JPH11510042A

JPH11510042A - 純粋な乳酸の製造方法

Info

Publication number: JPH11510042A
Application number: JP9506338A
Authority: JP
Inventors: ビルジャバ，タピオ; コイビッコ，ハンヌ
Original assignee: カルターオイ
Priority date: 1995-07-18
Filing date: 1996-07-16
Publication date: 1999-09-07
Also published as: FI953480A0; DK0839209T3; DE69619985D1; EP0839209B1; FI100338B; WO1997004120A1; EP0839209A1; US5932455A; DE69619985T2; FI953480L; ATE214738T1; ES2174082T3; AU6460196A

Abstract

(57)【要約】本発明は発酵によって純粋な乳酸またはその塩を製造する方法に関する。製造方法はバイオリアクター再生サイクルおよび乳酸製造サイクルからなり、該製造サイクルの間に、実質的に純粋な供給原料からなる溶液が再生された微生物セルを含むバイオリアクターを通って再循環され、製造された乳酸がアルカリの添加によって中和され、そして再循環がアルカリ消費が実質的に減少されたときに中止され、また再生サイクルの間に、微生物セルが栄養源により富裕化された炭水化物溶液をバイオリアクターを通って再循環し、それによって微生物の酸を製造する能力を補充することによって再生されること、および乳酸塩の回収またはその乳酸または他の塩への転換からなる。

Description

【発明の詳細な説明】純粋な乳酸の製造方法本発明は、発酵による純粋な乳酸またはその塩の新規製造方法に関する。製造サイクルの間に、実質的に純粋な供給原料からなる溶液が、再生された微生物細胞、例えばバクテリア細胞またはカビ菌糸体を含むバイオリアクターを通って再循環される。再生サイクルの間に、微生物細胞が、栄養源により富裕化された供給原料溶液を再循環し、それによって微生物の乳酸を製造する能力を補充することによって再生される。発明の分野乳酸は、広範囲の様々な用途のために発酵および合成方法の双方によって製造される。生成物等級の純度は、工業用乳酸ないしわずかにより純粋な食品等級、そしてさらに医薬等級へと変化する。乳酸が有機合成において供給原料として用いられるときはしばしば、非常に純粋な熱安定等級の生成物が必要とされる。発酵によって製造された安価な乳酸は、一般に工業および食品用途のために使用されてきた。一方、乳酸の医薬および非常に純粋な（熱安定）等級は、通常比較的純粋な生成物が直接得られる合成工程によって製造されてきた。発酵によって製造された乳酸の好ましい精製は、多くの段階を必要とする扱いにくい工程であることが知られており、而して製造費の大きな部分を占めている。非常に純粋な（熱安定な）乳酸についての新しく絶えず増加している用途は、ラクチドポリマーの製造である。ラクチドは、制御下で重合されることができる二つの乳酸分子によって形成される環式エステルである。ポリラクチドは生物学的に分解可能であり、その性質の理由で、骨手術において使用される生分解性の支持体および結合部材を制御下で製造するための材料として用いられる。さらに、この性質の理由で、ポリラクチミドは堆肥にすることが可能なプラスチックのための潜在的に生の材料であるとみなされる。熱安定性に加えて、高い光純度がポリラクチドを製造するに用いられる乳酸について必要とされる。合成的に製造された乳酸は、二つの光学異性体の等モル混合物であり、そして高い等級のプラスチックはそれらから製造されることはできない。一方、ほとんど純粋な光学異性体は発酵によって、適した生産生物を選択することによって製造されることができる。いくつかの可能なホモ発酵乳酸バクテリア、例えばラクトバシルス（ge nera Lactobacillus）属、ストレプトコッカス（Streptcoccus）属およびペディオコッカス（Pediococcus ）属、例えばＬ−乳酸の製造のためのラクトバシルスデルブリュッキ（Lactobacillusdelbruckii）およびＤ−乳酸の製造のためのラクトバシルスブルガリクス（Lactobacillus bulgaricus）が存在する。