JPH11510064A - バクテリア検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、第１バクテリアに関するアッセイの応答時間を高める方法に関し、ａ）第１バクテリアが許容するファージ粒子による感染に第１バクテリアをさらし；ｂ）感染バクテリアを処理して外部ファージ粒子を不活性化し；ｃ）上記ファージまたはその複製体に許容性であって第１バクテリアの有効倍増速度より高い倍増速度を有する第２バクテリアの存在下で処理されたバクテリアを培養し；そして、ｄ）培養された第２バクテリア細胞中のファージ形成および／または第２バクテリアの成長の程度を評価することを特徴とする。本発明の方法を用いることにより、サンプル中のバクテリアの存在を評価でき、とりわけ、第１バクテリアがゆっくりと生育するバクテリア、特にミコバクテリウムツベルクロシスである場合であり、本発明の方法により、操作者は、サンプル中の低量のバクテリアの存在を、慣用バクテリア培養技術を用いて必要とされる数週間に代わり、数日以内に検出できる。本発明を用いることにより、薬剤または他の処理のバクテリアへの効果またはウイルスの効果を評価することもできる。本発明は、本発明の方法において使用するための診断キットも提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 バクテリア検出方法 本発明は、方法、特に、サンプル中のバクテリアの存在を診断する方法に関す る。発明の背景 適切な培養媒体上において痰のような体液サンプルからのバクテリアを増殖さ せることにより、視覚によるかまたは試験試薬あるいはアッセイを用いて培養媒 体上のバクテリアのコロニーの検出を可能にすることは、共通に実施されている 。そのような技術は、広範囲の培養にわたって適用可能であり、標準のバクテリ ア検出並びに診断の方法として広く受け入れられつつある。しかしながら、検出 可能な程にバクテリアの成長が生じるのに数日あるいは数週間さえ要するように 、バクテリアが低成長タイプである場合の問題が生じる。これは、特に幾つかの ミコバクテリウム（Mycobacterium）種またはレジオネラ（Legionella）種の場 合であり、バクテリアの検出可能なコロニーの増殖に４週間以上を要しうる。こ れは、患者のバクテリアの感染を確証するのに受容不可能な遅延を強いるので、 バクテリアの存在および同定のより迅速な評価を提供することが望まれる。 PCT出願番号WO92/02633には、生育可能なバクテリアのサンプルを用意して、 そのバクテリアに特異的なウイルスの株を感染させることが提案されており、そ のようなバクテリア感染ウイルスは、バクテリオファージまたはより一般にはフ ァージと呼ばれる。ファージ粒子の幾つかは、バクテリアに感染してバクテリア 細胞内で複製する。バクテリアにより吸収されないそのようなファージ粒子は、 バクテリアのキャリアーの母液またはマトリックス、典型的には培養媒体中に残 る。感染されたサンプルを次に例えば加熱および／または酸により処理して殺す かまたは洗浄剤で洗浄するならば、暴露された外側のファージ粒子、即ち、外部 のファージ粒子は不活性化されるかまたは除去される。感染性の内部のファージ 粒子は不活性化されないが、バクテリアの細胞内で保護されているからである。 次に、処理された感染バクテリアは、ファージ粒子により感染されうるのに許容 されるようなさらなる未感染バクテリアの存在下において培養できる。感染バク テリア 内のファージ粒子は複製して、細胞壁が破壊されるかまたは溶解して複製したフ ァージ粒子を放出させる。この子孫ファージ粒子の第１の世代が他のバクテリア 細胞に感染して、感染、複製そして溶解の連続するサイクルを引き起こす。これ は、培養媒体中でのファージ粒子の数の対数増加を提供する。初期の感染バクテ リア細胞数が小さい場合であっても、バクテリア細胞の成長の低下あるいは多数 の複製したファージ粒子のいずれかが測定されるかまたは観察できるので、即ち 、評価されるサンプル中の初期のバクテリア細胞の存在の検出感度が高められる 。 この修飾はバクテリア細胞の検出感度を高めて素早く成長するバクテリア、例 えばサルモネラ（Salmonella）種の検出に首尾よく使用されてきた。しかしなが ら、ゆっくりと成長するバクテリア、例えばミコバクテリア種に関しては、ファ ージ粒子の検出可能な集団を与えるためのこの方法に必要な時間は他の技術と実 質同じままであり、該方法はそのようなバクテリアに伴う時間の問題を解決しな いことを我々は見いだした。ゆっくりと成長するバクテリアの迅速且つ正確な検 出を達成する方法における要求が、なお存在する。 我々は、ゆっくりと成長するバクテリアが迅速に検出されうるような方法を考 案し、即ち、そのような検出に関して数日または数週間さえ要したことにおける 問題を克服した。その方法は、与えられたバクテリアの抗生物質および他の薬剤 に対する感度を測定すること、および与えられた抗生物質または薬剤が与えられ たバクテリアに対して活性であるか否か、または与えられた殺ウイルス剤組成物 が与えられたウイルスに対して効果を有するか否かを測定することにも使用でき る。該方法は単純な装置を用いて熟練していない人にも実施できるので、該方法 は、熟練した微生物学者並びに複雑な装置を得ることができない第３国における 操作を容易にさせる。発明の概要 したがって、一つの側面から、本発明はサンプル中の第１バクテリアの存在を 検出するための方法に関するが、該方法は、以下の工程： ａ．第１バクテリア細胞の生育可能なサンプルに該バクテリアに特異的なファ ージを感染させ、それにより少なくとも幾つかのバクテリア細胞各々にひとつま たはそれ以上のファージ粒子を吸着させ； ｂ．バクテリア細胞により吸着されなかったファージ粒子を不活性化するかま たは除去し； ｃ，第１バクテリア細胞の増殖速度よりも高い増殖速度を有する少なくとも一 つの他の第２バクテリアを含む培養媒体中において感染第１細胞を培養し、それ により感染第１バクテリア細胞の溶解により放出されたファージ粒子により少な くとも幾つかの第２バクテリア細胞を感染させ、但し各々の感染バクテリア細胞 は感染サイクルの次の世代のさらなる感染源として作用し；そして ｄ．工程ｃにおける複製したファージ粒子の数あるいは第２バクテリアの成長 の低下の何れかを監視することにより試験されたサンプル中の第１バクテリア細 胞の存在を測定すること からなる。 好ましくは、第２バクテリアの培養および感染はさらなるバクテリア細胞の成 長並びに溶解が実質上停止する定常状態またはそれに近い状態で実施する。この 状態において、ファージ粒子の活性のために実質上一定の数のバクテリアの死細 胞が培養媒体中に存在する。ファージの複製が生じる培養媒体の領域は、生育可 能なバクテリアの成長のためにより濁っているか、不透明であるか、さもなくば 視覚上異なる周囲の培養媒体中で明白なスポットとして視覚により検出すること ができる。