JPH11511643A - 遺伝子工学処理された細胞の条件的形質転換 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、二量体または多量体の好ましくは非ペプチドリガンドによるキメラタンパク質の多量体化に関する材料、方法および応用に関する。本発明の態様は、増殖ファクターに依存せずに幹細胞増殖を可能にする幹細胞のリガンド媒介トランスフォーメーション（形質転換）により例示される。

Description

【発明の詳細な説明】 遺伝子工学処理された細胞の条件的形質転換技術分野 本発明は、キメラ蛋白質を二量体または多量体の、好ましくは非ペプチドの、 リガンドで多量体化することに関する材料、方法および用途に関する。本発明の 側面は具体的には、成長因子に非依存的に細胞を増殖させる、細胞のリガンド媒 介トランスフォーメーションである。背景 宿主と免疫的に適合する骨髄を得るのが困難であることは、骨髄移植の有用性 を大きく制限している。不適合な骨髄は合併症を起こし、これはしばしば費用が かかり、また衰弱を生じさせるものであり患者の約20％が死に到る。これらの合 併症の殆どはオートロガス骨髄の使用により避けることができよう。このためヒ ト骨髄を培養する方法の開発が注目されてきた。かかる努力は、骨髄幹細胞の通 常とは異なる増殖法のため、あまり成功しなかった。現在まで、真正な多機能性 の幹細胞の培養を維持しうる細胞成長因子は見出されていない。いわゆる幹細胞 成長因子は、真正幹細胞よりも数段階多く分化し、従って特定の造血リネージ(l ineage)に供される細胞の増殖を実際に促進する。 一方、ガン治療における臨床研究とは別に、蛋白質の化学的誘導による二量体 化に基づく生物スイッチが開発されてきた。その研究の態様は、Spencer et al ，1993年11月12日，Science 262:1019-1024 および国際出願 PCT/US93/01617 お よび PCT/US94/08008(この３つの内容は参照としてここに援用する)に開示され ている。 ここでは、特に上記蛋白質の化学的誘導による二量体化により、悪性腫瘍のア ジュバント治療のための、幹細胞などの細胞の増殖維持に使用できる方法および 材料が記載される。これらの方法は、種々の細胞の条件的増殖を生じさせ、そし て特に、造血性幹細胞、Ｔ細胞およびマクロファージの子孫を、必須のウイルス 性蛋白質を細胞の分解経路に向かわせることによりHIV に抵抗性とするために使 用できる。 興味ある背景技術の情報をさらに開示している説明的文献は、PCT/US93/01617 、特に１〜４頁に示されている。しかし、この開示からも明らかなように、これ まで誰も本発明を記載あるいは示唆していない。本発明の要約 本発明は、細胞およびその子孫が条件的トランスフォーメーションを受けやす くなるようにするために宿主を遺伝的に操作するための材料および方法を提供す る。好ましくはこの細胞は哺乳動物由来、より好ましくはヒト由来であり、最終 的に分化していない、例えば造血幹細胞などの幹細胞または皮膚細胞である。か かる遺伝的操作および条件的トランスフォーメーションの方法は例えば上記細胞 集団の増殖に有用である。操作された細胞、またそれらを含む生物は臨床用途に おいてまた種々の研究および製造目的の生物学的試薬として有用である。 本発明は、生きている細胞において遺伝子転写またはその他の生物学的事象を 引き起こすために、キメラ「リスポンダー(responder)」蛋白質のホモおよびヘ テロ多量体化を用いる方法および材料の適用に関する（ここで用いる多量体、多 量体化する、および多量体化という用語は二量体、三量体およびより高次の多量 体およびその生成を含む）。キメラリスポンダー蛋白質は、対応する多量体化剤 （例えばFKBPドメインの場合のFK1012分子）に結合しうる、１またはそれ以上の 特異的受容体ドメイン、例えばFK506 結合蛋白(FKBP)ドメインを含む細胞内で発 現される融合蛋白質である。多量体化剤は、１以上のキメラ蛋白質分子上の受容 体ドメインに結合しうる多価リガンドである。キメラ蛋白質分子の１以上へのこ のような結合はキメラの二量体またはより高次の多量体を生じる。これらのキメ ラ蛋白質は対応する多価リガンドの結合ドメインを含むためにこのように多量体 化しうる。多量体化可能なキメラは受容体ドメインの他に別の１またはそれ以上 のドメインを含む。この別のドメインは、cDNA結合ドメイン、転写活性化ドメイ ン、膜標的ドメイン（例えばミリストイル化ドメイン）、細胞破壊ドメイン、単 鎖抗体（ScFV）のようなドメインまたはその他のドメインであってもよい。キメ ラ蛋白質は、リガンド媒介多量体化が、多量体化に応答性のDNA 要素の転写制御 の下でのトランスフォーメーション遺伝子の転写、腫瘍抑制もしくはウイルス蛋 白質の破壊、核もしくは細胞の膜などのトランスフォーメーション活性を担う細 胞内部位へトランスフォーメーション遺伝子産物を導くなどの生物学的事象を引 き起こすように設計される。 本発明の種々の態様での使用に適用できる、リガンドおよびリガンド結合性ド メイン、また制御された転写やその他の生物学的事象のための成分および方法は 、国際出願 PCT/US93/01617 および PCT/US94/08008、またSpencer et al，Scie nce,1993(この内容は参照としてここに援用する)に詳細に開示されている。図面の簡単な説明 図１ （Ａ）キメラ可溶性で膜結合した Sos分子の構築．アミノ酸残基２〜1333を含む 、hSos全長についてのプラスミドコード配列を、真核発現ベクター pBJ5 の誘導 体の Xho 1-Salサイトにおけるv-Src ミリストイル化の標的ドメイン(残基1-14) の直ぐ下流でクローン化し(Spencer et al.(1993),Science 262，1019-1024;Pru schy et al.(1994)Chemistry & Biology 1，163-172)、MSosE を得た。可溶性構 築物SSosE は、ミリストイル化配列の欠けた同一のpBJ5- 誘導ベクターにhSosを 配置することによって構築された。hFKBP(Gulbins et al(1993)Science 260，82 2-825)から誘導されたFKBP12モジュールを、(Spencer et al.,1993，supra)に記 述されているようなPCR によって増幅し、そして３つの縦列コピーをSSosEの Xh o 1サイトにクローン化して、SF3SosE を得た。このFKBP12モジュール分子を、 前述のベクターにおけるミリストイル化の標的ドメインの下流の３縦列デムコピ ーでクローン化して、MF3Eを得た。構築物はいずれも蛋白検出を促進するＣ末端 インフルエンザHAエピトープ標識を含んでいる。構築物の完全性は、ジオキシ配 列 S,Sal 1; X，Xhol 1，Sc,Sac II; E,Eco R1によって証明された。 （Ｂ）膜標的SosによるＴ細胞シグナル形質導入の活性化．Jurkat-TAg細胞(10⁷) を、2 μg のNF-AT-SX分泌アルカリホスファターゼ(SEAP)リポータープラスミド 、および8 μg のMSosE、SSosE、4 μg の構成的に活性なv-Ha-Rasまたは優性陰 性な(dominant negative)Ras の RSVN17Rasのいずれかをを使って、またはベク ター単独の対照によりトランスフェクションさせた。いずれのトランスフェクシ ョンにあっても、いずれも等しいモル量のプラスミドがトランスフェクションさ れ、ベクターDNA を使用してDNA トランスフェクション量を一定とした。24時間 のトランスフェクションの後に各トランスフェクションからの10⁵細胞の部分を 、培地単独、増殖培池200 μｌ中のイオノマイシン(１μM)、またはイオノマイ シン＋PMA(25 ng/ml)でさらに20時間刺激した。刺激に続いて培池をSEAP活性に ついて試験した。(Gulbins et al(1994)Mol.Cell Biol 14,906-913)。データは 、イオノマイシン＋PMA で刺激したトランスフェクションからの細胞(100％ )に対するイオノマイシン単独で刺激したときの活性の割合で示す。データは少 なくとも３回の別々に行った試験の平均を示し、平均＋SEM としてプロットして ある。構築物の発現を証明するために、上記トランスフェクションからのサンプ ルをRIPA緩衝液に溶解し、HAエピトープ標識に特有の12CA5 mAb を使用して免疫 沈降させ、SDS-PAGE、次いで免疫ブロッティングによって分析した。 (Ｃ))ミリストイル化したSos はカルシウム依存性のシグナルリング事象と協働 する。Jurkat-TAg細胞は、2 μg のNIAT-SX、0.2 μg の構成的に活性なカルシ ネウリンCNMUT2B(Clipstone，N.A.&Crabtree,G.R.(1993)Annals New York Acad. Sci.696,20-30; O'Keefe at al(1992)Nature 357,692-695.)、および4 μg のv- Ha-Ras，8 μg のMSosE、SSosE のいずれか、またはベクターだけを使って共ト ランスフェクションした。SEAP活性への刺激および分析は（Ｂ）で述べたように して行った。活性は、各トランスフェクションのサンプルについて、PMA で刺激 したときの活性に対して培池だけの刺激をしたときの割合で示す。 （Ｄ）膜標的Dbl およびVav はＴ細胞におけるシグナル形質導入を活性化させな い。Jurkat-TAg細胞は、（Ｂ）で述べたようにして、2 μg のNFAT-SX リポータ プラスミド、および8 μg の指示発現プラスミドMDblE、McVavE、およびScVavE を使って共トランスフェクションさせ、刺激し、そしてSEAPについて分析した。 MDblEは腫瘍形成(oncogenic)Dblからのアミノ酸残基２〜498 を含んでおり、ま たMcVavEとScVavEは、図１Ａにおいて述べたように、ミリストイル化され可溶化 されたベクタにクローン化された、全長Vav プロト腫瘍形成遺伝子の残基２〜84 5 を含む。活性はこの場合にも、イオノマイシン＋PMA で刺激した細胞に対して イオノマイシンだけで刺激したときの活性の割合でもって示している。エピトー プ標識構築物の発現は（Ｂ）におけると同様にして証明された。アステリシク記 号は12CA5抗体によって認識される非特定バンドを示す。図２ 可溶性でミリストイル化されたSos は、明確な細胞下局在化を示す。Cos-1 細 胞は、カバーグラスの上で、SSosE（A,B）またはMSosE(C,D)発現プラスミドによ ってトランスフェクションされ、12CA5 mAb およびFITC接合されたウサギ抗マウ ス二次抗体によって固定され、染色され、そして共焦顕微鏡によって観察され た。MSosE は細胞膜に主として局在しており、SSosE はサイトゾル性のままであ る。図３ （Ａ）Ｃ末端プロリン富化領域に変異を含むSos 分子の構築。PCR 媒介サイト特 異性ほ突然変異誘発を利用して、図示のアミノ酸を含有するプロリン富化配列の 一方または両方を、図示のようにアラニンに変化させ、SH3 結合に対するコンセ ンサスを破壊した。これらの突然変異体の位置を、触媒領域およびプレックスト リン(pleckstrin)ホモロジィ領域(PH)に関して示す。Sos の変更バージョンは第 １図において述べたベクターにクローン化され、MSosP1E およびMSosP1,2E を発 生させる。 （Ｂ）突然変異のＣ末端のプロリン富化領域をもった膜結合Sos 分子はもはやＧ rb-2には結合しない。Jurkat-TAg細胞は図示の膜結合Sos 構築物と、またはベク ター単独と共トランスフェクションし、過剰の可溶性Grb-2 は高い発現水準でpB J5にクローン化され、12CA5 抗体によって二重に(in duplicate)免疫沈降され、 そしてSDS-PAGEによって分析された。サンプルは、Sos 構築物を検出するために は12CA5 によって、また共沈したGrb-2 の存在を検出するためには抗-Grb-2 mAb によって免疫ブロッティングされた。 （Ｃ）膜結合Sos はGrb-2 の相互作用に影響は受けない。Jurkat-TAg細胞は、2 μg のNFAT-SX、および8 μｇの図示MSosE 突然変異体によってコトランスフェ クションされた。SEAP活性の刺激および分析は第１図に説明したようにして行っ た。データは、各トランスフェクションについて、イオノマイシン＋PMA で刺激 したときの活性に対してイオノマイシンだけで刺激したときの活性の割合で示す 。図４ （Ａ）FK1012 を使用してSos のGrb-2 誘導局在化の役割を模す。上欄: Grb-2 の Sos を細胞膜に局在化させる時の提案された生理学上の役割。下欄:FK1012 が細 胞膜でキメラSos/FKBPのミリストイル化FKBPへの局在化を誘導する。 （Ｂ）Sos の誘導可能な膜局在化によるRas の活性化。Jurkat-TAg細胞を２μg NF-AT-SX、９μg SF3SosE または4.5 μg(モル当量)SF3E、および１μg MF3Eで 共トランスフェクションした。トランスフェクションから24時間後に、細胞をイ オノマイシン＋図示の1012希釈液で20時間刺激し、細胞上清を図１で説明したSE AP活性について分析した。データは、各トランスフェクションサンプルについて 、イオノマイシン＋PMA で刺激した後の活性化に対するイオノマイシン＋FK1012 で刺激した後の活性化の％として示す。全部のFKBP含有構築物の発現がイムノブ ロッティングえ確認された。Sos の誘導可能な膜局在化によるRas の活性化は、 優性陰性Ras により阻害される。イオノマイシン＋図示のKF1012希釈液を、4 μ g 優性陰性Ras または４μg ベクター対照のいずれかで（Ｂ）に記載のように共 トランスフェクションしたJurkat-TAg細胞に添加した。活性化を（Ｂ）に記載の ように示す。 （Ｄ）Grb-2 の誘導可能な局在化はRas を活性化しない。イオノマイシン＋図示 のKF1012希釈液を、2 μg NF-AT-SX、4 μg SF3GrbE または4 μg SF3Eと、1 μ g MF3Eとで共トランスフェクションしたJurkat-TAg細胞に添加した。活性化を、 （Ｂ）に記載のように示す。図５ （Ａ）キメラ細胞内シグナリング分子の構築。Src 群キナーゼ−FKBP12の図式を 誘導可能な膜の標的化（ターゲッティング）に対して使用した。Src 群キナーゼ を図示のようにＣ末端チロシン残基の突然変異により調節解除し、Ｎ末端ミリス トイル化標的ペプチドのトランケーション(truncation)により不活性化する。SF 1ΔSH3Fynは残基１〜144 を持たず、SF1ΔSH31SH2Fynは残基１〜254 を持たず、 そしてSF1ΔK3Fyn はK296E 置換を有する。膜標的は、これらの修飾キナーゼをF KBP12標識(tagging)ベクターMF1E（ミリストイル化）またはSFIE（サイトゾル性 ）中にサブクローニングすることにより達成される。 Ｍ：v-src(残基１〜14)(Spencer et al，1993 supra; Cross，1984，MCB)、 Ｓ：可溶性非ミリストイル化、 Ｕ：ユニークドメイン、 ｅ：インフルエンザ赤血球凝集素エピトープ標識（Field et al，1988，MCB）、 テイル(TAIL)：Ｃ末端調節性ペプチド。 （Ｂ）CD45タンパク質−チロシンホスファターゼおよびCsk PTK によるLck/Fyn の調節のモデル。CD45タンパク質−チロシンホスファターゼによるＣ末端ホスフ ェートの除去は、Lck/Fyn チロシンキナーゼ阻害を軽減し、下流シグナリングを 可能にする（Weiss，A.Y.，Littman,D.R．（1984）Cell 76，263-274からの修正 ）。 （Ｃ）合成リガンドによる誘導可能な膜標的化のモデル。 左：SRC 群キナーゼを、その膜標的モチーフをFKBP12により置換して不活性化 した。 右：膜透過性FK1012の添加により、チロシンキナーゼを細胞膜ドッキングタン パク質MF1 にリクルートさせ、生物学的応答を誘発。 Ｙ＝チロシン、ＹＰ＝リンチロシン。