JPH11508685A

JPH11508685A - Ｈｐｖ蛋白質に対する特異的抗体の検出方法

Info

Publication number: JPH11508685A
Application number: JP9504713A
Authority: JP
Inventors: ツェントグラフ，ハンスヴァルテル; フレイ，マンフレート; フェルハーゲン，イーリス; マルテンス，レギーナ; メシェデ，ヴォルフガンク; パウリタ，ミヒャエル; ブラスペニンク，ヨリス; トマシーノ，マッシモ
Original assignee: ドイチェスクレブスフォルシュンクスツェントルムスチフトゥングデスエッフェントリヒェンレヒツ
Priority date: 1995-07-04
Filing date: 1996-07-04
Publication date: 1999-07-27
Also published as: EP0848822A1; DE19627031C2; DE19627031A1; US6214541B1; WO1997002491A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、体液中のＨＰＶ蛋白質に対して作用する特異的抗体の検出方法に関する。該方法は、下記工程：（Ｉ）担体物質に結合した天然のＨＰＶ蛋白質を体液とインキュベートする工程、ならびに（II）ＨＰＶ蛋白質に結合する特異的抗体（ａ）を、抗体（ａ）に対して作用する標識抗体（ｂ）、または未標識抗体（ｂ）いずれかと反応させ、次いで、該未標識抗体（ｂ）に対して作用する標識抗体（ｃ）と該未標識抗体（ｂ）を反応させる工程を含む。さらに、本発明は、この方法を行なうためのキットに関する。

Description

【発明の詳細な説明】ＨＰＶ蛋白質に対する特異的抗体の検出方法本発明は、体液中のＨＰＶ蛋白質に対する特異的抗体の検出方法に関する。さらに、本発明は、この目的のために使用可能なキットに関する。さらに、本発明は、本発明の方法を行なうために適する天然のＨＰＶ蛋白質を扱う。公知のように、多くの人がヒトパピローマウイルス（以下、ＨＰＶと称する）により起こる持続感染を被っている。また、公知のように、すべての肛門性器癌、特に子宮頸癌の９５％を超えるものおよび口腔／咽頭腔における癌の相当な割合が、ＨＰＶにより生じる持続感染を伴っている。また、ＨＰＶ遺伝子、具体的にはＥ６および／またはＥ７遺伝子の制御できない発現が、ＨＰＶにより生じる持続感染を有する細胞の癌の形成に必要であることが示唆されている。従って、かかる発現の検出は、ＨＰＶ関連癌の早期検出に役立つ可能性があるであろう。従って、本発明の目的は、ＨＰＶ遺伝子、具体的にはＥ６および／またはＥ７遺伝子の制御できない発現が検出できる方法を提供することにある。本発明によれば、このことは、請求の範囲に定義された主題により達成される。従って、本発明の主題は、下記工程：（Ｉ）担体物質に結合した天然のＨＰＶ蛋白質を体液とインキュベートする工程、および（II）ＨＰＶ蛋白質に結合した特異的抗体（ａ）を −抗体（ａ）に対する標識抗体（ｂ）と反応させ、または −未標識抗体（ｂ）と反応させ、後者にはさらに抗体（ｂ）に対する標識抗体（ｃ）と反応させる工程を含む、ＨＰＶ蛋白質に対する特異的抗体の検出方法に関する。本発明の方法は、ＨＰＶ遺伝子、具体的には、Ｅ６および／またはＥ７遺伝子の制御できない発現を示すヒトに、これらの遺伝子の発現産物に対する抗体がしばしば存在するという出願人の発見に基づくものである。前記「ＨＰＶ蛋白質」という用語は、いかなる型のＨＰＶ蛋白質をも含むものである。この用語は、具体的にはＨＰＶ−Ｅ６蛋白質およびＨＰＶ−Ｅ７蛋白質に関し、より具体的にはＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８のＨＰＶ−Ｅ６蛋白質およびＨＰＶ−Ｅ７蛋白質に関する。ＨＰＶ蛋白質は、野生型配列を含んでもよい。また、ＨＰＶ蛋白質は、それから派生する配列を有してもよく、該派生は、１以上のアミノ酸の付加、欠失および／または置換の形式で現れてもよい。さらに、ＨＰＶ蛋白質は、融合蛋白質の一部であってもよい。ＨＰＶ蛋白質の調製には、常法を用いることかできる。ＨＰＶ蛋白質をコードする核酸、具体的にはＤＮＡを発現ベクターに挿入して、後者を宿主細胞のトランスフェクションおよび宿主細胞の形質転換それぞれに用いることが好ましい。