３．３０６
ページ］との間の変動は次の通りである１３１　　グル
タミン　　グルタミン酸３６４　ヒスチジン　　アラニ
ン ３６７　チロシン　　　ヒスチジン ３７０　アラニン　　　チロシン ３８１　　バリン　　　　メチオニン ４６４　グルタミン酸　ヒスチジン ４６５　ヒスチジン　　グルタミン酸 ５０１　　グルタミン　　グルタミン酸Ｂ、　ヒト血清
アルブミンの発現のための系の構成 ａ）プラスミドｒＰＸＬ５３Ｊを、開始コドン５°末端
のＮｃｏＩ部位に関してのみ、酵素ＮｃｏＩで部分的に
消化し、そしてプラント末端を充填（ｆｉｌｌｉｎｇ−
ｉｎ）により形成する［Ｒ、Ｍ　、ワルテル（Ｗａｒｔ
　ｅ　１　＋）およびＷ　、　Ｓ　−レズ＝コフ（Ｒｅ
ｚｎｉｋｏｆｆ）、遺伝Ｐ（Ｇｅｎｅ）（１９８０）、
旦、３０７ページ　ｅｔ　　ｓｅｑ、の技術に従う］。

制限酵素、例えば、ＢａｍＨＩの認識部位に相当する配
列、リボソーム結合部位に相当する部位［「コンセンサ
ス（ｃ　ｏ　ｎ　ｓ　ｅ　ｎ　ｓ　ｕ　ｓ）　　（ｃ　
。

ｎｓ）」または「理論的Ｊ　ＲＢＳＩを５′末端に含有
する［アダプター（ａｄａｐｔｏｒ）を合成する。この
アゲブタ−配列は５°ＧＧＡＴＣＣＴＡＧＧＡＧＧＡＡ
３　’である。

プラント末端ＤＮＡの５°末端におけるアダプターの結
合は、例えば、ｃ、ｐ、パール（Ｂａｈｌ）ら、遺伝子
（Ｇｅｎｅ）（１９７６）、１．８１ベージ　ｅｔ　　
ｓｅｑ、に記載されている。

この方法は次の成分を含有する溶液の２０３Ｌ１のつい
て反応を叉施することから成る＝５０ミリモルのトリス
−ＨＣｌ　　ｐＨ７，５，１０ミリモルのＭｇＣｌ２．
１５ミリモルのＤＴＴ、１ミリモルのＡＴＰ、５０４　
ｇ　／　ｍ　ｌのアダプター、２０　ｇ　ｇ／ｍ　１の
ＤＮＡおよび１単位のＤＮＡリガーゼにュー・イングラ
ンド・バイオラプス・インコーホレーテッド）、この反
応は１５℃で１０時間実施する。この結合はＮｃｏＩ部
位を排除しないでＢａｍＨＩ部位をつくる。

この結合生成物をＢａｍＨＩおよびＨｉｎＤｍで消化す
る。ヒト血清アルブミン遺伝子の３′部位にＨｉｎＤｍ
が存在する結果、全体の解読配列（ｃｏｄｉｎｇ　　５
ｅｑｕｅｎｃｅ）を含有するＤＮＡ断片が得られる。

これにより得られるＨｉｎＤＩＩｒ−ＢａｍＨｒ断片は
１例えば、プラスミドｒｐＢＲ３２２Ｊ中で、前述の方
法に従いＥ、ｃｏｌｉを形質転換してプラスミドｒｐＸ
Ｌ６１Ｊを得ることによりサブクローニングする。

プラスミドｒｐＸ６１Ｊはプロモーターを含有しない。

バクテリオファージラムダ「Ｐ　」プロモーターは、Ｂ
ｇ１１１部位とＢａｍＨＩ部位との間のバクテリオファ
ージ染色体上に位置し［Ｅ。

スジパルスキー（Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ）およびＷ、スジ
パルスキー（Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ）、遺伝子（Ｇｅｎｅ
）（１９７９）、７．２１７ページ　ｅｔ　　ｓｅｑ、
＄照］そしてそのヌクレオチド配列は知られている［Ｆ
、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）ら、ジャーナル・オブ・モ
レキュラー・バイオロジー（Ｊ　、Ｍｏ　Ｉ　、Ｂｉ　
ｏ　ｌ　、）　　（１９８２）、１６２，２７９ページ
　ｅｔｓｅｑ、］。この断片は既知の方法に従いクロー
ニングし、そしてその制限部位を修飾することができる
。

このプロモーターが構造的に発現されるのを防１卜する
ために、リプレッサー遺伝子ｃＩを有する見よ００１１
株中でＰＬを有するプラスミドを伸張しなくてはならな
いことが認められる。

