【発明の詳細な説明】
遺伝子治療のための自己削除性ベクター発明の分野
本発明は、好ましくは組み込み時に転写単位に無関係のすべての配列が除去さ
れるように転写単位を真核細胞に導入する、特別に作製されたベクターに関する
。任意の天然のまたは合成プロモーター／エンハンサー配列、タンパク質コード
配列およびポリアデニル化部位を含む１つの転写単位のみが、ゲノムに保持され
る。ゲノムから自分自身を除去することにより本発明のベクターは、導入された
遺伝子または組み込み部位に隣接する遺伝子による転写妨害、細胞癌遺伝子の活
性化、内因性レトロウイルスの動員、および免疫応答の出現のような、従来のベ
クター（例えば、レトロウイルスおよびそのベクター）で遭遇する問題を避ける
ことができる。発明の背景
レトロウイルスは、ＤＮＡ中間体を介して複製するＲＮＡウイルスである。ウ
イルスＲＮＡゲノムの端には、ＤＮＡ合成、組み込み、転写、およびＲＮＡプロ
セシングを制御する短い配列の繰り返し（Ｒ）とユニークな配列（Ｕ５とＵ３）
が隣接する。制御領域の間には、ウイルス粒子の主要な構造タンパク質（ｇａｇ
とｅｎｖ）および粒子中に存在する酵素（ｐｏｌ、プロテアーゼ、逆転写酵素お
よびインテグラーゼ（integrase））のコード配列がある（図１）。
感染後まもなく、ウイルスＲＮＡは逆転写酵素によりＤＮＡに変換される。こ
のプロセスは、細胞性ｔＲＮＡが伸長プライマーとして作用して、ウイルスゲノ
ム内の相補的な領域に結合することにより開始される。プライマー結合部位（Ｐ
ＢＳ）とも呼ばれるこの領域は、Ｕ５のすぐ下流に存在し、ウイルス複製に必須
である。組み込みの前に、それぞれがＵ３、ＲおよびＵ５領域を含有する長い末
端反復配列（ＬＴＲ）がレトロウイルスゲノムの両側に隣接するように、ウイル
スゲノムの末端配列は複製される。この型の線状ＤＮＡ分子はゲノム内に組み込
まれる（図１）。
ＬＴＲ配列は、プロウイルスとも呼ばれる組み込まれたウイルス内で維持され
るが、２つのヌクレオチド（ｎｔ）は各末端から失われる。細胞性ＤＮＡ配列も
変化しないが、組み込み時に、プロウイルスは両端に４〜６ｎｔの反復配列が隣
接するように４〜６ｎｔが複製される。プロウイルスとしてレトロウイルスゲノ
ムは細胞性ＤＮＡとともに複製され、ＲＮＡポリメラーゼIIにより細胞性遺伝子
として転写される。プロウイルス転写は、５’ＬＴＲのＵ３領域に存在するプロ
モーター／エンハンサー配列により制御される。ポリアデニル化転写体は、５’
ＬＴＲ内のＵ３とＲ（ｃａｐ部位）の結合部分で開始し、ポリアデニル化のシグ
ナルを含有する３’ＬＴＲのＲで終結する。完全長（ゲノム）ＲＮＡは、核から
細胞質に運搬され、ウイルス粒子にパッケージングされて細胞から出芽するかま
たは翻訳されてｇａｇおよびｐｏｌタンパク質を産生する。ＲＮＡの一部はスプ
ライスされて、ｅｎｖをコードするｍＲＮＡを生成する。
哺乳動物ゲノムに遺伝子を導入するようにレトロウイルスを改変することは可
能である。ＬＴＲ内のいくつかの制御配列が変化しないなら、逆転写、組み込み
および粒子形成に必要なタンパク質を発現する細胞中で複製するその能力を障害
することなく、レトロウイルスゲノムを削除することができる。このために、ベ
クターＤＮＡは、完全なレトロウイルスゲノムまたはヘルパーウイルスを含有す
る細胞株にトランスフェクションされる。ヘルパーウイルスは、Ｕ５とｇａｇの
間の配列（Ｙ）を含む小さい欠失のために粒子が集合することのないように作製
される。ベクターＤＮＡはＹ欠失を含有しないため、組換え転写体はパッケージ
ングされ、ウイルス粒子として細胞から排除される。Ｙ以外にｇａｇ配列もまた
、ベクターがパッケージングされる能力を増強することができる。
今日までレトロウイルスベクターは、外来遺伝子を哺乳動物細胞に導入するの
に最も効率的な手段である。従ってレトロウイルスは、認可されたすべての遺伝
子治療試験の８０％以上で使用されている。しかしいくつかの要因が、遺伝子治
療ベクターとしての従来のレトロウイルスの実際的使用を妨げている。まず、導
入された遺伝子はしばしば、メチル化またはウイルスゲノムへの転写レプレッサ
ーの結合により不活性化される（１〜３）。これらのレプレッサーはいくつかの
レトロウイルスのプライマー結合部位に結合することが証明されており、その単
純な除去によりウイルス複製が妨害されるであろう。第２に、レトロウイルスは
ゲノムにほとんどランダムに組み込まれるため、しばしば組み込みにより突然変