図６ Src 群キナーゼの膜標的による合成二量体を使用した誘導可能なシグナリング 形質導入。 （Ａ）二量体リガンドFK1012がSF1Fynを細胞膜ドッキングタンパク質MF1Eにリク ルートする能力を、Jurkat-TAg細胞中のNF-AT 応答性リポータープラスミドNF-A T-SXの誘導によりアッセイする（Clipstone and Crabtree，Nature，1992，Nort hrup et al，1993，Nature）。これを、野性型Fyn(SF1Fynwt)またはサイトゾル 性FKBP12（SE1E）のFK1012依存性リクルートに比較する。 （Ｂ）FK1012が複数のSrc 群メンバーを細胞膜ドッキングタンパク質MF3Eに標的 化する能力を、対照タンパク質SF1Eと比較した。 （ＣおよびＤ）そほSH3(ΔSH3)、SH3 とSH2(ΔSH3,2)、またはキナーゼ（ΔＫ） 領域を持たない各種Fyn(Ｃ)またはLck(Ｄ)変異体のシグナリング能力を、FK1012 による膜標的化により、親構築物SF1Fyn（Ｃ）またはSF1Lck（Ｄ）と比べる。対 照として、ミリストイル化FKBP-Lck(MF1Lcvk)によるCID に依存しないシグナリ ングを示す。全部の構築物を、インフルエンザ赤血球凝集素エピトープ（Cross ，1984，MCB）に対して12CA5 mAb を用いたウェスタンブロットによりアッセイ したとこと、同様に発現させた。図７ Src 群キナーゼの条件的活性化がTCR シグナリングを模す。CID 誘導Fyn（A） またはLck（B）による転写因子(Spencer et al，1993)のパネルの誘導の比較。 （C）優性−陰性Ras(RSV-N17Ras、2 μg)またはFK506（2 ng/ml）がFyn またはL ck の300 nM FK1012 による膜リクルートによるNF-AT 活性化をブロックする能 力。 （D）1 μm FK1012を使用したFyn およびLck による活性化の動力学の、ミトゲ ンまたは直接TCR 架橋（材料および方法の欄を参照）によるそれに対して検査。図８ SF1Fynの膜リクルートが、TCR 複合体から独立してシグナリングを活性化。 （A）Fynのシグナリング能力をJurkat-TAg細胞のTCR 変異体，J.RT-T3.5（Weiss ，A & Stobo，J．(1984)，J．Exp．Med．160,1284-1299）中で、NF-AT の誘導を アッセイすることにより検査した。 （B）Fynまたはキナーゼ欠損Fyn(SF1FynΔK)のシグナリング能力を、AP-1の誘発 をアッセイすることにより非T COS 細胞中で検査。（挿入部）12CA5 抗赤血球凝 集素 mAbを用いた上記トランスフェクションからのサンプルのウェスタンブロッ ト。 １またはそれ以上のトランスフォーメーション遺伝子の調節的発現 本発明のある態様においては、例えば、国際出願 PCT/US93/01617 および PCT /US94/08008、またSpencer et al，Science,19993に開示された調節的転写の手 法を応用して、予め定めたリガンドの存在に応答性の転写制御要素の発現制御の 下で１またはそれ以上のトランスフォーメーション遺伝子を含み、これを発現し うるように細胞を操作する。 ここで用いる場合、トランスフォーメーション遺伝子は２種類からなることが ある。第１のものはmyc、fos、mybなどのトランスフォーメーション蛋白質をコ ードするDNA 配列であり、そのトランスフォーメーション能は過発現による。こ れらのトランスフォーメーション遺伝子は、以下に説明するように、制御された 発現のために所望の転写調節要素に連結していてもよい。トランスフォーメーシ ョン遺伝子の第２の種類は、ras、raf、sosやscr 様チロシンキナーゼなどの蛋 白質をコードし、そのトランスフォーメーション活性は、細胞膜に位置している ことおよび／または活性化蛋白質の物理的近接により誘導されうるアロステリッ ク変化によるものである。Src 様キナーゼの場合は、トランスフォーメーション 遺伝子を含むDNA 配列は少なくともsrc 群のキナーゼ部分の活性型を含む蛋白質 をコードする。第２の種類のトランスフォーメーション遺伝子、例えばras、raf 、sos、活性化キナーゼ等は細胞内標的ドメインをコードするDNA 配列に結合し たキメラ遺伝子として制御されて発現する。かかる場合のトランスフォーメーシ ョン遺伝子産物は、核局在配列又は細胞膜へ融合蛋白質を導くミリストイル化配 列などの、標的ドメインに融合したトランスフォーメーション遺伝子によりコー ドされるペプチド配列を含む融合蛋白質からなる。 調節しうる発現には、トランスフォーメーション遺伝子（例えば、myc または ミリストイル化配列に連結したsos の融合蛋白質）をコードする第１のDNA 配列 を含む組み換えDNA 構築物（「標的遺伝子構築物」）およびプロモーターやエン ハンサー配列のような転写制御要素を含む第２のDNA 配列−これはキメラリスポ ンダー蛋白質の多量化に応答しうる−を含む。これらの態様の標的遺伝子は以下 に説明するように、トランスフォーメーション遺伝子からなる。 所望のトランスフォーメーション遺伝子のためのDNA 配列は慣用の手段で容易 に得ることができる。例えば、プライマーを所望の標的のDNA の公開された配列 に基づいて設計し、慣用の方法で合成し、標準PCR 手法により標的遺伝子DNA を 得るのに用いればよい。クローニングおよびトランスフォーメーション遺伝子配 列の使用に関するDNA 配列の情報および他の情報は容易に入手できる。 本発明のこの側面は、１またはそれ以上のキメラリスポンダー蛋白質、それら をコードするDNA 構築物（「リスポンダー」構築物）、およびキメラ蛋白質を多 量体化しうる多価リガンド分子の使用を含む。これらは上で引用された特許文献 に詳細に記載されている。要するに、キメラ蛋白質は少なくとも１つのリガンド 結合（即ち「受容体」）ドメインおよび、キメラリスポンダー分子の多量体化の 際に、細胞内のトランスフォーメーション遺伝子の転写を開始しうる作用（acti on）ドメインを有する。キメラ蛋白質はさらに、別のドメインを含有してもよい 。これらのキメラリスポンダー蛋白質およびそれらをコードするリスポンダー構 築物はその種々の成分が異なる起源であり（即ち、互いに異種である）、自然に は見出されないという意味で組み換え体である。また、多量体化剤の存在、即ち 上記多量体化リスポンダー蛋白質に応答しうる、転写制御要素の転写制御下でト ランスフォーメーション遺伝子を含む組み換えトランスフォーメーション構築物 も提供される。転写制御要素は、トランスフォーメーション遺伝子の転写が、こ れらの構築物を含む細胞中DNA 多量体化リスポンダーキメラの存在により活性化 されるという意味で応答性である。言い換えればキメラリスポンダー構築物を発 現し、多量体化リガンドに応答性のトランスフォーメーション遺伝子構築物を含 む細胞の暴露によりトランスフォーメーション遺伝子の発現を生じる。本発明の 構築物はネオマイシン耐性遺伝子（neor）や単純ヘルペスウイルスのチミジンキ ナーゼ（HSV-tk）のような１またはそれ以上の選択マーカーを有していてもよい 。 リスポンダー構築物を含有し、かつ発現し、そしてトランスフォーメーション 遺伝子構築物を含有する本発明の遺伝子操作細胞を多量体化剤に暴露すると、ト ランスフォーメーション遺伝子の発現が活性化する。 変性細胞を作製するために、選択した宿主細胞に所望の構築物を導入する。こ れは慣用のベクター（これらの多くの種類が市販されている）および手法を用い て達成できる。所望により、１またはそれ以上の構築物をうまく導入した変性細 胞を次いで選択し、慣用の方法により他の細胞から分離し培養してもよい。 本発明の実施においてトランスフォーメーション遺伝子の発現をひきおこすの に有用な多量体化リガンドは、２（又はそれ以上）の受容体ドメイン、即ち、こ のような受容体ドメインを含む２又はそれ以上のキメラリスポンダー蛋白質に結 合しうる。多量体化リガンドは、順に又は同時にキメラに結合し、好ましくは約 10〜6 以下のKd値で、より好ましくは約10〜7、さらにより好ましくは約10〜8 以下で、場合によっては約10〜9M以下で結合する。リガンドは好ましくは、非蛋 白質であり、約5KDaより少ない分子量を有する。さらにより好ましくは、多量体 化リガンドは約２KDa より少ないさらに好ましくは1500Daより少ない分子量を有 する。 リガンド媒介多量体化によって、標的遺伝子の転写をひきおこしうるキメラリ スポンダー蛋白質の使用、また設計、構築、及びそれらをコードするDNA の使用 はPCT/US94/01617及びSpencer et al、Science;1993に開示されている。 簡単にいうと、キメラ蛋白質の作用ドメインは多量体化により、同族体制御要 素の転写制御に下にある標的遺伝子の転写を活性化しうる任意の蛋白質又は蛋白 質ドメイン（好ましくは所望の宿主細胞または生物の種の）から選択すればよい 。例えば、キメラリスポンダー蛋白質分子の作用ドメインは、CD3 zeta サブユ ニットのような、リガンドに暴露され、次いで多量体化されたとき、IL−2 プロ モーターを介して転写活性に導く検出可能な細胞内シグナルを開始しうる蛋白質 ドメインからなる。あるいは、例えば、一方がその作用ドメインとして、GALAな どのDNA 結合性蛋白質を含み、他方がその作用ドメインとして、VP16などの転写 活性ドメインを含む一群のリスポンダー蛋白質がある。GAL4−VP16二量体を形成 するかかるリスポンダー蛋白質のヘテロ二量体化は（ヘテロ）二量体化リスポン ダー蛋白質が結合しうる要素の転写制御の下で遺伝子の転写（この場合トランス フォーメーション遺伝子）を活性化する。このような態様のすべてにおいて多量 体化は、多量体化事象に応答性の転写制御要素（例えば、エンハンサーおよび／ またはプロモーター要素等）の転写制御下でトランスフォーメーション遺伝子の 転写を活性化する。 本発明の種々の態様のためのDNA 構築物は設計原理により、そしてここで引用 した特許文献−PCT/US94/0617 を含む−に開示された材料および方法を、ここに 記載し、以下の実施例に開示するように変形して用いて作製すればよい。 本発明はさらに、ここに作成した種々の構築物を有するDNA ベクターを含み（ これらのおよび他の態様のために）組織培養における宿主細胞への導入のため、 胚への導入のため、生体への投与のため、インビポでの細胞への構築物の導入の ためであってもよい。いずれの場合も、構築物はエピソームにより、又は染色体 への組み込みのために導入されればよい。ベクターは、例えばアデノ、アデノ関 連又はレトロウイルスベクターを含むウイルスベクターであればよい。構築物及 びそれらを含むベクターは、構築物を含むトランスフェクタントの選択を可能に する選択しうるマーカーを含んでいてもよい。 本発明はさらに、ここに記述した構築物を有し、および／または発現する遺伝 的に操作された細胞を含み、これらは、原核細胞および真核細胞、特に酵母、虫 、昆虫、マウス又はその他のネズミ、及びヒト細胞を含む種々のその他の哺乳動 物細胞およびリネエージを含み、これらは凍結しても増殖中でも、また培養した ものでもそれらを含む生物体中のものでもよい。 かかる態様の遺伝子操作細胞は１以上のトランスフォーメーション遺伝子（例 えば、myc およびSOS −ミリストイル化配列融合）を含有し、かつ調節的に発現 でき、各遺伝子は同じ又は異なる多量体調節的発現制御の下にあればよい。操作 細胞又はその子孫をキメラ転写制御蛋白質により認識される多量体化リガンドに 暴露すると、トランスフォーメーション遺伝子の発現及びトランスフォーメーシ ョンされた表現型に特有の細胞増殖を生じる。 トランスフォーメーション遺伝子産物の調節的局在下 他の態様では、トランスフォーメーション遺伝子は条件的にトランスフォーメ ーションを行わせるように用いられる、即ちras、raf、sos、活性化キナーゼな どの第２の種類のトランスフォーメーション遺伝子によりコードされるペプチド 配列を、FKBPドメインなどのリガンド結合性ドメインに融合させる。 リガンド結合性ドメインはトランスフォーメーション遺伝子産物を標的としう る能力を与える。得られる融合蛋白質は、膜結合蛋白質又は他の局在蛋白質との リガンド媒介結合が可能であり、こうして標的としうるトランスフォーメーショ ン因子を構成する。局在蛋白質は、リガンド結合性ドメイン及び融合蛋白質を特 定の細胞内位置、例えばミリストイル化配列の場合の細胞膜や核局在配列の場合 の核などに、融合蛋白質を導く標的領域を含む融合蛋白質である。２又はそれ以 上のリガンド結合性ドメインに結合しうる多価リガンドをおおまかにに選んでそ の存在下で、標的となるトランスフォーメーション因子を局在蛋白質との結合に より所望の細胞内位置に導く。 細胞を、１またはそれ以上の標的となるトランスフォーメーション因子および 局在下蛋白質をコードする組み換えDNA 配列を含み、かつ発現しうるように操作 する。第１のDNA 配列は、トランスフォーメーション遺伝子によりコードされる ペプチド配列に融合したリガンド結合ドメインからなるキメラ蛋白質をコードす る−これは適宜細胞内環境（例えば、核もしくはraf やsos のような蛋白質の場 合細胞膜）への局在下によりトランスフォーメーション経路を活性化する。第２ のDNA 配列は、リガンド結合ドメインに融合した細胞内もしくは細胞下局在ドメ イン（例えば、細胞膜に蛋白質を導くミリストイル化部位、または核もしくはそ の他の局在化シグナル）を含むキメラ蛋白質をコードする。多量体化リガンドの 存在下で、キメラトランスフォーメーション因子の分子はキメラ局在化蛋白質と 多量体化し、こうして細胞膜もしくはその他の標的部位で局在化する。２つのキ メラ蛋白質をコードするDNA 配列はそれ自身、キメラトランスフォーメーション および局在化蛋白質が結合する同じもしくは異なるリガンドを用いて、上記した ようにリガンドにより調節されて発現することができる。細胞はさらにmyc，fos ，myb 等の蛋白質をコードするトランスフォーメーション遺伝子−そのトランス フォーメーション活性は過剰交換機能による−を少なくとも１つ含み、そのトラ ンスフォーメーション遺伝子は構成的にあるいは上記したリガンド調節系の制御 下に、上記キメラ蛋白質が結合する同じもしくは異なるリガンドの調節下に発現 される。 本発明のこの側面を説明するために、本発明者らは複数のFKBPドメインに融合 したヒトSOS 蛋白質をコードする活性化構築物を調製した。膜結合性蛋白質をコ ードする第２の構築物を調製し、これは複数のFKBPドメインに融合したc-src 蛋 白質からの20個のアミノ酸のミリストイル化シグナルをコードする。これらの２ つの構築物をエレクトロポレーションによりJurkat Tリンバ球にトランスフェク トし、二量体化試薬FK1012を操作細胞に加えると、AP-1およびNF-AT による転写 活性化により示されるように、細胞でのトランスフォーメーション機構の迅速か つ完全な活性化が生じる。 他の例では、多数のFKBPドメインおよびfyn，lck，lyn などの変性src 群のチ ロシンキナーゼを有する融合蛋白質からなる標的可能なトランスフォーメーショ ン因子をコードする構築物を調製した。src 群のチロシンキナーゼへの変性には 、既知のトランスフォーメーション変異の導入、トランスフォーメーション活性 に必要なミリストイル化配列の欠失、およびすべての非キナーゼドメインを含む その他のドメインの任意の欠失などがある。宿主細胞は次いで、かかる構築物、 およびFKBPを含有する膜結合性蛋白質をコードする構築物を用いてトランスフェ クトされた。二量体化合成リガンド、FK1012の存在下で、標的となりうるトラン スフォーメーション因子は膜結合性蛋白質と会合し、こうして細胞膜に結合し、 そこでトランスフォーメーション過程を活性化する。このことは、AP-1などのト ランスフォーメーション蛋白質の転写活性が進むことにより証明される。 腫瘍サプレッレーの調節的破壊 本発明のその他の態様では、細胞を、１またはそれ以上の次のドメインの種々 の組み合わせからなるキメラ蛋白質をコードする組み換えDNA 配列を含有し、か つ発現しうるように操作する：標的結合ドメイン（シグナル鎖FVまたはその他の 抗体部分）、多量体化リガンド結合ドメイン、および分解もしくは破壊のための キメラを標的とするドメイン。 