最初の構成において、Ｐ　はプラスミドｒ　ｐＰ　−ラ
ムダ」からＢａｍＨＩ断片の形態で入毛り 可能である（ファーマシ７　Ｐ、Ｌ、バイオケミカルズ
）、このＢａｍＨＩ断片をプラスミド「ｐＸＬ６１Ｊの
ＢａｍＨ１部位に挿入することにより、ペプチドｒｐＸ
Ｌ６５Ｊを得ることができ、このプラスミドにおいて、
ヒト血清アルブミンの構造遺伝子に関するプロモーター
の配向は正しいことが立証された。

他の構成は入手可能なプラスミドから実施することがで
きる。例えば、プラスミド「ｐＰ　−ラムダ」からＰ　
プロモーターを含有するＨａｅｆｌＩ−Ｈａｅｍ断片を
切除し、そしてそれをあるプラスミド、例えば、プラス
ミドｒｐＵＣ８Ｊ　　［Ｊ。

ビエイラ（Ｖｉｅｉｒａ）およびＪ、メッシング（Ｍｅ
ｓｓｉｎｇ）、遺伝子（Ｇｅｎｅ）（１９８２）、７旦
、２５９ページ　ｅｔ　　ｓｅｑ、］により支持される
多部位クローニング配列のＳｍａ１部位の中に挿入して
、ＥｃｏＲＩ部位がプロモーターの５゛末端上に存在す
るｒｐＵＣ８−Ｐ　」を得ることが可能である。

プラスミドｒｐｐｓｉＪ　　［Ｐ、サルミエントス（Ｓ
ａｒｍｉｅｎｔｏｓ）ら、細胞（Ｃｅｌｌ）（１９８３
）、３２．１３３７ページ　ｅｔ、ｓｅｑ、］を使用し
て出発し、ＮｄｅＩ部位に最も近いＨｉｎＤｍ部位（第
２図）をまず破壊し、次いで小さいＥｃｏＲＩ−Ｈｉ　
ｎＤｍ断片を、一方において、Ｐ　プロモーターを含有
するプラスミド　　ｒｐＵＣ８−Ｐ　　　　Ｊ　　　ｃ
７）ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片で６検し、そして他方
において、血清アルブミン遺伝子を含有するプラスミド
ｒｐＸＬ６１」のＢ　ａｍＨｒ　−Ｈｉ　ｎＤｍ断片で
置換することが可能である。これによりプラスミドｒｐ
ＸＬ７０」が得られ、ここでアセンブリー［ｐ−ｒコン
センサスＪ　ＲＢＳ−ヒト血清アルブミン］はＥｃｏＲ
Ｉ−ＨｉｎＤｍ　　ＤＮＡ断片上に支持されている。

ｂ＞　　ｒコンセンサスＪ　ＲＢＳのバクテリオファー
ジラムダのＣ■遺伝子のそれによる置換 バクテリオファージラムダのＣＨ遺伝子（その配列およ
び開始部位が知られている）Ｌｉ効率的に翻訳すること
ができる［Ｅ、シュワルズ（Ｓ　ｃ　ｈｗａ　ｒ　ｚ）
ら、ネイチ−？−（Ｎａｔｕｒｅ）（１９７８）、２ヱ
ヱ、４１０ページ　ｅｔ　　ｓ　　ｅｑ、］。

ン遺伝子］。

例えば、ｒｐＵＣ８−Ｐ　　Ｊ　（７）ＢａｍＨＩ部位
り がＳＩ酵素の作用により破壊された［Ａ、Ｊ、ベルク（
Ｂｅｒｃｋ）およびＰ、Ａ、シャープ（Ｓｈａｒｐ）、
Ａａｌ胞（Ｃｅ　ｌ　１）（１９７７）、↓冬、７２１
］後、Ｐ　プロモーターを含有するＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎ
Ｄｍ断片を単離することができ、次いでこの断片をプラ
スミドｒＰＤｓ２０ＪのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎＤｍ断片と
遺伝子して［Ｇ、ズエステル（Ｄｕｅｓｔｅｒ）ら１ｍ
胞（Ｃｅ　１１）（１９８２）、３０．８５５ページｅ
ｔ　　ｓｅｑ、ＪプラスミドｒｐＸＬ７３Ｊを得ること
ができる。

ｃｎ遺伝子ＲＢＳをプラスミドｒｐＰｓ　ｔ」から抽出
する。このプラスミドをＮｄｅＩで消化し、モしてＢａ
ｍＨＩアダプターをプラント末端の形成後に挿入する９
次いで、ＲＢＳｔ−Ｈｉ　ｎＤｍ−ＢａｍＨＩ断片の形
ＩＥで抽出する。

