JPH11510794A

JPH11510794A - 初乳由来成長因子

Info

Publication number: JPH11510794A
Application number: JP9506409A
Authority: JP
Inventors: デニスケリー
Original assignee: ザロウェットリサーチインスティチュート
Priority date: 1995-07-17
Filing date: 1996-07-15
Publication date: 1999-09-21
Also published as: DE69626826T2; US6277813B1; DE69626826D1; DK0839157T3; ATE234863T1; EP0839157B1; WO1997004009A1; AU6523996A; EP0839157A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、定義された化学的及び生物学的な特徴を有する初乳から由来するポリペプチド成長因子（ＣＤＧＦ）に関する。この因子は、ブタの初乳から調製され、そしてその製薬上の用途は、病原体による身体への侵入と闘うことと、創傷治癒、器官の成長及び発育を促進することと、及び食事の変化に対する消化管の適応を促進することと、を含む。

Description

【発明の詳細な説明】初乳由来成長因子本発明は、初乳に存在する新規な成長因子、該成長因子を含む組成物、及びその製薬上の用途に関する。本発明は、新規なポリペプチドＣＤＧＦ（初乳由来成長因子）を提供する。さらに、本発明は、医学上及び獣医学上の応用におけるＣＤＧＦの用途を提供する。特に、本発明は、組織の成長及び／又は機能を促進するＣＤＧＦの用途、並びに疾患の症状又は異常と闘うか又は軽減するＣＤＧＦの用途を提供する。ＣＤＧＦは、創傷治癒の応用（例えば事故又は手術後）のために、そして組織の再生が要求される疾患の症状（例えば潰瘍）と闘うか又は軽減するために、特別な有用性を有することができる。ＣＤＧＦは、また他の医薬の処方の有害な副作用と闘う、特にガンに対する化学療法又は放射線療法の副作用の低下、そしてとりわけ消化管におけるこれらの治療の影響と闘うのに有用性を有することができる。ＣＤＧＦは、消化管、骨格筋、肝臓及び腺組織（特に乳腺）から由来する組織について特別な有用性を有するものと思われるが、本発明は、これらの器官のみに関して使用されることに限定されない。さらに詳細には、ＣＤＧＦは、健康な組織の再生を促進するのに手術後の患者を治療するのに助けとなり、そして腫瘍の外科的除去後のＣＤＧＦ治療は、特に有利であると思われる。ＣＤＧＦの効果の一つは、消化管に沿って並んだ細胞間の密な接合を促進することである。これは、出産予定前の新生児にとり重要であり、かれらは、未熟なしかも「漏れやすい」腸（即ち、腸の細胞間の接合が十分に密ではない）を有するだろう。これは、次に栄養素の吸収に影響する。同様に、アトピー性である（そしてそれ故アレルギーになりがちである）新生児は、また未熟な「漏れやすい」腸を有することが分かっている。ＣＤＧＦの投与（医薬として又は食品補強物としての何れか）は、それ故、これら新生児の消化管の成熟を促進するのに有利である。関連するやり方で、完全な非経口的栄養（ｔｐｎ）を要する患者は、別々な処方物で、又はｔｐｎ組成物の成分としての何れかで、ＣＤＧＦを得ることから利益を得る。消化管に関して、ＣＤＧＦは、ａ）損傷をうけた組織の再生の促進ｂ）出産予定前の新生児、栄養的に免疫不全な新生児の腸及び身体の機能の促進ｃ）消化管のバリヤー機能の促進、それによる疾患抵抗性の増大ｄ）微生物（特に細菌性）の病原体による腸の集落化に対する攻撃を行うことができる。他の点では、本発明は、不活性担体又は助剤とともにＣＤＧＦを含む組成物を提供する。望ましくは、組成物は、治療用の応用（予防用の治療の応用を含む）に処方でき、そして担体又は助剤は、それに従って選ばれねばならない。別なやり方として、組成物は、食品補助物又は食品として処方できる。例えば、本発明は、ＣＤＧＦを含むベビーフード処方物、及びまたｔｐｎ処方物、又はＣＤＧＦを含む病人用フード処方物を含む。ＣＤＧＦに加えて、組成物は、他の成分を含むことができる。特に、生物学的に活性な成分（例えば、抗生物質；サイトカインとアミノ酸又はポリアミンとの組合せを含む他の成長因子例えばＩＧＦ、ＥＧＦ、ＦＧＦ、又はＰＤＧＦ（例えばＩＧＦ／グルタミンの組合せ）；インスリン；サイトカイン例えばインターロイキン又は生物学的な望ましい効果を有する任意の他の剤）；粘度調節剤；浸透圧調節剤、緩衝剤、ｐＨ調節剤、香料、安定剤、着色剤、保存料などを挙げることができる。