異が起き、これが隣接遺伝子の発現を増強する（４、５）。隣接するプロト癌遺
伝子の活性化の次に感染細胞の悪性形質転換が起きることが、記載されている（
６）。活性化機構には、上流Ｕ３プロモーターまたは近くのＵ３エンハンサーに
よる転写増強が関与する。第３に、パッケージシグナルやリーダー配列のような
ウイルスベクター配列は、内因性レトロウイルスと組換えを起こして、新しい好
ましくない型の感染性ウイルスを生成することがある（７〜９）。最後に、ある
ベクターのウイルスまたは非ウイルス配列は、導入された細胞を排除する免疫応
答を引き起こすことがある（１０）。遺伝子治療の総説は（２６）に記載されて
いる。
本発明の目的は、先行技術のベクターの欠点を示さない新規ベクターを提供す
ることである。
このような目的は、部位特異的リコンビナーゼの少なくとも１つのコード配列
およびこのリコンビナーゼに特異的に認識される少なくとも１つの標的配列から
なる遺伝子治療に有用なベクター系により達成される。
このベクター系は、ＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターでもよい。現在、遺
伝子治療に使用でき、本発明のベクター系の作製のための出発物質として適して
いるベクターがいくつかある。
部位特異的リコンビナーゼは、標的配列を特異的に認識する任意のリコンビナ
ーゼであってよい。先行技術は、部位特異的リコンビナーゼおよび対応する標的
配列のいくつかの例を提供する。当業者は、ベクター内のリコンビナーゼおよび
標的配列をコードする配列の位置は、哺乳動物ゲノムに取り込まれた後ベクター
のどの部分が除去されるかにより、選択することができる。部位特異的リコンビ
ナーゼは随時、標的配列とさらにゲノムにベクターを取り込むのに必要な配列を
含有するベクターを有する細胞中に同時に含有される別のベクターによりコード
されてもよい。さらに、リコンビナーゼは、標的配列を有するベクターを含有す
る細胞にタンパク質として添加してもよい。
好適な実施態様において、使用されるリコンビナーゼと標的配列の組合せは、
リコンビナーゼＣｒｅと標的配列ｌｏｘＰである。
さらなる実施態様において、リコンビナーゼはＦｌｐであり、標的配列はｆｒ
ｔである。
本発明のベクターは、哺乳動物ゲノム内に導入される目的の機能をコードする
遺伝子からなる転写単位である、任意の転写単位を含有してもよい。多くの場合
この遺伝子は、本発明のベクターを受け取る細胞により正しく調製されないタン
パク質をコードする。
さらに好適な実施態様において、本発明のベクターはレトロウイルスベクター
であり、最も好ましくはレトロウイルスＤＮＡである。
レトロウイルスベクターが使用される場合、標的配列は好ましくはＵ３および
／またはＵ５領域に挿入され、この領域はさらに転写単位を含有してもよい。さ
らに好適な実施態様において本発明のベクターは、ウイルスプロモーターおよび
／またはエンハンサーを含んでよい。
哺乳動物細胞への本発明のベクターの導入の結果、ゲノムの所望ではないベク
ター部分の除去後、ベクターにより導入された少なくとも１つの標的配列を含有
する細胞が得られる。ベクターがまた追加の転写単位を含む多くの場合、この追
加の転写単位は哺乳動物細胞ゲノム内に含有される。転写単位が、通常は哺乳動
物細胞にも含有されるが何らかの理由で機能しない遺伝子を含有する場合、本発
明のベクターを介して細胞に導入される遺伝子は、細胞内に天然に存在する場合
の遺伝子と比較すると異なる染色体環境を有するであろう。ベクター配列（例え
ば、プロウイルスゲノム）が染色体から削除されると、一般にプロウイルスゲノ
ムの数個のヌクレオチドが細胞のゲノム内に残る。従って本明細書において「基
本的にプロウイルスゲノムがない」とは、好ましくは６００塩基対未満、より好
ましくは１００塩基対未満のヌクレオチドがゲノム内にとどまることを意味する
。
本発明のベクターを使用することにより、任意のＤＮＡを哺乳動物細胞のゲノ
ムに取り込むことができる。
ベクター内の標的配列の位置は、ベクターの取り込み後にベクターのどの部分
がゲノムから削除されるかを、あらかじめ決定することを可能にする。
本発明は、真核細胞のゲノム内に治療目的または非治療目的で転写単位を導入
するための新規のベクター、特にレトロウイルスの開発を含む。このベクターは
、ＣｒｅまたはＦｌｐのようなリコンビナーゼおよびｌｏｘＰまたはｆｒｔのよ
うな少なくとも１つの特異的標的配列を含む部位特異的組換え系を有する。この