発酵による乳酸の製造は、一度に一つのバッチを発酵することによって通常行われる。乳酸を、連続的に固体担体に結合されたバクテリアにより、また通常の混合された発酵によって製造することも知られている。これら全ての方法において、乳酸の製造はバクテリアの個体数の成長に強く依存している。必要とする成長因子を合成する能力が大変小さいので、乳酸バクテリアは成長のために富裕な培養液を必要としすることが知られている。従って、Ｂ群ビタミンおよび広範囲の様々な異なるアミノ酸が、培養液に添加されなければならない。この添加はしばしば酵母エキスによってなされ、それは糖供給原料の量の少なくとも１０分の１の量で必要とされる。酵母エキスのそのような量のための費用は、糖のものと同じくらいである。成長するバイオマスに結合されない栄養源の一部は生成物中に残留し、而してその純度を低下させる。特別な問題が熱安定等級を製造することを考慮して、窒素栄養源成分により存在する。前述の知識において、純粋な乳酸の工業製造のための理想的な発酵工程は、これまで知られた工程より本質的により純粋な生成物を製造し、これまで知られた方法より実質的により少ない栄養源を必要とし、また本質的により少ないバイオマスを製造する工程であると結論づけることができる。以下に記載された発明はこれらの必要に答える。発明の説明乳酸の製造、実際の発酵反応および生産生物の培養が、個別の製造および再生サイクルに分離されることができることが今や見いだされた。培養段階、即ち再生サイクルにおいて、富裕な栄養源培養液はバイオリアクターを数時間通過させられる。培養段階後、乳酸へと反応する純粋な供給原料溶液はバイオリアクターを通過させられることができる。炭水化物、例えば澱粉または他の多糖、例えばポリデキストロースもしくはイヌリン、またはスクロース、ラクトースもしくはグルコース、または他の単糖、二糖もしくはオリゴ糖またはこれらの混合物が供給原料として使用され得る。適した生産生物は、天然および／または選択された微生物、または適応によって製造された微生物、または所望の乳酸を製造するために改変された微生物を含む。好ましい生産生物は、第一に全ての乳酸バクテリア、例えばアエロコッカス（Aerococcus）属、カルボバクテリウム（ Carbobacterium）属、エンテロコッカス（ Enterococcus）属、エリシペロトリックス（Erysipelothrix）属、ゲメラ（Gemella ）属、グロビカテラ（ Globicatella）属、ラクトバシルス（ Lact obacillus ）属、ラクトコッカス（ Lactococcus ）属、ロイコノストック（ Le uconostoc ）属、ペディオコッカス（ Pediococcus ）属、ストレプトコッカス（ Streptococcus ）属、テトラゲノコッカス（ Tetragenococcus ）属、およびヴァゴコッカス（ Vagococcus）属を含む。またカビ、例えばクモノスカビも用いられ得る。特に好ましい微生物は、ラクトコッカスラクチス（Lactococcus lactis）、ラクトバシルスデルブリュッキ（Lactobacillus delbruckii）、ラクトバシルスブルガリクス（Lactobacillu s bulgaricus）、並びにラクトバシルスレイクマニ（Lactobacillus leichmanii ）、およびリヒゾプスオリザエ（Rhizopusoryzae）を含む。生産生物はバイオリアクター設備中に保持される。好ましくは、生産生物は固体担体に結合される。バイオリアクター中での微生物の保持はまた、例えばマイクロろ過膜技術によって達成されることもできる。バイオリアクター設備は、例えば攪拌タンクリアクター、マルチーダクト管リアクター、バスケットリアクター、流動床リアクター、充填ベッドリアクターまたはフィルターリアクターからなる。充填ベッドリアクターが好ましく使用される。担体は好ましくは実質的に非圧縮性であり、そして好ましくは大きな表面積を有する連続マトリックス、またはさもなくば、大きな表面積を有する多孔質もしくは網目状粒子からなる。