遅延放出又はコントロール放出の処方物も含まれる。本発明の組成物は、任意の好適な手段による投与のために処方できる。投与の経口、経腸、非経口、皮下及び経鼻の経路を特に挙げることができる。組成物は、噴霧、溶液、懸濁物、コロイド、濃縮物、粉末、顆粒、錠剤、圧縮錠剤、カプセル（被覆及び非被覆の錠剤及びカプセルを含む）、座薬などとして製造できる。遅延放出又はコントロール放出の処方物も含まれる。有利には、組成物は、滅菌され、そして医学的用途に好適であろう。組成物は、ＣＤＧＦについて上述されたように使用でき、これらの用途は、本発明のさらなる面を形成する。他の面では、本発明は、ＣＤＧＦの用途を提供し、又は製薬上の用途における医薬の製造を提供する。さらなる面では、本発明は、ヒト又はヒト以外の動物（好ましくは哺乳動物）の身体を治療する方法を提供し、該方法は、治療上有効な量のＣＤＧＦ又はＣＤＧＦを含む組成物を該身体に投与することを含む。上記の治療方法は、病原体による身体（特に消化管）への侵入と闘い、創傷治癒を促進し、器官（例えば腸）の成長及び発育（特に新生児又は栄養的又は疾患の免疫不全の成人）を促進することである。方法は、また食事における変化に対する消化管の適応を促進することに有用性がある。上記の参考のために、ポリペプチドＣＤＧＦについて述べる。このポリペプチド（用語「ポリペプチド」は、本明細書で使用されるとき、分子のサイズ、形状又は構造に関係なく、任意のペプチド分子に関する）は、初乳から由来する活性因子である。ブタの初乳は、ＣＤＧＦの好適な源として挙げられている。ＣＤＧＦは、２００ｋＤａ以上の見かけの分子量を与える大きな担体分子に結合して最初に見いだされた。ＣＤＧＦは、６０〜８０ｋＤａの範囲の分子量を有すると測定されている。ＣＤＧＦは、疎水性である。ＣＤＧＦは、以下の物理的な特徴を有することが分かっている。１）蛋白分解酵素（トリプシン）により完全に破壊される活性。２）１０分間１００℃に加熱後に本質的に熱安定（７０％より高い活性が維持されている）。３）２．４Ｍの蟻酸中で安定。４）０．１％のトリフルオロ酢酸の１００％中で安定且つ溶解。５）５０ｍＭのジチオスレイトールによる処理後の活性維持。６）５０％アセトニトリルで安定。７）５０％エタノールで安定且つ溶解。ブタ初乳からのＣＤＧＦの精製は、実施例に詳細に記載されている。しかし、方法は、以下のように簡単に要約できる。ａ）２００ｋＤａより大きい分子量を有する初乳の全ての成分の分離。（このカット・オフ以下の分子量を有する成分は捨てる）ｂ）ジチオスレイトール及び１０分間煮沸による工程（ａ）の生成物の処理、及びｃ）工程（ｂ）の混合物を遠心分離して全ての沈澱物をスピンダウンさせ、ＣＤＧＦは上澄液に存在する。ＣＤＧＦは、以下の生物学的な効果をもたらすものとして明らかにされている。１）生体外培養における腸細胞の増殖の刺激。２）ラクターゼ活性及び蛋白グリコシル化により測定される腸細胞の分化の促進。３）実施例に記載される燐酸化アッセイにおけるＭＶＭ小のうの膜蛋白の燐酸化。４）ＭＶＭ小のうにおけるＧＡＰを経るＲａｓ経路の刺激。５）遺伝子ｃ−ｍｙｃ及びｆｏｓの刺激。本発明は、以下の、本発明を制限しない実施例に関連してさらに記述されるだろう。実施例１ブタ初乳から由来する生物学的に活性な成長因子の同定及び精製序論初乳の経口摂取が、蛋白の合成、蛋白の増大、並びに骨格筋及び肝臓を含む腸及び末梢組織の成長を促進することは、今や十分に確立された事実である。さらに、腸上皮の分化に対する初乳の顕著な効果は、立証されている。これらの効果のきっかけを与える初乳中の因子の生物学的性質に関する多くの予想が存在してきた。乳房の分泌は、栄養（成長促進）作用を有するポリペプチド成長因子の豊富な源を提供し、それ故非常に同様な類似物を示すことが知られている。この仮説の支持は、ここ１０年間に行われた研究から生じ、それは、腸の上皮細胞の分裂及び分化のコントロールにおけるペプチド成長因子の中心的な重要性を過小に評価している。成長因子の組成上の変化は、ヒト及びブタの両方の乳の授乳中に報告されている。最大の分裂促進活性は、授乳の初めの週の間に観察され、そしてその後段々に減少することが観察される。これらの変化は、腸の成熟を調節するのに生理学的に関連すると考えられる。本明細書で提出されたデータは、腸の分化に対するブタ初乳の生物学的な効果、並びに強力な潜在的に新規な成長因子の同定及び単離を記述している。