JPH11509102A - 酸性環境中において高エステルペクチンを用いてタンパク質を安定化するためのプロセス - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 少なくとも１つのタンパク質を含む酸性環境にブロックワイズに酵素的に脱エステル化されたペクチンを添加することであり、そしてこのペクチンが高エステルペクチンである、プロセスが記載される。組換えペクチンメチルエステラーゼもまた記載される。

Description

【発明の詳細な説明】 酸性環境中において高エステルペクチンを用いてタンパク質を 安定化するためのプロセス 本発明は、プロセスおよびこのようなプロセスに使用するための酵素に関する 。 特に、本発明は、酵素的に改変されたペクチンを調製および使用するためのプ ロセスに関する。 ペクチンは、今日の産業において重要な商品である。例えば、これは、濃化剤 またはゲル化剤として、ジャムの調製におけるような、食品産業で使用され得る 。 ペクチンは、通常、植物細胞壁にプロトペクチンの形態で見いだされる構造多 糖類である。ペクチンの骨格は、少数の1,2結合したα-L-ラムノース単位で断続 されるα-1-4結合したガラクツロン酸残基を含む。さらに、ペクチンは、ほとん ど交互になっているラムノ−ガラクツロナン鎖とともに高度に分枝した領域を含 む。これらの高度に分枝した領域はまた、ラムノース単位のC3またはC4原子ある いはガラクツロン酸単位のC2またはC3原子へのグリコシド結合によって結合され る他の糖単位（例えば、D-ガラクトース、L-アラビノース、およびキシロースな ど）を含む。α-1-4結合したガラクツロン酸残基の長鎖は、通常「平滑」領域と 呼ばれるが、高度に分枝した領域は、通常「毛状領域」と呼ばれる。 ガラクツロン残基のカルボキシル基のいくつかはエステル化される（例えば、 カルボキシル基がメチル化される）。代表的には、カルボキシル基のエステル化 は、ガラクツロン酸残基の重合化後に生じる。しかし、すべてのカルボキシル基 がエステル化（例えば、メチル化）されることは非常にまれである。通常、エス テル化の程度は０〜90％で変化する。50％以上のカルボキシル基がエステル化さ れると、得られるペクチンは、「高エステルペクチン」（略して「HEペクチン」 ）または「高メトキシルペクチン」と呼ばれる。50％未満のカルボキシル基がエ ステル化されると、得られるペクチンは「低エステルペクチン」（略して「LEペ クチン」）または「低メトキシルペクチン」と呼ばれる。ペクチンが全くまたは ２、３しかエステル化した基を含まなければ、通常、ペクチン酸と呼ばれ る。 ペクチンの構造、特にエステル化（例えば、メチル化）の程度は、ペクチンの 多くの結果としてもたらされる物理学的および／または化学的特性を指示する。 例えば、ペクチンのゲル化は、ペクチンの化学的性質、特にエステル化の程度に 依存する。しかし、さらに、ペクチンのゲル化はまた、可溶化固体含量、pH、お よびカルシウムイオン濃度に依存する。後者に関しては、カルシウムイオンが、 カルボキシル基、特にLEペクチン上の遊離のカルボキシル基と複合体を形成する と考えられる。 ペクチン酵素は、ペクチン分子のガラクツロナン部分への攻撃の様式に従って 分類される。いくつかのペクチン酵素の総説は、PilnikおよびVoragen（Food En zymology，P.F.Fox編; Elsevier;(1991); 303-337頁）によって作成されている 。特に、ペクチンメチルエステラーゼ（EC 3.1.1.11）（他にPMEと呼ばれる）は 、HEペクチンをLEペクチンまたはペクチン酸に脱エステル化する。対照的に、お よび例として、ペクチンデポリメラーゼは、ガラクツロノシルメチルエステル残 基間のグリコシル結合を分裂させる。 より詳細には、PME活性は、遊離のカルボキシル基および遊離のメタノールを 生成する。遊離のカルボキシル基の増加は、自動化滴定によって容易にモニター され得る。これに関して、初期の研究は、いくつかのPMEが、１つより多くのペ クチン鎖上のエステル化した（例えば、メチル化した）ガラクツロン酸残基のい ずれかを脱エステル化するという意味で、ランダムな様式でペクチンを脱エステ ル化することを示している。ペクチンをランダムに脱エステル化するPMEの例は 、Aspergillus aculeatus（WO 94/25575を参照のこと）およびAspergillus japo nicus（Ishiiら J Food Sci 44 611-14頁）のような真菌供給源から得られ得る 。Baronら（Lebensm．Wiss．M-Technol 13 330-333頁）は明らかに、Aspergillu s nigerから真菌PMEを単離している。この真菌PMEは、39000Dの分子量、3.9の等 電点、4.5の至適pH、および３のＫ_m値（mg/ml）を有することが報告されている 。 対照的に、いくつかのPMEは、これらが非還元末端でまたは遊離のカルボキシ ル基の隣でのいずれかでペクチンを攻撃し、次いで一本鎖メカニズムによってペ クチン分子にそって続行し、それによって非常にカルシウム感受性である非エス テル化ガラクツロン酸単位のブロックを生成すると考えられているという意味で 、ブロックワイズ様式でペクチンを脱エステル化することが公知である。ペクチ ンをブロックワイズに酵素的に脱エステル化するこのような酵素の例は、植物PM Eである。PMEの12までのイソ形態は、柑橘類中に存在することが示唆されている （Pilnik W.およびNoragen A.G.J.（Food Enzymology(P.F.Fox編); Elsevier; ( 1991); 303-337頁）。これらのイソ形態は、異なる特性を有する。 Versteegら（J Food Sci 45 969-971頁）は、明らかに、オレンジからPMEを単 離している。この植物PMEは、異なる特性の複数のイソ形態に存在することが報 告される。イソ形態Ｉは、36000Dの分子量、10.0の等電点、7.6の至適pH、およ び0.083のＫ_m値（mg/ml）を有する。イソ形態IIは、36200Dの分子量、11.0の等 電点、8.8の至適pH、および0.0046のＫ_m値（mg/ml）を有する。イソ形態III（HM W-PE）は、54000Dの分子量、10.2の等電点、８の至適pH、および0.041のＫ_m値（ mg/ml）を有する。しかし、今日までのところ、このようなPMEについては非常に 限定された配列データがあった。 PilnikおよびVoragen（同上）によれば、PMEは多くの他の高等植物中に見いだ され得、例えば、リンゴ、アンズ、アボカド、バナナ、イチゴ、ライム、グレー プフルーツ、マンダンリン、サクランボ、スグリ、ブドウ、マンゴ、パパイヤ、 パッションフルーツ、モモ、西洋ナシ、プラム、マメ、ニンジン、カリフラワー 、キュウリ、ニラ、タマネギ、エンドウマメ、ポテト、ダイコン、およびトマト である。しかし、同様に、今日までのところ、このようなPMEについては非常に 限定された配列データがあった。 遊離のカルボキシル基のランダムまたはブロックワイズ分布は、高速イオン交 換クロマトグラフィーによって区別され得る（Scholsら Food Hydrocolloids 19 89 6 115-121頁）。これらのテストは、低温殺菌後に柑橘類果汁中の望ましくな い残りのPME活性についてチェックするためにしばしば使用される。なぜなら、 残りのPMEは、果汁中のメタノールの構成の他に、オレンジ果汁中に「曇りなし （cloud loss）」と呼ばれるものを生じ得るからである。 PMEは、産業において重要な用途を有する。例えば、これらはカルシウムイオ ンに対する封鎖剤にまたは封鎖剤として使用され得る。これに関して、ならびに PilnikおよびNoragen（同上）によれば、家畜の餌は、果汁抽出後に水酸化カル シウムのスラリーを柑橘類の皮に添加することによって調製され得る。添加後、 高いpHおよびカルシウムイオンは、皮において任意の天然のPMEを活性化してペ クチンの迅速な脱エステル化を引き起こし、そしてペクチン酸カルシウム凝集を 生じる。結合した液相は放出され、そして容易に押し出されて、その結果、元の 水含有物の画分のみが高価な熱乾燥によって除去される必要がある。次いで圧搾 液体は動物の餌として使用される。 PilnikおよびVoragen（同上）は、外因性PMEの使用を挙げ、これらは、果物に 由来する非常に多くのペクチンを含む場合に、果汁の粘度を減少させるために果 汁へ添加すること、未処理の果汁袋からの皮および他の膜の除去を容易にするた めに、20〜40℃の中心温度に加熱されている柑橘類の果物のアルベドにおいて気 泡ヘペクチナーゼ溶液としてそれらを添加すること（US-A-4284651）、ならびに いくつかの加工した果物および野菜（例えば、リンゴ（WileyおよびLee 1970 Fo od Technol 24 1168-70）、缶詰にしたトマト（Hsuら 1965 J Food Sci 30 583- 588頁）、およびポテト（BartolomeおよびHoff 1972 J Agric Food Chem 20 262 -266頁））の構造および堅さを保護および改良することにおいてそれらを使用す ることを包含する。 GlahnおよびRolin（1994 Food Ingredients Europe，Conf Proceedings 252-2 56頁）は、サワーミルク飲料と相互作用させるための工業用「GENU pectin type YM-100」の仮説の適用を報告する。GENU pectin type YM-100がどのように調製 されるかについてすべては詳細に示されていない。 EP-A-0664300は、カルシウム感受性ペクチンを調製するための化学的分画方法 を開示する。このカルシウム感受性ペクチンは、食品産業に好都合であるといわ れる。 したがって、PMEに加えて、ペクチンおよび脱エステル化ペクチンが、産業的 重要性を有する。しかし、酸性環境であるがその環境の粘度に不利な影響を及ぼ すことなくタンパク質を安定化する公知の方法を改良するということが継続して 求められている。これに関して、この環境の粘度への不利な影響は、得られる産 物の全体の外観および／または構造および／または風味の良さおよび／または口 当たりを悪くし得る。 本発明の第１の局面によれば、少なくとも１つのタンパク質含む酸性環境に、 ブロックワイズに酵素的に脱エステル化されたペクチンを添加する工程を包含す るプロセスが提供され、ここでペクチンは高エステルペクチンである。 本発明の第２の局面によれば、配列番号１もしくは配列番号２に示すアミノ酸 配列のいずれか１つを含む組換え酵素、またはその改変体、誘導体、もしくはホ モログ（それらの組み合わせを含む）でペクチンを処理する工程を包含する、ペ クチンをブロックワイズに酵素的に脱エステル化する方法が提供される。 本発明の第３の局面によれば、配列番号１もしくは配列番号２に示すアミノ酸 配列のいずれか１つを含む組換え酵素、またはその改変体、誘導体、もしくはホ モログ（それらの組み合わせを含む）が提供される。 本発明の第４の局面によれば、本発明の組換え酵素をコードするヌクレオチド 配列が提供され、ここでヌクレオチド配列は、配列番号３もしくは配列番号４に 示す配列のいずれか１つ、またはその改変体、誘導体、もしくはホモログを含む 。 本発明の第５の局面によれば、本発明の組換え酵素をコードするヌクレオチド 配列が提供され、ここでヌクレオチド配列は、NCIMB 40749もしくはNCIMB 40750 、またはその改変体、誘導体、もしくはホモログから得られ得る。 本発明の第６の局面によれば、本発明の組換え酵素または本発明のヌクレオチ ド配列を発現するまたは含む構築物が提供される。 本発明の第７の局面によれば、本発明の構築物または本発明の組換え酵素また は本発明のヌクレオチド配列を発現するまたは含むベクターが提供される。 本発明の第８の局面によれば、本発明の組換え酵素または本発明のヌクレオチ ド配列を発現するまたは含む少なくとも第１の構築物；ならびに目的の遺伝子（ GOI）およびプロモーターを含む第２の構築物を含む構築物の組み合わせが提供 される。 本発明の第９の局面によれば、本発明のベクターまたは本発明の構築物または 本発明の組換え酵素または本発明のヌクレオチド配列または本発明の構築物の組 み合わせを発現するまたは含む細胞、組織、または器官が提供される。 本発明の第10の局面によれば、本発明の上記の局面のいずれかを発現するまた は含むトランスジェニック生物が提供される。 本発明の第11の局面によれば、NCIMB 40749またはNCIMB 40750が提供される。 本発明の第12の局面によれば、トマトPME酵素ではなく、本発明の第３の局面 による精製組換え酵素に対して惹起した抗体と免疫学的に反応する組換えPME酵 素が提供される。 本発明の第13の局面によれば、ペクチンのエステル基の数を減少するための本 発明の組換え酵素の使用を提供する。 本発明の第14の局面によれば、ブロックワイズの様式でペクチンを脱エステル 化するための本発明の組換え酵素の使用が提供される。 本発明の第15の局面によれば、ペクチンのカルシウム感受性に影響を及ぼすた めの本発明の組換え酵素の使用が提供される。 本発明の第16の局面によれば、遊離のカルボキシル基を含むペクチンをエステ ル化するための本発明の組換え酵素の使用が提供される。 本発明の第17の局面によれば、本発明の方法によるような、本発明の組換え酵 素の使用によって得られ得るペクチンが提供される。 本発明の第18の局面によれば、本発明の組換え酵素および真菌PMEおよび／ま たは他のペクチン分解酵素（例えば、ペクチンライアーゼ）を含む酵素の組み合 わせが提供される。 本発明の他の局面には、食料品を調製するための本発明のペクチンの使用；お よび環境の粘度に不利な影響を及ぼすことなく酸性環境でタンパク質を安定化す るための本発明のペクチンの使用；および本発明の酵素をコードする組換えヌク レオチド配列が挙げられる。 したがって、本発明は、脱エステル化したペクチンの新しい使用に関する。本 発明はまた、このようなペクチンを調製するための新しい組換えPMEに関する。 本発明の重要な有利点のいくつかは、本発明の脱エステル化されたペクチンが 、環境の粘度に不利な影響を及ぼすことなく酸性環境でタンパク質に安定化を与 えることである。 本発明の第１の局面の好ましい実施態様は、少なくとも１つのタンパク質を含 む酸性環境に、ブロックワイズに酵素的に脱エステル化されたペクチンを添加す る工程を包含し、ここでペクチンは、組換えDNA技法の使用によって調製された 高エステルペクチンである、プロセスである。 用語「組換えDNA技法の使用によって調製されたブロックワイズに酵素的に脱 エステル化されたペクチン」とは、ブロックワイズに脱エステル化された基を含 むペクチンを意味し、ここでこのペクチンは、組換えDNA技法の使用によって調 製されている酵素でエステル化した基を含むペクチンを処理（例えば、接触）す ることによって調製される。 本発明のこの好ましい局面の重要な有利点のいくつかは、脱エステル化したペ クチンが容易に、そして相対程度の粘性で調製され得ることである。これに関し て、組換えPME自体は、かなり簡単および容易に、ならびに高い程度の均一性ま で調製され得る。これは次に、および先行技術のPME調製物とは異なり、得られ るPME活性がより一致しそして均質であるため、全体の脱エステル化プロセスが より制御されることが可能となることを意味する。 酸性環境で少なくとも１つのタンパク質を安定化するために、本発明のプロセ スにおけるブロックワイズに酵素的に脱エステル化されたペクチンを使用するこ と−これは好ましくは組換えDNA技法の使用によって調製される−は、乳清およ びミルクタンパク質（例えば、カゼイン）のようなタンパク質を酸性溶液中で安 定にさせるので、有用である。これは、スキムミルク、果汁、および乳清タンパ ク質飲料のような飲料市場に重要である。この分野では、以前は、高量の安定化 剤が存在したならば、pH4.2のようなかなり高い酸性条件下で重要なタンパク質 の風味を保持することのみが可能であった。 発明者らは、いくつかの適用について、本発明の少量の脱エステル化されたペ クチンが用いられ得ることを、現在見いだしている。これらの低レベルで、本発 明の脱エステル化されたペクチンは、安定化剤として作用するだけでなく、最終 産物に不利な影響を与えない。 所望であれば、本発明の脱エステル化されたペクチンの使用は、食品製造業者 が飲料のような食品のpHを増加させることを可能にする。これに関して、いくつ かの場合には、飲料のより酸性でない性質は、さらに人々、特に幼児の口に合う ようにし得る。したがって、先行技術のプロセスとは対照的に、現在は、ブロッ クワイズに酵素的に脱エステル化されたペクチン、特に組換えDNA技法の使用に よって調製されたブロックワイズに酵素的に脱エステル化されたペクチンの使用 によって、pH5.5までのような4.2よりも高いpH条件（例えば、pH5.2）でそれら のタンパク質の風味を保持することが可能である。 