当業者は、ＨＰＶ蛋白質をコードする核酸を公知である（シュワルツ(Schwarz ，E.）、「パピローマウイルスとヒト疾患」443-466頁（1987）、Springer-Verl agを参照）。ＨＰＶ−Ｅ６蛋白質およびＨＰＶ−Ｅ７蛋白質、具体的にはＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８のＨＰＶ−Ｅ６蛋白質およびＨＰＶ−Ｅ７蛋白質に関して、当業者であれば、下記の事実にも精通している：ＨＰＶ１６に対してはＥＭＢＬデータバンク、ＡＣＫ０２７１８；ＨＰＶ１６−Ｅ６に対してはＳｗｉｓｓプロテインデータバンクＰ０３１２６；ＨＰＶ１６−Ｅ７に対してはＳｗｉｓｓプロテインデータバンクＰ０３１２９およびデュルスト(Durst，M.)ら、Proc．N atl．Acad．Sci．USA 60，(1983)，3812-3815；ＨＰＶ１８に対してはＥＭＢＬデータバンク、ＡＣＭ２０３２５；ＨＰＶ１８−Ｅ６に対してはＳｗｉｓｓプロテインデータバンクＰ０６４６３；ＨＰＶ１８−Ｅ７に対してはＳｗｉｓｓプロテインデータバンクＰ０６７８８。さらに、当業者であれば、発現ベクターに精通している。大腸菌の発現ベクターの場合は、例えば、ｐＧＥＭＥＸ、ｐＵＣ誘導体、ｐＧＥＸ−２Ｔ、ｐＥＴ３ｂおよびｐＱＥ−８であり、後者が好ましい。酵母における発現に対しては、例えば、ｐＹ１００、Ｙｃｐａｄ１およびｐＲＥＰ−Ｌ２０であり、後者が好ましい。動物細胞における発現に対しては、例えば、ｐＫＣＲ、ｐＥＦＢＯＳ、ｃＤＭ８およびｐＣＥＶ４が挙げられるが、昆虫細胞における発現に対しては、バキュロウイルス発現ベクターｐＡｃＳＧＨｉｓＮＴ−Ａが好適である。さらに、当業者であれば、宿主細胞に精通している。かかる宿主細胞の例としては、大腸菌株ＨＢ１０１、ＤＨ１、χ１７７６、ＪＭ１０１、ＪＭ１０９、ＢＬ２１およびＳＧ１３００９が挙げられ、後者が好ましく、酵母株サッカロミセスセレビシエおよびサッカロミセスポンベが挙げられ、後者の株が好ましく、動物細胞Ｌ）ＮＩＨ３Ｔ３、ＦＭ３Ａ、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＶｅｒｏおよびＨｅＬａならびに昆虫細胞ｓｆ９が挙げられる。他方、当業者であれば、形質転換宿主細胞およびトランスフェクトした宿主細胞の培養条件それぞれに精通している。また、当業者であれば、発現したＨＰＶ蛋白質の単離方法と精製方法も公知である。本発明の方法において、１以上のＨＰＶ蛋白質、具体的にはＨＰＶ−Ｅ６蛋白質および／またはＨＰＶ−Ｅ７蛋白質、より具体的にはＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８のＨＰＶ−Ｅ６蛋白質および／またはＨＰＶ−Ｅ７蛋白質を、同時にまたは交互に用いてもよい。それらは、天然型で存在する。従って、ＨＰＶ蛋白質上に存在する特異的抗体のすべての天然のエピトープが提供される。このことは、変性型におけるＨＰＶ蛋白質の特異的抗体の検出を最適化する。天然型のＨＰＶ蛋白質を得るために、かかる蛋白質が変性型で存在する場合は０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４、１０％グリセリン、２ｍＭＤＴＴ、８Ｍ尿素等の尿素緩衝液中に溶解し、ＩＢＦＢｉｏｔｅｃｈｎｉｃｓ製のＨＡＵｌｔｒｏｇｅｌ等の通常のヒドロキシアパタイトカラムに供し、例えば、１５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．８、１０％グリセリン、２ｍＭＤＴＴ、１ＭＮａＣｌ、８Ｍ尿素等の前記尿素モル濃度の通常の溶出緩衝液で溶出し、例えば、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．１ｍＭＺｎＡｃ、１ｍＭＤＴＴ、５０ｍＭＮａＣｌ、４Ｍ尿素等の尿素モル濃度を低下させる通常の透析緩衝液に透析し、例えば、Ｑセファロース(Pharmacia)等の通常のアニオン交換体に供し、例えば、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．１ｍＭＺｎＡｃ、１ｍＭＤＴＴ、１ＭＮａＣｌ、４Ｍ尿素等の前記透析尿素緩衝液と同等の尿素モル濃度の通常の溶出緩衝液で溶出し、例えば、ゲル濾過等の通常の回収工程に供して、例えば、５ｍＭｈｅｐｅｓ、５％グリセリン、１ｍＭＤＴＴ、２０μＭＺｎＡｃ等の通常の透析緩衝液に透析することか好ましい。