こ（７）Ｈｉ　ｎＤｍ−Ｂ　ａｍＨＩ断片がプラスミド
「ｐｘＬ７３」の大きいＨｉ　ｎＤＩＩＩ−Ｂ　ａｍＨ
Ｉ断片と結合されたプラスミドｒｐＸＬ８８Ｊを最初に
構成する。この新規なｒｐＸＬ８８Ｊにおいて、ＣＩＩ
　　ＲＢＳをＰ　プロモーターの関して正し しい配向で挿入し、そして全体の組み合わせは多部位系
において、Ｐ　　−ＣＵ　　ＲＢＳアセンブリーがＥｃ
ｏＲｒ−ＢａｍＨｒ　　ＤＮＡ断片の５７８塩基対上に
支持されるように存在する。

５７８塩基対ｃｙ）ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片をプラ
スミドｒｐＭｃ１４０３ＪのＥｃｏＲＩ部位とＢａｍＨ
Ｉ部位との間でサブクローニングし［Ｂ、Ｊ、カサダバ
ｙ（Ｃａｓａｄａｂａｎ）、ジャーナル・オプ拳バクテ
リオロジ−（１，Ｂａｃｔｅｒｉｏ１、）（１９８０）
、１４３．９７１ベージ　ｅｔ　　ｓｅｑ、］プラスミ
ドｒｐＭＣ１４０３４はＢａｍＨＩ部位の後にβ−ガラ
クトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）を支持する。この構成
はプラスミドｒｐＸＬ９１Ｊに導き、ここでβ−ガラク
トシダーゼ遺伝子は［Ｐ　　−Ｃ１ｌ　　ＲＢＳＪ系の
制御のもとに発現される。

前述のプラスミドｒｐＸＬ６１ＪのＢａｍＨＩ〜Ｅｇｌ
ｆｆ断片をプラスミドｒｐＭｃ１４０３ＪのＢａｍＨＩ
部位においてサブクローニングする。（ＢａｍＨＩ部位
におけるＢ　ｇ　ｌ　ＩＩの結合は可能であるが、Ｂｇ
ｌＩＩにおけるＢａｍＨＩによる切除はもはや不可能で
ある：結局１つのＢａｎ）ＩＩ部位のみが残る）。

この構成（ｒｐＸＬ７１Ｊ　）は配列［ＢａｍＨｌ−ｒ
コンセンサスＪ　ＲＢＳ−ＡＴＧ−Ｎｃ　ｏ　１−血清
アプミンの部分的遺伝子（アミノ＃１〜２１８の遺伝情
報を指定する〕−β−ガラクトシダーゼ遺伝子］を含有
する７００塩基対のＤＮＡ断片の挿入に導く。

このプラスミドをＢａｍＨＩおよび５ａｃＩ（ＳａｃＩ
部位はβ−ガラクトシダーゼ遺伝子中に存在する）で切
断し、そして前もって存在するＢａｍＨＩ−５ａｃＩ断
片の代わりに前述のプラスミドｒｐＸＬ９１Ｊ中に挿入
する。

次いで、これはプラスミドｒＰＸＬ９７Ｊに導き、ここ
でインサージョンは次の構造を有する：［ＥｃｏＲＩ部
位−Ｐ　　ＣＩＩ　　ＲＢＳ−ＢａｍＨ１部位−［コン
センサスＪＲＢＳ−ＮｃｏＩ部位−ＡＴＧ−血清アルブ
ミンの遺伝情報を指定する部分的遺伝子−β−ガラクト
シダーゼ遺伝子］。

プラスミドｒｐＸＬ９７ＪをＢａｍＨＩで消化し、そし
て開始コドンに近いＮｃｏ工部工部間してのみＮｃｏＩ
で部分的に消化し、プラント末端をｓ＋　ヌクレアーゼ
の作用で形成し、次いでこのプラスミドを再び閉じる。

この操作は一方において「コンセンサスＪＲＢＳ　　Ｄ
ＮＡ配列を排除し、そして他方において、ＣＩＩ　　Ｒ
ＢＳのＡＴＧを血清アルブミン配列をもつ相にする。

これによりプラスミドｒｐｘＩ、ｌ　３６Ｊが得られ、
これは配列［ＥｃｏＲＩ部位−ｐ　　−ｃ■ＲＢＳ−Ａ
ＴＧ−血清アルブミンの部分的遺伝子−β−ガラクトシ
グーゼ遺伝子］を含有する。