さらに、pH4.2またはそれより低いような低いpH条件下でさえも、ブロックワ イズに酵素的に脱エステル化されたペクチン−特に組換えDNA技法の使用によっ て調製されたブロックワイズに酵素的に脱エステル化されたペクチン−は、これ らのpH条件に使用される先行技術の安定化剤よりもタンパク質を安定化すると考 えられている。 さらなる利点は、組換えPMEが、実質的に均質なブロックワイズの脱エステル 化ペクチンを産生し得ることである。これによって、実質的にすべてのペクチン 鎖が、少なくとも２つの隣接する脱エステル化されたカルボキシル基を含むこと を意味する。しかし、いくつかの適用については、このような実質的に均質なブ ロックワイズの脱エステル化ペクチンを調製または使用することが必要であり得 ない。 理論によって結びつけることを望むことなく、ブロックワイズに酵素的に脱エ ステル化されたペクチン−特に組換えDNA技法の使用によって調製されたペクチ ン−は、負電荷のブランケットでタンパク質を取り囲んで、そうして安定な乳濁 物を形成することによってタンパク質を安定化する。 本発明の組換えPME酵素は、ペクチンが実質的な水性培地中で組換え酵素と接 触する場合、ペクチンをブロックワイズに脱エステル化するために有用である。 いくつかの場合、ペクチンを脱エステル化することは、ペクチンのカルシウムイ オン感受性を増加させ得る−これは同様に有利であり得る。 あるいは、本発明の組換えPME酵素は、ペクチンが実質的な非水性培地中で、 例えば、メタノールの存在下、または高濃度の硫酸アンモニウムの存在下で、組 換え酵素と接触する場合、ペクチンをエステル化するために有用である。この局 面は、例えば、ペクチンのカルシウム感受性を減少させることが所望される場合 、有利である。 ペクチンをエステル化するこの方法は、先行技術のプロセスに関連する高温お よびメタノールエステル化条件への必要性を除去するので、有利である。したが って、本発明はまた、食料品の調製におけるそのエステル化されたペクチンなら びにペクチン自体の使用を包含する。 本発明によれば、本発明の脱エステル化ペクチンは、食料品の調製に有利であ る。 代表的な食料品には、乳製品、肉製品、家禽製品、魚製品、およびパン製品が 挙げられる。好ましくは、食料品は飲料である。 本発明の脱エステル化されたペクチンはまた、医薬品、医療用具、化粧品、お よび化粧用具の調製における安定化剤および／または粘度調セクション剤として の使用に有利である。 好ましくは、酸性環境は水溶液である。 好ましくは、水溶液は飲料である。 好ましくは、飲料は、飲用ヨーグルト、果汁、または乳清タンパク質を含む飲 料である。 好ましくは、このタンパク質は、ミルクまたはチーズのような乳製品に由来す るまたは由来し得る。 好ましくは、このタンパク質はカゼインまたは乳清タンパク質である。 好ましくは、酸性環境は、約3.5〜約5.5のpHを有する。 好ましくは、酸性環境は４〜約5.5のpHを有する。 好ましくは、ここでは酸性環境は約４のpHを有する。 好ましくは、ブロックワイズに酵素的に脱エステル化されたペクチン、特に組 換えDNA技法の使用によって調製されたペクチンは、約80％またはそれより少な いエステル基（すなわち、80％またはそれより少ないエステル化（DE）の程度） 、好ましくは約75％またはそれより少ないエステル基（すなわち、75％またはそ れより少ないDEの程度）を含む高エステルペクチンである。これに関して、エス テル化カルボキシル基に対するペクチンにおける遊離のカルボキシル基の比は、 1:1〜1:4、好ましくは1:2〜1:3である。 好ましくは、ブロックワイズに酵素的に脱エステル化されたペクチンは約76％ エステル基を含む。 いくつかの場合には、好ましくは、ブロックワイズに酵素的に脱エステル化さ れたペクチンは、Ca²⁺イオンに感受性である。カルシウム感受性は、実施例に記 載のプロトコルに従って決定され得る。 しかし、より好ましくは、ブロックワイズに酵素的に脱エステル化されたペク チン、特に組換えDNA技法によって調製されたペクチンは、Ca²⁺イオンに非感受 性である。カルシウム非感受性は、実施例に記載のプロトコルに従って決定され 得る。 好ましくは、ブロックワイズに酵素的に脱エステル化されたペクチンは、高分 子量を有する。 代表的には、分子量は、約50KDから約150KDまでの間である。 好ましくは、ブロックワイズに酵素的に脱エステル化されたペクチンは、少な くとも実質的にすべてのペクチン鎖におけるペクチンの２つ以上の隣接するガラ クツロン酸残基を脱エステル化する組換えペクチンメチルエステラーゼでペクチ ンを処理することによって調製される。 好ましくは、組換えペクチンメチルエステラーゼは、植物から得られ得るPME に由来する。 用語「植物から得られ得るPMEに由来する」とは、組換えPMEがブロックワイズ の様式でペクチンを脱エステル化し得るならば、組換えPMEが、植物から得られ 得るPMEの配列と類似の配列を有することを意味する。 好ましくは、植物は果物である。 好ましくは、果物は柑橘類の果物である。 好ましくは、柑橘類の果物はオレンジである。 好ましくは、組換えペクチンメチルエステラーゼは、オレンジのラメラまたは アルベドから得られ得るPMEに由来する。参考のために、代表的な柑橘類の果物 の断面を図１に示し、ここにはラメラおよびアルベドを示す。用語「オレンジの ラメラまたはアルベドから得られ得るPMEに由来する」とは、組換えPMEがブロッ クワイズの様式でペクチンを脱エステル化し得るならば、組換えPMEがオレンジ のラメラまたはアルベドから得られ得るPMEの配列と類似の配列を有することを 意味する。 好ましくは、ブロックワイズに酵素的に脱エステル化されたペクチンは、配列 番号１もしくは配列番号２に示すアミノ酸配列のいずれか１つを含む組換え酵素 、またはその改変体、誘導体、もしくはホモログ（それらの組み合わせを含む） でペクチンを処理することによって調製される。 好ましくは、ブロックワイズに酵素的に脱エステル化されたペクチンは、配列 番号３もしくは配列番号４に示すヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列の発 現によって得られ得る組換え酵素、またはその改変体、誘導体、もしくはホモロ グ、あるいはそれらの組み合わせでペクチンを処理することによって調製される 。 好ましくは、ブロックワイズに酵素的に脱エステル化されたペクチンは、NCIM B 40749またはNCIMB 40750に含まれるPMEコード配列の発現によって得られ得る 組換え酵素、またはその改変体、誘導体、もしくはホモログ、あるいはそれらの 組み合わせでペクチンを処理することによって調製される。 好ましくは、ブロックワイズに酵素的に脱エステル化されたペクチンは、ナト リウムイオンの存在下で組換えペクチンメチルエステラーゼでペクチンを処理す ることによって調製される。 好ましくは、組換えDNA技法によって調製されたブロックワイズに酵素的に脱 エステル化されたペクチンは、NaCl、NaNO₃、またはNa₂SO₄の存在下で組換えペ クチンメチルエステラーゼでペクチンを処理することによって調製される。 好ましくは、組換え酵素は、配列番号１または配列番号２に示す配列のすべて を含む。 好ましくは、組換え酵素は、配列番号３または配列番号４に示す配列のすべて を含むヌクレオチド配列によって発現される。 本発明はまた、上記の配列に相補的である配列を包含する。 用語「ペクチン」には、その正常な意味でのペクチン、ならびにその分別物お よび誘導体、ならびに改変されたペクチン（例えば、化学的に改変されたペクチ ンおよび酵素的に改変されたペクチン）が含まれる。 好ましくは、ペクチンは、ペクチン骨格の長さを実質的に減少するために酵素 ポリガラクツロナーゼで先に処理されているペクチンではない。 本発明の組換え酵素に関して、用語「改変体」、「ホモログ」、または「フラ グメント」には、得られるアミノ酸配列が、PME活性を有し、好ましくは配列番 号１および２に示す配列のいずれか１つ以上を含む組換え酵素の少なくとも同一 の活性を有するならば、配列からのまたは配列への１つ（またはそれより多くの ）アミノ酸の任意の代用、変更、改変、置換、欠失、または付加が含まれる。特 に、用語「ホモログ」は、得られる組換え酵素がPME活性を有するならば、構造 および／または機能に関する相同性を包含する。配列相同性（すなわち、類似性 ）に関しては、好ましくは、添付の配列表に示す配列に対して少なくとも75％、 より好ましくは少なくとも85％、より好ましくは少なくとも90％の相同性である 。より好ましくは、添付の配列表に示す配列に対して少なくとも95％、より好ま しくは少なくとも98％の相同性である。 本発明の組換え酵素をコードするヌクレオチド配列に関して、用語「改変体」 、「ホモログ」、または「フラグメント」には、得られるヌクレオチド配列が、 PME活性を有し、好ましくは配列番号１および２に示す配列のいずれか１つ以上 を含む組換え酵素の少なくとも同一の活性を有する組換え酵素をコードするなら ば、配列からのまたは配列への１つ（またはそれより多くの）核酸の任意の代用 、変更、改変、置換、欠失、または付加が含まれる。特に、用語「ホモログ」は 、得られるヌクレオチド配列がPME活性を有する組換え酵素をコードするならば 、構造および／または機能に関する相同性を包含する。配列相同性（すなわち、 類似性）に関しては、好ましくは、少なくとも75％、より好ましくは少なくとも 85％、より好ましくは少なくとも90％の相同性である。より好ましくは、少なく とも95％、より好ましくは少なくとも98％の相同性である。 上記の用語は、配列の対立遺伝子改変と同義である。 用語「相補的」とは、本発明がまた、コード配列のヌクレオチド配列にハイブ リダイズし得るヌクレオチド配列を包含することを意味する。 本発明に関して、用語「ヌクレオチド」には、ゲノムDNA、cDNA、合成DNA、お よびRNAが含まれる。好ましくは、DNA、より好ましくは本発明のコード配列につ いてのcDNAを意味する。 用語「柑橘類の果物」とは、Citrus属の種を意味し、そしてライム、レモン、 オレンジ、グレープフルーツ、キンカン、ザボン、およびマンダリンを含む。好 ましくは、オレンジを意味する。 用語「構築物」−これは、「結合体」、「カセット」、および「ハイブリッド 」のような用語と同義である−は、本発明のヌクレオチド配列、または構築物の 組み合わせの場合、プロモーターに直接的または間接的に結合したGOIを含む。 間接的結合の例は、イントロン配列（例えば、Sh1-イントロンまたはADHイント ロン）のような適切なスペーサー基の用意であり、プロモーターと本発明のヌク レオチド配列またはGOIとを媒介する。同じことは、直接的または間接的結合を 含む本発明に関しての用語「融合した」について当てはまる。各場合において、 そして両方とも天然に環境下にある場合、用語は、野生型遺伝子プロモーターに 通常関連する酵素をコードする遺伝子の天然の組み合わせを含まない。 構築物は、さらに、それが移される、例えば、糸状菌、好ましくはAspergillu s属（例えば、Aspergillus niger）、または植物（例えば、ポテト、テンサイな ど）における遺伝子構築物を選択させるマーカーを含むまたは発現し得る。種々 のマーカーが存在し、例えば、マンノース-6-リン酸イソメラーゼをコードする マーカー（特に植物について）、または抗生物質耐性を与えるマーカー（例えば 、G418、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、カナマイシン、およびゲンタマイ シンへの耐性）が使用され得る。 用語「ベクター」は、発現ベクターおよび形質転換ベクターを包含する。 用語「発現ベクター」とは、インビボまたはインビトロ発現を可能にする構築 物を意味する。 用語「形質転換ベクター」とは、１つの種から他へ−例えば、E．coliプラス ミドから糸状菌（好ましくはAspergillus属）へ−移され得る構築物を意味する 。E．coliプラスミドから植物のAgrobacteriumへ移され得る構築物でもあり得る 。 用語「組織」には、組織自体および器官を含む。 本発明に関して、用語「生物」には、本発明の組換え酵素をコードするヌクレ オチド配列および／またはそれから得られる産物を含み得る任意の生物を含み、 ここでプロモーターは、生物に存在する場合、本発明のヌクレオチド配列を発現 させ得る。 好ましくは、生物は、糸状菌であり、好ましくはAspergillus属、より好まし くはAspergillus nigerである。 本発明に関して、用語「トランスジェニック生物」には、本発明の組換え酵素 をコードするヌクレオチド配列および／またはそれから得られる産物を含み得る 任意の生物を含み、ここでプロモーターは、生物内で本発明のヌクレオチド配列 を発現させ得る。好ましくは、ヌクレオチド配列は生物のゲノムに組み込まれる 。 好ましくは、トランスジェニック生物は、糸状菌であり、好ましくはAspergil lus属、より好ましくはAspergillus nigerである。 したがって、本発明のトランスジェニック生物は、プロモーター、本発明の組 換え酵素をコードするヌクレオチド配列、本発明の構築物（それらの組み合わせ を含む）、本発明のベクター、本発明のプラスミド、本発明の細胞、本発明の組 織、またはそれらの産物のいずれか１つまたは組み合わせを含む生物を含む。 用語「トランスジェニック生物」は、天然の環境にある天然のプロモーターの 制御下にある場合、天然の環境中の本発明の天然のヌクレオチドコード配列を包 含しない。さらに、本発明は、天然の環境にある場合、およびこれもまた天然の 環境にある天然のヌクレオチドコード配列によって発現されている場合、および ヌクレオチド配列がこれもまた天然の環境にある天然のプロモーターの制御下に ある場合、本発明の天然の酵素を包含しない。 形質転換された細胞または生物は、その細胞または生物から容易に回復可能で ある所望の化合物の受容可能な量を調製し得る。 好ましくは、本発明の構築物は、本発明のヌクレオチド配列およびプロモータ ーを含む。 用語「プロモーター」は、当該分野の通常の意味で、例えば、遺伝子発現のJa cob-Monod理論におけるRNAポリメラーゼ結合部位に使用される。 １つの局面では、本発明のヌクレオチド配列は、細胞または組織特異的プロモ ーターであり得るプロモーターの制御下にある。例えば、生物が植物であるなら ば、プロモーターは、塊茎、茎、芽、根、および葉組織のいずれか１つ以上のヌ クレオチド配列の発現に影響を及ぼすものであり得る。 例として、本発明のヌクレオチド配列についてのプロモーターは、本発明者ら の1994年10月21日に出願された同時係属中の英国特許出願第9421292.5号に記載 されるようなα-Amy 1プロモーター（他に、Amy 1プロモーター、Amy 637プロモ ーター、またはα-Amy 637プロモーターとして知られる）であり得る。あるいは 、本発明のヌクレオチド配列についてのプロモーターは、本発明者らの1994年10 月21日に出願された同時係属中の英国特許出願第9421286.7号に記載されるよう なα-Amy 3プロモーター（他に、Amy 3プロモーター、Amy 351プロモーター、ま たはα-Amy 351プロモーターとして知られる）であり得る。 プロモーターは、適切な宿主中での発現を確実にするまたは増加させるための 特徴をさらに含み得る。例えば、この特徴は、Pribnow BoxまたはTATAボックス のような保存された領域であり得る。プロモーターは、本発明のヌクレオチド配 列の発現のレベルまたは構築物の組み合わせの場合、GOIの発現のレベルに影響 を及ぼす（例えば、維持する、増強する、減少させる）ための他の配列をさらに 含み得る。例えば、適切な他の配列は、Sh1-イントロンまたはADHイントロンを 含む。他の配列は、誘導性エレメント−例えば、温度、化学、光、またはストレ ス誘導性エレメントを含む。また、転写または翻訳を増強するための適切なエレ メントが存在し得る。後者のエレメントの例は、TMV 5'シグナル配列である（Sl eat Gene 217［1987］217-225;およびDawson Plant Mol．Blol．23［1993］97を 参照のこと）。 さらに、本発明はまた、プロモーターおよび／またはタンパク質または組換え 酵素をコードするヌクレオチド配列および／またはエレメントの組み合わせを包 含する。 本発明はまた、本発明の組換え酵素またはGOIをコードするヌクレオチド配列 を発現するためのプロモーターの使用を包含し、ここでプロモーターの一部は不 活性化されるが、プロモーターはなおプロモーターとして機能し得る。ある場合 には、プロモーターの部分的不活性化は有利である。特に、先に述べたAmy 351 プロモーターでは、部分的に不活性化したプロモーターが、ほんの１つの特定の 組織タイプまたは器官を発現するような、より特異的方法で、本発明のヌクレオ チドまたはGOIを発現するように、その一部を不活性することが可能である。 用語「不活性化した」とは、プロモーターの発現パターンが改変されているが 、部分的に不活性化されたプロモーターがなおプロモーターとして機能するとい う 意味での部分的不活性化を意味する。