かかる態様の１つには、これらの２つのDNA 配列を含有するように操作した細 胞がある。第１のDNA 配列は、リガンド結合ドメインおよび腫瘍サプレッレー結 合ドメインを含有する第１のキメラ蛋白質をコードする。第２のDNA 配列は、リ ガンド結合ドメイン（これは第１の粗のリガンド結合ドメインと同じでも異なっ ていてもよい）および分解または破壊のためのキメラを標的とするドメインを含 有する第２のキメラ蛋白質をコードする。第１および第２のキメラに結合しうる 多量体化リガンドの存在下でキメラが多量体化する。第１のキメラが結合する腫 瘍サプレッレーはこうして分解標的ドメインに途中で（in trans）で連結され、 それにより破壊の標的となり操作細胞から効率的に除去される。 本発明のかかる態様で標的となるべき腫瘍サプレッレーはp15，p16，p21，p27 等な含む。Weinberg，1991，”Tumor Suppressor Genes”Science 254:1138-114 6参照。分解標的ドメインには、cyclin destruction boxやjun degradation sig nalがある。腫瘍サプレッレー結合ドメインは、関連する腫瘍サプレッレーを認 識しうる単鎖FV断片（ScFV）の形で容易に調製できる。 その他の態様では、細胞を、目的の標的に結合するScFVなどの標的結合ドメイ ン、および例えば蛋白質分解経路を介して、分解または破壊するためのキメラを 標的とするドメインを含有するキメラ蛋白質をコードするDNA 配列を含むよう操 作する。そのDNA 配列は、予め決めたリガンドの存在に応答性の転写制御要素の 発現制御の下で、例えば上記した国際出願PCT/US93/01617およびPCT/US94/08008 に開示された転写調節の手法を適用して、結合させる。 ウイルス成分の調節的分解 上記の調節的破壊の２つの方法は、１またはそれ以上の腫瘍サプレッレーを標 的とすることから、１またはそれ以上のウイルス蛋白質、特にHIV ウイルスの１ またはそれ以上の必須蛋白質を標的とすることにまで広げられる。かかる場合で は、ScFV含有キメラをコードする組み換えDNA 配列を上記のようにして、ただし HIV 蛋白質、とりわけHIV プロテアーゼ、nef に関して用いる。造血幹細胞への 組み換えDNA 分子の導入により、組み換えDNA を発現しうるマクロファージおよ びＴ細胞への経路を提供する。かかる細胞は標的ウイルス蛋白質の分解のための リガンドにより調節される系を含有し、その意味でウイルスに対するリガンド誘 導耐性により特徴づけられる。 リガンドおよびDNA 構築物の成分 本発明の組み換えDNA への組み込みのための種々のDNA 配列をPCT/US94/1617 に記載のようにして得ることができる。これらには細胞性局在化シグナル（キメ ラを細胞膜に導くためのミリストイル化部位）をコードするDNA 配列、およびリ ガンド結合ドメイン（天然のまたは遺伝子操作したFKBPまたはシクロフィリンな ど）をコードするDNA がある。 ScFVは、所望の腫瘍サプレッレーに対する抗体の一部（またはウイルス蛋白質 もしくはその他の標的）（これも慣用の方法で製造できる）をコードするクロー ン化DNA を用いて慣用の方法で製造できる。例えば、慣用の方法を用いて、所望 の腫瘍サプレッレーを特異的に認識するmAbsを得ることができる。このような抗 体を産生するマウスハイブリドーマまたは脾臓細胞から出発して、市販のRecomb ination Phage Antibody System(組み換えファージ抗体系)およびpCANTAB 5 Gen e Rescue and Sequencing Primers(ファルマシアバイオテク)(または同等のもの )を用いて、所望のScFVをコードするDNA を含有するファージを生成させてもよ い。Analects 22(1):1-7(Winter 1993)およびそこに引用された文献参照。所望 のScFVをコードするDNA は、リガンド結合ドメインをコードするDNA の3'末端に 容易に連結させて、上記、リガンド結合ドメインおよび腫瘍サプレッレー結合ド メインを含有するキメラ蛋白質をコードする組み換えDNA を生成させることがで きる。 jun およびcyclin destruction boxのような分解標的ドメイン、またはユビキ チン結合酵素ドメインは、PCR を介してクローン化しても、自動オリゴヌクレオ チド合成操作を用いて合成してもよい。 広範囲のトランスフォーメーション遺伝子が知られており、クローニング(PCR )によりもしくは重複合成オリゴヌクレオチドの集合により得られる。例えば、M cCornic，"ras Oncogenes"pp125-145; Hunter，"Oncogene Production in the C ytoplasm: The Protein Kinases"，pp147-173; Eisenman，"Nuclear Oncogene"p p175-221 およびOncogenes and the Molecular Origins of Cancer（Cold Sprin g Harbor Press，1989，Weinberg，ed.）のその他の章参照。 DNA 構築物の設計および調製 種々の成分をコードするDNA 配列は、PCT/US94/1617 に記載の方法に類似した 方法で所望のキメラをコードする組み換えDNA 分子に集めることができる。組み 換え分子は増殖およびトランスフェクションのためにベクターに集めるか移動す ればよく、このベクターはさらに所望のプロモーター／エンハンサー要素などの 転写制御要素、および複製起点や分泌マーカーなどの慣用の遺伝子要素を含有で きる。 細胞 本発明によりいかなる真核細胞も操作できる。しかし、哺乳動物由来の造血幹 細胞、例えばマウスまたは好ましくは霊長類、特にヒト由来のものが好ましい。 各細胞種および由来に慣用の方法も用いて細胞を得て、操作し、培養する。 構築物の細胞への導入 構築物を細胞に導入するには、エレクトロポレーション、リポソームトランス ファー、DEAEトランスフェクションおよびリン酸カルシウムトランスフェクショ ンなどの慣用の方法を用いればよい。トランスフェクタントを慣用の方法および 材料を用いて選択する。次いで細胞を条件的トランスフォーメーションまたは細 胞増殖に有効な量の多量体化リガンドを含む培地で培養する。次いで細胞を洗浄 しするか操作し、最後に、幹細胞の場合は骨髄移植のための確立された手法を用 いて移す。 用途：臨床および非臨床 本発明の条件的トランスフォーメーションオートロガス(CAT)幹細胞の集団を 、細胞の増殖に有効な量の多量体化リガンドを含む培地において培養することに より増やす。こうして産生された細胞はガン化学療法の補助として必要に応じて 患者に投与することができる、例えば提供された骨髄細胞での骨髄移植に代わる ものとして白血病、リンパ腫、および種々の固形腫瘍に対して用いられる。上記 したようにHIV に対して抵抗性にしたCAT 幹細胞を用いて骨髄移植を行ってもよ い。操作細胞中に存在するキメラ蛋白質の多量体化を引き起こすのに有効な量の 多量体化リガンドを患者に投与すると、それらの細胞およびその子孫をHIV に抵 抗性にする。また、内皮細胞を本発明により条件的トランスフォーメーション特 性を付与するように操作してもよい。次いでかかる細胞の培養を、細胞増殖に十 分な 量の多量体化リガンドを含む培地中で行う。こうして得られた細胞を次いでCAT 皮膚幹細胞に移植してもよい。 本発明の方法および材料は非臨床目的に用いてもよい。例えば、非対称細胞分 裂の研究のために、トランスフォーメーション機構を研究するために、またその 他の研究目的で研究所に提供するために、幹細胞を増殖させるのに用いてもよい 。 実施例 実施例１：標的可能なSos タンパク質および膜ドッキングタンパク質のリガンド 媒介会合を経たRas 経路の調節可能な活性化材料および方法 細胞系およびトランスフェクション・アッセイ ．本研究に使用したCOS 細胞は、 10％(vol/vol)胎児性ウシ血清およびペニシリン／ストレプトマイシンを追加し たDulbeccoの修飾イーグル培地で増殖させた。Jurkat-TAg細胞(16)を、10％胎児 性ウシ血清、L-グルタミン、およびペニシリン／ストレプトマイシンを追加した RPMI 1640 中に維持した。トランスフェクションのために、10⁷個のJurkat-TAg 細胞を、指示された量の発現プラスミドと共に培地0.4 ml中にて960 μFD、250V でエレクトロポレーションした。SEAPリポーター活性をアッセイするため、指 示されたミトゲンおよびFK1012でトランスフェクションおよび刺激された熱不活 化（68℃、１時間）サンプル100 μｌを、100 μｌ 2Mジエタノールアミン(pH 1 0.0)，1mMメチルウンベリフェリルホスフェート(MUP)に添加し、37℃で数時間イ ンキュベーションし、Titerteck Fluorescan II(ICN)を用いて、発光波長355 nm および460 nmで蛍光単位を測定した。タンパク質分析 ．タンパク質発現を監視するため、細胞をRIPA緩衝液（150mM Na Cl，20mM Tris pH 7.5，0.5%デオキシコール酸ナトリウム，0.1% SDS，1% Trito n X100，1mM PMSF，1mM ベンザマジン，１μg/mlアプロチニン、１μg/mlアンチ パイン，１μg/mlロイペプチン）中でトランスフェクション後40時間溶解処理し 、リゼイト（溶解物）をタンパク質Ａ−セファロースに予め結合させたmAb 12CA 5(BABCO)により免疫沈降させ、10％SDS-PAGEで分析し、ニトロセルロースにエレ クトロトランスファーした。ブロットを12CA5 およびホースラディッシュペルオ キダーゼ(HRP)複合化ウサギ抗マウスIgG（Zymed）でプローブし、タンパク質をE CL(Amersham)で視覚化した。共免疫沈降アッセイのために、トランスフェクショ ンしたJurkat-TAg細胞をHNTG溶解緩衝液（50mM HEPES pH 7.5，150mM NaCl，10% グリセリン，1% Triton X100，1.5mM MgCl，1mM EGTA，1mg/ml BSA,上記のプ ロテアーゼ阻害剤）中で溶解処理した。リゼイトを上記のようにして12CA5 で免 疫沈降させ、HNTG緩衝液（50mM HEPES，10% グリセリン，0.1% Triton X100，15 0mM NaCl）中で強力に洗浄した。同じ免疫沈降物を、10％SDS-PAGEゲル上で分析 し、ブロットを12CA5 でプローブするか、または12％SDS-PAGEゲル上で分析し、 ブロットを抗Grb-2 mAb（Transduction Laboratories）でプローブした。免疫蛍光顕微鏡観察 ． COS細胞の50％全面単層(confluent monolayer)を、カバ ーガラス上でリポフェクトアミン(LipofectAmine，GibcoBRL)を用いて、指示さ れたプラスミドDNA でトランスフェクションした。24時間のトランスフェクショ ン後、細胞を４％パラホルムアルデヒドで15分間固定し、0.1％ Triton X100で ５分間透過処理し、12CA5 一次抗体で、次にウサギ抗マウスFITC複合化二次抗体 （Pharmingen）で染色した。共焦点(confocal)顕微鏡を用いて免疫蛍光を視覚し た。結果 Ｔリンパ球中のSos の膜局在化 ．Sos の膜局在化がＴ細胞のシグナリング（シグ ナル伝達）を活性化することができるという証拠が、v-src ミリストイル化配列 Ｎ末端をSos のコーディング（解読）領域に融合（fuse）させることにより得ら れた（図1A）。ミリストイル化配列をなくした、可溶性Sos をコードする対照ベ クターも構築した。この構築物に、細胞中のキメラ分子の合成を視覚化するため 、インフルエンザウイルスの赤血球凝集素(HA)に由来するＣ末端エピトープ標識 (tag)を添加した。可溶性のミリストイル化されたSos タンパク質の局在化を、 共焦点顕微鏡によりCOS 細胞中に確認したが、これは特異的細胞局在化／形態を この細胞系中で最も容易に観察することができたためである。可溶性Sos 構築物 の発現をサイトゾル(cytosol)中に専ら局在化させた(図2A，B)。Sos のミリスト イル化は、主に形質膜（細胞膜）での局在化を生じた（図2C,D）。シグナリング におけるSos 局在化の役割を評価するため、これらの分子を、NF-AT 応答性プロ モーター要素の制御下に、高発現のために分泌アルカリ性ホスファターゼリポー ター遺伝子と一緒に、SV40大Ｔ抗原（Jurkat-TAg細胞）を発現するヒトＴ細胞系 中に共トランスフェクションした(17)。NF-AT は、IL-2エンハンサー内の領域に 結合する転写ファクターであって、免疫応答に必要な細胞の作用と同調するIL-2 、IL-4、GMCSF およびCD40のような遺伝子の転写に不可欠である。NF-AT 転写複 合体(complex)は、TCR を経たシグナリング、ならびにNF-AT 依存性転写を活性 化するように相乗作用を発揮するホルボールエステルおよびイオノマイシン（カ ルシウムイオノホア）のような薬理学的薬剤に応答する(18-21)。Ｔ細胞シグナ ル形質導入（トランスダクション）の活性化を、分泌アルカリ性ホスファターゼ リポーター遺伝子のNF-AT 依存性転写の誘導と、培地中のアルカリ性ホスファタ ーゼの蓄積とによりアッセイした。構成的に(constitutively)活性なカルシネウ リン(Calcineurin)のトランスフェクションは、Ｔ細胞シグナリングにおけるカ ルシウム依存性の事象に機能的に置き替わることができる(17,22,23)が、構成的 に活性なRas(v-Ha-Ras)の発現は、ホルボールエステル刺激の必要性を迂回する ことができる(24)。可溶性およびミリストイル化されたSos 構築物の活性を、イ オノマイシン刺激により誘導されたカルシウムシグナルに相補性のシグナルを生 ずるその能力についてアッセイした。構成的に活性なRas かミリストイル化Sos のいずれかが、Ｔ細胞中のNF-AT 依存性転写を活性化させるためにイオノマイシ ンと相乗作用する（図1B）。これに対して、可溶性Sos はベクター単独のレベル より少ししか高くない活性化を示した。同様の結果が、ホルボールエステル刺激 とは無関係にAP-1依存性リポーター遺伝子の転写を活性化する際にこれらの構築 物で得られた。ミリストイル化Sos の発現により誘導されたシグナリングは、優 性陰性(dominant negative)N17Ras の共トランスフェクションにより阻害された （図1B）。これらのデータは、膜結合Sos によるシグナリングがRas 経路の活性 化により媒介されるという考えと一致する。構成的に活性なRas およびミリスト イル化Sos は（可溶性Sos ではなく）、追加の刺激が全くなくても、NF-AT を活 性化させるために構成的に活性なカルシネウリンと相乗作用し（図1C）、これは Sos がＴ細胞活性化のRas 依存性経路上で専ら機能することを意味している。ミ リストイル化Sos はイオノマイシン刺激またはカルシネウリン遺伝子の共トラン スフェクションのいずれかがないと不活性である。これらのデータは、繊維芽細 胞における全長Sos(26)およびSos の触媒ドメイン(27)の膜局在化もRas 依存性 シグナリングを活性化するという最近発表された知見と一致する。 Ｔ細胞中のRas 活性化に対するSos の特異性を調査するため、ヒトCDC42 タン パク質を含む小GTP 結合性タンパク質のRho/Rac サブファミリーのメンバーに対 してGEF 特異性であると考えられたDbl オンコタンパク質(oncoprotein)の活性 に対してSos の活性を比較した(28-30)。また、(32)に解説されている多様なシ グナル形質導入経路内に包含される造血特異性タンパク質であるVav プロトオン コジーン(proto-oncogene)(31)の産物の活性を調査した。Vav が特に興味あるの は、これが、TCR 活性化に続いてチロシンホスホリル化されることが示さたから であり(33)、また未確認の報告ではこれがLck 並びにジアシルグリセリン結合に よるホスホリル化に続いてRas 特異性GEF 活性を示すことが示唆されているから である(34,35)。