マトリックスまたは粒子はさらに、個別の微粒子または微繊維からなる。そのような担体材料テキスチャーは、バクテリア細胞の固定化を考慮して最大表面積を与える。担体は代表的に１０⁸ないし１０¹³細胞／担体１ｍｌの結合能力を有する。特に好ましい態様に従って、担体材料はポリスチレンに集合により粘着して結合されたジエチルアミノエチル−置換されたセルロース（ＤＥＡＥセルロース）の微繊維または微粒子からなる（合衆国特許第４３５５１１７号参照）。他の適した集合基材は、例えばメラミンホルムアルデヒド樹脂およびエポキシ樹脂（ＤＥ３１３０１７８Ｃ２参照）を含む。多孔質、半融ガラスまたはセラミック材料もまた担体として用いられ得る。生産生物は、バイオリアクター中に充填された固体担体に結合される。再生サイクルにおいて、栄養源、例えば酵母エキスおよび他の栄養源により富裕化された供給原料溶液は、リアクターを通って再循環される。炭水化物は、上記された供給原料溶液として用いられ得る。栄養源の再循環は微生物における成長を生じ、そしてそれゆえ酸は、発酵による乳酸の通常の製造と原則的には同じ方法において製造される。最終生成物阻害を予防するために、乳酸が製造されるときに、溶液のｐＨは一定に、一般には５ないし８．５に、好ましくは５．５ないし８．０に、アルカリ、例えば水酸化ナトリウム溶液を添加することによって保持される。再生はアルカリの消費を監視することによって観察され、そしてこの消費が急上昇を起こした後、再生は中止され、再生溶液はバイオリアクターから水によって置換され、そして製造サイクルが開始される。再生溶液タンク中の温度は、タンク中で微生物の成長が妨げられるような、高温（一般に６０ないし８０℃以上）に、または低温（一般に４℃以下）に保持される。同じ再生溶液は数回以上使用される。消費された再生溶液は発酵によって製造された通常の乳酸塩である。製造サイクルは、再生されたバイオリアクターを通って再循環される純粋な供給原料溶液を用いる。温度は、微生物の操作を考慮して最適、言い換えると、一般に５ないし６５℃、例え８０ないし８５℃の高温にさえ保持される。多くの微生物について最適な温度は１５ないし６０℃である。最終生成物阻害を予防するために、乳酸が製造されるときに、再循環溶液のｐＨは一定、通常５ないし７、好ましくは５．５ないし６．５に、アルカリを添加することによって保持される。再循環において最初に入れられた新たに単離された細胞は、製造サイクルの間に再び担体に結合され、そして而して再循環溶液は透明に保たれる。再生後、酸製造能力は数日間十分に保たれる。供給原料が消費されたとき、結果は、視覚評価で、透明であり、また通常のカチオン交換によって乳酸に変換されることができる純粋な乳酸塩溶液である。生成物溶液はバイオリアクターから水によって置換され、そして余分なバクテリアは逆流によって次の再生サイクルの前に除去される。再生サイクルは、微生物の製造能力が本質的に減少するときに開始される。微生物は、０．５ないし３０日の間隔で再生される。得られた乳酸塩溶液は、わずかな検査ろ過を介してカチオン交換に供給され、分離細胞マス分離工程は必要とされない。乳酸塩を酸に転換することに加えて、カチオン交換は生成物から溶解金属および他の異カチオンを除去する。イオン交換された乳酸溶液は蒸発によって濃縮される。水に加えて、発酵において製造された不純物の大部分を構成する酢酸、酪酸および他の揮発性の酸は、その後生成物から除去される。実際の分離および回収方法は従って必要とされない、なぜならば乳酸溶液は既にこの段階において、いくつかの精製段階を経た通常の方法によって製造された乳酸よりも高い純度を有するからである。溶液中に生じた淡色は工業において知られている通常の吸着方法、例えば活性炭および／または吸着樹脂によって除去されることができる。従来の技術を超える本発明の利点は以下のものである。１．栄養源、例えば酵母エキスは通常の量の一部の量でのみ消費される。２．バイオマスの製造は最小化され、そしてバクテリアまたは菌糸体の大部分は次のバッチにおける利用のために引き渡される。３．生成物には、ほとんど栄養源成分および微生物細胞が無く、そして而して後精製は簡単かつ安価である。