ファージの活性によりバクテリアの成長が低下したこれらの領域は、 一般にプラークと呼ばれる。第２バクテリアは第１バクテリアよりも高い速度で 増殖するから、最初に感染した第１バクテリア細胞が検出可能なプラークを形成 するのに要する時間は大幅に低下する。プラーク形成におけるこの加速は、同じ バクテリアを初期ファージ感染並びに続く培養工程に用いる場合には生じない。 別法として、工程ｃの終わりにおける培養媒体中の複製したファージ粒子の存 在は、慣用のファージアッセイ技術を用いて評価することができる。これは、上 記のプラークの存在の測定に加えて、または独立に実施することができる。 本発明の方法は、即ち、サンプル、例えばミコバクテリウムツベルクロシス（ Mycobacterium tuberculosis）に感染しているかまたはレジオナイレス（Legion n aires）の疾患の疑いのある患者であって、そのようなバクテリアが初期サンプ ルに存在したことについてあらゆる観察可能な示唆を与えるのに、慣用評価法で は数日または数週間を要した患者からのサンプル中の、ゆっくりと成長するバク テリアの検出に適用することができる。そのような場合、初期サンプルの一部を 予測されるバクテリアに特異的なファージで感染させて、不活性化工程ｂを通過 させるが、ファージ粒子は感染した細胞により保護されるからである。これらの 保護されたファージ粒子は、感染細胞の培養において各々の感染された第１バク テリア細胞の周辺においてファージまたはプラークの形成を引き起こす−工程ｃ 。疑われたバクテリアがサンプル中に存在しなかったなら、工程ｃにおいてファ ージまたはプラークは事実上形成されないはずであり、培養媒体は実質上均質な 外観を呈するはずである。 本発明は、抗生物質または他の薬剤が何らかの殺バクテリア作用を有するか否 かを測定する試験において、抗生物質または他の薬剤で処理された公知のバクテ リアを用いて実施してもよい。この場合、工程ｃにおけるファージまたはプラー クの数は、最初のバクテリアを殺すことにおける抗生物質または薬剤の効果また はその反対を示す。慣用の試験方法においては、抗生物質または薬剤はバクテリ アに適用されるはずであり、死細胞の数は抗生物質または薬剤の効果の直接の指 標となるはずである。しかしながら、顕微鏡を用いなければ、個々の死細胞を観 察することは難しい。本発明のこの応用において、第１バクテリアへの該細胞を 殺すかもしれない抗生物質または薬剤の処理は、ファージ粒子による残りの生育 可能な第１バクテリアの感染と組合わされて、どれくらいの第１バクテリアが抗 生物質または薬剤による殺傷から逃れたかを測定する。 本発明の他の応用において、ウイルスまたはファージのサンプルは殺ウイルス 作用またはウイルス成長制御作用を有する組成物で処理される。処理されたファ ージを用いて、次にその特異的なファージに許容性の生育可能な第１バクテリア 、即ちそのファージにより感染され得るバクテリアに感染させる。感染したバク テリアは、次にバクテリア細胞に感染せずに外部に暴露されたままのファージま たは細胞に対して外側のファージ粒子を不活性化するように処理される。次に、 不 活性化された感染第１バクテリア細胞物質を第２の早く増殖するバクテリアの存 在下で培養して、プラークを生成させるが、感染第１細胞中のファージ粒子は複 製して溶解した。ファージ粒子の最初の処理が完全に効果的であるなら、第１バ クテリア物質が感染された際に生育可能なファージ粒子は存在せず、したがって 、第２バクテリアの存在下での培養液に生育可能なファージ粒子は持ち込まれな い。したがって、第２バクテリアは増殖して、培養媒体に実質的に均一な発色ま たは不透明性を付与する。しかしながら、もしファージ粒子の最初の処理が完全 に効果的でなかったなら、ファージ粒子は第２バクテリアの培養液に生育可能な ファージ粒子が持ち込まれ、そして視覚により検出可能なプラークを生じる。 便宜上、本発明は、以後、ゆっくりと生育するミコバクテリア種の存在の評価 に関して記載される。本発明は、広範囲の動物または植物宿主からのバクテリア に適用できるが、哺乳類宿主からのバクテリアの検出に特に有用であり、便宜上 、本発明は、バクテリアに感染していると疑われたヒトからの体液の初期サンプ ル中のゆっくりと生育するバクテリアの評価に特に言及して記載される。 用語、ゆっくりと生育するバクテリアは、本明細書においては、7H9として公 知の培地90％v/vおよびOADCとして公知の栄養10％v/vを含む培養媒体中での37℃ における普通の増殖条件下で10時間を超えるバクテリア細胞集団が２倍になるこ とにより評価されるとおりの有効な増殖サイクル（有効倍増速度）を有するもの を意味する。そのようなバクテリアは、検出可能なファージ集団またはプラーク を生ずるのに、普通は慣用培養技術を用いて72時間以上を要するはずであるか、 または培養が難しい。本発明の方法を用いれば、ファージまたはプラークは、そ のようなバクテリアの場合、通常は16時間以内で検出できる。 典型的なゆっくりと生育するバクテリアは、ミコバクテリア種、特にミコバク テリウムツベルクロシス（Mycobacterium tuberculosis）、ミコバクテリウムパ ラツベルクロシス（Mycobacterium paratuberculosis）およびミコバクテリウム エビウム（Mycobacterium avium）；レジオネラ（Legionella）種、特にレジオ ネラニューモフィラ（Legionella pneumophila）；ヘリコバクター（Helicobact er）種、特にヘリコバクターピロリ（Helicobacter pylori）；ストレプトコッ カ ス（Streptococcus）種、特にストレプトコッカスアジャセンス（Streptococcus adjacens）；およびリッケチア（Rikettsia）種、特にリッケチアプロワゼキ（ Rikcttsia prowazekii）を含む。本発明は、10時間より長い瞬間倍増速度を有す るが、例えばストレプトコッカスデフェクテンス（Streptococcus defectens） およびエクストリモービルズ（Extremoobiles）種を最初に増殖させる困難ゆえ に、これよりも大きい平均有効倍増速度を有するバクテリアに適用してもよい。 ゆっくりと生育するバクテリアなる用語は、したがって、本明細書および請求の 範囲にて用いられて、遺伝的に遅いプロパゲーターであるバクテリア、およびそ れらの増殖サイクルにおける間欠性の減衰または干渉ゆえに、10時間より長い遅 い平均増殖速度を有するバクテリアを指す。 本発明はそのようなゆっくりと生育するバクテリアを検出することにおける特 別の利益を有するが、本発明は、検出可能なファージ集団またはプラークの形成 のスピードを増加させることが望まれる場合のあらゆるバクテリアに適用でき、 例えば、ヒトサンプル、食品生成物またはキッチン等のバクテリアの汚染を測定 するための採取されたサンプル中の10時間より短い倍増速度、例えば４から10時 間の範囲を有するバクテリアの検出において、慣用のバクテリア培養技術を用い て達成されるはずの速度より迅速なバクテリアのための試験を提供する。