PL185172B1

PL185172B1 - Sposób stabilizowania białka w środowisku kwasowym, obejmujący wprowadzanie czynnika stabilizującego

Info

Publication number: PL185172B1
Application number: PL96324503A
Authority: PL
Inventors: Tove M. I. E. Christensen; Jette D. Kreiberg; Hanne Thorsoe; Hans C. Buchholt; Preben Rasmussen; John Nielsen
Original assignee: Danisco
Priority date: 1995-07-14
Filing date: 1996-07-12
Publication date: 2003-03-31
Also published as: US6083540A; EP1625796A1; HK1035846A1; EP1621082A2; DK1101412T3; NZ313625A; EP1621082A3; EP0976822A3; DE69615199T3; DE69615199D1; EP1101412B1; EP1101412A2; US6268195B1; AU714570B2; JP2005124579A; CA2225481A1; US20020009790A1; EP0839006A1; ATE205366T1; EP0839006B1

Abstract

1. Sposób stabilizowania bialka w srodowisku kwasowym, obejmujacy wprowadzanie czynnika sta- bilizujacego, znamienny tym, ze zawiera: a) oczyszczanie enzymu metyloesterazy pektyno- wej (PME) zdolnego do enzymatycznego blokowego deestryfikowania pektyny; b) dodawanie tego oczyszczonego enzymu mety- loesterazy pektynowej (PME) zdolnego do enzymatycz- nego blokowego deestryfikowania pektyny do pektyny; c) otrzymywanie blokowo enzymatycznie deestry- fikowanej pektyny z pektyny za pomoca oczyszczonego enzymu metyloesterazy pektynowej (PME) zdolnego do enzymatycznego blokowego deestryfikowania pektyny; i) przy czym blokowo enzymatycznie deestryfiko- wana pektyna jest pektyna wysokoestrowa; oraz ii) blokowo enzymatycznie deestryfikowana pe- ktyna zawiera od okolo 70% do okolo 80% grup estro- wych, korzystnie okolo 76% grup estrowych; d) dodawanie blokowo enzymatycznie deestry- fikowanej pektyny do srodowiska kwasowego zawie- rajacego przynajmniej jedno bialko; oraz e) stabilizowanie tego bialka przez ta blokowo enzymatycznie deestryfikowana pektyne. Fig. 1 Schematyczny diagramu owocu cytrusowego PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób stabilizowania białka w środowisku kwasowym, obejmujący wprowadzanie czynnika stabilizującego, charakteryzujący się tym, że zawiera:

a) oczyszczanie enzymu metyloesterazy pektynowej (pME) zdolnego do enzymatycznego blokowego deestryfikowania pektyny;

b) dodawanie tego oczyszczonego enzymu metyloesterazy pektynowej (PME) zdolnego do enzymatycznego blokowego deestryfikowania pektyny do pektyny;

c) otrzymywanie blokowo enzymatycznie deestryfikowanej pektyny z pektyny za pomocą oczyszczonego enzymu metyloesterazy pektynowej (PME) zdolnego do enzymatycznego blokowego deestryfikowania pektyny;

i) przy czym blokowo enzymatycznie deestryfikowanąpektynąjest pektyna wysokoestrowa;

oraz ii) blokowo enzymatycznie deestryfikowana pektyna zawiera od około 70% do około 80% grup estrowych, korzystnie około 76% grup estrowych;

d) dodawanie blokowo enzymatycznie deestryfikowanej pektyny do środowiska kwasowego zawierającego przynajmniej jedno białko; oraz

e) stabilizowanie tego białka przez tą blokowo enzymatycznie deestryfikowaną pektynę.

Korzystnie, blokowo enzymatycznie deestryfikowaną pektynę wytwarza się przy użyciu technik rekombinowanego DNA.

Korzystnie, środowiskiem kwasowym jest roztwór wodny, korzystniej napój, najkorzystniej napojem jest pitny jogurt, sok owocowy lub napój zawierający białko serwatki.

Korzystnie, białko pochodzi lub możnaje uzyskać z produktów mlecznych, lub jest w produktach mlecznych, takich jak mleko lub ser.

W takim przypadku białkiem jest kazeina lub białko serwatki.

Korzystnie, środowisko kwasowe posiada pH od około 3,5 do około 5,5, korzystniej posiada pH od 4 do około 5,5, najkorzystniej środowisko kwasowe ma pH wynoszące około 4.

Korzystnie, blokowo enzymatycznie deestryfikowana pektyna jest niewrażliwa na jony Ca²⁺ zgodnie z protokołem oznaczania wskaźnika wrażliwości na jony wapnia (CP) dla próbek pektyny, i równie korzystnie posiada wysoki ciężar cząsteczkowy.

Korzystnie, metyloesteraza pektynowa (PME) deestryfikuje dwie lub więcej sąsiednie reszty kwasu galaktouronowego pektyny w co najmniej zasadniczo wszystkich łańcuchach pektyny i równie korzystnie pochodzi od PME, którą można otrzymać z rośliny.

Korzystnie, rośliną jest owoc, korzystnie owocem jest owoc cytrusowy, najkorzystniej owocem cytrusowym jest pomarańcza.

Korzystnie, metyloesteraza pektynowa pochodzi z PME, którą możną otrzymać z lamelli lub warstwy białej pomarańczy.

Korzystnie, enzym zawiera sekwencję aminokwasową wybraną spośród SEQ ID nr 1 lub SEQ ID nr 2, ich wariantu, pochodnej albo homologu, lub ich kombinacji.

185 172

Ί

Korzystnie, enzym może być otrzymany poprzez ekspresję sekwencji kodującej PME zawartej wNCIMB 40749 lubNCIMB 40750, lub ich wariantu, pochodnej albo homologu, lub ich kombinacji; lub przez ekspresję sekwencji nukleotydowej, zawierającej sekwencję nukleotydową SEQ ID nr 3 lub SEQ ID nr 4 lub ich wariantu, pochodnej albo homologu, lub ich kombinacji.

Korzystnie, blokowo enzymatycznie deestryfikowaną pektynę wytwarza się przez traktowanie pektyny rekombinowaną PME w obecności jonów sodu.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób stabilizowania białka w środowisku kwasowym, obejmujący wprowadzanie czynnika stabilizującego, charakteryzujący się tym, że zawiera:

a) insercję do organizmu sekwencji DNA kodującej enzym metyloesterazy pektynowej (PME) zdolny do enzymatycznego blokowego deestryfikowania pektyny;

b) ekspresjonowanie tej sekwencji DNA kodującej enzym metyloesterazy pektynowej (PME) zdolny do enzymatycznego blokowego deestryfikowania pektyny;

c) oczyszczanie ekspresjonowanego enzymu metyloesterazy pektynowej (PME) zdolnego do enzymatycznego blokowego deestryfikowania pektyny;

d) dodawanie tego oczyszczonego enzymu metyloesterazy pektynowej (PME) zdolnego do enzymatycznego blokowego deestryfikowania pektyny do pektyny;

e) otrzymywanie blokowo enzymatycznie deestryfikowanej pektyny z pektyny za pomocą oczyszczonego enzymu metyloesterazy pektynowej (PME) zdolnego do enzymatycznego blokowego deestryfikowania pektyny;

i) przy czym blokowo enzymatycznie deestryfikowaną pektynąjest pektyna wysokoestrowa; oraz ii) blokowo enzymatycznie deestryfikowana pektyna zawiera od około 70% do około 80% grup estrowych, korzystnie około 76% grup estrowych;

f) dodawanie blokowo enzymatycznie deestryfikowanej pektyny do środowiska kwasowego zawierającego przynajmniej jedno białko; oraz

g) stabilizowanie tego białka przez tą blokowo enzymatycznie deestryfikowaną pektynę.

Korzystnie, środowiskiem kwasowym jest roztwór wodny, korzystnie napój, korzystniej napojem jest pitny jogurt, sok owocowy lub napój zawierający białko serwatki.

Korzystnie, białko pochodzi lub możnaje uzyskać z produktów mlecznych, lub jest w produktach mlecznych, takichjak mleko lub ser, w takim przypadku białkiemjest kazeina lub białko serwatki.

Korzystnie, metyloesteraza pektynowa (PME) deestryfikuje dwie lub więcej sąsiednie reszty kwasu galaktouronowego pektyny w co najmniej zasadniczo wszystkich łańcuchach pektyny.

Korzystnie, metyloesteraza pektynowa pochodzi od PME, którąmożna otrzymać z rośliny.

Korzystnie, rośliną jest owoc, korzystniej owocem jest owoc cytrusowy, najkorzystniej owocem cytrusowym jest pomarańcza.

Korzystnie, że metyloesteraza pektynowa pochodzi z PME, którąmożna otrzymać z lamelli lub warstwy białej pomarańczy.

Korzystnie, enzym może być otrzymany poprzez ekspresję sekwencji kodującej PME zawartej w NCIMB 40749 lub NCIMB 40750, lub ich wariantu, pochodnej albo homologu, lub ich kombinacji; lub przez ekspresję sekwencji nukleotydowej, zawierającej sekwencję nukleotydową SEQ ID nr 3 lub SEQ ID nr 4 lub ich wariantu, pochodnej albo homologu, lub ich kombinacj i.

Korzystnie, blokowo enzymatycznie deestryfikowaną pektynę wytwarza się przez traktowanie pektyny rekombinowanąPME w obecności jonów sodu.

Szczegółowy opis wynalazku

W niniejszym wynalazku dostarcza się procesu, obejmującego dodanie do środowiska kwaśnego, które zawiera co najmniej jedno białko, pektyny blokowo enzymatycznie deestryfikowanej, gdzie pektynąjest pektyna wysoko estrowa.

W wynalazku dostarcza się także sposobu blokowej deestryfikacji enzymatycznej pektyny, obejmującego traktowanie pektyny rekombinowanym enzymem, zawierającym każdą z sekwencji aminokwasowych ukazanych jako SEQ ID nr 1 lub SEQ ID nr 2, albo ich odmianę, pochodną lub homolog, włączając ich połączenie.

W wynalazku dostarcza się także rekombinowanego enzymu, zawierającego każdą z sekwencji aminokwasowych ukazanych jako SEQ ID nr 1 lub SEQ ID nr 2, albo ich odmianę, pochodną lub homolog.

W wynalazku dostarcza się także sekwencję nukleotydową, kodującąrekombinowany enzym według niniejszego wynalazku, gdzie sekwencja nukleotydową zawiera każdą z sekwencji ukazanych jako SEQ ID nr 3 lub SEQ ID nr 4, albo ich odmianę, pochodną lub homolog.

W wynalazku dostarcza się także sekwencję nukleotydową, kodującą rekombinowany enzym według niniejszego wynalazku, gdzie sekwencja nukleotydową możliwajest do otrzymania z NCIMB 40749 lub NCIMB 40750, albo ich odmianę, pochodną lub homolog.

W wynalazku dostarcza się także konstrukcję, wykazującą ekspresję lub zawierającą rekombinowany enzym według niniejszego wynalazku, lub sekwencję nukleotydową według niniejszego wynalazku.

W wynalazku dostarcza się także wektor, wykazujący ekspresję lub zawierający konstrukcję według niniejszego wynalazku, albo rekombinowany enzym według niniejszego wynalazku, albo sekwencję nukleotydową według niniejszego wynalazku.

W wynalazku dostarcza się także połączenia konstrukcji, zawierających co najmniej pierwszą konstrukcję, wykazującą ekspresję lub zawierającą rekombinowany enzym według niniejszego wynalazku, albo sekwencję nukleotydową według niniejszego wynalazku; oraz drugą konstrukcję, zawierającą interesujący gen (GOI) i promotor.

W wynalazku dostarcza się także komórkę, tkankę lub narząd, wykazujący lub zawierający wektor według niniej szego wynalazku, albo rekombinowany enzym według niniej szego wynalazku, albo sekwencję nukleotydową według niniejszego wynalazku, albo połączenie konstrukcji według niniejszego wynalazku.

W wynalazku dostarcza się także organizm transgeniczny, w którym zachodzi ekspresja lub zawierający każdy z poprzednio wspomnianych aspektów niniejszego wynalazku.

W wynalazku dostarcza się także NCIMB 40749 lub NCIMB 40750.

W wynalazku dostarcza się także rekombinowany enzym PME, który jest imunologicznie reaktywny z przeciwciałem, wyhodowanym przeciw oczyszczonemu rekombinowanemu enzymowi zgodnego z trzecim aspektem niniej szego wynalazku, lecz nie enzymowi PME pomidora.

W wynalazku dostarcza się także zastosowanie rekombinowanego enzymu według niniejszego wynalazku do zmniejszania liczby grup estrowych pektyny.

W wynalazku dostarcza się także zastosowanie rekombinowanego enzymu według niniejszego wynalazku do deestryfikacji pektyny w sposób blokowy.

W wynalazku dostarcza się także zastosowanie rekombinowanego enzymu według niniejszego wynalazku do wpływania na wrażliwość pektyny na wapń.

W wynalazku dostarcza się także zastosowanie rekombinowanego enzymu według niniejszego wynalazku do estryfikacji pektyny, zawierającej wolne grupy karboksylowe.

W wynalazku dostarcza się także pektynę otrzymanąprzez zastosowanie rekombinowanego enzymu według niniejszego wynalazku, tak jak przez sposób według niniejszego wynalazku.

W wynalazku dostarcza się także połączenie enzymów, zawierające enzym według niniejszego wynalazku oraz PME grzyba i/lub inny enzym, rozkładający pektynę (np. liazę pektynową).

Inne aspekty, obejmują zastosowanie pektyny według niniejszego wynalazku do wytwarzania żywności; oraz zastosowanie pektyny według niniejszego wynalazku do stabilizowania białka w środowisku kwaśnym bez niekorzystnego wpływu na lepkość środowiska; oraz rekombinowaną sekwencję nukleotydową, kodującą enzym według niniejszego wynalazku.

W ten sposób niniejszy wynalazek ujawnia nowe zastosowanie pektyn deestryfikowanych. Ujawnienie dotyczy także nowego rekombinowanego PME do wytwarzania takich pektyn.

Niektórymi kluczowymi zaletami niniejszego wynalazku są takie, że deestryfikowane pektyny według niniejszego wynalazku zapewniają stabilność białek w środowisku kwaśnym bez niekorzystnego wpływu na lepkość środowiska.

Zalecanąpostacią realizacji pierwszego aspektujest proces, obejmujący dodanie do środowiska kwaśnego, które zawiera co najmniej jedno białko, pektyny blokowo enzymatycznie deestryfikowanej, wytworzonej przy użyciu technik rekombinacji DNa, gdzie pektyna jest pektyną wysoko estrową.

Termin „pektyna blokowo enzymatycznie deestryfikowana przy użyciu technik rekombinacji DNA” oznacza pektynę, zawierającą grupy deestryfikowane blokowo, gdzie pektynę wytwarza się przez traktowanie (np. zetknięcie) pektyny, zawierającej zestryfikowane grupy, za pomocą enzymu, który wytworzono stosując techniki rekombinacji DNA.

Niektóre z kluczowych korzyści tego zalecanego aspektu niniejszego wynalazku są takie, że pektynę deestryfikowaną można wytworzyć z łatwością i z odpowiednim stopniem zgodności. Pod tym względem, sam rekombinowany PME można wytworzyć całkiem prosto i łatwo, a także do wysokiego stopnia homogeniczności. Odwrotnie i nie takjak w preparatach PME z wcześniejszego stanu techniki, oznacza to, że uzyskana aktywność pMe jest bardziej zgodna i homogeniczna, a więc umożliwia lepszą kontrolę procesu całkowitej deestryfikacji.

Zastosowanie pektyny blokowo enzymatycznie deestryfikowanej - którą korzystnie wytwarza się stosując techniki rekombinacji DNA - w procesie według niniejszego wynalazku, do stabilizowania co najmniej jednego białka w środowisku kwaśnym, jest korzystne, ponieważ pozwala białkom, takimjak białka serwatki i mleka (takimjak kazeina), na stabilność w roztworach kwaśnych. Jest to istotne dla rynku napojów, takich jak napoje z mleka odtłuszczonego, z soków owocowych i z białkami z serwatki, w których przedtem możliwe było zachowanie posmaku kluczowych białek, tylko w całkiem wysoko kwasowych warunkach - takich jak pH 4,2 - jeśli obecne były duże ilości stabilizatora.

Odkryliśmy obecnie, że do niektórych zastosowań można użyć małych ilości deestryfikowanej pektyny według niniejszego wynalazku. Przy tym niskim poziomie, deestryfikowana pektyna według niniejszego wynalazku nie tylko zachowuje się jak stabilizator lecz także nie posiada niekorzystnego wpływu na końcowy produkt.

Jeśli jest to pożądane, użycie deestryfikowanej pektyny według niniejszego wynalazku umożliwiłoby producentom żywności zwiększyć pH pokarmów, takichjak napoje. Z tego względu, w niektórych wypadkach mniej kwasowy charakter napojów może czynić je smaczniejszymi dla ludzi, zwłaszcza niemowląt. W ten sposób, w przeciwieństwie do procesów z wcześniejszego stanu techniki, obecnie jest możliwe zachowanie posmaku tych białek w warunkach pH wyższego niż 4,2, tak jak do pH 5,5 (tak jak pH 5,2), przez użycie pektyny blokowo enzymatycznie deestryfikowanej wytworzonej przy użyciu technik rekombinacji DNA.

Poza tym, uważa się, że nawet w warunkach niskiego pH, takiego jak pH 4,2 lub mniejszego, pektyna blokowo enzymatycznie deestryfikowana - zwłaszcza pektyna blokowo enzymatycznie deestryfikowana wytworzona przy użyciu technik rekombinacji DNA - stabilizuje białko(a) bardziej niż stabilizatory z wcześniejszego stanu techniki, które stosuje się do tych warunków pH.

Dalszą korzyściąjest to, że rekombinowany PME umożliwia produkcję zasadniczo homogenicznej pektyny blokowo deestryfikowanej. Rozumiemy przez to, że zasadniczo wszystkie łańcuchy pektynowe zawierają co najmniej dwie sąsiednie deestryfikowane grupy karboksylowe. Jednakże, dla pewnych zastosowań, nie musi być konieczne wytworzenie lub użycie takiej zasadniczo homogenicznej blokowo deestryfikowanej pektyny.

185 172

Unikając ograniczenia przez teorię, uważa się, że blokowo enzymatycznie deestryfikowana pektyna - szczególnie pektyna wytworzona przy użyciu technik rekombinacji DNA -stabilizuje białko(a) przez otaczanie białka(ek) płaszczem ładunków ujemnych, tworząc w ten sposób stabilną emulsję.

Rekombinowany enzym PME według niniejszego wynalazku jest użyteczny do blokowej deestryfikacji pektyn, gdy pektyny stykają się z rekombinowanym enzymem w środowisku zasadniczo wodnym. W niektórych przypadkach, deestryfikujące pektyny mogą zwiększać wrażliwość na wapń pektyn - co odwrotnie może być korzystne.

Alternatywnie, rekombinowany enzym PME według niniejszego wynalazku jest użyteczny do estryfikowania pektyn, gdy pektyny stykają się z rekombinowanym enzymem w środowisku zasadniczo niewodnym, tak jak w obecności metanolu lub w obecności wysokiego stężenia siarczanu amonowego. Ten aspekt jest korzystny jeśli np. pożądane jest zmniejszenie wrażliwości pektyny na wapń.

Ten sposób estryfikacji pektyn jest korzystny, ponieważ omija on potrzebę wysokiej temperatury i warunków estryfikacji metanolowej związanej z procesami z wcześniejszego stanu techniki. W ten sposób, niniejszy wynalazek obejmuje także zastosowanie tej estryfikowanej pektyny w wytwarzaniu żywności, jak również pektyny jako takiej.

Zgodnie z niniej szym wynalazkiem, deestryfikowana pektyna według niniej szego wynalazku jest korzystna do wytwarzania żywności.

Typowa żywność obejmuje produkty mleczne, produkty mięsne, produkty drobiowe, produkty rybne i pieczywo. Korzystnie, żywnościąjest napój.

Deestryfikowana pektyna według niniejszego wynalazku jest także korzystna do użytku jako stabilizator i/lub modyfikator lepkości w wytwarzaniu produktów farmaceutycznych, urządzeniach farmaceutycznych, kosmetykach i urządzeniach kosmetycznych.

Korzystnie środowiskiem kwasowym jest roztwór wodny.

Korzystnie roztworem wodnym jest napój.

Korzystnie napojemjestjogurt pitny, sok owocowy lub napój, zawierający białko serwatki.

Korzystnie białko pochodzi lub może pochodzić z produktów mlecznych, takichjak mleko lub ser.

Korzystnie białkiem jest kazeina lub białko serwatki.

Korzystnie środowisko kwasowe ma pH, wynoszące od około 3,5 do około 5,5.

Korzystnie środowisko kwasowe ma pH, wynoszące od 4 do około 5,5.

Korzystnie, w którym środowisko kwasowe ma pH, wynoszące około 4.

Korzystnie blokowo enzymatycznie deestryfikowana pektyna, szczególnie ta wytworzona przy użyciu technik rekombinacji DNA, jest pektyną wysoko estrową, zawierającą około 80% grup estrowych lub mniej (to jest stopień estryfikacji (DE) 80% lub mniejszy). Z tego względu stosunek wolnych grup karboksylowych do zestryfikowanych grup karboksylowych w pektynie wynosi od 1:1 do 1:4, korzystnie od 1:2 do 1:3.

Korzystnie, blokowo enzymatycznie deestryfikowana pektyna zawiera około 76% grup estrowych.

W niektórych przypadkach, korzystnie pektyna blokowo enzymatycznie deestryfikowana jest wrażliwa naj ony Ca2+. Wrażliwość na wapń można określić stosuj ąc następujący 20 protokół jaki wspomniano w przykładach.

Korzystniej jednakże, blokowo enzymatycznie deestryfikowana pektyna, szczególnie ta wytworzona przy użyciu technik rekombinacj i DNA, j est wrażliwa naj ony Ca2+. Wrażliwość na wapń można określić stosując następujący protokół jaki wspomniano w przykładach.