後者の生物学的な活性も記述されている。研究のやり方本発明者は、生物活性の初乳成分を同定する二三のアプローチを利用した。最初に、全体の動物のアプローチを使用して、腸の蛋白の合成及び腸細胞の分化を促進することにおける全初乳の有効性を立証した。しかし、さらに最近、生体外のやり方が、強力な成長因子を同定し、単離しそして特徴付けるのに採用され、そしてまた初乳由来成長因子（ＣＤＧＦ）の細胞及び分子の作用を規定するのに採用された。腸の成熟に対する初乳の生体外効果新生児期の間、腸は、拡張性の構造上及び細胞化学上の改造作用を行う。例えば、乳中の主な炭水化物の加水分解の原因である主要な腸のジサッカリダーゼであるラクターゼは、生後の期間中劇的に低下する。それ故、腸の上皮中の酵素の発現の測定は、日常的に使用されて腸の発育及び適応を検討する。さらに、分泌及び膜の両方の複合糖質の末端グリコシル化における明確な年令に関連する変化が生ずる。従来の文献（Ｋｅｌｌｙ及びＫｉｎｇ、１９９１ＨｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌＪｏｕｒｎａｌ．；２３；５５−６０参照）に提出された細胞化学的データは、組織血液の群の抗原が非常に感受性のある腸の分化マーカーであることを立証している。初乳及び初期の乳が腸の成熟に影響することを立証するために、二三の生体内の実験が行われた。ラクターゼの発現及び腸のグリコシル化に対する初乳の摂食の効果を記述する一つの実験の詳細が提出される。実験のプロトコル初乳の採集授乳中の雌ブタは、乳の低下を刺激するためにオキシトシンの１回の注射を受けた。初乳のサンプルは、ヒトによる搾乳により得られそして滅菌容器に凍結保存された。実験の開始日に、初乳を解凍しプールして、均一性を確実にした。動物試験のための子孫は、５頭の雌ブタ（ラージホワイト種（ＬａｒｇｅＷｈｉｔｅ）×ランドレース種（Ｌａｎｄｒａｃｅ））から由来した。同時の交配及び薬理学上の操作の組合せを使用して、全ての雌ブタを２４時間以内に分娩させた。各雌ブタからの６頭の仔ブタは、産まれたときに捕らえられ、そして滅菌したインキュベーター中で飼育された。それぞれの同腹子からの仔ブタの半分を、初乳又は市販の代用品により胃管栄養を行った（図１）。後者の飼料製品を細胞培養系で評価し、そして成長因子の活性を欠くことが分かった。各処理からの５頭の仔ブタを、分娩後１、３及び５週で殺した。腸の組織を麻酔下得た。結果分娩後１週で、腸のラクターゼ（比活性及び組織化学的に測定された絨毛／腺窩活性）は、代用品飼育動物に比べて初乳飼育仔ブタで有意に低下した（図２）。同様なデータは、最近、Ｂｕｒｒｉｎら、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＮｕｔｒｉｔｉｏｎ１２４、２３５０−２３５７（１９９４）により記述された。分娩後３及び５週で、他の酵素即ちスクラーゼの活性は、それらの初乳由来同腹子に比べて初乳飼育仔ブタで増大した(Ｋｅｌｌｙら、ＢｉｏｌｏｇｙｏｆｔｈｅＮｅｏｎａｔｅ、６４、２３５−２４４、１９９３)。α２，６−シアリル化からα１，２−フコシル化への漸進的な変化及び腸の複合糖質に対するα２，３ −シアリル化発現は、ブタの生後の発育中に生ずる。この時間に関する事象は、酵素ラクターゼについて立証されている（図３）。有意に、分娩後１週における α２，６−シアリル化の損失及び３週におけるα２，３−シアリル化の個体発生の増大は、初乳飼育仔ブタにおいてさらに進む（図４）（Ｋｅｌｌｙら、１９９３、同上）。関連するテストでは、初期の乳の摂取を長引かせることは、また、腸のラクターゼ、並びに腸の膜上の組織血液群のＡＯ抗原の発現の早熟な低下をもたらすことが分かった(Ｋｅｌｌｙら、１９９１、同上及びＫｅｌｌｙら、１９９１Ｇｕｔ；３２：３８６−３９２)。結論新生のブタにおける初乳の消化は、ラクターゼの劇的な低下を伴う、小腸における有意な増殖上のレスポンスを生じた。これらの初期のレスポンスは、腸の膜のシアリル化における生後の変化と相関した。これ及び既存の両者の研究は、初乳及び初期の乳が腸の成熟を制御する因子を含むことを追認する。実施例２初乳中の生物活性因子の同定現在一致している意見は、初乳の非栄養成分が、初乳の成長促進及び成熟効果に関係があることである。初乳の生物活性成分の多くの同定及び機能は、現在知られておらず、そして解明されることが残っている。過去２０年間にわたる観察は、細胞の機能の制御におけるペプチド成長因子の中心的な重要性を過小評価してきた。