これは、Vav の触媒領域が交換ファクターのRho/Rac 群に相同 性であり(36)、RhoAおよびDbl に類似の形質転換を示し、Ras 媒介形質転換とは 異なる表現型変化を誘発する(37,38)ことからみて予想外である。予想された通 り、ミリストイル化Dbl はＴ細胞活性化においてRas 依存性経路を活性化するこ とができなかった（図1D）。これは、膜標的GEF によるRas に対する特異性が不 可欠であることを意味している。面白いことに、野性型可溶性Vav プロトオンコ ジーン(ScVavE)の発現は、イオノマイシンまたはPMA が存在しなくてもNF-AT 依 存性転写を最大刺激の約15％のレベルまで活性化し（図1D）、これはSos とは異 なり、これがNF-AT で指揮された転写に対して弱いが十分なシグナルを付与する ことを意味している。ミリストイル化Vav(McVavE)はイオノマイシンが存在しな いとNF-AT 依存性転写を活性化せず、イオノマイシンの添加後にほんの僅か上昇 しただけであった。McVavEタンパク質はScVavEタンパク質より安定性が低いよう であり（図1D，挿入）、ミリストイル化Vav の低下した活性は、単により低いタ ンパク質発現の結果であるかもしれない。これらの結果は、Vav がNF-AT 依存性 転写により現れるTCR シグナリングに或る役割を果たすが、その役割はSos のそ れとは異なるらしいということを示している。Ras 活性化におけるGrb-2 の役割 ．インタクトのSos Ｃ末端ドメインを維持する 間にミリストイル化Sos とのフルオロ相互作用を排除するため、フルオロ相互作 用に不可欠であることが見出された２つのプロリン富化配列(39)を突然変異させ た。各ドメインのコンセンサスPPRを、Grb-2 SH3 ドメインとの相互作用を廃止 するためにAAA に変化させた（図3A）。MSosE 免疫沈降物を抗Grb-2 抗体による ウェスタンブロッティングによりGrb-2 について分析した。残基1147〜1156のコ ンセンサス配列の突然変異は構成的Grb-2 結合を約50％低下させたが、残基1290 〜1295のサイトの追加の突然変異は検出可能なGrb-2 相互作用を排除した（図3B ）。これは高親和性Grb-2/Sos 相互作用が両方のGrb-2 SH3 ドメインの同調結合 を必要とするという知見と一致する(39)。Sos とのGrb-2 相互作用の役割を同定 するため、これらのミリストイル化Sos 突然変異物をＴ細胞中のRas 依存性シグ ナリングを活性化するその能力についてアッセイした。Grb-2 相互作用の排除は 膜結合したSos シグナリングに何の影響も及ぼさなかった（図3C）。これは、グ アニンヌクレオチド交換ファクターSos を膜に局在化させるか、配座変化を誘発 しないというＴ細胞中のGrb-2 の役割と一致する。これらの結果は、Sos が膜に 構成的に局在化された時にはGrb-2 相互作用とは独立して機能できることを実証 している。Sos の条件的アレレの開発 ． Sosの構成的活性化はRas 活性化経路の下流側の 全シグナルの持続した活性化を生じ、フィードバック経路を開始させ、Ras の下 流側の即時の作用を隠蔽（マスク）する可能性がある。さらに、ミリストイル化 配列の追加によりSos に膜局在化を及ぼすと、偶然の配座変化を誘発することに よりそのGEF 活性を活性化することがある。これらの妨害を避けるため、合理的 に設計された化学的二量体化誘導剤(CID)であるFK1012を用いて膜局在化を誘導 することにより、Sos の膜リクルート(membane recruitment)におけるGrb-2 の 役割を模した、Sos の条件的アレレ（対立遺伝子）を工夫した。このSos アレレ は、細胞表面レセプターの細胞内オリゴマー化を誘導するために最近開発された 技法を修正することにより設計した(40,41)。可溶性Sos をFKBP12(SF3SosE)の三 つのドメインに融合させ、Jurkat-TAg細胞中で膜結合ミリストイル化FKBP(MF3E) と共発現させた。CID(FK1012)の添加により、膜結合FKBPによる可溶性Sos の局 在化、およびRas の活性化を生じた（図4B）。膜のまたはSos 上のミリストイル 化配列へのFKBPの融合がずっと少ないと、恐らくFK1012の内生FKBPとの効果的で はない相互作用およびMF3Es とSosFKBP のホモ二量体化のために、あまり最適で はない膜局在化を生じた。FK1012により膜にリクルートされた可溶性Sos により 誘 導された活性化は、優性陰性Ras の共発現により阻害された（図4C）。これらの データは、CID FK1012の添加により誘導されたシグナルは実際にはRas 依存性シ グナリングの活性化に起因し、細胞膜へのSos の標的化（ターゲティング）それ 自体はRas の活性化を容易にするという強力な証拠を与える。 繊維芽細胞における以前の研究は、Sos がGrb-2 との既に村内する複合体中で 刺激前に存在することを示していた。実際、一部のGrb-2 は刺激前にＴ細胞中で Sos と共沈降させることができ（図3B）、膜へのGrb-2 の局在化がSos をリクル ートすることがあり、Ras 依存性シグナルを活性化させるかも知れないことを示 唆している。Ｔ細胞におけるこの可能性を評価するため、FKBPモジュールの３縦 列コピーを含む修飾ヒトGrb-2 分子，SF3GrbEを、SF3SosE の産生について説明 したのと同様に生成させた（図1A参照）。細胞をMF3EおよびSF3GrbE で共トラン スフェクションし、KF1012で処理して膜に修飾Grb-2 をリクルートし、イオノマ イシンで刺激した。Sos の膜リクルートとは異なり、このGrb-2 の膜への再局在 化は、Ｔ細胞のRas 依存性シグナル形質導入を活性化しなかった（図4D）。FKBP 分子Ｃ末端のGrb-2 への配置(SGrbF3E)またはＮ末端ミリストイル化配列の追加 による膜へのGrb-2 の構成的局在化(MGrbE)も、同様にRas を活性化しなかった 。これらの結果は、別のレベルの調節がＴ細胞活性化調節Sos/Grb-2 相互作用に 存在することを示唆している。これらのデータは、Grb-2 の修飾がそのSos との 相互作用を排除するかもしれないという論理を妨げるものではないが、Grb-2 の ３種類の別々の修飾がRas 活性化を生じなかったことからありそうにもない。論考 Ｔ細胞活性化におけるRas の役割は明らかになっているが(42)、その活性化の メカニズムおよび完全な因果関係は多くの討論の主題となってきた。本発明者ら の研究は、Ｔ細胞における少なくとも１つのメカニズムをがSos の膜リクルート により媒介されうることを示している。膜近接性(proximity、膜に近いこと)はR as 依存性事象にとって不可欠である。なぜなら、RasGAP(43)およびRaf(44,45) のようなRas 経路の他の成分も膜局在化により活性化されうるからである。TCR によるGrb-2/Sos 膜リクルートはShc により媒介される可能性もあるが、TCR 刺 激後にShc 上でのチロシンホスホリル化は低レベルでしか検出されない(46)。こ れに対して、細胞の粒子フラクションに局在化させた36〜38 kD チロシンリンタ ンパク質(46,47)は、TCR 刺激後にGrb-2/Sos と会合することが見出され、これ はレセプター刺激後の膜へのGrb-2/Sos のトランスロケーション（転座）の原因 であるかも知れない。実際には、Ｔ細胞中の膜へのSos のリクルートは、細胞膜 で実証された予め形成されたGrb-2/Sos 複合体の膜への局在化より複雑であるか も知れない。最近の研究は、Ｔ細胞中ではGrb-2 とSos との相互作用を抗原レセ プターの活性化後に誘導しうること、およびこの会合は、Grb-2 SH2 ドメインと Shc からのホスホチロシン含有ペプチドとの相互作用によりインビトロで増強さ せることができたことを示している(48)。これは、構成系と誘導系の両方でのGr b-2 単独の膜リクルートがRas 活性化を生じなかったという本発明者らの知見と 一致する。 Grb-2 がSos の配座変化を誘導し、それによりその触媒活性を活性化させる可 能性は、突然変異させたSH3 結合性領域でのGrb-2 とSos との間の検出可能な相 互作用の不存在下でMSosE がRas 経路を完全に活性化させることができることか らみて、もはや考えられない。これは、インビトロでのSos へのGrb-2 結合が、 グアニンヌクレオチド交換活性に測定可能な影響を及ぼさないことを示すデータ (49)と一致する。さらに、生物物理学的研究では、Grb-2 SH3 ドメインがホスホ チロシンペプチドへのGrb-2 SH2 結合の後に配座変化を示さないことが示された (50)。実際、哺乳動物細胞におけるデータとは異なり、ショウジョウバエ(Droso phila)Sosの成長点(頂,apical)膜局在化はDrk とは独立していることが示され、 ショウジョウバエSos プレックストリン(pleckstrin)ホモロジー領域とセベンレ ス(Sevenless)レセプターそれ自体との間の相互作用が示された(51)。Sos Ｃ末 端ドメインの削除は、Sos 活性を強めることが示された。これは、Sos Ｃ末端へ のGrb-2 結合が陰性調節領域を排除するかも知れないことを示唆している(26,51 )。しかし、Sos Ｃ末端領域の削除は、Sos を活性化しない可能性があり、それ よりフィードバックループにおいてSos を陰性に調節するかも知れないMAPK族の メンバーによりホスホリル化のサイトを排除するかも知れない(52)。さらに、通 常は触媒ドメインと並列しているSos Ｃ末端ドメイン全体の削除は、正規では ない配座変化を誘導することがあり、触媒活性がより高くなるか、または触媒ド メインのRas への接近性がより大きくなる。 TCR 活性化におけるVav の役割も不明のままである。突然変異Vav アレレを含 有するES細胞による胚盤胞(blastcyst)相補を利用した分析が、最近TCR による シグナリングにおけるVav の役割と関係していた。Vav の活性化は、通常はTCR レセプター刺激後に存在する追加のシグナルを必要とするが、我々のデータは、 Vav がＴ細胞中でRas に対する膜リクルートGEF ではないことを示唆している。 このイオノマイシンの存在下でミリストイル化Vav の発現により引き出された低 水準のシグナリングならびにイオノマイシンの不存在下での可溶性Vav の低い基 底活性は、Vav がSH2、SH3、プレックストリンホモロジー、およびロイシン富化 ドメインを含むタンパク質−タンパク質相互作用に重要な多様なモチーフを含有 しているので、恐らく膜への他のシグナリング成分のリクルートにより生じたと 考えられる。実際、Vav はまた細胞骨格、細胞形状およびモティリティ(motilit y)の成分を変化させるのに必須のRho/Rac 特異性GEF としての役割も果たすこと がある。Vav GEF 気質特異性の正確な規定とその各種ドメインの役割が、Ｔ細胞 活性化におけるVav の正確な役割を規定するのに必要である。 別の研究が、Grb-2 がSos を細胞膜に結合させる機能を果たし、その構成的GE F 活性を膜会合Ras に発揮させることができるという仮説と一致する。Grb-2 の 役割および成長（増殖）因子レセプターとSos との間の相互作用を媒介するシグ ナリング経路におけるその挿入に対する原理(rationale)は、最初は余分または 奇怪であると見なされるかもしれない。しかし、この形態の誘導可能なリンカー (linker)で媒介される二量体化は、生物学で普通に見られるものであり、これは ２つの利点を持つことを提示しておく。まず、生物学的応答を媒介するために特 異的接触がGrb-2 の片側で保持されるに違いないので、これはレセプターとSos との相互作用の生物学的特異性を向上させる。第二に、生物学低応答はGrb-2 と の２つの結合のいずれかの解離により停止させることができるので、リンカー媒 介二量体化はシグナル形質導入にとってより有利な動力学を生ずる。レセプター とのGrb-2 のインビボの解離速度がSos とのGrb-2 の解離速度と似ていると、解 離速度の二倍の増加が実現されよう。現時点では、インビトロでの個々のペプチ ドの溶液測定だけが利用可能であり(56,57)、高い非対称相互作用がこの形態の 媒介二量体化に有利な動力学を低下させよう。この形態の誘導された二量体化を 利用する他の生物学的プロセスは、IL-2および TGFベータ(58,59)のような成長 因子によるレセプターのヘテロ二量体化、およびTAF により媒介される転写活性 化剤とTBP との間の容易になった相互作用を含む。Sos の条件的アレレを作るに は、膜へのSos の局在化を誘導するために合理的に設計されたCID を用いて、こ の天然形態おリンカー媒介二量体化を模した。 膜へのSos の局在化を誘導的に調節するための条件的アレレの使用は、膜への Sos 単独のリクルートはRas 活性化を生ずることを明らかに実証している。誘導 可能な活性化もこの経路の長い活性化から生ずるかも知れない補償またはフィー ドバックシグナルを最小限にし、直ぐのおよび長期の両方のRas 活性化に続く事 象の経時的な分析を可能にしよう。ここに実証したRas の誘導可能な活性化に加 えて、膜局在化によるチロシンキナーゼのSrc 様群メンバーの誘導可能な調節も 達成された。これは、多様なシグナル形質導入事象を研究する際のCID 媒介タン パク質の局在化の利用を例示する。このGEF のリガンド誘導活性化法は、ベシク ル（小胞）輸送、分泌、および細胞骨格性再配列に含まれるような他のRas 様GT P 結合性タンパク質の特異的調節にも適用しうる方法を示す。 実施例１に関する参考文献 実施例２：Src 群チロシンキナーゼの標的可能な条件的アレレ材料および方法 プラスミドクローン ．本研究で使用した発現プラスミドは図5A以下に示される。 PCR により作成されたこれら構築物の全部について配列決定した。タンパク質発 現はインフルエンザ赤血球凝集素エピトープ標識(12CA5)(7)を用いたウェスタン ブロット分析により確かめた。マウスLck，FynおよびLyn 鋳型、それぞれm-lck, pmTF およびlynAF からであった(18,19)。プライマーをXho I(5'プライマー)ま たはSal I(3'プライマー)サイトによりフランキングし(flanked)、得られた断片 をpKS(Stratagene)中にサブクローンニングし、配列決定し、既述のSF1E（SF1 系）またはJFIE(MF1 系)(5)のSal Ｉサイト中にサブクローンニングした。RSV-N 17Ras(20)が優性−陰性Harvey Ras変異体である。 レセプタープラスミドNF-AT-SX，IL-2-SX，NFκB-SXおよびOct/OAP-SXは記載 されたものである(5)。簡単に説明すると、これらは分泌アルカリ性ホスファタ ーゼ(SEAP)発現をドライブする最小インターロイキン２(IL-2)プロモーター[-70 〜+47(21)]の上流側でクローンされた各種の転写ファクターに対する多結合サイ トを含んでいる。細胞系および組織培養 ．Jurkat-TAg細胞，J.RT-T3.5 細胞(22)およびCOS(サル腎 臓)細胞をこれらの研究に使用した。Jurkat-TAg細胞およびCOS 細胞はサルウイ ルス40大腫瘍抗原を含み、この抗原はサルウイルス40開始点(origin)を含むプラ スミドの複製が可能である。J.RT-T3.5 はJurkat細胞は、TCR β鎖欠損サブクロ ーン(20)である。全細胞を増殖させ、10％(vol/vol)胎児性ウシ血清、10 mM Hep es(pH 7.4)およびペニシリン／ストレプトマイシン加 RPM1 1640培地中でエレク トロポレーションした。エレクトロポレーションおよびSEAPアッセイ ．