しかし、上記のように、改変されたプロモ ーターは、元のプロモーターの少なくとの１つ（しかしすべてではない）の特定 の組織において本発明のヌクレオチドまたはGOIを発現し得る。このようなプロ モーターの１つは、上記のAmy 351プロモーターである。部分的不活性化の例に は、プロモーター配列の折り畳みパターンを変更すること、またはヌクレオチド 配列の部分に種を結合することが挙げられ、その結果ヌクレオチド配列の一部は 例えば、RNAポリメラーゼによって認識されない。プロモーターを部分的に不活 性化する他のそして好ましい方法は、そのフラグメントを形成するためにプロモ ーターを切断することである。他の方法は、RNAポリメラーゼがその部分または 他の部分に結合し得ないように配列の少なくとも一部を変異することである。他 の改変は、調セクションタンパク質（例えば、炭素カタボライト抑制を発揮する ための糸状菌から公知のCreAタンパク質）に対する結合部位を変異することであ り、したがって、天然のプロモーターのカタボライト抑制を廃止する。 本発明の構築物の組み合わせに関して、用語「GOI」とは、目的の任意の遺伝 子を意味する。GOIは、問題の生物（例えば、糸状菌、好ましくはAspergillus属 、または植物）に対して外来または生来のいずれかである任意のヌクレオチドで あり得る。GOIの代表的な例は、代謝およびカタボライトプロセスを改変するタ ンパク質および酵素をコードする遺伝子を含む。GOIは、病原体耐性を導入また は増加するための因子をコードし得る。GOIは、関連の組織に存在する天然の転 写物の発現を改変するためのアンチセンス構築物でもあり得る。GOIはさらに、 糸状菌、好ましくはAspergillus属の非天然タンパク質、あるいは動物またはヒ トに有益である化合物をコードし得る。 GOIの例には、他のペクチナーゼ、ペクチンデポリメラーゼ、ポリガラクツロ ナーゼ、ペクテートリアーゼ、ペクチンライアーゼ、ラムノ−ガラクツロナーゼ 、ヘミセルラーゼ、エンド-β-グルカナーゼ、アラビナーゼ、またはアセチルエ ステラーゼ、あるいはそれらの組み合わせ、ならびにそのアンチセンス配列が挙 げられる。 GOIは、食物または作物に栄養価を与えるタンパク質であり得る。代表的な例 には、抗栄養因子の形成を阻害し得る植物タンパク質、およびより望ましいアミ ノ酸組成を有する植物タンパク質（例えば、非トランスジェニック植物よりも高 いリジン含量）が挙げられる。GOIはさらに、キモシン、タウマチン、およびα- ガラクトシダーゼのような食物加工に使用され得る酵素をコードし得る。GOIは 、害虫トキシン、パタチンまたはα-アミラーゼに対するもののようなアンチセ ンス転写物、ADP-グルコースピロホスホリラーゼ（例えば、EP-A-0455316を参照 のこと）、プロテアーゼアンチセンス、グルカナーゼ、またはゲノムPMEのいず れか１つをコードする遺伝子であり得る。 GOIはさらに、特定の酵素のイントロンをコードし得るが、イントロンはセン スまたはアンチセンス方向であり得る。後者の場合、特定の酵素はゲノムPMEで あり得る。ゲノムエクソンまたはイントロン配列のGOIとしてのアンチセンス発 現は、天然のPME発現が減少または排除されるが、組換えPME発現は影響を受けな いことを意味する。これは、アンチセンスイントロンまたはセンスイントロン発 現について特に真実である。 GOIは、1994年7月4日に出願された本発明者らの同時係属中の英国特許出願941 3439.2の主題であるα-アミラーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列であり得 る。GOIは、1994年10月21日に出願された本発明者らの同時係属中の英国特許出 願9421290.9の主題であるα-アミラーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列であ り得る。GOIは、1994年4月7日に出願された本発明者らの同時係属中のPCT特許出 願PCT/EP94/01082の主題であるADP-グルコースピロホスホリラーゼ酵素をコード するヌクレオチド配列のいずれかであり得る。GOIは、1994年10月15日に出願さ れた同時係属中の本発明者らのPCT特許出願PCT/EP94/03397に記載されるα-グル カンリアーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列のいずれかであり得る。 宿主生物は、原核生物または真核生物であり得る。適切な原核生物の例には、 E．coliおよびBacillus subtilisが含まれる。原核生物宿主の形質転換の教示は 、当該分野で十分に立証されており、例えば、Sambrookら（Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第２版，1989，Cold Spring Harbor Laboratory Press ）を参照のこと。真核生物宿主が使用されるならば、遺伝子は、形質転換前にイ ントロンの除去によるように適切に改変される必要があり得る。 上記のように、好ましい宿主生物は、Aspergillus nigerのようなAspergillus 属であり得る。 本発明のトランスジェニックAspergillusは、以下の教示に従って調製され得 る。Rambosek，J.およびLeach，J．1987（Recombinant DNA in filamentous fun gi: Progress and Prospects．CRC Crit．Rev．Biotechnol．6:357-393）、Davi s R.W．1994（Heterologous gene expression and protein secretion in Asper gillus.: Martinelli S.D.，Kinghorn J.R.(編)Aspergillus: 50 years on．Pro gress in industrial microbiology 29巻．Elsevier Amsterdam 1994．525-560 頁）、Ballance，D.J．1991（Transformatin systems for Filamentous Fungl a nd an Overview of Fungal Gene structure.: Leong，S.A.，Berka R.M.(編)Mol ecular Industrial Mycology．Systems and Applications for Filamentous Fun gi．Marcel Dekker Inc．New York 1991．1-29頁）、およびTurner G．1994（Ve ctors for genetic manipulation.: Martinelli S.D.，Kinghorn J.R.(編)Asper gillus: 50 years on．Progress in industrial microbiology 29巻．Elsevier Amsterdam 1994．641-666頁）。しかし、以下の説明は、本発明のトランスジエ ニックAspergillusを生産するためのこれら教示の要旨を提供する。 ほぼ一世紀の間、糸状菌は、有機化合物および酵素の生産のために、多くのタ イプの産業に広く使用されてきた。例えば、伝統的な日本の麹および大豆発酵は 、Aspergillus種を使用してきた。また、今世紀には、Aspergillus nigerは、有 機酸、特にクエン酸の生産に、および産業での使用のための種々の酵素の生産に 使用されている。 糸状菌が産業でこのように広く使用されているのには２つの主な理由がある。 第１に、糸状菌は、大量の細胞外産物、例えば、酵素および有機化合物（例えば 、抗生物質または有機酸）を産生し得る。第２に、糸状菌は、穀物、ふすま、ビ ートパルプなどのような低コストの基質上で増殖し得る。同じ理由で、糸状菌は 本発明の異種発現のための宿主として、魅力的な生物となった。 トランスジェニックAspergillusを調製するために、発現構築物は、本発明の ヌクレオチド配列（またはGOIも）を糸状菌での発現のために設計された構築物 中に挿入することによって調製される。 異種発現のために使用されるいくつかのタイプの構築物が開発されている。こ れらの構築物は、好ましくは、真菌中で活性であるプロモーターを含む。プロモ ーターの例として、グルコアミラーゼプロモーターまたはα-アミラーゼプロモ ーターのような、高度に発現された細胞外酵素についての真菌性プロモーターが 挙げられる。本発明のヌクレオチド配列（またはGOIも）は、分泌されるべき本 発明のヌクレオチド配列（またはGOIも）によってコードされるタンパク質を指 向するシグナル配列に融合され得る。通常、真菌起源のシグナル配列が使用され る。真菌で活性なターミネーターは発現系を終結させる。 他のタイプの発現系が、真菌において開発されており、ここで、本発明のヌク レオチド配列（またはGOIも）は、安定なタンパク質をコードする真菌遺伝子の より小さなまたはより大きな部分に融合され得る。これは、本発明のヌクレオチ ド配列（またはGOIも）によってコードされるタンパク質を安定化し得る。この ような系において、特定のプロテアーゼによって認識される切断部位は、真菌の タンパク質と本発明のヌクレオチド配列（またはGOIも）によってコードされる タンパク質との間に導入され得、それにより、産生された融合タンパク質は特定 のプロテアーゼによってこの位置で切断され得、従って、本発明のヌクレオチド 配列（またはGOIも）によってコードされるタンパク質を遊離させる。例として 、少なくともいくつかのAspergillusで見いだされるKEX-2様ペプチダーゼによっ て認識される部位を導入し得る。このような融合物は、インビボの切断を導き、 その結果、より大きな融合タンパク質ではなく、発現された産物の保護を生じる 。 Aspergillusにおける異種発現は、細菌、真菌、脊椎動物、および植物のタン パク質をコードするいくつかの遺伝子について報告されている。タンパク質は、 本発明のヌクレオチド配列（またはGOIも）がシグナル配列に融合されない場合 、細胞内に堆積し得る。このようなタンパク質は、細胞質内に蓄積し、そして通 常はグリコシル化されず、このことはいくつかの細菌タンパク質にとって利点と なり得る。本発明のヌクレオチド配列（またはGOIも）がシグナル配列に備え付 けられると、タンパク質は細胞外に蓄積する。 産物の安定性および宿主株の改変に関しては、いくつかの異種タンパク質は、 真菌の培養液中に分泌される場合、あまり安定ではない。ほとんどの真菌は、異 種タンパク質を分解するいくつかの細胞外プロテアーゼを産生する。この問題を 避けるために、プロテアーゼ産生が減少された特別な真菌株が、異種産生のため の宿主として使用されている。 糸状菌の形質転換について、いくつかの形質転換プロトコルが多くの糸状菌に ついて開発されている（Ballance 1991，同上）。それらの多くは、プロトプラ ストの調製ならびにPEGおよびCa²⁺イオンを使用するプロトプラスト中へのDNAの 導入に基づく。次いで、形質転換されたプロトプラストは再生し、そして形質転 換された真菌は、種々の選択マーカーを使用して選択される。形質転換に使用さ れるマーカーの中では、argB、trpC、niaD、およびpyrGのような多くの栄養要求 性マーカー、ベノミル耐性、ハイグロマイシン耐性、およびフレオマイシン耐性 のような抗生物質耐性マーカーがある。通常使用される形質転換マーカーは、A ．nidulansのamdS遺伝子であり、これは唯一の窒素供給源としてアクリルアミド を用いて高コピー数で真菌を増殖させる。 他の実施態様では、トランスジェニック生物は酵母であり得る。これに関して 、酵母はまた、異種遺伝子発現のためのビヒクルとして広く使用されている。Sa ccharomyces cerevisiae種は、異種遺伝子発現のための使用を含めて、産業用途 の長い歴史を有する。Saccharomyces cerevisiaeにおける異種遺伝子の発現は、 Goodeyら（1987，Yeast Biotechnology，D R Berryら編，401-429頁，Allen and Unwin，London）およびKingら（1989，Molecular and Cell Biology of Yeasts ，E F WaltonおよびG T Yarronton編，107-133頁，Blackie，Glasgow）によって 総説されている。 いくつかの理由について、Saccharomyces cerevisiaeは異種遺伝子発現によく 適合している。第１に、ヒトに対して病原性でなくそして特定のエンドトキシン を産生し得ない。第２に、種々の目的のための数世紀の商業的利用にならった安 全な用途の長い歴史を有する。このことは、広い公衆への受容可能性を導いてい る。第３に、広範な商業的用途およびこの生物に向けられた研究により、Saccha romyces cerevisiaeの遺伝学および生理学、ならびに大規模発酵の特徴について の豊富な知識が得られた。 Saccharomyces cerevisiaeにおける異種遺伝子発現および遺伝子産物の分泌の 原理の総説は、E Hinchcliffe E Kenny（1993，「異種遺伝子の発現のためのビ ヒクルとしての酵母」，Yeasts，5巻，Anthony H RoseおよびJ Stuart Harrison 編，第２版，Academic Press Ltd.）によって与えられる。 組込みベクターを含むいくつかのタイプの酵母ベクターが入手可能であり、こ れはその維持のために宿主ゲノムとの組換えを必要とし、そしてプラスミドベク ターを自律的に複製する。 トランスジェニックSaccharomycesを調製するために、発現構築物は、本発明 のヌクレオチド配列を酵母での発現のために設計された構築物中に挿入すること によって調製される。異種発現に使用されるいくつかのタイプの構築物が開発さ れている。構築物は、本発明のヌクレオチド配列に融合される酵母中で活性なプ ロモーターを含み、通常は、GALIプロモーターのような酵母起源のプロモーター が使用される。通常、SUC2シグナルペプチドをコードする配列のような、酵母起 源のシグナル配列が使用される。酵母中で活性なターミネーターは、発現系を終 結させる。 酵母の形質転換について、いくつかの形質転換プロトコルが開発されている。 例えば、本発明のトランスジェニックSaccharomycesは、Hinnenら（1978，Proce edings of the National Academy of Sciences of the USA 75，1929）；Beggs, J D（1978，Nature，London，275，104）；およびIto，Hら（1983，J Bacterio logy 153，163-168）の教示に従って調製され得る。 形質転換された酵母細胞は、種々の選択マーカーを使用して選択される。形質 転換のために使用されるマーカーには、LEU2、HIS4、およびTRP1のような多くの 栄養要求性マーカー、およびアミノグリコシド系抗生物質マーカー（例えば、G4 18）のような優勢抗生物質耐性マーカーがある。 他の宿主生物は植物である。 たとえ酵素およびそれをコードするヌクレオチド配列がEP-B-0470145およびCA -A-2006454に開示されていなくても、これらの２つの文献は、本発明のトランス ジェニック植物を調製するために用いられ得るタイプの技法についてのいくつか の有用なバックグラウンドの説明を提供する。これらのバックグラウンド教示の いくつかは、ここで以下の説明に含まれる。 遺伝学的に改変された植物の構築における基本的原理は、挿入された遺伝物質 の安定な維持を得るために植物ゲノムに遺伝情報を挿入することである。 遺伝情報を挿入するためのいくつかの技法が存在し、２つの主な原理は遺伝情 報の直接的導入およびベクター系の使用による遺伝情報の導入である。一般的技 法の総説は、Potrykus（Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol［1991］42:20 5-225）およびChristou（Agro-Food-Industry Hi-Tech 3月/4月 1994 17-27）に よる文献に見られ得る。 したがって、１つの局面において、本発明は、本発明のヌクレオチド配列また は構築物を有し、そして植物のような生物のゲノム中にこのヌクレオチド配列ま たは構築物を導入し得るベクター系に関する。 ベクター系は１つのベクターを含んでいてもよいが、２つのベクターを含み得 る。２つのベクターの場合には、ベクター系は、通常、バイナリーベクター系と 呼ばれる。バイナリーベクター系は、Gynheung Anら(1980)，Binary Vectors，P lant Molecular Biology Manual A3，1-19に、さらに詳細に記載される。 所定のプロモーターまたはヌクレオチド配列または構築物での植物細胞の形質 転換のために広範に用いられる１つの系は、Agrobacterium tumefaciens由来のT iプラスミドまたはAgrobacterium rhizogenes由来のRiプラスミドの使用に基づ く。