初乳は、生物活性ホルモン及び成長因子の豊富な源であり（図５）、それらの多くは、単離して投与されるとき、腸の成長、分化、免疫系及び腸内分泌系の発育に影響することが示されている。成長因子は、成長調節生物活性を有する蛋白（５ｋＤ〜８０ｋＤ）として規定できる。しかし、生物学的作用は、また細胞表現型の調節を含む。生物学的な作用を働かすために、成長因子は、特定の高い親和性の膜結合受容体と相互に反応し、そして適切なシグナル導入／二次メッセンジャーカスケードを活性化しなければならない。受容体酵素（チロシンキナーゼ）及びＧ−蛋白結合受容体は、血漿膜に位置する導入要素を形成する。リガンド／受容体活性化のこの基本的な機構は、生物学的な活性について初乳及び初乳フラクションをスクリーンするために生体外二次メッセンジャーバイオアッセイを開発するのに利用された。燐酸化バイオアッセイ微小絨毛膜調製：腸のブラシ縁膜／微小絨毛膜（ＭＶＭ）小のうは、新生、乳のみ及び離乳のブタからの新鮮又は凍結した組織の粘膜のかきとったものから調製された。腸管のセクションは、氷パック上で縦に開けられ、そして粘膜は、顕微鏡スライドの端により丁寧なかきとりにより取り除かれた。組織は、緩い栓をしたガラス− ガラスホモゲナイザーを使用して、２ｍＭのトリス−ＨＣｌ、５０ｍＭのマニトール、ｐＨ７．４(ロイペプチン１μＭ；ペプスタチン１μＭ；ＰＭＳＦ０．２ｍＭ；ジナトリウムＥＤＴＡ０．１ｍＭ；アンチパイン２７μｇ／ｍｌを含む)からなる緩衝液（緩衝液Ａ）３容量に分散され、そして全ての外膜の結合組織を３分間２００ｇでの遠心分離により除いた。上澄液を５容量の緩衝液Ａにより希釈し、そして懸濁物をさらにテフロンガラスホモゲナイザー中で１０００ｒｐｍで１０〜１５回ホモゲナイズした。個体のＭｇＣｌ₂を１０ｍＭ加え、そして低速度で遠心分離する（１５分間で３００ｇ）前に、懸濁物を２０分間氷中に放置した。粗ＢＢＭｖを、３０分間２７０００ｇでさらに遠心分離することにより、上澄液からペレットにし、そして最後の製品は、緩衝液Ａ中の穏やかな再懸濁次に３０分間の２７０００ｇの遠心分離の２サイクル後得られた。燐酸化バイオアッセイ；ＭＶＭｖ製品を、４℃で３時間、２％トリトンＸ−１００を含む２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＭｎＣｌ₂、４ｍＭのＮａＦ、１００μＭのＮａ₃ＶＯ₄、１０ｍＭのβ−グリセロホスフェート、１μｇ／ｍｌのロイペプチン、２５μｇ／ｍｌのトリプシン阻害剤、２５ＫＩＵ／ｍｌのアプロチニン、０．１ＭのＰＭＳＦ、０．０５％のバシトラシン（緩衝液Ｂ）に溶解した。膜溶解蛋白は、３０分間の２７０００ｇの遠心分離後に得られた。可溶化したＭＶＭｖは、３ｍｇ／ｍｌの蛋白濃度に緩衝液Ｂにより希釈された。３０μｌの可溶化膜は、５μｌの１：１０希釈の脱脂無細胞初乳、初乳フラクション又はナノモル濃度の周知の成長因子並びに５μｌの緩衝液Ｂとともに１０分間周囲温度でインキュベーションし、次にさらに１５分間氷上でインキュベーションした（図６）。燐酸化は、緩衝液Ｂ中で調製された１０μｌの２０μＭ γ−³²Ｐ−ＡＴＰ（２０μＣｉ）の添加により開始された。反応は、３×Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液を使用して４℃で１５分間そして１００℃で１０分間煮沸した後、停止された。燐酸化ＭＶＭｖは、還元条件下で７．５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分析された。乾燥したゲルのオートラジオグラムは、Ｘ−ＯｍａｔＡＲフィルムにより得られた。実験の結果初乳及びＩＧＦ−１に応じる微小絨毛膜蛋白の燐酸化この生体内アッセイを有効にするために、周知の成長因子の有効性を立証することを必要とした。本発明者の研究室からの以前のデータは、新生ブタの腸中のペプチド成長因子ＩＧＦ−１に対する特定の受容体の存在を立証した。これらの受容体は、腸の筋系、固有層及び粘膜に局在していることが分かった。詳細な細胞の分析は、尖端又は微小絨毛の膜のＩＧＦ−１受容体の集団を明らかにした。燐酸化アッセイを使用して、本発明者は、ＩＧＦ−１及び脱脂無細胞初乳に応じた多数のＭＶＭ蛋白中への放射能燐の増加した挿入を立証するのに成功した（図７）。ＩＧＦ−１は、他の膜基質に加えてＩＧＦ受容体の９７ｋＤサブユニットを刺激することが分かった。初乳の乳清は、２９〜２００ｋＤの分子量範囲の二三の膜蛋白の燐酸化を刺激することが分かった。