JPH11511325A

JPH11511325A - 高力クモシルク蛋白質のクローニング方法

Info

Publication number: JPH11511325A
Application number: JP9510520A
Authority: JP
Inventors: バーゼル，リチヤード・エム; エリオン，グレン・アール
Original assignee: アグリコラ・テクノロジーズ・インコーポレイテツド
Priority date: 1995-08-22
Filing date: 1996-08-22
Publication date: 1999-10-05
Also published as: IL123398A0; BR9612625A; WO1997008315A1; EP0848754A1; AU7152996A; CN1200145A

Abstract

(57)【要約】本発明は、絹生産クモからの絹タンパク質をコードするＤＮＡフラグメントの生産方法に関する。本発明は、クモ絹タンパク質をコードするＤＮＡ配列にも関する。本発明は更に、上記ＤＮＡ配列を用いるクモ絹タンパク質の生産方法に関する。本発明のタンパク質のクローニング方法及び生産方法は、全ての絹生産クモに適用できる。これらの方法で開発されたクローンは市販できる量の高分子量絹タンパク質を生産する。このようなタンパク質から作出された絹は優れた強度を有するので、本発明のクローン化絹タンパク質は顕著な産業上の重要性を有する。

Description

【発明の詳細な説明】高力クモシルク蛋白質のクローニング方法発明の分野この発明は、クモシルク蛋白質に関してコード化するＤＮＡ断片の新規生産方法に関する。本発明はまた、クモシルク蛋白質をコード化するＤＮＡ配列にも関する。この発明はさらに、前記ＤＮＡ配列を用いるクモシルク蛋白質の新規生産方法にも関する。本発明はまた、これらのクモシルク蛋白質の精製方法、及びこれらの蛋白質からの繊維及びフィルムの製造方法にも関する。本発明の方法によって開発されたクローンは、分子量が９０，０００〜２５０，０００以上の高分子クモシルク蛋白質を大腸菌、商業的に有用な量で生産する。この分子量は、Ｎｅｐｈｉｌａｃｌａｖｉｐｅｓから得られた自然の主要アンプレート（ａｍｐｕｌａｔｅ）（ドラッグライン）（ｄｒａｇｌｉｎｅ）のクモシルク蛋白質の分子量の４０％〜１００％を超える。これらの高分子蛋白質から出来ているシルク糸は、優れた物理的性質、例えば高張力及びかなり大きな弾性を有しているので、本発明のクローン化シルク蛋白質は工業的には重要性がかなり高い。これらのクモシルク蛋白質は、本発明のいくつかの方法によってクローン化され、自然配列のクモシルククローンは、大腸菌発現系において生産された。従ってこれらの発現系は、様々な部分的長さのクモシルク蛋白質及び完全な長さの自然クモシルク蛋白質を生産するために用いられている。これらは細胞質量１リットルあたり２グラムを超えるレベルで発現させられたものである。ついでこれらのクモシルク蛋白質は精製され、多くの目的、例えば繊維紡績、フィルム成形、及びフィラメントのウイービングから生じるその他の用途に用いられる。発明の背景様々な多くの動物目（例えば昆虫、蜘形類、及びダニ）によるシルクの生産はよく知られている。例えばクモは、高張力を有する自然のクモの巣とドラッグラインを生産する。同様にカイコは、シルクを高い生産率で生産するが、そのシルク蛋白質は、物理的性質においてクモシルク蛋白質より劣ると考えられている。例えばカイコ蛋白質は、張力がクモシルク蛋白質よりかなり低い。オーブ・ウイーバー（ｏｒｂｗｅａｖｅｒ）及びその他のクモ類は、シルクフィラメントを少量しか（商品化するには経済的でない量）自然には生産しないが、強いフィラよりも数倍強い（３×１０⁴Ｊｋｇ^-1に対して９．５×１０⁴Ｊｋｇ^-1）。これらの優れた強度特性によって、クモシルク蛋白質フィラメントは、パラシュート、帆、ボディ用防具、及び強いフィラメントが必要なその他の高強度の用途に対して好ましい製品となっている。さらにはこれらのクモフィラメントは、多くの重金属及び生物兵器をも含む有機物に対して、吸収性フィルムとしての用途にも用いることができる。これらはまた、選択的にＤＮＡを結合する吸収体、及びその他の多くの化学薬品、香味料及び香料の吸収体としても用いることができる。クモシルクは養殖クモから生産できるという仮説があるが、いくつかの理由でこのことは実際的ではない。第一に、クモは育てるのが非常に難しいことに加えて、非常に密度の高いところで成長する場合、クモは近くに居るものを食べる習性がある。第二に、クモは非常に少量のシルク蛋白質しか生産しない。このためミリグラムの量の生産でさえ、極端に高価なものになる。このような制限があるので、クモシルク蛋白質の商業的な量での許容しうる唯一の生産方法は、クモの遺伝子を許容しうる大規模生産ベクターにクローン化することである。本発明はこの目的を達成する。合成シルク蛋白質遺伝子は、以前には、短い塩基対セグメントを作り、ついで多数の反復単位を用いて生産されていた。中程度の分子量（２０，０００〜８０，０００）の蛋白質はこのような方法で得られていた。多様な物理的性質を得るために、この方法は変更され、種々の配列を有する合成蛋白質が生産された。例えば先行技術の研究者らは、自然界に生じるシルク蛋白質の短い長さのものを選び、配列を変えて得られた配列を用いていた。しかしながらこれらの先行技術の方法は、自然のシルクより劣る材料を生じる結果になった。さらにはこの先行技術はまた、商業用に用いる場合に必要な長期使用には不安定なクローンを生じる場合もあった。従って本発明の目的の１つは、重合された短いＤＮＡ配列の場合に生じる前記問題を解決することである。このことは、高力な高分子シルク蛋白質に関してコード化する長いＤＮＡの生産によって、本発明を利用して達成される。高力の主要アンプレート（ドラッグライン）のクモシルクが高い可能性を有するので、例えばＮｅｐｈｉｌａｃｌａｖｉｐｅｓのようなオーブ・ウイーバーのシルクに対して、これの強度の分子的根拠を理解しようとする研究が行なわれた。研究者達はまた、クモシルク繊維の高い強度の原因となる反復要素を組込むことによって、自然の蛋白質をクローン化するか、あるいは合成シルク遺伝子を作る試みを行なったが限定的な成功しか得られなかった。しかしながらシルク蛋白質のクローニングに関連した問題は多い。第一に、自然の蛋白質アミノ酸配列は、多数の反復サブ単位から構成されている。従ってこの配列は、自然の遺伝子をクローン化するために用いることができる多くのユニーク部位を有していない。文献には、Ｎｅｐｈｉｌａｃｌａｖｉｐｅｓからのドラッグラインのクモシルク蛋白質のカルボキシ末端は、ユニークであることが証明されている唯一の区域であると指摘されている。このことから、自然遺伝子をクローン化する先行技術の試みはわずかで、その結果、合成蛋白質を生産する先行技術の試みははるかに多いものになった。それにもかかわらず、安定クローンの生産及びその結果生じる合成クモシルク蛋白質は問題が多いが、これは摸倣されるＤＮＡ配列の反復性のためである。例えば多量の反復（特にＧＣＡ反復）を有するＤＮＡは、転写エラーにより、また組換え欠失の確率が高いために不安定であり、その結果として常に変化するＤＮＡが生じる。これらの問題のために、多くのクローンの完全性については疑問があった。本質的にシルク遺伝子はまったく安定である。これは反復部及び非反復部が混在しているからである。残念ながら合成遺伝子は、このような構成には向いていない。その理由は、これらの合成遺伝子が組換え、特に組換え欠失に対して非常に不安定だからである。安定クローンを得ることができないのは、不十分な量の遺伝子がクローン化され、従ってその自然の安定性の基礎を作りうる非反復部が得られなかったからである。従って、非反復部及び反復部を有する安定クローンを得ることが、本発明の目的の１つである。ドラッグラインのクモシルクのクローン化についてのもう１つの問題は、遺伝子の大きさである。クモシルク蛋白質は一般に、２００，０００ｋＤａ又はこれよりも大きく、対応する遺伝子はまた、少なくとも１つのイントロンを有している。従ってＤＮＡ断片のサイズを、５〜１０Ｋｂ＋イントロンの範囲内にするように計画される。現在の技術では、この規模の遺伝子はクローン化がいまだに難しい。本発明はこの問題を克服した。これらの機械的強度特性のために、クモシルク蛋白質のクローニングに多くの関心が向けられてきた。Ｎｅｐｈｉｌａｃｌａｖｉｐｅｓドラッグラインシルクの理解に関しては、スー（Ｘｕ）らによって、主要な進歩がなされた（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：７１２０、１９９０年）。スーらは、部分的クローンからのクモドラッグラインシルクの反復配列の一部を突きとめた。この反復単位は３４までのアミノ酸に関してコード化したが、これは正確には保持されなかった。その理由は、この配列がその反復のいくつかにおいて欠失及び変化を有していたからである。それにもかかわらず、スーらは配列内に２つの重要な区域を発見した。すなわちクモシルクにその特性のいくつかを与える反復部と、非反復（カルボキシ）部である。ヒンマン（Ｈｉｎｍａｎ）及びルイス（Ｌｅｗｉｓ）（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１９３２０、１９９２年）は、第二クモ蛋白質から来るものと推定される第二ｃＤＮＡクローンについて報告した。この配列は、スーらによって発見されたのと同様な反復部と、カルボキシターミナル非反復末端を有していた。ヒンマン及びルイスの反復単位はより長く、５１アミノ酸に関してコード化するものであり、高度に可変であった。１９９１年１０月２３日に公告されたルイスらの欧州特許出願ＥＰ０４５２９２５Ａ２によるクモシルク蛋白質の発現において、小さい蛋白質断片のみが少ない収率で生産されたようである。これらの小さい蛋白質断片はおそらく商品としての価値はない。その理由は、良好な機械的性質は、これより大きな蛋白質、特に完全な長さに近いものから生じるからである。１９９１年１０月３１日に公告されたロンバルディ（Ｌｏｍｂａｒｄｉ）らの国際特許出願ＷＯ９１／１６３５１号はまた、組換えクモシルク蛋白質を非常に低い収率で生産したが、これらのクローンは分子量が小さいために機械的強度が低いようであった。同様にこれまでに開発されたクモシルククローンは、自然の遺伝子の忠実なコピーではないことが理論付けられている。これはいくつかの研究によって確認されている。例えばベックウイズ（Ｂｅｃｋｗｉｔｈ）及びアーシジアコノ（Ａｒｃｉｄｉａｃｏｎｏ）（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９（９）：６６６１、１９９４年）は、両方のクモ蛋白質が高度な相同性を有し、実際に同じ蛋白質を表わしているかもしれないことを示している。自然の発現系がシルク変異体として役に立つことを多くの研究者が認めてはいるが、コドンプレフェンスに基づく発現の問題を解決することはできなかった。高度に保持された反復性反復部を用いると、改良された蛋白質を生産することができると考えられるが、これらの合成遺伝子発現系は、ＤＮＡの安定性の問題、低発現率、及び自然のクモシルクより望ましくない特性を有する蛋白質の生産という問題を抱えている。従ってこれらの問題を解決することが本発明の目的である。１９８８年５月１９日に公告されたフェラーリ（Ｆｅｒｒａｒｉ）らの国際特許出願ＷＯ８８／０３５３３号は、シルク様特性を有する蛋白質を生じる合成遺伝子を開示している。さらに、１９９０年５月１７日に公告されたカペッロ（Ｃａｐｐｅｌｌｏ）らの国際特許出願ＷＯ９０／０５１７７号によって、自然繊維蛋白質を模倣する若干の小さい反復蛋白質が開発された。１９９４年１２月２２日に公告されたフロイド（Ｆｌｏｙｄ）らの国際特許出願ＷＯ９４／２９４５０号でも、スーらによって開発されたいくつかの自然の反復単位を用いるクモシルク合成遺伝子を開発することが試みられた。しかしながらこれらのクローンのすべては分子量が小さく、従って自然のクモシルクに望まれる特性を備えることが妨げられている。本発明は、部分的長さ及び完全な長さのクモシルク蛋白質クローンの新規合成に関する。これらの部分的長さのクローンはまた、自然のクモシルクの分子量までの、又はこれを超える分子量を有する他のクローンに多量体化された（ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｚｅｄ）ものもある。本発明により、全範囲にわたる特性を有する自然のシルク様クローンを開発することができるようになった。分子生物学における当業者は、その他の役に立つシルク特性、例えば強度、降伏点、粘着性、及び可塑性などを有するクローンを作るための出発点として、これらのクローンを用いることができる。さらには、これらの新規配列はその他の合成遺伝子を設計するための出発点として用いることもできる。