JPH11510069A - 皮膚および軟組織の欠損修復のための自己皮膚繊維芽細胞の使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本出願は、被験者の皮下または皮膚組織の修復方法に関する。本方法は、被験者から得られる検体からの培養した皮膚繊維芽細胞を調製し、実質的に免疫原性タンパク質を含有しない繊維芽細胞調製物を注入して、皮下または皮膚組織を修復する。本方法は、しわ、妊娠線、陥没瘢痕、非外傷性の皮膚の陥没、ならびに口唇の美容的な増加に応用される。

Description

【発明の詳細な説明】 皮膚および軟組織の欠損修復のための自己皮膚繊維芽細胞の使用 １．発明の分野 本発明は、ヒト被験者のしわを含む皮膚および軟組織の欠損の修復に関する。 さらに詳しくは本発明は、皮膚または皮下組織の容量を増やす非外科的方法で使 用するための新しい材料に関する。自己細胞の懸濁物を注入することにより、本 発明は、既存の材料の使用に伴う不利益なしに下部隣接組織（subadjacent tiss ue）の長期間の増加を提供する。２．発明の背景 美容効果を求めて、体内、特に顔への材料の注入（「注入物（injectate）」 ）をすることは、19世紀末にさかのぼる。例えば、顔貌の欠陥を整えるためのパ ラフィン注入は、第一次世界大戦前に短期間行われていた。しかし長期間経過し た後に合併症や好ましくない性質が発生するため、用いられなくなった。1960年 代初期に注入可能なシリコーンが利用できるようになり、これらの方法が実質的 に復活した。特別に製造された「医療用グレード」のシリコーン溶液（例えば、 ダウコーニング（Dow Corning）MDX4.4011）は、米国のいくつかの認可された試 験センターで実験的に使用されている。シリコーンに対する局所性の反応および 全身性の反応、注入物の移動、および局所的な組織の破損などの合併症のため、 シリコーン注入の使用は制限されてきた。シリコーン注入の初期の支持者達は、 制限された数の被験者で実験プログラムを続けてきたが、この方法が大勢の外科 医や内科医に採用される可能性はほとんどないようである。総説は、Matton，G. ，et al.，1985，Aesthetic Plastic Surgery 9: 133-40; Spira，M．& Rosen， T.，1993，Clin．Plastic Surgery 20: 181-9に記載されている。 非生物的材料では良好な結果が得られないため、注入物として外来のタンパク 質（特に、ウシのコラーゲン）の使用が試みられた。未処理のウシコラーゲンは ヒトに注入するには免疫原性が強すぎるが、酵素的分解によりウシコラーゲンの C-末端およびN-末端ペプチドを除去することによりある材料（「アテロコラーゲ ン」）得られ、これは免疫反応性のある患者をあらかじめスクリーニングして除 外すれば限定された患者で使用することができる。このような生成物の調製法は 、米国特許第3,949,073号、米国特許第4,424,208号および米国特許第4,488,911 号に記載されている。この製品はZYDERM（登録商標）ブランドの35mg/mlおよび6 5mg/mlの濃度のアテロコラーゲン溶液として販売されている。これは世界的に広 く使用され、1987年現在、米国では200,000人の被験者がいるが、ZYDERMの使用 は、被験者の約90％での抗ウシ抗体の増加、および約１〜３％での明らかな免疫 学的合併症に関係している。DeLustro，F.，et al.，1987，Plastic and Recons tructive Surgery 79: 581。 アテロコラーゲン溶液は、数週間から数ヶ月以内に、宿主の物質により置換さ れることなく注入部位から被験者によって吸収されるため、決して完全に満足で きるものではない。繰り返し注入からなるプロトコルも考えられてきたが、この ようなプログラムは、実際には、ウシのアテロコラーゲンに対する免疫反応の進 行、費用、および患者の耐性によって制限される。これらの制限を克服するため に、ウシのアテロコラーゲンをグルタルアルデヒド架橋によってさらに処理し、 次にろ過し、微細なメッシュに通して破砕した。この物質の製造と使用とは、米 国特許第4,582,640号および米国特許第4,642,117号に記載されている。