別法として、例えば、１００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ８．０、８Ｍ尿素等の尿素緩衝液に変性蛋白質を溶解し、例えば、５０ｍＭＭｏｐｓ／ＮａＯＨ、ｐＨ７．８、５００ｍＭＮａＣｌ、２０％グリセリン、５ｍＭＤＴＴ、１００ μＭＺｎＣｌ₂等の通常の透析緩衝液にステップワイズ透析に供することが好ましい。透析緩衝液は、例えば、それぞれ、８Ｍ、３Ｍ、１Ｍおよび０Ｍと尿素モル濃度を下げる。透析は、例えば、各２４時間以内等通常のように行なう。最終透析後、例えば、ゲル濾過、具体的にはＳｕｐｅｒｄｅｘ２００(Pharmacia) 等による常法により回収した折りたたんだＨＰＶ蛋白質を得る。前記したように折りたたんだＨＰＶ蛋白質も、本発明の主題に属するものである。本発明によれば、ＨＰＶ蛋白質を担体物質に結合させる。具体的にはマイクロタイタープレート、小試験管、マイクロスフェアーおよびスライド等の蛋白質の結合に適するいかなる物質も、かかる担体物質として使用できる。ＨＰＶ蛋白質と担体物質間の接着は、常法により行なってもよい。ｔａｇポリペプチドに対する一般に入手可能な抗体を介して担体物質と結合できるように、ＨＰＶ蛋白質が融合蛋白質としてＳＶ４０ｔ抗原の１１アミノ酸等のＣ末端を形成するｔａｇポリペプチドとともに存在することが好ましい。本発明によれば、担体物質と結合したＨＰＶ蛋白質を体液とインキュベートする。これらの体液は、動物体、具体的には哺乳類、より具体的にはヒトから得られうるすべての液体を含む。体液は、血清、リンパ液、唾液、痰、尿、便、液(L iquor)、胆汁および胃腸管分泌液が好ましい。さらに、体液は、肺、脳および骨髄、塗抹標本および生検材料ならびに肛門性器癌等の腫瘍等の固体組織から単離可能な液体も含んでよい。常法により、ＨＰＶ蛋白質を体液とインキュベートすることができる。前記インキュベーションは、ＨＰＶ蛋白質に特異的な抗体を結合させるために役立つ。次いで、かかる抗体（以下、（ａ）と称する）を −抗体（ａ）に対する標識抗体（ｂ）と反応させ、または −未標識抗体（ｂ）と反応させ、後者にはさらに抗体（ｂ）に対する標識抗体（ｃ）と反応させる。標識は、放射性または非放射性であってもよい。後者の場合、他の通常のマーカーを用いる。フルオレセインイソチオシアネート等の蛍光色素およびアルカリホスファターゼまたはペルオキシダーゼ等の酵素が特に好ましい。増感系としてビオチン／ストレプトアビジン複合体を使用することができる。一般に、マーカーが利用可能である。製造業者の指示により抗体（ｂ）または抗体（ｃ）を結合させる。前もって標識した抗体（ｂ）および抗体（ｃ）も一般に利用可能である。標識または非標識の好適な抗体（ｂ）の選択は、用いる体液の起源である動物および動物種それぞれに依存する。例えば、ヒト由来の体液に関するならば、使用する抗体（ｂ）は、ヒトイムノグロブリンに対するものである。同様に、抗体（ｃ）を追加して用いるならば、抗体（ｂ）の由来する動物または動物種に関して選択される。当業者であれば、好適な抗体の選択に精通しており、この選択は、前もってなされうる。標識抗体（ｂ）および未標識抗体（ｂ）ならびに次いで標識抗体（ｃ）と結合した抗体（ａ）の変換は、それぞれ、常法によりなされうる。抗体（ｂ）での変換を両別法で３７℃で１時間以内に行なうことが好ましい。数回の洗浄工程後、マーカーに対応する基質溶液を第１の方法に添加して検出反応を発色させる。それは、製造業者の指示により行なわれる。第２の方法において、洗浄工程後に抗体（ｃ）を添加する。変換および検出反応の現像を同様に行なう。本発明の方法は、高度の特異性を有する。工程（Ｉ）がＨＰＶ−ｔａｇ融合蛋白質を使用した場合に特に高い。さらに、本発明の方法は、高度の感受性を有する。工程（II）も抗体（ｃ）を使用した場合に特に高い。さらに、工程（Ｉ）において、１以上の変性ＨＰＶ蛋白質および／または１以上のその断片を追加して使用することが好ましいことが多い。従って、例えば、ＨＰＶ蛋白質の分解産物に対する特異的抗体が検出可能である。本発明の方法に基づいてなされた前述のこと、具体的には天然のＨＰＶ蛋白質を担体物質に接着させて、該蛋白質を体液とインキュベートすることは、同様に、ここで適用する。本発明によれば、前記方法を行なうために適するキットも提供される。