Anら(1986)，Plant Physiol．81，301-305およびButcher D.N.ら(1980)，Ti ssue Culture Methods for Plant Pathologists，D.S．IngramsおよびJ.P．Helg eson編，203-208。 いくつかの異なるTiおよびRiプラスミドが構築されており、これらは上記の植 物または植物細胞構築物の構築に適している。このようなTiプラスミドの限定さ れない例は、pGV3850である。 本発明のヌクレオチド配列または構築物は、T-DNA境界を直接取り囲む配列の 分裂を避けるために、好ましくはT-DNAの末端配列間またはT-DNA配列に隣接する Tiプラスミドに挿入されるべきである。なぜなら、少なくとも１つのこれらの領 域が植物ゲノムへの改変されたT-DNAの挿入に必須であるようであるからである 。 上記の説明から理解されるように、生物が植物である場合は、本発明のベクタ ー系は、好ましくは、植物を感染させるために必要な配列（例えば、vir領域） およびT-DNA配列の少なくとも１つの境界部分を含むものであり、境界部分は、 遺伝子構築物と同じベクター上に位置している。好ましくは、ベクター系は、Ag robacterium tumefaciens Ti-プラスミドまたはAgrobacterium rhizogenes Ri- プラスミド、あるいはそれらの誘導体であり、これらのプラスミドは周知であり そしてトランスジェニック植物の構築に広く用いられるので、これらのプラスミ ドまたはその誘導体に基づく多くのベクター系が存在する。 トランスジェニック植物の構築において、本発明のヌクレオチド配列または構 築物は、まず、ベクターが複製され得そして植物への挿入前に操作することが容 易である微生物中に構築され得る。有用な微生物の例は、E．coli.であるが、上 記の特性を有する他の微生物が使用され得る。上記のようなベクター系のベクタ ーがE．coli中に構築されている場合、必要ならば、適切なAgrobacterium株、例 えば、Agrobacterium tumefaciens中に移される。したがって、本発明のヌクレ オチド配列または構築物を有するTi-プラスミドは、本発明のヌクレオチド配列 または構築物を有するAgrobacterium細胞を得るために、好ましくは、適切なAgr obacterium株、例えば、A．tumefaciens中に移され、DNAは続いて改変されるべ き植物細胞中に移される。 CA-A-2006454に報告されるように、大量のクローニングベクターが利用可能で あり、これらはE．coliでの複製系および形質転換された細胞の選択を可能にす るマーカーを含む。ベクターとして、例えば、pBR322、pUCシリーズ、M13 mpシ リーズ、pACYC184などが挙げられる。 このように、本発明のヌクレオチドまたは構築物は、ベクター中の適切な制限 位置に導入され得る。含まれるプラスミドは、E．coliにおける形質転換に使用 される。E．coli細胞は、適切な栄養培地中で培養され、次いで採収されて溶解 される。次いでプラスミドが回収される。分析の方法として、一般的に使用され る配列分析、制限分析、電気泳動、およびさらなる生化学的分子生物学的方法が ある。各操作後、使用されたDNA配列は、制限されそして次のDNA配列と連結され 得る。各配列は、同じまたは異なるプラスミドにクローニングされ得る。 植物中の本発明の所望のプロモーターまたは構築物またはヌクレオチド配列の 各導入方法の後、さらなるDNA配列の存在および／または挿入が必要であり得る 。例えば、形質転換について、植物細胞のTi-またはRi-プラスミドが使用される 場 合、Ti-およびRi-プラスミドT-DNAの少なくとも右の境界、しかししばしば右お よび左の境界が、導入された遺伝子の領域に隣接するように、連結され得る。植 物細胞の形質転換のためのT-DNAの使用は集中的に研究されており、そしてEP-A- 120516；Hoekema: The Binary Plant Vector System Offset-drukkerij Kanters B.B.，Alblasserdam，1985，第5章；Fraleyら，Crit．Rev．Plant Sci.，4:1-4 6；およびAnら，EMBO J.（1985）4:277-284に記載される。 Agrobacteriumによる植物組織の直接感染は、広く用いられ、そしてButcher D .N.ら(1980)，Tissue Culture Methods for Plant Pathologists，D.S．Ingrams およびJ.P．Helgeson編，203-208に記載されている単純な技法である。この項目 のさらなる教示については、Potrykus（Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Bio l［1991］42:205-225）およびChristou（Agro-Food-Industry Hi-Tech 3月/4月1 994 17-27）を参照のこと。この技法で、植物の感染は、植物の特定の部分また は組織、すなわち、葉、根、茎の一部、または植物の他の部分で行われ得る。 代表的には、プロモーターおよび／またはGOIを有するAgrobacteriumによる植 物組織の直接感染では、感染されるべき植物は、例えば、かみそりで植物を切断 すること、または針で植物に穴を開けること、または研磨剤で植物をこすること によって、傷つけられる。次いで、傷は、Agrobacteriumが接種される。次いで 、接種された植物または植物の部分は、適切な培養培地で増殖され、そして成熟 植物に発育させる。 植物細胞が構築される場合、これらの細胞は、アミノ酸、植物ホルモン、ビタ ミンなどのような必要な増殖因子を補充した適切な培養培地中で細胞を培養する ことによるような、周知の組織培養方法に従って、増殖および維持され得る。遺 伝子的に改変された植物中に形質転換された細胞の再生は、例えば、形質転換さ れた苗条を抗生物質を使用して選択することによって、および適切な栄養、植物 ホルモンなどを含む培地で苗条を継代培養することによって、細胞または組織培 養物からの植物の再生のための公知の方法を使用して成し遂げられ得る。 植物形質転換のさらなる教示は、EP-A-0449375に見い出され得る。 要約すると、本発明は、酸性環境下で少なくとも１つのタンパク質を安定化す るプロセスを提供し、このプロセスは、ブロックワイズに酵素的に脱エステル化 されたペクチン（特に組換えDNA技法によって調製されたブロックワイズに酵素 的に脱エステル化されたペクチン）とタンパク質とを接触させる工程を包含する 。 さらに、本発明は、このプロセスに有用な組換え酵素を提供する。 本発明の好ましい実施態様は、酸性環境で少なくとも１つのタンパク質を安定 化するプロセスに関し、このプロセスは、組換えDNA技法によって調製されたブ ロックワイズに酵素的に脱エステル化されたペクチンとタンパク質とを接触させ る工程を包含する。ここで、ブロックワイズに酵素的に脱エステル化されたペク チンは、組換え酵素の使用によって調製され、そして組換え酵素は、配列番号１ もしくは配列番号２に示すアミノ酸配列のいずれか１つ、またはその改変体、誘 導体、もしくはホモログ（それらの組み合わせを含む）を含み、そして以下の特 徴を有する： １．約36kD〜約64kDの分子量； ２．0.15M NaCl中の0.5％ライムペクチンとともに測定した場合、pH７〜８の至 適pH； ３．最低でも50℃の至適温度； ４．10℃〜最低でも40℃の範囲における温度安定性； ５．0.07％のＫ_m値； ６．約0.25M NaClのレベルでの最大活性； ７．約0.2M Na₂SO₄のレベルでの最大活性；および ８．約0.3M NaNO₃のレベルでの最大活性。 本発明の他の好ましい実施態様は、ペクチンをブロックワイズに酵素的に脱エ ステル化する方法に関し、この方法は、配列番号１もしくは配列番号２に示すア ミノ酸配列のいずれか１つ、またはその改変体、誘導体、もしくはホモログ（そ れらの組み合わせを含む）を含む組換え酵素でペクチンを処理する工程を包含す る。ここで組換え酵素は以下の特徴を有する： １．約36kD〜約64kDの分子量； ２．0.15M NaCl中の0.5％ライムペクチンとともに測定した場合、pH７〜８の至 適pH； ３．最低でも50℃の至適温度； ４．10℃〜最低でも40℃の範囲における温度安定性； ５．0.07％のＫ_m値； ６．約0.25M NaClのレベルでの最大活性； ７．約0.2M Na₂SO₄のレベルでの最大活性；および ８．約0.3M NaNO₃のレベルでの最大活性。 本発明の他の好ましい実施態様は、配列番号１もしくは配列番号２に示すアミ ノ酸配列のいずれか１つ、またはその改変体、誘導体、もしくはホモログ（それ らの組み合わせを含む）を含む組換え酵素に関し、ここで組換え酵素は以下の特 徴を有する： １．約36kD〜約64kDの分子量； ２．0.15M NaCl中の0.5％ライムペクチンとともに測定した場合、pH７〜８の至 適pH； ３．少なくとも50℃の至適温度； ４．10℃〜少なくとも40℃の範囲における温度安定性； ５．0.07％のＫ_m値； ６．約0.25M NaClのレベルでの最大活性； ７．約0.2M Na₂SO₄のレベルでの最大活性；および ８．約0.3M NaNO₃のレベルでの最大活性。 本発明のより好ましい実施態様は、上記の好ましいプロセス、方法、および組 換え酵素に関し、そしてここで組換え酵素は、配列番号３もしくは配列番号４に 示す配列を含むヌクレオチド配列、またはその改変体、誘導体、もしくはホモロ グによって発現されている。 以下のサンプルは、承認された寄託機関であるThe National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited(NCIMB)（23 St Machar Drive，Aberd een，Scotland，AB2 1RY，United Kingdom）に、1995年6月6日にブダペスト条約 に基づいて寄託されている：NCIMB 40749（プラスミドp034に対応する）。 以下のサンプルは、承認された寄託機関であるThe National Collectlons of Industrial and Marine Bacteria Limited（NCIMB）（23 St Machar Drive，Abe rdeen，Scotland，AB2 1RY，United Kingdom）に、7月12日にブダペスト条約に 基 づいて寄託されている：NCIMB 40750（プラスミドpO17に対応する）。 したがって、本発明のより好ましい実施態様は、上記のプロセス、方法、およ び組換え酵素に関し、そしてここで組換え酵素は、NCIMB 40749またはNCIMB 407 50によって発現され得る。 本発明はまた、タンパク質に熱安定性を与えるまたは増加させることにおける 使用に適切な、配列番号５に示す配列を含むアミノ酸配列、またはその改変体、 誘導体、もしくはホモログを提供する。 さらに、本発明は、タンパク質に熱安定性を与えるまたは増加させるためのア ミノ酸配列を発現させることにおける使用に適切な、配列番号６に示す配列を含 むヌクレオチド配列、またはその改変体、誘導体、もしくはホモログを提供する 。 これらの最後の局面に関して、この場合アミノ酸配列およびヌクレオチド配列 はもちろんタンパク質の熱安定性に影響を及ぼすが、改変体、誘導体、ホモログ 、構築物、ベクター、宿主生物の形質転換についての上記の説明は、等しく適用 可能である。 これに関して、配列番号５に示すアミノ酸配列が、本発明の組換えPMEのよう なタンパク質の熱安定性を与えるまたは増加させ得ると考えられる。このアミノ 酸配列はまた、他の供給源由来のPMEを含む他のタンパク質の熱安定性を増加さ せまたは与え得る。 本発明は、今回、例としてのみ記載されており、その参照は、以下に添付の図 面に対してなされる： 図１は、オレンジのような、柑橘類の果物の概略図である； 図２は、本発明の組換え酵素のSDS PAGEゲルである； 図３は、至適pHを決定するためのプロットである； 図４は、至適温度を決定するためのプロットである； 図５は、温度安定性を決定するためのプロットである； 図６は、Ｋ_m値を決定するためのプロットである； 図７は、NaClの存在下または不在下での活性を決定するためのプロットである ； 図８は、Na₂SO₄の存在下または不在下での活性を決定するためのプロットで ある； 図９は、NaNO₃の存在下または不在下での活性を決定するためのプロットであ る； 図１０は、pO17のプラスミドマップである； 図１１は、pO34のプラスミドマップである； 図１２は、２つの遺伝子の模式図である； 図１３は、pJK10のプラスミドマップである； 図１４は、pJK11のプラスミドマップである； 図１５は、pJK12のプラスミドマップである； 図１６は、pJK20のプラスミドマップである； 図１７は、pJK21のプラスミドマップである；そして 図１８は、pJK22のプラスミドマップである。 図１は、上記の説明で参照された。他の図は以下の説明で論じられる。 実験のセクション 生化学のための材料および方法 植物材料：種子を有さないNavelina変種クラスIの未成熟なSpanishオレンジをPM Eの単離のために用いた。このオレンジを手で皮をむき、そしてその皮を−80℃ で保存した。 オレンジの皮からのPMEの抽出 PMEを以下の手順に従って精製した。全ての操作を４℃で行った。600gの冷凍 したオレンジの皮を解凍し、小片に切断した。次いで、それらを1200mlの緩衝液 （100mM コハク酸Na pH 6.2、１mM DTT）中で２分間、Warringブレンダーでホモ ジナイズした。膜結合タンパク質を単離するために、36ｇの固体NaClをこのホモ ジネートに添加して、３％（w/v）の最終濃度にした（Versteegら、（1978）Leb ensmittel.-Wiss.u．Technol.，11:267-274）。４℃で穏やかに撹拌しながら２ 時間インキュベートした後に、この懸濁物をナイロンメッシュで濾過し、濾液を 10,000rpmで20分間遠心分離して、不溶性の残渣を除去した。 次いでこの上清を(NH₄)₂SO₄沈殿を用いて分画した。上清を、30分間緩徐に撹 拌しながら30％(NH₄)₂SO₄で最初に沈殿した。20,000rpmで10分間遠心分離した後 に、上清を30分間、60％(NH₄)₂SO₄でさらに沈殿した。この懸濁物を上記のよう に遠心分離し、沈殿物を50mlの50mM MES、１mM DTT pH 6.8中に再懸濁し、そし て同じ緩衝液に対して一晩透析した。 クロマトグラフィー 透析したサンプルを陽イオン交換クロマトグラフィーによりさらに分離した。 40〜50mlのサンプルを、緩衝液Ａ：50mM MES、１mM DTT pH 6.8でのラウンドの 間に30分間の洗浄を伴う２ラウンドで、CM-Sepharose^TMCL-6B（1.5×15cm）にア プライした。緩衝液Ａで非結合タンパク質を洗浄した後、結合タンパク質を、総 量500mlの０〜0.4M NaClの漸増NaClグラジエントで溶出した。流速は25ml/hであ り、8.33mlの画分を回収した。このタンパク質吸収プロフィールを280nmで測定 した。 全ての画分を、PME活性およびタンパク質について分析した。タンパク質含量 を、BioRad法で分光光度的に測定した。 PME活性を含む画分をプールし、Amiconフィルターシステムを用いて加圧透析 によって濃縮した。50mM Tris，1mM DTT、0.1M NaCl pH 7への緩衝液交換を同一 のシステムで行った。 次いで、９mlの濃縮PMEサンプルをSephacryl^TMS-200（2.6×70cm）ゲル濾過カ ラムにアプライした。このカラムを、50mM Tris、1mM DTT、0.1M NaCl pH 7で平 衡化した。流速は40ml/hであり、5.33mlの画分を回収した。PME活性を含む画分 をプールし、濃縮した。 酵素活性 PMEは、ペクチンからのメチルエステル基の切断を触媒する。精製工程の間、P MEを、メチルレッド指標試験を用いる迅速な方法によって検出した。ペクチン鎖 中のガラクツロン酸残基からのメチル基の切断により、このアッセイにおいてカ ルボキシル基が形成され、そしてpHが低下する。pH指標-メチルレッド-は、pH低 下時に黄色（pH 6.2）からピンク（pH 4.2）に色が変化する。このアッセイは、 0.15M NaCl pH 7中に可溶化された１mlの0.5％ Grinds ted^TMPectin 1450(DE 70 ％)(Danisco Ingredients，Danisco A/Sにより供給される)および125μlのサン プルを含有した。次いで、30℃で10分間のインキュベーションの後にメチルレッ ド試験で陽性を示したサンプルを、滴定法（Versteegら(1978)Lebensmittel.-Wi ss.u．Technol.，11: 267-274）によってさらに測定した。 