系は組み込まれると、転写単位に関係のないすべてのウイルスおよび非ウイルス
配列が除去されるように活性化される。この種のレトロウイルスは好ましくは、
従来のレトロウイルスベクターで遭遇するすべての好ましくない副作用を避ける
ことができる。
本発明の好適なレトロウイルスベクターは、好ましくはＵ３またはＵ５領域内
に、プロモーター、タンパク質コード配列、およびポリアデニル化配列を含む転
写単位を含有する。また好ましくはＵ３またはＵ５領域において、本発明のレト
ロウイルスは、部位特異的組換え系の少なくとも１つの合成または天然の標的配
列を含有する。このような系において、同じ配向を有する標的配列が隣接するＤ
ＮＡ断片は、対応するリコンビナーゼにより除去される（図２）。
本発明のレトロウイルスは、複製中にＵ３またはＵ５領域内に標的配列を挿入
して複製する。これによりウイルスゲノムの大部分が同一の標的配列内に配置さ
れ、リコンビナーゼがプロウイルスの塊を除去することを可能にする。目的の遺
伝子を含有する導入された転写単位の１つのコピーのみが、ゲノム内に残る。こ
のリコンビナーゼの発現は、導入された細胞内へのタンパク質またはリコンビナ
ーゼを発現するプラスミドの導入によりトランスで達成されるか、または好まし
くはプロウイルス自身からリコンビナーゼを発現してシスで達成される（図３、
４）。この場合、リコンビナーゼをコードする配列は、好ましくはプロウイルス
制御領域（ＬＴＲ）の外の標的配列の間に配置される。これらの発現は好ましく
は、第２の合成または天然のプロモーターにより制御される。ポリアデニル化シ
グナルは好ましくは、３’ＬＴＲのＲ領域により提供される。プロウイルスに対
してリコンビナーゼカセットが逆の配向の場合、転写は、隠れたプロウイルスポ
リアデニル化シグナルで終わるか、または逆の配向でウイルスにクローン化され
た追加の合成または天然のポリアデニル化配列で終わる。
本発明のレトロウイルスはエンハンサーおよび／またはプロモーターがないこ
とが好ましい。しかし本発明のレトロウイルスは、それ自身のプロモーターおよ
びエンハンサー配列を含有し続ける。
本発明のレトロウイルスは好ましくは、哺乳動物細胞に治療遺伝子を導入する
のに使用されるが、基礎的研究にも使用できる。
本発明のレトロウイルスはまた、有害な可能性のある配列が組み込まれた後の
しかるべき時期に削除される限り、これらを導入してもよい。例えば、応用の可
能性のあるのは、ヒトレトロウイルス（ＨＩＶ、ＨＴＬＶＩ）ベースのベクター
である。
本発明は、本発明のレトロウイルスにより導入された少なくとも１つの部位特
異的組換え標的（例えば、ｌｏｘＰまたはｆｒｔ）および少なくとも１つのタン
パク質コード配列を含有する哺乳動物細胞を含有する。これらの細胞はほとんど
レトロウイルス配列が欠失している。
最後に本発明は、哺乳動物ゲノム内にｃＤＮＡ配列を導入する方法（例えば本
発明のレトロウイルスによるプロデューサー細胞のトランスフェクション、哺乳
動物細胞の感染、およびリコンビナーゼ発現カセットの削除に関連する部位特異
的リコンビナーゼの発現）を含む。図面の簡単な説明
図１は、先行技術のレトロウイルスのゲノムの略図である。
図２は、部位特異的組換え系の略図である。
図３と４は、本発明のレトロウイルスの略図であり、Ｐ＝プロモーター；Ｔｓ
＝部位特異的標的配列；ＰＣＳ＝タンパク質コード配列、Ｒｅｃ＝レコンビナー
ゼである。
図５は、レトロウイルスベクターＵ３ｐｇｋｌｘｔｋｎｅｏとＵ３ｐｇｋｌｘ
ｔｋｎｅｏＭＣＣｒｅの略図である。
図６は、ＭＣＣｒｅをトランスフェクションする前後のＵ３ｐｇｋｌｘｔｋｎ
ｅｏを発現するクローンのサザンブロット解析である。最初の６つのレーンにお
いて、ＤＮＡはプロウイルス内で切断しない酵素ＮｄｅＩとＸｂａＩで消化した
。レーン７〜１２は、Ｃｒｅ発現（＋）クローンおよび非発現（−）クローンか
らのＨｉｎｄIII で消化したＤＮＡを含有する。
図７は、Ｕ３ｐｇｋｌｘｔｋｎｅｏ（Ａ）とＵ３ｐｇｋｌｘｔｋｎｅｏＭＣＣ
ｒｅ（Ｂ）を発現するクローンから得たＤＮＡによるサザンブロット解析を示す
。Ｃｒｅ発現クローン（Ｂ）からの一定のＨｉｎｄIII 断片のシグナル強度の低
下に注意されたい。可変バンドは、プロウイルスの数に対応する。
図８は、レトロウイルスベクターｐｇｇＳＶＣｒｅＵ３ｌｘｐｇｋｐｕｒｏと
ｐｇｇＳＶＣｒｅＵ３ｌｘＳＶｐｕｒｏの略図である。
図９は、ＮＩＨ３Ｔ３細胞中のＵ３ｌｘｐｇｋｐｕｒｏＳＶＣｒｅプロウイル