血清アルブミンの部分的遺伝子はＰ　ｖ　’ｕ　ＩＩ部
位を有するので、プラスミドｒｐＸＬ１３６ＪをＥｃｏ
ＲＩおよびＰ　ｖ　ｕ　ＩＩ　テ消化し、７６０塩基対
の断片を抽出し、そして前述のプラスミドｒｐＸＬ７０
」のＥｃｏＲｒ部位とＰｖｕ１１部位との間に挿入する
。これによりプラスミドｒｐＸＬ　ｌ　３９」が得られ
、これはプラスミドｒ　ｐ　Ｘ　Ｌ　７０　Ｊと同様に
、ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎＤｍ断片上に構造［Ｐ　　−Ｃｎ
　　ＲＢＳ−ＡＴＧ−完全な血清アルブミン遺伝子］を
有し、そしてＣ■遺伝子のそれによる「コンセンサスＪ
　ＲＢＳのＭｍ体を有する。

ｃ）ｒＰ　　」プロモーターの誘導後の血清アルブミン
の発現 ｒＰ　　Ｊプロモーターの温度感受性遺伝′ｆ（ｃｓ 工　　遺伝ｆ）を有する単離されたＥ、ｃｏｌｉコロニ
ーの接種を実施し、そしてプラスミド「ｐＸＬ６５Ｊ、
ｒｐＸＬ７０」およｔＦ　ｒｐＸＬ１３９」の１つによ
り形質転換する。

バクテリアが対数期にあるとき、このプラスミドの「Ｐ
　」プロモーターをインキュベーション温度を４２℃に
急速に上昇されることにより誘導する。インキュベーシ
ョンを９０分間続ける。培養の試料を抜出し、そしてバ
クテリアを６０ミリモルのトリス・ＨＣＩ　　ｐＨ６，
８，２％のＳＤＳ、１００ミリモルのβ−メルカプトエ
タノール、１０％のグリセロールおよび０．１％のブロ
モフェノール・ブルーを含有する懸濁液中で５分間溶解
する。

蛋白質をＵ、に、ラエムリ（Ｌａｅｍｌｉ）１、ネイチ
ャー（Ｎａｔｕｒｅ）（１９７０）、２２７，６８０ペ
ージ　ｅｔ　　ｓｅｑ、またはに、ウェーバ−（Ｗｅｂ
ｅｒ）およびＭ、オスポーン（Ｏａｂｏｒｎｅ）、ジャ
ーナル・才ブ・バイロジカルφケミストリー（Ｊ、Ｂｉ
ｏｌ。

Ｃｈｅｍ、）（１９６９）、２４４．４４０６ｅｔ　　
ｓｅｑ、の方法に従いポリアクリルアミドゲルの電気泳
動により分離する。

蛋白質をニトロセルロースのフィルターに移す［Ｍ、ビ
ッタ−（Ｂｉｔｔｅｒ）ら、アナリティカルーバイオケ
ミストリ−（Ａｎａ１、Ｂｉｏｃｈｅｍ、）（１９８０
）１０２．４５９ページｅｔ　　ｓｅｑ、；Ｅ、Ｊ、ス
テルウサグ（Ｓｔｅｌｌｗｓａｇ）およびＡ、Ｅ、ダー
ルバーグ（Ｄａｈｌｂｅｒｇ）、核酸の研究（Ｎｕｃｌ
ｅｆｃＡｃｉｄｓ　　Ｒｅｓ、（１９８０）、８，２２
９ページ　ｅｔ　　ｓｅｑ、］、ヒトアルブミンに対す
る抗体を使用し１次いで標識蛋白質Ａを結含するか、あ
るいはアビジンーベルオキシターゼ複合体により可視化
したビオチン標識抗アルブミン抗体を使用して、ヒトア
ルブミンの存在を免疫学的に検出する。

このようにして、ヒトアルブミンに対する抗体と反応し
、真正アルブミンと一緒に移動し、かっＥ、ｃｏ　１　
ｉを４２℃においてプラスミドｒｐＸＬ６５Ｊ、ｒｐＸ
Ｌ７０ＪまたはｒｐＸＬ１３９」の存在下の誘導後にＥ
、ｃｏｌｉのリゼイト中にのみ存在する蛋白質の存在が
立証される。

これらの条件下にヒト血清アルブミンのレベルを決定す
ることができる。再現的に生産されるアルブミンの比率
は、変性条件下にＥ、ｃｏｌｉリゼイト中に明らかにさ
れた合計の蛋白質の０．１％程度である。