主な特徴は、２９〜４５ｋＤの分子範囲で観察できる高燐酸化である。新生、乳のみ及び離乳の微小絨毛膜の燐酸化新生、乳のみ及び離乳の膜試料は、脱脂初乳に対して同様な定量的レスポンスを生じた（図８）。しかし、等しい膜蛋白の基準では、乳のみの動物からのＭＶＭ蛋白は、より大きな程度に刺激されるように思われる。効力の順序は、乳のみ、離乳そして新生である。この時間的なレスポンスは、発育中の膜受容体の発現における定量的な差を反映しているようである。腸膜の受容体は、コムギ胚芽凝集アフィニティー精製後有意に増大する。簡単には、可溶化されたＭＶＭは、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１０ｍＭのＭｇＣｌ₂、０．１％のトリトンｘ−１００、ｐＨ７.６により既に平衡されているＷＧＡセファローズアフィニティーカラム( ２ｍｌの上澄液／１ｍｌの樹脂床)に適用された。カラムは、４℃で６時間端から端までインキュベーションされた。樹脂を次に１００ｍｌのプロテアーゼ阻害剤を含む上記の平衡緩衝液により洗った。結合した糖蛋白を、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、０．０５％のトリトンＸ−１００及び０．３ＭのＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを含む緩衝液により５００μｌずつのフラクションに溶離した。フラクション１〜８をプールし、そして３０ｋＤのｆｉｌｔｒｏｎ（Ｆｉｌｔｒｏｎ、ＵＫ）を使用して１０倍に濃縮した。ＷＧＡ精製蛋白の燐酸化は、上記のように行われた。結果（図９）は、膜の蛋白、特に高燐酸化蛋白及び１２０ｋＤの蛋白の燐酸化の有意な増大を示す。この結果は、初乳により活性化される二次メッセンジャーカスケード中に或る洞察をもたらす。初乳による腸膜チロシンキナーゼ受容体の活性化上述のように、２種の主な膜結合受容体群、即ちチロシンキナーゼ受容体及びＧ−蛋白結合受容体が存在する。ペプチド成長因子のための膜透過受容体の多くは、リガンド結合のときに多数の膜及び細胞質ゾル基質の自動燐酸化及び燐酸化を誘導する固有のチロシンキナーゼ活性を有する（図１０）。特異的な阻害剤は、初乳の効果を媒介する受容体の群を確かめるために使用された。ベンジリデンマロンニトリル核から由来するチルホスチン（ｔｙｒｐｈｏｓｔｉｎ）と命名された一連の有機化合物が、受容体チロシンキナーゼ活性を阻害することが示されている。以下の阻害剤チルホスチン１、２５、Ｂ４２、Ｂ４４、Ｂ４６、Ｂ４８、Ｂ５０、Ｂ５６は、ナノモルからミクロモルに及ぶ濃度で、テストされた（図１１、１２）。ゲニステイン、スタウロスポリン（ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ）及びＨ７（図１３）も検討された。ゲニステインは、イソフラボン化合物であり、そしてスタウロスポリンは、細菌性アルカロイドである。スタウロスポリンは、チロシンキナーゼを阻害するが、また蛋白キナーゼＣ（ＰＫＣ）に影響する。膜製品は、阻害剤の存在下一晩インキュベーションされ、そして燐酸化アッセイは、上記のように行われた。チルホスチン２５、スタウロスポリン及びＨ７は、膜蛋白の燐酸化を有意に阻害し、受容体がチロシンキナーゼ受容体であることを示した。ＰＫＣも含まれる。脱脂無細胞初乳によるＲＡＳ／ＧＡＰ燐酸化の活性化Ｒａｓ蛋白の活性化は、リガンド結合細胞表面チロシンキナーゼ受容体により引き起こされる生化学的経路における重要な段階である。同様に、２１ｋＤのＧＴＰ結合蛋白であるＲａｓが、成長のコントロールに重要な役割をはたしていることは、長い間確実とされている。Ｒａｓの活性は、それがＧＴＰ又はＧＤＰにより占められているかどうかにより決定される。変換は、受容体の活性化後に生ずる。受容体の活性化後、Ｇｒｂ２及びＳＯＳと呼ばれる２種の蛋白（図１４）は、受容体と錯体をつくる。Ｇｒｂ２は、細胞質センサー／輸送体として働き、そしてリガンド誘導自動燐酸化を検知する。Ｓｏｓは、グアニンヌクレオチド放出因子として働き、そしてＧＴＰではなくＧＤＰに対するＲａｓのアフィニティーを低下させ、それによりＲａｓ活性化に導く。Ｇｒｂ２及びＳｏｓは、高アフィニティーＳＨ２結合により、受容体上の特異的な自動燐酸化部位に結合する。他の分子は、この錯体、例えばホスホリパーゼＣγ（ＰＬＣγ）及びＧＴＰアーゼ活性化蛋白（ＧＡＰ）に含まれる。１２０ｋＤの蛋白であるＧＡＰは、燐酸化により活性化され、そしてまた受容体と錯体をつくり、さらにＲａｓＧＴＰからＲａｓＧＤＰへの変換を触媒化する（図１５）。