便宜上 、本発明は、以下において、第１バクテリアとしてミコバクテリウムツベルクロ シスを用いる場合について記載される。 第１バクテリアは、患者からのあらゆる適切な形態において、例えば、痰また は他の粘膜分泌物中に存在しうる。しかしながら、本発明は、ヒト、他の哺乳類 例えばウマ、ウシ、ヒツジおよびブタの他の体液サンプル、例えば血液、尿また は糞便サンプル、および植物体例えば葉または根菜類または実からのサンプルに 適用することができる。便宜上、本発明は、ヒト患者の痰サンプルの試験に関し て以下に記載される。 典型的には、サンプルは、バクテリアがまだ生育可能な新たに採取された液体 として存在する。しかしながら、試験前の保存および／または輸送のためにサン プルが凍結または乾燥している場合は、サンプルを適切な培養媒体中において約 20から55℃、好ましくは37℃において保持して、本発明の方法の工程ｂにおいて バクテリアが生育可能であってファージ粒子により感染を受けることができるこ とを保証することが望ましい。所望であれば、初期サンプルは処理することがで き、例えばＮ−アセチルシステインで希釈し、および／またはアルカリ、界面活 性剤または酸で処理して、評価されるバクテリアの検出を干渉するかもしれない 他のバクテリア集団を減少させることができる。そのような前処理は、評価のた めのバクテリアサンプルの調製において共通に使用される条件および技術を用い て実施することができる。しかしながら、本発明の方法は慣用試験法より迅速で あり、他のバクテリアの作用がほとんど顕著ではないから、他のバクテリアから の初期サンプルを浄化する（decontaminate）必要性は、ゆっくりと生育するバ クテリアを評価する慣用法に比較して減じられる。 初期サンプルは生育可能な状態において評価されるバクテリアを含む。これは 通常液体またはゲル中、例えばカンテン、培養媒体中にある。しかしながら、キ ャリアー媒体は、粒子状固形物又は小孔（foraminous）材料の孔、例えばセラミ ックのフリットまたは気泡（foamed）プラスチックまたはフィルターペーパーま たは網状物質中のメッシュ孔であって適切な栄養組成物中に浸されたものであり うる。便宜上、本発明は以下において、続いてゲルキャリアー媒体に適用される 初期バクテリアサンプルのための液体キャリアー媒体の使用に関して記載される 。 初期サンプルは、評価される第１バクテリア種に特異的なファージであって且 つ感染した第１バクテリアが本発明の方法の工程ｃにおいて培養される際第１バ クテリアに特異的な、適切なファージに感染させる。ファージはバクテリア種に 属特異的であってよく、そのためファージは属中の範囲のバクテリアに感染する 。しかしながら、特定のバクテリアを評価する場合には、狭い特異性のファージ を用いることが好ましいかもしれない。所望であれば、ファージはファージ特異 性を増大させるように修飾してよく、それにより、評価されるサンプル中の他の バクテリアの感染を減じる。適切なファージの修飾は、公知の技術例えば感染さ れる特定のバクテリアに関する遺伝上の修飾により達成でき、例えばPCT出願番 号WO92/02633に記載されているとおりである。本発明の使用のための典型的なフ ァ ージは、AG1，B1，BG，BK，C3，D29，D34，D56A，GS4E，HP1，L1，13およびTM4 を含む。本発明の使用のための最適なファージは使用される第１および第２バク テリアに依存するが、このファージまたはバクテリア細胞から溶解により生成し たその複製物は用いられるバクテリアに供される必要があるからである。即ち、 ミコバクテリウムツベルクロシスの存在を評価する際にミコバクテリウムスメグ マティスを第２バクテリアとして用いる場合、ファージD29が適切であり、そし てミコバクテリウムエビウムを用いるならファージTM4が適切である。 ファージは例えば液体媒体中の培養物（cultivar）の形態で提供することがで き、あるいは、凍結乾燥またはスプレー乾燥粒子の形態で提供することができる 。ファージは、任意の適切な技術を用いて且つ任意の適切な条件下で生育可能な バクテリアサンプルと混合する。典型的には、バクテリアサンプルは液体の形態 であって、ファージ感染は液体キャリアー中でバクテリアサンプルに適用される 。 ファージ感染は、55℃まで特に約37℃の温度において10分から４時間進行させ て、大多数のバクテリア細胞を各々少なくとも一つのファージ粒子で感染させる ことが好ましい。しかしながら、過剰の感染は、以下に記載される酸を用いた非 吸着ファージ粒子の不活性化にて残存しないほどにバクテリアを弱めるかもしれ ない。与えられたバクテリアの最適な感染時間は、単純な試行錯誤およびエラー の試験によるか、または感染バクテリアの顕微鏡試験により決定することができ 、本発明の方法の次の段階にて経験される条件に関連する。 次に、感染したバクテリアサンプルを処理して、バクテリア細胞中に吸収され ずにバクテリア細胞外に残ったあらゆる外部ファージ粒子を除去するかまたは不 活性化して、不活性化段階の間に導入される条件に暴露される−工程ｂ。便宜上 、不活性化なる用語は、本明細書において、非吸着ファージ粒子を、本発明の方 法の次の工程において実質上複製不可能にするあらゆる方法を集合して指す。即 ち、この用語は、サンプルからのファージ粒子の物理的な分離または除去あるい は粒子の脱活性化を含む。この不活性化は、あらゆる適切な技術、例えばPCT出 願番号WO92/0233に記載された技術を用いて実施することができる。好ましい技 術は、感染バクテリア細胞から物理的に外部ファージ粒子を分離するために感染 サンプ ルを洗浄することおよび濾過を含み；感染サンプルを酸、界面活性剤または化学 薬品により処理して外部ファージ粒子をを殺すかまたは不活性化するか；または のちにバクテリア細胞から分離可能な適切な基質上に、感染サンプルからの外部 ファージ粒子を選択的に吸着させることによる。 便宜上、本発明は、以下に感染バクテリア細胞と外部ファージ粒子の混合物の 化学薬品または酸処理に関して記載される。そのような処理は、無機酸またはそ の鉄塩を用いて実施することが好ましく、例えば硫酸アンモニウム鉄またはリン 酸または硫酸；Ｃ_1-4脂肪族カルボキシル酸、特に酢酸であり希釈した氷酢酸あ るいは酢であってよく；または酸のバッファー媒体である。処理は、用いられた ファージを不活性化するが感染第１細胞を殺さないバクテリアキャリアー媒体中 でｐＨ値を得る。最適な洗浄およびｐＨ条件は評価されるバクテリアに依存し、 単純な試行錯誤およびエラー試験により決定できる。典型的には、感染バクテリ ア材料は酸性にされて、上昇温度、典型的には37℃にて十分な時間、典型的には 約15分間インキュベートされて、次にアルカリまたは塩基の添加によりｐＨをほ ぼ中性に調節する。 