このキットは、 −担体物質に結合した１以上の天然のＨＰＶ蛋白質、任意に担体物質に結合した１以上の変性ＨＰＶ蛋白質および／またはそれらの断片および請求項１記載の標識抗体（ｂ）、ならびに通常の洗浄緩衝液および任意に該標識に対応する基質、または −担体物質に結合した１以上の天然のＨＰＶ蛋白質、任意に担体物質に結合した１以上の変性ＨＰＶ蛋白質および／またはそれらの断片、および請求項１記載の未標識抗体（ｂ）および標識抗体（ｃ）、ならびに通常の洗浄緩衝液および任意に該標識に対応する基質を含むことが好ましい。本発明の方法に基づいてなされた前述のことは、同様に、ここで適用する。本発明により、ＨＰＶ遺伝子、具体的にはＥ６遺伝子および／またはＥ７遺伝子の制御できない発現を検出することが可能である。従って、本発明は、ＨＰＶ関連癌の早期検出に適する。以下の実施例により本発明を説明する。実施例１：ＨＰＶ１６−Ｅ７蛋白質およびＨＰＶ１６−Ｅ７ｔａｇ融合蛋白質の調製（ａ）ＨＰＶ１６−Ｅ７蛋白質の調製ＨＰＶ１６の原ＤＮＡを基礎として用いた（デュルスト(Durst，M.)ら前掲を参照）。このＤＮＡを、ＰＣＲ法の鋳型として用いた。以下のプライマー対を使用した：５’−ＴＴＴＧＧＡＴＣＣＡＴＧＣＡＴＧＧＡＧＡＴＡＣＡＣＣＴＡＣＡＴＴＧ−３’および５’−ＴＴＴＧＴＣＧＡＣＴＴＡＴＧＧＴＴＴＣＴＧＡＧＡ−３’。ＰＣＲバッチと条件は、標準であった。増幅したＤＮＡを、ＢａｍＨＩとＳａｌＩで切断し、ＢａｍＨＩとＳａｌＩで開裂させた酵母シャトルベクターｐＲＥＰ−Ｌ２０に挿入した。このベクターは、ｐＲＥＰ３に相当する（マウンドレル(Maundrell，K.)、Gene 123（1993）、1 27-130 を参照）が、以下の「マルチクローニングサイト」を含むものである。発現プラスミドｐＲＥＰ−Ｌ２０ＨＰＶ１６−Ｅ７を得た。これを用いて、シゾサッカロミセスポンベＬＥＵ１．３２のトランスフェクションを行なった（ブレッカー(Broker，M.)、Biotechniques，(1993)，119を参照）。トランスフェクトした酵母細胞を、チアミンの存在下、一晩、通常の「ポンベミン(min)」培地で培養した。これにより、前記発現プラスミドの「メッセージなしチアミン」プロモーターが抑制された。チアミンを洗浄除去してチアミン不含培地で培養した後、プロモーターのスイッチを入れ、ＨＰＶ１６−Ｅ７遺伝子を発現させた。酵母細胞の機械的破砕開裂後、ＨＰＶ１６−Ｅ７蛋白質を単離した。（ｂ）ＨＰＶ１６−Ｅ７ｔａｇ融合蛋白質の調製ＨＰＶ１６の原ＤＮＡを基礎として用いた（デュルスト(Durst，M.)ら前掲を参照）。このＤＮＡを、ＰＣＲ法の鋳型として用いた。以下のプライマー対を使用した：５’−ＴＴＴＴＣＴＡＧＡＡＧＡＴＣＴＡＴＧＣＡＴＧＧＡＧＡＴＡＣＡＣＣＴ−３’および５’−ＴＴＴＧＧＡＴＣＣＴＧＧＴＴＴＣＴＧＡＧＡＡＣＡ−３’。ＰＣＲバッチと条件は、標準であった。増幅したＤＮＡを、ＢｇｌＩＩ．５−ＢａｍＨＩで切断し、ＢｇＩＩＩとＢａｍＨＩで開裂させ、ｔａｇポリペプチドをコードするｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターｐＬ４４１に挿入した。得られたＤＮＡ分子を、ＸｂａＩおよびＳａｌＩで切断してＨＰＶ１６−Ｅ７ｔａｇＤＮＡを単離した。このＤＮＡを、ＸｂａＩおよびＳａｌＩで開裂させた発現ベクターｐＲＥＰ−Ｌ２０に挿入した（前記参照）。発現プラスミドｐＲＥＰ−Ｌ２０ＨＰＶ１６−Ｅ７ｔａｇを得た。これを用いて、シゾサッカロミセスポンベＬｅｕ１．３２のトランスフェクションを行なった（前記参照）。酵母細胞の培養およびＨＰＶ１６−Ｅ７ｔａｇ遺伝子の発現ならびにＨＰＶ１６−Ｅ７ｔａｇ融合蛋白質の単離は、実施例１（ａ）記載と同様であった。実施例２：ＨＰＶ１６−Ｅ７蛋白質およびＨＰＶ１６−Ｅ７融合蛋白質の（ａ）ＨＰＶ１６−Ｅ７蛋白質の折りたたみ実施例１（ａ）で得られたＨＰＶ１６−Ｅ７蛋白質は、不溶性の変性型で存在した。これを、２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１０％グリセリン、２ｍＭＤＴＴ、６Ｍ塩酸グアニジン、５０ｍＭＮａＦ、０．１ｍＭＮａ− ｏ−ヤナデート(Yanadat)の緩衝液に溶解した。折りたたみのために、それを１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４、１０％グリセリン、２ｍＭＤＴＴ、８Ｍ尿素の尿素緩衝液で１：１２に希釈し、ヒドロキシアパタイトカラム（ＨＡＵｌｔｒｏｇｅｌ、ＩＢＦＢｉｏｔｅｃｈｎｉｃｓ製）に供した。ＨＰＶ蛋白質を、１５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．