スの組換えを示す。（Ａ）部位特異的組換えの前後のプロウイルスの予測される
構造。（Ｂ）Ｕ３ｌｘｐｇｋｐｕｒｏＳＶＣｒｅプロウイルスのサザンブロット
解析。ゲノムＤＮＡはＥｃｏＲＩで切断し、アガロースゲルで分画し、ナイロン
フィルターにブロットし、32Ｐ標識ｐｇｋ−プローブにハイブリダイズさせた。
レーン１〜１４、Ｕ３ｌｘｐｇｋｐｕｒｏＳＶＣｒｅを発現するクローン１〜１
４。遍在する７kbの一定のバンドは、内因性ｐｇｋプロモーターである。（Ｃ）
Ｕ３ｌｘｐｇｋｐｕｒｏＳＶＣｒｅを発現するクローンのＰＣＲ解析。ゲノムＤ
ＮＡは、Ｃｒｅ−（上）またはｂ−アクチン−（下）特異的プライマーで増幅し
た。増幅産物は、１％アガロースゲルで分離し、以下のようにレーンを臭化エチ
ジウムで染色して可視化した：Ｍ、分子量標準物質（１kbのＢＲＬラダー）；１
〜１４、Ｕ３ｌｘｐｇｋｐｕｒｏＳＶＣｒｅを発現するクローン１〜１４；１５
、単一のコピーのＵ３ｐｇｋｌｘｔｋｎｅｏを発現するクローン（陰性対照）；
１６、単一のコピーのＵ３ｐｇｋｌｘｔｋｎｅｏＭＣＣｒｅを発現するクローン
（陽性対照）。
図１０は、ＮＩＨ３Ｔ３細胞中のＵ３ｌｘＳＶｐｕｒｏＳＶＣｒｅプロウイル
スの組換えを示す。（Ａ）部位特異的組換えの前後のプロウイルスの予測される
構造。（Ｂ）Ｕ３ｌｘＳＶｐｕｒｏＳＶＣｒｅプロウイルスのサザンブロット解
析。細胞性ＤＮＡはＥｃｏＲＩ（左）またはＨｉｎｄIII （右）で切断し、図２
の凡例に記載のように処理し、32Ｐ標識ＳＶ４０−プローブにハイブリダイズさ
せた。レーン１〜１２、Ｕ３ｌｘＳＶｐｕｒｏＳＶＣｒｅを発現するクローン１
〜１２。（Ｃ）Ｕ３ｌｘＳＶｐｕｒｏＳＶＣｒｅを発現するクローンのＰＣＲ解
析。ゲノムＤＮＡは、Ｃｒｅ−（左）またはｂ−アクチン−（右）特異的プライ
マーで増幅した。増幅産物は、１％アガロースゲルで分離し、以下のようにレー
ンを臭化エチジウムで染色して可視化した：Ｍ、分子量標準物質（１kbのＢＲＬ
ラダー）；１〜１２、Ｕ３ｌｘＳＶｐｕｒｏＳＶＣｒｅを発現するクローン１〜
１２；１３〜１４、単一のコピーのＵ３ｐｇｋｌｘｔｋｎｅｏを発現するクロー
ン（陽性対照）；１５〜１６、単一のコピーのＵ３ｐｇｋｌｘｔｋｎｅｏＭＣＣ
ｒｅを発現するクローン（陰性対照）。
「ベクター系」という用語は、リコンビナーゼのコード配列およびこのリコン
ビナーゼの標的配列を細胞のゲノムに導入することができる少なくとも１つのベ
クターを意味する。リコンビナーゼをコードする配列および標的配列は、２つの
異なるベクター上に位置してもよいが、好ましくは１つのベクター中に存在する
。リコンビナーゼは随時、ベクター系がリコンビナーゼのコード配列を含まなく
てもよいように、細胞内にタンパク質として導入されてもよい。
「レトロウイルス」という用語は、ＤＮＡ中間体を介して複製する任意のＲＮ
Ａウイルスを意味する。このようなウイルスには、継代のためにヘルパーウイル
スのような他のウイルスの存在を必要とするものがある。すなわちレトロウイル
スは、そのＲＮＡ中に実質的な欠失または突然変異を有するものを意味すること
が企図される。
「対照領域」という用語は、感染後および組み込みの前に複製されるレトロウ
イルスの領域を意味する。対照領域は、Ｕ３およびＵ５領域を含む。このような
領域はまた、ＬＴＲ領域を含む。
「転写単位」という用語は、天然のまたは合成プロモーター、タンパク質コー
ド配列、およびポリアデニル化シグナルを含む核酸の配列を意味する。プロモー
ターはエンハンサーを含有してもよい。
「タンパク質コード配列」という用語は、治療的価値を有するかまたは何らか
の方法で細胞の代謝を妨害するポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を
意味する。これはまた、一般に「選択性マーカー」と呼ばれる、ポリペプチド鎖
を発現する細胞をポリペプチド鎖を発現しない細胞から区別するポリペプチドを
含む。
「標的配列」または「部位特異的標的配列」という用語は、部位特異的リコン
ビナーゼにより認識される合成または天然のヌクレオチド配列を意味する。この
ような配列の例には、Ｐ１ファージ由来のｌｏｘＰ（１１〜１３）またはサッカ
ロミセス・セレビッシェ（S．cerevisiae）由来のｆｒｔ（１４〜１６）がある
。
「リコンビナーゼ」または「部位特異的リコンビナーゼ」という用語は、特異
的標的配列に結合、を切断、を組換えする、合成、天然、または組換え酵素を意