滴定法において、アッセイは、0.15M NaCl pH 6.8中に可溶化された10mlの0.5 ％ライムペクチン（Grindsted^TMPectin 1450 -Danisco Ingredients，Danisco A /Sによって供給される）および10〜100μlのサンプルを含有した。適定を0.02M NaOHを用いて行い、そして反応を室温で測定した。自動滴定機を用いた（Verste egら、(1978)Lebensmittel.-Wiss.u．Technol.，11: 267-274）。 SDS-PAGE/ウエスタンブロッティング PME画分の純度を、10〜15％SDS-勾配ゲルを用いるPharmacia PhastSystem^TMを 用いるSDS-PAGEによって調査した。タンパク質の電気泳動および銀染色を、Phar maciaのマニュアルに記載されるように行った。pIの決定のために、IEF 3-9 Pha stSystem^TMゲルを用いた。 免疫ゲル電気泳動を、オレンジの皮のPMEに対して惹起したポリクローナル抗 体の特徴付けのために用いた。酵素画分を、SDS-PAGEで分離し、PhastSystem^TM のSemidryトランスファーユニット上でのセミドライブロッティング技術によっ てNC-ペーパーに移した。このNC-ペーパーを、1:50に希釈した一次抗体とともに インキュベートし、そして1:1000の希釈度で用いられるアルカリホスファターゼ （Dako A/S Glsotrup，Denmark）に結合した二次抗体で染色した。 ペプチドマッピング PMEを、トリプシンまたはLysobacter enzymogenes由来のエンド-プロテイナー ゼLys-Cのいずれかで消化した（両酵素調製物は、Boerhinger Mannheim，German yから購入した配列決定用グレードであった）。 100μgの精製したPMEをヨードアセトアミドでカルボキシメチル化して、還元S H基を保護した。次いで、このタンパク質をトリプシン（４μg/20〜100μl）で 切断した。加水分解切断を、40℃で2×3時間行った。この反応を、20μlのTFAの 添加により停止した。15,000rpmでの５分間の遠心分離の後、ペプチドを逆相HPL Cカラム（Vydac 10 C18カラム）で精製した。2×500μlのサンプルをアプライし た。ペプチドを、0.1％TFA中で60分間、0.05〜0.35％の漸増アセトニトリルグラ ジエントを用いて溶出し、そして分離した。ペプチドを、Eppendorfチューブ中 に手動で回収した。 エンド-プロテイナーゼLys-Cでの消化のために、凍結乾燥PME（0.1mg）を、50 μlの８M尿素、0.4M NH₄HCO₃，pH 8.4中に溶解した。N₂での被覆および５μlの4 5mM DTTの添加の後、このタンパク質をN₂下で50℃にて15分間変性および還元し た。室温に冷却した後、５μlの100mMヨードアセトアミドを添加し、N₂下で暗所 にて室温で15分間システインを誘導体化した。続いて、90μlの水ならびに50μl の50mMトリシンおよび10mM EDTA，pH 8.0中の５μgのエンド-プロテイナーゼLys -Cを添加し、N₂下で37℃にて24時間消化を行った。 得られたペプチドを、トリプシン消化ペプチドに関して記載されるように分離 した。 選択したペプチドを、Devosil 3 C₁₈RP-HPLCカラム0.46×10cm（Novo Nordisk ，Denmark）上でさらに精製した。次いで、精製ペプチドを、pulsed-liquid fas t cycleを用いて、アミノ酸シーケンサー、Applied Biosystems 476Aにアプライ した。 研究１ PMEの精製の間、600gの凍結したオレンジの皮をホモジナイズし、30〜60％(NH₄ )₂SO₄での沈殿および透析の後、サンプルを陽イオン交換カラム（CM-Sepharose^TM CL-6B）にアプライした。PMEはpH 6.8で陽イオン交換カラム材料に強固に結合 したが、一方、タンパク質のほとんどはそのカラムに結合せず、それ故洗浄容積 中に溶出する。漸増NaClグラジエントにより、PMEは、0.25MのNaCl濃度でPME I （画分49〜53）において主要な活性を有する２つのピーク中に溶出した。微量な PMEピークが、より低濃度のNaCl（画分25〜32）で溶出した。さらなる精製を、P ME Iについてのみ行った。これは最も高い活性を含んでいた。 濃縮の後、ゲル濾過クロマトグラフィー（Sephacryl^TMS-200カラム）を用いて PME画分をさらに精製した。最も高いPME活性を含む画分をプールし、アミコンフ ィルター透析において濃縮した。 総量で約４mgのPMEを600gのオレンジの皮から得た。これは12％のタンパク質 収量に相当する。 SDS-PAGEは、36,000 DのMWを有する精製PME画分中の唯１つのタンパク質バン ドを示した（図２）。PMEの等電点電気泳動は、そのPIが＞９であることを示し た。 特徴付けおよび動態学的データ PMEの特徴付けおよび至適条件決定（optima determination）を、材料および 方法に記載されるような滴定方法で全て行った。 PME活性の至適pHを、0.15M NaCl中の0.5％ライムペクチン（Grindsted^TMPecti n 1450 -Danisco Ingredients，Danisco A/Sによって供給される）を用いて測定 した。このデータを図３に示す。至適はpH7〜8付近に見出された。 至適温度は、50℃で見出された−図４に示されたデータを参照のこと。 PMEの熱（温度）安定性を、異なる温度で15分間Eppendolfチューブ中の酵素サ ンプルをインキュベートすることにより決定した。インキュベーション後、酵素 活性を、滴定法による従来のアッセイによって測定した。酵素活性の安定性は、 10℃〜40℃の間であった−図５のデータを参照のこと。 ライムペクチン（Grindsted^TMPectin 1450 -Danisco Ingredients，Danisco A /Sによって供給される）に対する親和性を、活性に対する異なるペクチン濃度の Lineweaver Burkプロットによって決定した。このデータを図６に示す。K_mは0.0 7％であることがカーブから計算された。 本発明者らはまた、PMEがまたサトウダイコンペクチンを脱エステル化し得る ことを見出した。サトウダイコンペクチンは、そのカルボキシル基のいくつかが メチル化されている60％のガラクツロン酸残基を含有し（約60％のDE）、さらに 、ガラクツロン酸基の幾つかはC-2および/またはC-3でアセチル化されている。0 . 15 M NaCl中に可溶化された１％サトウダイコンペクチンを、サトウダイコンペ クチンが約60％のペクチンを含有するようなアッセイにおいて用いた以外は、PM E活性を材料および方法に記載のように測定した。結果は、ガラクツロン酸残基 がC-2/C-3位でアセチル化されているとしてもPMEがサトウダイコンペクチンを脱 エステル化し得たことを示した。 さらなる実験は、本発明のPMEが、好ましくは、活性のためにNaClを必要とす ることを示した−図７のデータを参照のこと。活性は、漸増するNaCl濃度（0.25 M NaClで至適である）で増大する。最大活性と比較して、より高い濃度が活性を 減少させている。 さらなる実験は、他の塩、例えば、Na₂SO₄またはNaNO₃がPME活性のためにNaCl を置換し得ることを示した。このデータを図８および９に示す。至適活性を、0. 2M Na₂SO₄および0.3M NaNO₃それぞれで見出した。 Ｎ-末端分析 天然のPMEのN-末端配列がブロックされることが研究により示された。チュー ブ中で45℃にて４分間、無水TFAでPVDF膜にブロットしたPMEを処理することによ り、脱ブロック化を達成した。TFAのほとんどの蒸発の後、チューブを65℃にて ４時間置いた（Wellner，D.ら、（1990）Proc.Natl.Acad.Sci 87: 1947-1949） 。得られた配列は、SSSVTPNVVVAADSSGNFKであった。そのN-アセチルセリンはPME のN末端残基である。 免疫組織局在化 免疫組織化学のための組織サンプルの調製のために、成熟果物の中央部分の薄 切片を、0.05Mのリン酸緩衝液pH 7で緩衝化した２％パラホルムアルデヒド、0.2 5％グルタルアルデヒドおよび３％スクロース中で固定した。25℃で２時間およ び５℃で63時間のインキュベーションの後、検体を0.05Mリン酸緩衝液pH 7中で ３×20分洗浄した。一連のエタノール洗浄（50％、70％、80％および96％）、そ れに続く99％エタノールの３回の洗浄（各エタノール濃度について30分間）を用 いて脱水を行った。石油（Shellsol^TMD70k，Q7712）中で２×２時間および７％ ビーズワックスを有するパラフィン中での２×２時間のさらなる処理の後、サン プルをパラフィン中に包埋した。12.5μmの横断面を、Supercut 2050 Reichart Jung pyramitome上で作製した。 免疫学 PME抗体での１時間の処理の前に、組織切片をTBS（0.5M Tris/HCl pH 7.6，0. 15M NaCl，0.1％Triton X-100）中の20％ブタ血清で30分間プレインキュベート し、TBS中に1:50で希釈した。過剰な抗体を、５×５分間のTBSでの洗浄により除 去した。洗浄後、切片をTBS緩衝液中にて1:20のアルカリホスファターゼと結合 した二次抗体で30分間インキュベートした。余剰の二次抗体を上述のようなTBS 洗浄によって除去した。染色の前に、切片をベロナールアセテート緩衝液pH 9.2 で５分間処理し、次いでFast RedおよびNaphtol AS-BIホスフェート（Sigma no N4875）で20分間染色した。過剰な試薬を水での洗浄により除去した。コントロ ールを平行して実行し、免疫前の血清で処理した。 結果 皮PMEに対して惹起した抗体を用いた免疫学的局在化により、PMEが袋間のラメ ラの外側の細胞層、小胞（juice sac）の果心および外側の細胞層、アルベドの 内側の細胞層にも大量に位置することが示された（図１を参照のこと）。これら の結果は、皮PMEに対する抗体が果肉（袋からなる果肉、図１を参照のこと）由 来のPMEと交差反応することを実証し、皮および果肉それぞれに位置するPME間 の高い相同性を示した。 研究２ オレンジの皮由来のPMEを大量に精製した。これに関して、約70mgのPMEを５kg のオレンジの皮から単離した。次いで、精製PMEをミルクタンパク質（すなわち 、飲用ヨーグルト）を用いる応用試験に用いた。この試験において、ブロックワ イズの様式で酵素的に脱エステル化されたペクチンは、おそらくは形成されたブ ロック構造のために、非脱エステル化ペクチンと比較してタンパク質安定化特性 を改善した。最終産物はまた、好適な粘度を有していた。 酵素イソ型 理論に束縛されることを意図しないが、本発明のPMEは少なくとも２つのイソ 型で存在し得ると考えられている。イソ型Ｓは約36kDの分子量を有し、「短PME 」と称され得る。イソ型Ｌは約64kDの分子量を有し、「長PME」と称され得る。 また、イソ型Ｌはイソ型Ｓよりも熱安定性であると考えられている。また、イ ソ型Ｓはブロックワイズで最初の脱エステル化工程を開始し、次いでイソ型Ｌに よって取って替わられると考えられている。 換言すれば、イソ型Ｌは、部分的に脱エステル化されたペクチンに対してイソ 型Ｓよりも大きな親和性を有し得ると考えられている。 イソ型Ｌの熱安定性は、配列番号５として表されたアミノ酸配列に起因し得る と考えられている。 さらなる研究により、イソ型Ｌの遺伝子は、シグナル配列の上流にＮ末端伸長 を有することが示されている。これは図12に模式的に示されている。オレンジより入手可能であるペクチンメチルエステラーゼをコードするcDNAの単 離および特徴付け 分子生物学のための材料および方法 １．材料 Morocco起源のオレンジ（Citrus sinensis）var．Navelを用いた。 ２．DNA ゲノムDNAを、Dellaporta S.L.ら（1983）Plant Mol Biol Rep 1(4):19-21に 記載されるように単離した。プラスミドDNAを、EP-B-0470145に記載されるよう に単離した。 ３．RNA 全RNAを、成熟オレンジ果物から単離した。Logemann J.，Schell J.およびWil lmitzer L.（1987）Anal．Biochem 163: 16-20、「植物組織からのRNAの単離の ための改善方法」に記載される手順に従って、Navelオレンジ果物の果肉の外部 部分およびアルベド層の内部部分（図１を参照のこと）をRNA単離のために用い た。 ４．PCR 全オレンジRNAを用いて、以下の温度サイクルで供給者の指示に従ってrTth Re verse PCR Kit（Perkin Elmer）で逆PCRを行った： 逆転写： 70℃ ２分 60℃ ２分 50℃ ２分 45℃ ５分 40℃ ５分 30℃ 10分 42℃ 10分 70℃ 2.5分 ５℃ 浸漬 増幅（PCR）： 94℃ ２分 92℃ １分 45℃ ２分 72℃ ２分 40サイクル 72℃ ５分 ５℃ 浸漬 ５．PCRフラグメントのクローニング PCRフラグメントを、供給者の指示に従ってベクターpT7Blue（Novagen）のEco RV部位にクローン化した。 ６．DNA配列決定 Auto Rad Sequencing Kit(Pharmacia)およびPharmacia LKB A.L.F．DNA seque ncer（Ref: Sanger，F.，Nicklen，S.、およびCoulson，A.R．(1979)）を用いて 、本質的にSangerら（1979）のジデオキシ法に従って、２本鎖DNAを配列決定し た。DNA配列決定は鎖決定インヒビターを用いて行った(Proc．Nat．Acad．Sci． USA 74:5463-5467)。配列決定に用いたプライマーを以下に列挙する（5から3に 示す）： 配列決定したヌクレオチド配列を配列番号３（pO17由来）および配列番号４（ pO34由来）として示す。Ｎ末端配列を配列番号６として示す。 ７．ライブラリーのスクリーニング オレンジ果物の果肉およびアルベド層から単離されたmRNAから調製したλzapI I（Stratagene）のcDNAライブラリーを、適切な放射標識PCRプローブでスクリー ニングした。プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションを、２ ×SSC、0.1％ SDS、10×Denhardt sおよび100μg/mlの変性サケ精子DNA中で行っ た以外は、スクリーニングを供給者の指示に従って行った。ハイブリダイゼーシ ョンは67℃で一晩であった。フィルターを、2×SSC、0.1％ SDS中で２回、１×S SC、0.1％ SDS中で２回、および0.1×SSC、0.1％ SDS中で２回洗浄した。 ８．プローブ クローン化されたPCRフラグメントを、適切な制限酵素で消化することによりp T7 blueベクターから単離した。フラグメントを、アガロースゲル電気泳動によ り、ベクターから分離し、フラグメントを精製し、そしてReady to Go^TMDNA標識 化キット（Pharmacia）を用いて放射標識した。 ９．サザン分析 オレンジゲノムDNAまたはプラスミドDNAを、適切な制限酵素で消化し、Hybond N^+TM膜に転写し、そして供給者（Amersham）の指示に従ってハイブリダイズした 。 10．インサイチュハイブリダイゼーション実験 インサイチュハイブリダイゼーション技術は、mRNAへのアンチセンスリボヌク レオチド配列のハイブリダイゼーションの原理に基づく。この技術は、上記のmR NAが存在する顕微鏡切片中の領域を可視化するのに用いられる。本願の場合には 、この技術を、C．sinensisの切片中の酵素ペクチンメチルエステラーゼをコー ド するmRNAを局在化するのに用いた。 インサイチュハイブリダイゼーション用の組織サンプルの調製 成熟オレンジ果物の中央部分の薄切片を、FAA固定法（45％エタノール、５％ ホルマリン(40％パラホルムアルデヒド)および５％酢酸）による固定および25℃ で２時間および５℃で63時間のインキュベーションによって固定化した。サンプ ルを、0.05Mリン酸緩衝液、pH 7中で３×20分間洗浄した。一連のエタノール洗 浄（50％、70％、80％、96％）を用いて脱水を行い、99％エタノール中で３回洗 浄することにより終了させた。各洗浄は30分間であった。次いでこのサンプルを ２×２時間石油（shellsol^TMD70k，Q7712）中で、およびさらに２×２時間７％ ビーズワックスを有するパラフィン中で処理した。この後、サンプルをパラフイ ン中に包埋した。Supercut 2050 Reichart Jung pyramitomeを用いて、12,5μm の断面を作製した。 インサイチュハイブリダイゼーション用の³⁵S標識プローブの調製 ２回目のPCR増幅由来の501bpのPCRフラグメントを、pT7blueベクター（Novage n）中に両方向でクローン化した。