別の技術において、外部ファージは殺ウイルス剤を感染バクテリア材料に添加 することにより殺される。最適な殺ウイルス剤は殺されるファージおよび第１バ クテリアの性質に依存し、単純な試行錯誤およびエラー試験により容易に決定で きる。即ち、第１バクテリアがミコバクテリウムツベルクロシスである場合の本 発明の使用のための適切な殺ウイルス剤は無機酸の鉄塩および不飽和脂肪酸およ び12から24の炭素原子を含むアルコールを含み、任意に化学線または他の照射、 特に約400から600nmの波長のＵＶ照射を伴う。 不活性化後、バクテリア材料は少なくとも幾つかの生育可能なファージ粒子を 内部に有する生育可能な第１バクテリア細胞を含む。この混合物は、第２バクテ リアを含む培養混合物またはバクテリア混合物と混合される。これらの第２バク テリアは、第１バクテリアの細胞内でファージ粒子により感染可能であること、 ファージに対して許容性であること、および評価される第１バクテリアの増殖速 度よりも大きい速度で増殖することを特徴とする。第２バクテリアは第１バクテ リアの倍増速度の少なくとも２倍の倍増速度を有することが好ましい。最適な相 対増殖速度は第１バクテリアの実際の増殖速度に依存し、検出可能なファージ集 団および／または減じられた第２バクテリアの成長エリアまたはプラークを生じ るのにかかる時間が過剰でないならば、極めてゆっくりと生育する第１バクテリ アに関して高い相対増殖速度が望まれる。典型的には、第２バクテリアは第１バ クテリアの４から20倍の倍増速度を有する。即ち、初期サンプル中のミコバクテ リウムツベルクロシスの評価のためには、ミコバクテリウムスメグマティスを第 ２バクテリアとして用いた場合に特に迅速な結果を与えることを我々は見いだし た。本発明の使用のための他の適切な第２バクテリアは、他のミコバクテリア、 例えばミコバクテリウムアウルム（Mycobacterium aurum）を含む。 所望であれば、感染した第１バクテリアを、第２バクテリアと混合する前に、 不活性化工程ｂの後に放置して少なくとも１世代の複製を達成して感染細胞から ファージ粒子を放出させることができる。そのような放置は複製したファージ粒 子が感染バクテリア細胞から放出されるのを可能にして、第２バクテリア細胞内 の潜在的な感染のための多くの部位を提供して、初期サンプル中の少量の生育可 能な第１バクテリアの検出を助ける。 本発明の方法の工程ｃにおいて、感染第１バクテリアは第２のより早く増殖す るバクテリアの存在下で培養される。ファージ粒子が感染第１バクテリア細胞中 で複製するとき、細胞が溶解する際に感染細胞から放出されるより多数のファー ジ粒子を形成する。放出された各々のファージ粒子は隣のバクテリア細胞に感染 することができ、それは第１バクテリア細胞でも第２バクテリア細胞でもよい。 それらの新たに感染したバクテリア細胞中の各々のファージ粒子は複製すること ができて放出されることによりさらにバクテリア細胞等に感染する。 第１および第２バクテリアの混合物の培養は、あらゆる適切な技術および条件 を用いて実施することができる。典型的には、第２バクテリアは、感染第１バク テリアと混合された液体またはゲル媒体中で培養物の形態で用いられる。しかし ながら、第２バクテリアは凍結またはスプレー乾燥粉末の形態で、あるいはその 上に含浸またはコートされたバクテリアを有する固形粒子として用いてよい。便 宜上、本発明は、以下においてカンテンゲルキャリアー中の第２バクテリアを感 染第１バクテリアに適用することに関して記載される。処理された第１バクテリ アサンプルに添加される第２バクテリアの量は、サンプル中の第１バクテリア細 胞の予測される量に依存して広範囲に変更でき、本発明の方法からの結果の範囲 で所望の時間が必要とされる。一般に、大量の、典型的には第１バクテリア細胞 の数の２から50倍の第２バクテリア細胞を提供することにより、感染第１バクテ リア細胞からの溶解によるファージ粒子が他の第１バクテリア細胞よりも第２バ クテリア細胞に感染する可能性を高める。第２バクテリア細胞に対する第１バク テリア細胞の最適な比率は、単純な試行錯誤およびエラーの試験により容易に確 立することができる。 培養プロセスの間、培養媒体は、複製したファージ粒子、生育可能な第２バク テリアまたはファージ粒子の作用のために死んだバクテリア細胞のプラークの存 在を反映する幾つかの検出可能な方法において変化する。典型的には、第２バク テリアの成長はカンテン培養媒体中の曇りまたは発色を起こし、そしてファージ 粒子およびそれらが放出される関連のバクテリア死細胞は発色または曇った媒体 中にわずかに曇ったかまたは明瞭なスポット、プラークをもたらし、その結果プ ラークが視覚により検出および評価できる。別法として、異なった生育をするエ リアは、慣用染色技術を用いて差別的染色により検出できる。培養媒体が適切な 成分を含む場合、バクテリア細胞は溶解した際に発光体（lumiphores）を放出し て、それらはＵＶ照射下で検出でき、例えばPCT出願WO92/02633に記載されてい るとおりである。増大した数の複製ファージ粒子も、免疫技術例えばELISAまた は他の酵素技術により検出できる。 ファージ粒子および／またはプラークの数は存在する第１バクテリア細胞の数 の指標を与え、よって、初期サンプル中のそのような細胞の存在またはその反対 が評価される。 上記に示すとおり、本発明の方法は、患者からの初期サンプル中の予測される バクテリア株の存在の迅速な試験を提供する。第１バクテリアに感染するために 使用されるファージ粒子の適切な選択により、試験は特定のバクテリアに特異的 にできる。別法として、試験は初期サンプル中に存在するバクテリアの種類に関 する広い指標を提供することができる。本発明の方法は、即ち、必要とされる結 果にあつらえることができる。結果は今まで必要とされた数日どころか、ものの 数時間で得ることができるから、初期の一般的なスクリーンを実施して、初期サ ンプル中に存在するバクテリアの一般種が同定されれば、特定の試験を実施する のに実用的である。本発明の方法は単純な細胞培養技術を用いて実施することが できて、その結果は視覚により評価できるから、本発明の方法は、熟練した労力 および複雑な実験室の設備が利用できない第３国において容易に使用することが できる。 本発明は、サンプル中の第１バクテリアの存在または不在を検出するための本 発明の方法において使用される診断キットも提供するが、該キットは、第１バク テリアのための公知のファージ感染源；第１バクテリアよりも早い倍増速度を有 し且つ上記ファージ感染により感染した第１バクテリアから放出されるファージ 粒子に許容性の生育可能な第２のバクテリアの源を含む。好ましくは、該キット は、ファージ感染の上記源により完成した第１バクテリアからの外部ファージ粒 子の不活性化および／または除去のための手段を含む。 本発明は以下の実施例により今例示されるが、すべての部（parts）は、他に 述べない限り重量により与えられる。