純度に関して、本発明から導き出される利点は、用いた供給原料の純度に自然に依存している。以下に説明される実施例は本発明をより詳細に説明するけれども、微生物もしくはリアクター、固定化方法、または他の詳細の選択に関して、実施例について本発明の応用性を限定しない。本質的なことは、培養および製造サイクルの効率的な分離である。実施例において、全ての百分率は重量百分率を示す。実施例１担体の前処理、バイオリアクターの充填および細胞の結合３５０ないし８５０μｍの粒子の大きさを有しかつ合衆国特許第４３５５１１７号に従って製造されたＤＥＡＥセルロース粒子、スペザイマー（Spezymer）ＧＤＣ２２０を、細胞のための担体として使用した。担体前処理、バイオリアクターの充填およびバクテリア細胞の結合を以下のように行った。ＤＥＡＥセルロース粒子６００ｇを水中でスラリーにし、そして５時間時々攪拌しながら浸軟させた。水和された担体をバイオリアクターとして与えられかつ内径５０ｍｍおよび高さ１００ｃｍを有するガラスカラム中に注ぎ入れた。形成された担体ベッドの高さは約７５ｃｍであった。バイオリアクター容積の残余は水により満たした。担体ベッドを、水を２％水酸化ナトリウム溶液により置換し、そしてバイオリアクターを通して２時間６０℃の温度でそれを再循環することによって滅菌した。滅菌後、活性なアルカリ液を水により置換し、そしてベッドを、流出液のｐＨが６．０以下になるまでベッドを通して２％硫酸をポンプ送りすることによって中和した。最終段階として、ベッドを水によりフラッシュした。ラクトバシルスデルブリュッキ（Lactobacillusdelbruckii）を１６時間４０ ℃でＭＲＳ培養液で培養した（de Man，J．C.，Rogosa，M.，Sharpe，M．E.，J．Appl．Bacteriol．23，13 0-135，1960）。約１０⁹バクテリア／溶液ｍｌを含む、而して得られたバクテリア培養を、バイオリアクターを通して徐々にポンプ送りし、バクテリアの大部分は担体に結合した。実施例２細胞の最初の再生培養液を、３リットルの体積を有しかつミキサーを備える再生溶液タンク中に、水中に固形グルコース１００ｇ、酵母エキス８ｇ、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ₄）０．２ｇおよび硫酸マンガン（ＭｎＳＯ₄）０．２ｇを２リットルの全溶液体積を与えるように溶解することによって製造した。溶液およびタンクを１２１ ℃の温度でオートクレーブすることによって滅菌した。而して製造された培養液をバイオリアクター中に底部からポンプ送りし、バイオリアクター中に存在する水を置換し、それをバイオリアクターの上端から回収した。バイオリアクターからの水流出が培養液に変化し始めたとき、ポンプ送り方向を反転し、培養液をバイオリアクター中に上部から搬送し、そしてバイオリアクターからの流出溶液を再生タンクに返送した。而して培養液を再生溶液タンクからバイオリアクターへと、体積流速１５ｌ／ｈで再生溶液タンク温度６０℃ およびバイオリアクター温度４０℃により再循環しそして返送した。再生溶液の通過を再生タンクのｐＨを測定することによって観察した。再生に関連して製造された乳酸を、タンクの含有成分のｐＨを６．５に保持するように、再生タンクに１０モル水酸化ナトリウム溶液を添加することによって中和した。再生の開始から４時間で、水酸化ナトリウムの消費はバクテリアが対数的な成長を開始したことを示す急上昇を起こし、そして再生を中止した。バイオリアクター中に存在する培養液を、バイオリアクターからの流出溶液を再生溶液タンクに再導入しながら、底部を通して同時に水をポンプ送りすることによって置換した。バイオリアクターからの流出溶液が無色になったとき、ポンプ送りを中止した。実施例３乳酸の製造純粋なグルコース溶液を、３リットルの容量を有するタンク中に、水中に２リットルの全体積を与えるように結晶グルコース１２０ｇを溶解することによって製造した。グルコース溶液およびタンクを１２１℃の温度でオートクレーブすることによって滅菌した。製造されたグルコース溶液を、バイオリアクター中に底部からポンプ送りし、バイオリアクター中に存在する水を置換しドレインへ搬送するようにした。