味する。このような例は、Ｐ１ファージ由来のＣｒｅリコンビナーゼ（１３）ま
たはサッカロミセス・セレビッシェ（S．cerevisiae）由来のＦｌｐリコンビナ
ーゼ（１４）がある。
本発明は、好ましくは体細胞へ治療価値のある遺伝子を導入するために使用さ
れる、自己削除性ベクター（好ましくはレトロウイルス）に関する。
図５は、本発明の２つの好適な実施態様を示す。上のベクター−ｐｇｇＵ３ｐ
ｇｋｌｘｔｋｎｅｏ−において、マウスホスホグリセレートキナーゼ（ｐｇｋ）
プロモーター（１７）、ｌｏｘＰ標的配列（１１）、およびチミジンキナーゼ／
ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｔｋｎｅｏ）融合遺伝子からなる転写
単位を、エンハンサーのないＭｏＭｕＬＶレトロウイルスベクターの３’−Ｕ３
領域に挿入した。下のベクターでは、ＭＣＣｒｅ（ここで、Ｃｒｅ＝Ｃｒｅリコ
ンビナーゼ、ＭＣ＝ポリオーマラージＴエンハンサーに融合したＨＳＶチミジン
キナーゼプロモーター）をコードする追加の転写単位を、ウイルス本体のＬＴＲ
の間に挿入した。ウイルス複製とＬＴＲ介在複製は、ＭＣＣｒｅを他のウイルス
配列および非ウイルス配列とともにｌｏｘＰ部位の間に配置し、Ｃｒｅリコンビ
ナーゼが、ＬＴＲを含有するｐｇｋ−ｌｘ−ｔｋｎｅｏの１つのコピー以外の組
み込まれたプロウイルスのほとんどを削除することを可能にする。
図８は、本発明の２つの追加の好適な実施態様である。両方の作製体において
、ＭＣプロモーターはサルウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーターで置換され、
ｔｋｎｅｏ融合遺伝子はプロマイシン耐性遺伝子で置換された。上のベクター−
ｐｇｇＳＶＣｒｅＵ３ｌｘｐｇｋｐｕｒｏ−において、プロマイシン耐性遺伝子
は、ｐｇｋプロモーターにより制御される。下のベクター−ｐｇｇＳＶＣｒｅＵ
３ｌｘＳＶｐｕｒｏ−において、同じＵ３遺伝子はＳＶ４０プロモーターにより
制御される。これらの例において３’ＬＴＲ中のｌｏｘＰ部位は転写単位の上流
においた。
上記の好適な実施態様において転写単位と部位特異的リコンビナーゼ標的はＵ
３内にあるが、これは必須ではない。転写単位と標的配列の両方は、ベクターの
どの部分が削除されるかに依存して、Ｕ５領域またはベクターの他の部分にあっ
てもよい。
最後に、Ｃｒｅ組換えは、未変性のタンパク質としてまたはリコンビナーゼを
発現するプラスミドとしてトランスで提供されてもよい。例１
部位特異的組換え標的が隣接するプロウイルス配列が組み込み後に削除できる
かどうかを調べるために、我々はエンハンサーのないモロニーマウス白血病ウイ
ルスのＵ３領域内に、転写単位−ｐｇｋ−ｌｏｘＰ−ｔｋｎｅｏ−を挿入した（
図５）。プラスミド
ＣｒｅリコンビナーゼとｌｏｘＰの配列は、それぞれｐＭＣＣｒｅとＰＧＥＭ
３０から得た（１１）。マウスホスホグリセレート−キナーゼ−プロモーター（
ｐｇｋ）は、ｐｐｇｋＣａｔ（１８）から得て、ＳＶ４０／プロマイシン−アセ
チルトランスフェラーゼカセットはｐＢＡＢＥｐｕｒｏから得た（１９）。ｔｋ
ｎｅｏ遺伝子は、ＨＳＶチミジンキナーゼコード配列（２０）のＥｈｅＩ／Ｓｐ
ｅＩ ＰＣＲ増幅産物をネオマイシン−ホスホトランスフェラーゼコード配列（
２１）のＳｐｅＩ／ＮｈｅＩ増幅産物に結合させることにより得た。フレーム内
（in frame）融合は、チミジンキナーゼ停止コドンとＮｅｏ−ＡＵＧを削除する
ことにより行なった。ｐｇｋｌｘｔｋｎｅｏカセットは、ｐｇｇＵ３ｅｎ（−）
のユニークなＮｈｅＩ部位に平滑末端にしてクローン化してｐｇｇＵ３ｐｇｋｌ
ｘｔｋｎｅｏを得た。ｐｇｇＵ３ｅｎ（−）は、ｐｇｇＵ３Ｎｅｏｅｎ（−）（
２１）からｎｅｏを除去し、ウイルス配列をＳｓｔＩ断片としてｐＢＡＢＥｐｕ
ｒｏの骨格にサブクローニングして得た。ｐｇｋｌｘｔｋｎｅｏは、ｐＧＥＭ３
０のＰｓｔＩ／ＥｃｏＲＩ断片としてｌｏｘＰを、ｐｇｋＣＡＴのＸｂａＩ／Ｂ
ｇｌII断片としてｐｇｋを、そして平滑末端断片としてｔｋｎｅｏを、ｐＢｌｕ
ｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳポリリンカー（ストラタジーン(Stratagene)）の対応す
る部位に挿入することにより、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ中で組
み立てた。ｐｇｇＵ３ｐｇｋｌｘｔｋｎｅｏＭＣＣｒｅを得るために、ＭＣＣｒ