ｉ、ｒＰＪプロモーターを置換するた めのＥ、ｃｏｌｉ）リプトファンオ ペロン（Ｐｔｒｐ）のプロモーター 使用 誘導バクテリアプロモーターの背後のヒト血清アルブミ
ンの構造遺伝子の導入は、この蛋白質のＥ、ｃｏｌｉ中
の発現を可能とする。前述の異なる系の発現のレベルは
互いに密接し、そして１０００分子の血清アルブミン／
細胞程度である。これらの結果は、同様な系、例えば、
欧州特許出願ＥＰ７３．６４６号およびＥＰ９１．５２
７号に記載されているものを使用して得られるものに近
似する。とくに、欧州特許出願ＥＰ９１，５２７号にお
いて、「ヒト血清アルブミンに類似するポリペプチド」
の８．０００分子／細胞の最高収率が認められる。得ら
れる蛋白質はヒト血清アルブミンと厳格に同一ではなく
、そして生産されるレベルは工業的生産の要求に適合し
ない。その上、血清アルブミンの生産は生産バクテリア
の致死作用を伴う。

ヒト血清アルブミンの生産は、Ｅ、ｃｏｌｉペニシリン
アミダーゼのプレペプチド（ｏ　ｒｅ￥ｐｅｐｔｉｄｅ
）の遺伝子の後に、ヒト血清アルブミンの構造遺伝子を
含有し、その構造遺伝子の発現が縦に並ぶ（ｉ　ｎ　ｔ
　ａｎｄｅｍ）２つの調節遺伝子により制御されるプラ
スミドを使用することによ′って、かなり改良できるこ
とが今回発見され、そしてこれは本発明の主題を形成す
る。

さらに詳しくは、本発明は、バクテリア、例えば、Ｅ、
ｃｏｌｉのペニシリンアミダーゼのプレペプチド（信号
ペプチド）の後に、ヒト血清アルブミンの構造遺伝子を
含有するプラスミドを維持できるバクテリアを培養し、
前記構造遺伝子の発現は誘導プロモーターと縦に並ぶペ
ニシリンアミダーゼプロモーター、例えば、トリプトフ
ァンオペロンｒＰｔｒｐＪによって制御される、ことか
らなるヒト血清アルブミンの調製法を提供する。

Ｅ、ｃｏｌｉのトリプトファンオペロンのプロモーター
は、Ｅ、ｃｏｌｉの株をトリプトファンの不存在下にあ
るいは類似体、例えば、３−インドリルアクリル産の存
在下に培養するとき、遺伝その発現を可能とする［Ｃ，
ヤ／フスキー（Ｙａｎｏｆｓｋｙ）ら、核酸の研究（Ｎ
ｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　　Ｒｅｓ、（１９８１）、旦
、６６４７ページ　ｅｔ　　ｓｅｑ、］、このようなプ
ロモーターは、プラスミド例えば、ｒｐＤＲ７２０」　
（ファーマシア　ＰＬ　　バイオケミカルス）Ｅまた、
Ｄ、ラッセル（Ｒｕｓｓｅｌ）およびＧ。

ベネット（Ｂｅｎｎｅｔ）、遺伝子（Ｇｅｎｅ）１９８
２）、２０．２３１ページ　ｅｔ　　ｓｅｑ参照］。

ペニシリンＧを６−７ミノペニシラン酸に転化するＥ、
ｃｏｌｉペニシリンＧアミダーゼ（ＰＡＭ）（ＥＣ３，
５，１１，ペニシリンアミノヒドラーゼ）は、Ｅ、ｃｏ
ｌｉの株１例えば、旦ユｃｏｌｉ　　ＡＴＣＣ１１１０
５のより生産される［Ｃ，クツバッチ（Ｋｕｔｚｂａｃ
ｈ）およびＥ、ラウエンプシ、（Ｒａｕｅｎｂａｓｈ）
、ホッペーセイラーズ（Ｈｏｐｐｅ−３ｅｙｌｅｒ’ｓ
）Ｚ、Ｐｈｙｓｉｏ１、Ｃｈｅｍ、）　　（１９７４）
、３５４．４５ベージ　ｅｔ　　ｓｅｑ、；Ｅ、Ｊ、パ
ンタンメ（Ｖａｎｄａｍｍｅ）、ｘコノミック・マイク
ロバイオロジー（Ｅｃｏ、ｎｏｍｉ、ｃ　　Ｍｆｃｒｂ
ｉｏｌｏｇｙ）（１９８０）、５．４６７ページ　ｅｔ
　　ｓｅｑ、］、この酵素は、通常Ｅ、ｃｏｌｉにより
切除される信号ペプチドを有する。この遺伝子はクロー
ニングされ、そしてその−次構造は配列化により定めら
れたＬＨ、メイヤー（Ｍｅｙｅｒ）ら、「医学的、環境
的および商業的に重要なプラスミドＪ　　（１９７９）
、に、Ｎ、チミス（Ｔｉｍｍｉｓ）およびＡ、ビュヘラ
ー（Ｐｕｈｌｅｒ、）、ｆｉ１者、エルセピア−／ノー
スーホホランド・バイオメディカル・プレス（Ｅｌｓｅ
ｖｉｅｒ／Ｎｏｒｔｈ−Ｈｏｌｌａｎｄ　　Ｂｉ　ｏｍ
ｅｄｉｃａｌ　　Ｐｒｅｓｓ）、４５９ベージ　ｅｔ　
　ｓｅｑ、およびＷ、プルンス（Ｂ　ｒ　ｕ　ｎ　ｓ）
ら、「生物技術の第３ヨーロッパ会、７Ｅ（Ｔｈｉｒｄ
　　Ｅｕｒｏｐｅａｎ　　Ｃｏｎｇｒｅｓｓ　　ｏｆ　
　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｙ）Ｊ、　　（１９８４）ｖ
ｏ１、ｍ、フェルラグ・ヘミ−（Ｖｅｒｌａｇ　　Ｃｈ
ｅｍｍｅ）、３７１ページｅｔ　　ｓｅｑ、Ｊ、信号ペ
プチドはｒＡＴＧＪ翻訳開始コドン、その次の前記信号
ペプチドの２５アミノ酸の遺伝情報を指定する７５ヌク
レオチドから成る。ヒト血清アルブミンの遺伝子は、翻
訳相が保存されるような方法でそれに融合される、こう
して、翻訳後、前記アルブミンの第１７ミノ＃（アスパ
ラギン酸）は信号ペプチドの切除部位に存在する。