８、１０％グリセリン、２ｍＭＤＴＴ、８Ｍ尿素の尿素溶出緩衝液で溶出し、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．１ｍＭＺｎＡｃ、１ｍＭＤＴＴ、５０ｍＭＮａＣｌ、４Ｍ尿素の尿素透析緩衝液に透析した。透析物を、アニオン交換体、Ｑセファロース (Pharmacia)に供し、ＨＰＶ蛋白質を、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．１ｍＭＺｎＡｃ、１ｍＭＤＴＴ、１ＭＮａＣｌ、４Ｍ尿素の尿素透析緩衝液で溶出した。溶出液を、通常のゲル濾過に供し、次いで、５ｍＭｈｅｐｅｓ、５％グリセリン、１ｍＭＤＴＴ、２０μＭＺｎＡｃの透析緩衝液に透析した。天然のＨＰＶ１６−Ｅ７蛋白質が得られた。（ｂ）ＨＰＶ１６−Ｅ７ｔａｇ融合蛋白質の折りたたみ実施例１（ｂ）で得られた変性ＨＰＶ１６−Ｅ７ｔａｇ融合蛋白質を、実施例２（ａ）に記載のように折りたたんだ。天然のＨＰＶ１６−Ｅ７ｔａｇ融合蛋白質が得られた。実施例３：子宮頸癌に罹った女性患者の血清中のＨＰＶ特異的抗体の検出（ａ）ＨＰＶ１６−Ｅ７蛋白質を用いるＥＬＩＳＡＥＬＩＳＡを行なうために、実施例２（ａ）のＨＰＶ１６−Ｅ７蛋白質溶液を、ｐＨ９．６の炭酸塩緩衝液中で希釈した。９６ウエルのプレートを被覆するために、各ウエルに、１００ｎｇのＨＰＶ蛋白質を満たし、空の対照として１つのウエルを炭酸塩緩衝液で満たした。４℃で一晩インキュベートした後、ＰＢＳ、０．０５％ｔｗｅｅｎ２０を用いて６回の短時間の洗浄工程を行なった。次いで、ポリマー担体の未結合部位を、ブタ皮膚ゼラチン、ＢＳＡまたはカゼイン等の、後者が好ましい無関係な蛋白質を用いるＰＢＳ中３７℃で１時間のインキュベーションによりブロックした。各症例はメキシコからの子宮頸癌に罹った女性患者およびヒト対照の血清を、プレート上でＰＢＳ（１：５０希釈）中、３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳ、０．０５％ｔｗｅｅｎ２０を用いる別の洗浄工程後、一般に入手可能なペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒト抗体（Zymed Labo ratories、アメリカ、カルフォルニア；製造業者の指示により希釈）を添加した。３７℃で１時間のインキュベーション後、別の洗浄工程を行ない、その後、ＴＭＢ発色溶液（５０ｍＭ酢酸ナトリウム、０．４ｍＭ３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンジヒドロクロリド、４．４ｍＭＨ₂Ｏ₂）を用いて室温で３０分以内でペルオキシダーゼ検出反応を行なった。１Ｍ硫酸で反応を停止させ、４５０ｎｍで分光光度計により発色強度を測定した。ＨＰＶ１６−Ｅ７蛋白質により、子宮頸癌に罹った女性患者の血清中で、ＨＰＶ特異的抗体が検出できることが示された。（ｂ）ＨＰＶ１６−Ｅ７ｔａｇ蛋白質を用いるＥＬＩＳＡ実施例２（ｂ）のＨＰＶ１６−Ｅ７ｔａｇ蛋白質を用いるＥＬＩＳＡを行なうために、孔当たり２００ｎｇの一般に入手可能なｔａｇポリペプチドに対するモノクローナルマウス抗体Ｍａｂｔａｇ（ＫＴ３）で９６ウエルのプレートを被覆した。この目的のために、プレートを前記炭酸塩緩衝液に溶解した抗体とともに４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳ、０．０５％ｔｗｅｅｎ２０を用いて６回の短時間の洗浄工程を行なった後、前記炭酸塩緩衝液に溶解したＨＰＶ１６ −Ｅ７ｔａｇ蛋白質を、ウエル当たり１００ｎｇの量で添加した。さらなる工程は、実施例３（ａ）に記載のように行なった。ＨＰＶ１６−Ｅ７ｔａｇ蛋白質により、子宮頸癌に罹った女性患者の血清中で、ＨＰＶ特異的抗体が検出できることが示された。実施例３（ａ）および（ｂ）の両検出は、ＨＰＶ１６−Ｅ７断片、即ち、非天然蛋白質を用いる比較のＥＬＩＳＡよりも特異的であった。この関係で、３（ｂ）の検出特異性は、３（ａ）の検出特異性よりもかなり大きかった。３（ａ）において、２個の陽性症例が６４個の対照値中に得られたが、３（ｂ）においてはこれらの対照値のすべてが陰性であった。さらに、子宮頸癌に罹った女性患者由来の７３個の血清の２８個が３（ｂ）においてＨＰＶ特異的として検出できたが、３（ａ）においては２０個のみであった。