実施例１ 本発明の原理は、少なくとも10時間の典型的倍増速度を有する第１バクテリア および約２時間の倍増速度を有する第２バクテリアとしての早く生育するミコバ クテリウムスメグマティスを表す、ゆっくりと生育するワクチン株BCGを用いた 安全なモデル中で試験された。この実施例は、液体および固体カンテン工程を組 み合わせて、外部ファージは酸で不活性化した。 工程１．カンテンを基材とする媒体からのBCGのコロニーを7H9プラス10％（v/v ）OADC付加物（ディフコ）（以後、7H9、OADCと呼ぶ）中の液体培地中にて37℃ において生育させて、検出アッセイにおいて使用できる細胞のストックを生じた 。臨床の場において、これらの細胞は臨床サンプルを直接の起源とし、この前培 養 工程を必要としないはずである。臨床の場において、ゆっくりと生育する細胞は ミコバクテリウムツベルクロシスである。 工程２．BCG細胞を含む液体培地を連続希釈して、各々の希釈駅10μlを10⁵のD29 バクテリオファージ（ファージ）を含む10μlの7H9、OADCと混合した。対照サン プルも、 ａ）BCGを含まず、但しあらゆるBCGを含まない媒体10μlをファージと混合し ；そして ｂ）ファージと混合する前にBCGを80℃において30分間加熱することにより加 熱殺菌した対照 を含むように設定した。 工程３．37℃において90分間インキュベーションした後、20μlの1.2％（v/v）H Clを添加して、外部ファージ粒子を不活性化した。 工程４．次に、20μlの22.2mM NaOHを加えて酸性を中和した。 工程５．次に、10μlのこの溶液を、7H9、OADC、定常期のミコバクテリウムスメ グマティスの培養液を５％（v/v）および1.5％のバクトアガー（ディフコ）を含 むカンテンプレートにスポットした。 工程６．次に、プレートを37℃においてインキュベートして保護された内部ファ ージ粒子がBCG細胞中で複製できるようにした。複製したファージ粒子はBCG細胞 の溶解を起こさせて放出された。少なくとも幾つかの放出されたファージ粒子は ミコバクテリウムスメグマティスに感染してこれらの早く成長する細胞中の感染 サイクルを確立した。 工程７．16時間後、次にプレートは、非感染のミコバクテリウムスメグマティス インディケーター細胞の曇った生育の間のファージの溶解またはプラークの透明 なエリアについて観察した。結果を記録して以下に示す： サンプル 溶解の程度 希釈していないＢＣＧ ＋ １０^-2希釈液 １０プラーク １０^-4希釈液 − 熱殺菌ＢＣＧ − ＢＣＧを含まないファージのみ − ＋ 個々のプラークが観察されるが計数するには多すぎる − プラークなし 熱殺菌したBCGおよびファージのみの対照は陰性のままであり、酸による不活 性化からファージが保護されるためには、生きた細胞が必要であることを示した 。生きたBCGはファージを保護することができて、感染してBCG細胞内で複製した 。BCG細胞の溶解に際して、複製したファージ粒子は放出されて少なくとも幾つ かのファージは早く生育するミコバクテリウムスメグマティス中で複製サイクル を始め、16時間後にプラークを生じた。溶解を示したBCGの最も高い希釈液は10^{- 2} であったが、用いた元のBCG培養液がまだ初期対数期にあったので、約10³BCGコ ロニー形成ユニットを表す。このアッセイは、したがって、与えられたサンプル 中のゆっくりと生育するバクテリアの生存数ほんの10³の存在を検出する能力を 有する。この感度は顕微鏡に関して記載された感度より高く、慣用法をミコバク テリアの検出に適用した場合の培養物の感度とほぼ同じである。しかしながら、 観察可能なプラークを作らせるのに要する時間は、慣用の培養技術に要する４− ６週に比して24時間より短かった。実施例２ 実施例１の方法を繰り返したが、固体カンテン培地中でアッセイを実施した点 、並びに酸処理によらずに洗浄により外部ファージを除去した点が異なる。 工程１．工程１は実施例１に記載された通りに実施した。 工程２．BCG培養物の連続10倍希釈を7H9，OADC中で実施した。各希釈物10μlを カンテンプレート（7H9，OADC，1.5％バクトアガー）上にスポットした。加熱殺 菌したBCG培養物10μlも同様のプレート上にスポットして対照プレートを提供し た。プレートは37℃に保った。 工程３．１片のフィルターペーパーを7H9，OADC，３％ミルクパウダー，ミリリ ットルあたり10⁶のD29バクテリオファージで湿潤した。 工程４．５片のフィルターペーパーの堆積物をファージで浸したフィルターペー パー上におき、そしてフィルターペーパーの堆積物を通した毛管作用により感染 細胞の周囲から外部ファージを除去した。 工程５．フィルターペーパーの堆積物を完全に湿潤させた場合、すべてのフィル ターペーパーをカンテン表面から除去して捨てた。 工程６．次に、ニトロセルロースフィルターを用いてカンテン表面から感染細胞 を取り除いた（stripped）。ニトロセルロースフィルターをカンテン上におき、 湿潤させてはがした。次に、このフィルターを、より早く生育するミコバクテリ ウムスメグマティスのインディケーター細胞（7H9，OADC，定常期のミコバクテ リウムスメグマティス培養液５％（v/v）、1.5％バクトアガー）を含むカンテン プレート上の下方の細胞側においた。 工程７．プラークが視覚により観察できるまで、工程６のプレートを37℃におい てインキュベートし、結果を記録した。 サンプル 溶解の範囲 未希釈ＢＣＧ ＋＋＋ １０^-1希釈 ＋＋＋ １０^-2希釈 ＋＋ １０^-3希釈 ＋ １０^-4希釈 − 加熱殺菌ＢＣＧ − ＋＋＋ インディケーター細胞の完全な溶解（細胞生育なし） ＋＋ プラーク間にインディケーター細胞の幾らかの生育を伴うプラーク ＋ 個々のプラークは観察されるが計数するには多すぎる − プラークなし 加熱殺菌された対照は再び陰性のままであったことから、洗浄による除去から のファージの保護には、生きた細胞が必要であったことが示された。生きたBCG は再び、感染してBCG細胞内で複製したファージを保護することができた。BCG細 胞の溶解時に、複製したファージは放出されて少なくとも幾つかのファージは早 く生育するミコバクテリウムスメグマティス中で複製サイクルを始め、16時間後 にプラークを生じた。溶解を示したBCGの最も高い希釈液は10^-3であったが、用 いた元のBCG培養液がまだ初期対数期にあったので、約10³BCGコロニー形成ユニ ットを表す。このフォーマット中のこのアッセイは、したがって、与えられたサ ンプル中のゆっくりと生育するバクテリアの生存数ほんの10³の存在を検出する 能力を有する。実施例３ この実施例は、バクテリアアッセイを実施するための別の方法を例示する。ファージ感染工程のための痰サンプルの加工 ： 完全痰サンプルを滅菌20mlスクリューキャップしたガラスボトル中に入れる。 １．