色又は色素をそのシルク蛋白質に組込んでいるクモのいくつかに関しては、これらの方法はまた、天然色蛋白質をも許容しうる。本発明はまた、培地において移入された宿主の独創的な化学的発酵方法にも関する。細菌発酵によってシルク蛋白質を生産することに関する主な問題の１つは、プロテアーゼによる蛋白質の部分的消化である。実際、プロテアーゼによる蛋白質分解率が、高分子シルク蛋白質発現率を上回る場合もあり、このことによって商品化は不可能になる。本発明はこの潜在的問題を克服する。本発明のこれらの目的及びその他の目的及び利点は、次の明細書によって示される。図面の簡単な説明図１は、クモシルク蛋白質をコードする２ＫｂＤＮＡ配列を示している。発明の概要この発明は、シルク蛋白質に関してコードするＤＮＡ断片の生産方法であって、（ｉ）シルクを生産するクモから取られた標的ＤＮＡを選択する工程であって、この標的ＤＮＡが複数の反復部及び非反復部を備える工程；（ｉｉ）標的ＤＮＡの一部位を相補するＤＮＡ配列を有する少なくとも１０個のヌクレオチドの一本鎖ＤＮＡプライマーを選択する工程；及び（ｉｉｉ）ＤＮＡプライマーと融解標的ＤＮＡとを反復的に組合わせ、この組合わせＤＮＡプライマー及び標的ＤＮＡを、ヌクレオチド及びＤＮＡ断片を生産する校正能力を有するＤＮＡポリメラーゼでインキュベーションする工程であって、ここにおいてＤＮＡ断片は前記標的ＤＮＡを相補するものであり、少なくとも２Ｋｂである工程、を含む方法に関する。より特別な実施態様においては、少なくとも５ＫｂのＤＮＡ断片が生産できる。シルク蛋白質をコードするＤＮＡ断片の前記生産方法のもう１つの実施態様において、この方法は、１つではなく２つの異なるＤＮＡプライマーを用いる工程を含んでいる。一本鎖ＤＮＡプライマー又は２つの異なるＤＮＡプライマーを用いるＤＮＡ断片の生産方法のさらにもう１つの実施態様において、標的ＤＮＡは、クモシルクに関してコードする完全な長さのｍＲＮＡの逆転写によって作られたｃＤＮＡであり、この方法はさらに次の工程を含んでいる。すなわち（ｉ）これから作られた第一鎖ｃＤＮＡのアミノターミナル末端へプライマー部位を加える工程、及び（ｉｉ）第一ポリメラーゼプライミング部としてｃＤＮＡのポリＴ部を用いる工程である。ＤＮＡ断片のこれらの生産方法のさらにもう１つの実施態様において、第二プライマー部位は、ライゲーションカセットを用いて、ＤＮＡの未知末端において作られる。さらにもう１つの実施態様において、第二プライマー部位は、ターミナルトランスフェラーゼを用いて、ＤＮＡの未知末端において作られ、ポリｄＴ、ポリｄＡ、ポリｄＧ、及びポリｄＣから成る群から選ばれるプライマー部位が作られる。ＤＮＡ断片の前記生産方法のためのＤＮＡプライマーは、下記開始配列及び終了配列（ｉ）〜（ｘｘ）によって表わされるＤＮＡから選ぶことができる：ここにおいて、Ｎ＝Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃ；Ｖ＝Ｇ、Ａ、Ｃ；Ｂ＝Ｇ、Ｔ、Ｃ；Ｈ＝Ａ、Ｔ、Ｃ；Ｄ＝Ｇ、Ａ、Ｔ；Ｋ＝Ｇ、Ｔ；Ｓ＝Ｇ、Ｃ；Ｗ＝Ａ、Ｔ；Ｍ＝Ａ、Ｃ；Ｙ＝Ｃ、Ｔ；及びＲ＝Ａ、Ｇである。ＤＮＡ断片の生産方法のさらにもう１つの実施態様において、標的ＤＮＡは、ＤＮＡプローブへのハイブリダイゼーションにより選択される。これは前記配列（ｉ）〜（ｘｘ）の少なくとも１つを有するものである。すなわち、これは支持体に可逆的に結合されて、シルクコード化ＤＮＡ断片を富化する。シルク蛋白質をコード化するＤＮＡ断片のもう１つの生産方法の実施態様は、多量体化方法と呼ばれるものであるが、この実施態様において、この方法は、（ｉ）シルクを生産するクモから取られた、シルク蛋白質をコード化する標的ＤＮＡを選択する工程であって、この標的ＤＮＡが複数の反復部及び非反復部を備える工程；（ｉｉ）種々のＤＮＡプライマーの第一対を選択する工程であって、ＤＮＡプライマーの第一対はどちらも標的ＤＮＡの一部位を相補するものであり、ＤＮＡプライマーの第一対の少なくとも１つが配列（ｉ）〜（ｘｘｖｉ）によって表わされる工程；（ｉｉｉ）ＤＮＡプライマーの第一対と、融解標的ＤＮＡとを反復的に組合わせ、かつこの組合わせＤＮＡプライマー及び標的ＤＮＡを、ヌクレオチド及び第一ＤＮＡ断片を生産する校正能力を有するＤＮＡポリメラーゼでインキュベーションすることによって第一ＤＮＡ断片を生産する工程であって、この第一ＤＮＡ断片が、標的ＤＮＡを相補するものであり、少なくとも２Ｋｂである工程、を含んでいる。この多量体化工程はさらに、（ｉｖ）種々のＤＮＡプライマーの第二対を選択する工程であって、ＤＮＡプライマーの第二対の少なくとも１つが、ＤＮＡプライマーの第一対の配列のどちらとも異なり、ＤＮＡプライマーの第二対の少なくとも１つは、配列（ｉ）〜（ｘｘｖｉ）によって表わされる工程；（ｖ）ＤＮＡプライマーの第二対と、融解標的ＤＮＡとを反復的に組合わせ、かつこの組合わせＤＮＡプライマー及び標的ＤＮＡを、ヌクレオチド及び第二ＤＮＡ断片を生産する校正能力を有するＤＮＡポリメラーゼでインキュベーションすることによって第二ＤＮＡ断片を生産する工程であって、この第二ＤＮＡ断片が第一ＤＮＡ断片とは異なり、これも標的ＤＮＡを相補するものであり、この第二ＤＮＡ断片が少なくとも２Ｋｂである工程；（ｖｉ）第一ＤＮＡ断片及び第二ＤＮＡ断片を制限切断する工程；及び（ｖｉｉ）第一ＤＮＡ断片及び第二ＤＮＡ断片の制限部分を、多量体化ＤＮＡに組換える工程であって、この多量体化ＤＮＡがクモシルク蛋白質をコード化するものであり、これの長さが少なくとも４Ｋｂである工程を含んでいる。前記多量体化方法のさらに特別な実施態様において、ＤＮＡプライマーはすべて、配列（ｉ）〜（ｘｘｖｉ）によって表わされる。もう１つの特別な多量体化方法の実施態様において、すべてのＤＮＡプライマーは異なっている。さらにより特別な多量体化方法の実施態様において、多量体化ＤＮＡは、長さが少なくとも６Ｋｂ又は８Ｋｂである。ＤＮＡ配列の実施態様において、この発明はクモシルク蛋白質をコード化するＤＮＡ配列に関している。ここにおいてＤＮＡ配列は複数の反復部及び非反復部を備えており、長さが少なくとも２Ｋｂである。より特別な実施態様において、ＤＮＡ配列は長さが少なくとも５Ｋｂである。本発明のさらに特別なＤＮＡ配列の実施態様において、ＤＮＡは図１に示されている配列を備えている。シルク蛋白質生産方法の実施態様において、この発明は、（ｉ）ＤＮＡを選択する工程；（ｉｉ）ＤＮＡを発現ベクターへ挿入する工程；（ｉｉｉ）宿主細胞を発現ベクターで移入する工程；（ｉｖ）移入された宿主を培地で発酵させてシルク蛋白質を生産する工程；及び（ｖ）シルク蛋白質を回収する工程を含んでいる。より特別なシルク蛋白質生産方法の実施態様において、移入された宿主を発酵させるための培地は、プロテアーゼ抑制剤を含んでいる。さらにもう１つのシルク蛋白質生産方法の実施態様において、この方法は、（ｉ）宿主細胞を破壊するために超音波エネルギーを加える工程；（ｉｉ）シルク蛋白質を再懸濁させるために超音波エネルギーを加える工程；及び（ｉｉｉ）破壊された宿主細胞を遠心分離して、細胞膜をシルク蛋白質から分離する工程を含んでいる。これらのシルク蛋白質生産方法において、シルク蛋白質の精製は、限外濾過又はアルコール沈殿によって実施される。シルク蛋白質の紡績方法の実施態様において、本発明は、（ｉ）限外濾過又はアルコール沈殿によって精製されたシルク蛋白質の濃縮工程；（ｉｉ）濃縮シルク蛋白質の繊維を引き出す工程；（ｉｉｉ）シルク繊維を紡績してシルク糸を製造する工程；及び（ｉｖ）シルク糸を洗浄してあらゆる可溶化試薬を除去する工程、を含む方法に関する。可溶化試薬は、ヘキサフルオロイソプロパノール、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、尿素、燐酸ウレア、リチウム塩、有機溶媒、塩酸グアニジン、硫酸アンモニウム、酢酸、燐酸、ジクロロ酢酸、蟻酸、及び硫酸から成る群から選ばれる。さらに特別なシルク紡績方法において、この方法はさらに、シルク繊維又はシルク糸を酸化錫又は酸化チタンで被覆する工程をも含んでいる。織物の実施態様において、本発明は、本発明の方法のいずれかに従って製造されたクモシルク糸を含む織物に関している。さらにもう１つの織物の実施態様において、この織物は、合わされ、本発明の方法のどれかに従って製造されたクモシルク糸を含んでいる。この蛋白質は、コーティングとして用いることができ、押出して繊維にすることもでき、あるいはまたポリマーフィルムにすることもできる。発明の詳細な説明シルクを生産するクモのＤＮＡ源本発明の方法は、Ｎｅｐｈｉｌａｃｌａｖｉｐｅｓの主要アンプレート（ドラッグライン）のクモシルクをクローン化するために特に開発されたものであるが、シルク蛋白質のクローニング方法及び生産方法は、シルクを生産するすべてのクモに適用することができる。クモはグループとしては８種類までの絹糸腺を有していることがある。絹糸腺の８本全部を有するクモ種はないが、すべてのクモは少なくとも３つの絹糸腺を有しており、大部分は５本有している。各腺は種々の特性を有する種々の型のシルクを生産する。例えば非常に早く乾燥するシルクもあれば、粘着性のままのシルクもある。クモは、Ａｒｔｈｒｏｐｏｄａ（節足動物）門、Ａｒａｃｈｎｉｄａ（蛛形）類、Ａｒａｎｅａｅ（真正クモ）目に属している。本当のクモは、Ｌａｂｉｄｏｇｎａｔｈａ亜目に属している。その他のクモの種類には、ｃｏｍｂｆｏｏｔｅｄ、ｃｒａｂ、ｆｉｓｈｅｒ、ｆｕｎｎｅｌｗｅｂ、（ｈａｃｋｌｅｄ−ｂａｎｄ、オーブ・ウイーバー、ｊｕｍｐｉｎｇ、及びｏｇｒｅｆａｃｅｄｓｔｉｃｋなどがある。本発明によれば、次の属群のあらゆるクモを用いることができる。すなわち、Ｍｉｃｒａｔｈｅｎａ、Ｍａｓｔｏｐｈｏｒａ、Ｍｅｔｅｐｅｉｒａ、Ａｒａｎｅｕｓ、Ａｒｇｉｏｐｅ、Ｎｅｐｈｉｌａ、又はＧａｓｔｅｒａｃａｎｔｈａである。オーブ・ウイーバーは、最も優良なクモグループの１つである。その理由は、これらは顕著な強度と柔軟性のあるシルクを放出するからである。オーブ・ウイーバーは、Ａｒｇｉｏｐｉｄａｅとして知られており、これには頭が矢印形のクモ（ａｒｒｏｗｈｅａｄｅｄｓｈａｐｅｄ）であるＭｉｃｒａｔｈｅｎａｓａｇｉｔｔａｔａ、ｂｏｌａｓのＭａｓｔｏｐｈｏｒａｃｏｒｎｉｇｅｒａ、ｌａｂｙｒｉｎｔｈのＭｅｔｅｐｅｉｒａｌａｂｙｒｉｎｔｈｅａ、ｍａｒｂｌｅｄのＡｒａｎｅｕｓｍａｒｍｏｒｅｕｓ、ｂｌａｃｋ−ａｎｄ−ｙｅｌｌｏｗｇａｒｄｅｎのＡｒｇｉｏｐｅｂｒｕｅｎｎｉｃｈｉ、ｇｏｌｄｅｎｓｉｌｋのＮｅｐｈｉｌａｃｌａｖｉｐｅｓ、及びｓｐｉｎｙｂｏｄｉｅｄのＧａｓｔｅｒａｃａｎｔｈａｃａｎｃｒｉｆｏｒｍｉｓがある。Ｎｅｐｈｉｌａｃｌａｖｉｐｅｓは、これのシルク糸が強く、絹糸腺が大きくて切開しやすいので、遺伝子研究においては最も研究がなされている。その他のオーブ・ウイーバーも強いシルク糸を生産する。すべてのクモがシルクを生産するが、シルク糸を形成する蛋白質は、その分子構成においてかなり様々であり、多様な目的に役立っている。例えばＡｎｔｒｏｄｉａｔｕｓクモは、ただ２つの蛋白質を含む単一の種類のシルクを紡ぐ。これに対して、Ａｒａｎｅｏｉｄｅａ科のクモはウエブ・スピナーと呼ばれるものであるが、これは８種類までの様々なシルクを生産する。オーブ・ウイーバーは、いくつかの蛋白質を用いて多様なシルクを生産し、より強くより柔軟なクモの巣を作る。クモシルク蛋白質はまた、どんな絹糸腺から紡がれたかによって、品質が異なる。最も強いシルクとして知られているのは、オーブ・ウイーバーの主要アンプレート腺から出たものである。オーブクモによって生産された８種類のシルクのうちで、この研究のために、主要アンプレート（ドラッグライン）シルクが選ばれた。これは物理的強度及び非粘着性を有するからである。このドラッグラインシルクは蛋白質から構成されている。但し炭水化物が繊維と組合わされている。クモの出糸突起において、液体シルクは、アラニンとグリシンの高い相対比から構成される不溶形態への不可逆性転移に付される。この繊維は、弾力のあるインタースペースを備えた逆平行β−シートから成る。このシルクのアミノ酸組成（下記表に示されている）は、本発明のクローンの組成を模倣している。Ｎｅｐｈｉｌａｃｌａｖｉｐｅｓの主要アンプレートクモ絹のパーセントアミノ酸組成 “ＳｉｌｋＰｏｌｙｍｅｒｓ”、ＡＣＳ、Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ、Ｓｅｒ．５４４、１９９４年クローニング２プライマーＰＣＲクローニング多くの研究では、ＰＣＲ型技術を用いて、反復シルク遺伝子のクローニングが試みられたが、少なくとも２つの問題が生じた。これらのＰＣＲ技術では、長さが８〜１５Ｋｂの遺伝子に関して十分忠実にＤＮＡを転写することはできなかった。実際に、文献において報告されている大部分のクローンは、不正確に転写されていた。従って本発明の発明者らは、これらの欠点の克服に着手し、幾分縮重したプライマーを用いることによって、ＰＣＲ産物の１つあるいはいくつかを生産することができることを発見した。Ｎｅｐｈｉｌａｃｌａｖｉｐｅｓの腹部から取られたゲノムＤＮＡが用いられた。