pT7ベクターはT7プロモーターを含有する。ア ンチセンスRNAおよびセンスRNAの転写を、BamHIでプラスミドを消化した後にSP7 プロモーターにより駆動させた。Maxiscript Kit^TM（Ambion）を以下の改変を加 えて行った。転写産物を６％配列決定用ゲルに泳動して、取り込まれたヌクレオ チド取り出し、そしてT7 RNAポリメラーゼインビトロ転写キット（Ambion）で供 給される溶出緩衝液で溶出させた。転写産物は、一方の末端に55個の非コードヌ クレオチドを、さらに他方の末端に９個の非コードヌクレオチドを含有していた 。ハイブリダイゼーションのために10⁷cpm/mlの³⁵Ｓ標識プローブを用いた。 インサイチュハイブリダイゼーションを、本質的にLangedale J.A.（1994）Ma ize Handbook-M．Freeling and V．Walbot，編、165-180頁 SpringerVerlaga，N ew York，Inc.に記載されるように行った。ハイブリダイゼーション温度は、57 ℃で至適であることが見出された。57℃での洗浄の後、切片をKodak K-5写真感 光乳剤で被覆し、そして暗所で５℃にて３日間放置した。 11．結果 以下の配列情報を用いて、以下に記載したPCR反応のためのプライマーを生成 し、そしてそれぞれのヌクレオチド配列によって生成されたアミノ酸配列（添付 の配列番号７〜19を参照のこと）をチェックした。プライマーの産生のために用いたペクチンメチルエステラーゼのペプチド配列 プライマーA（Met Leu Ala Tyr Gln Asp Thr）を生成するために用いたアミノ酸 配列（PE492B，４〜７） プライマーA ATG(CT)T(GATC)GC(GATC)TA(TC)CA(AG)GA(TC)AC 256ミックスプライマーB（Glu Ala Gln Ala Phe Thr Pro）を生成するために用いたアミノ酸 配列（PE701，７〜13） プライマーB GT(AG)AA(GATC)GC(TC)TG(GATC)GC(TC)TC 128ミックス （配列は相補鎖に対応する）ペクチンメチルエステラーゼを部分的にコードするPCR DNAフラグメントの生成 ２つのオーバーラッしないペプチド（上記）のアミノ酸配列を用いて、ミック スオリゴヌクレオチドを生成した。これらを、逆転写および引き続く全RNAの増 幅（PCR）のためのプライマーとして用いた。得られたPCRクローンを配列決定し 、そしてそれは501bpの挿入物を有していた。ヌクレオチド配列から推定された アミノ酸配列は、配列番号７〜19で与えられたペプチド配列とほとんど完全に一 致した。インサイチュハイブリダイゼーション分析 ペクチンメチルエステラーゼのmRNAに対するリボプローブ（適切なPCRクロー ンから産生された）を用いるインサイチュハイブリダイゼーション実験（材料お よび方法を参照のこと）により、袋間のラメラの外側の細胞層における強固なハ イブリダイゼーションが示された（図１を参照のこと）。強いシグナルをまた、 小胞の外側の細胞層、albedoの内側の細胞層および果心から得た。これらの結果 は、以前に記載された皮PMEに対して惹起された抗体で見られた免疫学的局在化 の結果と非常に良好に一致する。サザン分析 サザン分析により、単離されたPME遺伝子（cDNAクローンにより表される）の さらなるコピーが、C.sinensisゲノム中に存在することが示された。これらの他 のPME遺伝子は、pO17およびpO34中に表される遺伝子とかなり相同であった。 この点に関して、本発明者らは、強いハイブリダイゼーションシグナルの１つ のバンド、中程度のハイブリダイゼーションシグナルの２つのバンドおよび残り と比較してより弱いシグナルの少なくとも２つのバンドを各レーンにおいて観察 した。このパターンは、C.sinensisがゲノムに中に少なくとも５および７コピー のPME遺伝子を有することを示している。新規PME cDNAの単離および特徴付け 材料および方法に記載のように調製したλzapII（Stratagene）のcDNAライブ ラリーを、PCRクローン由来の放射標識した501bp挿入物でスクリーニングした。 いくつかのハイブリダイゼーションクローンを同定し、プラスミドDNAを供給者 の指示に従ってインビボで切り出した。クローン中のcDNA挿入物のサイズを、Ec oRVおよびSmaIでの消化、それに続くアガロースゲル電気泳動によって決定した 。１方のクローンpO34は約2kbの挿入物サイズを有し、一方、他方のクローンpO1 7は約1.4kbの挿入物サイズを有していた。これらのクローンをさらなる分析のた めに選択した。ヌクレオチド配列を決定し、そしてpO17およびpO34についてそれ ぞれ配列番号３および配列番号４として示す。 ヌクレオチド29から開始しそしてヌクレオチド1780で終結する、O34中のオー プンリーディングフレームは、推定上のシグナルペプチドを含む584アミノ酸のP MEをコードする。46位のグリシンと47位のイソロイシンとの間の可能な切断部位 は、von Heijne，G.（1986）Nucl Acids Res 14，4683-4690「シグナル配列切断 部位を予測するための新規の方法」の規則に従って予測し、それによって58386 ダルトンの計算分子量を有する538アミノ酸の長い成熟PME酵素を得た。シグナル 配列を含む長PMEの分子量は、63502ダルトンとして計算され得る。pO34ヌクレオ チド配列は、29ヌクレオチドの非翻訳5領域およびポリAテイルで終結する186ヌ クレオチドの非翻訳3領域を含む。 O17中のオープンリーディングフレームは、ヌクレオチド18から開始し、そし てヌクレオチド1103で終結する。これは、44アミノ酸のシグナルペプチドを含む 362アミノ酸の短PMEをコードする。推定上の切断部位は、44位のグルタミンと45 位のセリンとの間に予測され得、アミノ酸配列Ser-Ser-Ser-Val-Thr-Proで開始 する成熟短PMEを残す。このＮ末端アミノ酸配列は、生化学セクションに記載し たような精製された短型のPMEのＮ末端アミノ酸配列と同一である。精製酵素か ら得られたアミノ酸配列を、pO17の推定上の成熟アミノ酸配列と整列させた。完 全な同一性をペプチドフラグメントについて見出した。 全ての配列決定したペプチドとpO17中の推定アミノ酸配列との間にほぼ完全な 同一性が存在し、そしてまた、pO34から推定されるアミノ酸配列である長PMEと もほぼ完全な同一性が存在した。この点に関して、pO17は１つのアミノ酸位（成 熟ポリペプチドをコードする配列における24番目）で異なる。成熟短PMEタンパ ク質は、33954ダルトンの計算分子量を有する。シグナルペプチドを含む短PME型 の計算分子量は、39088ダルトンである。O17は、17ヌクレオチドの5非翻訳領域 およびポリA尾部で終結する180ヌクレオチドの3非翻訳領域を含む。 長PME酵素と短PME酵素との間の主要な差異は、O34由来の成熟酵素中に存在し 、配列番号５として表される220アミノ酸のN末端伸長部である。長PME酵素のこ の領域をコードする対応するヌクレオチド配列を、配列番号６として示す。 微生物におけるPMEの発現 オレンジPMEの長形態または短形態のいずれかをコードするDNA配列を微生物に 導入し、ペクチンの酵素的処置のために使用すべき高い特異的活性を有する大量 の組換え酵素を生産する。PICHIA PASTORIS における発現 pJK10 、pJK11、およびpJK12の構築（図13〜15を参照のこと） 以下の対のプライマーを用いるPCR反応において、pO34プラスミドDNAを鋳型DN Aとして使用した： 5-GAATTCATTGTCGCCGGAGTGAAC-3（１つの末端にEcoRI部位を有する）、および 5-AAGACCAGAGACCTATGGATCCAC-3（末端の近くにBamHIを有する）。 AmpliTaq^RDNA Polymerase(Perkin Elmer)、鋳型DNA，dATP、dGTP，dCTP、およ びdTTP、ならびに２つのプライマーを以下の緩衝液中で合わせ： 60mM Tris-HCl(pH8.5)、15mM(NH₄)₂SO₄、および1.5mM MgCl₂、 そして以下の温度サイクルを用いた：94 ℃ ２分 94℃ １分 55℃ ２分35 サイクルにおいては72℃ ２分 72℃７分 ５℃で浸漬 1690bpの予想されるPCR産物が生成され、これは、供給者の説明に従って、精製 され、ベクターpT7Blue（Novagen由来）にサブクローン化した。 予想されるサイズのEcoRI-BamHIフラグメントを含む得られたクローン（pT7-O 34と呼ぶ）を、DNA配列決定（Molecular Biologyの材料および方法を参照のこと ）によってさらに確認した。適正な配列を含むpT7-O34サブクローンを、EcoRIお よびBamHIで消化し、そして1685bpのフラグメントを精製し、そして同一の酵素 で消化したPchia pastorisベクターpHIL-S1（Invitrogen由来）にサブクローン 化した。 PMEの成熟した長形態をコードする配列を、ベクター中のPHO1分泌シグナル（S ）とインフレームで、この方法でクローン化した。得られたプラスミドを、pJK1 0と呼び、そして図13に示す。 pJK11（図14を参照のこと）を作製するために、pT7-O34クローンのEcoRI-BanH Iフラグメントを、同じ酵素で消化したpBSK-ベクター（Straragene由来）にさら にサブクローン化した。次いで、得られたクローンの１つに由来するEcoRI-NotI フラグメント（DNA配列決定によって確認された）を、同じ酵素で消化したPichi a pastoris発現ベクターpPIC9（Invitorogen由来）にサブクローン化した。これ により、長形態のPMEの成熟タンパク質をコードするリーディングフレームは、 下流、およびpPIC9中のα因子分泌シグナル（S）の下流またはそれとインフレー ムで配置される。図14を参照のこと。 さらに、pT7-O34由来のEcoRI-NotIフラグメントをまた、pPIC9K（Invitorogen ）ベクターにサブクローン化して、図15に示すpJK12プラスミドを作製した。pJK 11とpJK12との間の差異は、カナマイシンに対する耐性をコードする遺伝子のみ であり、そしてこれはpJK12中に位置する。 pJK10中のPHO1分泌シグナルおよびpJK11およびpJK12中のα分泌シグナルの両 方は、PMEの長形態をコードする成熟ペプチドの分泌を指向し得る。pJK20 、pJK21、およびpJK22の構築 以下のプライマーを用いるPCR反応において、pO17プラスミドDNAを鋳型DNAと して使用した： 5-GAATCCTCTCCTCGTCGGTGACACCG-3（１つの末端にEcoRI部位を有する）、およびA AGACCAGAGACCTATGGATCCAC-3（末端の近くにBamHI部位を有する）。 鋳型DNA、AmpliTaq^Rポリメラーゼ、dATP、dGTP、dCTP、およびdTTPを、緩衝液 （60 mM Tris-HCl（pH8.5）、15mM(NH₄)₂SO₄、および1.5mM MgCl₂）と合わせ、 そして以下の温度サイクルでサーモブロックにおいて置いた：94 ℃ ２分 94℃ １分 55℃ ２分35 サイクルにおいては2℃ ２分 72℃７分 ５℃浸漬 これにより1008bpの予想されるPCRバンドを産生し、これを精製し、そしてpT7 Blue（Novagen）にサブクローン化した。得られたクローンを、上記に説明した ようにDNA配列決定によって確認した。適正な配列を有するプラスミドを、EcoRI およびBamHIで消化し、そして得られたフラグメントをさらにpHIL-S1ベクター（ Invitrogen）にさらにサブクローン化し、得られたプラスミドをpJK20（図16を 参照こと）と呼ぶ。そしてこれにより、PMEの短形態の成熟ポリペプチドをコー ドする領域が、PHO1分泌シグナルのインフレームに、そしてその下流に配置され る。 プラスミドpJK21およびpJK22を、EcoRI-NotIフラグメントをpBSK-O17クローン から得ること以外はpJK11およびpJK12について説明した同じ様式で構築した。図 17および図18は得られたプラスミドを示し、ここで、成熟ポリペプチドをコード する領域は、それぞれpPIC9およびpPIC9K中のα分泌シグナルの下流に、そして それとインフレームで配置される。スフェロプラスト形成および形質転換による、Pichia pastoris中のPMEの長形態 または短形態の導入 プラスミドpJK10、pJK11、pJK12、pJK20、pJK21、およびpJK22を、Pichia pas toris GS115細胞への分離実験において導入した。 これに関して、スフェロプラストを、酵母抽出物ペプトンデキストロース培地 （YPD）中で、28〜30℃で増殖させたGS115細胞から調製した。スフェロプラスト の調製および形質転換手順を、Pichia発現キット：Instruction Manuzl（Invitr ogen）に記載のように行った。次いで、得られたPchia pastoris Mut⁺またはMut^S 形質転換体を、組換えPME遺伝子の発現について、Biochemistryの材料および方 法に記載の方法を用いてPME活性について上清をアッセイすることによって分析 した。PME の長形態または短形態の高発現についての形質転換体のスクリーニング 推定のポジティブな形質転換体を、最少培地（Pichia 発現キットInstruction Manual,Invitrogenに詳述されるMinimal Dextrose MediumまたはMinimal Glyce rol Mediumのいずれか）中でさらに増殖させ、そしてゲノムDNAを単離し、そし てInstruction Manualに記載のPCRによって分析した。 最初のスクリーニングにおいて見出されたポジティブクローン（これは、予想 されるサイズのPCRバンドもまた産生する）を選択し、そしてPchia Instruction Manualに記載の手順に従って、28〜30℃でフラスコ中でさらに増殖させた。 各構築物（pJK10、pJK11、pJK12、pJK20、pJK21、およびpJK22）の少なくとも 10個の確認した組換えクローンを、PMEの分泌についてスクリーニングし、そし てそれらの相対的な発現レベルを２〜６時間毎にサンプリングすることによって 経時的に過剰時間を測定した。サンプル中の細胞をペレット化し、そしてMateri als and Methods for Biochemistryに説明された方法に従ってPME活性について 上清をアッセイした。 pJK12またはpJK22のいずれかでの形質転換後に得られたクローンを、Scorer C .A.ら、(1994)Bio/Technology 第12巻、181〜184頁およびLaroche Y.ら、(1994) Bio/Technology第12巻、1119〜1124頁に記載のように、選択遺伝子として組み込 まれたカナマイシン耐性遺伝子を用いて予め選択した。この方法により、複数の コピー組み込み形質転換体が得られ、そして上記のようにさらにスクリーニング した。 PMEの長形態または短形態のいずれかを示すか、あるいは高レベルで組み換え タンパク質を発現することが示された形質転換対を選択し、そしてウェスタンブ ロット分析（Materials and Methods for Biocheistryを参照のこと）によって さらに分析した。組換えPMEの精製および特徴付け 組換えPMEタンパク質を、必要に応じてMaterials and Methods for Biochemis tryに記載の手順を用いて培養上清から精製した。 PMEの長形態の予想される高温安定性を、Characterization and kinetic data のセクションに説明されるように、異なる温度でのインキュベーション後に酵素 活性を試験することによって確認した。精製した組換え酵素（長PME形態および 短PME形態の両方）を、Characterization and kineticc dataのセクションで説 明されるようにさらに特徴付けた。これらの分析は、両方のタイプが、約７〜８ の至適pHを有し、組換え短PMEの熱安定性は10℃〜40℃の間、そして組換え長PME については80℃までであることが見出されたことを示した。ASPERGILLUS NIGER における発現 別の実施態様において、pO34またはpO17を適切な制限酵素で消化し、そして本 発明のPMEの長形態または短形態のコード配列をAspergillus nigerでの発現のた めにAspergillus発現ベクターpBAMTE1（Neurospora crassas由来のメチルトリプ トファン耐性プロモーターを含む）にクローン化した（Pallら、(1993)Fungal Genet Newslett.第40巻59〜62頁）。 プロトプラストを、溶解酵素Sigma L-2773およびリティカーゼSigma L-8012を 用いるDaboussiら（Curr Genet（1989）第15巻 453〜456頁）に従って調製した 。