Korzystnie blokowo enzymatycznie deestryfikowana pektyna ma wysoki ciężar cząsteczkowy.

Zwykle, ciężar cząsteczkowy zawiera się od około 50 KD do około 150 KD.

Korzystnie blokowo enzymatycznie deestryfikowaną pektynę wytwarza się przez traktowanie pektyny rekombinowaną metyloesterazą pektynową, która deestryfikuje dwa lub więcej

185 172 sąsiadujących reszt kwasu galaktouronowego pektyny w co najmniej zasadniczo wszystkich łańcuchach pektynowych. .

Korzystnie rekombinowana metyloesteraza pektynowa pochodzi od PME możliwego do uzyskania z rośliny. .

Termin „pochodząca od PME możliwego do uzyskania z rośliny” oznacza, że rekombinowany PME posiada sekwencję podobną do tej z PME, który jest możliwy do uzyskania z rośliny, zapewniaj ąc możliwość deestryfikacj i pektyny przez rekombinowany PME, w sposób blokowy.

Korzystnie roślinąjest owoc.

Korzystnie owocem jest owoc cytrusowy.

Korzystnie owocem cytrusowym jest pomarańcza.

Korzystnie rekombinowana metyloesteraza pektynowa pochodzi od PME możliwego do uzyskania z lamelli lub warstwy białej pomarańczy. Dla odniesienia, przekrój poprzeczny typowego owocu cytrusowego pokazuje się w fig. 1 gdzie wskazuje się lamellę i warstwę białą. Termin „pochodząca od PME możliwego do uzyskania z lamelli lub warstwy białej pomarańczy” oznacza, że rekombinowany PME posiada sekwencję podobną do tej z PME, który jest możliwy do uzyskania z lamelli lub warstwy białej pomarańczy, zapewniając możliwość deestryfikacj i pektyny przez rekombinowany PME, w sposób blokowy.

Korzystnie, blokowo enzymatycznie deestryfikowaną pektynę wytwarza się przez traktowanie pektyny rekombinowanym enzymem, zawierającym każdąz sekwencji aminokwasowych pokazanych jako SEQ ID nr 1 lub SEQ ID nr 2, lub ich odmianę, pochodną lub homolog, włączając ich połączenia.

Korzystnie, blokowo enzymatycznie deestryfikowaną pektynę wytwarza się przez traktowanie pektyny rekombinowanym enzymem, który można otrzymać przez ekspresję sekwencji nukleotydowej, zawierającej sekwencję pokazanąjako SEQ ID nr 3 lub SEQ ID nr 4, lub ich odmiany, pochodnej lub homologu, albo ich połączeń.

Korzystnie, blokowo enzymatycznie deestryfikowaną pektynę wytwarza się przez traktowanie pektyny rekombinowanym enzymem, który można otrzymać przez ekspresję sekwencji, zawartej w NCIMB 40749 lub NCIMB 4075U, lub ich odmiany, pochodnej lub homologu, albo ich połączeń.

Korzystnie, blokowo enzymatycznie deestryfikowaną pektynę wytwarza się przez traktowanie pektyny rekombinowanąmetyloesterazą pektyn<^^^ą w obecności jonów sodu.

Korzystnie, blokowo enzymatycznie deestryfikowaną pektynę wytworzoną przy użyciu technik rekombinacji DNA, wytwarza się przez traktowanie pektyny rekombinowaną metyloesterazą pektynową w obecności NaCl, NaNO₃ lub Na₂ SO₄.

Korzystnie, rekombinowany enzym podlega ekspresji przez sekwencję nukłeotydowąpokazanąjako SEQ ID nr 1 lub SeQ ID nr 2..

Niniejszy wynalazek kryje także sekwencje, które są komplementarne do sekwencji wyżej wspomnianych.

Termin „pektyna” obejmuje pektynę w jej zwykłym sensie, jak również produkty jej frakcjonowania i jej pochodne, jak również pektyny modyfikowane (np., pektyny modyfikowane chemicznie i pektyny modyfikowane enzymatycznie).

Korzystnie, pektyna nie jest pektyną, którą potraktowano enzymem poligalaktouronazą, w celu zasadniczego zmniejszenia długości szkieletu pektyny.

Termin „odmiana” lub „fragment” w odniesieniu do rekombinowanego enzymu według niniejszego wynalazku obejmuje każdą substytucję odmianę, modyfikację, zamianę, delecję lub addycję jednego (lub więcej) aminokwasu z, lub do sekwencji, zapewniając uzyskanej sekwencji aminokwasowej aktywność PME, korzystnie mającej taką samą aktywność rekombinowanego enzymu, zawierającego każdąjednąlub więcej sekwencji pokazanej jako SEQ ID nr 1 i 2. W szczególności, termin „homolog” kryje homologię ze względu na strukturę i/lub działanie, zapewniające uzyskanemu rekombinowanemu enzymowi aktywność PME. Ze względu na homologię sekwencji (to jest podobieństwo), korzystna jest co najmniej 75%, korzystniejsza co najmniej 85%, korzystniejsza co najmniej 9% homologia z sekwencjami pokazanymi

185 172 w załączonych wykazach sekwencji. Korzystniejsza jest co najmniej 95%, korzystniej co najmniej 98% homologia z sekwencjami pokazanymi w załączonych wykazach sekwencji.

Termin „odmiana”, „homolog” lub „fragment” w odniesieniu do sekwencji nukleotydowej, kodującej rekombinowany enzym według niniejszego wynalazku, obejmuje każdą substytucję, odmianę, modyfikację, zamianę, delecję lub addycję jednego (lub więcej) aminokwasu z, lub do sekwencji, zapewniając uzyskanej sekwencji aminokwasowej aktywność PME, korzystnie mającej taką samą aktywność rekombinowanego enzymu, zawierającego każdąjednąlub więcej sekwencji pokazanej jako SEQ ID nr 1 i 2. W szczególności, termin „homolog” kryje homologię ze względu na strukturę i/lub działanie, zapewniające uzyskanemu rekombinowanemu enzymowi aktywność PME. Ze względu na homologię sekwencji (to jest podobieństwo), korzystna jest co najmniej 75%, korzystniejsza co najmniej 85%, korzystniejsza co najmniej 90% homologia. Korzystniejsza jest co najmniej 95%, korzystniej co najmniej 98% homologia.

Powyższe terminy są zamienne z odmianami allelicznymi sekwencji.

Tarmin „komplementarny” oznacza, że niniejszy wynalazek kryje także sekwencje nukleotydowe, które mogą hybrydyzować z sekwencjami nukleotydowymi sekwencji kodującej.

Termin „nukleotyd” w odniesieniu do niniejszego wynalazku obejmuje genomowy DNA, cDNA, syntetyczny DNA oraz RNA. Korzystnie oznacza on DNA, korzystniej cDNA dla sekwencji kodującej według niniejszego wynalazku.

Termin „owoc cytrusowy” oznacza gatunki z rodzaju Citrus i obejmuje limonę, cytrynę, pomarańczę, greipfrut, kumkwat, pomarańczę olbrzymią i mandarynkę. Korzystnie oznacza on pomarańczę.

Termin „konstrukcja” - będący synonimem z terminami takimi jak „koniugat”, „kaseta” i „hybryda” - obejmuje sekwencję nukleotydową według niniejszego wynalazku lub, w przypadku połączenia konstrukcji, GOI bezpośrednio lub pośrednio dołączony do promotora. Przykładem dołączenia pośredniego jest dostarczenie odpowiednich grup rozdzielających, takich jak sekwencja intronowa, taka jak intron Shl lub aDh lub GOI. To samo jest prawdziwe dla terminu „połączony” w stosunku do niniejszego wynalazku, który obejmuje łączenie bezpośrednie lub pośrednie. W każdym przypadku terminy nie oznaczająnaturalnego połączenia genu kodującego dla enzymu, zwykle związanego z promotorem dzikiego typu i gdy są one oba w swym naturalnym środowisku.

Konstrukcj a może nawet zawierać lub wykazywać ekspresję markera, który pozwala na selekcję konstrukcji genetycznej np. grzybów nitkowatych, korzystnie rodzaju Aspergillus, takich jak Aspergillus niger, lub roślin, takich jak ziemniaki, burak cukrowy itd., do których została ona przeniesiona. Istnieją różne markery, których można użyć, takie jak np. kodujące izomerazę mannozo-6-fosforanową (zwłaszcza dla roślin) lub te markery, które zapewniają oporność na antybiotyki - np. oporność na G418, higromycynę, bleomycynę, kanamycynę i gentamycynę.

Termin „wektor” obejmuje wektory ekspresji i wektory transformacji.

Termin „wektor ekspresji” oznacza konstrukcję, umożliwiąjącąekspresję in vitro lub in vitro.

Termin „wektor transformacji” oznacza konstrukcję, umożliwiającą przeniesienie z jednego gatunku do drugiego -takąjak z plazmidu E.coli do grzyba nitkowatego, korzystnie z rodzaju Aspergillus. Może to być nawet konstrukcja, umożliwiająca przeniesienie z plazmidu E.coli do Agrobacterium do rośliny.

Termin „tkanka” obejmuje tkankę jako taką oraz narząd.

Termin „organizm” w odniesieniu do niniejszego wynalazku obejmuje każdy organizm, który mógłby zawierać sekwencję nukleotydową, kodującą enzym rekombinacyjny według niniejszego wynalazku i/lub produkt z niej otrzymany, gdzie promotor może pozwolić na ekspresję sekwencji nukleotydowej według wynalazku jeśli jest obecna w organizmie.

Korzystnie organizmemjest grzyb nitkowaty, korzystnie z rodzaju Aspergillus, korzystniej Aspergillus niger.

Termin „organizm transgeniczny” w odniesieniu do niniejszego wynalazku obejmuje każdy organizm, który zawiera sekwencję nukleotydową, kodującą enzym rekombinowany według

18f5172 niniejszego wynalazku i/lub produkty z niej otrzymane, gdzie promotor może pozwolić na ekspresję sekwencji nukleotydowej według niniejszego wynalazku wewnątrz organizmu. Korzystnie sekwencja nukleotydowa jest włączona w genom organizmu.

Korzystnie organizmem transgenicznymjest grzyb nitkowaty, korzystnie z rodzaju Aspergillus, korzystniej Aspergillus niger.

Zatem, organizm transgeniczny według niniejszego wynalazku obejmuje organizm, zawierający każdy jeden lub połączenia, promotor, sekwencję nukleotydową, kodującąrekombinowany enzym według niniejszego wynalazku, konstrukcję według niniejszego wynalazku (włączając ich połączenia), wektory według niniejszego wynalazku, plazmidy według niniejszego wynalazku, komórki według niniejszego wynalazku, tkanki według niniejszego wynalazku lub ich produkty.

Termin „organizm transgeniczny” nie obejmuje natywnej kodującej sekwencji nukleotydowej według niniejszego wynalazku wjej naturalnym środowisku, gdy jest ona pod kontrolą jej natywnego promotora, który także jest w swym naturalnym środowisku. Poza tym, niniejszy wynalazek nie obejmuje natywnego enzymu według niniejszego wynalazku, gdy jest on w swym naturalnym środowisku i gdy jego natywna kodująca sekwencja nukleotydowa, która także jest w swym naturalnym środowisku, spowodowałajego ekspresję, i gdy ta sekwencja nukleotydowa jest pod kontroląswego natywnego promotora, który takżejest w swym naturalnym środowisku.

Transformowana komórka lub organizm mógłby wytwarzać dopuszczalne ilości żądanego związku, który byłby łatwo odbierany z komórki lub organizmu.

Korzystnie konstrukcja według niniejszego wynalazku obejmuje sekwencję nukleotydową według niniejszego wynalazku oraz promotor.

Termin „promotor” używa się w zwykłym sensie w tej dziedzinie, np. miejsce wiązania polimerazy RNA w teorii ekspresji genu Jacoba-Monoda.

W jednym aspekcie, sekwencja nukleotydowa według niniejszego wynalazku jest pod kontrolą promotora, który może być promotorem specyficznym dla komórki lub tkanki. Jeśli np. organizmem jest roślina, wtedy promotor może być tym, który wpływa na ekspresję sekwencji nukleotydowej w każdej jednej lub więcej tkanek bulwy, łodygi, pędu, korzenia i liścia.

Drogąprzykładu, promotor dla sekwencji nukleotydowej według niniejszego wynalazku może być promotorem α-Amy 1 (z drugiej strony znanym jako promotor Amy 1, promotor Amy 637 lub promotor α-Amy 637) jaki opisano w naszym równolegle toczącym się zgłoszeniu patentowym UK nr 9421292.5 wypełnionym 21 października 1994. Alternatywnie, promotorem dla sekwencji nukleotydowej według niniejszego wynalazku może być promotor α-Amy 3 (z drugiej strony znany jako promotor Amy 3, promotor Amy 351 lub promotor α-Amy 351) jaki opisano w naszym równolegle toczącym się zgłoszeniu, patentowym UK nr 9 421 286.7 wypełnionym 21 października 1994.

Promotor może dodatkowo obejmować cechy, zapewniające lub zwiększające ekspresję w odpowiednim gospodarzu. Przykładowo, cechami mogą być zachowane regiony, takie jak boks Pribnowa lub boks TATA. Promotor może także zawierać inne sekwencje, wpływające (tak jak utrzymujące, wzmacniające, zmniejszające) na poziomy ekspresji sekwencji nukleotydowej według niniejszego wynalazku lub, w przypadku połączenia konstrukcji, GOI. Przykładowo, odpowiednie inne sekwencje obejmują intron Shl lub intron ADH. Inne sekwencje obejmują elementy możliwe do indukcji - takie jak elementy możliwe do indukcji temperaturowe, chemiczne, świetlne lub stresowe. Mogą być także obecne odpowiednie elementy do wzmacniania transkrypcji lub translacji. Przykładem tego ostatniego elementujest sekwencja sygnałowa TMV 5' (patrz Sleat Gene 217 [1987] 217-225; oraz Dawson Plant Mol. Biol. 23 [1993197).

Dodatkowo, niniejszy wynalazek obejmuje także połączenia promotorów i/lub sekwencji nukleotydowych, kodujących białka lub rekombinowane enzymy i/lub elementy.

Niniejszy wynalazek obejmuje także zastosowanie promotorów do ekspresji sekwencji nukleotydowej, kodującej rekombinowany enzym według niniejszego wynalazku lub GOI, gdzie część promotorajest inaktywowana lecz gdzie promotor wciąż może działać jako promotor. Częściowa inaktywacja promotora w niektórych przypadkach jest korzystna. W szczególności, jeśli

185 172 chodzi o wspomniany wcześniej promotor Amy 351, jest możliwe inaktywowanie jego części tak, że częściowo inaktywowany promotor wykazuje ekspresję nukleotyd według niniejszego wynalazku lub GOI w bardziej specyficzny sposoby tak jak tylko w jednej specyficznej tkance lub narządzie.

Termin „inaktywowany” oznacza częściową inaktywację w takim sensie, że wzór ekspresji promotorajest zmieniony lecz w którym częściowo inaktywowany promotor wciąż działajak promotor. Jednakże, jak wspomniano powyżej, modyfikowany promotor jest zdolny do ekspresji nukleotydu według niniejszego wy nalazku lub GOI co najmniej wjednej (lecz nie wszystkich) specyficznej tkance oryginalnego promotora. Jednym takim promotoremjest promotor Amy 351 opisany wyżej. Przykłady częściowej inaktywacji obejmują zmianę wzoru składania sekwencji promotora, lub rodzaju wiązania do części sekwencji nukleotydowej tak, że część sekwencji nukleotydowej nie jest rozpoznawana np. przez polimerazę RNA. Inną i korzystną drogą częściowej inaktywacji promotora jest pocięcie go do postaci jego fragmentów. Inną drogą byłaby mutacja co najmniej części sekwencji tak, że polimeraza RNAnie mogłaby wiązać się z tą częścią lub inną częścią. Inną modyfikacją jest zmutowanie miejsc wiązania dla białek regulatorowych np. białka CreA znanego z grzybów nitkowatych, maj ącego wpływ na represj ę katabolitu węglowego, i w ten sposób znosi represję katabolitoową natywnego promotora.

Termin „GOI” w odniesieniu do połączenia konstrukcji według niniejszego wynalazku, oznacza każdy interesujący gen. GOI może być każdym nukleotydem, który jest albo obcy albo naturalny dla organizmu (np. grzyba nitkowatego, korzystnie z rodzaju Aspergillus, lub rośliny) o który chodzi. Typowe przykłady GOI obej^iy^geny, kodujące białka i enzymy, które modyfikują procesy metaboliczne i kataboliczne. GOI może kodować czynnik do wprowadzania lub zwiększania oporności na patogeny. GOI może nawet być konstrukcją antysensowną do modyfikowania ekspresji naturalnych produktów transkrypcji obecnych w związanych tkankach. GOI może nawet kodować nie natywne białko grzyba nitkowatego, korzystnie z rodzaju Aspergillus, lub związek korzystny dla zwierząt lub ludzi.

Przykłady GOI obejmują inne pektynazy, depolimerazy pektynowe, poligalaktouronazy, liazy pektynianowe, liazy pektynowe, ramno-galaktouronazy, hemicelulazy, endo-P-glukanazy, arabinazy lup esterazy acetylowe, lub ich połączenia,jak również ich sekwencje antysensowne.

GOI może być białkiem, dającym wartość odżywczą pożywieniu lub plonom. Typowe przykłady obejmują białka roślinne, które mogąhamować tworzenie się czynników antyżywieniowych, oraz białka roślinne, które posiadają bardziej pożądany skład aminokwasowy (np. wyższą zawartość lizyny niż w roślinie nietransgenicznej). GOI może nawet kodować enzym, który można stosować w obróbce pokarmu, taki jak chymozyna, taumatyna (thaumatin) i α-galaktozydaza. GOI może być genem, kodującym każdą toksynę szkodnika, antysensowny produkt transkrypcji, taki jak patatyna lub α-amylaza, ADP-glukozopirofosforylaza (np. patrz EP-A-0 455 316), antysensowna proteaza, glukanaza lub genomowy PME.

GOI może nawet kodować intron dla poszczególnego enzymu, lecz w którym intron może być w orientacji sensownej lub anty sensownej. W ostatnim wypadku, poszczególny enzym mógłby być genomowym PME. Antysensownaekspresja sekwencji genomowego egzonu lub intronu jak GOI, znaczyłaby, że ekspresja naturalnego PME byłaby zmniejszona lub usunięta, ale gdzie ekspresja rekombinowanego PME nie byłaby zakłócona. Jest to szczególnie prawdziwe dla ekspresji intronu antysensownego lub intronu sensownego.

GOI może być sekwencją, nukleotydową, kodującą enzym α-amylazę, która jest przedmiotem naszego równolegle toczącego się zgłoszenia patentowego UK 9 413 439.2, wypełnionego 4 lipca 1994. GOI może być sekwencją nukleotydową, kodującą enzym α-amylazę, który jest przedmiotem naszego równolegle toczącego się zgłoszenia patentowego UK 9 421 290.9, wypełnionego 21 października 1994. GOI może być każdą z sekwencji nukleotydowych, kodujących enzymy ADP-glukozopirofosforylazy, które są przedmiotem naszego równolegle toczącego się zgłoszenia patentowego PCT PCT/EP 94/01082, wypełnionego 7 kwietnia 1994. GOI może być każdąz sekwencji nukleotydowych, kodujących enzym liazę α-glukanową, które

185 172 opisuje się w naszym równolegle toczącym się zgłoszeniu patentowym PCT PCT/EP 94/03397, wypełnionego 15 października 1994.

Organizm gospodarza może być organizmem prokariotycznym lub eukariotycznym. Przykłady odpowiednich gospodarzy prokariotycznych obejmują.©. coli i Bacillus subtilis. Doświadczenia transformacji gospodarzy prokariotycznych, są dobrze udokumentowane w tej dziedzinie, np. patrz Sambrook i in., (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2-gie wydanie, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press) . Jeśli używa się gospodarza prokariotycznego, wtedy może zajść potrzeba modyfikacji genu przed transformacją - tak jak przez usunięcie intronów.

Jak wspomniano powyżej, zalecany organizm gospodarza jest z rodzaju Aspergillus, taki jak Aspergillus niger.

Transgeniczny Aspergillus według niniejszego wynalazku można wytworzyć z użyciem następujących pouczeń J.Ramboseka i J.Leacha, 1987 (Recombinant DNA in filamentous fungi: Progress and Prospects. CRC Crit.Rev.Biotechnol. 6:357-393), R.W.Davis, 1994 (Heterolgous gene expresion and protein secretion in Aspergillus. W: S.D.Martinelli, J.R.Kinghorn (wydawcy) Aspergillus: 50 years on. Progress in industrial microbiology, tom 29, Elsevier Amsterdam 1994, strony 525-560), D.J.Ballance, 1991 (Transformation systems for Filametous Fungi and Overview ofFungal Gene structure. W: S.A.Leong, R.M.Berka (wydawcy) Molecular Industrial Mycology. Systems and Applications for Filamentous Fungi. Marcel Dekker Inc.New York 1991, strony 1-29) i G. Tumern 1994 (Yectors for genetic manipulation. W: S.D.Martinelli, J.R.Kinghom (wydawcy) Aspergillus: 50 years on. Progress in industrial microbiology, tom 29, Elsevier Amsterdam 1994, strony 641-666). Jednakże, następujące uwagi zapewniają streszczenie tych pouczeń do wytwarzania transgenicznego Aspergillus według niniejszego wynalazku.

Przez prawie wiek, grzyby nitkowate szeroko stosowano w wielu gałęziach przemysłu do produkcji organicznych związków i enzymów. Przykładowo, fermentacje tradycyjnej japońskiej koji i soi stosowały Aspergillus sp. Także w tym wieku Aspergillus niger używano do produkcji kwasów organicznych, szczególnie kwasu cytrynowego oraz do produkcji różnych enzymów do użytku w przemyśle.