Jurkat-TAg細胞を、レセプタープ ラスミドNF-AT-SXまたはその誘導体の１つ(5,23)２〜３μg、「ドッキングタン パク質」MF1EまたはMF3Eを含むpBJ5発現ベクター１μg、およびSrc 群キナーゼ の１つまたは対照構築物ＳF1を含有するpBJ5 ２μg と共にエレクトロポレーシ ョンした(Bio-Rad Gene Pulser，960 μF および250 V、0.4 cm幅キュベット 中)。別の方法では、１μg のMF1Lckを２μg のリポーターと共に共トランスフ ェクションした。COS 細胞については、上記量の半量を使用した。J.RT-T3.5 細 胞については、発現プラスミドRSV-TAg(24)0.2 μg を共トランスフェクション して発現を高めた。24時間後、細胞の一部づつをFK1012AMA またはミトゲン(mit ogen)の希釈液（１μｍイオノマイシン＋ホルボール12−ミリステート13−アセ テートおよび25 ng/ml）プラス１μM 不反応性、単量体対照リガンドFK506-M(5) で刺激した。20時間後、上清を(5)に報告のようにしてSEAPについてアッセイし 、データをミトゲン刺激に対する相対値として示す。各データ点を２回反復実施 し、データは２回の実験の平均値である。全試薬をエタノールに溶解させ、培養 液中の溶媒の最大濃度は0.1 ％を決して超えなかった。活性の動力学 ．抗TCR モノクローナル抗体(mAb)UCHT1（Sigma）被覆したマイク ロタイターのウェルを、ホスフェート緩衝食塩水(PBS)1ml当たり10μg のmAbと 共に37℃で１時間インキュベーションし、胎児性ウシ血清１％を含有するPBS中 で37℃で１時間ブロックした。細胞をこれらのウェルまたはミトゲンもしくはFK -1012 を含有する未処理のウェルに分注した。マイクロタイターのウェルから細 胞の一部を時間点ごとに取り出し、最後の時間点まで凍結した。データは２回反 復実施した２つの実験値の平均値として示す。結果 Src キナーゼを膜に可逆的にリクルートさせることができるために、ミリスト イル化標的するペプチドをFyn、Lck およびLyn のＮ末端から除去し、これをFKB P12で置換した(図5A)(8,25)。また、v-src からFKBP12(5)のｎ＝１〜３コピー後 にＮ末端ミリストイル化標的するペプチドからなる膜結合したドッキングタンパ ク質、MFnEも設計した。下流シグナリング事象に焦点を当てるため、上流側の調 節性事象［例、キナーゼ活性化におけるCsk ホスホリル化およびSD45脱ホスホリ ル化(図5B)]の影響を排除することが必要であると推論した。従って、キミラLck (SF1Lck)、Fyn(SF1Fyn)およびLyn(SF1Lyn)を、それらの調節性Ｃ末端チロシン残 基を除去することにより調節解除した（図5A）。論理的に、CID FK1012(5,26)の 投与は、ヘテロおよびホモ二量体の生成に至るべきである（図5C）。 この手段の可能性を実証するために、Jurkat-TAg細胞(24)をいくつかのFKBP-1 2 含有構築物の１つおよびSEAP遺伝子がNF-AT 転写ファクター(23,27)の制御下 にあるリポータープラスミド(NF-AT-SX)と共に共トランスフェクションした。こ のリポーターのNF-AT 依存性転写は、カルシネウリンとRas の両方を必要とし、 サイクロスポリンＡおよびFK506(31)で阻害される二股分岐シグナリング経路を 経て抗原レセプターにより誘発される。従って、いくつかの点で、これはＴリン パ球の活性化要件を忠実に模している。サイトゾル性FKBP12-Fynキメラ(SF1Fyn) またはドッキングタンパク質(MF1E)をJurkat-TAg細胞中にトランスフェクション すると、FK1012の全濃度でNF-AT 活性は検出不可能である（図6A）。しかし、ド ッキングタンパク質およびFKBP12-FynキメラをJurkat-TAg細胞中に共トランスフ ェクションすると、FK1012は１nM程度の低濃度でシグナリングを活性化する。 「野性型」Fyn、SF1Fynwtは、シグナリングには不十分である（図6A）。予想 通り、FK1012媒介膜リクルートおよび３個のFKBP12をを含有するSF3Fynwtの架橋 (crosslinking)は効果的にシグナリングした。また、膜で束縛され、調節解除さ れたFyn(MF1Fyn)は、FK1012とは独立してシグナリングを活性化した（イオノマ イシンおよびホルボール12−ミリステート13−アセテート活性化に対して約40％ )(参照７および９)。 いくつかのSrc 群メンバーの中で可能性ある分化(Specialization)を検討する ため、Fyn、LckおよびLyn のシグナリングを活性化する能力について比較した。 Lck はわずかではあるが、再現性をもって活性化し、この系では低めのFK1012濃 度でFyn またはLyn より良好に活性化した。これに対し、調節解除されたFyn お よびLyn の膜リクルートがシグナリングを活性化する効力には著しい差異がない （図6B）。Lyn は主にＢ細胞特異性であるが(32)、人工的に細胞膜を標的とした 時にはＴ細胞中で明らかにシグナリングすることができる。これらの結果は、Sr c 群メンバーのキナーゼドメインがその特異性役割に著しくは寄与していないか も知れず、これらのキナーゼを活性化する特異的メカニズムが生物学的特異性に 重要であることを示唆している。 FK1012により誘導されるシグナリングにおけるSrc ホモロジー(SH)2 および三 度目の役割を、SH3 およびSH2 ドメインの一方または両方が欠損した一連のFyn およびLck を構築することにより検討した。MF3Eを、各種Fyn もしくはLck 構築 物またはキナーゼ欠損突然変異物の１つと共にJurkat細胞単独中に共トランスフ ェクションした（図5Aおよび6C，6D）。これらの結果は、キナーゼドメインがシ グナリングに必要なだけでなく、十分であるのに対し、SH3 ドメインとSH2 ドメ インはどちらもシグナリングの誘導には必要なく、実際には阻害することがある ことを示している。これらのＮ末端ドメインの分配性(dispensability)は、SH3 またはSH3 会合シグナリング分子の膜リクルートがシグナリングを起こすという 形式的な可能性を排除するものである。 既に示したように、インタクトTCR またはTCR 複合体のξ鎖の架橋は、NF-AT 、Oct/OAP およびAP-1を含むIL-2遺伝子の転写誘導に必要な転写ファクターのサ ブセットを活性化するのに対し、NF−κB ファクターの活性化はコスティミュレ ートリ(costimulatory)シグナルを必要とする(5,33)。誘導可能なFyn またはLck がファクターの類似パネルを活性化することができるか否かをアッセイするた め、各種のリポータープラスミドをMF3EおよびSF1FynまたはSF1Lckと一緒にJurk at-TAg細胞中に共トランスフェクションした（それぞれ図7Aおよび7B）。FK1012 を添加すると、NF-AT、Oct/OAP およびAP-1の各応答性リポーターだけが活性化 され、NF−κB 応答性リポーターおよびIL-2エンハンサー含有リポーターは完全 に不活性であった。また、Fyn またはLck により誘導されたNF-AT 依存性転写は 、Ca²⁺調節されたホスファターゼカルシネウリン(23,24,25)の強力な阻害剤であ るFK506 でブロックされ、優性陰性Ras のRSV-N17 Ras が誘導を完全にブロック するため、機能的Ras 活性を必要とする(図7C)(20)。最後に、Fyn およびLck の 活性化の動力学（速度）を検査し、これを直接TCR 刺激またはミトゲン刺激のそ れと比較した。リポーター酵素分泌の合計レベルは、TCR 刺激細胞の方がFyn ま たはLck 刺激細胞より数倍高いが、いずれの場合もリポーター活性は３時間で最 初に測定可能であり、FK1012活性化シグナリングがリポーターのそれに匹敵しう ることを実証している（図7D）。従って、複数の基準で、FK1012によるFyn また はLck の誘導はTCR 媒介刺激を忠実に再現摩るようである。 Fyn またはLck シグナリングのTCR 複合体への依存性を検討するため、SF1Fyn またはSF1Lck＋MF3EをJurkat細胞のJ.RT-T3.5(22)のTCR サブクローン中に一時 的にトランスフェクションした。これらの細胞はTCR β鎖を持たないので、細胞 膜でTCR 複合体とアセンブル（結合）せず、アセンブルしないTCR 複合体サブユ ニットの小胞体(ER)中で分解または保持の増大を生ずる(36)。予想外なことに、 Fyn（図8A）またはLck の膜リクルートは、機能性TCR の不存在下でシグナリン グを開始した。これを調査するため、SF1Fynまたはキナーゼ欠損SF1FynΔK ＋MF 3Eを非リンパ球COS 中にトランスフェクションした（図8A）。やはり、Fyn の膜 リクルートはシグナリングに十分であったが、キナーゼ欠損SF1FynΔ Kはそのシ グナリング能力が不足していた。これらの結果は、Src 群キナーゼによるシグナ リングは抗原レセプター複合体を迂回することができるかもしれないことを示し ている。実施例２の参考文献

【手続補正書】 【提出日】１９９７年８月１１日 【補正内容】 明細書 遺伝子工学処理された細胞の条件的形質転換技術分野 本発明は、キメラ蛋白質を二量体または多量体の、好ましくは非ペプチドの、 リガンドで多量体化することに関する材料、方法および用途に関する。本発明の 側面は具体的には、成長因子に非依存的に細胞を増殖させる、細胞のリガンド媒 介トランスフォーメーション（形質転換）である。背景 宿主と免疫的に適合する骨髄を得るのが困難であることは、骨髄移植の有用性 を大きく制限している。不適合な骨髄は合併症を起こし、これはしばしば費用が かかり、また衰弱を生じさせるものであり患者の約20％が死に到る。これらの合 併症の殆どはオートロガス骨髄の使用により避けることができよう。このためヒ ト骨髄を培養する方法の開発が注目されてきた。かかる努力は、骨髄幹細胞の通 常とは異なる増殖法のため、あまり成功しなかった。現在まで、真正な多機能性 の幹細胞の培養を維持しうる細胞成長因子は見出されていない。いわゆる幹細胞 成長因子は、真正幹細胞よりも数段階多く分化し、従って特定の造血系に供され る細胞の増殖を実際に促進する。 一方、ガン治療における臨床研究とは別に、蛋白質の化学的誘導による二量体 化に基づく生物スイッチが開発されてきた。その研究の態様は、Spencer et al ，1993年11月12日，Science 262:1019-1024 および国際出願 PCT/US93/01617 お よび PCT/US94/08008(この３つの内容は参照としてここに援用する)に開示され ている。 ここでは、特に上記蛋白質の化学的誘導による二量体化により、悪性腫瘍の補 助治療のための、幹細胞などの細胞の増殖維持に使用できる方法および材料が記 載される。これらの方法は、種々のタイプの細胞の条件的増殖を生じさせ、そし て特に、造血性幹細胞、Ｔ細胞およびマクロファージの子孫を、必須のウイルス 性蛋白質を細胞の分解経路に向かわせることによりHIV に抵抗性とするために使 用できる。 興味ある背景技術の情報をさらに開示している説明的文献は、PCT/US93/01617 、特に１〜４頁に示されている。しかし、この開示からも明らかなように、これ まで誰も本発明を記載あるいは示唆していない。発明の要約 本発明は、細胞およびその子孫が条件的トランスフォーメーションを受けやす くなるようにするために宿主を遺伝的に操作するための材料および方法を提供す る。好ましくはこの細胞は哺乳動物由来、より好ましくはヒト由来であり、最終 的に分化していない、例えば造血幹細胞などの幹細胞または皮膚細胞である。か かる遺伝的操作および条件的トランスフォーメーションの方法は例えば上記細胞 集団の増殖に有用である。操作された細胞、またそれらを含む生物は臨床用途に おいてまた種々の研究および生産のための生物学的試薬として有用である。 本発明は、生きている細胞において遺伝子転写またはその他の生物学的事象を 引き起こすために、キメラ「リスポンダー(responder)」蛋白質のホモおよびヘ テロ多量体化を用いる方法および材料の適用に関する（ここで用いる多量体、多 量体化する、および多量体化という用語は二量体、三量体およびより高次の多量 体およびその生成を含む）。キメラリスポンダー蛋白質は、対応する多量体化剤 （例えばFKBPドメインの場合のFK1012分子）に結合しうる、１またはそれ以上の 特異的受容体ドメイン、例えばFK506 結合性蛋白(FKBP)ドメイン、を含む細胞内 で発現される融合蛋白質である。多量体化剤は、２以上のキメラ蛋白質分子上の 受容体ドメインに結合しうる多価リガンドである。２以上のキメラ蛋白質分子へ のこのような結合はキメラの二量体またはより高次の多量体を生じる。これらの キメラ蛋白質は対応する多価リガンドの結合ドメインを含むためにこのように多 量体化しうる。多量体化可能なキメラは受容体ドメインの他に別の１またはそれ 以上のドメインを含む。この別のドメインは、DNA 結合性ドメイン、転写活性化 ドメイン、膜標的化ドメイン（例えばミリストイル化シグナル）、細胞破壊ドメ イン、単鎖抗体（ScFV）のようなドメインまたはその他のドメインであってもよ い。キメラ蛋白質は、リガンド媒介多量体化が、そのような多量体化に応答性の DNA 要素の転写制御の下でのトランスフォーメーション遺伝子の転写、腫瘍サプ レッサーもしくはウイルス蛋白質の破壊、核もしくは細胞の膜などのトランスフ ォーメーション活性を担う細胞内部位へトランスフォーメーション遺伝子産物を 導くなどの生物学的事象を引き起こすように設計される。 本発明の種々の態様での使用に適用できる、リガンドおよびリガンド結合性ド メイン、また制御された転写やその他の生物学的事象のための成分および方法は 、国際出願 PCT/US93/01617 および PCT/US94/08008、またSpencer et al，Scie nce,1993(この内容は参照としてここに援用する)に詳細に開示されている。図面の簡単な説明 図１ （Ａ）可溶性および膜結合キメラ Sos分子の作成．アミノ酸残基２〜1333を含む 、hSos全長についてのプラスミドコード配列を、真核性発現ベクター pBJ5 の誘 導体(Spencer et al.(1993),Science 262，1019-1024; Pruschy et al.(1994)Ch emistry & Biology 1，163-172)の Xho 1-Sal部位におけるv-Src ミリストイル 化標的化ドメイン（残基1-14）の直ぐ下流にクローン化し、MSosE を得た。可溶 性作成物SSosE は、同じpBJ5- 誘導ベクターでミリストイル化配列の欠けたベク ターにhSosを入れることによって作成した。hFKBP から誘導されたFKBP12モジュ ール(Gulbins et al(1993)Science 260，822-825)を、(Spencer et al.,1993， 上記)に記述されているようなPCR によって増幅し、そして３つの縦列コピーでS SosE の Xho 1部位にクローン化して、SF3SosE を得た。このFKBP12モジュール 分子を、前述のベクターにおけるミリストイル化標的ドメインの下流に３縦列コ ピーでクローン化して、MF3Eを得た。作成物はいずれも蛋白検出を容易にするＣ 末端インフルエンザHAエピトープ標識を含んでいる。作成物の完全性は、ジデオ キシ配列 S,Sal 1; X，Xhol 1，Sc,Sac II; E,Eco R1によって証明された。 （Ｂ）膜標的Sos によるＴ細胞シグナル変換の活性化．Jurkat-TAg細胞(10⁷)を 、2 μg のNF-AT-SX分泌アルカリ性ホスファターゼ(SEAP)リポータープラスミド 、 および8 μg のMSosE、SSosE、4 μg の構成的に活性なv-Ha-Rasまたは優性で負 の(dominant negative)Ras の RSVN17Rasのいずれか、またはベクター単独（対 照）でトランスフェクションした。いずれのトランスフェクションにあっても、 いずれも等しいモル量のプラスミドがトランスフェクションされ、ベクターDNA を使用してDNA トランスフェクション量を一定とした。