バイオリアクターからの水流出がグルコース溶液に変化し始めたとき、ポンプ送り方向を反転し、グルコース溶液をバイオリアクターへ上部から搬送し、そしてバイオリアクターからの流出溶液をタンクに返送した。而してグルコース溶液をタンクからバイオリアクターへと、体積流速１５ｌ／ｈでタンクおよびバイオリアクター温度４０℃により再循環しそして返送した。生物反応の進行をタンクの含有成分のｐＨを測定することによって観察した。製造された乳酸を、タンクの含有成分のｐＨを６．５に保持するように、再生タンクに１０モル水酸化ナトリウム溶液を添加することによって中和した。製造サイクルの開始から３日で、水酸化ナトリウムの消費は終了し、そして再循環を中止した。バイオリアクター中に存在する乳酸ナトリウム溶液を、バイオリアクターからの流出溶液がタンクに返送しながら、底部を通して同時に水をポンプ送りすることによって置換した。バイオリアクターからの乳酸ナトリウム流出溶液が水に変化したとき、ポンプ送りを中止した。実施例４乳酸塩の乳酸へのイオン交換実施例３において製造された乳酸ナトリウム溶液を、体積流速１０００ｍｌ／ｈで内径５０ｍｍを有しかつカチオン交換樹脂レライト（Relite）Ｃ３６０（製造者ミツビシケミカルインダストリーズ）１０００ｍｌを含むガラスカラム中に搬送した。透明で黄色がかった乳酸溶液を生成物として得た。生成物の灰分含有量を燃焼によって、窒素含有量をアンテク（Antek ）法によって、全乳酸含有量を水素形態におけるイオン交換樹脂による液体クロマトグラフィーによって、またＬ−乳酸含有量をボーリンガー−インゲルハイム（Boehringer-I ngelheim）酵素法によって分析した。而して得られた全純度は乾燥固形分について乳酸９７％であり、乳酸の９５％はＬ−乳酸であった。灰分含有量は乾燥固形分について０．１％であり、また窒素含有量は乾燥固形分について０．０８％であった。イオン交換カラムを、次のサイクルのために、それを通して５％塩酸１４００ｍｌを搬送すること、水２０００ｍｌによりフラッシすることおよび最後に水３０００ｍｌにより逆流させることによって再生した。実施例４ａ乳酸塩の乳酸へのイオン交換実施例４の実験を微生物としてラクトコッカスラクチス（Lactococcus lactis ）バクテリアを使用して反復した。実施例３において製造された乳酸ナトリウム溶液を、体積流速１０００ｍｌ／ｈで内径５０ｍｍを有しかつカチオン交換樹脂レライト（Relite）Ｃ３６０（製造者ミツビシケミカルインダストリーズ）１０００ｍｌを含むガラスカラム中に搬送した。透明で黄色がかった乳酸溶液を生成物として得た。生成物の灰分含有量を燃焼によって、窒素含有量をアンテク（Antek ）法によって、全乳酸含有量を水素形態におけるイオン交換樹脂による液体クロマトグラフィーによって、またＬ−乳酸含有量をボーリンガー−インゲルハイム（Boehringer-Ingelheim）酵素法によって分析した。而して得られた全純度は乾燥固形分について乳酸９７％であり、乳酸の９８％はＬ−乳酸であった。灰分含有量は乾燥固形分について０．０７％であり、また窒素含有量は乾燥固形分について０．０１％であった。イオン交換カラムを、次のサイクルのために、それを通して５％塩酸１４００ｍｌを搬送すること、水２０００ｍｌによりフラッシュすることおよび最後に水３０００ｍｌにより逆流させることによって再生した。実施例５第二の再生および製造実施例１において製造されたバイオリアクターであって、乳酸ナトリウム生成物を実施例３において記載された方法において置換したバイオリアクターを、次の再生および製造サイクルのために水による逆流によって準備した。洗浄の開始で、濁ったバクテリア懸濁液をベッドから離し、そしてドレインに搬送した。その後洗浄水の流れ方向を上部から底部へと反転し、そして洗浄を流出水が透明になるまで継続した。乳酸へと部分的に反応した培養液であって、実施例２において再生溶液タンク中に残留している培養液を、次の再生のために使用した。バイオリアクター中に存在する水を、リアクター中に底部から再生溶液をポンプ送りすることによって置換した。バイオリアクターからの水流出が培養液に変化し始めたとき、ポンプ送り方向を反転し、バイオリアクターからの流出溶液を再生溶液タンクに返送するようにした。