プロトプラストの形質転換は、形質転換されたプロトプラストをプレーティン グすることについてはPuntら(Methods in Enzymology（1992）第216巻 447〜457 頁)に記載のプロトコルに従ったが0.6％の浸透左安定性のトップアガロースを用 いた以外は、Buxtonら（Gene（1985）第37巻207〜214頁）に記載のプロトコルに 従った。 結果は、精製されたオレンジPME活性が、Aspergilus niger培養物から得るこ とが出来ることを示した。用途 タンパク質飲料の粘度および安定性に対するペクチンで処置されたオレンジPME の効果 方法オレンジから誘導可能なPMEを用いたペクチンの酵素処理 酵素的に処理されたペクチンのバッチを以下のように調製した： 125gのペクチンを、有効な撹拌下で熱湯に溶解した。45.3gのNaCl（試薬グレ ード）を添加し、そして容積を水で4.01に調整した。この溶液を、塩が溶解する まで撹拌した。このペクチン溶液を40℃に冷却し、そして1NのNaOH（試薬グレー ド）を用い、そして有効に撹拌してpHをpH7.0まで増加させた。オレンジPMEの適 切なサンプルを添加し、そして所望の程度のエステル化が達成されるまで、酵素 反応を続けた。インキュベーションの間、1NのNaOH（試薬グレード）の自動投与 によってpHをpH７に一定に保ち、そして酵素反応をNaOHの消費によって追跡した 。 ペクチンサンプルが所望の程度の脱エステル化に達した際に、NaOHの添加を停 止し、溶液のpHを、２％のHClの添加により約3.0に低下させた。次いで、ペクチ ン溶液を、70℃で５分間加熱し、完全に酵素を不活化した。処理されたペクチン を、１容積のイソプロパノールを用いて沈殿させ、60％のイソプロパノールで洗 浄し、そして約50％の乾燥物にプレスした。次いで、酵素処理されたペクチンバ ッチを、40℃で風乾し、そして最終的に乾燥粉末に粉砕した。 プロトコル カルシウム感受性指標（CF）のためのペクチンサンプルの測定 ペクチン１gあたり57.6mgのカルシウムを有する溶液中に溶解したペクチンの 粘度を、溶液中の正確に同量のペクチンの粘度（しかし、カルシウムを添加しな い）で割った比としてカルシウム感受性を測定する。非カルシウム感受性ペクチ ンは、１のCF値を有する。 4.2gのペクチンサンプルを、有効な撹拌を伴って550mlの熱湯に溶解する。溶 液を約20℃に冷却し、そしてpHを1NのHClで1.5に調セクションする。ペクチン溶 液を水で700mlに調セクションし、そして撹拌した。この溶液の145gを４つの粘 度ガラス（viscosity glass）中に個々に測り入れる。10mlの水をこのガラスう ちの２つに添加し（二重測定）、そして10mlの250mM CaCl₂溶液を残りの２つの ガラスに撹拌下で添加する。 50mlの酢酸緩衝液（50M、pH約4.6）を、有効な磁石撹拌下で４つの粘度ガラス に添加し、それによりペクチン溶液のpHはpH4.0を超えて上昇する。磁石を取り 出し、そしてガラスを20℃で一晩放置する。翌日に粘度をBrookfieldの粘度計を 用いて測定する。カルシウム感受性指標を、以下のように計算する： ペクチンサンプルのエステル化の程度（％DE）の決定 50mlの60％イソプロパノールおよび５％のHCl溶液に、2.5gのペクチンサンプ ルを添加し、そして10分間撹拌する。ペクチン溶液をガラスフィルターを通して 濾過し、そして15mlの60％イソプロパノール/５％HCl溶液で６回洗浄し、その後 さらに60％のイソプロパノールでフィルターに塩素がなくなるまで洗浄した。フ ィルターを80℃で一晩乾燥する。 20mlの0.5NのNaOHおよび20.0mlの0.5NのHClをコニカルフラスコ中で合わせ、 そして２滴のフェノールフタレインを添加した。これを0.1NのNaOHで永久的な色 素変化が得られるまで滴定した。0.5NのHClは、0.5NのNaOHよりわずかに強いは ずである。0.1NのNaOHの添加した容積をV₀として表す。 0.5gの乾燥ペクチンサンプル（濾過物）を、コニカルフラスコ中に測り入れ、 そしてサンプルを96％エタノールで湿らせる。最近ボイルし、そして冷却した10 0mlの蒸留水を添加し、そして得られた溶液をペクチンが完全に溶解するまで撹 拌する。次いで、５滴のフェノールフタレインを添加し、そしてその溶液を0.1N のNaOHで滴定する（色が変化し、そしてpHが8.5まで）。ここで使用した0.1NのN aOHの量を、V₁として表す。20.0mlの0.5NのNaOHを添加し、そしてフラスコを強 く振り、次いで15分間放置する。20.0mlの0.5NのHClを添加し、そしてピンク色 が消えるまで振る。次いで、３滴のフェノールフタレインを添加し、次いで、得 られた溶液を0.1NのNaOHで滴定する。使用した0.1NのNaOHの容積をV₂として表す 。 エステル化の程度（％DE: 全カルボキシ基の％）を、以下のように計算する： ヨーグルト生産 標準化した脱脂乳（粉状のミルクを適切な容量の水と混合して調整した）を、 90℃で５分間加熱し、次いで200kp/cm²でホモジェナイズし、そしてミルクを31 ℃に冷却した。ヨーグルト培養物を添加し、そしてそのミルクを約pH4.0まで発 酵した。ヨーグルトを20℃に冷却し、そしてペクチンサンプルを飽和糖溶液（約 65％糖）として添加し、そして15分間撹拌した。pHを乳酸でpH4.0に調整した。 ヨーグルトを88℃で15秒間低温殺菌し、そして150kp/cm²でホモジェナイズし、 次いで20℃に冷却し、そして滅菌した250mlの青キャップボトル中に満たした（2 00ml/ボトル）。 最終製品の組成は：7.6％MSNF（乳固形分）、9.15％糖、および0.25％または0 .35％ペクチンサンプルであり、総固形分はそれぞれ17.0％または17.10％であっ た。ヨーグルト飲料の粘度の決定 ヨーグルトサンプルの粘度を、18.5〜46.0の剪断速度（shear rate）を有する Bohlin Rheometer^TM（Bohlin Instrumentsより供給された）または同一の剪断速 度を有するStressTech^TM（Rheologica instruments AB）のいずれかを用いて決 定（二重決定）した。遠心分離試験によって測定されたタンパク質の安定性 20gのサンプル（例えば、飲用ヨーグルト）を、10℃で20分間、2300×gで遠心 分離する。上清を捨て、そして遠心分離ガラスを30分間逆さまにした。ガラスを 計量し、そして沈降％を以下のように計算した： ここで、Wgt＝重さ、そしてCentri ＝遠心分離サンプルにおける粒子サイズ分布によって判断されるタンパク質の安定性 ヨーグルトサンプルの粒子サイズ分布を、Malvern 2600 Easy^TMサイズ測定器 の使用により決定した。粒子サイズを、この方法によるレーザー光散乱によって 決定する。１mlのヨーグルトサンプルを９mlの脱気(de-areated)緩衝溶液（30. 7％の0.1M クエン酸、19.3％の0.2M Na₂HPO₄、および50.0％水）に添加し、そし て混合した。脱気した緩衝液を測定するガラスに添加し、そしてサンプル／緩衝 液の混合物を最適な濃度が得られるまで滴下によって添加する。平均の粒子サイ ズは、測定から計算される。 約３μm未満の平均粒子サイズを有するヨーグルトはむしろ安定であると考え られるが、約10μm以上を越える平均粒子サイズを有するヨーグルトは、長期保 存において安定ではないと考えられる。長期安定性の決定 サンプルを４℃または室温で保存し、そしてホエー分離を測定した（ボトル中 のサンプルの上部におけるホエーのmmにおいて）。サンプルを250mlの青いキャ ップのボトル（二重決定）に満たした。各場合におけるサンプルの深さは、約70 mmであった（これは、各ボトルの200mlのマークに対応する）。 実施例１ サワーミルク乳飲料 ペクチンをサワーミルク乳飲料（例えば、ヨーグルト飲料）に添加する目的は 、飲料の細菌学的および感覚による有効期間の間、物理的に均一なままの飲料を 生産することである。さらに、ペクチンを添加しない場合、長期貯蔵のためのヨ ーグルト飲料の処理により、飲料中のタンパク質が不安定化し、砂っぽい舌触り のある飲料となり、そしてかなり早期にシネレシスを示す。ペクチンの処理 市販の高エステルペクチン；Grindsted^TMPectin URS（Ultra Rapid Set pecti n型）を、その高いエステルレベル（82の％DE、図19参照のこと）のために、母 ペクチンとして選択した。この母ペクチンのオレンジPME酵素での処理を、方法 のセクションで説明する。 酵素反応を停止し、そして得られた実験に用いるペクチン（ペクチン番号1944 -96-2と呼ぶ）を、エステル化の程度に関して、方法のセクションに記載の方法 で調べた。さらに、２つのペクチンのタイプ、母ペクチンおよび処理されたペク チンを、公知の良質の市販の飲用ヨーグルトペクチンのタイプと比較するために 、Grinsted^TMPectin AM453を実験に含めた。 ３つの選択されたペクチンの相対的カルシウム感受性を、方法のセクションで 説明したように測定した：ペクチンサンプルのカルシウム感受性指標（CF）の測 定、およびその結果を以下の表に示す。 82％DEから下は76％DEまでのGrindsted^TMPectin URS母ペクチンの脱エステル 化は、これらの２つのペクチンのカルシウム感受性に、ほとんど何ら変化を与え なかった(ΔCF＝１は感受性なし)。測定可能なカルシウム感受性を有するペクチ ンが、70％DEまでのオレンジPME酵素での母ペクチンのさらなる処理によって生 産され得る。なぜなら、このペクチンは14のΔCFを有していたからである。ヨーグルト/飲用ヨーグルト分析の結果 ヨーグルトを方法のセクションで説明したように生産した。３つのペクチン（ Grindsted^TMPectin URS、ペクチン1944-96-2、およびGrindsted^TMPectin AM453 ）を、以下の調製法において個々に用いた： 7.6％MSNF（乳固形分）、9.15％砂糖、および0.25％または0.35％ペクチンサ ンプルを用いると、最終産物中で、それぞれ17.0％または17.10％の全固形分と なった。 生産された個々のヨーグルトの質は、方法のセクションに記載のように、遠心 分離試験におけるそれらの沈降％により、ヨーグルト中の粒子サイズを測定する ことにより、粘度を測定することにより、そして長期貯蔵の間に乳清の分離が生 じるか否かを試験することにより調べた。 ３つのペクチンのタイプを用いて生産されたヨーグルトの沈降を、以下の表に 示す。 ヨーグルトの沈降（％） これらの結果は、１〜４個の独立した生産物の平均値である。 母ペクチン（URS型）が高い沈降％を有し、従って生産されたヨーグルトが乳 清の分離を示し、そして用いられた両方のペクチン濃度（0.25および0.35％）で 不安定であったことが明らかである。これは驚くことではない。なぜなら、通常 URSペクチンのタイプは、熱処理されたタイプのヨーグルトの長期保存のための 安定化に用いられ得ないからである。 ペクチン1944-96-2を用いて生産されたヨーグルトは、75日を越える貯蔵後に 、用いられた両方のペクチン用量で安定性、および上記の結果に見られるように 低い沈降を示し、そして乳清の分離は何ら示さなかった。これに対して、ヨーグ ルト生産に通常用いられる良質のGrindsted^TMPectin AM453もまた、予想された ように低い沈降を示し、そして乳清の分離のない安定なヨーグルトを生産した（ 上記の結果を参照のこと）。 母URSペクチンのオレンジPMEでの処理により、不適切なペクチンを、ヨーグル トの中の安定剤として適切にし、そしてこの処理されたペクチンは良質の市販の 安定剤と同じくらい良く働く。 粒子サイズ決定による生産されたヨーグルトのさらなる試験（方法のセクショ ンを参照のこと）を行った。結果を以下の表に示す。ヨーグルトの粒子サイズ（μM） 母URSペクチンを用いて生産されたヨーグルトの平均の粒子サイズ（Malvern装 置を用いたD(4.3)画分に対応する数を示す）は、予想通り高い。これらの結果も また１〜４個の生産物の平均値である。 ペクチン1944-96-2およびGrindsted^TMPectin AM453の両方から生産されたヨー グルトの平均の粒子サイズは、用いられた両方のペクチン用量において小さい( 上記の結果を参照のこと)。これらのペクチンのタイプを用いて生産されたヨー グルトが、安定なヨーグルトを生産するのに適していることがまた示される。 最後に、そして非常に重要であるが、長期保存のための飲料ヨーグルトを生産 する場合には、その粘度を測定し、そしてその結果を以下の表に示す。ヨーグルトの粘度（MPa） 母URSペクチンがヨーグルトを安定化し得なかったので、得られた粘度は、予 想通り、両方のペクチン濃度でやや高い。沈降の度合いが低くそして小さい粒子 サイズを有する安定なヨーグルトを生産した良質のGrindsted^TMPectin AM453は 、0.25％ペクチン用量においてGrindsted^TMPectin URSペクチンを用いたときに 見られた粘度の約半分の粘度、そして0.35％ペクチン用量においてURSペクチン をほぼ同じ粘度（AM453ペクチンのみが安定なヨーグルトを生産したという事実 とは無関係に）を示した。 URSおよびAM453の両方の場合、観察されたより高い粘度は、添加されたペクチ ンの量に部分的に起因するようであり、特にこれはAM453ペクチンの場合にあて はまるようである。なぜなら、添加されたペクチンの量が増加（0.25から0.35％ まで）すると、ほぼ２倍粘度の高いヨーグルトが生産されたからである。 オレンジ処理されたPMEペクチン1944-96-2を用いて得られた粘度は、0.25％濃 度において、母URSペクチンに比較して劇的な粘度の低下を示す。これは、1944- 96-2ペクチンでのヨーグルトの安定化に部分的に起因するが、これが唯一の理由 ではない。なぜなら、AM453ヨーグルトは、そのペクチン用量において２倍高い 粘度を有するからである。実際、0.35％の1944-96-2ペクチンをヨーグルトに添 加しても、（0.25％用量に比較して）粘度が６単位増加するだけであるが、AM45 3の場合、0.25％から0.35％に変えると、19単位増加する。 オレンジPME処理ペクチン1944-96-2は、ペクチン用量が0.25％（または0.35％ ）（これは、他の未処理ペクチン（例えば、Grindsted^TMPectin AM453）を用い た場合、ほぼ２倍高い粘度を与える）であったにも関わらず、非常に低い粘度を 有するヨーグルトを安定化し得る。 これは、サワーミルク乳飲料の生産のための、新しく非常に重要な開発である 。 Grindsted^TMPectin URSをオレンジPMEで処理することにより、新しいペクチン のタイプが作製される。これは、母ペクチンとは対照的に、ヨーグルトを安定化 し得、そして最も重要なことに、通常用いられるペクチンよりもずっと低い粘度 を示す。他の高エステルペクチンはまた、オレンジPMEでの処理により改善され 得る。 実施例２ 乳清ジュース飲料 （上記のように調製された）本発明の改変されたペクチンを、以下のように乳清 ジュース飲料において用いた： 乾燥したPME改変ペクチン、クエン酸ナトリウム、および砂糖を混合し、次い で80℃で水に溶解した。このペクチン溶液を５℃未満に冷却し、そして乳清を５ ℃において添加した。Grindsted着香料(Danisco Ingredients，Danisco A/Sによ り供給される）およびジュースをゆっくり添加し、そしてサンプル混合物中のpH をクエン酸または乳酸でpH 4.0に調セクションした。サンプル混合物を、撹拌し ながら約30分間熟成した。低温殺菌を80℃で15秒間行い、そして均質化を200bar (2900psi)で行った。サンプルを20℃にまで冷却し、そして無菌的に容器に満た した。 サンプル試験を、室温で、24時間、１ヶ月、および６ヶ月インキュベートした 後に分析した。調査分析には、粘度の測定、安定性指標粒子サイズ、および長期 的安定性が含まれた（上記のプロトコル）。 これらの結果により、PME改変ペクチンで加工された乳清ジュース飲料におい て、改善された安定性および長期的安定性が、コントロール試験で用いた参照ペ クチンに比較して示された。さらに、乳清ジュース飲料は、コントロール飲料よ りも低い都合の良い粘性を有していた。 乳清ジュース飲料をまた、植物PMEで改変されたライムおよびレモンペクチン でそれぞれ加工した(すなわち、本発明のPMEで改変した)。その結果により、PME 改変ペクチンが、非改変ペクチンと比較して、また参照ペクチンと比較して、改 善されたタンパク質安定性を有することが実証された。 実施例３ ミルク/果汁飲料 Grindsted^TMURS(Danisco Ingredients，Danisco A/Sから入手した)を、ヨーグ ルト飲料について記載したように、PMEで改変した。改変ペクチンを、以下を含 むミルク/果汁飲料において用いた： 乾燥したPME改変ペクチンおよび砂糖を混合し、次いで80℃で水に溶解した。 ペクチン溶液を５℃未満に冷却し、そしてミルクを５℃で添加した。