こうして 製造された製品は、ZYPLAST（登録商標）ブランドの架橋ウシアテロコラーゲン として販売されている。架橋により得られる利点（宿主の分解に対する耐性の増 加）は、粘性の増大のために打ち消される。粘性の増大、特に不規則な粘性体（ 塊）によってこの物質の使用が困難になり、いくつかの目的については使用でき なくなる。例えば、米国特許第5,366,498号を参照されたい。 さらに、何人かの研究者は、ZYDERMに比較してZYPLASTでは、持続性がまった く増加しないかまたはほんのわずかであり、注入効果の持続期間はせいぜい約４ 〜６ヶ月であると報告している。Matti，B.A．& Nicolle，F.V.，1990，Aesthet ic Plastic Surgery 14: 227-34; Ozgentas，H.E．et al.，1994，Ann Plastic Surgery 33: 171。多くの開業医の経験によれば、約４〜６ヶ月後に顕著な吸収 がある。 ヒトにおけるウシコラーゲン生成物の免疫原性がもたらす限界により、他の研 究者達は、胎盤（例えば、米国特許第5,002,071号）、外科サンプル（例えば、 米国特許第4,969,912号および米国特許第5,332,802号）からのヒトコラーゲンの 調製を考えた。ヒトのコラーゲンはウシのコラーゲンと同じ分解過程に供される ため、架橋や他の化学的修飾によるヒトコラーゲンのさらなる処理が必要である 。 完全に被験者自身の組織サンプルから得られる注入用のヒトコラーゲンが利用 可能になり、AUTOLOGEN（登録商標）のブランド名で販売されている。ヒトコラ ーゲン注入物ではウシコラーゲン注入物より効果が持続するという証拠はない。 さらに、自己の処理コラーゲンの使用は、美容整形を受けた被験者に限定される 。これは、その製造の出発物質が美容整形手術の間に除去した皮膚であることに よる。明らかに、自己の処理コラーゲンはウシコラーゲンの免疫原性を超えるも のであるが、ウシコラーゲンのように、長期の治療効果を提供せず、手術を受け た患者に限定される。 他の研究者達は、下部隣接真皮を増加させる目的で、アテロコラーゲンの代替 物として、ゼラチン粉末、ε−アミノカプロン酸および被験者の血漿(「FIBREL( 登録商標)」)の混合物を注入した。Multiventer trial，1987，J．Am．Acad．De rmatol．16: 1155-62。 FIBREL（登録商標）の作用は、一部は軟組織を増加させるための硬化性炎症性 応答の誘導に依存するようである。Gold，M.H.，1994，J．Dermatologic Surg． Oncol．20: 586-90。FIBREL（登録商標）治療の報告では、これは一部の患者に 有益（例えば、Millikan，L.，et al.，1991，J．Dermatologic Surg．Oncol．1 7: 223-29を参照）であるが、塊と持続性の欠如とからくる問題があると述べら れている。注入に伴う不快感と、医師にとってこの調製は面倒であるという理由 から、FIBREL（登録商標）の使用もまた、制限されてきた。 要約すると、入手できる非生体注入性材料はいずれも、下部隣接真皮および軟 組織を増加させる目的を完全に満足させられるものではない。 アテロコラーゲン注入物を用いた長期持続性の結果が得られないこととFIBREL （登録商標）の使用の問題のために、何人かの研究者達は、下部隣接真皮および 軟組織を増加させるために生体の脂肪組織を得て注入（移植）することを試みた 。外科的に脂肪組織を取り出して再移植すると、主要な欠損の矯正において良好 な 結果を得ることができる。例えば、McKinney，P．& Pandya，S.，1994 Aestheti c Plastic Surgery 18: 383-5; Davies，R.E．et al.，1995 Arch of Otolaryng ology--Head & Neck Surgery 121: 95-100を参照されたい。しかし、注入によ り移植片をのせることが必要な修復では、結果は明らかにあまり好ましくない。 Ersek，R.A.，1991，Plsatic & Reconstructive Surgery 87: 219-27。すなわち 、ある程度の有益な結果も報告されている（例えば、Hambley，R.M．