Są dwa główne powody, dlaczego grzyby nitkowate tak szeroko stosuje się w przemyśle. Po pierwsze grzyby nitkowate mogą wytwarzać duże ilości produktów zewnątrzkomórkowych np. enzymów i związków organicznych, takich jak antybiotyki lub kwasy organiczne. Po drugie grzyby nitkowate mogą rosnąć na tanich substratach, takich jak ziarna, otręby, pulpa buraczana itd. Takie same powody uczyniły grzyby nitkowate atrakcyjnymi organizmami jako gospodarzami dla heterologicznej ekspresji według niniejszego wynalazku.

W celu wytworzenia transgenicznego Aspergillus, sporządza się konstrukcje ekspresji, przez wtrącenie sekwencji nukleotydowej według niniejszego wynalazku (lub nawet GOI) do konstrukcji zaplanowanej do ekspresji w grzybach nitkowatych.

Wykorzystano kilka typów konstrukcji użytych do ekspresji heterologicznej. Konstrukcje te korzystnie zawierają promotor, który jest aktywny w grzybach, przykłady promotorów obejmują promotor grzybowy dla zewnątrzkomórkowego, enzymu, podlegającego wysokiej ekspresji, taki jak promotor glukoamylazy lub promotor α-amylazy. Sekwencję nukleotydową według niniejszego wynalazku (lub nawet GOI) można połączyć z sekwencją sygnałową, która kieruje wydzielaniem białka kodowanego przez sekwencję nukleotydową według niniejszego wynalazku (lub nawet GOI). Zwykle, stosuje się sekwencję sygnałową grzyba. Terminator aktywny w grzybach kończy układ ekspresji.

Inny typ układu ekspresji wykorzystano w grzybach, gdzie sekwencję nukleotydową według niniejszego wynalazku (lub nawet GOI) można połączyć z mniejszą lub większą częścią genu grzybowego, kodującego stabilne białko. To może stabilizować białko kodowane przez sekwencję nukleotydową według niniejszego wynalazku (lub nawet GOI). W takim układzie, miejsce rozszczepienia, rozpoznawane przez specyficzną. proteazę, można wprowadzić między białko grzybowe i białko kodowane przez sekwencję nukleotydową według niniejszego wynalazku (lub nawet GOI). Drogą przykładu, można wprowadzić miejsce, które jest rozpoznawane przez peptydazę podobne do KEX-2 znajdującą się w -co najmniej niektórych Aspergilli. Taka fuzja pro16

185 172 wadzi do rozszczepienia in vivo, dając w wyniku produkt, podlegający ekspresji i nie większe białko połączone.

Heterologicznąekspresję w Aspergillus opisywano dla kilku genów, kodujących białka bakteryjne, grzybowe, kręgowców i roślin. Białka można osadzać wewnątrzkomórkowo jeśli sekwencji nukleotydowej według niniejszego wynalazku (lub nawet GOI) nie łączy się z sekwencją sygnałową. Takie białka będą gromadzić się w cytoplazmie i zwykle nie będąglikozylowane, co może być zaletą dla pewnych białek bakteryjnych. Jeśli sekwencję nukleotydową według niniejszego wynalazku (lub nawet GOI) zaopatrzy się w sekwencję sygnałową, białko będzie gromadzić się zewnątrzkomórkowo.

Ze względu na stabilność produktu i modyfikacje szczepu gospodarza, pewne białka heterologiczne nie sąbardzo stabilne, gdy sąwydzielane do płynu hodowlanego grzybów. Większość grzybów produkuje kilka zewnątrzkomórkowych proteaz, które rozkładają heterologiczne białka. Aby uniknąć tego problemu, stosuje się specjalne szczepy grzybowe ze zmniejszonąprodukcjąproteaz, jako gospodarzy do produkcji heterologicznej.

Dla transformacji grzybów nitkowatych, wykorzystano kilka protokołów trasformacyjnych dla wielu grzybów nitkowatych (Ballance 1991, jak wyżej). Wiele z nich opiera się na wytworzeniu protoplastów i wprowadzeniu DNA do protoplastów, przy użyciu PEG i jonów Ca2+. Transformowane protoplasty regeneruje się potem i transformowane grzyby poddaje się selekcji, przy użyciu różnych merkerów selekcyjnych. Wśród markerów użytych do transformacji jest wiele markerów auksotroficznych, takich jak argB, trpC, niaD i pyrG, markerów oporności na antybiotyki, takjak oporność na benomyl, oporność na higromycynę i oporność na fleomycynę. Powszechnie używanym markerem transformacji jest gen amdS A.nidulans, który w dużej liczbie kopii pozwala grzybom na wzrost, z akrylamidem jako wyłącznym źródłem azotu.

W innej postaci realizacji, transgenicznym organizmem mogą być drożdże. Pod tym względem, drożdże także szeroko stosowano jako nośnik dla ekspresji genu heterologicznego. Gatunek Saccharomyces cerevisiae ma długa, historię zastosowania przemysłowego, włączając jego użycie do ekspresji genu heterologicznego. Ekspresję genu heterologicznego w Saccharomyces cerevisiae przebadali Goodey i in., (1987, Yeast Biotechnolgy, D.R.Berry i in., wyd., strony 401-429, Allen i Uwin, Londyn) oraz King i in., (1989, Molecular and Celi Biology of Yeasts,

E.F.Walton i G.T.Yarronton, wyd., strony 107-133, Blackie, Glasgow).

Z kilku powodów Saccharomyces cerevisiae jest bardzo odpowiedni dla ekspresji genu heterologicznego. Po pierwsze, jest niepatogenny dla ludzi oraz jest on nie zdolny do produkcji pewnych endotoksyn. Po drugie, posiada długą historię bezpiecznego stosowania przez wieki komercyjnej eksploatacji w różnych celach. Doprowadziło to do szerokiej publicznej akceptowalności. Po trzecie, szerokie komercyjne stosowanie i badanie poświęcone organizmowi dało w wyniku bogatą wiedzę o genetyce i fizjologi, jak również cechy fermentacji na wielką skalę Saccharomyces cerevisiae.

Przegląd zasad ekspresji genu heterologicznego u Saccharomyces cerevisiae i wydzielanie produktów genowych podaje się u E.Hincliffe E.Kenny (1993, „Yeast as a vehicle for the expresion of heterologous genes, Yeasts, tom 5, Anthony H.Rose i J.Stuart Harrison, wydania, 2 wydanie, Academic Press Ltd.).

Dostępnych jest kilka typów wektorów drożdżowych, włączając wektory integracyjne, które wymagają rekombinacji z genomem gospodarza do ich utrzymania, oraz autonomicznego powielania wektorów plazmidowych.

W celu sporządzenia transgenicznego Saccharomyces, konstrukcje ekspresji sporządza się przez wtrącenie sekwencji nukleotydowej według niniejszego wynalazku do konstrukcji zaplanowanej dla ekspresji u drożdży. Stosuje się kilka typów konstrukcji do ekspresji heterologicznej. Konstrukcje zawierają promotor aktywny w drożdżach, połączony z sekwencją nukleotydową według niniejszego wynalazku, stosuje się zwykle promotor pochodzenia drożdżowego, taki jak promotor GALI. Zazwyczaj, stosuje się sekwencję sygnałową pochodzenia drożdżowego, taką jak sekwencję, kodującą peptyd sygnałowy SUC2. Terminator aktywny w drożdżach kończy układ ekspresji.

185 172

Do transformacji drożdży wykorzystano kilka protokołów transformacji. Przykładowo, transgeniczny Saccharomyces cerevisiae według niniejszego wynalazku można wytworzyć za pomocą następujących pouczeń Hinnena i in., (1978, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 75,1929); J.D.Beggs (1978, Nature, Londyn, 275,104); i H.Ito i in., (1983, J.Bacteriology 153, 163-168).

Transformowane komórki drożdży poddaje się selekcji, przy użyciu różnych markerów selekcyjnych. Wśród markerów użytych do transformacji jest wiele markerów auksotroficznych, takich jak LEU2, IS4 i TRP1, oraz markerów dominującej oporności na antybiotyki, takich jak markery antybiotyków aminoglikozydowych, np. G418.

Innym organizmem gospodarza jest roślina.

Mimo, że enzymu i sekwencji nukreotydowej, kodującej go nie opisano w EP-B-0 470145 i CA-A-2 006 454, te dwa dokumenty dostarcząjąpewnych użytecznych uwag drugoplanowych, dotyczących rodzajów technik, które można wykorzystać do wytworzenia roślin transgenicznych według niniejszego wynalazku. Niektóre z tych drugoplanowych pouczeń włącza się obecnie do następujących komentarzy.

Podstawową zasadą w konstrukcji genetycznie modyfikowanych roślin jest wtrącenie informacji genetycznej do genomu rośliny tak, aby otrzymać stabilne utrzymanie wtrąconego materiału genetycznego.

Istnieje kilka technik wtrącania informacji genetycznej, przy czym dwie główne zasady są bezpośrednim wprowadzeniem informacji genetycznej i wprowadzeniem informacji genetycznej przy użyciu układu wektorowego. Przegląd generalnych technik można znaleźć w artykułach Portykusa (Annu.Rev.Plant Physiol.Mol.Bio.[1991]42:205-225) i Christou (Agro-Food-Industry Hi-Tech marzec/kwiecień 1994 17-27).

W ten sposób, wjednym aspekcie, niniejszy wynalazek odnosi się do układu wektorowego, który niesie sekwencję nukleotydową lub konstrukcję według niniejszego wynalazku i który umożliwia wprowadzenie sekwencji nukleotydowej lub konstrukcji do genomu organizmu, takiego jak roślina.

Układ wektorowy może zawierać jeden wektor lecz może zawierać dwa wektory. W wypadku dwóch wektorów, układ wektorowy zwykle przytacza się jako układ wektorowy binarny. Binarne układy wektorowe opisuje się w dodatkowych szczegółach u An. Gynheunga i in. (1980), Binary Vectors, Plant Molecular, Biology Mannual A3,1-19.

Jeden z szeroko stosowanych układów do transformacji komórek roślinnych za pomocą danego promotora lub sekwencji nukleotydowej lub konstrukcji, opiera się na użyciu plazmidu Ti z Agrobacterium tumefaciens lub plazmidu Ri z Agrobacterium rhizogenes An i in. (1986), Plant Physlol. 81, 301 -305 i D.N.Butcher i i.( 1980), Tissue Culture Methods for Plant Pathologists, wyd.: D.S.Ingrams i J.P.Helgeson, 203-208.

Skonstruowano kilka różnych plazmidów Ti i Ri, które są odpowiednie do montowania konstrukcji roślin lub komórek roślinnych opisanych powyżej. Nie ograniczającym przykładem takiego plazmidu Ti jest pGV3850.

Sekwencję nukleotydową lub konstrukcję według niniejszego wynalazku powinno się korzystnie wtrącić do plazmidu Ti między sekwencje terminalne T-DNA lub sąsiednią sekwencję T-DNAtak, aby uniknąć przerwania sekwencji bezpośrednio otaczających granice T-DNA, jako że co najmniej jeden z tych regionów okazuje się zasadniczym do insercji modyfikowanego T-DNA do genomu rośliny.

Jak będzie zrozumiałe z powyższego wytłumaczenia, jeśli organizmem jest roślina, wtedy układ wektorowy według niniejszego wynalazku jest korzystnie tym, który zawiera sekwencje konieczne do zakażenia rośliny (np. region vir) i co najmniej jedną część graniczną sekwencji T-DNA, przy czym część graniczna położona jest na tym samym wektorze co konstrukcja genetyczna. Korzystnie, układ wektorowy jest plazmidem Ti Agrobacterium tumefaciens lub plazmidem Ri Agrobacterium rhizogenes lub ich pochodną, jako, zaś plazmidy te są dobrze znane i szeroko stosowane w konstruowaniu roślin transgenicznych, istnieje wiele układów wektorowych, które opierają się o te plazmidy lub ich pochodne.

185 172

W konstruowaniu rośliny transgenicznej, sekwencję nukeotydowąlub konstrukcję według niniejszego wynalazku można najpierw zmontować w drobnoustroju, w którym wektor może się powielać i który jest łatwy do manipulowania przed wtrąceniem do rośliny. Przykładem użytecznego drobnoustroju jest E.coli lecz można stosować inne drobnoustroje, posiadające powyższe właściwości. Gdy wektor lub układ wektorowy jaki określono powyżej został zmontowany w E.coli, przenosi się go jeśli trzeba, do odpowiedniego szczepu Agrobacterium, np. Agrobacterium tumefaciens. Plazmid Ti, będący siedliskiem sekwencji nukleotydowej lub konstrukcji według wynalazku przenosi się w ten sposób do odpowiedniego szczepu Agrobacterium, np. Agrobacterium tumefaciens tak, aby uzyskać komórkę Agrobacterium, będąca, siedliskiem sekwencji nukleotydowej według wynalazku, której DNA przenosi się następnie do komórki modyfikowanej roślinnej.

Jak doniesiono w CA-A-2 006 454, dostępna jest wielka liczba wektorów kloningowych, które zawierają, układ replikacji w E. coli i marker, pozwalający na selekcję transformowanej komórki. Wektory zawierają np. pBR 322, serie pUC, serie M13 mp, pACYC 184 itd.

Tym sposobem, nukleotyd lub konstrukcję według niniejszego wynalazku można wprowadzić do odpowiedniej pozycji restrykcyjnej w wektorze. Zawarty plazmid stosuje się do transformacji w E.coli. Komórki E.coli hoduje się w odpowiedniej pożywce i potem zbiera i poddaje lizie. Następnie plazmid odzyskuje się. Jako metod analizy, używa się generalnie analizy sekwencji, analizy restrykcji, elektroforezy i dodatkowych biologicznych metod biochemicznomolekulamych. Po każdej manipulacji, użytą sekwencję DNA można poddać restrykcji i połączyć z następną sekwencją DNA. Każdą sekwencję można klonować w tym samym lub innym plazmidzie.

Po każdej metodzie wprowadzenia żądanego promotora lub konstrukcji lub sekwencji nukleotydowej według niniejszego wynalazku w roślinach, obecność i/lub wtrącenie dodatkowych sekwencji DNA może być konieczne. Jeśli np. do transformacji plazmidu Ti lub Ri używa się komórek roślinnych, można połączyć co najmniej prawy obszar graniczny, a jednak często prawy i lewy obszar graniczny T-DNAplazmidu Ti i Ri, jako obszary oskrzydlające wprowadzane geny. Użycie T-DNA do transformacji komórek roślinnych, studiowano intensywnie i opisano w EP-A-120 516; Hoekema, w: The Binary Plant Vector System Ottset-drukkerij B.B.Kanters, Albasserdam, 1985, Rozdział V; Fraley i in., Crit.Rev.Plant.Sci., 4:1-46 i An i in., EMBO J.(1985) 4:277-284.

Bezpośrednie zakażenie tkanek roślinnych przez AgrobacPerium jest prostą techniką, którą szeroko stosowano i którą opisano u D.N. Butchera i in. (1980) Tissue Culture Methodsfor Plant Pathologists, wyd.: D.S. Ingrams i J.PHelgeson, 203-208. Dla dodatkowych pouczeń w tym temacie, patrz Portykus (Annu.Rev.Plant Physiol Mol.Biol. [1991] 42:205-225) oraz Christou (Agr-Food-Industry Hi-Tech marzec/kwiecień 1994 17-27). Za pomocą tej techniki można wykonać zakażenie rośliny na pewnej części lub tkance rośliny, to jest na części liścia, korzenia, łodygi lub innej części rośliny.

Zazwyczaj, za pomocą bezpośredniej infekcji tkanek roślinnych przez Agrobacetrium, niosącąpromotor i/lub GOI, zakażanąroślinę uszkadza się np. przez nacięcie rośliny brzytwą lub nakłucie rośliny igłą, albo otarcie na ścierniwie. Ranę okulizuje się potem Agrobacterium. Okulizowaną roślinę lub część rośliny hoduje się następnie w odpowiedniej pożywce hodowlanej i pozostawia do rozwinięcia w dojrzałe rośliny.

Gdy komórki roślinne są skonstruowane, komórki te można hodować i utrzymywać zgodnie z dobrze znanymi metodami hodowli tkanek, takj ak przez hodowlę komórek w odpowiedniej pożywce hodowlanej z niezbędnymi czynnikami wzrostu, takimi jak aminokwasy, hormony roślinne, witaminy itd. Regeneracji transformowanych komórek do genetycznie modyfikowanych roślin można dokonać przy użyciu znanych metod regeneracji roślin z hodowli komórkowych lub tkankowych, np. przez selekcję transformowanych pędów przy użyciu antybiotyku oraz przez subhodowlę pędów na pożywce, zawierającej odpowiednie składniki odżywcze, hormony roślinne itd.

Dodatkowe pouczenia o transformacji roślin można znaleźć w EP-A- 449 375.

185 172

Podsumowując, niniejszy wynalazek dostarcza procesu stabilizowania co najmniej jednego białka w środowisku kwaśnym, obejmującego zetknięcie białka z blokowo enzymatycznie deestryfikowanąpektyną, w szczególności blokowo enzymatycznie deestryfikowaną pektyną wytworzoną przy użyciu technik rekombinacji DNA.

Dodatkowo, niniejszy wynalazek dostarcza rekombinowanego enzymu użytecznego w tym procesie.

Zalecana postać realizacji niniejszego wynalazku odnosi się do procesu stabilizowania co najmniej jednego białka w środowisku kwaśnym, obejmującego zetknięcie białka z blokowo enzymatycznie deestryfikowaną pektyną wytworzoną przy użyciu technik rekombinacji DNA, gdzie blokowo enzymatycznie deestryfikowaną pektynę wytwarza się przy użyciu rekombinowanego enzymu, oraz gdzie rekombinowany enzym zawiera każdą, z sekwencji aminokwasowych pokazanych jako SEQ ID nr 1 lub SEQ ID nr 2 lub ich odmianę, pochodną lub homolog, włączając ich połączenia, oraz posiada następujące cechy:

1. Ciężar cząsteczkowy, wynoszący od około 36 KD do około 64 KD;

2. Optimum pH, wynoszące 7-8, mierzone z 0,5 % pektyną limy w 0,15 M NaCl;

3. Optimum temperaturowe, wynoszące co najmniej 50°C;

4. Stabilność temperaturową w zakresie 10°-co najmniej 40°C;

5. Wartość K_m wynoszącą0,075;

6. Maksimum aktywności na poziomie około 0,25 M NaCl;

7. Maksimum aktywności na poziomie około 0,2 M Na₂SO₄; oraz

8. Maksimum aktywności na poziomie około 0,3 M NaNO₃.

Inna zalecana postać realizacji niniejszego wynalazku odnosi się do sposobu blokowo enzymatycznie deestryfikowanej pektyny, obejmującego traktowanie pektyny rekombinowanym enzymem, zawierającym każdą z sekwencji aminokwasowych pokazanych jako SEQ ID nr 1 lub SEQ ID nr 2 lub ich odmianę, pochodną lub homolog, włączając ich połączenia, gdzie rekombinowany enzym posiada następujące cechy:

1. Ciężar cząsteczkowy, wynoszący od około 36 KD do około 64 KD;

2. Optimum pH, wynoszące 7-8, mierzone z 0,5 % pektyną limy w 0,15 M NaCl;

3. Optimum temperaturowe, wynoszące co najmniej 50°C;

4. Stabilność temperaturową w zakresie 10°-co najmniej 40°C;

5. Wartość Km wynoszącą 0,075;

6. Maksimum aktywności na poziomie około 0,25 M NaCl;

7. Maksimum aktywności na poziomie około 0,2 M Na₂SO4; oraz

8. Maksimum aktywności na poziomie około 0,3 M NaNO₃.

Inna zalecana postać realizacji niniejszego wynalazku odnosi się do rekombinowanego enzymu, zawierającego każdą z sekwencji aminokwasowych pokazanych jako SEQ ID nr 1 lub SEQ ID nr 2 lub ich odmianę, pochodną lub homolog, włączając ich połączenia, gdzie rekombinowany enzym posiada następujące cechy:

1. Ciężar cząsteczkowy, wynoszący od około 36 KD do około 64 KD;

2. Optimum pH, wynoszące 7-8, mierzone z 0,5 % pektyną limy w 0,15 M NaCl;

3. Optimum temperaturowe, wynoszące co najmniej 50°C;

4. Stabilność temperaturową w zakresie 10°-co najmniej 40°C;

5. Wartość K_ni wynoszącą 0,075;

6. Maksimum aktywności na poziomie około 0,25 M NaCl;

7. Maksimum aktywności na poziomie około 0,2 M Na₂SO4; oraz

8. Maksimum aktywności na poziomie około 0,3 M NaNO3.

Bardziej zalecane postacie realizacji niniejszego wynalazku odnoszą się do wcześniej wspomnianego zalecanego procesu, sposobu i rekombinowanego enzymu, i w których rekombi20

185 172 nowany enzym podlegał ekspresji przez sekwencję nukleotydową, zawierającą sekwencję pokazanąjako SEQ ID nr 3 lub SEQ ID nr 4, lub ich odmianę, pochodną lub homolog.

Następującą próbkę, złożono zgodnie z Układem Budapesztańskim, w uznanym depozytariuszu Narodowych Kolekcji Bakterii Przemysłowych i Morskich spółka z o.o. (NCIMB) przy StMachar Drive 23, Aberdeen Szkocja, AB2 1RY, Zjednoczone Królestwo, 6 lipca 1995: NCIMB 40750 (która odpowiada plazmidowi pO17).

Zatem, bardziej zalecane postacie realizacji niniejszego wynalazku odnos:ząsię do wcześniej wspomnianego procesu, sposobu i rekombinowanego enzymu i w którym rekombinowany enzym umożliwia ekspresję przez NCIMB 40749 lub NCIMB 40750.

Niniejszy wynalazek dotyczy także sekwencji aminokwasowej, zawierającej sekwencję pokazanąjako SEQ ID nr 5, lub jej odmiany, pochodnej albo homologu, odpowiedniego do użytku w nadawaniu lub zwiększaniu stabilności cieplnej białku.

Dodatkowo, niniejszy wynalazek dostarcza sekwencję nukleotydową, zawierającą sekwencję pokazanąjako SEQ Id nr 6 lub jej odmianę, pochodną albo homolog, odpowiednią do użytku w ekspresji sekwencji aminokwasowej do nadawania lub zwiększania stabilności cieplnej białku.