等量の「浄化剤」をサンプルに添加してサンプルを浄化して液体化する。 ２．希釈サンプルを数回倒置することにより混合して、混合物を10分間放置して 痰を液体化する。 ３．次に、サンプルを4000×ｇにて10分間遠心分離して、細菌を沈殿させる。 ４．その結果の上清液体を、希釈しないハイコリン（Hycolin）殺菌剤に注ぎ、 捨てる。 ５．細菌沈殿物を再び20mlの滅菌蒸留水に懸濁する。 ６．懸濁した細菌混合物を工程４と同じように遠心分離して細菌を沈殿させる。 ７．細菌沈殿物を次に1.0mlの「生育媒体」中に再懸濁して35-37℃において24時 間放置してサンプルをアッセイ試験に提供する。 ８．対照サンプルは、1.0mlの「生育媒体」を新しいチューブに加えて不活性化 対照を提供して；そして「ヘルパー細胞」１滴を新しいチューブ中の1.0mlの「 生育媒体」に添加して、内部ファージの保護に関する陽性対照を提供する。細菌へのバクテリオファージの感染 ９．滅菌パステット（pastette）を用いて、１滴（50μl）の「バクテリオファ ージ」を、各試験サンプル並びに不活性化対照サンプルに添加する。振盪により 混合して、3.0時間、35-37℃において振盪せずにインキュベートする。内部ファ ージの保護に関する陽性対照はこの時間を進行させない。 10．サンプルにバクテリオファージを添加して2.5時間後に、ミコバクテリウム スメグマティスの沈殿を陽性対照チューブに添加する。 11．すべての試験サンプルおよび対照サンプルを各々全部で３時間インキュベー トする。２滴（100μl）の「不活性化試薬」を滅菌パステットとともに各サンプ ル並びに対照サンプルに添加する。サンプルを完全に混合して５分間放置する。 12．滅菌プラスチックパステットを用いて、「生育媒体」を各サンプル中の５ml の目盛線まで添加して、含有物を混合して、４時間、35-37℃において振盪せず にインキュベートする。バクテリオファージのプラークの視覚化 13．滅菌プラスチックパステットを用いて、1.0mlの「ヘルパー細胞」を各試験 サンプルおよび対照サンプルに添加する。 14．５mlの溶解基材カンテンを各サンプルに添加して、サンプルとカンテンをゆ っくりとした渦巻きにより混合する。 15．各チューブの含有物を冷却した対応の標識した「インディケータープレート 」に添加する。 16．「インディケータープレート」はベンチ上に30分間放置してカンテンを固化 させる。 17．「インディケータープレート」を37℃において15時間おく。 18．各「インディケータープレート」上のプレート数を、暗いバックグラウンド に対してプレートを観察することにより視覚により数える。プレート上において 、「ヘルパー細胞」の生育は、バクテリオファージがこの濁りの中で明瞭または 透明なエリアとして観察されるので（プラーク）溶解エリアと共に不透明なエリ アとして観察される。対照チューブの検査 試験サンプル中の結果を分析する前に、不活性化対照サンプルについて、不活 性化処理後も生きているファージによる溶解の発生に関して試験する。このプレ ート上には10未満のプラークが存在するべきである。10プラークより多ければ、 外部ファージの化学不活性化が不完全であって、アッセイを繰り返さねばならな い。陽性対照プレートをプラークに関して試験する。広範囲な溶解が生じるべき であり、このプレート上には多数のプラークが存在するべきである。幾つかの状 況においては、プレートがバクテリアの芝生を有さないかもしれない結果を伴う 細胞の完全な溶解のために、「ヘルパー細胞」の生育がまったくないかもしれな い。 試験サンプルプレートの各々を試験して、プラークまたは溶解の存在を以下の基 準に従い評価する： ＋＋＋ 完全な溶解、バクテリアの残渣なし ＋＋ 完全な溶解であるが、幾らかのバクテリア残渣 ＋ プラークが重なり合うが幾つかのプラークは独立している プラークの数を数えることができるならば、この数を記録する − プラークが観察されない 溶解を示すそれらのプレートは、それらの痰サンプルが、ミコバクテリオファ ージの複製の宿主となる生存ミコバクテリアを含むことを示す。 肺結核患者からの８つの浄化された痰サンプルを上記ファージアッセイ技術に より試験したところ、５つのサンプルが生存ミコバクテリウムツベルクロシスを 含み、３つのサンプルが含まなかった。これらの結果を慣用のバクテリアサンプ ルの培養と比較すると、培養によると陽性であった５つのサンプルはファージア ッセイでも陽性であり、即ち、バクテリオファージの生存および複製が支持され 、一方培養によると陰性であった３つのサンプルもファージアッセイにより陰性 であり、バクテリオファージの生存および複製を支持しなかった。 上記試験法において用いた試薬は以下のとおりである： 浄化剤：２グラムのNaOH，0.5％のN-アセチルL-システインを滅菌蒸留水中に 含む100ml 生育媒体：0.1％グリセロールを付加された7H9，OADC 基材カンテン：1.5％バクトアガーを添加した生育媒体 バクテリオファージ：プレート溶解物から調製したバクテリオファージD29。 コンフルエントな溶解を示す90mmトリ皿を10mlの7H9，OADC、0.1％のグリセロー ル、１mMのCaCl₂で浸して冷蔵庫の中に一晩（16時間）放置した。パステットを 用いて液体をプレートから回収して4000×ｇにて15分間遠心分離した。上清の液 体を0.4μフィルターでフィルター滅菌して、分注して４℃において保存した。 ヘルパー細胞：定常期まで生育させて４℃に保存したミコバクテリウムスメグ マティス。 不活性化剤：100mMの硫酸アンモニウム鉄、フィルター滅菌した。実施例４ ： 本発明の原理は、安全モデル系中のミコバクテリアの薬剤感受性試験について 試験した。BCGを感受性ミコバクテリア（低濃度のイソニアジドおよびリファン ピシンに感受性）のモデルとして使用し、遺伝学上イソニアジドには耐性であっ てリファンピシンに一部耐性のミコバクテリウムスメグマティスを耐性または半 耐性ミコバクテリアのモデルとして用いた。 工程１．カンテンを基材とする媒体からのBCGコロニーを、7H9，OADC中の液体培 地中において37℃にて２週間生育させて、検出アッセイにおいて使用できる薬剤 感受性細胞のストックを生成した。同様に、ミコバクテリウムスメグマティスの ストックを、24時間、7H9，OADC中にて生育させて、薬剤耐性細胞のストックを 生成した。臨床において、これらの細胞は臨床サンプルから直接起こせるはずで あり、この前培養工程を必要としない。臨床においては、薬剤感受性細胞はミコ バクテリウムツベルクロシスのさまざまな株であるかまたは単離物である。 工程２．各培養物100μlを72時間イソニアジドおよびリファンピシンと共にさま ざまな濃度にて３mlの体積の7H9，OADC中でインキュベートした。この工程は、 細胞が抗生物質薬剤により影響を受けるのに必要である。薬剤を含まない対照も 用意した。 工程３．各培養物100μlを次に試験のために取り出した。 工程４．