24時間のトランスフェク ションの後に各トランスフェクションからの10⁵細胞の部分を、培地単独、増殖 培地200 μl 中のイオノマイシン(１μM)、またはイオノマイシン＋PMA(25 g/ml )でさらに20時間刺激した。刺激に続いて培地をSEAP活性について試験した。(Gu lbins et al(1994)Mol.Cell Biol 14,906-913)。データは、イオノマイシン＋PM A で刺激したトランスフェクションからの細胞(100％)に対するイオノマイシン 単独で刺激したときの活性の割合で示す。データは少なくとも３回の別々に行っ た試験の平均を示し、平均＋SEM としてプロットしてある。挿入部：作成物の発 現を証明するために、上記トランスフェクションからのサンプルをRIPA緩衝液に 溶解し、HAエピトープ標識に特異的な12CA5 mAb を使用して免疫沈降させ、SDS- PAGE、次いで免疫ブロッティングによって分析した。 （Ｃ）)ミリストイル化したSos はカルシウム依存性のシグナルリング事象と協 働する。 Jurkat-TAg細胞を、2 μg のNIAT-SX、0.2 μg の構成的に活性なカル シニューリンCNMUT2B(Clipstone，N.A.&Crabtree,G.R.(1993)Annals New York A cad.Sci.696,20-30; O'Keefe at al（1992）Nature 357,692-695.)、および4 μ g のv-Ha-Ras，8 μg のMSosE、SSosE のいずれか、またはベクターだけを使っ て共トランスフェクションした。刺激およびSEAP活性の分析は（Ｂ）で述べたよ うにして行った。活性は、各トランスフェクションのサンプルについて、PMA で 刺激したときの活性に対して培地だけで刺激をしたときの割合で示す。 （Ｄ）膜標的Dbl およびVav はＴ細胞におけるシグナル変換を活性化させない。 Jurkat-TAg細胞を、（Ｂ）で述べたようにして、2 μg のNFAT-SX リポータプラ スミド、および8 μg の指示された発現プラスミドMDblE、McVavE、およびScVav Eを使って共トランスフェクションさせ、刺激し、そしてSEAPについて分析した 。MDblE は腫瘍形成(oncogenic)Dblからのアミノ酸残基２〜498 を含んでおり、 またMcVavEとScVavEは、図１Ａにおいて述べたように、ミリストイル化および可 溶 化ベクターにクローン化された、全長Vav がん原遺伝子の残基２〜845 を含む。 活性化はこの場合にも、イオノマイシン＋PMA で刺激した細胞に対してイオノマ イシンだけで刺激したときの活性の割合でもって示している。挿入部：エピトー プ標識作成物の発現は（Ｂ）におけると同様にして証明された。アステリシク記 号は12CA5 抗体によって認識される非特異的バンドを示す。図２ 可溶性およびミリストイル化Sos は、明確な細胞下局在化を示す。Cos-1 細胞 を、カバーグラスの上で、SSosE（A,B）または MSosE(C,D)発現プラスミドによ ってトランスフェクションし、12CA5 mAb およびFITC結合ウサギ抗マウス二次抗 体によって固定および染色し、そして共焦顕微鏡によって観察した。MSosE は細 胞膜に主として局在しており、SSosE は細胞質ゾル性のままである。図３ （Ａ）Ｃ末端のプロリンに富む領域に変異を有するSos 分子の作成。PCR による 部位特異的変異誘発を利用して、図示のアミノ酸を含有するプロリンに富む配列 の一方または両方を、図示のようにアラニンに変化させ、SH3 結合に対する共通 配列を破壊した。これらの変異の位置を、触媒ドメインおよびプレックストリン (pleckstrin)ホモロジードメイン(PH)に関して示す。改変Sos を第１図において 述べたベクターにクローン化し、MSosP1E およびMSosP1,2E を得た。 （Ｂ）Ｃ末端のプロリンに富む領域が変異した膜結合Sos 分子はもはやGrb-2に は結合しない。 Jurkat-TAg細胞を図示の膜結合Sos 作成物またはベクター単独と 、高い発現水準のためにpBJ5にクローン化された過剰の可溶性Grb-2 で共トラン スフェクションし、12CA5 抗体によって二重に(in duplicate)免疫沈降し、そし てSDS-PAGEによって分析した。サンプルを、Sos 作成物を検出するためには12CA 5によって、また共沈したGrb-2 の存在を検出するためには抗-Grb-2 mAbによっ て免疫ブロッティングした。 （Ｃ）膜結合Sos の活性はGrb-2 との相互作用に影響を受けない。Jurkat-TAg細 胞を、2 μg のNFAT-SX、および8 μｇの図示MSosE 変異体によって共トランス フェクションした。刺激およびSEAP活性の分析は第１図に説明したようにして行 った。データは、各トランスフェクションについて、イオノマイシン＋PMA で刺 激したときの活性に対してイオノマイシンだけで刺激したときの活性の割合で示 す。図４ （Ａ）FK1012 を使用してSos のGrb-2 誘導局在化の役割を模す。上欄: Grb-2 の Sos を細胞膜に局在化させる時の提案された生理学上の役割。下欄:FK1012 が細 胞膜でキメラSos/FKBPのミリストイル化FKBPへの局在化を誘導する。 （Ｂ）Sos の誘導可能な膜局在化によるRas の活性化。Jurkat-TAg細胞を2 μg NF-AT-SX、9 μg SF3SosE または4.5 μg(モル当量)SF3E、および1 μg MF3Eで 共トランスフェクションした。トランスフェクションから24時間後に、細胞をイ オノマイシン＋図示のFK1012希釈液で20時間刺激し、細胞上清を図１で説明した SEAP活性について分析した。データは、各トランスフェクションサンプルについ て、イオノマイシン＋PMA で刺激した後の活性化に対するイオノマイシン＋FK10 12で刺激した後の活性化の％として示す。全部のFKBP含有作成物の発現がイムノ ブロッティングにより確認された。(C)Sosの誘導可能な膜局在化によるRas の活 性化は、優性負のRas により阻害される。イオノマイシン＋図示のFK1012希釈液 を、4 μg 優性負のRas または4 μg ベクター対照のいずれかで（Ｂ）に記載の ように共トランスフェクションしたJurkat-TAg細胞に添加した。活性化を（Ｂ） に記載のように示す。 （Ｄ）Grb-2 の誘導可能な局在化はRas を活性化しない。イオノマイシン＋図示 のFK1012希釈液を、2 μg NFAT-SX、4 μg SF3GrbE または4 μg SF3Eと、１μg MF3Eとで共トランスフェクションしたJurkat-TAg細胞に添加した。活性化を、 （Ｂ）に記載のように示す。図５ （Ａ）キメラ細胞内シグナリング分子の作成。誘導可能な膜の標的化（ターゲッ ティング）に用いたSrc 群キナーゼ−FKBP12キメラの図式。Src 群キナーゼを図 示のようにＣ末端チロシン残基の変異により調節解除し、Ｎ末端ミリストイル化 標的ペプチド（残基１〜10）の切除(truncation)により不活性化する。SF1ΔSH3 Fynは残基１〜144を持たず、SF1ΔSH31SH2Fynは残基１〜254 を持たず、そして SF1ΔKFynはK296E 置換を有する。膜標的化は、これらの修飾キナーゼをFKBP12 標識(tagging)ベクターMF1E（ミリストイル化）またはSFIE（細胞質ゾル性）中 にサブクローニングすることにより達成される。 Ｍ：v-src からのミリストイル化標的配列(残基１〜14)(Spencer et al，1993上 記； Cross，1984，MCB)、 Ｓ：可溶性非ミリストイル化、 Ｕ：ユニークドメイン、 ｅ：インフルエンザ赤血球凝集素エピトープ標識（Field et al，1988，MCB）、 テイル(TAIL)：Ｃ末端調節性ペプチド。 （Ｂ）CD45タンパク質−チロシンホスファターゼおよびCsk PTK によるLck/Fyn の調節のモデル。CD45タンパク質−チロシンホスファターゼによるＣ末端ホスフ ェートの除去は、Lck/Fyn チロシンキナーゼ阻害を軽減し、下流シグナリングを 可能にする（Weiss，A.Y.，Littman,D.R．（1984）Cell 76，263-274からの修正 ）。 （Ｃ）合成リガンドによる誘導可能な膜標的化のモデル。 左：SRC 群キナーゼを、その膜標的モチーフをFKBP12により置換して不活性化 した。 右：膜透過性FK1012の添加により、チロシンキナーゼを細胞膜結合性タンパク 質MF1 にリクルートさせ、生物学的応答を誘発。 Ｙ＝チロシン、ＹＰ＝ホスホチロシン。図６ Src 群キナーゼの膜標的化による合成二量体を使用した誘導可能なシグナリン グ変換。 （Ａ）二量体リガンドFK1012がSF1Fynを細胞膜結合性タンパク質MFIEにリクルー トする能力を、Jurkat-TAg細胞中のNF-AT 応答性リポータープラスミドNF-AT-SX の誘導により検定する（Clipstone and Crabtree，Nature，1992，Northrup et al，1993，Nature）。これを、野生型Fyn(SF1Fynwt)または細胞質ゾル性FKBP12 （SE1E）のFK1012依存性リクルートに比較する。 （Ｂ）FK1012が複数のSrc 群メンバーを細胞膜結合性タンパク質MF3Eに標的化す る能力を、対照タンパク質SF1Eと比較した。 （ＣおよびＤ）そのSH3(ΔSH3)、SH3 とSH2(ΔSH3,2)、またはキナーゼ（ΔＫ） ドメインを持たない各種Fyn(Ｃ)またはLck(Ｄ)変異体のシグナリング能力を、FK 1012による膜標的化により、親作成物SF1Fyn（Ｃ）またはSF1Lck（Ｄ）と比べる 。対照として、ミリストイル化FKBP-Lck(MF1Lcvk)によるCID に依存しないシグ ナリングを示す。全部の作成物を、インフルエンザ赤血球凝集素エピトープ（Cr oss，1984，MCB）に対して12CA5 mAb を用いたウェスタンブロットにより検定し たところ、同様に発現した。図７ Src 群キナーゼの条件的活性化はTCR シグナリングを模す。CID 誘導Fyn（A） またはLck（B）による転写因子(Spencer et al，1993)群の誘導の比較。(C)優性 −負のRas(RSV-N17Ras、2 μg)またはFK506（2 ng/ml）がFyn またはLck の300 nM FK1012 による膜リクルートによるNF-AT 活性化を阻止する能力。 (D)１μm FK1012を使用したFyn およびLck による活性化の動力学の、マイトジ ェンまたは直接TCR 架橋（材料および方法の欄を参照）によるそれに対する検査 。図８ SF1Fynの膜リクルートが、TCR 複合体から独立してシグナリングを活性化。 （A）Fynのシグナリング能力をJurkat-TAg細胞のTCR 変異体，J.RT-T3.5（Weiss ，A & Stobo，J．(1984)，J．Exp．Med．160,1284-1299）中で、NF-AT の誘導を 検定することにより調べた。 （B）Fynまたはキナーゼ欠損Fyn(SF1FynΔK)のシグナリング能力を、AP-1の誘発 を検定することにより非T COS 細胞中で検査。（挿入部）12CA5 抗赤血球凝集素 mAbを用いた上記トランスフェクションからのサンプルのウェスタンブロット。１またはそれ以上のトランスフォーミング（形質転換性）遺伝子の調節的発現 本発明のある態様においては、例えば、国際出願 PCT/US93/01617 および PCT /US94/08008、またSpencer et al，Science,1993 に開示された調節的転写の手 法を応用して、所定のリガンドの存在に応答性の転写制御要素の発現制御の下で １またはそれ以上のトランスフォーミング遺伝子を含み、これを発現しうるよう に細胞を操作する。 ここで、トランスフォーミング遺伝子という場合２種類からなることがある。 第１のものはmyc、fos、myb などの、トランスフォーミング蛋白質をコードする DNA 配列であり、そのトランスフォーメーション能は過発現による。これらのト ランスフォーミング遺伝子は、以下に説明するように、制御しうる発現のために 所望の転写調節要素に連結していてもよい。トランスフォーミング遺伝子の第２ の種類は、ras、raf、sos やscr 様チロシンキナーゼなどの蛋白質をコードし、 そのトランスフォーメーション能は、細胞膜に位置していることおよび／または 活性化蛋白質の物理的近接により誘導されうるアロステリック変化によるもので ある。Src 様キナーゼの場合は、トランスフォーミング遺伝子を含むDNA 配列は 少なくともsrc 群のキナーゼ部分の活性型を含む蛋白質をコードする。第２の種 類のトランスフォーミング遺伝子、例えばras、raf、sos、活性化キナーゼ等は 細胞内標的化ドメイン（targeting domain）をコードするDNA 配列に結合したキ メラ遺伝子として制御されて発現する。かかる場合のトランスフォーミング遺伝 子産物は、核局在化配列又は細胞膜へ融合蛋白質を標的化するミリストイル化配 列などの標的化ドメインに融合した、トランスフォーミング遺伝子によりコード されるペプチド配列を含む融合蛋白質からなる。 調節可能な発現には、トランスフォーミング遺伝子（例えば、myc またはミリ ストイル化配列に連結したsos の融合蛋白質）をコードする第１のDNA 配列、お よびプロモーターやエンハンサー配列のような転写制御要素−これはキメラリス ポンダー蛋白質の多量体化に応答性である−を含む第２のDNA 配列を含む組み換 えDNA作成物（「標的遺伝子作成物(target gene construct)」）が必要である。 これらの態様の標的遺伝子は以下に説明するように、トランスフォーミング遺伝 子を含む。 所望のトランスフォーミング遺伝子のためのDNA 配列は慣用の手段で容易に得 ることができる。例えば、プライマーを所望の標的 cDNA の公開された配列に基 づいて設計し、慣用の方法で合成し、これを標準PCR 手法により標的遺伝子DNA を得るのに用いればよい。トランスフォーミング遺伝子配列のクローニングおよ び使用に関するDNA 配列の情報および他の情報は容易に入手できる。 本発明のこの側面は、１またはそれ以上のキメラリスポンダー蛋白質、それら をコードするDNA 作成物（「リスポンダー」作成物）、およびキメラ蛋白質を多 量体化しうる多価リガンド分子の使用に関する。これらは上で引用された特許文 献に詳細に記載されている。簡単に述べると、キメラ蛋白質は少なくとも１つの リガンド結合性（即ち「受容体」）ドメインおよび、キメラリスポンダー分子の 多量体化の際に、細胞内のトランスフォーミング遺伝子の転写を開始しうる作用 ドメイン(action domain)を有する。キメラ蛋白質はさらに、追加のドメインを 含有してもよい。これらのキメラリスポンダー蛋白質およびそれらをコードする リスポンダー作成物はその各種成分が異なる起源であり、自然には一緒には見出 されない（即ち、互いに異種である）という意味で組み換え体である。また、多 量体化剤の存在に応答性、即ち多量体化した上記リスポンダー蛋白質に応答しう る、転写制御要素の転写制御下のトランスフォーミング遺伝子を含む組み換えト ランスフォーミング作成物も提供される。転写制御要素は、トランスフォーミン グ遺伝子の転写が、これらの作成物を含む細胞中で多量体化リスポンダーキメラ の存在により活性化されるという意味で応答性である。言い換えれば、キメラリ スポンダー作成物を発現し、多量体化リガンドへの、応答性のトランスフォーミ ング遺伝子作成物を含む細胞の暴露によりトランスフォーミング遺伝子の発現を 生じる。本発明の作成物はネオマイシン耐性遺伝子（neor）や単純ヘルペスウイ ルスのチミジンキナーゼ（HSV-tk）のような１またはそれ以上の選択マーカーを 有していてもよい。リスポンダー作成物を含有し、かつ発現し、そしてトランス フォーミング遺伝子作成物を含有する本発明の遺伝子操作細胞を多量体化剤に暴 露すると、トランスフォーミング遺伝子の発現が活性化する。 改変細胞を作成するために、選択した宿主細胞に所望の作成物を導入する。こ れは慣用のベクター（これらの多くの種類が市販されている）および手法を用い て達成できる。所望により、１またはそれ以上の作成物をうまく導入した改変細 胞を次いで慣用の方法により選択し、他の細胞から分離し培養してもよい。 