実施例４：ＨＰＶ１６（１８）−Ｅ６（Ｅ７）蛋白質の調製と精製（ａ）ＨＰＶ１６−Ｅ６蛋白質の調製と精製プラスミドｐＧｅｍ−２／１６Ｅ６を基礎として用いた。それは、ＨＰＶ１６ −Ｅ６蛋白質をコードするＤＮＡを含む（ウェルネス(Werness，B.A.)ら、Scien ce,第248巻、(1990)，76-79を参照）。このＤＮＡを、ＰＣＲ法の鋳型として用いた。以下のプライマー対を使用した：５’−ＣＡＧＧＧＡＴＣＣＧＡＴＧＡＣＧＡＴＧＡＣＡＡＡＡＴＧＴＴＴＣＡＧＧＡＣＣＣＡＣＡＧＧ−３’および５’ −ＧＧＧＡＡＧＣＴＴＡＴＴＡＣＡＧＣＴＧＧＧＴＴＴＣＴＣＴＡＣ−３’。ＰＣＲバッチおよびＰＣＲ条件は、それぞれ以下のようであった。ＰＣＲバッチ鋳型ＤＮＡ：１μｌ＝１ｎｇＰｆｕポリメラーゼ１０×緩衝液：１０μｌ＝１× ＤＭＳＯ：１０μｌ＝１０％ｄＮＴＰｓ：１μｌ＝各２００μＭオリゴヌクレオチド、各１．５μｌ：３μｌ＝各１５０ｎｇＨ₂Ｏ再蒸留したもの：合計９９μｌＰＣＲ条件 − ９２℃ ５分間 − １μｌＰｆｕポリメラーゼ（Stratagene）＝２．５ユニットの添加 − パラフィンの添加ＰＣＲ９２℃ １分間５８℃ １分間１サイクル７２℃ １０分間９２℃ １分間５８℃ １分間３９サイクル７２℃ ２分間７２℃ １０分間１サイクル増幅したＤＮＡを、ＢａｍＨＩとＨｉｎｄIII で切断し、ＢａｍＨＩとＨｉｎｄIII で開裂させた発現ベクターｐＱＥ−８(Qiagen)に挿入した。発現プラスミドｐＱ／１６／Ｅ６が得られた。それは、６個のヒスチジン残基およびエンテロキナーゼ制限部位（Ｎ末端パートナー）ならびにＨＰＶ１６のＥ６蛋白質（Ｃ末端パートナー）からなる融合蛋白質をコードする。ｐＱ／１６／Ｅ６を、大腸菌ＳＧ１３００９の形質転換に用いた（ゴッテスマン(Gottesman，S.)ら、J．Bact eriol．148，(1981)，265-273を参照）。該細菌を、１００μｇ／ｍｌアンピシリンと２５μｇ／ｍｌカナマイシンを有するＬＢ培地で培養し、６０μＭイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で４時間誘導した。細菌の溶菌は、６Ｍ塩酸グアニジンの添加により行なった。次いで、クロマトグラフィー材料の製造業者(Qiagen)の指示に従って、８Ｍ尿素の存在下、溶菌液を用いてクロマトグラフィー（Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂）を行なった。結合した融合蛋白質を、ｐＨ３．５を有する緩衝液で溶出した。その中和後、融合蛋白質を、１８％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、クマシーブルーを用いて染色した（トーマス(Thomas，J．O.）とコーンバーグ(Kornberg，R．D.)、J．Mol．Biol ．149(1975)，709-733）。純粋なＨＰＶ１６−Ｅ６融合蛋白質（分子量約１８ｋＤ）が得られた。それは、変性型で存在した。（ｂ）ＨＰＶ１６−Ｅ７およびＨＰＶ１８−Ｅ６（Ｅ７）蛋白質の調製と精製実施例４（ａ）に記載のように、ＨＰＶ１６−Ｅ７およびＨＰＶ１８−Ｅ６（Ｅ７）蛋白質を調製し、精製した。以下の変更を行なった。ＨＰＶ１６−Ｅ７の調製のために、プラスミドｐＷＶ２９１６を基礎として用いた。それは、ＨＰＶ１６をコードするＤＮＡを含む（デュルスト(Durst，M.) ら、Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A.,第60巻，(1983)，3812-3815を参照）。ＰＣＲ法には以下のプライマー対を使用した：５’−ＣＡＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＣＡＴＧＧＡＧＡＴＡＣＡＣＣＴＡＣ−３’および５’−ＧＧＧＡＡＧＣＴＴＡＴＴＡＴＧＧＴＴＴＣＴＧＡＧＡＡＣＡＧＡＴＧ−３’。増幅したＤＮＡをエンテロキナーゼ制限部位をもたないＤＮＡを有するｐＱＥ −８にクローニングし（ｐＱ／１６／Ｅ７）、ＳＧ１３００９で発現させ、ならびに精製後、純粋なＨＰＶ１６−Ｅ７融合蛋白質（分子量約１２ｋＤ）が得られた。それは、変性型で存在した。ＨＰＶ１８−Ｅ６の調製のためには、プラスミドｐＧｅｍｌ／１８Ｅ６を基礎として用いた。それは、ＨＰＶ１８−Ｅ６蛋白質をコードするＤＮＡを含む（ウェルネス(Werness，B.A.)ら、前掲を参照）。