この構成は次の方法で実施することができるＰＡＮｉｉ
ｌ伝子を含有するＥ、ｃｏｌｉ　　ＡＴＣＣ１１１０５
（７）ＥＣＯＲＩ−ＰｓｔＩ断片を。

プラスミドｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ部位とＰｓｔＩ部
位との間に挿入する。プラスミドｒｐＸＬ２０」がこれ
により得られる。

次いで、ＰＡＭ遺伝子を含有するプラスミドｒ　ｐＸＬ
　２０Ｊ　（７）Ｈｉ　ｎＤｍ−Ｈｉ　ｎＤｍ生長を、
プ５スミドｒｐＸＬ７３Ｊ　の）１ｉ　ｎＤｍ部位のＰ
　プロモーターと同一の方向に挿入する。これにより、
配列［Ｐ　　ニア’ロモーターーＰＡＭ遺伝り 子］を含有するプラスミドｒｐＸＬ１２５」をか得られ
る。プラスミドｒｐＸＬ１２５ＪをＮｒｕ■（プラント
末端部位）で消化し、モしてＢａｍＨＩ合成性制限部位
をＨｉｎＤｍ部位から１７０７５ヌクレオチドにおける
ＰＡＭ遺伝子の開始場所に位置する部位の中に挿入する
。Ｐ　を含有するＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ　［ＮｕｒＩ
］は、それ自体の結合によりプラスミドｒｐＸＬ１３４
」をケえる。

次イテ、プラスミドｒｐＸＬ７．Ｊ　（７）ＥｃｏＲＩ
−ＢａｍＨＩ断片をＰ　プロモーター、ＰＡＭＲＢＳお
よびＰＡＭｉ！！仏子の開始を含有するプラスミドｐＸ
Ｌ１３４のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片と置換する。こ
れにより、次の配列を含有するプラスミドｒｐＸＬ１３
４」が得られる：Ｅｃ。

ＲＩ−Ｐ　　−ＰＡＭ［プロモーター−ＲＢＳ−信り 号ペプチドの遺伝情報を指定する７５ヌクレオチド］　
−ＢａｍＨＩ−ｒコンセンサス（ｃｏｎｓｅｎｓ　ｕ　
ｓ）Ｊ　ＲＢＳ−ＡＴＧ−血清アルブミン遺伝子。

プラスミドｒｐＸＬ１３４Ｊ　（ｉ’）ＥｃｏＲＩ−５
ａｌＩ断片を、ｐＤＲ７２０のそれと置換する。

次の構造を含有するプラスミドｒ　ｐＸＬ　１９４Ｊが
得られる：ＥｃｏＲＩ−Ｐｔ　ｒｐ−５ａｔ　Ｉ−ＰＡ
Ｍ　［プロモーター−ＲＢＳ−信号ペプチドの遺伝情報
を指定する７５ヌクレオチド］　−ＢａｎＨＩ−ｒコン
センサスＪ　ＲＢＳ−ＡＴＧ−血清アルブミン遺伝子。