& Carruthe rs，J.A.，1992，J．Derm．Surgery & Oncol．18: 963-8を参照せよ）が、この 方法の支持者達も、この方法は多くの開業医にとって満足できる結果を与えてい ないことを認めている。Lewis，C.M.，1993，Aesthetic Plastic Surgery 17: 1 09-12。医師や被験者がしばしば遭遇する問題は、結果が予測できないことおよ び塊ができる（このため、この方法は、細かいしわの治療には適さない）こと、 ならびに注入後、極端に腫れる期間（４〜６週間続く）があることである。３．発明の要約 本発明は、欠損部に下部隣接する真皮および皮下組織内に自己皮膚繊維芽細胞 （autologous dermal fibroblast）の懸濁物の注入による被験者の皮膚の美容的 および美的欠陥を修正する方法を提供する。この方法で矯正される典型的な欠損 には、しわ、妊娠線、陥没瘢痕、非外傷性の皮膚の陥没、尋常性座瘡からのきず 、および唇の形成不全がある。本発明の注入される細胞は、被験者と組織適合性 があり、細胞培養系で継代して増加されている細胞である。好適な実施態様にお いて、移植された細胞は、被験者から採取した生検の検体の培養物から得られる 皮膚繊維芽細胞である。 本発明はさらに、継代された皮膚繊維芽細胞を培養培地中で実質的に免疫原性 タンパク質を含まないようにする方法を提供し、その結果これらを皮膚の欠損の 矯正に使用することができる。この方法は、増殖された繊維芽細胞を、タンパク 質を含まない培地中で一定時間インキュベートする工程を含む。４．発明の詳細な説明 本発明は、一部分は、欠損に下部隣接する真皮および皮下組織を増加させるた めの理想的な材料は、通常、真皮中に存在する組織型の生細胞であるという認識 に基づく。本発明はまた、所望の型の自己細胞の豊富な供給が、注入の数週間前 に被験者から採取した生検検体を培養することにより得られるという認識に基づ く。本発明はさらに、このような組織培養増殖の後、自己細胞は多量の抗原タン パク質を含有するであろうが、本出願の教示に従い、この抗原タンパク質を被験 者に注入する前に除去することができるという認識に基づく。４．１．注入可能な細胞懸濁物を得る方法 本発明は、培養液中で増殖させることができる任意の未分化の間充細胞を注入 することにより実施することができる。好適な実施態様において、皮膚繊維芽細 胞は容易に得られ増殖させることができ、そしてこれらは真皮および下部隣接組 織中に普通に存在する細胞の型の１つであるため、皮膚繊維芽細胞が注入される 。 皮膚繊維芽細胞培養は、皮膚の２×５mmの充分な厚さの生検検体から開始する 。移植外科医や免疫学者に公知の同種移植片拒絶の現象のために、培養された繊 維芽細胞は宿主と組織適合性を有することが必須である。その皮膚の欠損を矯正 すべき被験者の生検検体を得て、この検体から繊維芽細胞を培養することにより 、組織適合性を確保することができる。 培養を始める前に、生検検体は、抗生物質や抗真菌剤で繰り返し洗浄する。次 に、表皮および皮下の脂肪細胞含有組織を取り、その結果得られる培養物を実質 的に非繊維芽細胞を含まないようにし、真皮の試料をメスまたはハサミで細切す る。検体片をピンセットで組織培養フラスコの乾燥表面上に１つずつ置き、５〜 10分の間付着させ、次に少量の培地を付着した組織断片をはがさないように注意 しながら、ゆっくり加える。24時間インキュベーションした後、フラスコに追加 の培地を入れる。T-25フラスコを使用して培養を開始する時は、培地の初期の量 は1.5〜2.0mlである。生検検体からの細胞株の樹立には通常２〜３週間かかり、 増殖するために、この時点で初期の培養容器から細胞をはがすことができる。 培養の初期段階で、組織片が培養容器の底に付着していることが望ましい。付 着していない組織片は新しい容器に再度植え込むべきである。当業者に公知の技 術により、EDTA−トリプシンに組織培養物を短時間暴露することにより、繊維芽 細胞を刺激して増殖させることができる。トリプシンへの暴露は非常に短い時間 であるため、培養容器の壁に付着した繊維芽細胞は遊離しない。培養物が樹立さ れてコンフルエンスに近づいた後に直ちに、繊維芽細胞のサンプルを凍結保存の ために取り出すことができる。