Ze względu na ostatni aspekt, powyższe uwagi dla odmian, pochodnych, homologów, konstrukcji, wektorów, transformacji organizmów gospodarza, jest równie możliwy do stosowania, chociaż oczywiście sekwencja aminokwasowa i sekwencja nukleotydową w tym przypadku wpływa na stabilność cieplną białek.

Odnośnie tego, uważa się, że sekwencja aminokwasowa pokazana jako SEQ ID nr 5 jest zdolna do nadawania lub zwiększania stabilności cieplnej białku, tak jak rekombinowany PME według niniejszego wynalazku. Sekwencja aminokwasowa może także zwiększać lub nadawać stabilność cieplną innym białkom, włączając PME z innych źródeł.

Niniejszy wynalazek będzie teraz opisany tylko drogą przykładu, w którym odnosi się do następujących załączonych fig.:

Figura 1, któraj est schematycznym rysunkiem owocu cytrusowego, takiegoj ak pomarańcza;

Figura 2, która jest żelową SDS PAGE rekombinowanego enzymu według niniejszego wynalazku;

Figura 3, która jest wykresem do określania optimum pH;

Figura 4, która jest wykresem do określania optimum tempernaury;.

Figura 5, która jest wykresem do określania stabilności temperatury;

Figura 6, która jest wykresem do określania wartości K_m;

Figura 7, którajest wykresem do określania aktywności w obecności lub przy nieobecności

NaCl;

Figura 8, którajest wykresem do określania aktywności w obecności lub przy nieobecności ^Na2^SO4^;

Figura 9, którajest wykresem do określania aktywności w obecności lub przy nieobecności NaNO₃;

Figura 10, którajest mapąplazmidu p017;

Figura 11, którajest mapąplazmidu pO34;

Figura 12, którajest schematycznym przedstawieniem dwóch genów;

Figura 13, którajest mapąplazmidu pJK10;

Figura 14, która jest mapąplazmidu pJK11;

Figura 15, która jest mapąplazmidu pJK12;

Figura 16, którajest mapąplazmidu pJK20;

Figura 17, którajest mapąplazmidu pJK21; oraz

Figura 18, którajest mapąplazmidu pJK22.

Figurę 1 przytaczano w powyższym opisie. Inne fig. omawia się w uwagach poniżej.

Część doświadczalna

Materiały i metody biochemiczne

185 172

Materiał roślinny: niedojrzałych pomarańczy hiszpańskich odmiany Navellina klasy I bez nasion, użyto do izolacji PME. Pomarańcze wyciśnięto ręcznie i łupiny przechowywano w temperaturze -80°C.

Ekstrakcja PME z łupin pomarańczy

PME oczyszczono według następującej procedury.

Wszystkie operacje przeprowadzono w temperaturze 4°C. 600 g zamrożonych łupin rozmrożono i pocięto na mniejsze kawałki.

Następnie homogenizowano je w blenderze Wanringa przez 2 minuty w 1200 ml buforu (100 mM bursztynianu Na, pH 6,2,1 mM DTT). Do homogenizatu dodano 36 g stałego NaCl, aby osiągnąć końcowe stężenie, wynoszące 3% (ciężar/objętość), w celu izolowania białek związanych z błoną(Versteeg i in. (1978), Lebensmittel.-Wiss.u.Technol.,11: 267-274). Po 2 godzinach inkubacji z delikatnym mieszaniem w temperaturze 4°C, zawiesinę przesączono przez sito nylonowe i przesącz wirowano przy 10 000 obrotów na minutę przez 20 minut, aby usunąć nierozpuszczalne pozostałości.

Supematant frakcjonowano potem za pomocą prepicytacji (NH₄)₂SO₄. Najpierw supematant poddano precypitacji za pomocą30% (NH₄)₂SO₄ przy powolnym mieszaniu przez 30 minut. Po wirowaniu przy 20 000 obrotów na minutę przez 10 minut, supematant poddano dodatkowej precypitacji za pomocą 60% (NH₄)₂SO4 przez 30 minut. Zawiesinę wirowano jak poprzednio i precypitat ponownie zawieszono w 50 ml 50 mM MES, 1 mM DTT, pH 6,8 i dializowano przeciw temu samemu buforowi, przez noc.

Chromatografia

Dializo wanąpróbkę oddzielono dalej przez chromatografięjono-wymienną. 40-50 ml próbkę nałożono na CM-Sepharose™ CL-6B (1,5 x 15 cm) w dwóch okrążeniach z 30 minutowym myciem między okrążeniami, za pomocąbuforu A: 50 mM MES, 1 mM DTT pH 6,8. Po wymyciu niezwiązanych białek buforem A, związane białka wymyto wzrastającym gradientem NaCl od 0-0,4 M NaCl w całkowitej ilości 500 ml. Przepływ wynosił 25 ml/godzinę i frakcje 8,33 ml zbierano. Profil absorpcji białka mierzono przy 280 nm.

Wszystkie frakcje analizowano pod względem aktywności PME i białka. Zawartość białka mierzono spektrofotometrycznie metodą BioRad.

Frakcje, zawierające aktywność PME zlano i zatężono przez dializę ciśnieniowąprzy użyciu układu filtracyjnego Amicon. Wymiany buforów na 50 mM Tris, 1 mM DTT, 0,1 M NaCl pH 7 wykonano na tym samym układzie.

Następnie nałożono 9 ml próbkę PME na kolumnę żelowo-filtracyjną Sephacryl™ S-200 (2,6 x 70 cm). Kolumnę zrównoważono 50 mM Tris, 1 mM DTT, 0,1 M NaCl pH7. Przepływ wynosił 40 ml/godzinę i frakcje o 5,33 ml zebrano. Frakcje, zawierające aktywność PME zlano i zatężono.

Aktywność PME

PME katalizuje odszczepienie grup metyloestrowych z pektyny. Podczas etapów oczyszczania PME wykrywano szybkimi metodami, przy użyciu testu wskaźnika czerwieni metylowej. Z powodu odszczepienia grup metylowych z reszt kwasu galaktouronowego w łańcuchu pektynowym, tworzyły się grupy karboksylowe i w oznaczeniu spadało pH. Wskaźnik pH -czerwień metylowa - zmienia kolor przy spadku pH z żółtego (pH 6,2) na pomarańczowy (pH 4,2). Oznaczenie, zawierało 1 ml 0,5% Grinsted™ Pectin 1450 (DE 70%) (dostarczonego przez Danisco Ingredients, Danisco A/S), rozpuszczonej w 0,15 M NaCl pH 7 i próbkę o 125 μΐ. Próbki, które wykazywały pozytywny test czerwieni metylowej po 10 minutach inkubacji w temperaturze 30°C mierzono potem przez metodę miareczkowania (Versteeg i in. (1978), Lebensmittel.-Wiss.u.Technol., 11: 267-274).

SDS-PAGE/Westem blotting

Czystość frakcji PME badano przez SDS-PAGE, przy użyciu Pharmacia PhastSystem™ z żelami z 10-15% gradientem SDS. Elektroforezę i barwienie srebrem białek wykonano jako opisano w instrukcje od Pharmacia. Do określenia pI użyto żelów IEF 3-9 PhastSysten™.

185 172

Elektroforezy immunologicznej w żelu użyto do charakteryzacji przeciwciał poliklonalnych, które wzrosły przeciw PME z łupin pomarańczy. Frakcje enzymu oddzielono na SDS-PAGE i przeniesiono na papier NC techniką pół-suchą na jednostce do przenoszenia Semidry PhastSystem™. Papier NC inkubowano z pierwotnym przeciwciałem, rozcieńczonym 1:50 i barwiono z wtórnym przeciwciałem sprzężonym z fosfatazą, zasadową (Dako A/S Gisotrup, Dania) użytym w rozcieńczeniu 1:1000.

Mapowanie peptydu

PME trawiono albo trypsynąalbo endoproteaząLys-C z Lysobacter enzymogenes (oba preparaty enzymowe były klasy sekwencjonującej, nabyte z Boehringer Monachium, Niemcy).

100 pg oczyszczonego PME karboksymetylowano jodoacetamidem, aby zabezpieczyć zredukowane grupy SH. Potem białko odszczepiono trypsyną(4 (g/20-100 μΐ). Odszczepienie hydrolityczne przeprowadzono w temperaturze 40°C przez 2x3 godziny. Reakcję zatrzymano przez dodanie 20 pl TFA. Po wirowaniu przy 15 000 obrotów na minutę przez 5 minut peptydy oczyszczono na kolumnie HPLC z odwrotną fazą (kolumna Vydac 10 C18). Nałożono próbki 2 x 500 pl. Peptydy wymyto potem i oddzielono za pomocą wzrastającego gradientu acetonitrylu od 0,05-0,35% w 60 minut w 0,1% TFA. Peptydy zebrano ręcznie w rurkach Eppendorfa.

Do trawienia endoproteinazą Lys-C, liofilizowany PME (0,1 mg) rozpuszczono w 50 pl 8M mocznika, 0,4MNH₄HCO₃, pH 8,4. Po nalaniu^ i dodaniu 5 pl 45 mM DTT, białko denaturowano i redukowano przez 15 minut w temperaturze 50°C w atmosferze N2. Po ochłodzeniu do temperatury pokojowej, dodano 5 pl 100 mMjodoacetamidu, w celu derywatyzacji cystein przez 15 minut w temperaturze pokojowej, w ciemności, w atmosferze N2.

Uzyskane peptydy oddzielono jak opisano dla peptydów trawionych trypsyną.

Wybrane peptydy oczyszczano dalej na kolumnie Devosil 2 C₁₈ RP-HPLc 0,46 x 10 cm (Novo Nordisk, Dania). Oczyszczone peptydy nałożono potem na sekwencer aminokwasów, Applied Biosystems 476A, przy użyciu szybkich cykli pulsowania płynu (pulsed-liquid fast cycles).

Badanie 1

Podczas oczyszczania PME zamrożone łupiny pomarańczy homogenizowano i po precypitacji z 30-6-% (NH₄)₂SO₄ i dializie, próbkę nałożono na kolumnę kationowo-wymienną (CM-Sepharose™ CL-6B). PME wiąże się silnie z materiałem kolumny kationowo-wymiennej przy pH 6,8, podczas gdy większość białek nie wiąże się z kolumną, a więc podlega elucji podczas przemywania kolumny. Za pomocą wzrastającego gradientu NaCl, PME poddano elucji do dwóch pików z główną aktywnością w PME I (frakcją49-53) przy stężeniuNaCl, wynoszącym 0,25 M. Pomniejszy pik PME poddano elucji przy niższym stężeniu NaCl (frakcja 25-32). Dalsze oczyszczanie przeprowadzono tylko dla PME I, który zawierał najwyższą aktywność.

Po stężeniu frakcję PME oczyszczono dodatkowo, przy użyciu chromatografii żelowo-filtracyjnej (kolumna Sephacryl™ S-200). Frakcje, zawierające najwyższą aktywność PME zlano i zatężono na urządzeniu do dializy filtracyjnej amicon.

Z 600 g łupin pomarańczy otrzymano całkowitąilość blisko 4 mg PME, co odpowiada wydajności białka, wynoszącej 12%.

SDS-PAGE wykazała tylko jedną wstęgę białka w oczyszczonej frakcji PME, z MW, wynoszącym 36 000 D (fig. 2). Punkt izoelektryczny PME wykazał, że pI wynosił >9.

Charakteryzacja i dane kinetyczne

Charakteryzację PME i określenia optimów wykonano w całości metodą miareczkowania jako opisano w Materiałach i metodach.

Optimum pH aktywności PME mierzono z 0,5% pektyny limony (Grinsted™ Pectin 1450dostarczonej przez Danisco Ingredients, Danisco A/S) w 0,15 M NaCl. Dane ukazano w fig. 3. Optimum pH znajdowało się około 7-8.

Stabilność cieplną (temperaturową) PME określono przez inkubację próbki enzymu w rurkach Eppendorfa w różnych temperaturach przez 15 minut. Po inkubacji aktywność enzymu mierzono drogą tradycyjnego oznaczenia, metodą miareczkowania. Stabilność aktywności enzymu wynosiła 10°-40°C - patrz dane w fig. 5.

185 172

Powinowactwo do pektyny limony (Grinsted™ Pectin 1450 - dostarczonej przez Danisco Ingredients, Danisco A/S) określono za pomocą wykresu Lineweavera Burka stężenia różnych pektyn przeciw aktywności. Dane pokazuje się w fig. 6. K_m obliczono z krzywej i wynosiła ona 0,07%.

Odkryliśmy także, że PME mogła także deestryfikować pektynę cukru buraczanego. Pektyna cukru buraczanego zawiera 60% reszt kwasu galaktouronowego, których niektóre grupy karboksylowe są metylowane (przybliżony DE 60%) oraz, dodatkowo, niektóre grupy kwasu galaktouronowego są acetylowane przy C-2 i/lub C-3. Aktywność PME mierzono jak opisano w Materiałach i metodach, z wyjątkiem tego, że 1% pektyny cukru buraczanego rozpuszczonej w 0,15 M NaCl użyto w oznaczeniujako, że pektyna cukru buraczanego zawierała około 60% pektyny. Wyniki pokazały, że PME mógł deestryfikować pektynę cukru buraczanego, nawet mimo, że reszty kwasu galaktouronowego są acetylowane przy pozycjach C-2/C-3.

	Aktywność enzymatyczna (μ l/minutę/ml)
TM 0,5% pektyny limony (Grinsted Pectin 1450-dostarczonej przez Danisco	387
Ingredients, Danisco A/S) 1,0% pektyny cukru buraczanego	80

Dalsze doświadczenia pokazały, że PME według niniejszego wynalazku korzystnie wymaga NaCl do aktywności - patrz dane w fig. 7. Aktywność wzrasta ze zwiększającym się stężeniem NaCl, z optimum przy 0,25 M NaCl. Wyższe stężenia zmniejszają aktywność w porównaniu z aktywnością maksymalną.

Dalsze doświadczenia pokazały, że można zamienić NaCl innymi solami np. Na₂SO₄ lub NaNOj, do aktywności PME. Dane ukazuje się w fig. 8 i 9. Optimum aktywności znaleziono odpowiednio przy 0,2 M Na₂SO₄ i 0,3 M NaNO₂.

Analiza N-terminalna

Badania wykazały, że sekwencja N-terminalna natywnego PME była zablokowana. Odblokowanie uzyskano przez traktowanie PME odciśniętym na błonie PVDF z bezwodnym TFA przez 4 minuty w temperaturze 45°C, w rurkach. Po odparowaniu większości TFA rurki umieszczono w temperaturze 65°C przez 4 godziny (D.Wellner i in., (190) Proc.Natl. Acad.Sci.86H 947-1949). Otrzymaną sekwencją była SSSVTPNVVVAADSSGNFK i ta N-acetyloseryna jest N-terminalną resztą PME.

Lokalizacja immunohistologiczna

W celu sporządzenia próbek tkanki do immunohistochemii, cienkie płatki środkowej części dojrzałego owocu, utrwalono w 2% p-formaldehydzie, 0,25% aldehydzie glutarowym i 3% sachorozie buforowanej 0,05 M buforem fosforanowym pH 7. Po inkubacji przez 2 godziny w temperaturze 25°C i 63 godzinach w temperaturze 5°C próbki przemyło 3 x 20 minut w 0,05 M buforze fosforanowym pH 7.

Odwodnienie przeprowadzono, stosując szereg przemyć etanolem (50%, 70%, 80% i 96%), po czym 3 przemycia 99% etanolem (30 minut dla każdego stężenia etanolu). Po dodatkowym traktowaniu 2x2 godziny w ropie naftowej (Shellsol™D70k, Q7712) i 2 x 2 godziny w parafinie z 7% woskiem pszczelim, próbki osadzono w parafinie. Przekroje poprzeczne, wynoszące 12,5 m wykonano na piramitomie (pyramitome) Supercut 2050 Reichart Jung.

Immunologia

Przekroje tkankowe poddano inkubacji wstępnej z 20% surowicą świńską w TBS (0,5 M Tris/HClpH 7,5,0,15 MNaCl, 0,1%TritonX-100) przez30minut przed traktowaniem przez 1 godzinę przeciwciałami PME rozcieńczonymi 1:50 w TBS. Nadmiar przeciwciał usunięto przez przemycie TBS przez 5x5 minut. Po przemyciu przekroje inkubowano przez 30 minut z wtórnymi przeciwciałami sprzężonymi z fosfatazą zasadową 1:20 w buforze TBS. Nadmiar wtórnych przeciwciał usunięto przez przemycie TBS jak opisano powyżej. Przed barwieniem, przekroje traktowano buforem octanu weronalu pH 9,2 przez 5 minut i następnie barwiono Fast Red i fosforanem Naphtol AS-BI (Sigma nr N4875) przez 20 minut. Nadmiar odczynnika usunię24

185 172 to przez przemycie wodą. Próby kontrolne przebiegały równolegle i traktowane były surowicą wstępnie odpornościową.

Wyniki

Lokalizacja immunologiczna za pomocą przeciwciał wyhodowanych przeciw PME łupin wykazała, że PME jest umiejscowione w wielkich ilościach w zewnętrznej warstwie komórkowej lamelli między segmentami, w rdzeniu i zewnętrznej warstwie komórek torebek sokowych, a także w wewnętrznej warstwie komórek warstwy białej (patrz fig. 1). Wyniki te przedstawiają, że przeciwciało przeciw PME łupin reaguje krzyżowo z PME z miąższu (miąższ składa się z segmentów, patrz fig. 1), wskazując na wysoką homologię między PME umiejscowionym, odpowiednio w łupinie i w miąższu.

Badanie 2

PME z łupiny pomarańczy oczyszczono w wielkich ilościach. W związku z tym, wyizolowano około 70 mg PME z 5 kg łupin pomarańczy. Oczyszczony PME użyto potem w stosowaniu testu, przy użyciu białka mleka - to jest pitnego jogurtu. W teście tym, blokowo enzymatycznie deestryfikowana pektyna polepszyła właściwości stabilizowania białka w porównaniu z pektyną nie deestryfikowaną, przypuszczalnie z powodu utworzonej struktury blokowej. Produkt końcowy posiadał także korzystną lepkość.

Izoformy enzymu

Unikaj ąc wiązania się z teorią, uważa się, że PME według niniej szego wynalazku może istnieć w co najmniej dwóch izoformach. Izoforma S posiada ciężar cząsteczkowy, wynoszący około 36 KD i możnająprzytaczać jako „krótki PME”. Izoforma L posiada ciężar cząsteczkowy, wynoszący około 64 KD i można ją przytaczać jako „długi PME”.

Uważa się także, że izoforma L jest bardziej stabilna cieplnie niż izoforma S. Uważa się także, że izoforma S zaczyna inicjalny etap deestryfikacji w sposób blokowy i jest potem wypierana przez izoformę L.

Innymi słowy, uważa się, że izoforma L może mieć większe powinowactwo do częściowo deestryfikowanej pektyny niż izoforma S.

Uważa się, że stabilność cieplna izoformy L może być spowodowana sekwencją aminokwasową przedstawionąjako SEQ ID nr 5.

Dalsze badania pokazały, że gen dla izoformy L ma przedłużenie N-terminalne w górę od sekwencji sygnałowej. Pokazano to schematycznie w fig. 12.

Izolacja, i charakteryzacja cDNA kodujących metyloesterazę pektynową możliwą do otrzymania z pomarańczy.

Materiały i metody dla biologii molekularnej

1. Materiały

Użyto pomarańczy (Citrus sinensis)var. Navel pochodzących z Maroka.

2. DNA

Genomowy DNA izolowano jak opisano u S.L.Dellaporta (1983) Plant.Mol.Biol.Rep. 1(4): 19-21. Plazmid DNA izolowano jak opisano w EP-B-0 470 145.

3. RNA

Wyizolowano całkowity RNA z dojrzałych owoców pomarańczy. Zewnętrznej części miąższu i wewnętrznej części warstwy białej (patrz fig. 1) owocu pomarańczy Navel, użyto do izolacji RNA postępując zgodnie z procedurąopisanąprzez J. Logemanna, J.Schella i L.Willmitzera (1987)

Anal.Biochem. 163:16-20. „Improved Method for the isolation of RNA from Plant Tissues”.

4. PCR

Całkowitego RNA użyto do wykonania odwrotnej PCR za pomocąrTth Reverse PCR Kit (Perkin Elmer) zgodnie z instrukcjami dostawców, z następującymi cyklami temperatur:

Odwrotna transkrypcja:

70°C 2 minuty

185 172

60°C 2 minuty

50°C 2 minuty

45°C 5 minut

40°C 5 minut

30°C 10 minut

42°C 10 minut

70°C 2,5 minuty 5°C nasycenie

Powielenie (PCR):

94°C 2 minuty

92°C 1 minuta

45°C 2 minuty

72°C 2 minuty w 45 cyklach

72°C 5 minut 5°C nasycenie

5. Kloning fragmentów PCR

Fragmenty PCR klonowano do miejsca EcoRV wektora pT7Blue (Novagen) postępując zgodnie z instrukcjami dostawców.