５×10⁶のD29ファージを含む800μlの7H9，OADCを添加して37℃におい て、BCGの培養に関しては4.5時間あるいはミコバクテリウムスメグマティスの培 養に関しては40分間のいずれかでインキュベートした。加熱殺菌したBCGおよび ミコバクテリウムスメグマティスおよびファージのみのサンプルも対照実験とし て含んだ。 工程５．次に、外部ファージは100μlの酸バッファー（32.2mlの0.IＭクエン酸 ２ナトリウムおよび67.8mlの0.1Ｍ HCl）の添加により不活性化した。 工程６．５分後、84μlの1.0Ｍ NaOHを添加して酸性を中和した。 工程７．さらに４mlの7H9，OADCを添加してミコバクテリウムスメグマティス培 養物を直接プレートした。BCG培養物は、しかしながら、37℃において３時間イ ンキュベートして内部の保護されたファージがあらゆる生存細胞中で複製するの を可能にさせた。 工程８．次に、100μlの各培養物を、定常期のミコバクテリウムスメグマティス ５％（v/v）および0.7％のバクトアガー（ディフコ）を含む５mlの液体7H9，OAD Cと混合して50mmのペトリ皿に注いだ。 工程９．カンテンが固まった後に、プレートを37℃において16時間インキュベー トした。この時間の間、生育可能なミコバクテリア中での酸処理後に生存してい たあらゆる内部ファージが複製して最初の標的細胞を溶解して、少なくとも幾つ かのこれらファージはより早く生育するミコバクテリウムスメグマティスインデ ィケーター細胞中で新たな複製サイクルを確立した。 工程１０．次に、非感染インディケーター細胞の濁った生育の間のファージ溶解 またはプラークの明瞭なエリアに関して、プレートを観察した。結果は記録され て以下に示される： この表は、さまざまな抗生物質の存在下で生育させた異なるミコバクテリアに 関して観察されたプラークの数を示す。 ＋＋ プラークが重なり合っており、プラークの間でインディケーター 細胞が幾らか成長している ＋ 個々のプラークが観察されるが、計数するには多すぎる ゆっくりと生育するミコバクテリウムツベルクロシスは、イソアニジドおよび リファンピシンに感受性である。リファンピシンの存在下で生育させると、細胞 は殺されて、その結果、不活性化から保護されてそれらの生育を支持する生存細 胞がなくなる。全濃度のリファンピシン存在下で観察されたプラークの数はバッ クグラウンドレベルを優位に越えず；バックグラウンドは加熱殺菌されたサンプ ルにおいて観察されたプラークの数であった。早く生育するミコバクテリウムス メグマティスは、しかしながら、低濃度のリファンピシンに耐性であり、これは 最も低いリファンピシン濃度においては多数のプラークが観察されうる。リファ ンピシン濃度が増加するにつれて、細胞は影響されてプラーク数が次第に低下す る。 ミコバクテリアにおけるリファンピシンの作用は迅速であることが知られてい るが、イソアニジドはその作用を及ぼすのに幾らか時間がかかる。結果として、 もっとも低濃度のイソニアジドにおいて、BCGは影響を受けなかったし、これは 観察されたプラーク数に反映されており、薬剤を含まない対照において観察され たプラーク数の近辺であった。高い濃度のイソニアジドにおいては、しかしなが ら、これらの細胞の死を反映する顕著なプラーク数の低下があった。対照的に、 ミコバクテリウムスメグマティスはイソニアジドによりほとんど影響されず、最 も高い濃度においてプラーク数のわずかな低下があったにすぎない。 この実験は、本発明がゆっくりと生育する細胞、例えばミコバクテリウムツベ ルクロシスの薬剤感受性を評価するのに使用できることを示す。このアッセイは 簡単に実施することができ、少ない細胞数に実施でき、そして薬剤が細胞に影響 を及ぼすのに必要な時間を含めて結果を４日以内に得ることができる。培養技術 を必要とする慣用の薬剤感受性アッセイは多数の細胞を必要とし、そして結果を 得るのに４週以上もかかる。慣用技術よりも早いバクテック（Bactec）システム は高価な器具の大きな完成品を必要とするが、本発明の方法は最小の器具しか必 要とせず、安価であり、結核がより普通な第三世界の環境により適している。 したがって、本発明は、バクテリアに対する処理効果を評価する方法も提供し 、該方法は、 ｉ．バクテリアを処理にさらして、次に、 ii．ａ 処理されたバクテリアサンプルをバクテリアが許容するファージによ り感染させ； ｂ 感染サンプル中の外部ファージ粒子を不活性化し； ｃ 第１バクテリアよりも早い速度で倍増する第２バクテリアの存在下で 不活性化サンプルを培養し；そして ｄ プラーク形成の程度および／または第２バクテリアの成長の程度を評 価する ことによりバクテリアのサンプル中に残った生存バクテリア細胞の数を評価する ことからなる。 本発明の方法は、ファージに対する組成物の効果を評価するために使用するこ ともでき、 ａ．ファージ粒子を組成物で処理し； ｂ．生きたファージを許容する第１バクテリアに、処理されたファージ粒子を 感染させ； ｃ．感染第１バクテリア細胞にとって外部のファージ粒子を不活性化し； ｄ．第１バクテリアよりも早い速度、好ましくは２倍、典型的には４から10倍 で倍増する第２バクテリアの存在下で不活性化細胞を培養し；そして ｅ．培養した第２バクテリア細胞中のプラーク形成の程度および／または第２ バクテリアの成長の程度を評価する ことからなる。 本発明の方法のこの応用において、バクテリアの成長の程度はファージ粒子の 最初の処理の効果またはその反対を示す。プラークが形成されないならば、最初 の処理はファージ粒子を殺すかまたは不活性化して、即ち第１バクテリア細胞へ のそれらの感染を妨害した。第２バクテリアの培養段階におけるこれらの細胞の 複製は、第２バクテリア細胞を殺すかまたはその複製を妨害するファージ粒子を 放出しなかった。培養した第２細胞は、即ち、バクテリア細胞の均一な成長を示 す実質的に均一な発色または不透明さを示す。ファージ粒子を殺すかまたは不活 性化するのに組成物が効果的でなかった場合、ファージ粒子は第１バクテリアに 感染して、感染第１バクテリアの不活性化処理に対して保護される。感染細胞が 第２バクテリアの存在下で培養された場合、ファージ粒子は複製して感染第１細 胞を溶解して、第２バクテリア細胞に感染して、プラークまたは第２バクテリア の視覚上不均一な成長を与える。プラークまたは不均一な成長の程度は、存在す るファージ粒子の数の指標を与え、そして即ち、ファージ粒子への初期処理の効 率の範囲の指標を与える。本発明の方法のこの応用は、定量結果を与えないかも しれないが、組成物の定量効果を決定するために他の試験に供されうる、潜在性 候補組成物同志を識別するために使用できる迅速な初期スクリーニング技術を提 供する。 したがって、その最も広い側面において、本発明は第１バクテリアに関するア ッセイの応答時間を高める方法を提供するが、 ａ．第１バクテリアが許容するファージ粒子による感染に第１バクテリアをさ らす； ｂ．