正常なヒト繊維芽細胞の細胞培養物の継代数は制 限されるため、継代数の多い繊維芽細胞より継代数の少ない繊維芽細胞を凍結保 存することが好ましい。 繊維芽細胞は、これを保存するのに適した任意の凍結培地中で凍結することが できる。70％の増殖培地、20％(v/v)のウシ胎児血清および10％(v/v)のジメチル スルホキシド（DMSO）からなる培地を使用すると良好な効果が得られる。融解し た細胞を使用して二次培養を開始すると、第二の検体を得るという不便さなしに 、同じ被験者で使用するための懸濁物を得ることができる。 生検検体からの皮膚の繊維芽細胞の播種に適した任意の組織培養法を、本発明 を実施するために、細胞の増殖に使用することができる。当業者に公知の技術は 、R.I．Freshney編、ANIMAL CELL CULTURE: A PRACTICAL APPROACH（IRL Press ，Oxford England，1986）およびR.I．Freshney編、CULTURE OF ANIMAL CELLS: A MANUAL OF BASIC TECHNIQUES，Alan R．Liss & Co.，New York，1987）に記載 されており、これらは参考文献として本明細書に組み込まれる。 この培地は初代繊維芽細胞培養物の増殖に適した任意の培地である。多くの例 で、この培地には0.5％〜20％(v/v)の血清を添加し、繊維芽細胞の増殖を促進す る。高濃度の血清は、繊維芽細胞のより速い増殖を促す。好適な実施態様におい て、血清はウシ胎児血清であり、これは培地の10％の最終濃度になるよう加える 。培地は、例えば、２mMグルタミン、110mg/Lのピルビン酸ナトリウム、10％(v/ v)のウシ胎児血清および抗生物質を添加した、高グルコースDMEM（「完全培地」 ）である。 細胞はトリプシン処理により新しいフラスコに継代される。増殖のため、各フ ラスコに1/3を分けて入れる。三底T-150フラスコ（総培養面積450cm²）が、本発 明の実施に適している。三底T-150は、約６×10⁶個の細胞を接種して、約1.8×1 0⁷個の細胞を産生する能力を有する。フラスコの容量いっぱいに達した（これに は典型的には５〜７日間の培養を必要とする）ときに、増殖培地を無血清培 地で置換し、その後、細胞を、タンパク質不含培地中で少なくとも６時間、約30 ℃〜約40℃で、好ましくは37℃で12時間以上、そして最も好ましくは16〜18時間 インキュベートする。無血清培地中で細胞をインキュベートすることにより、存 在すれば被験者に対して免疫原性でありアレルギー反応を引き起こすであろう、 ウシ胎児血清由来のタンパク質を細胞から実質的に除去する。 無血清培地中でのインキュベーションの最後に、細胞をトリプシン/EDTAによ って組織培養フラスコからはがし、遠心分離と再懸濁してさらに充分に洗浄し、 注入のために等量の注入可能な等張の生理食塩水で懸濁する。容量いっぱいに増 殖させた六底T-150フラスコからは、約10⁶個の細胞が産生され、これは約1.0ml の懸濁物を作製するのに充分である。 または、細胞を懸濁物の作製後18時間以内に注入するのであれば、４℃で輸送 することもできる。フェノールレッドpH指示薬を含まず、輸送のためにウシ胎児 血清を被験者の血清と置換することを除いて、等量の完全培地中に細胞を懸濁す ることができる（輸送培地）。細胞を吸引し、輸送培地に注入することができる 。 細胞を懸濁する輸送培地の容量は、決定的に重要ではない。開業医が注入する つもりの繊維芽細胞の数、治療すべき欠損の大きさや数、および治療の結果を早 く得たいという患者の要求の緊急度などの要因に依存して、開業医は細胞を大量 の培地に細胞を懸濁し、各注入部位に対応する少量を注入することができる。４．２．粘性懸濁物中で注入可能な細胞集団を得るための代替法 皮膚欠損の修復に多量の材料が必要なときには、本発明は注入可能な細胞の懸 濁物を調製するための代替法を提供する。このような欠損の例としては、唇を大 きくする必要な被験者、鼻唇ひだの治療および皮下欠損の治療が必要な被験者が 含まれる。 約１×10⁶個の細胞の集団が得られるまでは、代替法は上記の方法と同じであ る。100mmのシャーレの底に血漿の凝集塊を形成させ、これに被験者の血漿２ml と50〜100ユニットの自己のトロンビン（典型的には50μl）を加えて、凝集塊を 形成させることによって処理して、組織培養表面を持たせる。