6. Sekwencjonowanie DNA

DNA o podwójnym łańcuchu sekwencjonowano zasadniczo według metody dideoksy Sangera i in. (1979), przy użyciu Auto, Read Sequencing Kit (Pharmacia) i sekwencera DNA Pharmacia LKB A.L.F. (odnośniki: F.Sanger, S. Nicklen i A.R.Coulson (1979). DNA Sequencing with chaindetermination inhibitors. Proc.Natl.Acad.Sci.USA74:5463-5467). Primery użyte do sekwencjonowania wymienia się poniżej (przedstawione od 5' do 3'):

UNI (primer M13-20) - 17-mer

GTAAACGACGGCCAGT

REV-19-mer

GGAAACAGCTATGACCATG

01-20-mer

GACAACGGCAACGAGCCTCA

02-22-mer

GCACTTGTAATAACCCTAAAT

03-20-mer

CAGGGTAGTTTCCCGACGTA

04-20-mer

TACGTCGGGAAACTACCCTG

05-21-mer

CTCCTGGAAGCTTCATTGCTG

06-20-mer

GAAGCTTCTTGAAGAGAACG

07-20-mer

CGTTCTCTTCAAGAAGAAGCTTC

08-22-mer

GAGGATAGCATGATGAGGCTCG

09-22-mer

GCAGTTCACAAAGAACTGGCGG

010-22-mer

CCTCATGATCATCATGTCAGTG

011-21-mer

GCTCCTCAGGGAGGCACTAAG

012-21-mer

CAGCAATGAAGCTTCCAGGAG

013-21-mer

CTTAGTGCCTCCCTGAGGAGC

014-18-mer

GCCACCGCCTGGTGCTTT

015-18-mer

AAGCACCAGGCGGTGGC

016-20-mer

GCGGGCTGCGTTGTCAGACG

017-20-mer

GAGGCACTAAGCGGTATATT

018-18-mer

GCAACTGTAGCAGACTTG

019-20-mer

CACTGACATGATGATCATGA

020-20-mer

CAATTAAGCAGTTCACAAAG

021-20-mer

AATATACCGCTTAGTGCCTC

Sekwencj ono wana sekwencja nukleotydowa ukazana jest jako SEQ ID nr 3 (pochodząca odpO17) i SEQ ID nr 4 (pochodząca od pO34). Sekwencja N-terminalna pokazana jestjedco SEQ ID nr 6.

7. Skrining biblioteki

Bibliotekę cDNA w lambda zapił (Stratagene), którą sporządzono z mRNA izolowanego z miąższu i warstwy białej owocu pomarańczy, poddano skriningowi z odpowiednią sondą PCR znakowaną radiologicznie. Skrining przeprowadzono zgodnie z instrukcjami dostawców z wyjątkiem tego, że prehybrydyzację i hybrydyzację przeprowadzono w 2 x SSC, 0,1% SDS, 10 x Denhardt i 10 pg/ml DNA denaturowanego nasienia łososia. Hybrydyzacja zachodziła przez noc w temperaturze 67°C. Filtry przemyto dwukrotnie w 2 x SSC, 0,1 % SDS, dwukrotnie w 1x SSC, 0,1% SDS i dwukrotnie w 1 x SSC, 0,1% SDS.

8. Sonda

Klonowany fragment PCR izolowano z wektora pT1 blue, przez trawienie odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi. Fragment wydzielono z wektora przez elektroforezę na żelu agarowym i fragment oczyszczono oraz znakowano radiologicznie, przy użyciu zestawu do znakowania DNA Ready to Go™ (Pharmacia).

9. Analiza Southern

Genomowy DNA pomarańczy lub DNA plazmidowy trawiono odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi, przeniesiono na błony Hybond+™ i hybrydyzowano postępując zgodnie z instrukcjami dostawców (Amersham).

10. Doświadczenia hybrydyzacji in situ

Technika hybrydyzacji in situ opiera się o zasadę hybrydyzacji antysensownej sekwencji rybonukleotydowe z mRNA. Technikę stosuje się do uwidocznienia obszarów w mikroskopijnych przekrojach, gdzie obecny jest wymieniony mRNA. W tym szczególnym przypadku technikę stosowano do lokalizacji mRNA, kodującego enzym metyloesterazę pektynową w przekrojach C.sinensis.

Sporządzanie próbek tkanki do hybrydyzacji in situ.

Cienkie płatki środkowej części dojrzałego owocu pomarańczy, umocowano przez utrwalenie za pomocąutrwalania FAA (45% etanol, 5% formalina (40% p-formaldehyd) i 5% kwas octowy) i inkubację przez 2 godziny w temperaturze 25°C i 63 godziny w temperaturze 5°C. Próbki myto przez 3 x 20 minut w 0,05 M buforze fosforanowym, pH 7. Przeprowadzono odwodnienie, przy użyciu szeregu przemyć etanolem (50%, 70%, 80%, 96%) kończąc 3 myciami w 99% etanolu. Każde mycie trwało 30 minut. Próbki traktowano potem ropą naftową (Shellsol™D70k, Q7712)2x2 godziny i przez następne 2x2 godziny w parafinie z 7% woskiem pszczelim. Potem

185 172 próbki osadzono w parafinie. Przekroje poprzeczne, wynoszące 12,5 pm wykonano przy użyciu piramitomu (pyramitome) Supercut 2050 Reichart Jung.

Sporządzenie sond znakowanych ³⁵S do hybrydyzacji in situ

Fragment PCR o 501 bp z drugiego powielenia PCR klonowano do wektora pT7blue (Novagen) w obu kierunkach. Wektor pT7 zawiera promotor T7. Transkrypcja antysensownego RNA i sensownego RNA kierowana była przez promotor SP7 po trawieniu plazmidu BamHI. Maxiscript Kit™ (Ambion) stosowano z następującymi modyfikacjami. Produkty transkrypcji przebiegały na 6% żelu do sekwencjonowania, aby usunąć wprowadzone nukleotydy i poddano elucji buforem do elucji dostarczonym z zestawem do transkrypcji in vitro polimerazy RNA T7 (Ambion). Produkty transkrypcji, zawierały 55 nukleotydów niekodujących przy jednym końcu, a także 9 nukleotydów niekodujących na drugim końcu. Do hybrydyzacji użyto 10⁷ cpm/ml sondy znakowanej ³5S.

Hybrydyzację in situ przeprowadzono zasadniczo jak opisano u J.A.Langedale(1994) w Maize Handbook - M. Freeling i V.Walbot, wyd., strony 165-180 Springer-Verlag, Nowy Jork, Inc. Odkryto, że temperaturą optymalną było 57°C. Po przemyciu w temperaturze 57°C przekroje pokryto emulsją fotograficzną Kodak K-5 i pozostawiono na 3 dni w temperaturze 5°C w ciemności.

11. Wyniki

Następującą kolejność informacji stosowano do utworzenia primerów do reakcji PCR wspomnianej poniżej i do sprawdzenia sekwencji aminokwasowej utworzonej przez odpowiednie sekwencje nukleotydowe - patrz załączone SEQ ID nr 7-19.

Sekwencje peptydowe metyloesterazy pektynowej użyte do utworzenia primerów

Asn Cys Asp Met Leu Ala Tyr Gin Asp Thr Leu Tyr (PE492B)

Val Ile Thr Ser Ala Thr Glu Ala Gln Ala Ohe Thr Pro Gly Ser Phe Ile Ala Gly Ser Ser Trp Leu Gly Ser Thr Gly Phe (PE701)

Sekwencja aminokwasowa (PE492B.4-7) użyta do utworzenia primera A (Met Leu Ala Tyr Gin Asp Thr)

Primer A

ATG(CT)T(GATC)GC(GATC)TA(TC)CA(AG)GA(TC)AC 256 miesz

Sekwencja aminokwasowa (PE701,7-13) użyta do utworzenia primera B (Glu Ala Gin Ala Phe Thr Pro)

Primer B

GT(AG)AA(GATC)GC(TC)TG(GATC)GC(TC)TC 128 miesz

Utworzenie fragmentu DNA PCR częściowo kodującego metyloesteraze pektynową

Sekwencje aminokwasowe dwóch peptydów nie okrążających (opisanych powyżej) stosowano do utworzenia mieszanych oligonukleotydów'. Były one użyte jako primery do odwrotnej transkrypcji i następującego po niej powielenia (PCR) całkowitego RNA. Uzyskany klon PCR sekwencjonowano i miał on insert o 501 bp. Przypuszczalna sekwencja aminokwasowa z sekwencji nukleotydowej odpowiadała prawie doskonale sekwencjom peptydowym podanym w SEQ ID nr 7-19.

Analiza hybrydyzacji in situ

Doświadczenia hybrydyzacji in situ (patrz Materiały i metody) za pomocąrybosond (wytworzonych z odpowiednich klonów PCR) przeciw mRNA metyloesterazy pektynowej, wykazały silną hybrydyzację w zewnętrznej warstwie komórkowej lamelli między segmentami (patrz fig. 1) . Silne sygnały otrzymano także z zewnętrznej warstwy torebek sokowych, wewnętrznej warstwy, warstwy białej i rdzenia. Wyniki te odpowiadają bardzo dobrze wynikom lokalizacji immunologicznej widocznej z przeciwciałem wyhodowanym przeciw PME łupin jak opisano poprzednio.

Analiza Southern

Analiza Southern wykazała, że dodatkowe kopie i izolowane geny PME (reprezentowane przez klony cDNA) sąobecne w genomie C.sinensis. Te inne geny PME były raczej homologiczne z tymi reprezentowanymi w pO 17 i pO34. W związku z tym, obserwowaliśmy w każdym prze28

185 172 biegu jedną wstęgę silnego sygnału hybrydyzacji, dwie wstęgi średniego sygnału hybrydyzacji i co najmniej jeszcze dwie wstęgi słabszego sygnału, w porównaniu z resztą. Ten wzór wskazuje, że C.sinensis posiada co najmniej 5-7 kopii genów PME w genomie.

Izolacja i charakteryzacja nowych cDNA PME

Bibliotekę w lambda zapił (Stratagene), którą sporządzono jak opisano w Materiałach i metodach, poddano skriningowi za pomocąznakowanego radiologicznie insertu o 501 bp z klonu PCR. Zidentyfikowano kilka hybrydyzujących klonów i DNA plazmidu cięto in vivo według instrukcji dostawców. Wielkość insertów cDNA w klonach określono przez trawienie EcoRV i Smal, po czym przez elektroforezę na żelu agarozowym. Wielkość insertujednego klonu p034 wynosiła około 2 kb, podczas gdy wielkość insertu innego klonu pO17 wynosiła około 1,4kb. Klony te poddano selekcji do dalszej analizy. Określono sekwencje nukleotydowe i są one pokazane jako SEQ ID nr 3 i SEQ ID nr 4 odpowiednio dlapO17 i pO34.

Otwarta ramka odczytu w 034, zaczynająca się przy nukleotydzie 29 i kończąca się przy nukleotydzie 1780, koduje PME o 584 aminokwasach, włączając przypuszczalny peptyd sygnałowy. Możliwe miejsce rozszczepienia między glicyną w pozycji 46 i izoleucyną w pozycji 47 można przewidzieć zgodnie z regułami G. vonHeijnego (1986) Nuci.Acids Res. 14,4683-4690 „Anew Method for predicting signal sequence cleavage sites”, dając przez to długi dojrzały enzym PME o 538 aminokwasach, posiadający obliczony ciężar cząsteczkowy, wynoszący 58386 daltonów. Ciężar cząsteczkowy długiego PME, włączając sekwencję sygnałową można obliczyć na 63502 daltony. Sekwencja nukleotydową p034 obejmuje region 5' nie poddany translacji o 29 nukleotydach i region 3' nie poddany translacji o 186 nukleotydach, kończąc się w ogonku poli A.

Otwarta ramka odczytu w O17 rozpoczyna się przy nukleotydzie 18 i kończy przy nukleotydzie 1103. Koduje ona krótki PME o 362 aminokwasach, włączając peptyd sygnałowy o 44 aminokwasach. Przypuszczalne miejsce rozszczepienia można przewidzieć między glutaminą w pozycji 44 i seryną w pozycji 45, pozostawiając dojrzały krótki PME, rozpoczynający się sekwencją aminokwasową Ser-Ser-Ser-Yal-Thr-Pro. Ta sekwencja N-terminalna jest identyczna z N-terminalną sekwencją aminokwasową oczyszczonego PME krótkiego typu jaki opisano w części biochemicznej. Sekwencje aminokwasowe otrzymane z oczyszczonego enzymu były zorientowane tak jak przypuszczalna sekwencja aminokwasowa pO17. Pełną identyczność znaleziono dla fragmentów peptydu.

Istniała prawie pełna identyczność między wszystkimi sekwencjonowanymi peptydami i przypuszczalną sekwenec ą aminokwasową w pO17, a także z sekwencj ją aminokwasową wnioskowaną z p034, długiego PME. Z tego względu, pO17 różni się wjednej pozycji aminokwasu (nr 24 2 sekwencji kodującej dojrzały polipeptyd). Dojrzałe krótkie białko PME ma ciężar cząsteczkowy obliczony na 33954 daltony. Obliczony ciężar cząsteczkowy postaci krótkiego PME, włączając peptyd sygnałowy, wynosi 39088 daltonów. 017 obejmuje region 5' nie poddany translacji o 17 nukleotydach i region 3' nie poddany translacji o 180 nukleotydach, kończąc się w ogonku poli A.

Główną różnicą między długim i krótkim enzymem PME jest przedłużenie N-terminalne o 220 aminokwasach obecne w dojrzałym enzymie pochodzące od O34 i obecne jako SEQ ID nr 5. Odpowiadającą sekwencje nukleotydową, kodującą ten region długiego enzymu PME, pokazuje się jako SEQ ID nr 6.

Ekspresja PME w drobnoustrojach

Sekwencję DNA, kodującąalbo długą albo krótkąpostać PME, wprowadzono do drobnoustrojów, w celu wytworzenia rekombinowanego enzymu w wielkich ilościach, posiadającego wysoką specyficzną aktywność do użytku w traktowaniu enzymatycznym pektyny.

Ekspresja w Pischia pastoris

Konsbrukcca pJK10, pJK11 i pJK12 (patrz fig. 13-15)

Plazmidu p024 użyto jako matrycę w reakcji PCR z następującym zbiorem primerów:

5'-GAATTCATTGTCGCCGGAGTGAAC-3' z miejscem EcoRl w jednym końcu oraz

5'-AAGACCAGAGACCTATGGATCCAC-3' z miejscem BamHI przy końcu.

185 172

Łącząc AmpliTaq^R DNA Polymerase (perkin Elmer), DNA matrycy, dATP, dGTP, dCTP i dTTP oraz dwa primery w następującym buforze: 60 mM Tris-HCl (pH 8,5), 15 mM (NH4)2SO4 i 1,5 mM MgCl2 oraz stosując następujący cykl temperaturowy:

94°C 2 minuty

94°C 1 minuta

55°C 2 minuty

72°C 2 minuty w 35 cyklach

72°C 2 7 minutach 5°C nasycenie wytworzono oczekiwany produkt PCR o 1690 bp, który oczyszczono i subklonowano do wektora pY7Blue (z Novagen) postępując zgodnie z instrukcjami dostawców.

Otrzymane klony (nazywane pT7-034), zawierające fragment EcoRI-BamHI oczekiwanej wielkości, weryfikowano dodatkowo przez sekwencjonowanie DNA (patrz Materiały i metody dla biologii molekularnej). Subklon pT7-034, zawierający prawidłową sekwencję trawiono EcoRl i BamHI i fragment o 1685 bp oczyszczono i subklonowano do wektora Pischia pastoris pHIL-S1 (z Invitrogen) trawionego tymi samymi enzymami.

Sekwencję, kodującą dojrzałą postać PME klonowano w ten sposób w ramce z sygnałem sekrecji(S)PHO1 wwektorze. Otrzymany plazmid nazywa się pJK10 i pokazany jest w fig. 13.

Aby wytworzyć pJK11 (patrz fig. 14) fragment EcoRJ-BamHIklonu pT7-O34, subklonowano dalej do wektora pBSK- (od Stratagene) trawionego takimi samymi enzymami. Potem, fragment EcoRI-Notl z jednego z otrzymanych klonów (zweryfikowanych przez sekwencj onowanie DNA) subklonowano do wektora ekspresji Pischia pastoris pPIC9 (od Invitrogen) trawionego takimi samymi enzymami. Umieszcza to ramkę odczytu, kodującą dojrzałe białko, długiej postaci PME, w dół i w ramce z sygnałem sekrecji (S) czynnika alfa w ppIC9, patrz fig. 14.

Dodatkowo, fragment EcoRI-Notl z pT7-O34 także subklonowano do wektora pPIC9K (Invitrogen), tworząc plazmid pJK 12 pokazany w fig. 15. JedynąróżnicąmiędzypJK11 ipJK12 jest gen, kodujący oporność na kanamycynę i jest on usytuowany w pJK12.

Zarówno sygnał sekrecji PHO1 w pJK10 jak i sygnał sekrecji alfa w pJK11 i pJK12, może kierować sekrecją dojrzałego polipeptydu, kodującego długą postać PME.

Konstrukcja pJK20, pJK21 i pJK22

Użyto plazmidu p017 jako DNA matrycy w reakcji PCR z następującymi primerami:

5'-GAATCTCCTCGTCGGTGACAcCG-3' z miejscem EcoRl na jednym końcu oraz

5'-AAGACCAGAGACCTATGGATCCAC-3' z miejscem BamHI przy końcu.

DNA matrycy, polimerazę AmpliTaqR dATP, dGTP, dCTP i dTTP połączono z buforem (60 mM Tris-HCl, pH 8,5; 15 mM (NHL4)2SO4 i 15 mM MgCR) i umieszczono w termobloku z następującym cyklem temperaturowym:

94°C 2 minuty

94°C 1 minuta

55°C 2 minuty

72°C 2 minuty w 35 cykli

72°C w 7 minut

5°C nasycenie

Wytworzyło to oczekiwaną wstęgę PCR o 1008 bp, którą oczyszczono i subklonowano do pT7Blue (Novagen). Otrzymane klony weryfikowano przez sekwencionowanie DNAjak wytłumaczono powyżej. Plazmid z prawidłową sekwenecątrawiono EcoRl i BamHI i otrzymany fragment subklonowano dalej do wektora pHIL-S 1 (Invirrogen), otrzymamy wektor nazywa się JJK20 (pokazany w fig. 16) i w nim jest region, kodujący dojrzały polipeptyd krótkiej postaci PME usytuowany w ramce i w dół od sygnału sekrecji PHO1.

Plazmid pJK21 i pJK22 zmontowano w ten sam sposób jak wytłumaczono dla pJK11 i pJK12 z wyjątkiem tego, że fragment EcoRI-Notl uzyskano z klonu pBSK-O17. Fig 17 i 18pokazująotrzymane plazmidy, gdzie region, kodujący dojrzały polipeptyd leży w dół, i wramce, od sygnału sekrecji alfa, odpowiednio w pPIC9 i ppIC9K.

185 172

Wprowadzenie długiej lub krótkiej postaci PME do Pischla pastoris przez tworzenie i trasformację sferoplastu

Plazmidy pJK1O, pJK11, pJK12, pK20, pJK21 i pJK22 wprowadzono w oddzielnych doświadczeniach do komórek GS115 Pischia pastoris.

Z tego względu, sporządzono sferoplasy z komórek GS115, hodowanych w pożywce dekstrozowej peptonu ekstraktu z drożdży (YPD) w temperaturze 28-30°C. Wytwarzanie sferoplastów i transformację wykonano jak opisano w zestawie do ekspresji Pischia: instrukcja obsługi (Invitrogen). Otrzymane transformanty Pischia pastoris Mut+ lub Mut^s analizowano potem pod względem ekspresji rekombinowanego genu PME przez testowanie supematantu pod względem aktywności PMe, przy użyciu metod opisanych w Materiałach i metodach dla biochemii.

Skrining transformantów pod względem wysokiej ekspresji długiej lub krótkiej postaci PME.

Przypuszczalne pozytywne transformanty hodowano dodatkowo w pożywce minimalnej (albo Minimal Dextrose Medium albo Minimal Glycerol Medium jak wyszczególniono w instrukcji obsługi zestawu ekspresji Pischia, Invitrogen) i genomowy DNA izolowano i analizowano przez PCR jak opisano w instrukcji obsługi.

Klony pozytywne znalezione w początkowym przesiewie; które także wytwarzały wstęgę PCR oczekiwanej wielkości, poddano selekcji i hodowano dalej w kolbie w temperaturze 28-30°C, postępując zgodnie z procedurą opisaną w instrukcji obsługi Pischia.

Co najmniej 10 zweryfikowanych rekombinowanych klonów z każdej konstrukcji (pJK10, pJK11, pJK12, pJK20, pJK21 i pJK22) poddano skriningowi pod względem sekrecji PME i ich odpowiednich poziomów ekspresji, mierzono w czasie przez próbkowanie co 2-6 godzin. Komórki w próbkach granulowano i supernatant testowano pod względem aktywności PME postępując zgodnie z metodami wyjaśnionymi w materiałach i metodach dla biochemii.

Klony otrzymane po trasformacji albo z pJK12 albo z pJK22 poddano wstępnej selekcji, przy użyciu zintegrowanego genu oporności na kanamycynę jako genu selektorowego, jaki opisano u Y.Laroche’a i in. (1994) Bio/Technology tom 12, strony 1119-1124. W ten sposób otrzymano wielokrotne kopie transformantów integracyjnych i poddano je dalszemu skriningowi jak opisano powyżej.

Transformanty reprezentujące albo długą albo krótkąpostać PME i wykazujące ekspresję rekombinowanego białka na wysokim poziomie, poddano selekcji i dalej analizowano przez analizę Western biot (patrz materiały i metody dla biochemii).

Oczyszczanie i charakteryzacja rekombinowanego PME

Rekombinowane białko PME oczyszczono z supematantu hodowlanego, przy użyciu procedur opisanych w materiałach i metodach dla biochemii, jak konieczne.

Przewidywaną stabilność w wysokiej temperaturze długiej postaci PME zweryfikowano przez testowanie aktywności enzymatycznej po inkubacj i w różnych temperaturachj ak obj aśniono w części Charakteryzacja i dane kinetyczne. Oczyszczone rekombinowane enzymy (zarówno długajak i krótka postać PME) charakteryzowano dalej jak objaśniono w części Charakteryzacja i dane kinetyczne. Analizy te wykazały, że oba typy posiadały optimum pH około 7-8 i stabilność temperaturowa krótkiego rekombinowanego pMe okazała się wynosić 10-40°C i do 80°C dla długiego rekombinowanego PME.

Ekspresja w Aspergillus niger

W innej postaci realizacji, p034 lub pO17 trawiono odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi i sekwencję kodującą dla długiej lub krótkiej postaci PME według niniejszego wynalazku klonowano do wektora ekspresji Aspergillus pBAMTE1 (zawierającego promotor oporności na metylotryptofan z Neurospora crassa) w celu ekspresji w Aspergillus niger (Pall i in. (1993) Fungal Genet.Newslett. tom 40 strony 59-62).