ｅのＰＣＲ増幅産物を、ｐｇｇＵ３ｐｇｋｌｘｔｋｎｅｏのユニークなＸｈｏＩ
部位にクローン化した。細胞とウイルス
ＮＩＨ３Ｔ３細胞とＢＯＳＣ２３細胞（２２）を、１０％胎児牛血清（ギブコ
（Gibco））補足ＤＭＥＭ（ギブコ（Gibco））培地中で増殖させた。ペア（Pear
）ら（２２）が記載したように、ＢＯＳＣ２３細胞の一過性トランスフェクショ
ンにより、ヘルパーウイルスのない組換えレトロウイルスを得た。１０5のＮＩ
Ｈ３Ｔ３細胞を、ろ過したウイルス上清とともに４μg/mlのポリブレン（アルド
リッチ（Aldrich））の存在下で２４時間インキュベートして感染させた。２μg
/mlのプロマイシン（シグマ（Sigma））または１mg/ml のＧ４１８（ギブコ（Gi
bco））を含有する培地中で７日間選択して、プロウイルスを発現するクローン
を単離した。サザンブロットハイブリダイゼーション
既に記載されている（２１）ように32Ｐ標識プローブを用いてＤＮＡハイブリ
ダイゼーションを行なった。サザンブロットをホスホイメージャー（PhosphoIma
ger）（モレキュラーダイナミクス（Molecular Dynamics））でスキャンし、イ
メージクオント（ImageQuantNT）ソフトウェア（モレキュラーダイナミクス（Mo
lecular Dynamics））で解析した。結果
以前の研究で、ＭｏＭｕＬＶのＵ３領域は比較的多量の外部配列（５kbまで、
（２３））を許容できることが証明された。これらをウイルス配列とともに複製
して、組み込まれたプロウイルス（（２４）に総説がある）が隣接する長い末端
反復配列（ＬＴＲ）を作成する。従って我々は、レトロウイルスベクターの３’
−Ｕ３領域への部位特異的組換え−ｌｏｘＰ−の標的配列の挿入後に、ＬＴＲ−
介在複製が、ウイルスゲノムを２つのｌｏｘＰ部位の間に配置し、こうしてこれ
がＣｒｅ−リコンビナーゼによる切断を受けやすくすることを予測した。
この予測を調べるために、マウスホスホグリセレートキナーゼ（ｐｇｋ）プロ
モーター（１７）、ｌｏｘＰ標的配列（１１）、およびチミジンキナーゼ／ネオ
マイシンホスホトランスフェラーゼ（ｔｋｎｅｏ）融合遺伝子から構成される転
写単位を、エンハンサーのないＭｏＭｕＬＶレトロウイルスベクターの３’−Ｕ
３領域（ｐｇｇＵ３ｅｎ（−）、（２１））に挿入して、ｐｇｇＵ３ｐｇｋｌｘ
ｔｋｎｅｏ−（図５）を得た。このプラスミドをＢＯＳＣ２３ヘルパー細胞（２
２）にトランスフェクションして組換えウイルスを得て、これをＮＩＨ３Ｔ３細
胞を感染するのに使用した。ＬＴＲ介在複製は、感染細胞中でｐｇｋｌｘｔｋｎ
ｅｏが隣接したプロウイルスを生成するはずである（図６）。これを試験するた
めに、Ｇ４１８中で選択後に、得られる１２のネオマイシン耐性クローンをサザ
ンブロットで解析した。ＬＴＲを切断する制限エンドヌクレアーゼを使用して、
各場合にＬＴＲ介在複製を確認した（データは示していない）。Ｃｒｅリコンビ
ナーゼがｌｏｘＰに隣接された配列を削除して５’ｐｇｋプロモーターを３’ｔ
ｋｎｅｏ遺伝子（図６）に融合させるかどうかを調べるために、Ｕ３ｐｇｋｌｘ
ｔｋｎｅｏを発現する２つの細胞株を、それぞれＣｒｅリコンビナーゼとプロマ
イシン耐性をコードする発現プラスミドＭＣＣｒｅ（１１）とｐＢＡＢＥｐｕｒ
ｏ（１９）で同時トランスフェクションした。プロマイシンで選択して得られた
細胞プールから抽出したゲノムＤＮＡを、ＨｉｎｄIII （ＬＴＲを切断するエン
ドヌクレアーゼ）で消化した（図６）。ｎｅｏ−プローブにハイブリダイズした
時、非組換えプロウイルスは、ｌｏｘＰが隣接する配列を収容できる４．７kbの
一定のバンドを生成する（図６、レーン７〜１２）。このバンドは、Ｃｒｅを発
現するクローン中では非常に弱いかまたは完全に消滅（図６、レーン８、９、１
１、１２）し、大部分のプロウイルスが組換えを受けていることを示した。すな
わちＵ３に挿入したｌｏｘＰ部位は、Ｃｒｅリコンビナーゼが１つのＬＴＲ以外
の大部分のプロウイルスを切り出すことを可能にする。大部分のプロウイルスＤ
ＮＡの削除後に染色体内に残るプロウイルスＤＮＡの部分は、染色体挿入部位の
配列解析と、外来遺伝子を導入するために使用されるベクターと配列比較するこ
とにより、容易に試験できる。例２
哺乳動物細胞への自己削除のために必要なすべての成分を有するベクターを開
発するために、我々は、Ｕ３に挿入されたｌｏｘＰ部位は、Ｃｒｅが同じプロウ
イルスから発現される時、組換えを受けるかどうかを調べた。ＭＣプロモーター