外部ファージ粒子を不活性化するように、感染したバクテリアを処理する ； ｃ．処理されたバクテリアを、上記ファージまたはその複製物に許容性であっ て、第１バクテリアよりも早い速度、好ましくは２倍、典型的には４から10倍で 倍増する第２バクテリアの存在下で培養する；そして ｄ．培養した第２バクテリア細胞中のプラーク形成の程度および／または第２ バクテリアの成長の程度を評価する ことからなる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｇ Ｅ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ， ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．第１バクテリアに関するアッセイの応答の時間を高めるための方法であっ て、以下： ａ．第１バクテリアが許容するファージによる感染に、第１バクテリアをさらす こと； ｂ．外部ファージ粒子を不活性化するように感染バクテリアを処理すること； ｃ．上記ファージ粒子またはその複製体に許容性であって、第１バクテリアの有 効倍増速度よりも早い速度で倍増する第２のバクテリアの存在下で、処理された バクテリアを培養すること；および ｄ．プラーク形成の程度および／または培養した第２バクテリアの成長の程度を 評価すること を特徴とする。 ２．以下の工程： ａ．第１バクテリアの生育可能なサンプルに該バクテリアに特異的なファージを 感染させて、少なくとも幾つかのバクテリア細胞各々にひとつまたはそれ以上の ファージ粒子を吸着させ； ｂ．バクテリア細胞により吸着されなかったファージ粒子を不活性化または除去 し； ｃ．第１バクテリアの有効倍増速度より大きい倍増速度を有する少なくとも一つ の他の第２バクテリアを含む媒体中で、感染第１バクテリアを培養して、少なく とも幾つかの第２バクテリア細胞が感染第１バクテリア細胞の溶解に際して放出 されたファージ粒子により感染することとなり、上記感染細胞各々を感染サイク ルの次の世代のさらなる感染源として作用させ；そして ｄ．工程ｃのファージ粒子の集団および／または第２バクテリアの成長の低下を 監視することにより、試験されるサンプル中の第１バクテリア細胞の存在を測定 すること からなる、サンプル中の第１バクテリアの存在を検出する方法を提供することを 特徴とする、請求項１記載の方法。 ３．バクテリア細胞中で複製するファージ粒子の能力またはその反対を評価す ることによりファージ粒子に対するウイルス制御組成物または殺ウイルス剤の効 果を評価する方法を提供することを特徴とする、請求項１記載の方法であって、 ファージ粒子を組成物で処理し、そして ａ．生きたファージを許容する第１バクテリアに、処理されたファージ粒子を感 染させ； ｂ．感染第１バクテリア細胞にとって外部のファージ粒子を不活性化し； ｃ．第１バクテリアよりも早い速度で倍増する第２バクテリアの存在下で不活性 化細胞を培養し；そして ｄ．培養した第２バクテリア細胞中のプラーク形成の程度および／または第２バ クテリアの成長の程度を評価することからなる。 ４．バクテリアに対する処理効果を評価する方法であって、 ｉ．バクテリアを処理にさらし、そして次に、 ii．ａ 処理されたバクテリアサンプルを、バクテリアが許容するファージに より感染させ； ｂ 感染サンプル中の外部ファージ粒子を不活性化し； ｃ 第１バクテリアよりも早い速度で倍増する第２バクテリアの存在下で 不活性化サンプルを培養し；そして ｄ プラーク形成の程度および／または第２バクテリアの成長の程度を評 価する ことによりバクテリアのサンプル中に残った生存バクテリア細胞の数を評価する ことからなる。 ５．第１バクテリアが、7H9として知られる培地を90％（v/v）およびOADCとし て知られる栄養を10％（v/v）含む培養媒体中で37℃において10時間より高い有 効倍増速度を有する、請求項１ないし４の何れか１項記載の方法。 ６．第２バクテリアが第１バクテリアの有効倍増速度より少なくとも２倍高い 倍増速度を有する、請求項１ないし５の何れか１項記載の方法。 ７．第２バクテリアが第１バクテリアの有効倍増速度より４から10倍高い倍増 速度を有する、請求項１ないし６の何れか１項記載の方法。 ８．第１バクテリアがミコバクテリウム種またはレジオネラ種である、請求項 ７記載の方法。 ９．第１バクテリアがミコバクテリウムツベルクロシスまたはミコバクテリウ ムエビウムである、請求項８記載の方法。 10．第２バクテリアがミコバクテリウムスメグマティスまたはミコバクテリウ ムアウルムである、請求項８記載の方法。 11．第１バクテリアが２から10時間の倍増速度を有する、請求項１ないし４の 何れか１項記載の方法。 12．第１バクテリアのファージ感染が55℃までの温度並びに10分間から10時間 に間実施される、請求項１ないし11の何れか１項記載の方法。 13．ファージが、AG1，B1，BG₁，BK₁，C3，D29，D34，D56A，GS4E，HP1，L1， 13またはTM4である、請求項１ないし12の何れか１項記載の方法。 14．第１バクテリアがミコバクテリウムツベルクロシスまたはミコバクテリウ ムエビウムであり、第２バクテリアがミコバクテリウムスメグマティスであり、 そしてファージがD29またはTM4である、請求項１ないし５の何れか１項記載の方 法。 15．ｉ．感染第１バクテリア細胞から外部ファージ粒子を分離するために感染 バクテリア材料を洗浄および濾過するか；または ii．外部ファージ粒子を殺すかまたは不活性化するために感染第１バクテ リア材料を殺ウイルス剤、酸または界面活性剤により処理するか；および／また は iii．バクテリア細胞から分離した基質上に、第１バクテリア材料からの 外部ファージ粒子を選択的に吸着させる ことにより、工程ｂにおいて外部ファージ粒子を不活性化することを特徴とする 、請求項１ないし14の何れか１項記載の方法。 16．第２バクテリアが初期量にて工程ｃにおいて提供されて、感染第１バクテ リアと培養される第２バクテリアの混合物中の２から50倍の数の第１バクテリア 細胞を提供する、請求項１ないし15の何れか１項記載の方法。 17．さらにバクテリア細胞の成長および続く実質的な溶解が停止する実質的な 定常状態まで培養工程ｃを実施することを特徴とする、請求項１ないし16の何れ か１項記載の方法。 18．ｉ．第１バクテリアのための公知のファージ感染源； ii．第１バクテリアの倍増速度より高い速度を有して且つファージ感染に より感染した第１バクテリアから放出されるファージ粒子に許容性の生育可能な 第２バクテリア源 を含むことを特徴とする、サンプル中の第１バクテリアの在否を検出するための 、請求項１ないし５の何れか１項記載の方法において使用するための診断キット 。 19．ファージ感染源により感染した第１バクテリアからの外部ファージ粒子を 不活性かおよび／または除去する手段も含むことを特徴とする、請求項18記載の 診断キット。