ＤＮＡをクモから分離するために、サムブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）らの“ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、第１〜３巻、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニューヨーク（１９８９年）に記載されている調製方法に正確に従った。この手順から、２Ｋｂより多い高分子ゲノムＤＮＡが結果として生じた。発明者らは、スーらによって開示された配列データに関連した多くのプライマーを用いて実験を行なった。用いられているプライマーのいくつかは、プライマー配列（ｉ）〜（ｘｘ）として上に開示されているものである。これらのプライマーはベックウイズ及びアーシジアコノも試みたものであるが、本発明者らは、２プライマーＰＣＲクローニング系を用いて、長さ２Ｋｂまでのクモシルク蛋白質を初めて生産した。本発明者らはまた、特許請求されているｃＤＮＡ、及び下記単一部位クローニング方法によって、より大きいＫｂのクモシルク蛋白質を生産することができた。ＰＣＲクローンの当初条件は、スーらとヒンマン及びルイスによって規定されているスピドロイン（ｓｐｉｄｒｏｉｎ）１に由来するプライマーを用いて作られた。Ｔａｑポリメラーゼ（カリフォルニア州、ラ・ジョーラ（ＬａＪｏｌｌａ）、ノース・トレイ・パインズ・ロード（ＮｏｒｔｈＴｏｒｒｅｙＰｉｎｅｓＲｏａｄ）１１０１１のストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）社のパーキン・エルマー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）からのライセンス下のストラタジーン製品Ｎｏ．６００１３１）を用いた普通のＰＣＲで、発明者らは７００〜１０００ｂｐまでのＰＣＲ製品のみを得ることができた。このことは他の人々の発見を確認するものである。これらの小片でさえ品質は疑わしいと考えられた。Ｔａｑエクステンダー（ストラタジーン製品Ｎｏ．６００１４８）を用いて、実施例１に示されているように、約１９００ｂｐまでのいくつかの帯が得られた。しかしながら校正活性を有するもう１つのポリメラーゼ（タカラＴａｑＬＡ）が用いられた場合、下記実施例２に記載されているように、１つの主要帯だけが得られた。実施例１：Ｔａｑポリメラーゼを用いたクローニングこの実施例において、ベックウイズ及びアーシジアコノの手順によって分離されたＮｅｐｈｉｌａｃｌａｖｉｐｅｓＤＮＡが、次の２つのプライマーと共に用いられた：プライマー（ｉ）ＧＧＣＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＴと、プライマー（ｉｉ）ＧＧＣＧＡＡＴＴＣＡＣＣＣＴＡＧＧＧＣＴＴＧＡＴＡＡＡＣＴＧＡＴＴＧＡＣ。プライマー（ｉ）は前進（ｆｏｒｗａｒｄ）読み枠に基づくポリアラニン反復配列をコード化する。フレーム内開始コドンと、突出部としてのクローニングのためのＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩとの両方のリーダー制限部位を挿入するリーダー配列も、プライマーに入れられた。プライマー（ｉｉ）は、スーらの逆配列に基づくＰＣＲプライマー（ｂｐ２２１８〜２２４２）である。この配列はまた、フレーム内停止コドン及びＥｃｏＲＩ制限部位とを有している。この実施例及び実施例２に示されているように、結果はＰＣＲ条件によるものであり、より新しいポリメラーゼを用いない場合には確実なものではない。通例のＴａｑ及びＴａｑエクステンダーは同じ結果を生じなかったが、これはおそらく読みまちがい又は誤プライミングによるものであろう。ＰＣＲ混合物は下記のとおりであった：５μｌＴａｑエクステンダー緩衝液（ストラタジーン社）；Ｔａｑポリメラーゼ（ストラタジーン社）５μｌ／μｌが１μｌ；１μｌ／μｌのＤＮＡ鋳型（クモゲノムＤＮＡ）１μｌ；水中の２μＭプライマー（ｉ）が１μｌ；水中の２μＭプライマー（ｉｉ）が１μｌ；ＮＴＰのもの５μｌ（各々２μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ、ｐＨ７．０）；Ｔａｑエクステンダー（ストラタジーン社）４５μｌ；及び全部で１００μｌまでの水。ＰＣＲサイクル条件は次の通りである：当初ドエル９４℃で２分間；ＰＣＲ条件（３０サイクル）；６０℃で１分間のアニーリング；７２℃で２分間の伸長；９４℃で１分間の変性。あるいはまた、６０℃で１分間のアニーリング、７２℃ で２分間の伸長というＰＣＲ条件は、７２℃で２分間の処理と代えることもできる。１％アガロース電気泳動により分析されたこの反応混合物の５μｌ部分は、ＤＮＡ帯を示した。この技術によって、７までのＤＮＡ帯が得られ、これらの帯は配列においていくつかのアラニン反復部を表わすと考えられた。最大のＤＮＡ断片は１９００〜２０００ｂｐであった（これは２Ｋｂ片と呼ばれた）。これは本質的には実施例２において得られたものと同じ帯である。これはＧｅｎｅＣａｐｓｕｌｅ^TM（ミズーリ州６３１０８セントルイス、ワシントンブールバード３８３０のジーノ・テクノロジー社（ＧｅｎｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｃ．）のＣａｔ．Ｎｏ．７８６ −００１）のゲルから切り取られたものであり、フェノール及びエタノール沈殿で精製されたものである。これらの帯は、下記実施例２に記載された手順を用いて、大腸菌ＸＬ１ＭＲＦ’超コンピテント細胞にクローン化された。実施例２に記載されたタカラＥｘＴａｑＬＡポリメラーゼＰＣＲ条件がプライマー（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）と共に用いられた時に、２Ｋｂ片も見られた。実施例２：タカラＴａｑＬＡポリメラーゼによるクローニング凍結乾燥したクモの腹部を乳鉢に入れて乳棒で粉砕し、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、１−３巻、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８９年）に従って抽出して、ゲノミックＤＮＡを分離した。次のプライマーを用いてこの実施例のためのクローニングを実施した：プライマー（ｉｉｉ）は、Ｍｅｌｌｏら、ＳｉｌｋＰｏｌｙｍｅｒｓ，ＡＣＳ，Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ，Ｓｅｒ５４４（１９９４年）が述べているペプチド配列４から作製した。プライマー（ｉｉ）は上記の実施例１で述べたようにして作製した。以下のＰＣＲ混合物と条件を使用した。ＰＣＲ混合物：１０倍のタカラＬＡＰＣＲ緩衝液５μｌ；タカラｄＮＴＰ混合物５μｌ；プライマー（ｉｉｉ）（２ μＭ）１μｌ；プライマー（ｉｉ）（２μＭ）１μｌ；プルーフリーディング作用を持つタカラＥｘＴａｑ１μｌ；クモのゲノミックＤＮＡ１μｌ；合計５０μ ｌにするための水；鉱油５０μｌ。タカラＬＡＰＣＲ緩衝液、ｄＮＴＰ混合物およびタカラＥｘＴａｑは、ＰａｎｖｅｒａＣｏｒｐ．，５６５ＳｃｉｅｎｃｅＤｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ５３７１１が配給しているタカラロールキットから入手した。ＰＣＲサイクルの条件は次の通りであった：９４℃で１分間の初期ドエル；ＰＣＲ条件（３０サイクル）；６８℃で１分間のアニーリングと延長および９４℃で１分間の変性；４℃でのポストドエル。この２Ｋｂ断片を大腸菌に挿入するため、周知のベクター、ｐＵＣ１８を選択した。これはプラスミドが多数のクローニング部位を有しており、蛋白質を良好に発現しうるからである。このベクターが周知のプライマーを用いた配列分析に適することも知られている。この２Ｋｂ断片を大腸菌ＫＬ１ＭＲＦ’に挿入するため、最初にＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ.，Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ１４５０８，Ｓｔ．Ｌｏｕｌｓ，ＭＯ６３１７８−９９１６から入手したＤＮＡ標本１ μｇ／１μｌにおいてｐＵＣ１８を作製した。また同様に制限酵素を用いて挿入部分を消化した。制限プロトコールは次の通りであった：５μｇ以下のプラスミドあるいは挿入ＤＮＡ；制限酵素１０倍緩衝液５μｌ；１ｍｇ／ｍｌのアセチル化ＢＳＡ５μｌ；制限酵素（ＥｃｏＲＩ）５μｌ；最終容量５０μｌにするための水；３７℃で３時間インキュベートする。またフェノール抽出し、クリーンアップした後、ベクターをＥｃｏＲＩ制限酵素で処理した。ウシの腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＡＰ）でベクターを同様に処理した。この処理はベクターが再アニーリングするのを予防した。制限プロトコールに加えて実施したＣＩＡＰプロトコールは次の通りであった：５００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ９．０、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、１ｍＭＺｎＣｌ₂および１０ｍＭスペルミジンから成るＣＩＡＰ１０倍緩衝液１０μｌ；ＣＩＡＰ１単位；最終容量１００μｌにするための水；３７℃で６０分間インキュベートする。１単位のＣＩＡＰは、３７℃で１分当り６．０ｍＭのｐ−ニトロフェニルホスフェートを加水分解する。これらの単位を、１．０ｍＭＺｎＣｌ₂、１．０ｍＭＭｇＣｌ₂を含む０．１Ｍグリシン緩衝液ｐＨ１０．４中で測定する。次の段階は挿入部をｐＵＣ１８に連結することであった。これを行うために、該ＤＮＡをフェノール抽出とエタノール沈降反応によって再精製し、その後以下に述べるプロトコールに従って連結した。連結プロトコール：ベクターＤＮＡ１００ｎｇ；１００ｎｇ以下の挿入ＤＮＡ；Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１単位（ワイス単位）；リガーゼ１０倍緩衝液１μｌ；最終容量１０μｌにするための水；室温で１時間インキュベートする。次に、スーパーコンピテント細胞を挿入するためのＣｌｏｎｅｔｅｃｈ法を用いて、ＣｌｏｎｅｔｅｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，４０３０ＦａｂｉａｎＷａｙ，ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ９４３０３から入手した大腸菌ＸＬ１ＭＲＦ’に新しいベクターを挿入した。ＬＢ肉汁１０ｇ／ｌ細菌ペプトン、５ｇ／ｌ酵母抽出物および５ｇ／ｌＮａＣｌ中で、５０μｇ／μｌのアンピシリンを用いてアンピシリン耐性により形質転換体を選択した。最初に適当な大きさのプラスミド、約４．３Ｋｂを探して、クローンの適当な挿入部を調べた。同時に、ビオチン化したプローブを使用し、ハイブリダイゼーションに関してアッセイすることによっても挿入部を調べた。挿入した蛋白質はｐＵＣ１８内で発現するように挿入されているので、その発現に関して形質転換からの最良の５箇所の挿入部を検討した。上述したＰＣＲ手法を用いて２Ｋｂの挿入部が容易に作製された。この手法は以下の３つの方法よりもすぐれた結果をもたらした：ペプチド塩基配列決定に基づくプローブによるシルクに関してのショットガンクローンライブラリーのスクリーニング（Ｘｕら）；絹糸腺からのｃＤＮＡ挿入部（ＨｉｎｍａｎとＬｅｗｉｓ）；Ｔａｑポリメラーゼあるいはおよびプローフリディング作用のない他のポリメラーゼを用いたＰＣＲ（ＢｅｃｋｗｉｔｈとＡｒｃｉｄｉａｃｏｎｏ）。上記の３つの方法に比べて実施例２のＰＣＲ手法は迅速であり、他の報告されている方法から明らかなように配列に誤りを生じず、所望する遺伝子だけを対象とした。クモシルクのアミノ末端およびカルボキシ末端からの配列を少しだけ用いて、この手法を主要なアンプレート（ドラッグライン）シルク以外のシルクの塩基配列決定に、あるいは同様の特性を持つ他のクモに適用することができる。蛋白質が大腸菌宿主において発現するかどうかを調べるために、クモシルク蛋白質の測定のための抗体アッセイを開発した。これらのアッセイを以下に述べる。さらに、ＳＤＳゲル電気泳動は、２Ｋｂ挿入部が良好な収率で９４ＫＤａ蛋白質を生じることを示した。ゲル電気泳動はＭｅｌｌｏｗら、ＳｉｌｋＰｏｌｙｍｅｒｓ，ＡＣＳ，ＳｙｍｐｏｓｉｕｍＳｅｒ．５４４（１９９４年）の手順に従って実施した。ＬＢ肉汁を用いると、収率は細菌によって生成される総蛋白質の０．１−１０％の範囲であった。Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，３３００ＲｅｇａｔｔａＢｌｖｄ．