により制御されるＣｒｅのコード配列をＬＴＲの間でｐｇｇＵ３ｐｇｋｌｘｔｋ
ｎｅｏに挿入してｐｇｇＵ３ｐｇｋｌｘｔｋｎｅｏＭＣＣｒｅを得た。感染性ウ
イルスを得るために、ｐｇｇＵ３ｐｇｋｌｘｔｋｎｅｏＭＣＣｒｅを例１に記載
のようにＢＯＳＣ２３細胞にトランスフェクションした。ＮＩＨ３Ｔ３細胞を感
染してＧ４１８中で選択した後得られたネオマイシン耐性クローンを、例１に記
載のようにサザンブロットで解析した。このベクターから得られたプロウイルス
は、組み込み後に自身を切断することが予測された。Ｕ３ｐｇｋｌｘｔｋｎｅｏ
とＵ３ｐｇｋｌｘｔｋｎｅｏＭＣＣｒｅを発現するいくつかの独立のクローンか
らのゲノムＤＮＡをＨｉｎｄIII （ｔｋｎｅｏの下流の両方のプロウイルスを切
断する制限エンドヌクレアーゼ）で消化した。ｎｅｏにハイブリダイズした時、
非組換えプロウイルスは、ｌｏｘＰが隣接するすべての配列を保持し、その結果
、それぞれ４．７kbと６kbの一定のバンドを生成する。このバンドはＣｒｅ発現
クローンにもまだ存在するが、これは非発現クローン中より５〜１０倍弱かった
（図７、Ｂ−レーン）。両方のタイプのクローンは匹敵する数のプロウイルスを
含有したため、結果は、かなりの数のＵ３ｐｇｋｌｘｔｋｎｅｏＭＣＣｒｅプロ
ウイルスが、ｌｏｘＰに隣接される配列を削除したことを示す。例３
Ｃｒｅを発現するプロウイルスの自己削除の効率を改良するために、追加のプ
ロモーターと選択性マーカー遺伝子を使用して２つの追加の作製体を作成した。プラスミド
ＭＣＣｒｅのＣｒｅ領域、ｐＢＡＢＥｐｕｒｏのＳＶ４０プロモーター、およ
び下流のＨｉｎｄIII 部位を含有するｐＧＥＭ３０のｌｏｘＰ断片を、平滑末端
断片としてｐＧｇＵ３ｅｎ（−）のそれぞれＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩおよびＮｈｅ
Ｉ部位に順番に挿入した。平滑末端ｐｇｋ−ｐｕｒｏ−またはＳＶ４０−ｐｕｒ
ｏ発現カセットをｌｏｘＰのＨｉｎｄIII 部位に連結して、ｐｇｇＳＶＣｒｅＵ
３ｌｘｐｇｋｐｕｒｏとｐｇｇＳＶＣｒｅＵ３ｌｘＳＶｐｕｒｏを得た。細胞とウイルス
例１と２に記載のものと同じ。ＤＮＡハイブリダイゼーションとＰＣＲ
既に記載されている（２１）ように32Ｐ標識プローブを用いてＤＮＡハイブリ
ダイゼーションを行なった。サザンブロットをホスホイメージャー（PhosphoIma
ger）（モレキュラーダイナミクス（Molecular Dynamics））でスキャンし、イ
メージクオント（ImageQuantNT）ソフトウェア（モレキュラーダイナミクス（Mo
lecular Dynamics））で解析した。ＰＣＲ測定法のために、１５０ngのゲノムＤ
ＮＡを、Ｃｒｅ特異的プライマー５’−ＴＴＡＧＣＴＡＧＣＡＴＧＣＣＣＡＡＧ
ＡＡＧＡＡＧＡＡＧ−３’と５’−ＧＧＡＧＣＴＡＧＣＣＴＡＡＴＣＧＣＣＡＴ
ＣＴＴＣＣＡＧ−３’を使用して４０サイクル（９４℃３０秒、６０℃１分、７
２℃１分）増幅した。対照ＰＣＲは、既に記載されているように（２５）アクチ
ンプライマーを使用する以外は同じ条件下で行なった。結果
ベクター−ｐｇｇＳＶＣｒｅＵ３ｌｘｐｇｋｐｕｒｏ−と−ｐｇｇＳＶＣｒｅ
Ｕ３ｌｘＳＶｐｕｒｏ−（図８）をＢＯＳＣ２３細胞にトランスフェクションし
て感染性ウイルスを得た。回収したウイルスをＮＩＨ３Ｔ３細胞の感染のために
使用し、選択７日後にプロマイシン耐性クローンを単離した。
いずれかの作製体で得たプロマイシン耐性クローンのゲノムＤＮＡをサザンブ
ロットで解析した。Ｕ３ｌｘｐｇｋｐｕｒｏＳＶＣｒｅプロウイルスの組換えを
同定するために、ＤＮＡをＥｃｏＲＩ（両方のプロウイルスを各プロモーターの
前で切断するエンドヌクレアーゼ）で消化した（図９Ａ、１０Ａ）。ｐｇｋにハ
イブリダイズした時、非組換えプロウイルスは、ｌｏｘＰが隣接するすべての配
列を保持し、その結果３．１kbの一定のバンドを生成する（図９Ｂ、レーン５、
９、１２〜１４）。このバンドはＣｒｅ発現クローンから消えるはずである（図
９Ａ）。従ってこのバンドは、１４個のＵ３ｌｘｐｇｋｐｕｒｏＳＶＣｒｅ発現
クローンのうち９個から消失し、大部分のプロウイルスは組換えされていること
を示した（図９Ｂ、レーン１〜４、６〜８、１０）。種々のサイズの追加のバン
ドは、３’ＬＴＲのＥｃｏＲＩ部位から隣接する細胞性ＤＮＡの部位に伸長して
いる断片である（図９Ｂ）。しかし、サザンブロットで組換えられて現れたクロ