Grindsted 着香料およびジュースをゆっくり添加し、そしてサンプル混合物中のpHを（必要 であれば）クエン酸または乳酸でpH4.0に調セクションした。サンプル混合物を 、乳清ジュース飲料について記載のように熟成させ、低温殺菌し、そして均一化 した。サンプルを20℃に冷却し、そして無菌的に容器に満たした。 その結果により、PME改変ペクチンで加工されたミルク/果汁飲料において改善 された安定性（長期的安定性を含む）が、コントロール試験において用いた参照 ペクチンに比較して示された。さらに、ミルク/果汁飲料は、コントロール飲料 よりも低い都合の良い粘性を有していた。改善された機能性もまた観察された。 ミルク/果汁飲料はまた、本発明のPMEで改変されたライムおよびレモンペクチ ンで加工し得る。 実施例４ 乳清安定性 酵素で改変されたペクチンをpH 4.0で試験した。得られたペクチン溶液のpHを 、KOH/HClでpH 4.0に調セクションした。ペクチン濃度を、1.0％に調整した。ペ ク チンを濃度0.1％〜0.25％において試験した。ペクチン、Jenness緩衝液（以下を 参照のこと）、および乳清溶液（以下を参照のこと）を混合し、そして96℃にて 25分間加熱した。室温に冷却した後、吸光度を500nmで測定した。乾燥混合Jennessの緩衝液： 乾燥粉末Jenness（Jenness，RおよびKoops，J Preparation and Properties o f a salt solution which simulates milk ultrafiltrate，Nederlands Melk-en Zuiveltijdschrift，第16巻 nr３、153-164頁、1962）： 15.80g KH₂PO₄ 5.08g K₃シトレート 17.91g Na₃シトレート,2H₂O 1.80g K₂SO₄ 13.20g CaCl₂,2H₂O 5.02g Mg₃シトレート,H₂O 3.00g K₂CO₃ 10.78g KCl 緩衝液： pH 4.0の7.5900g/lの乾燥粉末Jennessの水溶液。乳清溶液 乳清タンパク質の濃縮物を凍結乾燥し、そして粉末化した。0.40％w/wの乳清 タンパク質の溶液を、Jenness緩衝液中でpH 4.0で調製した。ペクチン溶液 １％w/wのペクチン水溶液をpH 4.0で作製した。混合物濃度： ペクチン、Jenness緩衝液、および乳清溶液を、以下の表に示すように混合し た。混合物を、25分間96℃に加熱し、そして室温に冷却してから、サンプルを分 光光度計で500nmにおいて測定した。 結果 結果を以下の表に示す。上述の500nmでの吸光度の値は、２つの測定から得た 平均値である。種々の異なるタイプのペクチンおよび本発明の酵素的に改変され たペクチンの比較のために、非改変ペクチンであるGrindsted^TMPectin 3450（Da nisco Ingredients，Danisco A/Sから供給された）についての指標を100に設定 する。 指標＞100は、サンプル3450を用いるよりも低いタンパク質の安定性を示す。 指標＝100は、サンプル3450と類似の安定性を示す。指標＜100は、サンプル3450 を用いるよりも良いタンパク質の安定性を示す。指標≦95は、非常によいタンパ ク質の安定性を示す。 結果から見られるように、本発明により改変されたGrindsted^TMpectin URSペ クチンは、参照のGrindsted^TMpectin 3450および非改変Grindsted^TMpectin URS ペクチンに比較して、安定性を増加するのに都合の良い特性、そしていくつかの 場合には非常によい特性を示す。 実施例５ 長期の有効期間を有する低pHのラバン飲料 ラバン（Laban）飲料は、pH値が4.2より低い酸性化した乳飲料である。ラバン 飲料は、ペクチン溶液と混合したラバンベースからなる飲料である。ラバンベー スの処方は以下の通りである： 標準化された全乳（無水乳脂肪および脱脂乳粉末）を、75-80℃、圧力200bar( 2900psi)で均質化し、その後90-95℃で５〜10分間低温殺菌した。pH4.0くらい まで培養した後、pHをクエン酸または乳酸で3.8〜4.2に調セクションする。次い で、ペクチン溶液を添加する。次いで、その混合物を均一な混合物になるまで撹 拌する。次いで、90〜95℃で10〜15秒間低温殺菌し、そしてさらに150〜200bar で均質化する。20〜25℃に冷却した後、その製品を無菌的に容器に満たす。 ２〜３日後、非安定化ラバン飲料は、しばしばシネレシスを示す。 しかし、本発明の酵素的に改変したペクチンの添加により、シネレシスは抑制 され、そして粘性は改善される。 さらに、この製品は、はっきりしたヨーグルトの味および長期の有効期間を有 する。 実施例６ オレンジジュース（タンパク質富化） オレンジジュース飲料は、２％のDANPROLACT 40^TM(Central Soya，Aarhus A/S )、６％の砂糖、10％のオレンジ濃縮物、0.4％のレモン濃縮物、0.2％のペクチ ン、および81.4％の水を含む酸性化された飲料（pHは約４）である。この製品は 、大豆タンパク質を富化したオレンジジュースである。この製品は、低温殺菌お よび均質化されている。20〜25℃に冷却した後、この製品を無菌的に容器に満た し、そして約６ヶ月間、室温で貯蔵することが可能である。本発明の酵素的に改 変されたペクチンをオレンジ飲料に添加（タンパク質添加）すると、都合の良い 特性（例えば、長期安定性）を示し、そしてこれは良い口当たりであった。 実施例７ 抗体産生 抗体を本発明の酵素に対して生じさせた。つまり、N HarboeおよびA Ingild（ 「Immunnization，Isolation of Immunoglobulins，Estimation of Antibody Ti tre」In A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis，Methods and Appl ications，N H Axelsenら、(編)、Universitetsforlaget，Oslo，1973）およびT G Cooper(「The Tools of Biochemistry」、John Wiley & Sons，New York，19 77)に従って記載された手順に従い、精製された酵素をウサギに注射し、そし て免疫グロブリンを抗血清から単離することにより抗体が生じた。 本発明の他の改変が、本発明の範囲から逸脱することなく当業者に明らかであ る。 以下の頁において、多数の配列リストを提示する。これらには、配列番号１か ら配列番号19まで連続的に番号が付され、そしてこれらは核酸配列およびアミノ 酸配列を表す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｐ 19/04 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:685） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｌ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 トーソー，ハンヌ デンマーク国 アーハス シー ディーケ イ−8000，レジル ２．１，シルクボーグ ベジ 30 (72)発明者 ブクホルト，ハンス クリスチャン デンマーク国 ブラブランド ディーケイ −8220，シバンゲベジ 16 (72)発明者 ラスムッセン，プレベン デンマーク国 リングビー ディーケイ− 2800，ムルドバド 45 (72)発明者 ニールセン，ジョン デンマーク国 コペンハーゲン ディーケ イ−2300，エングベジ 38

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．少なくとも１つのタンパク質を含む酸性環境に、ブロックワイズに酵素的 に脱エステル化されたペクチンを添加する工程を包含するプロセスであって、こ こで該ペクチンが高エステルペクチンである、プロセス。 ２．前記ブロックワイズに酵素的に脱エステル化されたペクチンが、組換えDN A技法によって調製される、請求項１に記載のプロセス。 ３．前記酸性環境が水溶液であり、好ましくは、該水溶液が飲料である、請求 項１または請求項２に記載のプロセス。 ４．前記飲料が、飲用ヨーグルト、果汁、または乳清タンパク質を含む飲料で ある、請求項３に記載のプロセス。 ５．前記タンパク質が、ミルクまたはチーズのような乳製品に由来する、また は由来し得る、または乳製品中に存在する、請求項１〜４のいずれか一項に記載 のプロセス。 ６．前記タンパク質が、カゼインまたは乳清タンパク質である、請求項５に記 載のプロセス。 ７．前記酸性環境が約3.5〜約5.5のpHを有し、好ましくは、該酸性環境が４〜 約5.5のpHを有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載のプロセス。 ８．前記酸性環境が約４のpHを有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の プロセス。 ９．組換えDNA技法の使用によって調製された前記ブロックワイズに酵素的に 脱エステル化されたペクチンが、約70％〜約80％のエステル基、好ましくは約76 ％のエステル基を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のプロセス。 １０．組換えDNA技法によって調製された前記ブロックワイズに酵素的に脱エ ステル化されたペクチンが、実施例に記載されるようなプロトコルのCa²⁺イオン に非感受性である、請求項１〜９のいずれか一項に記載のプロセス。 １１．組換えDNA技法によって調製された前記ブロックワイズに酵素的に脱エ ステル化されたペクチンが、高分子量を有する、請求項１〜１０のいずれか一項 に記載のプロセス。 １２．組換えDNA技法によって調製された前記ブロックワイズに酵素的に脱エ ステル化されたペクチンが、少なくとも実質的にすべてのペクチン鎖におけるペ クチンの２つ以上の隣接するガラクツロン酸残基を脱エステル化する組換えペク チンメチルエステラーゼを用いてペクチンを処理する工程によって調製される、 請求項１〜１１のいずれか一項に記載のプロセス。 １３．前記組換えペクチンメチルエステラーゼが、植物から得られ得るPMEに 由来する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のプロセス。 １４．前記植物が果物である、請求項１３に記載のプロセス。 １５．前記果物が柑橘類の果物である、請求項１４に記載のプロセス。 １６．前記柑橘類の果物がオレンジである、請求項１５に記載のプロセス。 １７．前記組換えペクチンメチルエステラーゼが、オレンジのラメラまたはア ルベドから得られ得るPMEに由来する、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載 のプロセス。 １８．前記ブロックワイズに酵素的に脱エステル化されたペクチンが、配列番 号１もしくは配列番号２に示すアミノ酸配列のいずれか１つを含む組換え酵素、 またはその改変体、誘導体、もしくはホモログ、それらの組み合わせを含むもの を用いてペクチンを処理する工程によって調製される、請求項１〜１７のいずれ か一項に記載のプロセス。 １９．前記ブロックワイズに酵素的に分解されたペクチンが、NCIMB 40749も しくはNCIMB 40750に含まれるPMEコード配列の発現によって得られ得る組換え酵 素、またはその改変体、誘導体、もしくはホモログ、またはそれらの組み合わせ ；あるいは、配列番号３もしくは配列番号４に示すヌクレオチド配列を含むヌク レオチド配列の発現によって得られ得る組換え酵素、またはその改変体、誘導体 、もしくはホモログ、またはそれらの組み合わせを用いてペクチンを処理する工 程によって調製される、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のプロセス。 ２０．前記ブロックワイズに酵素的に脱エステル化されたペクチンが、ナトリ ウムイオンの存在下で前記組換えペクチンメチルエステラーゼを用いてペクチン を処理する工程によって調製される、請求項１２〜１９のいずれか一項に記載の プロセス。 ２１．前記ブロックワイズに酵素的に脱エステル化されたペクチンが、NaCl、 NaNO₃、またはNa₂SO₄の存在下で前記組換えペクチンメチルエステラーゼを用い てペクチンを処理する工程によって調製される、請求項２０に記載のプロセス。 ２２．ペクチンをブロックワイズに酵素的に脱エステル化する方法であって、 配列番号１もしくは配列番号２に示すアミノ酸配列のいずれか１つを含む組換え 酵素、またはその改変体、誘導体、もしくはホモログ、それらの組み合わせを含 むものを用いてペクチンを処理する工程を包含する、方法。 ２３．前記ブロックワイズに酵素的に分解されたペクチンが、NCIMB 40749も しくはNCIMB 40750に含まれるPMEコード配列の発現によって得られ得る組換え酵 素、またはその改変体、誘導体、もしくはホモログを用いてペクチンを処理する 工程によって調製される、請求項２２に記載の方法。 ２４．前記ブロックワイズに酵素的に脱エステル化されたペクチンが、ナトリ ウムイオンの存在下で前記組換えペクチンメチルエステラーゼを用いてペクチン を処理する工程によって調製される、請求項２２〜２３に記載の方法。 ２５．前記ブロックワイズに酵素的に脱エステル化されたペクチンが、NaCl、 NaNO₃、またはNa₂SO₄の存在下で前記組換えペクチンメチルエステラーゼを用い てペクチンを処理する工程によって調製される、請求項２４に記載の方法。 ２６．配列番号１もしくは配列番号２に示すアミノ酸配列のいずれか１つを含 む組換え酵素、またはその改変体、誘導体、もしくはホモログ、それらの組み合 わせを含むもの。 ２７．前記ヌクレオチド配列が配列番号３もしくは配列番号４に示す配列のい ずれか１つを含む請求項２６に記載の組換え酵素をコードするヌクレオチド配列 、またはその改変体、誘導体、もしくはホモログ。 ２８．前記ヌクレオチド配列がNCIMB 40749もしくはNCIMB 40750から得られ得 る請求項２６に記載の組換え酵素をコードするヌクレオチド配列、またはその改 変体、誘導体、もしくはホモログ。 ２９．請求項２６に記載の組換え酵素、あるいは請求項２７または２８に記載 のヌクレオチド配列を発現するまたは含む構築物。 ３０．請求項２９に記載の構築物、あるいは請求項２６に記載の組換え酵素、 あるいは請求項２７または２８に記載のヌクレオチド配列を発現するまたは含む ベクター。 ３１．請求項２６に記載の組換え酵素あるいは請求項２７または２８に記載の ヌクレオチド配列を発現するまたは含む少なくとも１つの第１の構築物；ならび に目的の遺伝子（GOI）およびプロモーターを含む第２の構築物を含む構築物の 組み合わせ。 ３２．請求項３０に記載のベクター、あるいは請求項２９に記載の構築物、あ るいは請求項２６に記載の組換え酵素、あるいは請求項２７または２８に記載の ヌクレオチド配列、あるいは請求項３１に記載の構築物の組み合わせを発現する または含む細胞、組織、または器官。 ３３．請求項２６〜３２のいずれか一項に記載の発明を発現するまたは含むト ランスジェニック生物。 ３４．NCIMB 40749またはNCIMB 40750。 ３５．トマトPME酵素ではなく、請求項２６に記載の精製組換え酵素に対して 惹起した抗体と免疫学的に反応性である、組換えPME酵素。 ３６．ペクチンのエステル基の数を減少するための請求項２６または請求項３ ５に記載の組換え酵素の使用。 ３７．ブロックワイズの様式でペクチンを脱エステル化するための請求項２６ または請求項３５に記載の組換え酵素の使用。 ３８．ペクチンのカルシウム感受性に影響を及ぼすための請求項２６または請 求項３５に記載の組換え酵素の使用。 ３９．遊離のカルボキシル基を含むペクチンをエステル化するための請求項２ ６または請求項３５に記載の組換え酵素の使用。 ４０．請求項２６または請求項３５に記載の組換え酵素の使用によって得られ 得るペクチン。 ４１．食料品を調製するための請求項４０に記載のペクチンの使用。 ４２．環境の粘度に不利な影響を及ぼすことなく酸性環境においてタンパク質 を安定化するための、請求項４０に記載のペクチンの使用。 ４３．請求項２６または請求項３５に記載の組換え酵素および真菌PMEまたは 他のペクチン分解酵素を含む酵素の組み合わせ。 ４４．タンパク質に熱安定性を与えるまたは増加させることにおける使用に適 切な、配列番号５に示す配列、またはその改変体、誘導体、もしくはホモログを 含むアミノ酸配列。 ４５．タンパク質に熱安定性を与えるまたは増加させるためのアミノ酸配列を 発現させることにおける使用に適切な、配列番号６に示す配列、またはその改変 体、誘導体、もしくはホモログを含むヌクレオチド配列。 ４６．請求項２６に記載の酵素をコードする組換えヌクレオチド配列。 ４７．実質的に本明細書に記載される組換えPME酵素。 ４８．実質的に本明細書に記載される組換えPME酵素の使用によって調製され るペクチン。