，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ９４８０４からのＢｉｏ−ＲａｄキットＮｏ．１７０−６４６０を用いたウエスタンブロッティングも、この蛋白質がシルク蛋白であることを確認し、またそれは抗体反応を示す唯一の蛋白質であった。この２Ｋｂ挿入部ならびに本発明者によって開発された他の挿入部は、Ｐｒｏｍｅｇａシルバーシーケンスシステム、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｑ４１３０ＰｒｏｍｅｇａＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，２８００ＷｏｏｄｓＨｏｌｌｏｗＲｄ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ５３７１１−５３９９を用いて通常の条件に従って配列決定した。これは、多数のプライマー、欠失クローンおよび実施例１に基づく他のクローンを用いて実施した。この配列は図１に示すＤＮＡおよび蛋白配列を特徴とした。ｃＤＮＡからのクローニング多くの研究者がＮｅｐｈｉｌａｃｌａｖｉｐｅｓクモシルクをクローンすることを試みながら、ごく小さな断片がクローンされただけでほとんど成功していなかった。ｃＤＮＡからのクローニングに関連する問題としては、完全な長さのｍＲＮＡが得られないこと、蛋白質の逆転写がうまくいかないこと、および適合度が低いことが含まれた。もうひとつの主要な問題は、絹糸腺から十分な量のｍＤＮＡが得られないことであった。以下に述べる本発明のｃＤＮＡクローニング手法はこれらの問題を克服するものである。実施例３Ａ．完全な長さのｍＲＮＡの開発このクローニング法が成功を収めるまで、完全な長さのｍＲＮＡを得るという問題を解決しなければならなかった。クモ絹腺中のｍＲＮＡのコピー数は非常に少ないので、クモ絹糸腺から完全な長さのｍＲＮＡを得るのと類似の方法を開発するため、カイコＢｏｍｂｙｘｍｏｒｉを使用することにした。数多くのｍＲＮＡ分離法を試みたのち、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）からのｍＲＮＡ精製キット（Ｎｏ．８−ＭＢ４００３Ｋ）が、評価しうるほどの分解を伴わずに、一貫して基本的に完全な長さのｍＲＮＡを分離できることを発見した。このｍＲＮＡ精製法は、ｍＲＮＡを分離するために生体磁性ビーズ分離およびオリゴ（ｄＴ）₂₀粒子を使用する。Ｂ．長くて正確なＰＣＲ法の開発開発過程の次の段階は、該ｍＲＮＡを良好な一次ストランド鋳型に転換し、次に確実にＤＮＡを複製することであった。ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｙｃｌｅのｍＲＮＡ逆転写を用いると、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏｒｐ．，３９８５ＢＳｏｒｒｅｎｔｏＶａｌｌｅｙＢｌｖｄ．，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ９２１２１から入手したｃＤＮＡサイクルキットＬ１３１０−０１およびＰＣＲ増幅系は満足しうるものではなかった。開発されたプライマーはｍＲＮＡの小さな断片の増幅にしか適してなかったからである。発明者はその後、１０ＫｂｍＲＮＡを得るための自分達自身の手法を開発することにした。この工程の最初の部分は、逆転写酵素反応を至適にすることであった。ＡＭＶ（鳥類の骨髄芽球細胞症ウイルス）逆転写酵素（Ｍ５１０１）およびリボヌクレアーゼＨ活性を取り除くように修飾したＭ−ＭＬＶ（モロニーマウス白血病ウイルス）逆転写酵素（Ｍ５３０１）を含めた様々な逆転写酵素を試みて、一次ストランドを作製するための好ましい逆転写酵素を発見した。Ｔａｎｅｓｅ＆Ｇｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：１９７７（１９８８）参照。Ｍ５１０１とＭ５３０１はいずれもＰｒｏｍｅｇａＣｏｒｐ．，２８００ＷｏｏｄｓＨｏｌｌｏｗＲｏａｄ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ５３７１１から入手した。Ｐｒｏｍｅｇａ社の指示に従って使用したＭ−ＭＬＶは、最も高い適合性と最長の産物をもたらしたことから好ましいものであった。それ故、Ｍ−ＭＬＶと次の逆転写酵素プロトコールを使用することが勧められる：１０倍逆転写酵素緩衝液２μｌ；Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ）２μｌ；ジチオスレイトール２μｌ；ポリｄ（Ｔ）₂₀１ μｌ；ｍＲＮＡ１３μｌ。一次ストランドを作成後、ｍＲＮＡ断片を増幅する必要があった（フェノール抽出とエタノール沈降反応によって再分離した後）。該ｍＲＮＡがポリＡ末端を持つので、ポリＴプライマーを使用した。他方の末端にはマーカー配列が必要であり、数多くの可能性が存在した。マーカーカセットを各末端に置くと機能したが、この方法は少ない数の一次ストランドＤＮＡに連結する確率が低かった。ｍＲＮＡのポリＡ末端はは蛋白質のカルボキシ末端がコードされている部分に隣接しているので、一方の末端を標識する方法が既に使用されていた。それ故、１つの末端だけを標識する方法を採用し、ターミナルトランスフェラーゼを使用した。好ましい方法は、酵素ターミナルトランスフェラーゼを使用して、一次ストランドの３’末端にポリＡを付加するものである。単一プライマー法でｍＲＮＡからｃＤＮＡの両端を増幅することによってこれを行った。そのプロトコールは次の通りである：ターミナルトランスフェラーゼ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ処方）１０μｌ；ターミナルトランスフェラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）１μｌ；上述した逆転写手法からの一次ストランドＤＮＡ５μｌ；オリゴｄ（Ｔ）_6-12１μｌ；ｄ（Ａ）１μｌ；水７μｌ；３７℃で１時間インキュベートする。ターミナルトランスフェラーゼ緩衝液およびターミナルトランスフェラーゼはＰｒｏｍｅｇａＣｏｒｐ．，２８００ＷｏｏｄｓＨｏｌｌｏｗＲｄ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ５３７１１−５３９９、カタログＮｏ．Ｍ１８７１から入手した。次にフェノールとエタノール沈降反応を用いてＤＮＡを単離し、ＰＣＲを使用した。以下に述べる手法により、一方の末端にポリｄＡストランド、反対側の末端にはポリｄＴを持つＤＮＡストランドを生じた。かかる長いＤＮＡ断片についてＰＣＲを用いることの問題は、ポリＴをプライマーとして使用するｃＤＮＡの長くて正確な増幅プロトコールが必要とされるが、以下のＤＮＡ増幅のタカラＬＡ法を用いて解決した。ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅は次の通りであった：上述したターミナルトランスフェラーゼ手法からのＤＮＡ１μ ｌ；１０倍のタカラＬＡ緩衝液１０μｌ；ｄＮＴＰｓ（タカラ）１０μｌ；ポリｄ（Ｔ）２０プライマー１μｌ；タカラＥｘＴａｑＬＡポリメラーゼ１μｌ；水７８μｌ；鉱油１００μｌ。ＰＣＲの条件は次の通りであった：初期ドエルは９４℃で１分間であった；増幅サイクル（４０）は；９４℃で３０秒間；５５℃で２分間；７２℃で３分間であった；その後２℃でポストドエルを行った。増幅は最初多数のｍＲＮＡによるストリークを示した。必要な特異的プライマーを得るため、初期増幅からのｃＤＮＡを、最初にシルク蛋白の非反復領域をコードする２Ｋｂのプライマー（ｉｉ）だけで増幅した。これも最初のＰＣＲからのｃＤＮＡ１μｌを用いて停止コドンを導入した。これににより、一方の末端にポリｄ（Ａ）を持つ一本鎖ｃＤＮＡだけを生じる。この新しいプライマーだけがシルク蛋白をコードするｃＤＮＡを増幅する。これによりシルク蛋白の選択的ライブラリーを生じる。同時にシルク蛋白からのｃＤＮＡを優先的に増幅したストリークを生じた。次に、上述した反応産物１μｌをプライマー（ｉｉ）およびポリｄ（Ｔ）₂₀と共に使用してＰＣＲ法を実施した。これを行った時、エチジウムブロマイドを含むアガロースゲル上に３つの異なるｍＲＮＡ帯が形成された。これらのｍＲＮＡ帯はクモシルク遺伝子から形成される３つの異なる大きさのｍＲＮＡを示した。それらは約９５ｋＤａ、１９０ｋＤａおよび２２０ｋＤａの蛋白質をコードするものである。天然のクモシルクでは１９０ｋＤａと２２０ｋＤａ蛋白質が多いが、３つすべてが形成された。同じ３つの蛋白が、電気泳動で確認されたように、クローンと天然のクモドラッグラインシルクの両方において生成される。これは正しい遺伝子のクローニングを示す上で重要であった。これらの結果は、ＰＣＲ分析に従えば最後の２Ｋｂについては相同であるので、この蛋白には３箇所の開始部位が存在することを確信を持って示唆している。これらの断片の最大のものは約１４Ｋｂの長さである。その後２つの最大断片をクローンした。最大の断片は、ｐＵＣ１８をＳｍａＩで平滑末端制限開裂し、実施例２で述べたようにＣＩＡＰで処理してクローンした。ｃＤＮＡを、実施例２で示したようにこれをベクターに連結することによって平滑末端挿入した。これを、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅＣｌｏｎｉｎｇＳｙｓｔｅｍｓ，１１０１１ＮｏｒｔｈＴｏｒｒｅｙＰｉｎｅｓＲｄ．，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ９２０３７からのキットＮｏ．２００３０を用いてスーパーコンピテント大腸菌ＸＬ１ブルーＭＲＦ’で形質転換した。１％アガロースゲルで挿入部分の大きさを調べ、陽性形質転換体を挿入に関してアッセイした。次に陽性挿入体を、ＰＣＲとポリｄ（Ｔ）₂₀プライマーを用いて正しい挿入に関して試験した。同時に陽性体を以下に論じる抗体法によっても試験した。大きなｍＲＮＡについての抗体試験に適格した陽性体を、ＳＤＳ電気泳動を用いて検査し、複数の開始部位を示す３つの異なる蛋白を生じることが分かった。１つの蛋白質は２Ｋｂ断片よりもわずかに大きく、他の２つの蛋白質は天然クモシルクドラッグライン蛋白質よりもわずかに短かった。しかし、これらの高分子量蛋白をウエスタン染色で染色することは困難であるが、これは天然蛋白についても同様であった。開始コドンを挿入するあるいは確実に読取り枠を正しくするという試みは行わなかったが、これらのクローンは大量の蛋白を生成した。実際に、一部はあまりに多くの蛋白を生成したため増殖が抑制された。発明者の知る限り、培養が標的蛋白のこれほど多くの合成を示したのはこれが初めてであった。以下の発酵の章でさらに説明するが、低温のような培養条件が蛋白産生の増加を助けるというのは意外な発見であった。それらの蛋白が塩基配列決定のためのプラスミドＤＮＡの単離に干渉し、それによって、該ＤＮＡが細菌の蛋白をコードしている時に正しい配列を得ることを困難にすることが分かった。しかし、これらの各々の蛋白の配列の最後の部分は同じであった（アミノ末端で一部のクローンから１００塩基対までが欠失している小さな相違を除いて）。これらのクローンは、同じＤＮＡコード領域を読取るので、カルボキシ末端では同じ配列（最後の１９００＋塩基）を有している。単一部位プライマー系からのクローニング前述したように、プライマー（ｉｉ）は主要なドラッグラインシルク蛋白のカルボキシ末端をコードするので、独自のものである。それにもかかわらず、アミノ酸の方向を指示し、望ましくは全体配列を引き出す方法を開発する必要があった。そのような２つのアプローチを開発した。１つはショットガン法を用いてＤＮＡクローンを作製するもので、これは以下に述べる。１つの挿入部の中で遺伝子全体をクローンし、この方法で蛋白を生成することができる可能性は低いと思われた。発明者は、カルボキシ末端が対象となる他のクモシルクについても独自のものであることを知っていたので、既知の１つの固有部位から開始しなければならない、ＰＣＲのための方法が開発できるであろうと考えた。この手法が第二のアプローチであり、ＤＮＡの末端にカセットを連結することを含むが、ターミナルトランスフェラーゼの使用はやはり有効であろう。実施例４それによって部位に結合するＰＣＲプライマーを開発することができる、ＤＮＡの末端での独自のマーキングを容易にするために、タカラキットからの多くのカセットを開発した。以下の開示するカセット系を使用した。カセット１：Ｓａｕ３ＡＩカセット。カセット２：ＥｃｏＲＩカセット。カセット３：ＨｉｎｄＩＩＩカセット。カセット４：ＰｓｔＩカセット。カセット５：ＳａｌＩカセット。カセット６：ＸｂａＩカセット。プライマーＣ１プライマーＣ２プライマー（ｉｉ）Ｉｓｅｇａｗａら、Ｍｏｌ＆Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ６：４６７（１９９２年）参照。このアッセイを実施するためには、上記の制限部位のひとつで高分子量のクモゲノミックＤＮＡを消化する必要がある。