ーンを含むすべてのクローンは、ＰＣＲにより解析するとＣｒｅ特異的増幅産物
を生成した（図９Ｃ）。組換えられたクローンは１０〜５０倍少ない増幅産物を
生成した（図９Ｃ）が、結果は、リコンビナーゼは組換えに必要な閾値レベルを
均一に達成するのではないことを示唆する。
有意に高い組換え効率が、Ｕ３ｌｘｐｇｋｐｕｒｏＳＶＣｒｅにより得られた
。図１０Ｂに示すように、いずれのクローンもＳＶ４０にハイブリダイズした時
３kbの制限断片を生成せず、プロウイルス削除に一致する可変バンドのみが見ら
れた。組換えを確認するために、プロマイシンの上流で切断するＨｉｎｄIII で
ＤＮＡを消化した（図１０Ａ）。予想されたように、ＳＶ４０またはプロマイシ
ンプローブにハイブリダイズさせた時、可変サイズのバンドのみが見られた。さ
らにハイブリダイゼーションパターンはユニークであり、３’ＬＴＲのＨｉｎｄ
III 部位からそれぞれ５’および３’隣接細胞性ＤＮＡ中の部位に伸長している
断片を反映していた（図１０Ｂ、データは示していない）。ＰＣＲで解析した時
、１２クローンのうち３つのみが弱いＣｒｅ特異的増幅産物を生成した（図１０
Ｃ）。
本発明のベクター系は、従来の担体および／または希釈剤を含有する薬剤組成
物の調製に使用することができる。治療すべき疾患に依存して、このベクター系
は、疾患の治療に有用な遺伝子を追加の転写単位中に含有する。
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【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項
【提出日】１９９７年３月１８日
【補正内容】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図９】
【図９】
【図１０】
【図１０】
【図１０】
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フロントページの続き
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ
Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ
，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，
ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，Ｕ
Ｇ)，ＵＡ(ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ
，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ
，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，
ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ
Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ
，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，
ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ
Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ
，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ
(71)出願人 グレツ，マヌエル
ドイツ連邦共和国デイ−60596 フランク
フルト アム マイン，パウル−エールリ
ッヒ−シュトラーセ 42
(72)発明者 フオン メルフネル，ハラルド
ドイツ連邦共和国デイ−60590 フランク
フルト アム マイン，テオドル−シュテ
ルン カイ ７，ウニフェルジッタツクリ
ニクム フランクフルト アプト．ハマト
ロギー
(72)発明者 ルス，アンドレアス，ペテル
ドイツ連邦共和国ディ−60590 フランク
フルト アム マイン，テオドル−シュテ
ルン カイ ７，ウニフェルジッタツクリ
ニクム フランクフルト アプト．ハマト
ロギー
(72)発明者 グレツ，マヌエル
ドイツ連邦共和国デイ−60596 フランク
フルト アム マイン，パウル−エールリ
ッヒ−シュトラーセ 42