培養した皮膚繊維 芽細胞（３〜５ml中１×10⁶個の細胞）を凝集塊表面に接種し、完全培地中でさ らに７日間培養する。７日間の終わりに、完全培地を無血清培地と交換する。培 地を１時間間隔で２回除去して無血清培地に交換し、その後さらに無血清培地中 で14〜18時間細胞をインキュベートするプロトコルにより、満足できる結果が得 られる。無血清培地中でのインキュベートを完了した後、凝集塊をシリンジ内に 吸引し、必要に応じて注入する。 本発明の代替例において、繊維芽細胞は懸濁物にしない。むしろ凝集塊はその まま使用するか、またはメスで所望の形に切断し、繊維芽細胞を接種した凝集塊 の表面を、皮膚掻爬後の被験者の皮膚に外科用医薬材料として適用する。４．３．被験者への細胞の投与 本発明の細胞懸濁物は、ZYDERM（登録商標）やZYPLAST（登録商標）を使用す るために当業者が現在用いているものと同じ技術を用いて、皮膚欠損の治療に使 用することができる。細胞懸濁物は、前述の利点を有するアテロコラーゲンの代 わりに使用することができる。下部隣接真皮および皮下組織を増やすための注入 可能な材料の使用に関して代表的な教示は、外科の文献である。Gonzales，U.M. ，1992，Aesthetic Plastic Surgery 16: 231-4; Nicolle，F.V.,1985，Aesthet ic Plastic Surgery 9: 159-62; Pieyre，J.M.，1985，Aesthetic Plastic Surg ery 9: 153-54（これらは参考文献として本明細書に組み込まれる）に見いださ れる。 本発明の１つの実施態様である顔の微妙なラインの治療は、以下のように行う 。治療する場所にアルコールをつけて、のばして緊張した表面にする。シリンジ に細胞懸濁物を満たし、30ゲージの注射針をつける。皮膚のできるだけ表面に近 い部分に針を挿入する。斜角の向きは決定的に重要ではない。うすく青白くなる まで弱く圧力をかけて皮内注射を行う。多数回、連続的に注射をする。 他の実施態様において輪筋（obicularis musculature）に注入物を入れて、口 唇の形成不全を治療するか、または皮下組織に入れて深部皮下の欠損を治療する 。 別の実施態様において、座瘡の瘢痕の広範な領域を、中部または深部真皮のレ ベルまで皮膚を掻爬して治療することができる。次に、掻爬した表面を覆うよう に繊維芽細胞を含有する凝集塊を作製し、繊維芽細胞を接種した側が掻爬された 皮膚表面に配置されるように適用する。次に適用した凝集塊を外科用包帯剤（例 えば、Xeroform（登録商標）、Adaptic（登録商標）または任意の非閉鎖性の外 科用包帯剤）で覆う。５．臨床経験の要約 上記の方法に従って、６人の患者が種々の皮膚欠損の治療を受けた。診断は以 下の通りであった：笑いじわ（鼻唇ひだ）、２人の患者；口周囲のしわ、２人の 患者；眉間の溝；陥没瘢痕；口唇形成不全；および光線性頬しわ。 各患者の前腕に、試験量の0.1mlの細胞懸濁物を投与した。２人の患者は、軽 い紅斑を示したが、注入に対して他の反応の兆候はなかった。３週間後、皮膚の 欠損部位に総量1.0mlの治療用注入を行なった。４週間後、何人かの患者に２回 目の1.0mlの治療用注入を行なった。口唇を大きくする患者にのみ、同じ欠損を 修復するために、２回目の注入を行い、他のすべての患者では各治療部位に１回 のみ注入を行なった。 患者では紅斑はほとんど発生しないかまたは全くなく、即時型の全身性または 局所静置の副作用の兆候もなかった。各患者は、注入後直ちに仕事をすることが でき、各患者で直ちに改善が見られた。 注入に伴う不快感はほとんどなかった。不快感は、ウシのアテロコラーゲン注 入に伴うものより小さかったと報告された。患者は治療に対して満足感を示し、 他の欠損についてもさらに治療を受けたいという意志を示した。皮膚欠損の矯正 は、治療のことは何も知らない患者の友人や仲間が気づくものであった。触診に より、治療の証拠はある程度検出されるが、目に見える皮膚の治療の後遺症はな い。 注入後６ヶ月間の試験期間中、遅延性の局所性または全身性の副作用はなかっ た。脱落期嚢腫症、変形、またはむらが出現した患者は１人もいなかった。