Ｇａｐは、それ故成長をコントロールするシグナル経路において重要な位置を占めると考えられる。ＧＡＰ及び他の蛋白基質の免疫精製新生ブタからの可溶化ＭＶＭ（１００μｇ／３０μｌ）を、脱脂無細胞初乳により上記のように燐酸化した（注：初乳サンプルは、ＩｇＧを除きそして免疫精製の方法との干渉を防ぐために、５ｍｇの蛋白Ｇ及び７．５ｍｇの蛋白Ａによりそれぞれ４℃で２時間予め吸収された）。³²Ｐ−γＡＴＰの添加後、ＧＡＰをマウス抗ＧＡＰＭａｂ（ＵｐｓｔａｔｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、ＬａｋｅＰｌａｃｉｄ、ＮＹから購入）により単離した。ＧＡＰＭＡｂ(１０μｇ／１０μｌ)を４種の膜サンプルのそれぞれに加え( ４×１００μｇの蛋白)、そして４℃で４時間インキュベーションした。インキュベーション後、２ｍｇの蛋白Ｇを添加し、そしてサンプルを４℃でさらに４時間インキュベーションした。サンプルを次にｍｏｂｉｔｅｃフィルターカラム（Ｍｏｂｉｔｅｃ、Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ、ドイツ）に移し、カラムを５０カラム体積の緩衝液Ｂにより徹底的に洗った。結合した蛋白は、３×Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液を使用して回収され、そして１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分離された。図１６は、Ｒａｓ／ＧＡＰが初乳の刺激後活性化されることを立証する。多重燐酸化蛋白の外見は、受容体錯体の免疫精製と一致した。図１７は、２種の細胞骨格高燐酸化基質即ちアネキシン(ａｎｎｅｘｉｎ)及びサイトケラチン(ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ)の同定を説明している。実施例３初乳由来成長因子の単離及び特性周知の成長因子との比較：ＣＤＧＦは、微小絨毛膜蛋白の燐酸化の非常に再現可能且つ強力な刺激を誘導した。燐酸化のパターンは、活性を同定する試みにおいて周知の成長因子と比較された。ＩＧＦ−１は、新生及び乳のみのＭＶＭ蛋白を燐酸化することが既に示されているが、パターンは、全く異なる。同様に、初乳由来（ＣＤ）及び初乳飼育（ＣＦ）仔ブタへのＩＧＦ−１の経口投与の効果を検討する生体内実験は、ＩＧＦ−１は腸の機能を調節できるが、初乳の生物学的作用は、ＩＧＦ−１によって真似できない。要するに、ＩＧＦ−１は、ラクターゼの正常の細胞の低下を予防し、ＣＤにおけるα２，３−シアリル化の発現を遅延させるが、ＣＦブタにおいてではなかった（図１８、１９）。（Ｋｅｌｌｙら、１９９４）。多数の他の成長因子は、燐酸化アッセイを使用してスクリーンされている。ＣＤＧＦと同じ又は同様な作用を示す成長因子は、スクリーンされていない。図２０は、ＥＧＦ、インスリン、ＴＧＦ及びそれらの相乗作用とＣＤＧＦとの比較を示している。成長ホルモン、ボンベシン、ラクトフェリンなどもスクリーンされている。授乳中のＣＤＧＦの濃度：ＣＤＧＦは、初乳中に最高の濃度で存在し、そして授乳が進むにつれて有意に低下する。初乳の活性は、１００倍の希釈で無視されるレベルに減少する（図２１）。７日（ｄ）の授乳で生ずる乳は、約２０倍少ないＣＤＧＦを含むが、レベルは、なお生理学的に有意である。さらに、ＣＤＧＦの濃度の減少は、多くの周知の成長因子により示される低下する傾向と一致する。ＣＤＧＦの化学的な特徴：ＣＤＧＦは、トリプシンにより劣化し、そのペプチドの性質を確かなものとする。活性は、酸即ち蟻酸及びトリフルオロ酢酸中で安定である。１００℃で１０分間の加熱は、活性の小さな損失をもたらすように見える（図２２）。ＣＤＧＦの活性は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）で保存され、そのため、ジスルフィド橋は、生物学的な活性に関係がない。これらの処理の組合せは、生物学的活性に対して殆ど効果がなかったが、ＣＤＧＦの有意な精製をもたらした。（図２２ｂ参照）。ＣＤＧＦの精製：第一相：サイズ除外クロマトグラフィー初乳サンプルを分娩の開始から８時間以内の雌ブタから得た。初乳を３０分間２７０００ｇで遠心分離し、そしてＡｃＡ３４(アクリルアミド／アガロース) カラム（除外限界３００ｋＤ）に適用された。サンプルを２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．