制限消化手順は次の通りである：１μ ｇ／μｌのゲノミックＤＮＡ２μｌ；適当な制限酵素（上記に示した６つの制限カセットのひとつに対応するものあるいは同じ制限カセットを制限酵素と共に使用する場合はその他のもの）２０単位；制限酵素のための１０倍緩衝液５μｌ；合計５０μｌまでの蒸留水；３７℃で３時間インキュベートする。次のこの制限消化物を洗浄し、エタノール沈降反応によって再濃縮し、滅菌水に溶解する。その後カセットを各々のＤＮＡ消化物に連結する。連結反応手順は次の通りである：ゲノミックＤＮＡ消化物５μｌ；適当なカセット（上記のカセット１−６のような）２．５μｌ（２０ｎｇ／μｌ）；タカラ連結溶液７．５μ ｌ；室温で３０分間のインキュベーション。次のこの連結反応混合物を洗浄し、エタノール沈降反応によって再濃縮し、滅菌水５μｌに溶解する。タカラのキットのＴａｑはプローフリーディング作用あるいは高い適合性を持たないので、タカラＬＡＰＣＲキットからの試薬とポリメラーゼを使用し、非常に正確な転写が得られた。使用したプロトコールを以下に述べる。最初のＰＣＲ増幅混合物は次のものを含んだ：ＤＮＡ溶液２μｌ；カセット７（プライマーＣ１）１μｌ；カセット９（プライマー（ｉｉ））１μｌ；１０倍のＬＡｅＸＴａｑポリメラーゼ緩衝液１０μｌ；ＥｘＴａｑＬＡポリメラーゼ１μｌ；ｄＮＴＰｓ１０μｌ（各々２．５ｍＭ）；合計１００μｌにするための水。ＰＣＲ条件は次の通りであった：初期ドエル９４℃で１分間；増幅（３０サイクル）：９４℃で３０秒間；５５℃で２分間；７２℃で１−３分間；２℃でのポストドエル。最初のＰＣＲ増幅後、ゲノミックＤＮＡ溶液を１回目のＰＣＲ産物１μｌに置き換え、カセット７（プライマーＣ１）をカセット８（プライマーＣ２）に置き換えることを除いて、同じ条件下で２回目のＰＣＲを実施した。２回目のＰＣＲ産物のアガロースゲルは、カセット系のうちの３つに関する帯を示した：ＰｓｔＩ、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ。これらは長さ４０ｋＢ以上、一部は１００ｋＢ以上の弱い帯であった。ゲルに重要なストリークが形成されたが、発明者はこの長さのＰＣＲについての報告を発見できなかったので、これはＰＣＲ産物が極端に長かったためであろうと推測された。これらのＰＣＲ産物を各々ゲルから切り出し、ＧｅｎｅＣｌｅａｎで精製した。これらの産物は平滑末端の断片で、ＳｍａＩ平滑末端制限部位でｐＵＣ１８に直接クローンし、大腸菌ＸＬ１ブルーＭＲＦ’に形質転換した。これらの挿入部分はすべて挿入時にある程度欠失したが、それでもやはり、ドラッグラインクモシルク遺伝子全体を挿入するのに十分な長さである２０Ｋｂ以上（代表的には約２３Ｋｂ）のプラスミドクローンを生じた。以下に論じるように、大腸菌の形質転換体はシルクの高い産生から生じる生化学的問題のために、肉汁培養ではあまり良好に増殖しなかった。これらの形質転換体は、先に述べたｃＤＮＡ転換体と同様にあまり良好に増殖せず、シルクに似た綿状の塊を作ると思われた。このため、本発明者はクモシルクが産生されているかどうかを調べることにした。以下に述べる抗体検査と血球凝集反応は、大量のシルク蛋白の産生を示した。ＳＤＳゲル電気泳動は３種の蛋白（実施例３の上述したｃＤＮＡの検討から予測されたもの）の存在を検出し、最も大きい２つの断片は天然クモシルクに適合する完全な長さであることを示した。ウエスタンブロッティングもｃＤＮＡに関するのと同じ結果、すなわちより小さなシルク断片が非常に良好に染まることを示した。沈降反応その他の問題のため、非常に大きな蛋白は天然シルクのようにウエスタンブロッティングで陽性染色されなかった。実施例３はこの実施例と同様に機能した。しかし、いずれの場合も、また天然クモシルクに関しても、より大きな蛋白は陰性染色された。これらのクローンの多くの増殖に関してもいくつかの顕著な問題があった−− ｃＤＮＡクローンに関して認められるものと同様であるが、産生は著しく高い。これらのクローンの一部は、３７℃のＬＢ肉汁のような肉汁培養では良好に増殖しない。興味深いことに、本発明者は、プロモーターがクローンから生じて、産生率を助けているのではないかと推測した。プラスミドＤＮＡに関連した、完全な長さのシルクの配列上の問題（アガロースゲル上にストリークを生じさせる）を避けるためのひとつのアプローチは、蛋白を生成しないあるいは低分子量蛋白を生成するサブクローンにクローニングすることである。この問題は、上述したｃＤＮＡクローンや以下に述べる多量体に関して認められるものよりも深刻である。ｃＤＮＡクローンのようにこれらのクローンは大量の蛋白を産生し、大量生産に使用することができる。該ＤＮＡ配列の最後の２Ｋｂは、配列が終了する２Ｋｂ挿入部に適合することが既に確認されている。ゲノミックシルクＤＮＡからのショットガンクローニングこの独特の方法はカイコのＤＮＡをクローニングするのに知られているが、本発明者はこの手法がクモシルクＤＮＡの分離にも適することを発見した。しかし、遺伝子全体を含む適当なクローンを見つけるためには５０，０００までのクローンをハイブリダイゼーションプローブによってスクリーニングしなければならないと予想される。上述した他のクローニング法と異なって、これらのクローンのいずれもが（あるいは少数のクローンだけは）、広汎なスプラインシングを行わないと蛋白質を生成しないであろうと予想される。そのため、本発明者はこの手法を改善することに取り組んだ。本発明者が開発した改善とは、クローニングに使用されるもののような、ガラスビーズに付着したビオチン化されたプローブの使用を含む。この手法は、クローニングの前にシルク遺伝子の少なくとも一部を持った配列を強化することを認めた。ビオチン化プローブは、該プローブにハイブリダイズする特異的領域を持ったＤＮＡ配列を選択する。それ故、ＤＮＡ断片が遺伝子全体を有していないこともある。それにもかかわらず、この手法はクモシルク遺伝子を得るため、および蛋白質発現クローンを作製するための開始点として使用される。実施例１−４で述べたクローニング手法に比べると、これらのショットガン法は初歩的であるが、まだやはりＮｅｐｈｉｌａやその他のクモシルク蛋白をクローニングするための適切な方法である。実施例５ビオチン化プローブでクローンを選択するのにハイブリダイゼーションプローブを使用することは知られている。たとえば、Ｓｉｇｍａキット（Ｃｏｏｌ−１）、ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．，Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ１４５０８，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ６３１７８−９９１６は、ＢｉｏＲａｄの手法に従ってブロットしたシグマニトロセルロース膜上のクローンのドットブロットを最終的に展開するための試薬を提供する。これらの手法は数多くあり、また大半の分子生物学の当業者がこの基本的手法を実践している。ビオチン化プローブにハイブリダイズするＤＮＡ断片を濃縮するための手法はあまり知られていない。この系では、次の手順を用いてゲノミックＤＮＡの前強化にＤＮＡＬ（ＬａｋｅＳｕｃｃｅｓｓ，ＮＹ）Ｍ−２８０ガラスビーズを使用した。まず最初に、ビオチン化プローブとＤｙｎａｂｅａｄｓＭ−２８０Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎをミクロ遠心分離管において混合した。ビーズ１００μｌとビオチン化プローブ１００μｌ（１μｇ／μｌ）を混合し、室温で１０分間結合させた。管の磁石でビーズを遠心分離管中に保持し、静かに液体を流出させる。次に０．１ＭＮａＣｌを含むＴＥ緩衝液でビーズを３回洗浄しする。あらかじめ９５℃で２分間変性させたゲノミックＤＮＡ１００μｌをビーズに加える。２Ｘで、１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭＥＤＴＡおよび２ＭＮａＣｌから成る当量の結合溶液を用いて、ビーズとＤＮＡを４２℃で２時間ハイブリダイズさせる。次に温度を室温まで下げて、ハイブリダイゼーション溶液中でビーズを３回洗浄する。０．１ＭＮａＣｌを含む０．１５ＭＮａＯＨを用いて富化したＤＮＡを溶出させる。ＤＮＡを水中で５μｌに濃縮し、ＳｍａＩ部位でｐＵＣベクターに挿入してクローニングする。クモシルクＤＮＡ配列に結合する種々のビオチン化プローブを用いて正しい断片をさらに選択する。陽性クローンを配列させる。この手法は非常に有効であるが、選択にかなりの作業を要する。５００以下のクローンだけをスクリーニングすればよいようにＤＮＡの強化を行うことができる。この強化を行わないと、シルク遺伝子を持つクローンを得るためには２００，０００から２０００万のクローンをスクリーニングしなければならない。多量体化工程実施例１と２で述べた２つのプライマーＰＣＲクローニング手法と、Ｎｅｐｈｉｌａ型配列に基づく２０以上の異なるプライマーを用いたが、２Ｋｂ挿入部がクローニングした最長のクモシルク断片であった。このため、より大きな断片を作製するには別の手法が必要であろうという理論が立てられた。アミノ末端付近をコードする蛋白質の部分からの追加的な配列情報を得る手法が必要と考えられた。蛋白質の配列決定から得られた情報ではより大きな断片が生成されなかったからである。２Ｋｂ断片は完全な長さの４０％以上であるが、一般にシルクポリマーの大きさによって強度が異なるので、強度特性を高めるためには多量体化が必要と考えられた。それ故、発明者は２Ｋｂ挿入部を多量体化して。天然遺伝子よりも大きな蛋白を作製したいと考えた。本発明の発明者は、ＰＣＲは報告された配列の反復を避けるので、これらの挿入部を多量体化するのに適した方法をもたらすであろうと推測した。本発明の多量体化の工程は以下の実施例の中で示す。種々の有用な制限部位を持ったＰＣＲ断片の構築は、現在の開始および終了プライマーの突出部（オーバーハング）を修飾することによって実施した。上述したプライマー（ｉ）や（ｉｉ）のような他の開始および終了プライマーは異なる制限部位を有しており、蛋白がその部位を通してｍＲＮＡに翻訳され続けるように欠失した停止枠コドンを持ち、より長い構築物を作製することができる。開始コドンが最初に残され、そのため欠失を調べるのに役立ち、翻訳を上昇させる多数の蛋白質が存在する。独自の制限部位で種々の２Ｋｂ挿入部を作製するのに用いたプライマーを以下に示す。これらはプライマー（ｘｘｉ）−（ｘｘｖｉ）と称される。ＢａｍＨＩ部位を持つプライマー（ｘｘｉ）。ＨｉｎｄＩＩＩ部位を持つプライマー（ｘｘｉｉ）。ＳａｌＩ部位を持つプライマー（ｘｘｉｉｉ）。ＢａｍＨＩ部位を持ち、停止コドンを持たないプライマー（ｘｘｉｖ）。ＨｉｎｄＩＩＩ部位を持ち、停止コドンを持たないプライマー（ｘｘｖ）。ＳａｌＩ部位を持ち、停止コドンを持たないプライマー（ｘｘｖｉ）。実施例６（４Ｋｂ多量体構築物）この実施例の４Ｋｂ構築物は、ｐＵＣ１８中の２Ｋｂ挿入部を持つプライマー（ｉ）および（ｘｘｖ）のＰＣＲによって作製した。ゲノミックＤＮＡの代わりに２Ｋｂ開始プラスミドを使用したことを除いて、上記の実施例２に従って実施した別個の反応においてプライマー（ｉｉ）および（ｘｘｉｉ）を使用した。ＬＡ（長くて正確な）ＰＣＲ手法を用いて、発見されたＤＮＡ断片は、新たな制限部位とプラスミド全体を表わす２つの帯を持った２Ｋｂ断片であった。その後、製造会社の指示に従って１％アガロースゲル（８ｃｍゲル上での７０Ｖで９０分間の電気泳動）−−ＧｅｌＣａｐｓｕｌｅｓ（ＧｅｎｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ６３１０８）によりこれらの帯を分離した。ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩの両方の制限酵素で帯を切り、ベクター２μｇをＥｃｏＲＩで切って、実施例２で述べたようにＣＩＡＰで処理した。次に、２つの２Ｋｂ断片の各々の半分とベクターをフェノール抽出とエタノール沈降反応によって精製し、ＴＥ緩衝液１０μｌに溶解した。ＴＥ緩衝液はＳａｍｂｒｏｏｋらによって述べられている。各々の５μｌの部分標本をリガーゼ反応に加えて（実施例２の中の連結プロトコールで述べたように）、連結した。ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏｒｐ．，３９８５ＢＳｏｒｒｅｎｔｏＶａｌｌｅｙＢｌｖｄ．，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ９２１２１から入手したＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎエレクトロポレーター、カタログＮｏ．Ｓ１６７０−０１に添付されている通常の細菌プロトコールを用いて、これらを大腸菌ＸＬ１ＢｌｕｅＭＲＦ’細胞（キットＮｏ．２００２３０）、大腸菌ＴＯＰＰ細胞（キットＮｏ．