最も 重要なことは、ウシのアテロコラーゲン注入物は吸収されたであろうと予想され る注入後６ヶ月の観察期間中、治療効果が縮減することは無かったということで ある。逆に、ある患者では治療効果は、長期追跡で時間とともに高くなっていた 。長期間の改善が遅くなって現れることは、注入された繊維芽細胞が代謝活性を 有 し、注入部位に追加の細胞外マトリックスが蓄積されることを示している。 本発明は、本発明の個々の側面を例示するものとして記載した具体例によって その範囲が限定されるものではなく、機能的に均等な方法および成分は本発明の 範囲内にある。実際に、本明細書に記載したもの以外に本発明の種々の修飾は、 上述の記載から当業者には明らかであろう。そのような修飾は、添付の請求項の 範囲内に含まれる。引用したすべての文献は、参考文献として本明細書に組み込 まれる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ， ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ， ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，Ｖ Ｎ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ａ）実質的に、免疫原性タンパク質を含有しない、自己の継代皮膚繊維芽細 胞の懸濁物を提供する工程と、 ｂ）下部隣接皮下または皮膚組織の増加により改善されやすい欠損を識別する 工程と、そして ｃ）下部隣接組織内に有効量の懸濁物を注入して、組織を増加させる工程と、 を含んでなる、ヒト被験者の皮下または皮膚組織を長期間増加させる方法。 ２．欠損が、しわ、妊娠線、陥没瘢痕、非外傷性の皮膚の陥没、または口唇の発 育不全である、請求項１に記載の方法。 ３．懸濁物が、注入可能なゲルを形成するのに有効な量のヒトフィブリンをさら に含む、請求項１に記載の方法。 ４．注入可能なゲルが、トロンビン活性化同種血漿を含む、請求項３に記載の方 法。 ５．ａ）被験者の真皮の生検を行う工程と、 ｂ）0.5％〜20％の非ヒト血清を含む培地中で真皮の生検検体からの皮膚繊維 芽細胞を継代し、脂肪細胞、ケラチノサイト、および細胞外マトリックスを実質 的に含まない皮膚繊維芽細胞を提供する工程と、 ｃ）継代した皮膚繊維芽細胞を無血清培地中で少なくとも約６時間、約30℃〜 約40℃でインキュベートする工程と、 ｄ）インキュベートした繊維芽細胞をタンパク質分解酵素に暴露して、繊維芽 細胞を懸濁する工程と、 をさらに含む、請求項１に記載の方法。 ６．被験者の皮膚欠損を修復するための装置であって、 ａ）シリンジチャンバー、その中に配置されるピストン、およびチャンバーと 連絡するオリフィスを有する皮下注射器と、 ｂ）１）繊維芽細胞以外の細胞を実質的に含有せず、被験者に免疫原性である タンパク質を実質的に含有しない、被験者から得られる皮膚繊維芽細胞、および ２）薬剤学的に許容される担体溶液 を含んでなる懸濁物であって、この懸濁物はチャンバーの中に入れられ、そし て ｃ）オリフィスに取り付けた皮下注射針、 とを備える上記用具。 ７．ａ）被験者の真皮の生検を行う工程と、 ｂ）0.5％〜20％の非ヒト血清を含む培地中で真皮生検検体からの真皮繊維芽 細胞を継代して、繊維芽細胞以外の細胞を実質的に含まない皮膚繊維芽細胞を提 供する工程と、 ｃ）継代した皮膚繊維芽細胞を無血清培地中で少なくとも約６時間、約30℃〜 約40℃でインキュベートする工程と、 ｄ）インキュベートした繊維芽細胞をタンパク質分解酵素に暴露して、繊維芽 細胞を懸濁する工程と、そして ｅ）懸濁した繊維芽細胞を薬剤学的に許容される担体溶液に添加し、懸濁物を 形成させ、この懸濁物をシリンジチェンバーに入れる工程と、 を備える請求項６に記載の装置の製造方法。 ８．ａ）被験者から得られる皮膚繊維芽細胞を有する繊維芽細胞を接種した凝集 塊を提供する工程（ここで、繊維芽細胞は、繊維芽細胞以外の細胞を実質的に含 有せず、凝集塊は、被験者に免疫原性であるタンパク質を実質的に含有しない） 、 ｂ）被験者の尋常性ざ瘡の後遺症の部位を中部または深部真皮のレベルまで掻 爬する工程、および ｃ）掻爬した部位に凝集塊を適用して、接種された繊維芽細胞を真皮に向けて 並べる工程、 とを備える、被験者の尋常性ざ瘡の後遺症の修復方法。