本発明の実施においてトランスフォーミング遺伝子の発現をひきおこすのに有 用な多量体化リガンドは、２（又はそれ以上）の受容体ドメインに、即ち、この ような受容体ドメインを含む２又はそれ以上のキメラリスポンダー蛋白質に結合 しうる。多量体化リガンドは、順に又は同時にキメラに結合し、好ましくは約10 〜6 以下のKd値で、より好ましくは約10〜7 以下 、さらにより好ましくは約10 〜8 以下で、場合によっては約10〜9M以下のKd値で結合する。リガンドは好まし くは、非蛋白質であり、約5kDaより少ない分子量を有する。さらにより好ましく は、多量体化リガンドは約２kDa より少ない、さらに好ましくは1500Daより少な い分子量を有する。 リガンド媒介多量体化によって、標的遺伝子(target gene)の転写をひき起こ しうるキメラリスポンダー蛋白質の設計および使用、またそれらをコードするDN A の設計、作成および使用はPCT/US94/01617及びSpencer et al、Science;1993 に開示されている。 簡単にいうと、キメラ蛋白質の作用ドメインは、多量体化により、同種の制御 要素の転写制御に下にある標的遺伝子の転写を活性化しうる任意の蛋白質又は蛋 白質ドメイン（好ましくは所望の宿主細胞または生物の種の）から選択すればよ い。例えば、キメラリスポンダー蛋白質分子の作用ドメインは、CD3 zeta サユ ニットのような蛋白質ドメインからなり、これは、リガンドに暴露され、次いで 多量体化されたとき、IL−2 プロモーターを介して転写活性化に導く検出可能な 細胞内シグナルを開始しうるものである。あるいは、例えば、一方がその作用ド メインとして、GAL4などのDNA 結合性蛋白質を含み、他方がその作用ドメインと して、VP16などの転写活性ドメインを含む一群のリスポンダー蛋白質がある。か かるリスポンダー蛋白質のヘテロ二量体化によりGAL4−VP16二量体を形成すると 、（ヘテロ）二量体化リスポンダー蛋白質が結合しうる要素の転写制御下の遺伝 子（この場合トランスフォーミング遺伝子）の転写を活性化する。このような態 様のすべてにおいて多量体化は、多量体化事象に応答性の転写制御要素（例えば 、エンハンサーおよび／またはプロモーター要素等）の転写制御下のトランスフ ォーミング遺伝子の転写を活性化する。 本発明の種々の態様のためのDNA 作成物は設計原理に従い、そしてここで引用 した特許文献−PCT/US94/0617 を含む−に開示された材料および方法を、ここに 記載し、以下の実施例に開示するように変形して用いて作成すればよい。 本発明はさらに、（これらのおよび他の態様のために）ここに記載した種々の 作成物を有するDNA ベクターも含み、これは組織培養における宿主細胞への導入 のため、胚への導入のため、インビボでの細胞への作成物の導入のための生物体 への投与のためであってもよい。いずれの場合も、作成物はエピソームにより、 又は染色体への組み込みのために導入されればよい。ベクターは、例えばアデノ 、アデノ関連又はレトロウイルスベクターを含むウイルスベクターであればよい 。作成物及びそれらを含むベクターは、作成物を含むトランスフェクタントの選 択を可能にする選択しうるマーカーを含んでいてもよい。 本発明はさらに、ここに記述した作成物を含有および／または発現する遺伝的 に操作された細胞を含み、これらは、原核細胞および真核細胞、特に酵母、虫、 昆虫、マウス又はその他のネズミ類、及びヒト細胞を含む種々のその他の哺乳動 物細胞および系統を含み、これらは凍結したものでも増殖中でも、また培養した ものでもそれらを含む生物体中のものでもよい。 かかる態様の遺伝子操作細胞は１より多いトランスフォーミング遺伝子（例え ば、myc およびsos-ミリストイル化配列融合物）を含有し、かつ調節的に発現で き、各遺伝子は同じ又は異なる多量体−調節発現制御の下にあってもよい。操作 細胞又はその子孫をキメラ転写制御蛋白質により認識される多量体化リガンドに 暴露すると、トランスフォーミング遺伝子を発現し、トランスフォーメーション された表現型に特有の細胞増殖を生じる。トランスフォーミング遺伝子産物の調節的局在化 他の態様では、トランスフォーミング遺伝子を条件的にトランスフォーメーシ ョンを行わせるように用いてもよい。即ちras、raf、sos、活性化キナーゼなど の第２の種類のトランスフォーミング遺伝子によりコードされるペプチド配列を 、FKBPドメインなどのリガンド結合性ドメインに融合させる。リガンド結合性ド メインはトランスフォーミング遺伝子産物に標的化能を与える。得られる融合蛋 白質は、膜結合性蛋白質又は他の局在化蛋白質とのリガンド媒介会合が可能であ り、こうして標的化しうるトランスフォーミング因子を構成する。局在化蛋白 質は、リガンド結合性ドメインおよび標的化ドメインを含む融合蛋白質であり、 ここで標的化ドメインは融合蛋白質を特定の細胞内位置、例えばミリストイル化 配列の場合は細胞膜、核局在配列の場合は核に導く。２又はそれ以上のリガンド 結合性ドメインに結合しうる、適宜選択された多価リガンドの存在下で、標的化 しうる（targetable）トランスフォーミング因子が局在化蛋白質との会合により 所望の細胞内位置に導かれる。 かかる態様では、細胞を、１またはそれ以上の標的化しうるトランスフォーミ ング因子および局在化蛋白質をコードする組み換えDNA 配列を含みかつ発現しう るように操作する。第１のDNA 配列は、トランスフォーミング遺伝子によりコー ドされるペプチド配列に融合したリガンド結合性ドメインからなるキメラ蛋白質 をコードする−このトランスフォーミング遺伝子は適宜細胞内環境（例えば、核 もしくはraf やsos のような蛋白質の場合は細胞膜）への局在化によりトランス フォーメーション経路を活性化するものである。第２のDNA 配列は、リガンド結 合性ドメインに融合した細胞内もしくは細胞下局在化ドメイン（例えば、細胞膜 に蛋白質を導くミリストイル化部位、または核もしくはその他の局在化シグナル ）を含むキメラ蛋白質をコードする。多量体化リガンドの存在下で、キメラトラ ンスフォーミング因子の分子はキメラ局在化蛋白質と多量体化し、こうして細胞 膜もしくはその他の標的部位に局在化する。２つのキメラ蛋白質をコードするDN A 配列はそれ自身、キメラトランスフォーミングおよび局在化蛋白質が結合する のと同じもしくは異なるリガンドを用いて、上記したようにリガンドにより調節 されて発現することができる。細胞はさらにmyc，fos，myb 等の蛋白質をコード するトランスフォーミング遺伝子−そのトランスフォーメーション活性は過剰交 換機能による−を少なくとも１つ含み、そのトランスフォーミング遺伝子は構成 的にあるいは上記したリガンド調節系の制御下に、上記キメラ蛋白質が結合する のと同じもしくは異なるリガンドの調節下に発現される。 本発明のこの側面を説明するために、本発明者らは複数のFKBPドメインに融合 したヒトSOS 蛋白質をコードする活性化作成物を調製した。膜結合性蛋白質をコ ードする第２の作成物を調製し、これは複数のFKBPドメインに融合したc-src 蛋 白質からの20個のアミノ酸のミリストイル化シグナルをコードする。これらの２ つの作成物をエレクトロポレーションによりJurkat Tリンバ球にトランスフェク ションを行い、二量体化試薬FK1012を操作細胞に加えると、AP-1およびNF-AT に よる転写活性化により示されるように、細胞でのトランスフォーメーション機構 の迅速かつ完全な活性化が生じる。 他の例では、多数のFKBPドメインおよびfyn，lck，lyn などの改変src 群のチ ロシンキナーゼを有する融合蛋白質からなる標的化可能なトランスフォーミング 因子をコードする作成物を調製した。src 群のチロシンキナーゼへの改変には、 既知のトランスフォーメーション変異の導入、トランスフォーメーション活性に 必要なミリストイル化配列の欠失、およびすべての非キナーゼドメインを含むそ の他のドメインの任意の欠失などがある。宿主細胞を次いで、かかる作成物、お よびFKBPを含有する膜結合性蛋白質をコードする作成物を用いてトランスフェク ションした。二量体化合成リガンド、FK1012の存在下で、標的化可能なトランス フォーミング因子は膜結合性蛋白質と会合し、こうして細胞膜に向かい、そこで トランスフォーメーション過程を活性化する。このことは、AP-1などのトランス フォーミング蛋白質の転写活性が進むことにより証明される。腫瘍サプレッレーの調節的破壊 本発明のその他の態様では、細胞を、１またはそれ以上の次のドメインの種々 の組み合わせからなるキメラ蛋白質をコードする組み換えDNA 配列を含有し、か つ発現しうるように操作する：標的結合性ドメイン（単鎖FVまたはその他の抗体 部分）、多量体化リガンド結合性ドメイン、および分解もしくは破壊のためのキ メラを標的とするドメイン。 かかる態様の１つには、これらの２つのDNA 配列を含有するように操作した細 胞がある。第１のDNA 配列は、リガンド結合性ドメインおよび腫瘍サプレッレー 結合性ドメインを含有する第１のキメラ蛋白質をコードする。第２のDNA 配列は 、リガンド結合性ドメイン（これは第１のキメラのリガンド結合性ドメインと同 じでも異なっていてもよい）および分解または破壊のためのキメラを標的とする ドメインを含有する第２のキメラ蛋白質をコードする。第１および第２のキメラ に結合しうる多量体化リガンドの存在下でキメラが多量体化する。第１のキメラ が 結合する腫瘍サプレッレーはこうして分解標的化ドメイン（degradation target ing domain）に途中で（in trans）で連結され、それにより破壊の標的となり操 作細胞から効率的に除去される。 本発明のかかる態様で標的となるべき腫瘍サプレッレーはp15，p16，p21，p27 、R6等を含む。Weinberg，1991，”Tumor Suppressor Genes”Science 254:1138 -1146参照。分解標的化ドメインには、cyclin destruction boxやjun degradati on signalがある。腫瘍サプレッレー結合性ドメインは、関連する腫瘍サプレッ レーを認識しうる単鎖FV断片（ScFV）の形で容易に調製できる。 その他の態様では、細胞を、目的の標的に向かうScFVなどの標的結合性ドメイ ン、および例えば蛋白質分解経路を介して分解または破壊するためのキメラを標 的とするドメインを含有するキメラ蛋白質をコードするDNA 配列を含むよう操作 する。そのDNA 配列は、所定のリガンドの存在に応答性の転写制御要素の発現制 御の下で、例えば上記した国際出願PCT/US93/01617およびPCT/US94/08008に開示 された転写調節の手法を適用して、結合させる。ウイルス成分の調節的分解 上記の調節的破壊の２つの方法は、１またはそれ以上の腫瘍サプレッレーを標 的とすることから、１またはそれ以上のウイルス蛋白質、特にHIV ウイルスの１ またはそれ以上の必須蛋白質を標的とすることにまで広げられる。かかる場合で は、ScFV含有キメラをコードする組み換えDNA 配列を上記のようにして、ただし HIV 蛋白質、とりわけHIV プロテアーゼ、nef に関して用いる。造血幹細胞への 組み換えDNA 分子の導入により、組み換えDNA を発現しうるマクロファージおよ びＴ細胞への経路を提供する。かかる細胞は標的ウイルス蛋白質の分解のための リガンドにより調節される系を含有し、その意味でウイルスに対するリガンド誘 導耐性により特徴づけられる。リガンドおよびDNA 作成物の成分 本発明の組み換えDNA への組み込みのための種々のDNA 配列をPCT/US94/1617 に記載のようにして得ることができる。これらには細胞性局在化シグナル（キメ ラを細胞膜に導くためのミリストイル化部位）をコードするDNA 配列、およびリ ガンド結合性ドメイン（天然のまたは遺伝子操作したFKBPまたはシクロフィリン など）をコードするDNA がある。 ScFVは、所望の腫瘍サプレッレー（またはウイルス蛋白質もしくはその他の標 的）に対する抗体の一部（これも慣用の方法で製造できる）をコードするクロー ン化DNA を用いて慣用の方法で製造できる。例えば、慣用の方法を用いて、所望 の腫瘍サプレッレーを特異的に認識するmAbsを得ることができる。このような抗 体を産生するマウスハイブリドーマまたは脾臓細胞から出発して、市販のRecomb inant Phage Antibody System(組み換えファージ抗体系)およびpCANTAB 5 Gene Rescue and Sequencing Primers(ファルマシアバイオテク)(または同等のもの) を用いて、所望のScFVをコードするDNA を含有するファージを生成させてもよい 。Analects 22(1):1-7(Winter 1993)およびそこに引用された文献参照。所望のS cFVをコードするDNA は、リガンド結合性ドメインをコードするDNA の3'末端に 容易に連結させて、リガンド結合性ドメインおよび腫瘍サプレッレー結合性ドメ インを含有する、上記キメラ蛋白質をコードする組み換えDNA を生成させること ができる。 jun およびcyclin destruction boxのような分解標的化ドメイン、またはユビ キチン結合性酵素ドメインは、PCR を介してクローン化しても、自動オリゴヌク レオチド合成操作を用いで合成してもよい。 多種類のトランスフォーミング遺伝子が知られており、クローニング(PCR)に よりもしくは重複合成オリゴヌクレオチドの集合により得られる。例えば、McCo rmic，”ras Oncogenes”pp125-145; Hunter，"Oncogene Products in the Cyto plasm: The Protein Kinases"，pp147-173; Eisenman，”Nuclear Oncogene”pp 175-221 およびOncogenes and the Molecular Origins of Cancer（Cold Spring Harbor Press，1989，Weinberg，ed.）のその他の章参照。DNA 作成物の設計および調製 種々の成分をコードするDNA 配列は、PCT/US94/1617 に記載の方法に類似した 方法で所望のキメラをコードする組み換えDNA 分子に集めることができる。組み 換え分子は増殖およびトランスフェクションのためにベクターに集めるか移せば よく、このベクターはさらに所望のプロモーター／エンハンサー要素などの転写 制御要素、および複製起点や選択マーカーなどの慣用の遺伝子要素を含有してい てもよい。細胞 本発明によりいかなる真核細胞も操作できる。しかし、哺乳動物由来の造血幹 細胞、例えばマウスまたは好ましくは霊長類、特にヒト由来のものが好ましい。 各細胞種および由来に慣用の方法も用いて細胞を得て、操作し、培養する。作成物の細胞への導入 作成物を細胞に導入するには、エレクトロポレーション、リポソームトランス ファー、DEAEトランスフェクションおよびリン酸カルシウムトランスフェクショ ンなどの慣用の方法を用いればよい。トランスフェクタントを慣用の方法および 材料を用いて選択する。次いで細胞を条件的トランスフォーメーションまたは細 胞増殖に有効な量の多量体化リガンドを含む培地で培養する。次いで細胞を洗浄 しするか操作し、最後に、幹細胞の場合は骨髄移植のための確立された手法を用 いて移す。用途：臨床および非臨床 本発明の条件的トランスフォーメーションされたオートロガス(CTA)幹細胞の 集団を、細胞の増殖に有効な量の多量体化リガンドを含む培地において培養する ことにより増やす。こうして産生された細胞はガン化学療法の補助として必要に 応じて患者に投与することができる、例えば提供された骨髄細胞での骨髄移植に 代わるものとして白血病、リンパ腫、および種々の固形腫瘍に対して用いられる 。上記したようにHIV に対して抵抗性としたCTA 幹細胞を用いて骨髄移植を行っ てもよい。操作細胞中に存在するキメラ蛋白質の多量体化を引き起こすのに有効 な量の多量体化リガンドを患者に投与すると、それらの細胞およびその子孫をHI V に抵抗性にする。また、内皮細胞を本発明により条件的トランスフォーメーシ ョ ン特性を付与するように操作してもよい。