２００２４１）および大腸菌Ｓｕｒｅ細胞（キットＮｏ．２００２３８）にエレクトロポレーション導入した。大腸菌細胞はＳｔｒａｔａｇｅｎｅＣｌｏｎｉｎｇＳｙｓｔｅｍｓ，１１０１１ＮｏｒｔｈＴｏｒｒｅｙＰｉｎｅｓＲｏａｄ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ９２０３７から入手した。Ｓｕｒｅ細胞は、欠失のある形質転換体が少なく、より良好な結果を生じた。成功した形質転換体は９４および１８８ｋＤａの蛋白質を生成し、後者は天然クモシルクに関する文献の中で報告されている１９０ｋＤａ蛋白に類似している。実施例７（６Ｋｂ多量体構築物）本実施例の６Ｋｂ構築物は、実施例２で述べた手法を用いて３つの断片のＰＣＲによって作製した。この手法は、３つの２Ｋｂ構築物と以下のプライマーセットを使用することから成った：セット１：プライマー（ｉ）と（ｘｘｉｖ）；セット２：プライマー（ｘｘｉ）と（ｘｘｖ）；セット３：プライマー（ｘｘｉｉ）と（ｉｉ）。実施例６の４Ｋｂ多量体構築物において述べたのと同様の手法にてこれらをｐＵＣ１８内に構築した。Ｓｕｒｅ細胞の一部では天然シルクよりも大きい蛋白質を創造する欠失が起こらないことが発見されたが、プライマー（ｉ）と（ｉｉ）および形質転換体ベクターＤＮＡを用いたＰＣＲ産物のアガロースゲルから判断すると、多くの場合には何らかの欠失が起こった。Ｓｕｒｅ細胞は組み換え欠損であることから好ましかった。予想されたように、ＤＮＡは一定サイズ以上であったため、より不安定で反復を欠失していた。実施例８（８Ｋｂ多量体構築物）本実施例の８Ｋｂ構築物は、４つの別々の２Ｋｂ断片を次の４つのプライマーセットから作製したことを除き、上記の実施例の６Ｋｂ構築物と全く同じように作製した：セット１：プライマー（ｉ）（ｘｘｉｖ）；セット２：プライマー（ｘｘｉ）と（ｘｘｖ）；セット３：プライマー（ｘｘｉｉ）と（ｘｘｖｉ）；セット４：プライマー（ｘｘｉｉｉ）と（ｉｉ）。これらを、実施例６および７の他の挿入部分と同様の方法で挿入した。ほとんどすべての場合に欠失が起こったとしても、天然シルクより大きい蛋白質が生成され、この多量体化手法がよりすぐれた特性を持つ合成シルクの作製に使用できることを示唆した。この手法と完全な長さのＤＮＡを使用して、配列を変更して、天然シルクＤＮＡの多量体ユニットを生成できた。最終産物は通常よりもはるかに高い分子量を有していた。これらのクローンの一部は、完全な長さの天然シルクと同様の大きさかあるいはそれよりも大きなサイズの蛋白質を生成した。ｃＤＮＡや上述した単一部位系のような他の手法からのクローンを統合して、他の多量体を作製することもできた。８００ｋＤａまでのクローンは、完全な長さのクローンあるいはその断片を用いて本発明の多量体化手法が可能である。ベクターおよび生産系クモシルク蛋白のクローニングに関しては、大腸菌およびｐＵＣ１８が好ましい初期生産系である。どちらも高い適合性のある安定な発現を生じ、その細胞膜を通してシルク蛋白を排出する。発現系については１つの例しか示していないが、天然蛋白あるいはそれらから誘導される多量体をコードする特異的挿入部分は、いずれのベクターあるいはゲノム取り込み系における使用にも適用しうる。潜在的可能性のあるベクターおよび宿主のリストは膨大な長さとなるので、ごく一部の例だけを以下に示す。細菌系大腸菌発現系が好ましい。その理由は非常に高いレベルの組み換え蛋白質を生成し、それを細胞膜の外側に排出するために必要な生化学的仕組みを有しているからである。またそれらは簡単な発酵を用いると容易に増殖する。さらに、最も一般的な発現系であるので、この系による蛋白質生成にとっての主要な問題の多くが既に克服されている。ｐＵＣ１８は最も一般的に使用されるベクターである。ｐＵＣがそのひとつである、ヒトが作製した一般的なプラスミドに加えて、溶菌ファージに基づく他のベクター、ファージミド、シャトルベクターも発現挿入系として可能である。そのようなプラスミドの例は、ｐＢＲ３２２、ｐＳＰ−６４、ｐＵＲ２７８およびｐＯＲＦ１を含む。ファージベクターの例は、ラムダ（ λ）、１２００１、ラムダ（λ）ｇｔ１０、シャロン４ａ、シャロン４０、Ｍ１３ｍｐ１９および天然の細菌ファージから修飾した他のファージを含む。枯草菌系を含むＢａｃｉｌｌｕｓ発現系も使用できる。これらの細菌は宿主による良好な分泌という利点を持ち、その結果処理の段階とコストが少なくてすむ。発現カセットも使用できるが、これまでに検討されたベクター宿主系に関しては不必要であることがわかっている。大腸菌およびＢａｃｉｌｌｕｓシャトルベクターとして作用しうるひとつのファージミドはｐＴＺ１８Ｒで、これはＰｈａｒｍａｃｉａ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から入手できる。他の多くの細菌系が発現のために使用できる。寄託されているクローン代表的なクローンは、１９９５年６月２日にＡｍｅｒｉｃａｂＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（１２３０１ＰａｒｋｌａｗｎＤｒ．Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ２０８５２）に寄託され、ＡＴＣＣＮｏ．６９８３２を与えられた。寄託されているのは、完全な長さのＮｅｐｈｉｌａｃｌａｖｉｐｅｓシルク蛋白質を発現することができる完全な長さのクモシルク遺伝子を有するｐＵＣ１８プラスミド（２３Ｋｂ）を含む、大腸菌ＸＬ１ＭＲＦ’細胞、菌株名称ＰＡ２１である。酵母及び糸状菌系Ｓｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ、Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ、Ａｓｅｒｉｌｌｕｓｓｐ．、Ｈａｎｓｅｎｕｌａｓｐ．、及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｐ．は発現系として使用できる。しかし、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ及びＰｉｃｈｉａ系を除き、これらの系が細菌異常に蛋白質を生産し、規模拡大を容易にするだろうという証拠はほとんどない。しかしこれらの系は、細菌発酵が毒素及び発熱物質を有するので、ＵＳＰ又は食品級物質を生産するためには望ましいが、これらの酵母及び糸状菌の多くはすでに食品級物質として安全であることが示されてきた。植物変換系植物系はシルクのような形質転換蛋白質の生産のために使用できる。蛋白質の量は微生物系で生産されるよりも少ないだろうが、植物栽培はかなり低経費である。植物ゲノムへの遺伝子取込を可能にするＡｇｒｏｂａｃｔｅｒ型移入系が使用できる。これらは遺伝子ガン挿入、エレクトロポレーション又は多くの他の挿入手段を用いて、ＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｔｕｍａｆａｃｉｅｎｓＬＢ４４０４のような細菌により挿入してもよい。一旦挿入されると、それらは安定で遺伝可能な方法で植物ゲノムに組み込むことができる。これらの植物系は慣用的に大トン数で栽培され、収穫されるような、多くの利点を有する。農民はタバコ、大豆、菜種及び他の広く栽培される作物のような、産業的に重要な植物を栽培する経験を有し、それらはシルク生産のために関心のある主要植物である。タバコ及び大豆からの高分子量蛋白質の生成のための手段は現在存在する。昆虫系Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ発現系は使用でき、昆虫細胞系統での組換え蛋白質の高水準発現でよく知られている。複製及び有効な移入はｐＢａｃＰＡＫ６、ｐＢａｃＰＡＫ８又はｐＢａｃＰＡＣ９を含む多くのベクターで達成される。これらは他の系とほど経費的に有効ではないが、高水準の発現で使用できる。他の動物系種々の動物への挿入のために使用できる多くのベクターがある。それらは今や商業的価値のあるベクター宿主系ではないが、それによって将来蛋白質が有用になる応用があるかもしれない。発酵方法移入した宿主の第１発酵は１０ｇのバクトペプトン、５ｇのバクト酵母抽出物並びに５ｇの食塩及び１リットルの最終濃度のための蒸留水からなるＬＢ肉汁中で行われた。この特別な肉汁中に、クモシルク生産菌の大量の沈澱又は綿状塊が観察された。この観察は、蛋白質が細胞膜を通って分泌されることを示唆するので、重要である。しかし、これらの高い分泌速度は細胞を幾分洩れやすくすると思われる。したがって、生理的食塩濃度の増加が培養を安定化するようである。低温、特に室温及びそれ以下で蛋白質生産が増加することを発明者は発見した。高温では、蛋白質が室温又はそれ以下よりも発酵培地中で急速（５日以内）に消失することを発見した。この現象は３７℃付近の高温でプロテアーゼが誘起されたことを示した。このプロテアーゼ活性はリゾチーム及びプロテイナーゼＫのような多くのプロテアーゼとして顕著で、クモシルク蛋白質を分解するとは思われない。これらの好ましからざる代謝効果は低温で最少となる。これは低温におけるショック蛋白質の誘起のためであろう。発酵培地の組成がプロテアーゼ活性に影響することが分かった。例えば、二日培養の尿素−ＳＤＳゲルはＬＢ肉汁中で蛋白質分解を示さなかったが、ぶどう糖で補強したＬＢ培地（１０ｇのぶどう糖、１０ｇのペプトン及び１リットルにするための蒸留水）で培養すると、２４時間後大量の蛋白質分解があった。補強ＬＢ培地とＬＢ肉汁の間の唯一の差はＬＢ肉汁が１０ｇｍ／ｌのＮａＣｌを含むことであるが、補強培地は当量のぶどう糖を含んだ。このプロテアーゼ問題の発見の結果として、プロテアーゼ阻害剤が研究された。あまり経費のかからないプロテアーゼ阻害剤が発見され、培養培地中に挿入されるならば、発酵規模拡大に有利であろう。試験した化合物はＺｎＣｌ₂、硫酸銅、ＥＤＴＡ二ナトリウム、塩化ナトリウム、ほう酸、エチレングリコールビス（Ｂ−アミノエチルエーテル）、フッ化フェニルメチルスルホニル、Ｎ，Ｎ，Ｎ ’，Ｎ’−テトラ酢酸、１，１０フェナントロリン、１，１０フェナントロリン鉄錯体、蔗糖、ぶどう糖、乳糖、果糖、グリセリン、ペプトン及び酵母抽出物を含んだ。発見された最も有効な阻害剤はＮａＣｌ又はＫＣｌの塩添加であった。ほう酸も良好な阻害剤であることが分かった。他の化合物は有効でなかった。実際、簡単な糖類、特に乳糖及びぶどう糖はプロテアーゼ活性を促進した。ペプトン及び酵母抽出物はプロテアーゼ活性に影響しなかった。これらの化合物はビール中の蛋白質分解冷却補強酵素を試験するための方法、ＡＯＡＣ公式法９６９．１１で試験された。この試験を行うために、培養物の１ｍｌが採取され、試験された。活性プロテアーゼが存在すると、溶液は数秒で透明になった。プロテアーゼ陰性試料は６０℃で１／２時間、２０℃で一晩後に濁りを示した。この試験はその蛋白質分解酵素誘起能力に対して種々の培養培地を選別するための迅速な品質管理ツールとして使用された。発酵は種々の培地を用いて試みられた。複合培地が非常に良く発酵することが分かった。しかし、受容可能な蛋白質生産はＬＢ肉汁に含まれるよりも１０倍少ないペプトン及び酵母抽出物を用いて得られた。この簡単で経費の少ない培地はかなりの蛋白質を生産した。この培地は次の成分からなる：１．２ｇリン酸二カリウム、１．１ｇリン酸一ナトリウム、４．０ｇ塩化ナトリウム、０．４５ｇ硫酸マグネシウム、２．０ｇ硫酸アンモニウム、０．０４ｇ硝酸ナトリウム、０．０３ｇ塩化カルシウム、０．０２ｇ硫酸鉄、０．０１ｇ硫酸マンガン、０．０１ｇほう酸、０．０００５ｇモリブデン酸ナトリウム、０．００５ｇ塩化コバルト。０．５ｇグリシン、１．０ｇアラニン、１．０ｇ酵母抽出物、１０ｇグリセリン、ｐＨ７．０に調整された、１リットルにするための蒸留水。広い範囲の培養培地組成が本発明の発酵のために使用できる。これらの培地は塩類、グリセリン（又は他の炭素源）及び酵母抽出物又は他の若干の少量栄養物からの組成の範囲にある。簡単な培地は経費のあまりかからない、一般にシルク蛋白質を低水準で生じる。最適化しなければならない、他の主要発酵条件は酸素、栄養物水準及び温度である。３０℃で嫌気的条件が好ましいことが分かった。さらに、炭素源は成育及び蛋白質発現を最大にするために比較的高水準で加えられるべきである。例えば、１リットル当たり１０ｇのぶどう糖及び１０ｇのグリセリンが使用された。より単純な培地はより安価であるが、一般的に絹タンパク質のレベルが低下する。最適化する必要のある他の主要な発酵条件は、酸素、栄養レベル及び温度である。３０℃での嫌気性条件が好ましいことが知見された。更に、炭素源は、増殖とタンパク質発現を最大化するために、比較的高レベルで加えるべきである。例えば、１Ｌ当りグルコース１０ｇとグリセロール１０ｇを使用した。抗体試験クモ絹タンパク質が宿主 E.coli で発現しているかどうかを測定するために開発された抗体試験を、カイコ絹とクモ主要瓶状腺絹を用いて３種の動物宿主で行った。