第二の再生を実施例２において記載された方法において行い、そして４時間後に中止し、その後新しい乳酸塩製造サイクルを実施例３において記載された方法において行った。全部で１０回の連続する再生および製造サイクルを、再生サイクルにおいて実施例２において製造した同じ培養液を用いて行い、その後再生溶液タンクを空にし、そして新しい培養液を製造した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．発酵によって純粋な乳酸またはその塩を製造する方法であって、製造工程はバイオリアクター再生サイクルおよび乳酸製造サイクルからなり、該製造サイクルの間に、実質的に純粋な供給原料からなる溶液が、再生された微生物細胞、例えばバクテリア細胞またはカビ菌糸体を含むバイオリアクターを通って再循環され、また該再生サイクルの間に、微生物細胞が、栄養源により富裕化された供給原料溶液を再循環し、それによって微生物の酸を製造する能力を補充することによって再生されることを特徴とする方法。２．炭水化物は、澱粉または他の多糖、例えばポリデキストロースもしくはイヌリン、またはスクロース、ラクトースもしくはグルコース、または他の単糖、二糖もしくはオリゴ糖またはこれらの混合物より選択されることを特徴とする、請求項１に記載された方法。３．バイオリアクター設備は、攪拌タンクリアクター、マルチ−ダクト管リアクター、バスケットリアクター、流動床リアクター、充填ベッドリアクターまたはフィルターリアクターからなることを特徴とする、請求項１または請求項２に記載された方法。４．担体に結合された微生物細胞が用いられることを特徴とする、請求項１、２または３に記載された方法。５．担体は１０⁸ないし１０¹³細胞／担体１ｍｌの結合能力を有することを特徴とする、前述の請求項のいずれか一項に記載された方法。６．再生サイクルは、微生物の製造能力が本質的に減少されたときに開始されることを特徴とする、前述の請求項のいずれか一項に記載された方法。７．微生物は、０．５ないし３０日の間隔で再生されることを特徴とする、前述の請求項のいずれか一項に記載された方法。８．再生のために用いられる再生溶液は、再生タンク中で微生物の成長を妨げるような、高い温度、通常６０ないし８０℃以上に、または低い温度、通常４℃ 以下に保持されることを特徴とする、前述の請求項のいずれか一項に記載された方法。９．バイオリアクターを通って再循環される溶液のｐＨは、５ないし８．５、好ましくは５．５ないし８．０に保持されることを特徴とする、前述の請求項のいずれか一項に記載された方法。１０．バイオリアクターの温度は、微生物の操作を考慮して最適、すなわち一般に５ないし６５℃、例え８０ないし８５℃の高温でさえあることを特徴とする、上述の請求項のいずれか一項に記載された方法。１１．担体は、実質的に非圧縮性であり、そして好ましくは大きな表面積を有する連続マトリックス、またはさもなくば、大きな表面積を有する多孔質もしくは網目状粒子からなることを特徴とする、上述の請求項のいずれか一項に記載された方法。１２．微生物は、乳酸製造バクテリアおよび菌（カビ）より選択されることを特徴とする、上述の請求項のいずれか一項に記載された方法。１３．微生物は、ラクトコッカス（Lactococcus ）属、ラクトバシルス（Lact obacillus ）属、ストレプトコッカス（Streptococcus ）属およびペディオコッカス（Pediococcus ）属、例えばＬ−乳酸の製造のためにラクトコッカスラクチス（Lactococcus lactis）またはラクトバシルスデルブリュッキ（Lactobacillu sdelbruckii）およびＤ−乳酸の製造のためにラクトバシルスブルガリクス（Lac tobacillus bulgaricus）より、またはクモノスカビ、例えばリヒゾプスオリザエ（Rhizopus oryzae ）より選択されることを特徴とする、上述の請求項のいずれか一項に記載された方法。１４．製造サイクルの間に、実質的に炭水化物全含有量は乳酸塩に転換され、そのときアルカリ消費は実質的に終了し、再循環が中止されることを特徴とする、上述の請求項のいずれか一項に記載された方法。