ＰＣＲ法には以下のプライマー対を使用した：５’−ＣＡＧＡＧＡＴＣＴＧＡＴＧＡＣＧＡＴＧＡＣＡＡＡＡＴＧＧＣＧＣＧＣＴＴＴＧＡＧＧＡＴＣ−３’および５’−ＧＧＧＡＡＧＣＴＴＡＴＴＡＴＡＣＴＴＧＴＧＴＴＴＣＴＣＴＧＣＧ−３’。ｐＱＥ−８にクローニングし（ｐＱ／１８／Ｅ６）、ＳＧ１３００９で発現させた後、純粋なＨＰＶ１８−Ｅ６融合蛋白質（分子量約１９ｋＤ）が得られた。それは、変性型で存在した。ＨＰＶ１８−Ｅ７の調製のためには、プラスミドｐＧＥＭ３／９１を基礎として用いた。それは、ＨＰＶ１８をコードするＤＮＡを含む（ロッゲンバック(Rog genbuck，B.)ら、J．Virol.,第65巻、(1991)，5068-5072を参照）。ＰＣＲ法には以下のプライマー対を使用した：５’−ＣＡＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＣＡＴＧＧＡＣＣＴＡＡＧＧＣＡＡＣ−３’および５’−ＧＧＧＡＡＧＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＣＴＧＧＧＡＴＧＣＡＣＡＣＣ−３’。増幅したＤＮＡをエンテロキナーゼ制限部位をもたないＤＮＡを有するｐＱＥ −８にクローニングし（ｐＱ／１８／Ｅ７）、ＳＧ１３００９で発現させた後、純粋なＨＰＶ１８−Ｅ７融合蛋白質（分子量約１３ｋＤ）が得られた。それは、変性型で存在した。実施例５：変性ＨＰＶ１６（１８）−Ｅ６（Ｅ７）蛋白質の折りたたみ（ａ）ＨＰＶ１６−Ｅ６蛋白質の折りたたみ実施例４（ａ）で得られたＨＰＶ１６−Ｅ６蛋白質を、尿素緩衝液（１００ｍＭリン酸塩緩衝液、８Ｍ尿素、ｐＨ８．０）に溶解し、ステップワイズ透析に供した。透析緩衝液は、５０ｍＭＭｏｐｓ／ＮａＯＨ、ｐＨ７．８、５００ｍＭＮａＣｌ、２０％グリセリン、５ｍＭＤＴＴ、１００μＭＺｎＣｌ₂を含んでいた。また、該透析緩衝液は、それぞれ、８Ｍ、３Ｍ、１Ｍおよび０Ｍの尿素を含んでいた。各場合、別々の透析を２４時間以内で行なった。その後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ(Pharmacia)によりゲル濾過を行なった。ＨＰＶ１６−Ｅ６蛋白質が天然型で得られた。（ｂ）ＨＰＶ１６−Ｅ７およびＨＰ１８−Ｅ６（Ｅ７）蛋白質の折りたたみ実施例４（ｂ）で得られたＨＰＶ１６−Ｅ７、ＨＰＶ１８−Ｅ６（Ｅ７）蛋白質を、実施例５（ａ）に記載のように折りたたんだ。対応するＨＰＶ蛋白質が、天然型で得られた。実施例６：患者の血清中のＨＰＶ−Ｅ６およびＨＰＶ−Ｅ７特異的抗体の検出ＥＬＩＳＡを行なうために、実施例５のＨＰＶ１６−Ｅ６およびＨＰＶ１６− Ｅ７蛋白質を、緩衝液（０．１ＭＮａＨ₂ＰＯ₄、ｐＨ８．０）に溶解した。９６ウエルのプレートを被覆するために、各ウエルに、ＨＰＶ蛋白質をそれぞれ２０ｎｇと８ｎｇ含む１００μｌをピペッティングにより満たし、空の対照として１つのウエルに１％ＢＳＡをピペッティングにより満たした。４℃で一晩インキュベートした後、ＰＢＳ、０．０５％ｔｗｅｅｎ２０を用いて各場合５分の間隔で４回の短時間の洗浄工程を行なった。その後、ポリマー担体の未結合部位を、ＰＢＳ、０．０５％ｔｗｅｅｎ２０中の１％ＢＳＡを用いて４℃で一晩のインキュベーションによりブロックした。子宮頸癌に罹った女性患者から得られた試験対象の血清を、１：１００希釈（ＰＢＳ、１％ＢＳＡ、０．０５％ｔｗｅｅｎ２０）でプレート上で３７℃で１時間インキュベートした（「チェス盤滴定」）。ＰＢＳ、０．０５％ｔｗｅｅｎ２０を用いる４回の短時間の洗浄工程後、一般に入手可能なペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒト抗体（製造業者の指示により希釈）を添加した。３７℃で３０分間のインキュベーション後、再び４回の洗浄工程を前述のように行ない、その後、ＴＭＢ発色溶液（５０ｍＭ酢酸ナトリウム、０．４ｍＭ３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンジヒドロクロリド、４．４ｍＭＨ₂Ｏ₂）を用いて室温で３０分以内でペルオキシダーゼ検出反応を行なった。２Ｍ塩酸を用いて反応を停止させた後、４５０ｎｍで分光光度計により発色強度を測定した。ＢＳＡ対照の２倍を超える吸光度を陽性反応とみなした。子宮頸癌に罹った女性患者の血清中で、ＨＰＶ−Ｅ６およびＨＰＶ−Ｅ７特異的抗体が検出できることが示された。