信号ペプチド／血清アルブミンの融合は、既知の技術［
Ｊ　、　Ｐ　、アデル？　−（Ａ　ｄ　ｅ　１　ｍａ　
ｒ）ら、ＤＮＡ　（１９８３）、冬、１８３］に従いバ
クテリオファージ　Ｍ１３ｍｐｌＯ中のサブクローニン
グ［Ｊ、メッシング（Ｍｅ　ｓ　ｓ　ｉ　ｎｇ）、メソ
ッズ・オブ・エンジモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　　Ｅｎ
ｚｙｍｏ１、）（１９８４）、１０１．２０ページ　ｅ
ｔ　　ｓｅｑ、Ｊ後の生体外突然変異銹発により実施す
る。融合の品質は配列化により離昇され、そして融合し
た断片はプラスミド「ｐＸＬ１９４Ｊ中に挿入される。

これにより１次の構造を有するプラスミドｒｐＸＬ２８
８」が得が得られる：ＥｃｏＲＩ−Ｐｔ　ｒｐ−Ｓａｌ
　Ｉ　−ＰＡＭ　［プロモーター−ＲＢＳ−信号ペプチ
ドヌクレオチド］−血清アルブミン遺伝子。

Ｅ、ｃｏ　ｌ　ｉ株１例えば、Ｅ、ｃｏｌｉ　　Ｅ１０
３ＳまたはＥ、ｃｏｌｉ　　Ｂ　　はプラスミドｒｐＸ
Ｌ２８８Ｊで形質転換される。

プラスミドＰＸＬ２８８を含有するＥ、ｃｏｌ土株は、
ザ・セントラル・ビューロウ・ブーア・シンメルカルチ
ャーズ、（Ｔｈｅ　　ＣｅｎｔｒａｌＢｕｒｅａｕ　　
　Ｖｏｏｒ　　　Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ）
（ＣＢＳ）、オランダ国バーン（Ｂａａｒｎ）に１９８
６年３月１４日に番号ＣＢ５１５１，８６で受託された
。

濃厚な培地中ｃ７）Ｅ　、　ｃ　ｏ　ｌ　ｉ　（ｐＸＬ
２８８）の１６時間培養物を、トリプトファンを含有し
ない濃ｍＭ９最小培地［０，１％のカサミノ酸類（ｃａ
ｓａｍｉｎｏ　　ａｃｉｄｓ）］中で１／１００の希釈
で培養し、一定に攪拌しながら３７℃でインキュベーシ
ョンする。生育を対数期の終りに停止させ、そしてバク
テリアを超音波処理により溶解し、次いで遠心する。上
澄み液および沈殿物の中の蛋白質を変性条件下に電気泳
動により分析する。得られるヒト血清アルブミンのレベ
ルは、変性条件下で観測して１０％程度である。

これらの条件下で、ヒト血清アルブミンの生産は、６１
０ｎｍの吸収ｌについて、１０ｍｇ／ｌ媒質の領域であ
る。これらの条件下に、バクテリアの株について致死作
用は観測されない。