２（組織培養グレード）で操作した。フラクションをプールし、蒸留Ｈ₂Ｏについて透析し、そして最後に凍結乾燥した。フラクションを、初めの初乳濃度に戻し、そして生物学的な活性を燐酸化バイオアッセイを使用して求めた。活性は、初乳の高分子量フラクションに存在した（図２３）。図２４は、Ｆ５と完全に組合わさった燐酸化活性を示す。最初に述べたように、ペプチド成長因子は、３〜８０ｋＤの分子範囲にあると考えられる。単離された因子がボイド容量で溶離し、そのサイズが少なくとも２５０ｋＤであったことを示唆している。現在まで、新規なＴＧＦβが最近１５０ｋＤであると記述されているが、このサイズの成長因子は単離されていない。それ故、ＣＤＧＦは、多くの他のペプチド成長因子と同様に、より小さいペプチドであるが、大きな結合蛋白と組み合わされて初乳中に存在することが仮説として取り上げられた。第二相：逆相クロマトグラフィー即ちＣＤＧＦが結合蛋白に結合しそしてそれ自体より低い分子サイズを有するという上記の仮説の正当性を評価するために、２種のさらなる精製のやり方が行われた。第一のものは、逆相クロマトグラフィーを含んだ。ゲルろ過カラムから単離されそして生物学的活性（燐酸化アッセイを使用して測定される）により同定されるフラクションＦ５を、その結合蛋白からそれを解離するために、０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中に再懸濁した。フラクションを次に、アセトニトリル（ＡＣＮ）（遠紫外線グレード）及び０．１％のＴＦＡに予め浸漬することにより既に調製したＢｏｎｄＥｌｕｔＣ１８カラムに適用した。（これらのカラムは、不可逆的により大きな蛋白を結合することに注意）。カラムを次に９０％の０．１％ＴＦＡ／１０％のＡＣＮから２０％ＴＦＡ／８０％ＡＣＮの勾配により溶離した。溶離されたフラクションを、０．２％ウシ血清アルブミン (ＢＳＡ)の存在下蒸発乾固し、次に蒸留Ｈ₂Ｏにより再溶解した。活性ペプチドは、３０〜５０％のＡＣＮで溶離することが分かった（図２５）。第三相：カオトロピック剤グアニジン塩酸塩の存在下のＨＰＬＣ精製：ペプチドの分子サイズの指示をもたらすために、ゲルろ過カラムからのフラクションＦ５を０．１％ＴＦＡに再懸濁し、そしてＨＰＬＣＢｉｏＳｅｐＳＥＣ２０００カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）に注入した。サンプルを５Ｍグアニジン塩酸塩の存在下処理し、全てのピークを集めた。１０個の独立した注入からの溶離液をプールした。各フラクションを次に脱塩（残存グアニジンは５ｐＭ未満であった）するために、１ＫＦｉｌｔｒｏｎ濃縮器を使用して徹底的に洗い、そしてサンプルを約４０ｍｌの最初の体積から２００μｌに濃縮した。フラクションを次に０．２％のＢＳＡの存在下蒸発乾固し、そして蒸留水に再溶解した。活性は、フラクション２（溶離時間１３．５〜１４．５分）に存在した（図２６）。図２７は、Ｆ２に完全に組み合わされた燐酸化活性を示す。ペプチドの精製に採用した正確な処理条件下のカラムの以前の較正は、分子サイズが約７０ｋＤであることを明らかにした。ペプチドの正確な分子量は、配列データ、又はマトリックス補助レーザー脱着イオン化、フライト（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）スペクトル分析を要する。実施例４生物学的活性成長因子の作用の立証：成長因子としてのペプチドの最終的な分類は、培養中の細胞に対するその成長促進作用の立証である。ＣＤＧＦは、ブタの初乳から由来し、現在、ブタの腸の細胞系は存在しない。しかし、ラットの腸の腺窩細胞即ちＩＥＣ６から単離された細胞系は、ＣＤＧＦの分裂促進活性を検討するのに使用された。細胞は、５％の胎児ウシ血清（ＦＣＳ）、２ｍＭのＬ−グルタミン及びペニシリン／ストレプトマイシン抗生物質を含む１ｍｌのＤｕｌｂｅｃｃｏｓ修飾Ｅａｇｌｅｓ培地ＤＭＥＭ中の２４穴Ｃｏｒｎｉｎｇプレートの１穴当たり１００００個の細胞でシードされた。１６時間の培養後、細胞を、少なくとも２４時間、１０μｇ／ｍｌのトランスフェリン及び０．２μｇ／ｍｌの亜セレン酸ナトリウムを含むＤＭＥＭ中に入れた。細胞を次に、２０時間５％のＦＣＳ、１０％の脱脂無細胞初乳及び１０％のＣＤＧＦにより刺激し、その後、２μｃｉ ³Ｈ−チミジンをさらに４時間各穴に添加した。細胞を次いでＨａｎｋｓバランス塩溶液中で洗い、メタノール中で固定し、ＴＣＡで沈澱させ、そしてＮａＯＨで可溶化した。