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＪＰ，ＵＳ (72)発明者フレイ，マンフレートドイツ連邦共和国マンハイムデー− 68259 アレマンネンシュトラッセ 45 (72)発明者フェルハーゲン，イーリスドイツ連邦共和国シュヴェトツィンゲンデー−68723 ゲーテシュトラッセ 14 (72)発明者マルテンス，レギーナドイツ連邦共和国ザントハウゼンデー −69207 ジーガッセ 45 (72)発明者メシェデ，ヴォルフガンクドイツ連邦共和国ハイデルベルクデー −69121 ドッセンハイメルラントシュトラッセ 72 (72)発明者パウリタ，ミヒャエルドイツ連邦共和国エシェルブロンデー −74927 ギューンヴェーク 10 (72)発明者ブラスペニンク，ヨリスドイツ連邦共和国シェーンブルンデー −69436 ハイデルベルゲルシュトラッセ 47 (72)発明者トマシーノ，マッシモドイツ連邦共和国ブルクサルデー− 76646 ヴァイエベルゲルシュトラッセ 13

Claims

【特許請求の範囲】１．下記工程：（Ｉ）担体物質に結合した天然のＨＰＶ蛋白質を体液とインキュベートする工程、および（II）ＨＰＶ蛋白質に結合した特異的抗体（ａ）を −抗体（ａ）に対する標識抗体（ｂ）と反応させ、または −未標識抗体（ｂ）と反応させ、後者にはさらに抗体（ｂ）に対する標識抗体（ｃ）と反応させる工程を含む、体液中のＨＰＶ蛋白質に対する特異的抗体の検出方法。２．工程（Ｉ）において、ＨＰＶ−ｔａｇ融合蛋白質を使用することを特徴とする請求項１記載の検出方法。３．工程（Ｉ）において、担体物質に結合した１以上の変性ＨＰＶ蛋白質および／またはそれらの断片も使用することを特徴とする請求項１または２記載の検出方法。４．ＨＰＶ蛋白質がＨＰＶ−Ｅ６蛋白質またはＨＰＶ−Ｅ７蛋白質であることを特徴とする、請求項１〜３いずれか記載の検出方法。５．ＨＰＶ蛋白質がＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８に由来することを特徴とする、請求項１〜４いずれか記載の検出方法。６．工程（Ｉ）において、複数個の天然のＨＰＶ蛋白質を使用することを特徴とする請求項１〜５いずれか記載の検出方法。７．天然のＨＰＶ蛋白質が、対応する変性蛋白質の折りたたみにより得られたものであることを特徴とする、請求項１〜６いずれか記載の検出方法。８．変性ＨＰＶ蛋白質の折りたたみが、尿素緩衝液中への該蛋白質の溶解、尿素モル濃度を低下させることを含む通常の緩衝液での前記溶解した蛋白質の透析ならびに透析した蛋白質のゲル濾過を含むことを特徴とする請求項７記載の検出方法。９．変性ＨＰＶ蛋白質の折りたたみが、該蛋白質の通常の尿素緩衝液中への溶解、通常のヒドロキシアパタイトカラムへの適用、前記尿素モル濃度を有する通常の溶出緩衝液を用いる溶出、尿素モル濃度を下げる通常の透析緩衝液に対する透析、通常のアニオン交換体への適用、前記透析緩衝液と同等の尿素モル濃度を有する通常の溶出緩衝液による溶出、ゲル濾過の実施および通常の透析緩衝液に対する透析を含むことを特徴とする請求項７記載の検出方法。１０．体液が血清、リンパ液、唾液、痰、尿、便、液、胆汁、胃腸管分泌液ならびに固体組織および腫瘍から得られた液体を含むことを特徴とする請求項１〜９いずれか記載の検出方法。１１．担体物質がマイクロタイタープレート、小試験管、マイクロスフェアーおよびスライドを含むことを特徴とする請求項１〜１０いずれか記載の検出方法。１２．第１の方法の抗体（ｂ）および第２の方法での抗体（ｃ）が、酵素標識されていることを特徴とする請求項１〜１１いずれか記載の検出方法。１３．第１の方法の抗体（ｂ）および第２の方法の抗体（ｃ）が、蛍光色素で標識されていることを特徴とする請求項１〜１１いずれか記載の検出方法。１４．第１の方法の抗体（ｂ）および第２の方法の抗体（ｃ）が、放射線標識されていることを特徴とする請求項１〜１１いずれか記載の検出方法。１５．−担体物質に結合した１以上の天然のＨＰＶ蛋白質、任意に担体物質に結合した１以上の変性ＨＰＶ蛋白質および／またはそれらの断片、および請求項１記載の標識抗体（ｂ）、ならびに通常の洗浄緩衝液および任意に該標識に対応する基質、または −担体物質に結合した１以上の天然のＨＰＶ蛋白質、任意に担体物質に結合した１以上の変性ＨＰＶ蛋白質および／またはそれらの断片、および請求項１記載の未標識抗体（ｂ）および標識抗体（ｃ）、ならびに通常の洗浄緩衝液および任意に該標識に対応する基質、を含むキット。１６．請求項７〜９いずれか記載の方法により得られた天然のＨＰＶ蛋白質。