これらの抗体を開発するために、繭をかける前の第５齢Bombyx mori 幼虫からカイコタンパク質を取得した。このような幼虫を選択することによって、絹は粘度が高く、そのために幼虫は認めることができる半透明の外観を有した。粘度の高い液体絹を、無菌技術によって切開で採取した。次に、この絹を直接アジュバントに加えることができた。あるいは、クモの主要瓶状腺からのクモ絹を引き出すことができた。しかし、クモ絹を溶解させることが必要であった。このことは、８ＭＬｉＢｒ中で９５℃に５分間加熱してクモ絹を懸濁して行った。このクモ絹とカイコ絹を用いて、絹に対する抗体を作出した。抗体を作出するために、ＬｉＢｒを、遠心分離で８Ｍ尿素、最終的に２Ｍ尿素に置換えた。サンプルが尿素中にあるときに、絹のどちらかのサンプルをフロインド完全アジュバント１０ｍＬと混合する（１：１０）。これをマウス、ウサギ又はヤギに腹腔内注射し、抗体を生産させる。２１〜２８日に、動物に、絹とフロインド不完全アジュバントで追加免疫した。５週間目までに、血液を毎週集め、血清中の抗体を集めることは可能である。血清を用いて、血球凝集試験又はウエスタンブロットを行った。マウス、ウサギ及びヤギに対し、この方法を使用して、血液を採取し、血清を分離した。このことにより、各タイプの動物からカイコとクモの絹の両方に対するポリクローナル抗体を得た。これらの血清の抗体の力価を計り、全ては、標準的血球凝集試験によって力価が少なくとも２５６であることが知見された。血球凝集試験１％ＲＢＣ(Sigma Cat ＃R-3378)を被覆することによって、血球凝集試験を行った。溶解絹（１ｍｇ）を、１％ＲＢＳ１ｍＬに加えた。これを室温で数回渦巻混合し、一晩冷蔵した。次の朝、ＲＢＳを、リン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．２）中で遠心して３回洗浄し、非吸着タンパク質を除去した。その後、感作ＲＢＣは２週間以上冷蔵庫で安定であった。血清で血球凝集試験を行うために、抗血清２５μＬを連続希釈し（２倍希釈）、感作ＲＢＣ２５μＬを加えた。対照ウエルも同様に連続希釈し、非感作ＲＢＣ（２５μＬ）を加えた。ミクロタイタープレートを室温で１０分間揺動かし、プレートを室温で９０分間揺動かさないでインキュベートした。プレートを、Rose と Friedman の方法（Manual of Clinical Immunology，２版，Amer．Soc．Mic robiol.(1980)）で評価した。多くの絹は、それらの繰返し単位の同様性の故に同様の折畳み構造を有する。それ故、三次構造が同様のために、交差反応性がありうることが教示された。カイコ抗血清は、クモ絹タンパク質感作ＲＢＣと交差反応し、クモ絹抗血清は、カイコタンパク質ＲＢＣと交差反応することが知見された。絹が E.coli が作出した別のタンパク質ではないという確信をもって、抗体の両方のセットに対し、培養液を試験できたので、この交差反応性は主要な道具となった。本発明者らはまた、絹抗原によるＲＢＣの被覆に基づく別のスクリーニング技術を見出した。洗浄細胞を音波処理し、細胞膜を分離し、上清を採取すれば、血清の代わりにこれを２倍連続希釈で使用できることが知見された。ＲＢＳ上に絹感作細胞２５μＬを置くと、形質転換体の１次スクリーニングとして使用できる古典的な血球凝集試験ができる。絹タンパク質は、溶液中の他の絹タンパク質に結合し、ＲＢＣを架橋する粘着末端を有するという理論が立てられる。このことは、絹タンパク質が会合し、溶液から沈殿する同じ機構で起るであろう。この機構に基づくタンパク質アッセイには他の参考文献を見出すことができなかった。それ故、それは、絹及び絹様タンパク質の非常に特異的なアッセイであることが期待される。このコロニーについて血球凝集試験を行うために、細菌培養液（１ｍＬ）を、ＰＢＳ中で遠心分離により３回洗浄し、ＰＢＳ１００μＬに入れた。氷浴中で、１／８インチのチップを有する Branson 450 音波発生器を４０％パワーと２分間の２０％効率サイクルで用い、細菌を音波処理した。この溶液をＲＢＣを感作するために用いる。各々異なる細菌単離株について、上記と同じようにアッセイを行った。全ての場合に、絹タンパク質をうまく生産している培養液は、少なくとも１６、通常２５６の力価を有した。この方法を用いて、プラスミドとブロットの上記アガロースゲルで見出された１０種の最有望な単離株をスクリーニングした。２ｋｂの挿入物の場合だけの、最適の数株の単離株だけを更なる仕事のために保存した。絹タンパク質の精製本発明はまた、絹の精製技術と紡績技術も包含する。これらの工程は、該タンパク質の最終形態への加工に必須である。該タンパク質は被覆として使用でき、繊維に押出しでき、又は重合フィルムにすることができる。発酵培地からの絹タンパク質の精製は、２工程プロセスで行うことができる。第１に、細菌細胞と沈殿タンパク質を連続遠心分離で取得できる。発酵培養液に存在する残りの物質を限外濾過で分離できる。何故ならば、分子量８０，０００以上のタンパク質の大部分が絹だからである。次に、連続遠心分離と限外濾過方法からのタンパク質絹流を一緒にできる。残りのタンパク質の大部分は、細菌膜に存在する。超音波で細菌細胞の破壊によって、細胞は開き、細胞内の絹タンパク質は取出される。本発明の重要な知見は、超音波を用いてクモ絹の可溶化である。但し、クモ絹が洗浄されておらず、完全には乾燥していなかった場合である。次に、この再可溶化絹タンパク質溶液を遠心分離して細胞膜を除去できる。細胞膜の除去後、該タンパク質は限外濾過で更に精製できるか、又は紡績できる。絹を紡績するために、絹を溶液に保つことが重要である。しかし、従来方法では非常に過酷な化学薬品を用い、紡績操作のために絹溶解性を維持した。種々の化合物によって、紡績方法の前に、絹タンパク質は再沈殿しないようにできよう。これらの化合物には、種々の塩、リチウム塩、水酸化ナトリウムと水酸化カリウム、リン酸尿素、塩酸グアニジン、尿素、及びヘキサフルオロイソプロパノールなどがあるが、それらの全てが絹を可溶化させる。本発明者らによって、限外濾過による精製後、エタノール、メタノール、他のアルコール、又は同様の溶媒を加えるアルコール沈殿によって更なる精製を行うことができることも知見された。この精製絹タンパク質物質は、超音波又は１種以上の上記塩化合物の添加により、再溶解できた。絹タンパク質可溶化のための費用と環境を考慮して決定された好適化合物は、タンパク質精製のために超音波又はアルコールと組合せて使用される、水酸化ナトリウムと水酸化カリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化リチウム、又は臭化リチウムである。他の絹タンパク質のように、クモ絹タンパク質は容易に可溶化しない。クモ絹は、ギ酸（８８％）のような過酷な化学薬品で可溶化できることを示唆するデータはあるが、本発明者らは、それによって、完全長のタンパク質の分解が起ることを見出した。しかし、本発明者らは、絹繊維は、ＬｉＳＣＮ、ＬｉＢｒ、ＬｉＣｌ、尿素、ヘキサフルオロイソプロパノール、塩酸グアニジン、及び同様の変性剤中で再可溶化できることを見出した。絹タンパク質が可溶化すると、尿素を含むより強力でない変性剤を用いてタンパク質が再沈殿しないようにすることができる。糸に不可逆的に紡績する前に、溶解タンパク質を使用することが好ましそうである。それ故、完全に乾燥した絹タンパク質から再可溶化された絹タンパク質、及び発酵方法からの回収後完全には乾燥していない絹タンパク質は、紡績操作のために推奨される。絹タンパク質の織物への更なる加工絹の一般的加工カイコからの絹タンパク質は典型的には、以下のように加工される。織るために十分に強い絹繊維を作出するために、最大５本の繊維を一緒に織る。最初のリール後、絹をかせ上に再巻きし、それらを一緒に織る。次に、生の絹は、スローイングという幾つかの方法にかけられる。かせを洗浄し、乾燥し、大きなスプール又はボビン上に巻く。これらのボビンを二重枠上に置き、そこで一本鎖を二重にし、一緒に織り、所望の糸サイズを得る。次に、この糸を織り、スローイングフレームの紡錘で引張る。次に、スローイングフレームからの絹のボビンを水中に置き、絹をローラーの間で引張る。スローイングフレームでの伸長の程度は繊維の直径に影響を与える。ストレッチングフレーム上で、糸を滑らかに、一様にする。最終的に布が織られる前に、スローイングされた絹糸を煮沸し、残りの水溶性タンパク質又は他のゴム状物質を除去する。煮沸工程で、絹の重量が小さくなるので、損失重量の幾分かを取り戻すために、鉄塩又はスズ塩に浸す。この浸し工程の間、絹繊維はこれらの塩の幾分かを取り入れ、より重くなるが、つやは失わない。クモ絹タンパク質の特定の加工上記方法で産生されたクモ絹タンパク質は、カイコタンパク質と同じように織物に加工できる。このためには、タンパク質又はタンパク質溶液の紡績又は押出しが必要であり、直径５〜２００μｍ以上の範囲でありうる絹フィラメントを得ることができる。方法の第１工程は、発酵溶液からの絹タンパク質の濃縮である。この濃縮工程は、一定の分子量範囲の物質のみが通過できる膜技術の使用を含む幾つかの方法で行うことができる。これらの膜を使用する一つの欠点は費用である。絹タンパク質の濃縮と宿主ベクターの除去のための費用の点でより有効な他の方法には、連続遠心分離又はバッチ遠心分離がある。更に、超音波エネルギーを使用して細菌細胞壁を溶かすことができ、細胞壁内に生産された絹タンパク質を水性培地に逃すことができる。細菌細胞壁から絹タンパク質を分離するために、塩濃度が高いことが望ましい。この時点で、タンパク質溶液を、種々のアルコールにより培地から沈殿させることができる。有用なアルコールには、メタノール、イソプロパノール及びエタノールなどがある。従来技術は、この方法のこの時点で、絹タンパク質は、リチウム塩とフッ素を含む有機溶媒に溶解させることができることを教示する。しかし、その方法は高価であり、重大な環境に対する挑戦である。本発明のより好適な実施態様では、アルコール又は膜フィルターを用いてクモ絹タンパク質を濃縮し、クモ絹タンパク質が押出しを受けるまで、超音波と組合せて、塩化ナトリウム水溶液を用いて粘性形態の溶液中に維持する。必要ならば、尿素、水酸化ナトリウムと水酸化カリウム又はリチウム塩を、従来技術の方法で開示されたように、加えることができる。しかし、塩化ナトリウムと超音波のせいで、これらの物質のすこぶる低い濃度だけを使用する必要がありうる。精製の間の過度に高い超音波エネルギー、長い超音波の使用、又はリチウム塩の高モル濃度は、絹タンパク質の分子量を減少させるおそれがあることに注意すべきである。小直径フィラメントを産生する小直径チューブ又は他の方法を用いて、タンパク質が押出しを受けると、タンパク質は、カイコ絹と同様に加工することができる。タンパク質が空気に曝され、乾燥すると、もはや塩化ナトリウム中で、又は超音波によって溶けない。カイコのために使用するのと同様の装置を使用して、絹タンパク質の前段階伸長又は撚りを行うことができる。カイコのために使用するのと同様な煮沸も使用できる。煮沸による重量損失の大部分はカイコ繊維でのように水溶性タンパク質ではなく、発酵培地からの残りの塩及び水溶性栄養物である。この加工工程の間、生カイコ絹では２０〜２５％の重量損失が普通であるが、煮沸水に曝して、最終絹をきれいにするとき、又は染色のためにそれを調製するとき、本発明のクモ絹では５％未満の重量損失が予想される。本発明の方法を用いて、更にゲノムＤＮＡにコードされたプライマーを選別することによって、絹タンパク質の天然色を得ることができる。本発明のクローンと方法から生産されたクモ絹タンパク質で、白、黄、ピンク及び明紫色が得られた。天然色の選別は織物の製造には価値が高い。何故ならば、多くの場合に、染色の必要性と関連費用を無くすからである。２本以上の糸を一緒に巻くか、撚って、大きい紡ぎ糸を作出することによって、クモ絹タンパク質フィラメントは、カイコ絹と同様に処理できる。更に、これらの紡ぎ糸は、炭素もしくはグラファイトファイバー、ホウ素もしくはホウ素被覆グラフ具又は他の適用のための異常に高い強度の織った材料を作出できる。逆に、３〜５本のフィラメントと純粋のクモ絹だけからなる小さい紡ぎ糸を用いて、非常に滑らかな感触とつやのある織物を製造できる。最終的織物の弾性と他の性質は、押出し方法又は紡績方法後のフィラメント又は繊維の加工によって部分的に制御できる。カイコ加工からの方法パラメーターの大きな変化は、個々のフィラメントの前もっての伸長又は引っ張りの程度である。何故ならば、個々のフィラメントは、最初のタンパク質溶液から、又はカイコ産業で標準的な撚り工程で後に引張られているか、又は押出されているかだからである。上記に加えて、クモ絹タンパク質フィラメントの高強度性質には他の加工変数がある。一つのこのような方法変数は、色、増強強度、つや、真珠光沢、及び外観、感触、もしくは強度に基づき、織物の市販性を増す他の質を与える種々の物質を用いる絹糸のオンライン被覆である。オンライン被覆は、押出し工程、再巻き工程、もしくは撚り工程の間に、クモ絹フィラメントを種々の浴又はトラフに通すことを含む幾つかの方法で行うことができる。