挿入した放射能チミジンを次にβ−カウンターを使用して計数した。ＣＤＧＦは、ＩＥＣ６細胞を、対照より有意に上に刺激し、そして事実或る実験では初乳のそれより上に刺激することを知った（図２８）。周知の成長因子との比較：ＣＤＧＦの活性は、チロシンキナーゼ受容体を通してそれらの作用も媒介する周知の成長因子、即ちＥＧＦ、ＩＧＦ、ＦＧＦ及びＰＤＧＦと比較された。これらの因子は、ナノモルからミクロモルに及ぶ濃度で、単独又は組合せの何れかで細胞に供給された。テストされた周知の成長因子は、ＣＤＧＦと真似することができなかった（図２９、３０）。実験は、また、ＣＤＧＦが、ヒト腸Ｃａｃｏ− ２細胞系、ヒト結腸ガン細胞系の成長を促進できることを示した。ＣＤＧＦは、それ故、異なる種、即ちラット、ブタ及びヒトから由来する腸の細胞系上に生物学的作用を生ずることができる。ＲａｓのＣＤＧＦ下流の生物学的活性：成長因子に応答する増殖及び分化に関する遺伝学的基礎を理解する一つのアプローチは、遺伝子活性をモニターすることである。Ｒａｓ経路は、初期応答遺伝子ｃ−ｍｙｃ及びｆｏｓの誘導と結びついている（図３１）。遺伝子の発現を刺激するＣＤＧＦの能力は、ラットＩＥＣ６及びヒトＣａｃｏ−２の両者の細胞系を使用して検討された。培養条件は、上記のそれと同じであったが、但し細胞は、９０ｃｍのＧｒｅｉｎｅｒ培養プレート上にシードされた。細胞は、２時間１０μｇ／ｍｌのシクロヘキサミドの存在下初乳及びＣＤＧＦにより刺激され、そしてトランスフェリン及びセレンを補足されたＤＭＥＭの存在下成長した対照と比較された。初期応答遺伝子ｃ−ｍｙｃ及びｆｏｓの超誘導を調べるために、ＲＮＡをＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ及びＳａｃｃｈｉの方法を使用して抽出し、そして初期応答遺伝子発現をノーザンハイブリッド化を使用してモニターした。予備的なデータは、ＣＤＧＦがｆｏｓ及びｃ−ｍｙｃについてｍＲＮＡを刺激することを確証した（結果は示されていない）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 38/27 Ａ６１Ｋ 37/36 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．６０〜８０ｋＤａの分子量を有するとともに疎水性である初乳由来成長因子（ＣＤＧＦ）において、ｉ）該因子の活性が蛋白分解酵素により完全に破壊され、ｉｉ）前記因子が１００℃で１０分間加熱後熱安定であり、ｉｉｉ）前記因子が２．４Ｍ蟻酸中で安定であり、ｉｖ）前記因子が１００％の０．１％トリフルオロ酢酸中で安定且つ可溶であり、ｖ）前記因子の活性が、ジチオスレイトールによる処理後維持され、ｖｉ）前記因子が、５０％のアセトニトリル中で安定でありそしてｖｉｉ）前記因子が、５０％エタノール中で安定且つ可溶である初乳由来成長因子（ＣＤＧＦ）。２．前記因子がブタ初乳から由来する請求項１記載の因子。３．前記因子が、ｉ）生体外培養で腸細胞の増殖を刺激し、ｉｉ）ラクターゼ活性及び蛋白グリコシル化により測定されるように腸細胞の分化を促進し、ｉｉｉ）燐酸化アッセイにおいてＭＶＭ小のうの膜蛋白を燐酸化し、ｉｖ）ＭＶＭ小のう中のＧＡＰを経てＲａｓ経路を刺激しそしてｖ）ｃ−ｍｙｃ及びｆｏｓの遺伝子を刺激する請求項１又は２記載の因子。４．ａ）２００ｋＤａより大きい分子量を有する初乳の全ての成分を分離し、より低い分子量を有する成分を捨てる工程と、ｂ）ジチオスレイトール及び約１０分間煮沸により工程（ａ）の生成物を処理する工程と、及びｃ）工程（ｂ）の混合物を遠心分離して沈澱物をスピンダウンさせ、前記因子を含む上澄液を分離する工程と、を備える請求項１乃至３の何れか一つの項の因子の製造方法。５．請求項１乃至４の何れか一つの項の因子を含む治療組成物。６．少なくとも不活性担体又は助剤をさらに含む請求項５記載の治療組成物。７．食品補助剤又は食品として処方された請求項５記載の治療組成物。８．製薬上の用途用の治療剤の製造における請求項１乃至７の何れか一つの項の因子の用途。９．ヒト又はヒト以外の動物の身体に、治療上有効な量の請求項１乃至８の何れか一つの項の因子又は因子を含む組成物を投与することを含む該身体の治療方法。 10．病原体による身体への侵入と闘うことと、創傷治癒を促進することと、器官の成長及び発育を促進することと、及び食事における変化に対する消化管の適応を促進することと、を含む群からの少なくとも一つの治療のための請求項９の方法の用途。