Sporządzono protoplasty według Daboussiego i in. (Curr.Genet. (1989) tom 15, strony 453-456) przy użyciu enzymów lizy Sigma L-2773 i litykazy Sigma L-8012. Transformacja protoplastów postępowała zgodnie z protokołem ustanowionym przez Buxtona i in. (Gene (1985) tom 37, strony 207-214) z wyjątkiem tego, że dla powlekania protoplastów następował protokół

185 172 naszkicowany u Punta i in. (methods in Enzymology (1992) tom 216, strony 447-457) lecz z użyciem 0,6% osmotycznie stabilizowanej agarozy powierzchniowej.

Wyniki pokazały, że aktywność oczyszczonego PME pomarańczy była możliwa do otrzymania z hodowli Aspergillus Niger-.

Zastosowania

Wpływ pektyny traktowanej PME pomarańczy na lepkość i stabilność napój ów białkowych

Metody

Enzymatyczne traktowanie pektyny PME możliwym do uzyskania z pomarańczy

Partię enzymatycznie traktowanej pektyny wytworzono jak następuje:

125 g pektyny rozpuszczono w gorącej wodzie przy energicznym mieszaniu. Dodano 45,3 g NaCl (klasa odczynnika) i objętość wyregulowano do 4,0 litrów wodą. Roztwór ten mieszano dopóki sól nie rozpuściła się. Roztwór pektyny ochłodzono do 40°C i pH zwiększono do pH 7,0 przy użyciu 1N NaOH (klasa odczynnika) i energicznie mieszając. Dodano odpowiedniąpróbkę PME z pomarańczy i reakcję enzymatyczną kontynuowano do uzyskania żądanego stopnia deestryfikacji. pH utrzymywano stałe na poziomie 7 przez automatyczne dawkowanie 1N NaOH (klasa odczynnika), podczas okresu inkubacji, a reakcja enzymatyczna postępowała po zużyciu NaOH. ,

Gdy próbka pektyny osiągnęła żądany stopień deestryfikacji, zaprzestano dodawania NaOH, pH roztworu obniżono do około 3,0 przez dodanie 2% HC1. Roztwór pektyny ogrzano potem do 70°C przez 5 minut do całkowitej inaktywacji enzymu. Traktowanąpektynę strącono 1 objętością izopropanolu, przemyło 60% izopropanolem i odciśnięto do około 50% suchej masy. Partię pektyny z enzymem suszono potem na powietrzu w temperaturze 40°C i na koniec zmielono na suchy proszek.

Protokół

Oznaczenie próbek pektyny dla indeksu wrażliwości wapnia (CF)

Wrażliwość wapnia mierzy sięjako lepkość pektyny rozpuszczonej w roztworze z 57,6 mg wapnia/g pektyny, dzielonej przez lepkość dokładnie tej samej ilości pektyny w roztworze, ale bez dodawania wapnia. Brak wrażliwości pektyny na wapń ma wartość CF 1.

4,2 g próbki rozpuszcza się w 550 ml gorącej wody, energicznie mieszając. Roztwór ochładza się do temperatury około 20°C i pH doprowadza do 1,5 za pomocą 1N HC1. Roztwór pektyny dopełnia się do 700 ml wodą i miesza. 145 g tego roztworu mierzy się w 4 naczyniach do mierzenia lepkości. 10 ml wody dodano do dwóch z tych naczyń (podwójne określenia) i 10 ml 250 m roztworu CaCl2 dodano do innych dwóch naczyń, przy mieszaniu.

Dodano 50 ml buforu octanowego (0,5 M, pH około 4,6) do wszystkich czterech naczyń do mierzenia lepkości w trakcie efektywnego mieszania magnetycznego, doprowadzając w ten sposób pH roztworu pektyny do powyżej pH 4,0. Magnesy usunięto i naczynia pozostawiono przez noc w temperaturze 20°C. Lepkości mierzy się następnego dnia lepkościomierzem Brookfielda. Indeks wrażliwości wapnia oblicza się następująco:

_ _ Lepkość roztworu z 57,6 mg Ca²⁺ / g pektyny _ΛΛCp ' zt X 100

Lepkość roztworu z 0,0 mg Ca / g pektyny

Oznaczenie stopnia estryfikacji próbki pektyny (%DE)

Do 50 ml 60% izopropanolu i 5% roztworu HC1 dodaje się 2,5 g próbki pektyny i miesza przez 10 minut. Roztwór pektyny filtruje się przez szklany filtr i przemywa 15 ml 60% izopropanolu/5% roztworem HC1 6 razy, po czym dodatkowo przemywa się 60% izopropanolem, aż przesącz będzie wolny od chlorków. Przesącz suszy się przez noc w temperaturze 80 °C.

20,0 ml 0,5 N NaOH i 20,0 ml 0,5 N HC1 łączy się w kolbie stożkowej i dodaje 2 krople fenoloftaleiny. Miareczkuj e się to z 0,1N NaOH, do uzyskania trwałej zmiany koloru. 0,5 N HC1 powinno być nieznacznie mocniejsze niż 0,5 N NaOH. Dodaną objętość 0,1N NaOH zapisuje się jako V_o

185 172

0,5 g wysuszonej próbki pektyny (przesącz) odmierza się do kolby stożkowej i próbkę zwilża 96% etanolem. Dodaje się 100 ml świeżo gotowanej i ostudzonej wody destylowanej i uzyskany roztwór miesza do całkowitego rozpuszczenia pektyny. Potem dodaje się 5 kropli fenoloftaleiny i roztwór miareczkuje się z 0,1 NNaOH (aż do zmiany koloru i pH do 8,5). Użytą tutaj ilość 0,1 NNaOH zapisuje sięjako Vj. Dodaje się 20,0 ml 0,5 NNaOH, wstrząsa energicznie kolbąi później odstawia na 15 minut. Dodaje się 20,0 ml 0,5 N HC1 i wstrząsa kolbą aż do zniknięcia różowego koloru. Następnie dodaj e się 3 krople fenoloftaleiny i potem uzyskany roztwór miareczkuje z 0,1 N NaOH. Użytą objętość 0,1 N NaOH zapisuje sięjako V2.

Stopień estryfikacji (%DE wszystkich grup karboksylowych oblicza się następująco:

% DE = v₂-v₀ ν,+(ν₂-ν₀)

Produkcja jogurtu

Znormalizowane mleko odtłuszczone (przygotowane przez zmieszanie mleka w proszku z odpowiednią, obj ętościąwody) ogrzewano w temperaturze 90°C przez 5 minut i następnie homogenizowano w 200 kp/cm3 i mleko schłodzono do temperatury 31°C. Dodano kultury jogurtowe i mleko fermentowało do pH około 4.0. Jogurt ochłodzono do temperatury około 20°C i dodano próbkę pektyny jako nasycony roztwór cukru (około 65% cukru) i mieszano przez 15 minut. pH doprowadzono do 4,0 za pomocą kwasu mlekowego. Jogurt pasteryzowano w temperaturze 88°C przez 15 sekund i homogenizowano w 150 kp/cm3, potem ochłodzono do temperatury 20°C i nalano do sterylnych 350 ml kapslowanych butelek (200 ml/butelkę).

Końcowy produkt składał się z: 7,6% MSNF (zawartości stałych części mleka), 9,15% cukru i 0,25% lub 0,35% próbki pektyny dające odpowiednio suchej masy 17,0% lub 17,1%).

Oznaczanie lepkości napojów jogurtowych

Lepkość próbki jogurtu określono (podwójne określenie), używając albo Reometru Bohlina™ (dostarczanego przez Bohlin Instruments) z szybkością ścinania 18,5 - 46,0 lub używając Stress Tech™ (przyrządy Reologica AB) z tą samą, szybkością ścinania.

Mierzenie trwałości białka przez test wirówkowy g próbki (np. pitnego jogurtu) wiruje się w temperaturze 10°C, 2300 x g przez 20 minut. Supematant jest wydalany i naczynie do wirowania umiejscawia się dnem do góry na 30 minut. Naczynie obciąża się i % osadzania oblicza się następująco:

_n/ » , . Wgt naczynia po wirowaniu-Wgt naczynia % Osadzania =-^£----Wgt próbki

Gdzie Wgt = obciążenie, a wirowanie = odwirowywanie

Stabilność białka jako określona przez rozkład wielkości cząsteczki w próbce

Rozkład wielkości cząsteczki próbki jogurtu określono przy użyciu objętościomierza Malvern 2600 Easy™. Wielkość cząsteczki określa się przez światło lasera rozproszone w tej metodzie, 1 ml próbki jogurtu dodano do 9 ml odpowietrzonego roztworu buforowego (30,7% 0,1 M kwasu cytrynowego, 19,3 % 0,2 M Na2HPO4 i 50,0% wody) i mieszano. Odpowietrzony bufor dodaje się do menzurki i mieszaninę próbka/bufor dodaje kroplami aż do otrzymania optymalnego stężenia. Średni rozmiar cząsteczki oblicza się z pomiarów;

Jogurt z cząsteczkami o przeciętnych rozmiarach, wynoszących poniżej 3 pm jest uważany za raczej stabilny podczas, gdy jogurt z cząsteczkami o przeciętnych rozmiarach, wynoszących więcej niż około 10 pm uznaje się za niestabilny dla długiego terminu przechowywania.

Ustalenie długiego terminu trwałości

Próbki przechowywano w temperaturze 4°C lub w temperaturze otoczenia i mierzono oddzielenie serwatki (w mm serwatki od wierzchołka próbki, w butelce). Próbkę nalano do 250 ml niebieskich, kapslowanych butelek (podwójne oznaczenie). W każdym wypadku głębokość próbki była zbliżona do 70 mm - co odpowiadało znakowi 200 ml dla każdej butelki.

185 172

Przykład 1

Napój z kwaśnego mleka

Celem dodawania pektyny do napoju z kwaśnego mleka (np. napojujogurtowego) jest produkcja napoju tak aby zachował fizycznąjednorodność podczas bakteriologicznego i organoleptycznego okresu przydatności do picia. W dodatku obróbka napoju jogurtowego pod kątem długiego okresu przechowywania destabilizuje białko w napoju, dając napój ze wzrostem piaskowych odczuć smakowych i wykazując raczej szybką synerezę, jeśli nie doda się pektyny.

Obróbka pektyny

Dostępną w handlu pektynę wysoko estrową; Grinsted™ Pectin URS (typ pektyny Ultra Rapid Set) wybrano jako pektynę macierzystą, zgodnie z jej wysokim stopniem estryfikacji (%DE 82, patrz fig. 19). Obróbkę pektyny macierzystej enzymem PME z pomarańczy tłumaczy się w sekcji metodologicznej.

Reakcję enzymatyczną zatrzymano i otrzymaną w wyniku pektynę doświadczalną (nazywanąpektynąnr 19^^4-96-2) badano pod wględem stopnia estryfikacji, metodą opisaną w części metodologicznej. W dodatku, aby porównać dwa typy pektyn, pektyny macierzystej i pektyny obrabianej, za pomocą, znanego typu pektyny dobrego komercyjnego napojujogurtowego, Grinsted™ Pectin AM453 włączono do eksperymentu.

Względną wrażliwość na wapń trzech wybranych pektyn oznaczono jak objaśniono w sekcji metodologicznej:

Oznaczenie indeksu wrażliwości na wapń (CF) próbki pektyny, i rezultaty pokazano w tabeli poniżej.

Pektyna - typ	Δ CF	DE %
TM Grinsted Pectin URS	1,1	82
Pektyna 1944-96-2	1,4	76
Grinsted™ Pectin AM453	>20	72

De-estryfikacja pektyny macierzystej Grinsted™ Pectin URS od 82% DE do 76% DE prawie nie daje zmiany w wrażliwości na wapń tych dwóch pektyn (Δ CF 1 nie posiada wrażliwości). Pektynę z dającą, się zmierzyć wrażliwościąna wapń możnaby wytworzyć przez dalszą obróbkę za pomocąenzymu PME pomarańczy na pektynie macierzystej do 70% DE, ponieważ to pektyna miała Δ CF 14.

Wyniki Analizy Jogurtu/Jogurtu Pitnego

Jogurt produkowano jak wyjaśniono w sekcji metodologicznej. Trzy pektyny (Grinsted™ Pectin URS, Pektyna 1944-96-2 i Grinsted™ Pectin AM453) używano indywidualnie w następujących recepturach:

7,6% MSNF (zawartości części stałych mleka), 9,15% cukru i 0,25% lub 0,35% próbki pektyny, dającej odpowiednio 17,0% lub 17,10% suchej masy w końcowym produkcie.

Jakość każdego produkowanego jogurtu badano przez % sedymentacji ukazany w teście wirówkowym, przez mierzenie rozmiaru cząstek wjogurcie, przez mierzenie lepkości i przez badanie możliwości oddzielania serwatki podczas długiego okresu składowania, jak opisano w sekcji metodologicznej.

Sedymentację jogurtu produkowanego z trzema typami pektyn przedstawia się w tabeli poniżej.

Sedymentacja (w %) jogurtu

Pektyna - typ	Stężenie-0,25%	Stężenie-0,35%
TM Grinsted Pectin URS	29,4	21,02
Pektyna 1944-96-2	1,53	2,95
Grinsted™ Pectin AM453	2,20	1,85

185 172

Rezultaty są przeciętną z jednej do czterech różnych produkcji.

Jasne jest, że macierzysta pektyna (typ URS) ma wysoki % sedymentacji i konsekwentnie, produkowanyjogurt wykazał oddzielanie serwatki i był niestabilny przy obu stężeniach stosowanej pektyny (0,25 i 0,35%). Nie jest to dziwne, ponieważ normalnie typu pektyny URS nie można stosować do stabilizowania traktowanych ciepłem typówjogurtów do długiego terminu magazynowania.

Jogurt produkowany z pektyną 1944-96-2 wykazał stabilność przy obu użytych dawkach pektyny i niską sedymentację jak widać w rezultatach ukazanych powyżej, i brak oddzielania się serwatki po ponad 75 dniach magazynowania. Porównując, doskonała Grinsted™ Pectin AM453 normalnie używana w produkcji jogurtu także wykazała niską sedymentację, jak się spodziewano, i produkowała stabilny jogurt z nieoddzieloną serwatką (patrz wyniki powyżej).

Przez potraktowanie macierzystej pektyny URS pomarańczowym PME z niewłaściwej pektyny zrobiono odpowiedniąjako czynnik stabilizujący wjogurcie, i traktowana pektyna zachowywała się dokładnie tak jak doskonały handlowy stabilizator.

Dalsze badanie produkowanych jogurtów wykonano przez oznaczanie rozmiaru cząstki (zobacz sekcja metodologiczna) i wyniki pokazano w tabeli poniżej.

Rozmiar cząstki (w pM) jogurtu

Pektyna - typ	Stężenie-0,25%	Stężenie-0,35%
TM Grinsted Pectin URS	9,32	6,41
Pektyna 1944-96-2	1,33	1,55
TM Grinsted Pectin AM453	1,40	1,53

Średni rozmiar cząstki (pokazuje się numer odpowiadający frakcji D(4.3) stosując instrument Malverna) jogurtu produkowanego z pektynąmacierzystąURS jest wysoki, takjak oczekiwano. Znowu rezultaty są przeciętną z jednej do czterech produkcji.

Średni rozmiar cząstek jogurtu produkowanego z obu pektyn 1944-96-2 i Grinsted™ Pectin AM453, jest mały przy obu użytych dawkach pektyn (zobacz rezultaty powyżej).

Ukazując znowu, że jogurt produkowany z tymi typami pektynjest odpowiedni do produkcji stabilnych jogurtów.

Na koniec, i w sposób bardzo istotny, w wypadku produkcjijogurtu pitnego o długim czasie przechowywania, określono lepkość i wyniki pokazano w tabeli poniżej.

Lepkość (w MPa s) jogur	u
Stężenie/Pektyna - typ	Stężenie-0,25%	Stężenie-0,35%
TM Grinsted Pectin URS	55	40
Pektyna 1944-96-2	12	18
TM Grinsted ^M Pectin AM453	24	43

Ponieważ macierzysta pektyna URS może nie stabilizować jogurtu otrzymuje się, jak się spodziewano raczej wysoka, lepkość przy obu stężeniach pektyn. Doskonała Grinsted™ Pectin AM453, która produkuje stabilne jogurty z niską, sedymentacją, i małym rozmiarem cząstek wykazuje lepkość około połowy lepkości ukazanej z pektyną Grinsted™ Pectin URS przy dawce 0,25% pektyny i prawie taka samąjak pektyna URS przy dawce pektyny 0,35% - niezależnie od faktu, że tylko pektyna AM453 produkuje stabilny jogurt.

W obydwu przypadkach URS i AM453, widoczną wyższą lepkość możnaby częściowo przypisać ilości dodanej pektyny, zwłaszcza będzie to chyba w wypadku sytuacji pektyny AM453 ponieważ wzrost ilości dodanej pektyny (od 0,25 do 0,35%) wytwarzał blisko dwa razy bardziej lepki jogurt.

Lepkość otrzymana z pektyną 1944-96-2 potraktowaną PME pomarańczy pokazuje dramatyczny spadek lepkości, porównując z macierzystąpektynąURS, przy stężeniu 0,25%. Jest to częściowo spowodowane stabilizacj ąjogurtu z pektyną 19-44-96-2, ale nie jest to jedyny powód, ponieważ jogurt AM453 ma dwa razy wyższą lepkość przy tej dawce pektyny. Rzeczywiście dodanie 0,35% pektyny 1944-96-2 do jogurtu podniesie lepkość tylko do 6 jednostek (porównując z 0,25% dawką) podczas gdy w wypadku AM453 lepkość wzrośnie do 19 jednostek, przechodząc z 0,25% do 0,35%.

Pektyna 1944-96-2 traktowana PME pomarańczy może stabilizować jogurt, mający bardzo niską lepkość, pomimo, że dawka pektyny była 0,25% (lub 0,35%), która dawała blisko dwukrotnie wyższą lepkość przy użyciu -innych nietraktowanych pektyn - n.p. Grinsted™ Pectin AM453.

Jest to bardzo ważny postęp w produkcji napojów z kwaśnego mleka.

Przez potraktowanie Grinsted™ Pectin URS PME pomarańczy, tworzy się nowy typ pektyny, który w odróżnieniu do pektyny macierzystej ma możliwość stabilizowania jogurtu i w najbardziej znaczący sposób wykazuje niższą lepkość niż normalnie używane pektyny. Inne pektyny wysoko estrowe mogą być także udoskonalane przez traktowanie PME pomarańczy.

Przykład 2

Pitny sok serwatkowy

Zmodyfikowanąpektynę według niniejszego wynalazku (jakąwytworzono powyżej) użyto w pitnym soku serwatkowym następująco:

Słodka lub kwaśna serwatka	42,00%
Sok owocowy	40,00%
Cukier	8,00%
Cytryna Sodu	0,20%
Pektyna modyfikowana PME	0,20%
Grinsted Flavouring	+
Woda	9,60%

Suchąmodyfikowanąpektynę PME, cytrynian sodu i cukier mieszano i potem rozpuszczono w wodzie o temperaturze 80°C. Ten roztwór pektyny ochłodzono do temperatury poniżej 5°C i dodano serwatkę w temperaturze 5°C. Grinsted Flavouring (dostarczana przez Danisco Ingredients, Danisco A/S) i sok dodawano powoli i pH w próbce mieszaniny doprowadzono kwasem cytrynowym lub mlekowym, do pH 4,0. Próbkę mieszaniny poddano starzeniu w przybliżeniu przez 30 minut, przy mieszaniu. Przeprowadzono pasteryzację w temperaturze 80°C/15 sekund i homogenizację pod ciśnieniem 200 barów (2900 psi). Próbkę ochłodzono do temperatury 20°C i aseptycznie nalano w pojemniki.

Testy próbki analizowano po 24 godzinach, 1 miesiącu i 6 miesiącach inkubacji w temperaturze pokojowej. Analiza badania zawierała pomiary lepkości, rozmiaru cząstek indeksu stabilności, i długoterminowej trwałości -protokół, który opisano powyżej.

Rezultaty ukazały ulepszoną, stabilizację i długoterminową trwałość w pitnym soku serwatkowym przetworzonym z modyfikowaną pektyną PME w porównaniu z odnośną pektyną użytą w testach kontrolnych. W dodatku pitny sok serwatkowy miał korzystną lepkość, która była niższa niż w napojach kontrolnych.

Pitny sok serwatkowy także przetworzono za pomocą pektyny, odpowiednio limony i cytryny, modyfikowanej roślinnym PME - to jest modyfikowanej PME według niniejszego wynalazku. Wyniki pokazują, że pektyna modyfikowana PME polepsza trwałość białka, w porównaniu z pektyną nie modyfikowaną, a także porównując z pektyną wzorcową.

185 172

Przykład 3

Napój z mleka/soku owocowego

Grinsted™ URS (otrzymana z Danisco Ingredients. Danisco A/S) modyfikowano za pomocą PME jak opisano dla napoju jogurtowego. Modyfikowaną pektynę użyto w napoju mleko/sok owocowy, który zawiera:

Mleko odtłuszczone	45,00%
Sok owocowy	40,00%
Cukier	5,00%
Pektynę modyfikowaną PME	0,25%
Grinsted Flavouring	+
Woda	9,75%

Suchąpektynę modyfikowanąPME i cukier zmieszano i rozpuszczono w wodzie o temperaturze 80°C. Roztwór pektyny ochłodzono do temperatury poniżej 5°C i dodano mleko o temperaturze 5°C. Grinsted Flavouring i sok dodawano powoli i pH w próbce mieszaniny doprowadzono (jeśli to konieczne) za pomocą kwasu cytrynowego lub mlekowego do pH 4,0. Mieszaninę próbek poddano starzeniu, pasteryzowano i homogenizowano jak opisano dla pitnego soku serwatkowego. Próbki ochłodzono do temperatury 20°C i aseptycznie nalewano do pojemników

Rezultaty pokazały ulepszoną stabilność - łącznie z długim terminem trwałości - w przetwarzanym napoju mleko/sok owocowy z pektyną modyfikowaną PME, w porównaniu z odnośną pektyną zastosowaną w testach kontrolnych. W dodatku napój mleko/sok owocowy miał korzystną lepkość, która była niższa niż w kontrolnych napojach. Obserwowano także ulepszoną funkcjonalność.