さらに、生体内で成熟しない、ＰＡＭ／ヒト血清アルブ
ミン融合物をＥ、ｃｏｌｉの「リーダー（ｌｅａｄｅｒ
）Ｊ配列について特異的であるペプチダーゼで消化する
〔ジャーナル・オブ・バイロジカル・ケミストリー（Ｊ
、Ｂｉｏ１、Ｃｈｅｍ、）（１９８２）、２５７．７０
９８　　ｅｔｓｅｑ、］　と、真正ヒト血清アルブミン
と同一の蛋白質が得られる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、血清アルブミン遺伝子の制限地図、ならびに
３つの最も代表的なインサージョン、　ｒｐＴＩＢＩＩ
Ｊ、　ｒｐＡＡ３８Ｊおよび「２６ｄ８」と表示する、
の位置を示す。 第２図は、開始コドンの構造遺伝子中への組込みおよび
完成遺伝子の構成を示す。 第３図および第４図は、完成ヌクレオチド配列を誘導さ
れた蛋白質配列と一緒に示す。 一一一一一′ ｖｕＬ１ ＰＡＭ４１％９Ａ”プテト 図面の浄怜（ド（容ζこ変更なし） ＣＡＡＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＴＴＴＴＴＧＡＧＣＡＧＣ
ＴＴＧＧＡＧＡＧＴＡＣＡＡＡＴＴＣＣＧＴＴＴＴＡＡ
ＣＡＣＴＣＧＡＡＡＡＡＣＴＣＧＴＣＧＡＡＣＣＴＣＴ
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Ｇ図面の浄書（内容に変になし） ｐＸＬ５３市のヒトアルダＳン遺イ云壬の翻訳ＡＡＡ　
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Ｅ　　ＧＬＹ　　ＡＳＰ　　ＬＹＳ　　ＬＥＵ　　ＣＹ
Ｓ　　ＴＨＲＶＡＬ　　ＡＬＡ　　ＴＨＲ図面の浄ｉｉ
（内容に変更なし） ＣＴＴ　　ＣＧＴ　　ＧＡＡ　　ＡＣＣＴＡＴ　　ＧＧ
Ｔ　　ＧＡＡ　　ＡＴＧ　　ＧＣＴ　　ＧＡＣＴＧＣＴ
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ＬＹＳ図面の浄書（内容に変更なし］ ＡＧＧ　　ＴＡＴ　　ＡＡＡ　　ＧＣＴ　　ＧＣＴ　　
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図面の浄書（内容に変更なし） ＡＡＡ　　ＧＴＣＣＡＣＡＣＧ　　ＧＡＡ　　ＴＧＣＴ
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Ｎ　　ＴＹＲ図面の浄書（内容に変更なし） ＧＣＴ　ＧＡＧ　ＧＣＡ　ＡＡＧ　ＧＡＴ　ＧＴＣＴＴ
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ＡＣＣＡＣＴ　　ＣＴＡ　　ＧＡＧ　　ＡＡＧ：、、、
ＹＳ　　ＴＨＲＴＹＲＧＬＵ　　Ｔ）ＩＲＴ）ＩＲＬＥ
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ＣＡＧ　　ＣＴＴ　　ＧＧＡ０面の＃北内容に変更な口 ＧＡＧ　　ＴＡＣＡＡＡ　　　ＴＴＣＣＡＧ　　　ＡＡ
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ＩＳ　ＧＬＵ　ＬＹＳ　ＴＨＲＰＲＯＶＡＬ　ＳＥＲＡ
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ＣＣＡＡＧ　　ＡＡＡ　ＧＴＡ　　ＣＣＣＣＡＡ　　Ｇ
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ＰＲＯＧＬＮ　　ＶＡＬ　　５ＥＲＡＡＡ　　ＧＴＧ　
　ＧＧＣＡＧＣＡＡＡ　　ＴＧＴ　　ＴＧＴ　　ＡＡＡ
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　　　　１４９０ＴＡＴ　　ＣＴＡ　　ＴＣＣＧＴＧ　
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ＲＶＡＬ　　ＶＡＬ　　ＬＥＵ　　ＡＳＮ　　ＧＬＮＡ
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　ＧＡＡＡＲＧ　　ＶＡＬ　　ＴＨＲＬＹＳ　　ＣＹＳ
　　ＣＹＳ　　ＴＨＲＧＬＵ図面のθｉ（内容に変更な
し）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、￥エシェリヒア・コリ￥（￥Ｅ．ｃｏｌｉ￥）ペニ
   シリンアミダーゼの信号ペプチドの後に、ヒト血清アル
   ブミンの構造遺伝子を含有するプラスミドを維持できる
   バクテリアを培養し、前記構造遺伝子の発現はその上流
   に位置する誘導プロモーターと縦に並ぶペニシリンアミ
   ダーゼプロモーターによって制御され、そしてヒト血清
   アルブミンを単離することを特徴とするヒト血清アルブ
   ミンの微生物学的調製法。 ２、誘導プロモーターはトリプトファンオペロロンＰｔ
   ｒｐのそれである特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、前記プラスミドを維持するバクテリアは￥Ｅ．ｃｏ
   ｌｉ￥のある株である特許請求の範囲第１または２項記
   載の方法。 ４、前記バクテリアは、￥Ｅ．ｃｏｌｉ￥ペニシリンア
   ミダーゼプロモーターより上流のＰｔｒｐプロモーター
   、前記ペニシリンアミダーゼ遺伝子のリボソーム結合部
   位、ＡＴＧ開始コドンおよび、ヒト血清アルブミンの構
   造遺伝子と融合した、ペニシリンアミダーゼ信号ペプチ
   ドのヌクレオチドからなるプラスミドを含する￥Ｅ．ｃ
   ｏｌｉ￥である特許請求の範囲第１項記載の方法。 ５、￥Ｅ、ｃｏｌｉ￥ペニシリンアミダーゼプロモータ
   ーより上流のＰｔｒｐプロモーター、前記ぺニシリンア
   ミダーゼ遺伝子のリボソーム結合部位、ＡＴＧ開始コド
   ンおよび、ヒト血清アルブミンの構造遺伝子と融合した
   、ペニシリンアミダーゼ信号ペプチドのヌクレオチドを
   含有することを特徴とするプラスミド。