絹タンパク質上への材料のオンライン蒸気沈着は、フィラメントが最初に形成されるときに、残りの塩又は他の発酵化合物が存在しうるということを考慮にいれなければならない。更に、これらのフィラメントは、オーブン、ファン、もしくは他の方法によって乾燥されなければ、形成後湿ったままでありがちである。ある場合には、押出し後の煮沸が、発酵培地の痕跡の全てと再可溶化化学薬品（両方とも、織物に織られたときに皮膚からアレルギー反応をもたらしうる）を除去するために好ましい。クモ絹タンパク質上に蒸気沈着できる材料には、酸化スズと酸化チタンなどがある。これらの酸化物は、フィラメント上に層を形成し、その厚さはオーブン条件による。チタン被覆により高強度繊維が産生されうるが、二酸化チタン被覆にアレルギー反応が起るヒトもいるし、このことにより、衣服以外の適用のための使用が制限されうる。しかし、酸化チタンは、ヒトの皮膚接触のためのＧＲＡＳ（安全であると一般的に推奨される）であり、それ故、衣服適用に使用できる。クモ絹タンパク質のフィルムは、キャスティング（絹タンパク質溶液をシートに注ぎ、広げる）を含む幾つかの方法によって、又はローラーを使用して製造できる。キャスティング又はローリングの前に、化合物をタンパク質に添加してフィルムを修飾することもできる。これには、芳香剤、風味剤、吸収剤、又は種々の生物的物質と生物的武器への反応剤として働きうる活性物質の導入がある。フィルムは、加工の間に加えられた色をも有しうるし、又は絹クローンタンパク質からの天然色を選択して、天然色を与えることができる。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９７年３月１７日【補正内容】８．絹をコードするＤＮＡフラグメントを濃縮するために、支持体に可逆的に結合する配列（ｉ）〜（XX）を有するＤＮＡプローブへのハイブリダイゼーションによって標的ＤＮＡを選別することを特徴とする請求項７に記載の方法。９．標的ＤＮＡフラグメントが少なくとも５ｋｂであることを特徴とする請求項６に記載の方法。１０．削除１１．削除１２．クモが、Micrathena 属、Mastophora 属、Metepeira 属、Araneus 属、 Argiope 属、Nephila 属又は Gasteracantha 属であることを特徴とする請求項１４に記載の方法。１３．クモが Nephila clavipes であることを特徴とする請求項１４に記載のＤＮＡ。１４．図１に示す配列を含むクモ絹タンパク質をコードするＤＮＡ配列。１５．多重重合方法であって、絹生産クモから得られる絹タンパク質をコードする標的ＤＮＡを選別すること、但し標的ＤＮＡは複数の反復及び非反復領域を含む；異なるＤＮＡプライマーの第１のペアを選別すること、但しＤＮＡプライマーの第１のペアの両方が標的ＤＮＡの一領域に相補的であり、ＤＮＡプライマーの第１のペアの少なくとも一つが配列（ｉ）〜（XXVi）異なるＤＮＡプライマーの第２のペアを選別すること、但しＤＮＡプライマーの第２のペアの少なくとも一つが、ＤＮＡプライマーの第１のペアの配列の両方とは異なり、ＤＮＡプライマーの第２のペアの少なくとも一つが配列（ｉ）〜（XX ）によって表される；ＤＮＡプライマーの第２のペアを融解された標的ＤＮＡと混合し、混合したＤＮＡプライマーと標的ＤＮＡを、ヌクレオチド及び校正能力を有するＤＮＡポリメラーゼとインキュベートし、第２のＤＮＡフラグメントを生産させることを繰返すことによって第２のＤＮＡフラグメントを生産させること、但し第２のＤＮＡフラグメントは第１のＤＮＡフラグメントとは異なり、また標的ＤＮＡに相補的であり、少なくとも２ｋｂである；第１と第２のＤＮＡフラグメントの制限部分を多重重合ＤＮＡに再結合させること、但し多重重合ＤＮＡはクモ絹タンパク質をコードし、少なくとも４ｋｂである；を更に含む該多重重合方法。１６．全てのＤＮＡプライマーが配列（ｉ）〜（XXVi）によって表されることを特徴とする請求項１５に記載の多重重合方法。１７．全てのＤＮＡプライマーが異なることを特徴とする請求項１６に記載の多重重合方法。１８．多重重合ＤＮＡが少なくとも６ｋｂであることを特徴とする請求項１５〜１７のいずれかに記載の多重重合方法。１９．多重重合ＤＮＡが少なくとも８ｋｂであることを特徴とする請求項１８に記載の多重重合方法。２０．絹タンパク質の生産方法であって、請求項１４に記載のＤＮＡを選別すること；該ＤＮＡを発現ベクターに挿入すること；宿主細胞に該発現ベクターをトランスフェクトすること；トランスフェクトした宿主を培養培地で発酵させ、絹タンパク質を生産させること；及び該絹タンパク質を回収すること；の各工程を含むことを特徴とする該方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｑ 1/68 ＡＤ０１Ｆ 4/02 Ｄ０１Ｆ 4/02 Ｄ０３Ｄ 15/00 Ｄ０３Ｄ 15/00 ＡＤ０６Ｍ 11/46 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者エリオン，グレン・アールアメリカ合衆国、マサチユーセツツ・ 02633、チヤタム、メイン・ストリート・ 442

Claims

【特許請求の範囲】１．絹タンパク質をコードするＤＮＡフラグメントの生産方法であって、絹生産クモから得られる標的ＤＮＡを選別すること、但し標的ＤＮＡは複数の反復及び非反復領域を含むこと；標的ＤＮＡ中の一領域に相補的なＤＮＡ配列を有する少なくとも１０個のヌクレオチドの一本鎖のＤＮＡプライマーを選別すること；及びＤＮＡプライマーを融解された標的ＤＮＡと混合し、混合したＤＮＡプライマーと標的ＤＮＡを、ヌクレオチド及び校正能力を有するＤＮＡポリメラーゼとインキュベートし、該ＤＮＡフラグメントを生産させることを繰返すこと、但し該ＤＮＡフラグメントは標的ＤＮＡに相補的で、少なくとも２ｋｂである；の各工程を含むことを特徴とする該方法。２．２種の異なるＤＮＡプライマーを使用する工程を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。３．標的ＤＮＡが、クモ絹をコードする完全長のｍＲＮＡの逆転写によって作出されるｃＤＮＡであり、その作出された第１鎖のｃＤＮＡのアミノ末端にプライマー部位を加え、第１のポリメラーゼプライミング領域としてｃＤＮＡのポリｄＴ領域を使用することを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。４．第２のプライマー部位を、連結カセットを用いてＤＮＡの未知末端に作出することを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。５．ポリｄＴ、ポリｄＡ、ポリｄＧ、及びポリｄＣからなる群から選択されるプライマー部位を作出するために、第２のプライマー部位を、末端トランスフェラーゼを用いてＤＮＡの未知末端に作出することを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。６． Micrathena属、Mastophora属、Metepeira属、Araneus属、Argiope属、Nep hila属又はGasteracantha属のクモを選別する工程を含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。７．配列（ｉ）〜（XX）（式中、Ｎ＝Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃ；Ｖ＝Ｇ、Ａ、Ｃ；Ｂ＝Ｇ、Ｔ、Ｃ；Ｈ＝Ａ、Ｔ、Ｃ；Ｄ＝Ｇ、Ａ、Ｔ；Ｋ＝Ｇ、Ｔ；Ｓ＝Ｇ、Ｃ；Ｗ＝Ａ、Ｔ；Ｍ＝Ａ、Ｃ；Ｙ＝Ｃ、Ｔ；Ｒ＝Ａ、Ｇ）によって表されるプライマーＤＮＡを選別する工程を含むことを特徴とする請求項６に記載の方法。８．絹をコードするＤＮＡフラグメントを濃縮するために、支持体に可逆的に結合する配列（ｉ）〜（XX）を有するＤＮＡプローブへのハイブリダイゼーションによって標的ＤＮＡを選別することを特徴とする請求項７に記載の方法。９．標的ＤＮＡフラグメントが少なくとも５ｋｂであることを特徴とする請求項６に記載の方法。１０．クモの絹タンパク質をコードするＤＮＡ配列であって、複数の反復及び非反復領域を含み、少なくとも２ｋｂの長さを有することを特徴とする該ＤＮＡ配列。１１．ＤＮＡ配列が少なくとも５ｋｂの長さを有することを特徴とする請求項１０に記載のＤＮＡ。１２．クモが、Micrathena属、Mastophora属、Metepeira属、Araneus属、Argi ope属、Nephila属又はGasteracantha属であることを特徴とする請求項１０又は１１に記載のＤＮＡ。１３．クモがNephila clavipesであることを特徴とする請求項１１に記載のＤＮＡ。１４．ＤＮＡが図１に示す配列を含むことを特徴とする請求項１２に記載のＤＮＡ。１５．多重重合方法であって、絹生産クモから得られる絹タンパク質をコードする標的ＤＮＡを選別すること、但し標的ＤＮＡは複数の反復及び非反復領域を含む；異なるＤＮＡプライマーの第１のペアを選別すること、但しＤＮＡプライマーの第１のペアの両方が標的ＤＮＡの一領域に相補的であり、ＤＮＡプライマーの第１のペアの少なくとも一つが配列（ｉ）〜（ XXVi）によって表される；ＤＮＡプライマーの第１のペアを融解された標的ＤＮＡと混合し、混合したＤＮＡプライマーと標的ＤＮＡを、ヌクレオチド及び校正能力を有するＤＮＡポリメラーゼとインキュベートし、第１のＤＮＡフラグメントを生産させることを繰返すことによって第１のＤＮＡフラグメントを生産させること、但し第１のＤＮＡフラグメントは標的ＤＮＡに相補的であり、少なくとも２ｋｂである；の各工程を含み、異なるＤＮＡプライマーの第２のペアを選別すること、但しＤＮＡプライマーの第２のペアの少なくとも一つが、ＤＮＡプライマーの第１のペアの配列の両方とは異なり、ＤＮＡプライマーの第２のペアの少なくとも一つが配列（ｉ）〜（XX ）によって表される；ＤＮＡプライマーの第２のペアを融解された標的ＤＮＡと混合し、混合したＤＮＡプライマーと標的ＤＮＡを、ヌクレオチド及び校正能力を有するＤＮＡポリメラーゼとインキュベートし、第２のＤＮＡフラグメントを生産させることを繰返すことによって第２のＤＮＡフラグメントを生産させること、但し第２のＤＮＡフラグメントは第１のＤＮＡフラグメントとは異なり、また標的ＤＮＡに相補的であり、少なくとも２ｋｂである；第１及び第２のＤＮＡフラグメントを制限切断し；第１と第２のＤＮＡフラグメントの制限部分を多重重合ＤＮＡに再結合させること、但し多重重合ＤＮＡはクモ絹タンパク質をコードし、少なくとも４ｋｂである；を更に含む該多重重合方法。１６．全てのＤＮＡプライマーが配列（ｉ）〜（XXVi）によって表されることを特徴とする請求項１５に記載の多重重合方法。１７．全てのＤＮＡプライマーが異なることを特徴とする請求項１６に記載の多重重合方法。１８．多重重合ＤＮＡが少なくとも６ｋｂであることを特徴とする請求項１５〜１７のいずれかに記載の多重重合方法。１９．多重重合ＤＮＡが少なくとも８ｋｂであることを特徴とする請求項１８に記載の多重重合方法。２０．絹タンパク質の生産方法であって、請求項１２に記載のＤＮＡを選別すること；該ＤＮＡを発現ベクターに挿入すること；宿主細胞に該発現ベクターをトランスフェクトすること；トランスフェクトした宿主を培養培地で発酵させ、絹タンパク質を生産させること；及び該絹タンパク質を回収すること；の各工程を含むことを特徴とする該方法。２１．培養培地がプロテアーゼ阻害剤を含むことを特徴とする請求項２０に記載の方法。２２．超音波エネルギーをかけ、宿主細胞を破壊すること；超音波エネルギーをかけ、絹タンパク質を再懸濁すること；及び破壊された宿主細胞を遠心分離し、細胞膜を絹タンパク質から分離すること；の各工程を更に含むことを特徴とする請求項２１に記載の絹タンパク質の生産方法。２３．限外濾過又はアルコール沈殿による絹タンパク質の精製工程を更に含むことを特徴とする請求項２２に記載の絹タンパク質の生産方法。２４．請求項２３に記載の精製絹タンパク質を濃縮すること；濃縮された絹タンパク質の繊維を引張ること；絹繊維を紡ぎ、絹糸を生産すること；及び絹糸を洗浄し、可溶化薬剤を除去すること；の各工程を含むことを特徴とする絹タンパク質の紡績方法。２５．可溶化薬剤が、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、ヘキサフルオロイソプロパノール、塩酸グアニジン、尿素、リン酸尿素、リチウム塩、有機溶媒、硫酸アンモニウム、酢酸、リン酸、ジクロロ酢酸、ギ酸、及び硫酸からなる群から選択されることを特徴とする請求項２４に記載の絹紡績方法。２６．絹繊維又は絹糸を、酸化スズ又は酸化チタンで被覆する工程を更に含むことを特徴とする請求項２４に記載の絹紡績方法。２７．請求項２４に基づき作出された絹糸を含む織物。更に含むことを特徴とする請求項２７に記載の織物。