Napój mleko/sok owocowy może być także przetwarzany z pektyną limony lub cytryny, modyfikowaną PME według niniejszego wynalazku.

Przykład 4

Stabilność serwatki

Enzymatycznie modyfikowane pektyny testowano przy pH 4,0. pH powstałego roztworu pektyny doprowadzono do pH 4,0 z użyciem KOH/HCl. Stężenie pektyny doprowadzono do 1,0%. Pektyny testowano w stężeniach 0,1% - 0,25%. Pektynę, James Buffer (patrz poniżej) i roztwór serwatki (patrz poniżej) mieszano i podgrzewano do temperatury 96°C przez 25 minut. Po ochłodzeniu do temperatury pokojowej mierzy się absorbancję w 500 nm.

Suchy Bufor Blend Jennes

Suchy proszek Jennes (opisany w R.Jennes, i J.Koops, Preparation and Properties of salt solution which simulates milk ultrafltrate, Nederlands Melk-en Zuiveltijdschrift, tom 16 nr 3, str. 153 - 164, 1962):

15,80 g KHI₂PO₄

5,08 g cytjynianu K3

17,91 g cytiynianu Na₃, 2-H₂O

1,80 g K2SO4

13,20 g CaCl₂,2 -H₂O

5,02 g cytrynianu Mg3, H₂O

3,00 g K2CO3

10,78 g KC1

Roztwór buforowy:

Wodny roztwór z 7,5900 g/l suchego proszku Jannessa o pH 4,0.

Roztwór Serwatki

Stężone białko liofilizuje się i proszkuje. 0,40% roztwór ciężar/ciężar białka serwatki przygotowuje się w Jenness Buffer o pH 4,0.

185 172

Roztwór pektyn

1% ciężar/ciężar roztwór pektyn wykonuje się przy pH 4,0.

Zatężanie mieszaniny

Pektynę, Buffor Jennessa i roztwór serwatki mieszano jak pokazano w tabeli poniżej. Mieszaniny ogrzewano w temperaturze 96°C przez 25 minut i po ochłodzeniu do temperatury pokojowej próbkę mierzono spektrofotometrem przy 500 nm.

μΐ roztwór pektyny	pl Jenness Buffer	pl roztwór serwatki	pl objętość całkowita
500	2000	2500	5000
750	1750	2500	5000
•1000	1500	2500	5000
1250	1250	2500	5000

Wyniki:

Wyniki pokazano w tabeli poniżej. Wymieniona wartość absorbancji 500 nm jest średnią wartością, wziętą, z dwóch pomiarów'. Dla porównania pomiędzy różnymi typami pektyn i enzymatycznie modyfikowanymi pektynami według niniejszego wynalazku, indeks niemodyfikowanej pektyny Grinsted™ Pectin 3450 (dostarczanej przez Danisco Ingredients. Danisco A/S) ustawia się do 100.

Indeks > 100 wskazuje uboższą, stabilność białka niż przy użyciu próbki 3450. Indeks 100 wskazuje podobną stabilność do próbki 3450. Indeks <100 wskazuje większą stabilność białka niż użyta próbka 3450. Indeks 95 lub <95 wskazuje bardzo dobrą stabilność białka.

Typ Pektyny	pektyna 0,10%	pektyna 0,15%	pektyna 0,20%	pektyna 0,25%
Grinsted™ Pectin3450	100	100	100	100
Grinsted™ Pectin URS	127	140	155	161
5 min enz.	100	108	115	113
10 min enz.	98	106	111	111
15 min enz.	92	94	100	100
20 min enz.	90	95	100	99

Jak można zauważyć z rezultatów pektyny Grinsted™ pektyna URS modyfikowana zgodnie z niniejszym wynalazkiem wykazuje korzystne właściwości i w niektórych wypadkach bardzo dobre właściwości do zwiększania stabilności w porównaniu z odnośną pektyną Grinsted™ 3450 i nie modyfikowaną pektyną Grinsted™, pektyną URS.

Przykład 5

Napój podpuszczkowy z długim okresem przechowywania, niskim pH

Napój podpuszczkowy jest zakwaszonym napojem mlecznym z pH o wartości poniżej 4,2. Napój podpuszczkowy składa się z podstawy podpuszczkowej zmieszanej z roztworem pektyny. W skład podstawy podpuszczkowej wchodzi:

Bezwodne tłuste mleko	2,8%
Odtłuszczone mleko w proszku	10,0%
Grinsted Flavouring	+
Woda	87,2%

185 172

Standaryzowane mleko pełne (bezwodne tłuste mleko i odtłuszczone mleko w proszku) homogenizuje się w temperaturze 75 - 80°C i pod ciśnieniem 200 barów (2900 psi), następnie pasteryzuje w temperaturze 90 - 95°C przez 5 -10 minut. Po wyhodowaniu do pH około 4,0, pH doprowadzono do 3,8 - 4,2 kwasem cytrynowym lub mlekowym. Potem dodaje się roztwór pektyny. Mieszaninę miesza się następnie aż do uzyskania mieszaniny jednorodnej. Następnie pasteryzuje się jąw temperaturze 90 - 95°C przez 10-15 sekund i dalej homogenizuje pod ciśnieniem 150 - 200 barów Po ochłodzeniu do temperatury 20 - 25°C produkt rozlewa się aseptycznie do pojemników.

Po kilku dniach nie stabilizowany napój podpuszczkowy często wykazuje synerezę.

Jednakże dodawanie enzymatycznie modyfikowanych pektyn zgodnie z niniej szym wynalazkiem zapobiega synerezie i poprawia lepkość.

W dodatku, produkt ma wyraźny smak jogurtu i długi okres przechowywania.

Przykład 6

Sok pomarańczowy (Wzbogacony w białko)

Napój z soku pomarańczowego jest zakwaszonym napojem (pH w przybliżeniu 4), zawierającym 2% DANPROLACT 40™ (Central Soya, Aarhus A/S), 6% cukru, 10% koncentratu pomarańczowego, 0,4% koncentratu cytrynowego, 0,2% pektyny i 81,4% wody. Produktjest napojem z soku pomarańczowego wzbogaconym białkiem sojowymi Produkt pasteryzuje się i homogenizuje. Po ochłodzeniu do 20 - 25°C produkt rozlewa się aseptycznie do pojemników i może być przechowywany w przybliżeniu 6 miesięcy w temperaturze pokojowej. Dodawanie enzymatycznie modyfikowanych pektyn zgodnie z niniejszym wynalazkiem do napoju pomarańczowego (wzbogaconego w białko) wykazywał korzystne właściwości - takie jak długi termin trwałości - i posiada dobre walory smakowe.

Przykład 7

Produkcja przeciwciał

Wyhodowano przeciwciała przeciw enzymowi według niniejszego wynalazku przez iniekcję królikom oczyszczonego enzymu i wyodrębnienie immunoglobulin z antyserum zgodnie z procedurami opisywanymi w N.Harboe i A.Ingild („Immunization, Isolation ofImmunoglobulins, Estimation of Antibody Titre” In a Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis, Methods and Aplications, N. H. Axelsen, et al (wyd.), Universitetsforlaget, Oslo, 1973) i przez T.G. Cooper („The Tools of Biochemistry”, John Wiley & Sons, New York, 1977).

Inne modyfikacje według ninieszego wynalazku będą widoczne dla fachowców bez odbiegania od zakresu niniejszego wynalazku.

Na następnych stronach, przedstawia się wiele list sekwencji, które zostały ponumerowane od SEQ.I.D.Nr. 1 SEQ.I.D.Nr. 19, które przedstawiają sekwencje nukleotydowe i sekwencje aminokwasowe.

185 172

Sekwencje

SEQ.I.D. NO. 1

MIKNMTDTDM MIMRTSNNRK NWAADX3SG nfktvaaava NIMFIGDGRT RTIITGSROT GPSKHQAVAL RVGADLSAFY FIFGNAAAVL QNCDIHARKP ATSDLKPVQG SFPTYLGRPW LNTLFYGEHQ NAGAGAGTSG LGSTGFPFSL GL

SEQ.I.D. NO. 2

MTRIKEFFTK LSESSTNQNI VNSRKNSGDN GNEPHHAILK DVIEMSLNIT TTAVEHNYFG ELHKAVEDLE EYPNKKSLSQ HVRDALSDGQ VHVEKMCSNA DGWPAWLSTG DRHLLQSSSV RYIIRIKAGV YTEEWEEVTCK SATWAWGEG FLARDITFQN DTLYVHSNRQ FFVNCLIAGT TAQGRADPNQ NTGIVIQKSR MQSSITDVI« PAGWKEWDGN VITSATEAQA FTPGSFIAGS

SEQ.I.D. NO. 3

GTAGCAATGC GCTTGCTATG ATCATGAGGA CTTCAAACAA TGATGGGTGG CCGGCGTGGC CCTCGTCGGT GACACCGAAC TTTAAGACGG TCGCCGCAGC GCGGTATATT ATTAGGATTA TGACAAAGAA GCATAAAAAT ACTATCATCA CACGAACTAG gtctgctaca gttcctgttg CATTCCAAAA CACACCCGGC GTGGGACCTC ACCTTTCAGC AGACACACTC TACGTCCACT TTCCTCGCAC CGTTCATTTT AATTGTCACA TCCATGCACC CACAGCCCAA GGCAGGGCTG

LIEETSSTDG WPAALSTTGD AAPQGGTKRY I IRIKAAWY. WGSTTFKSA TTVAV(CSGFL NCDMLAYODT LYWSNRRrF NSGQraKNrrA QG^GRAPPQQT KEYSRT7IMQ SSITTPEHPA R\RViKGRRVI TTAATEAAAT

STIPKKKKKL FLALFATLLV AACASTRYPD LCFSAIAAVP IAKLLKRTNL TKREKEALHP HADDLETLMS AAMTNQGTCL LAMIKNMTDT DMMIMRTSNN TPNWWAADG AGNFKTVAAA HKNIMFIGDG RTRTIITGSR TAGPAKHQAE ALRVCADLSA VDFIFGNAAA ELANCPIHAR IGATSDLKPV QCAFPTYLCR FALNTLFYGE KQNACAGAGT SWLGSTCFPF SLGL

ATCAAGAACA TGACTCACAC CAGGAAGCTG ATACAGGACA TCTCCACCGG AGACACGAGG GTGGTGCTCG CACCACATGG GGTGGCGGCG GCTCCTCAGG AAGCCGCTCT TTATCGGGAA ATAATGTTCA TCCGTCACGG AAATGTGGTT GATGGAAGCA TTGGTGAACG ATTCTTGGCC CCCTCAAACC ACCACGCGGT ATTTTACAAT TGCGATATCT CGAACCGCCA GTTCTTTCTG ATTTTTGGTA ACGCTCCAGC AAAGCCCAAT TCCGGCCAAA ACCCTAACCA AAACACCGGC

	50
HTEEETασΠζ	100
AHDITFQNTA	150
	200
	250
GWHEWDGTFA	300
PGSFIAGSSW	350
	362

VAAVIGIVAG	50
EAAKKETAAK	1OO
CLETIDETLD	150
DCFSEDDANK	200
RKLIEETSTV	2 SO
EAAAPAGGTK	300
NWDGSTTFK	350
FYNCDMLAYQ	400
KPNAGAKNME	450
PVKEYSRTVI	500
SGRVXVKGFR	550
	584

TGACATGATG	50
CCAGTACGGT	100
CTGTTGCAGT	150
CAGCGGAAAC	200
GAGGCACTAA	250
AATGTTCACG	300
GAGGACTACA	3 5 0
CAACTTTCAA	400
CGAGACATTA	450
GGCACTACCA	500
TAGCTTACCA	55 0
AACTGCTTAA	600
CGTGTTACAA	650
AAAATATGGT	700
ATTGTCATTC	750

185 172

AAAAATCTAG GATTGGTGCC ACCTCCGATT TAAAACCGGT TCAGGGTAGT 800 TTCCCGACGT ACCTCGGCAG GCCCTGGAAG GAGTACTCGA GGACGGTGAT 850 CATGCAGTCA TCGATTACTG ACGTGATCCA CCCTGCCGGG TGGCACGAGT 900 GGGATGGTAA CTTCGCGTTG AACACATTGT TTTACGGAGA GCATCAGAAC 950 GCCGGAGCCG GTGCCGGAAC TTCAGGGAGA GTGAAATGGA AGGGATTTAG 1000 GGTTATTACA AGTGCTACCG AGGCTCAAGC TTTTACTCCT GGAAGCTTCA 1050 TTGCTGGTAG TAGCTGGCTG GGCTCCACTG GTTTCCCATT CTCCCTTGGT 1100 TTGTAATATT CACTAG^AGT TTTAATTAAT ATGTTTTGTA TTAGTGGATC 1150 CATAGGTCTC TGGTCTTTCA ATTTGTAATA TTTGATTGAG CGTGTCTTAT 1200 TCGTGGCTTC GATTTCACAA ATACTATTGT GTGATTAACA AGAAATAAAA 1250 TAGCATGGGA AGAATAATAA TTTCCGGCTT CTTTAAAAAA AAAAAAAAAA 1300 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAA 1323

SEQ.I.D. NO. 4

CTTTTGTTCT	CTCTTATCGA	GAAAAAAAAT	GACCCGCATA	AAAGAATTCT	50
TCACAAAACT	TTCTGAATCT	TCTACCAACC	AAAACATTTC	CAATATTCCC	100
AAGAAAAAAA	AGAAACTATT	CTTAGCTCTT	TTTCCAACCC	TACTCCTTCT	150
CGCTGCCGTA	ATCGGCATTG	TCGCCCCACT	GAACTCAAGA	AAAAACTCCG	200
GCGACAACGG	CAACGAGCCT	CATCATGCTA	TCCTCAAATC	ATCATGTAGC	250
AGCACAAGGT	ACCCGGACTT	ATCCΓTTTCC	GCTATTGCTG	CCGTTCCAGA	300
GGCCTCCAAA	AACGTCACAA	GCCAAAAGCA	CCTTATTCAG	ATGTCCTTAA	350
ACATCACAAC	AACACCCGTC	GAACACAACT	ACTTCCCCAT	TCACAACCTC	400
TTGAAGAGAA	CGAATCTCAC	CAAACCCGAA	AAGGTTGCTC	TCCATCACTC	450
TCTTGAGACG	ATCGATGAGA	CTCTTCATCA	GTTACACAAA	CCCCTCGACC	500
ATCTTGAGGA	GTACCCGAAC	AACAAATCTT	TATCACAGCA	TCCCCATCAT	550
CTCAAAACCC	TAATGAGTGC	CGCGATGACC	AATCACCCCA	CCTCTCTTCA	600
TGGGTTCTCT	CA^SA^A^	CTAATAAGCA	CGTCCGGCAT	CCCTTCTCAC	650
ACGGCCAGGT	TCATGTTGAG	AACATCTCTA	CCAATGCCCT	TCCTATCATC	700
AAGAACATGA	CTcACACTCA	CATCATCATC	ATCACCACTT	CAAACAACAG	750
GAAGCTGATA	CACCACACCA		TCCCTCCCCG	CCCTCCCTCT	800
CCACCGGAGA	CA^A^CK	TTCCACTCCT	CCTCCCTGAC	ACCGAACGTG	850
GTGGTGGCAG	CACATCGCAG	CCCAAACTTT	AACACGCTCC	CCGCATCGCT	900
CCCGCCCCCT	CCTCACCCAG	GCACTAAGCG	GTATATTATT	AGCATTAAAG	950
CCGCTCTTTA	TCCCCAAAAT	CTTGACCTGA	CAAAGAAGCA	TAAAAATATA	1OOO
ATGTTCATCG	CTCACcCGAG	CACTAGAACT	ATCATCACAG	CCAGTAGAAA	1050
TGTCCTTCAT	CCAAGCACAA	CTTTCAAGTC	TGCTACAGTT	GCTCTTCTTC	1100
CTGAAGCATT	CTTCGCCCGA	GACATTACAT	TCCAAAACAC	AGCCCCCCCC	1150
TCAAAGCACC	ACCCGCTCGC	ACTA^AC^	CCAGCTCACC	TTTCAGCATT	1200
TTACAATTGC	CATATCTTAC	CTTACCAAGA	CACACTCTAC	GTCCACTCGA	1250
ACCGCCAGTT	CTTTCTCAAC	τccrτAAττc	CTCGCACGCT	TGATTTTATT	1300
TTTGCTAACC		CTTACAAAAT	TCTCACATCC	ATCCACCAAA	1350
GCCCAATTCC	CCCCAAAAAA	ATATGGTCAC	AGCCCAACCC	ACCCCTCACC	1400
CTAACCAAAA	CACCCCCATT	GTCATTCAAA	KAICTA^A!¹	TGCTCCCACC	1450
TCCGATTTAA	AACCCGTTCA	CCCTAGTTTC	CCCACCTACC	TCCGCACCCC	1500

185 172

CTGGAAGGAG TACTCGAGGA CGGTGATCAT GCAGTCATCG ATTACTGACG 1550

TGATCCACCC TGCCGGGTGG CACGAGTGGG ATGGTAACTT CGCGTTGAAC 1600

ACATTGTTTT ACGGAGAGCA TCAGAACGCC GGAGCCGGTG CCGGAACTTC 1650

AGGGAGAGTT AAATGGAAGG GATTTAGGGT TATTACAAGT GCTACCGAGG 1700

CTCAAGCTTT TACTCCTGGA AGCTTCATTG CTGGTAGTAG CTGGCTGGGC 1750

TCCACTGGTT TCCCATTCTC CCTTGGTTTG TAATATTCAC TAGGAGTTTT 1800

AATTAATATG TTTTGTATTA GTGGATCCAT AGGTCTCTGG TCTTTCAATT 1850

TGTAATATTT GATTGAGCGT GTCTTATTCG TGGCTTCGAT TTCACAAATA 1900

CTATTGTGTG ATTAACAAGA AATAAAATAG CATGGGAAGA ATAATAATTT 1950

CCGGCTTCTT TAAATTAAAA AAAAA 1975

SEQ.I.D. NO. 5

IVAGVNSRKN SGDNGMEPIPi AIILKSCSST RRYPDLCFSAI AAVPEASKKV 50

TSQKDVIEMS LNITITAAA-H NN'FGIQQKLK RTNLTKREKV ALHDCLETID 100

ETLDELHKAV EDLEEYPYPNC SLSQHHADDK TUMSJAAtfWę (GTCLDSFSHD 150

DANKHVRDAL SDCDGQVrt:KEl CSNAAAMIKN WTOTDMIIIMR TSJNTCROLIEE 200

TSTVDGWPAW LSTGDRRLLQ 220

SEQ.I.D. NO. 6

ATTGTCGCCG GAGTC^ACTC AAGAAAAAAC TCCGGCGACA ACCGCA^GA 50

GCCTCATCAT AATCATCATG TAGCAGCACA AGGTACCCGG 100

ACTTATGCTT TTCGGCTATT GCTGSSGTTC CΆGAGGCSTS CAAAAAGGTG 150

ACAΆGSCΆΆA AGGACGTTAT TGAGATGTCC TTAAACATCA CAACAACAGC 200

CGTGGAACAC AACTACTTCG GGATTCAGAA GCTCTTGAAG AGAACGAATC 250

TCA^CCAAACG GGAAAAGGTT GCTCTCCATG ACTGTCTTGA GACGATCGAT 300

GAGACTCTTG ATGAGTTACA CAAAGCCGTC GAGGATCTTG AGGAGTACCC 3 50

GAACAAGAAA TCTTTATTAC AGCATGCGGA TGATCTCAAA ACCCTAATGA 4 00

GTGCCGCGAT GACCAATCAG GGGACGTGTC TTGATGGGTT CTCTCATGAT 4 50

GATGCTAATA AGCACCTCCG GGATGCGTTG TCAGACGGCC AGGTTCATGT 500

TGAGAAGATG TGTAGC.AATG CGCTTGCTAT GATCAAGAAC ATGACTGACA 550

CTGACATGAT GATCATGAGG ACTTCAAACA ACAGGAAGCT GATAGAGGAG 6 00

ACCAGTACGG TTGATGGGTG GSSGGSGTGG CTGTCCACCG GAGACAGGAG 650

GCTGTTGCAG 660

SEQ.I.D. NO. 7

PE511 (14 aa) ser-ala-tłh-val-ala-val-val-gly-glu-gly-ph.e-leu-alaarg

SEQ.I.D. NO. 8

PE3252 (4 aa)

Tyr-i---iU--arg

185 172

SEQ.I.D. NO. 9

PE8 (8 aa)

SEQ.I.D. NO. 10

PE21 (21 aa)

SEQ.I.D. NO. 11

PE492D (15 aa)

SEQ.I.D. NO. 12

PE492C (11 aa)

SEQ.I.D. NO. 13

PE492B (12 aa)

SEQ.I.D. NO. 14

PE492A (16 aa)

SEQ.I.D. NO. 15

PE701 (28 aa)

SEQ.I.D. NO. 16

PE594 (13 aa)

SEQ.I.D. NO. 17

PE7 (19 ^aa)

Asn-ile-met-phe-ile-gly-asp-gly

Ile-gly-ala-thrr-ser-asp-leu-lys-pro-val-gln-gly-ser phe~pro-thr-tyr-leu-gly-arg-pro xooc-ser-ala-thn--val-ala-val-val-gly-glu-gly-phe-leu ala-arg

3oac~ala-cyr-pro-gly-gln-aee-hrr-eer--sn-met

A^n-tys-a-p-met-leu-ala-tyr-gln-asp-thr-leu-tyrr

Val - -1 e -tir --er--i I-i -thr-gl u - a 1 a - gin - al a - phi e - tir- - p ro gly-ser-phe

Val--ae-εh..r--er-aaa-th.e-gau-ala-gln-aia-phe-Łhr-progay--er-phe-ile-aaa-gay--ee--ee-tep-1eu-gay--ee-thrgly-phe iae-ala-gly-ser-ser-crpj-leu-gly-ser-thr-gly-phe-pro

J—n-met - val - dr- - a JL a - g 1 n - gl y-arg-a 1 a-a s -5 - -3 ro - -i s n - gl n a-n-thr-gly--le-val--le

185 172

SEQ.I.D. NO. 18

PE 251 (38 aa) xxx-ar<g-ile-gly-ala-thr-ser-asp-leu-lys-pro-val-glngly-ser-phe-pro-thr-tyr-leu-gly-arg-pro- (trp) -lysglu-tyr- (ser) -arg- (thr) -val-ile-met-gln-ser-ser-ilethr

SEQ.I.D. NO. 19

PE 201 (27 aa) xxx-:x:xx-ile-gly-ala-thr-seχ·-asp-leu-lys-pro-val-glngly-ser-phe-pro-t^n--tyr-leu-gly-arg-pro-3xx:x-lys-glutyr

SEQ.I.D. NO. 20

PE 22 (21 aa) Se--arg-ile-gly-ala-thr-ser-asp-leu-lys-pro-val-glngly-ser-pre-p-o-th--cy--leu-gly aa 2 (arg) można zastąpić val aa3 (ile) można zastąpić met aa6 (thr) można zastąpić val

Fig. 2

PE

MW kD

185 172

Fig. 3 pH optymalne

Aktywność (μι-nol/min/ml)

^Aktywność PME

Fig. 4

Optimum temperatury dla PME

Aktywność PME -ΘFig. 5

Temperatura stabilności dla PME Aktywność (umol/min/ml)

Aktywność PME -ΘFig. 6 .Stężenie substratu

Aktywność (pmol/min/ml)

Km = 0,07% pektyn

185 172

Fig. 7

Stężenie chlorku sodu

PME rośliny μιηοΐ/min/ml

Aktywność PM]

Fig. 8

Stężenie siarczanu sodu

PME rośliny

Aktywność PME -θ185 172

Fig. 9

Stężenie azotanu sodu PME rośliny

Fig. 10

Fig. 12

Τ

Sygnał Przedłużenie N-term

I ł

Dojrzałe białko 'Długie PME

5'

H

ATG

Y

3'

Krótkie PME i

Sygnał

Dojrzałe białko

SacI (9115) EcoRl (1) \ J

EcoRV (5995)

Fig. 13

Fig. 14

Fig. 15

Fig. 16

SacI (801 BgUI(7810:

BamHI (8747) EcoRI (1)

EcoR.V (1538)

Xbal (1819)

Bgffl(5407)

EcoRY (5362)

Sali (2963)

Ncol (3418)

BamHI (1003)

Xbal (1015) Notl(1022)

Fig. 17

BglU (6659) EcoRY (6614)

BamHI (9999) EcoRI (1) garaHt

SacI (9269) B gin (9062) \ (1003) ΐ XbaI(1015) l /

Sali (2963)

Ncol (3418)

Notl(1022)

EcoRY (1538) Xbal(1819)

Fig. 18

Woreczki z sokiem

Warstwa żółta

Nasienie

Rdzeń

Warstwa biała

Lamella

Segment

Fig.l

Schematyczny diagri/R owocu cytrusowego

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 6,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób stabilizowania białka w środowisku kwasowym, obejmujący wprowadzanie czynnika stabilizującego, znamienny tym, że zawiera:

a) oczyszczanie enzymu metyloesterazy pektynowej (PME) zdolnego do enzymatycznego blokowego deestryfikowania pektyny;

b) dodawanie tego oczyszczonego enzymu metyloesterazy pektynowej (PME) zdolnego do enzymatycznego blokowego deestryfikowania pektyny do pektyny;

c) otrzymywanie blokowo enzymatycznie deestryfikowanej pektyny z pektyny za pomocą oczyszczonego enzymu metyloesterazy pektynowej (PME) zdolnego do enzymatycznego blokowego deestryfikowania pektyny;

i) przy czym blokowo enzymatycznie deesttyfikoweutypektynąjest pektyna wysokoestrową; oraz ii) blokowo enzymatycznie deestryfikowana pektyna zawiera od około 70% do około 80% grup estrowych, korzystnie około 76% grup estrowych;

d) dodawanie blokowo enzymatycznie deestryfikowanej pektyny do środowiska kwasowego zawierającego przynajmniej jedno białko; oraz

e) stabilizowanie tego białka przez tą blokowo enzymatycznie deestryfikowanąpektynę.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że blokowo enzymatycznie deestryfikowanąpektynę wytwarza się przy użyciu technik rekombinowanego DNA.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że środowiskiem kwasowym jest roztwór wodny, korzystnie napój.
4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że napojem jest pitny jogurt, sok owocowy lub napój zawierający białko serwatki.
5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że białko pochodzi lub można je uzyskać z produktów mlecznych, lub jest w produktach mlecznych, takich jak mleko lub ser.
6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że białkiemjest kazeina lub białko serwatki.
7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że środowisko kwasowe posiada pH od około 3,5 do około 5,5, korzystnie posiada pH od 4 do około 5,5.
8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że środowisko kwasowe ma pH wynoszące około 4.
9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że blokowo enzymatycznie deestryfikowana pektyna jest niewrażliwa na jony Ca²⁺ zgodnie z protokołem oznaczania wskaźnika wrażliwości na jony wapnia (CP) dla próbek pektyny.
10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że blokowo enzymatycznie deestryfikowana pektyna posiada wysoki ciężar cząsteczkowy.
11. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że metyloesteraza pektynowa (PME) deestryfikuje dwie lub więcej sąsiednie reszty kwasu galaktouronowego pektyny w co najmniej zasadniczo wszystkich łańcuchach pektyny.
12. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że metyloesteraza pektynowa pochodzi od PME, którą można otrzymać z rośliny.
13. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że roślinąjest owoc.
14. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że owocem jest owoc cytrusowy.
15. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że owocem cytrusowymjest pomarańcza.
16. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że metyloesteraza pektynowa pochodzi z PME, którą można otrzymać z lamelli lub warstwy białej pomarańczy.
17. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że enzym zawiera sekwencję aminokwasową wybranąspośród SEQ ID nr 1lub SEQ ID nr 2, ich wariantu, pochodnej albo homologu, lub ich kombinacji.
18. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że enzym może być otrzymany poprzez ekspresję sekwencji kodującej PME zawartej wNClMB 40749 lub NCIMB 40750, lub ich wariantu,

185 172 pochodnej albo homologu, lub ich kombinacji; lub przez ekspresję sekwencji nukleotydowej, zawierającej sekwencję nukleotydową SEQ ID nr 3 lub SEQ ID nr 4 lub ich wariantu, pochodnej albo homologu, lub ich kombinacji.
19. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że blokowo enzymatycznie deestryfikowaną pektynę wytwarza się przez traktowanie pektyny rekombinowanąPME w obecnościjonów sodu.
20. Sposób stabilizowania białka w środowisku kwasowym, obejmujący wprowadzanie czynnika stabilizującego, znamienny tym, że zawiera:

a) insercję do organizmu sekwencji DNA kodującej enzym metyloesterazy pektynowej (PME) zdolny do enzymatycznego blokowego deestryfikowania pektyny;

b) ekspresjonowanie tej sekwencji DNA kodującej enzym metyloesterazy pektynowej (PME) zdolny do enzymatycznego blokowego deestryfikowania pektyny;

c) oczyszczanie ekspresjonowanego enzymu metyloesterazy pektynowej (PME) zdolnego do enzymatycznego blokowego deestryfikowania pektyny;

d) dodawanie tego oczyszczonego enzymu metyloesterazy pektynowej (PME) zdolnego do enzymatycznego blokowego deestryfikowania pektyny do pektyny;

e) otrzymywanie blokowo enzymatycznie deestryfikowanej pektyny z pektyny za pomocą oczyszczonego enzymu metyloesterazy pektynowej (PME) zdolnego do enzymatycznego blokowego deestryfikowania pektyny;

i) przy czym blokowo enzymatycznie deestryfikowaną pektynąjest pektyna wysokoestrowa;

oraz ii) blokowo enzymatycznie deestryfikowana pektyna zawiera od około 70% do około 80% grup estrowych, korzystnie około 76% grup estrowych;

f) dodawanie blokowo enzymatycznie deestryfikowanej pektyny do środowiska kwasowego zawierającego przynajmniej jedno białko; oraz

g) stabilizowanie tego białka przez tą blokowo enzymatycznie deestryfikowaną pektynę.
21. Sposób według zastrz. 20, znamienny tym, że blokowo enzymatycznie deestryfikowaną pektynę wytwarza się przy użyciu technik rekombinowanego dNa.
22. Sposób według zastrz. 20, znamienny tym, że środowiskiem kwasowym jest roztwór wodny, korzystnie napój.
23. Sposób według zastrz. 22, znamienny tym, że napojem jest pitny jogurt, sok owocowy lub napój zawierający białko serwatki.
24. Sposób według zastrz. 20, znamienny tym, że białko pochodzi lub można je uzyskać z produktów mlecznych, lub jest w produktach mlecznych, takich jak mleko lub ser.
25. Sposób według zastrz. 24, znamienny tym, że białkiemjest kazeina lub białko serwatki.
26. Sposób według zastrz. 20, znamienny tym, że środowisko kwasowe posiada pH od około 3,5 do około 5,5, korzystnie posiada pH od 4 do około 5,5.
27. Sposób według zastrz. 20, znamienny tym, że środowisko kwasowe ma pH wynoszące około 4.
28. Sposób według zastrz. 20, znamienny tym, że blokowo enzymatycznie deestryfikowana pektynaj est niewrażliwa naj ony Ca²⁺ zgodnie z protokołem oznaczania wskaźnika wrażliwości na jony wapnia (CP) dla próbek pektyny.
29. Sposób według zastrz. 20, znamienny tym, że blokowo enzymatycznie deestryfikowana pektyna posiada wysoki ciężar cząsteczkowy.
30. Sposób według zastrz. 20, znamienny tym, że metyloesteraza pektynowa (PME) deestryfikuje dwie lub więcej sąsiednie reszty kwasu galaktouronowego pektyny w co najmniej zasadniczo wszystkich łańcuchach pektyny.
31. Sposób według zastrz. 20, znamienny tym, że metyloesteraza pektynowa pochodzi od PME, którą można otrzymać z rośliny.
32. Sposób według zastrz. 31, znamienny tym, że roślinąjest owoc.
33. Sposób według zastrz. 32, znamienny tym, że owocem jest owoc cytrusowy.
34. Sposób według zastrz. 33, znamienny tym, że owocem cytrusowymjest pomarańcza.

185 172
35. Sposób według zastrz. 31, znamienny tym, że metyloesteraza pektynowa pochodzi z PME, którą można otrzymać z lamelli lub warstwy białej pomarańczy.
36. Sposób według zastrz. 20, znamienny tym, że enzym zawiera sekwencję aminokwasową wybraną spośród SEQ ID nr 1 lub SEQ ID nr 2, ich wariantu, pochodnej albo homologu, lub ich kombinacji.
37. Sposób według zastrz. 20, znamienny tym, że enzym może być otrzymany poprzez ekspresję sekwencji kodującej PME zawartej w NCIMB 40749 lub NCIMB 40750, lub ich wariantu, pochodnej albo homologu, lub ich kombinacji; lub przez ekspresję sekwencji nukleotydowej, zawierającej sekwencję nukleotydową SEQ ID nr 3 lub SEQ ID nr 4 lub ich wariantu, pochodnej albo homologu, lub ich kombinacji.
38. Sposób według zastrz. 20, znamienny tym, że blokowo enzymatycznie deestryfikowanąpektynę wytwarza się przez traktowanie pektyny rekombinowaną PME w obecnościjonów sodu.

Niniejszy wynalazek dotyczy sposobu produkcyjnego oraz enzymu do użytku w takim sposobie. W szczególności niniejszy wynalazek dotyczy sposobu stabilizowania białka w środowisku kwasowym i użycia do tego celu enzymatycznie modyfikowanej pektyny.

Pektyna jest ważnym towarem w dzisiejszym przemyśle. Przykładowo można ją stosować w przemyśle spożywczymjest środek zagęszczający lub żelujący,jak przy wytwarzaniu dżemów.

Pektyna jest polisacharydem strukturalnym, znajdującym się zwykle w postaci protopektyny w ścianie komórkowej rośliny. Szkielet pektyny zawiera reszty kwasu galaktouronowego związane w pozycji α-1-4, poprzerywane niewielką liczbą jednostek α-L-ramnozy związanych w pozycji 1,2. Poza tym pektyna zawiera bardzo rozgałęzione regiony z prawie naprzemianległymi łańcuchami ramno-galaktouronowymi. Te bardzo rozgałęzione regiony zawierają także inne jednostki cukru (takie jak D-galaktozę, L-arabinozę i ksylozę), przyłączone wiązaniami glikozydowymi do atomów C3 lub C4 jednostek ramnozy, albo do atomów C2 lub C3 jednostek kwasu galaktouronowego. Długie łańcuchy reszt kwasu galaktouronowego przyłączone w pozycjach α-1-4 zwykle przytacza się, jako regiony „gładkie”, podczas gdy bardzo rozgałęzione regiony zwykle przytacza się jako regiony „kosmate”.

Niektóre grupy karboksylowe reszt galaktouronowych są zestryfikowane (np. grupy karboksylowe są metylowane). Zwykle estryfikacja grup karboksylowych zachodzi po polimeryzacji reszt kwasu galaktouronowego. Jednakże, estryfikacja (to jest metylacja) wszystkich grup karboksylowych jest niezwykle rzadka. Zazwyczaj, stopień estryfikacji zmienia się w zakresie 0-90%. Jeśli zestryfikowanychjest 50% lub więcej grup karboksylowych, wtedy powstałą pektynę nazywa się „pektyną wysoko estrową” (w skrócie „pektyną hE”) lub „pektyną wysoko metoksylowaną”. Jeśli zestryfikowanych jest mniej niż 50% grup karboksylowych, wtedy powstałą pektynę nazywa się „pektyną nisko estrową” (w skrócie „pektyną LE”) lub „pektyną nisko metoksylowaną”. Jeśli pektyna nie zawiera żadnej - lub tylko kilka grup zestryfikowanych, nazywa się ją zwykle kwasem pektynowym.

Struktura pektyny, szczególnie stopień estryfikacji (np. metylacji) narzuca wiele wynikających stąd właściwości fizycznych i/lub chemicznych pektyny. Przykładowo, żelowanie pektyny zależy od charakteru chemicznego pektyny, zwłaszcza stopnia estryfikacji. Poza tym jednakże, żelowanie pektyny zależy także od zawartości substancji rozpuszczalnych, pH i stężenia jonów wapniowych. Jeśli chodzi o ostatnie, uważa się, że jony wapniowe tworzą kompleksy z wolnymi grupami karboksylowymi, zwłaszcza w pektynie LE.

Enzymy pektynowe klasyfikuje się zgodnie ze sposobem atakowania części galaktouronowej cząsteczki pektyny. Przegląd niektórych enzymów pektynowych sporządzili Pilnik i Voragen (Food Enzymology, Wyd.: Fox, Elsevier; (1991); strony: 303-337). W szczególności, metyloesterazy pektynowe (EC 3.1.1.11), z drugiej strony przytaczane jako PME rozkładają wiązania estrowe pektyn HE do pektyn LE lub kwasów pektynowych. Przeciwnie, a także drogą

185 172 przykładu, depolimerazy pektynowe rozkładają wiązania glikozydowe między resztami galaktouranozylo-metyloestru.

Bardziej szczegółowo, aktywność PME wytwarza wolne grupy karboksylowe oraz wolny metanol. Wzrost wolnych grup karboksylowych można łatwo monitorować przez automatyczne miareczkowanie. Pod tym względem, wcześniejsze badania wykazały, że pewne PME deestryfikująpektyny w sposób przypadkowy w tym sensie, że deestryfiłoijąone każdą ze zestryfikowanych (np. metylowanych) reszt kwasu galaktouronowego, w więcej niż jednym z łańcuchów pektynowych. Przykłady PME, które przypadkowo deestryfikują pektyny można otrzymać ze źródeł grzybowych, takich jak Aspergillus aculeatus (patrz WO 94/25575) i Aspergillus japonicus (Ishii i in., J.Food.Sci.44 strony 611-14). Baron i in., (Lebensm. Wiss. M-Technol. 13 strony 330-333) wyizolował w sposób widoczny PME grzyba z Aspergillus niger. Donosi, że ten PME grzyba mą ciężar cząsteczkowy, wynoszący 39000 Daltonów, punkt izoelektryczny 3,9, optymalne pH 4,5 oraz wartość Km (mg/ml), wynoszącą 3.

Przeciwnie, o niektórych PME wiadomo, że deestryfikują pektyny w sposób blokowy, tak, że uważa się, że atakują one pektyny albo od końca nieredukującego, albo tuż przy wolnej grupie karboksylowej, i następnie działają wzdłuż cząsteczek pektyny przez mechanizm pojedynczego łańcucha, tworząc przez to bloki jednostek nieestryfikowanego kwasu galaktouronowego, które są bardzo wrażliwe na wapń. Przykładami takich enzymów, które rozkładają wiązania estrowe w sposób blokowy, są pMe roślinne. Sugerowano istnienie do 12 izoform PME w cytrusach (W.Pilnik i A.G.J. (Food Enzymology (Wyd.: P.F.Fox); Elsevier; (1991); strony 303-337). Te izoformy posiadaj ą różne właściwości.

Vesteeg i in., (J Food Sci 45 strony 969-971) najwyraźniej wyizolował PME z pomarańczy. Donosi się, że PME z tej rośliny występuje w wielorakich izoformach o różnych właściwościach. Izoforma I ma ciężar cząsteczkowy, wynoszący 36000 Daltonów, punkt izoelektryczny 10,0 optymalne pH 7,6 i wartość K_m (mg/ml), wynoszącą 0,083. Izoforma II ma ciężar cząsteczkowy, wynoszący 36200 Daltonów, punkt izoelektryczny 11,0 optymalne pH 8,8 i wartość Km (mg/ml), wynoszącą 0,041. Jednakże do dziś istnieją bardzo ograniczone kolejne dane o takich PME.

Według Pilnika i Voragena (jak wyżej), PME można znaleźć w wielu innych roślinach wyższych, takich jak jabłko, morela, awokado, banan, jagody, limona, greipfrut, mandarynka, wiśnie, porzeczki, winogrona, mango, papaja, passion, brzoskwinia, gruszka, śliwki, fasole, marchwie, kalafior, ogórek, por, cebula, groch, ziemniak, rzodkiew i pomidor. Jednakże podobnie, do dziś istnieją bardzo ograniczone kolejne dane o takich PME.

Przypadkowy lub blokowy rozkład grup karboksylowych, można rozróżnić drogą wysokosprawnej chromatografii jono-wymiennej (Schols i in., Food Hydrocolloids 19896, strony 115-121). Testy te stosuje się często do sprawdzania pod względem niepożądanej, resztkowej aktywności PME w sokach z cytrusów po pasteryzacji, ponieważ PME oprócz wytwarzania metanolu w soku, może spowodować tak zwaną „utratę zmętnienia” w soku pomarańczowym.

PME mają ważne zastosowanie w przemyśle. Przykładowo, możnaje stosować w, lubjako środki maskujące dla jonów wapnia. W związku z tym, i według Pilnika i Voragena (jak wyżej), można wytworzyć paszę dla bydła mlecznego przez dodanie zawiesiny wodorotlenku wapnia do łupin cytrusów po ekstrakcji soku. Po dodaniu, wysokie pH i jony wapnia aktywującały natywny PME w łupinach, powodując szybki rozkład wiązań estrowych pektyny i wystąpienie koagulację pektynianu wapnia. Związana faza ciekła uwalnia się i łatwo wyciska się ją na zewnątrz tak, że trzeba usunąć tylko zawartość frakcji wody pierwotnej przez drogie suszenie termiczne. Wyciśnięty płyn stosuje się potem jako paszę dla zwierząt.

Pilnik i Voragen (jak wyżej) wymieniają zastosowania PME, które obejmują ich dodawanie do soków owocowych, w celu zmiejszania lepkości soku jeśli zawiera on zbyt dużo pektyn, pochodzących z roślin, dodawanie ich jako roztworów pektynazy do bąbelków gazu w warstwie białej owoców cytrusowych, które ogrzano do temperatury rdzenia, wynoszącej 20-40°C, w celu ułatwienia usunięcia łupiny i innych błon w nieuszkodzonych segmentów z sokiem (US-A-4 284 651), oraz ich użycie w chronieniu i poprawianiu tekstury i twardości kilku obrabianych owoców i warzyw, takichjak jabłko (Wiley & Lee, 1970, Food Technol. 24 11 <58-70), pomidorów w puszkach

185 172 (Hsu i in., 1965, J.Food Sci. 30 strony 583-588) oraz ziemniaków (Bartolomew & Hoff, .1872, J.Agric.Food.Chem. 20 strony 262-266).

Glahn i Rolin (1994 Food Ingredients Europę, Conf. Proceedings, strony 252-256) donoszą o hipotetycznym zastosowaniu przemysłowej „pektyny GENU typ YM-100” do współdziałania z napojami z kwaśnego mleka. Nie przedstawia się wcale żadnych szczegółów o tym jak wytwarza się pektynę GENU typ YM-100.

EP-A-0 664 300 ujawnia metodę chemicznego frakcjonowania do wytworzenia pektyny wrażliwej na wapń. Uważa się, że ta pektyna wrażliwa na wapńjest korzystna dla przemysłu spożywczego.

W ten sposób, pektyny i pektyny deestryfikowane, poza PME, są ważne dla przemysłu. Jednakże istnieje ciągła potrzeba ulepszania znanych metod stabilizowania białek w środowisku kwaśnym lecz bez niekorzystnego wpływania na lepkość tego środowiska. Z tego względu, niekorzystny wpływ na lepkość środowiska może narazić na szwank cały wygląd i/lub teksturę i/lub przyjemny smak i/lub odczucia smakowe uzyskanego produktu.

Istota wynalazku