次いでかかる細胞の培養を、細胞増殖 に十分な量の多量体化リガンドを含む培地中で行う。こうして得られた細胞を次 いでCTA 皮膚幹細胞に移植してもよい。 本発明の方法および材料は非臨床目的に用いてもよい。例えば、非対称細胞分 裂の研究のために、トランスフォーメーション機構を研究するために、またその 他の研究目的で研究所に提供するために、幹細胞を増殖させるのに用いてもよい 。 実施例 実施例１：標的化可能なSos タンパク質および膜結合性タンパク質のリガンド媒 介会合を経たRas 経路の調節可能な活性化材料および方法 細胞系およびトランスフェクション・アッセイ ．本研究に使用したCOS 細胞は、 10％(vol/vol)ウシ胎児血清およびペニシリン／ストレプトマイシンを追加したD ulbeccoの修飾イーグル培地で増殖させた。Jurkat-TAg細胞(16)を、10％ウシ胎 児血清、L-グルタミン、およびペニシリン／ストレプトマイシンを追加したRPMI 1640 中に維持した。トランスフェクションのために、10⁷個のJurkat-TAg細胞 を、指示された量の発現プラスミドと共に培地0.4 ml中にて960 μFD、250 V で エレクトロポレーションした。SEAPリポーター活性をアッセイするため、トラン スフェクションされ、指示されたマイトジェンおよびFK1012で刺激された熱不活 化（68℃、１時間）サンプル100 μl を、100 μl 2Mジエタノールアミン(pH 10 .0)，1mMメチルウンベリフェリルホスフェート(MUP)に添加し、37℃で数時間イ ンキュベーションし、Titerteck Fluorescan II(ICN)を用いて、発光波長355 nm および460 nmで蛍光単位を測定した。タンパク質分析 ．タンパク質発現を監視するため、細胞をRIPA緩衝液（150mM Na Cl，20mM Tris pH 7.5，0.5%デオキシコール酸ナトリウム，0.1% SDS，1% Trito n X100，1mM PMSF，1mM ベンザマジン，１μg/mlアプロチニン、１μg/mlアンチ パイン，１μg/mlロイペプチン）中でトランスフェクション後40時間溶解処理し 、 ライゼートをタンパク質Ａ−セファロースに予め結合させたmAb 12CA5（BABCO） により免疫沈降させ、10％SDS-PAGEで分析し、ニトロセルロースにエレクトロト ランスファーした。ブロットを12CA5 およびホースラディッシュペルオキダーゼ (HRP)複合化ウサギ抗マウスIgG（Zymed）で検出し、タンパク質をECL(Amersham) で視覚化した。共免疫沈降アッセイのために、トランスフェクションしたJurkat -TAg細胞をHNTG溶解緩衝液（50mM HEPES pH 7.5，150mM NaCl，10%グリセリン， 1% Triton X100，1.5mM MgCl，1mM EGTA，1mg/ml BSA,上記のプロテアーゼ阻害 剤）中で溶解処理した。ライゼートを上記のようにして12CA5 で免疫沈降させ、 HNTG緩衝液（50mM HEPES，10% グリセリン，0.1% Triton X100，150mM NaCl）中 で強力に洗浄した。同じ免疫沈降物を、10％SDS-PAGEゲル上で分析し、ブロット を12CA5 で検出するか、または12％SDS-PAGEゲル上で分析し、ブロットを抗Grb- 2 mAb（Transduction Laboratories）で検出した。免疫蛍光顕微鏡観察 ． COS細胞の50％全面単層(confluent monolayer)を、カバ ーガラス上でリポフェクトアミン(LipofectAmine，GibcoBRL)を用いて、指示さ れたプラスミドDNA でトランスフェクションした。24時間のトランスフェクショ ン後、細胞を４％パラホルムアルデヒドで15分間固定し、0.1％ Triton X100で ５分間透過処理し、12CA5 一次抗体で、次にウサギ抗マウスFITC複合化二次抗体 （Pharmingen）で染色した。共焦点(confocal)顕微鏡を用いて免疫蛍光を視覚し た。結果 Ｔリンパ球中のSos の膜局在化 ．Sos の膜局在化がＴ細胞のシグナリング（シグ ナル伝達）を活性化することができるという証拠が、v-src ミリストイル化配列 Ｎ末端をSos のコーディング（解読）領域に融合させることにより得られた（図 1A）。ミリストイル化配列をなくした、可溶性Sos をコードする対照ベクターも 作成した。この作成物に、細胞中のキメラ分子の合成を視覚化するため、インフ ルエンザウイルスの赤血球凝集素(HA)に由来するＣ末端エピトープ標識(tag)を 添加した。可溶性のミリストイル化されたSos タンパク質の局在化を、共焦点顕 微鏡によりCOS 細胞中に確認したが、これは特異的細胞局在化／形態をこの細胞 系中で最も容易に観察することができたためである。可溶性Sos 作成物の発現は 専ら細胞質ゾル(cytosol)中に局在化した(図2A，B)。Sos のミリストイル化は、 主に原形質膜（細胞膜）での局在化を生じた（図2C,D）。シグナリングにおける Sos 局在化の役割を評価するため、これらの分子を、NF-AT 応答性プロモーター 要素の制御下に、高発現のために分泌アルカリ性ホスファターゼリポーター遺伝 子と一緒に、SV40 largeＴ抗原（Jurkat-TAg細胞）を発現するヒトＴ細胞系中に 共トランスフェクションした(17)。NF-AT は、IL-2エンハンサー内の領域に結合 する転写因子であって、免疫応答に必要な細胞の作用を調整するIL-2、IL-4、GM CSF およびCD40リガンドのような遺伝子の転写に不可欠である。NF-AT 転写複合 体(complex)は、TCR を経たシグナリング、ならびにNF-AT 依存性転写を活性化 するように相乗作用を発揮するホルボールエステルおよびイオノマイシン（カル シウムイオノホア）のような薬理学的薬剤によるシグナリングに応答する(18-21 )。Ｔ細胞シグナル変換(signal transduction)の活性化を、分泌アルカリ性ホス ファターゼリポーター遺伝子のNF-AT 依存性転写の誘導と、培地中のアルカリ性 ホスファターゼの蓄積とにより検定した。構成的に(constitutively)活性なカル シニューリン(calcineurin)のトランスフェクションは、Ｔ細胞シグナリングに おけるカルシウム依存性の事象に機能的に置き替わることができる(17,22,23)が 、構成的に活性なRas(v-Ha-Ras)の発現は、ホルボールエステル刺激の必要性を 迂回することができる(24)。可溶性およびミリストイル化されたSos 作成物の活 性を、イオノマイシン刺激により誘導されたカルシウムシグナルに応答するシグ ナルを生ずるその能力について検定した。構成的に活性なRas かミリストイル化 Sos のいずれかが、イオノマイシンと相乗的に作用し、Ｔ細胞中のNF-AT 依存性 転写を活性化させる（図1B）。これに対して、可溶性Sos はベクター単独のレベ ルより少ししか高くない活性化を示した。同様の結果が、ホルボールエステル刺 激とは無関係にAP-1依存性リポーター遺伝子の転写を活性化する際にこれらの作 成物で得られた。ミリストイル化Sos の発現により誘導されたシグナリングは、 優性で負の(dominant negative)N17Ras の共トランスフェクションにより阻害さ れた（図1B）。これらのデータは、膜結合Sos によるシグナリングがRas 経路の 活性化により媒介されるという考えと一致する。構成的に活性なRas および ミリストイル化Sos は（可溶性Sos ではなく）、構成的に活性なカルシニューリ ンと相乗的に作用し、追加の刺激が全くなくても、NF-AT を活性化させる（図1C ）。これはSos がＴ細胞活性化のRas 依存性経路上で専ら機能することを意味し ている。ミリストイル化Sos はイオノマイシン刺激またはカルシニューリン遺伝 子の共トランスフェクションのいずれかがないと不活性である。これらのデータ は、繊維芽細胞における全長Sos(26)およびSos の触媒ドメイン(27)の膜局在化 もRas 依存性シグナリングを活性化するという最近発表された知見と一致する。 Ｔ細胞中のRas 活性化に対するSos の特異性を調査するため、ヒトCDC42 タン パク質を含む小GTP 結合性タンパク質のRho/Rac サブファミリーのメンバーに対 してGEF 特異的であると考えられたDbl 発ガンタンパク質(oncoprotein)の活性 に対してSos の活性を比較した(28-30)。また、(32)に解説されている多様なシ グナル変換経路内に包含される造血特異的タンパク質であるVav がん原遺伝子(p roto-oncogene)(31)の産物の活性を調査した。Vav が特に興味あるのは、これが 、TCR 活性化に続いてチロシンホスホリル化されることが示されたからであり(3 3)、また未確認の報告ではこれがLck 並びにジアシルグリセリン結合によるホス ホリル化に続いてRas 特異的GEF 活性を示すことが示唆されているからである(3 4,35)。これは、Vav の触媒領域が交換因子のRho/Rac 群に相同性であり(36)、R hoAおよびDbl に類似のトランスフォーメーションを示し、Ras 媒介トランスフ ォーメーションとは異なる表現型変化を誘発する(37,38)ことからみて予想外で ある。予想された通り、ミリストイル化Dbl はＴ細胞活性化においてRas 依存性 経路を活性化することができなかった（図1D）。これは、膜標的GEF によるRas に対する特異性が不可欠であることを意味している。面白いことに、野生型可溶 性Vav がん原遺伝子(ScVavE)の発現は、イオノマイシンまたはPMA が存在しなく てもNF-AT 依存性転写を最大刺激の約15％のレベルまで活性化し（図1D）、これ はSos とは異なり、これがNF-AT で指示された転写に対して弱いが十分なシグナ ルを付与することを意味している。ミリストイル化Vav(McVavE)はイオノマイシ ンが存在しないとNF-AT 依存性転写を活性化せず、イオノマイシンの添加後にほ んの僅か上昇しただけであった。McVavEタンパク質はScVavEタンパク質より安定 性が低いようであり（図1D，挿入）、ミリストイル化Vav の低下した活性は、単 に より低いタンパク質発現の結果であるかもしれない。これらの結果は、Vav がNF -AT 依存性転写により現れるTCR シグナリングに或る役割を果たすが、その役割 はSos のそれとは異なるらしいということを示している。Ras 活性化におけるGrb-2 の役割 ．完全なSos Ｃ末端ドメインを維持しながらミ リストイル化Sos とのGrb-2 相互作用を排除するため、Grb-2 相互作用に不可欠 であることが見出された２つのプロリンに富む配列(39)を変異させた。各ドメイ ンの共通のPPR を、Grb-2 SH3 ドメインとの相互作用をなくすためにAAA に変化 させた（図3A）。MSosE 免疫沈降物を抗Grb-2 抗体によるウェスタンブロッティ ングによりGrb-2 について分析した。残基1147〜1156の共通配列の突然変異は構 成的Grb-2 結合を約50％低下させたが、残基1290〜1295の部位の追加の変異によ り検出可能なGrb-2 相互作用が消失した（図3B）。これは高親和性Grb-2/Sos 相 互作用が両方のGrb-2 SH3 ドメインの同調結合を必要とするという知見と一致す る(39)。Sos とのGrb-2 相互作用の役割を同定するため、これらのミリストイル 化Sos 変異体をＴ細胞中のRas 依存性シグナリングを活性化するその能力につい て検定した。Grb-2 相互作用の消失は膜結合Sos シグナリングに何の影響も及ぼ さなかった（図3C）。これは、グアニンヌクレオチド交換因子Sos を膜に局在化 させるが、立体構造の変化を誘発しないというＴ細胞中のGrb-2 の役割と一致す る。これらの結果は、Sos が膜に構成的に局在化された時にはGrb-2 相互作用と は独立して機能できることを実証している。Sos の条件的アレレの開発 ． Sosの構成的活性化はRas 活性化経路の下流側の全 シグナルの持続した活性化を生じ、フィードバック経路を開始させ、Ras の下流 側の即時の作用を隠蔽（マスク）する可能性がある。さらに、ミリストイル化配 列の追加によりSos に膜局在化を及ぼすと、偶然の立体構造変化を誘発すること によりそのGEF 活性を活性化することがある。これらの妨害を避けるため、合理 的に設計された化学的二量体化誘導剤(CID)であるFK1012を用いて膜局在化を誘 導することにより、Sos の膜リクルート(membrane recruitment)におけるGrb-2 の役割を模した、Sos の条件的アレレ（対立遺伝子）を工夫した。このSos アレ レは、細胞表面レセプターの細胞内オリゴマー化を誘導するために最近開発され た技法を修正することにより設計した(40,41)。可溶性Sos をFKBP12(SF3SosE) の三つのドメインに融合させ、Jurkat-TAg細胞中で膜結合ミリストイル化FKBP(M F3E)と共発現させた。CID(FK1012)の添加により、膜結合FKBPによる可溶性Sos の局在化、およびRas の活性化を生じた（図4B）。膜のミリストイル化配列また はSos へのFKBPの融合がより少ないと、恐らくFK1012の内生FKBPとの効果的では ない相互作用およびMF3Es とSosFKBPのホモ二量体化のために、あまり最適では ない膜局在化を生じた。FK1012により膜にリクルートされた可溶性Sos により誘 導された活性化は、優性負のRas の共発現により阻害された（図4C）。これらの データは、CID FK1012の添加により誘導されたシグナルは実際にはRas 依存性シ グナリングの活性化に起因し、細胞膜へのSos の標的化（ターゲティング）それ 自体はRas の活性化を容易にするという強力な証拠を与える。 繊維芽細胞における以前の研究は、Sos がGrb-2 との既に存在する複合体中で 刺激前に存在することを示していた。実際、一部のGrb-2 は刺激前にＴ細胞中で Sos と共沈降させることができ（図3B）、膜へのGrb-2 の局在化がSos をリクル ートすることがあり、Ras 依存性シグナルを活性化させるかも知れないことを示 唆している。Ｔ細胞におけるこの可能性を評価するため、FKBPモジュールの３縦 列コピーを含む修飾ヒトGrb-2 分子，SF3GrbE を、SF3SosE の産生について説明 したのと同様に生成させた（図1A参照）。細胞をMF3EおよびSF3GrbE で共トラン スフェクションし、KF1012で処理して膜に修飾Grb-2 をリクルートし、イオノマ イシンで刺激した。Sos の膜リクルートとは異なり、このGrb-2 の膜への再局在 化は、Ｔ細胞のRas 依存性シグナル変換を活性化しなかった（図4D）。FKBPモジ ュールＣ末端のGrb-2 への配置(SGrbF3E)またはＮ末端ミリストイル化配列の追 加による膜へのGrb-2 の構成的局在化(MGrbE)も、同様にRas を活性化しなかっ た。これらの結果は、別のレベルの調節がSos/Grb-2 相互作用を調節するＴ細胞 活性化に存在することを示唆している。これらのデータは、Grb-2 の修飾がその Sos との相互作用を排除するかもしれないという論理を妨げるものではないが、 Grb-2 の３種類の別々の修飾がRas 活性化を生じなかったことからありそうにも ない。論考 Ｔ細胞活性化におけるRas の役割は明らかになっているが(42)、その活性化の メカニズムおよび完全な因果関係は多くの討論の主題となってきた。本発明者ら の研究は、Ｔ細胞における少なくとも１つのメカニズムがSos の膜リクルートに より媒介されうることを示している。膜近接性(proximity、膜に近いこと)はRas 依存性事象にとって不可欠である。なぜなら、RasGAP(43)およびRaf(44,45)の ようなRas 経路の他の成分も膜局在化により活性化されうるからである。TCR に よるGrb-2/Sos 膜リクルートはShc により媒介される可能性もあるが、TCR 刺激 後にShc 上でのチロシンホスホリル化は低レベルでしか検出されない(46)。これ に対して、細胞の粒子分画に局在化させた36〜38 kD チロシンリンタンパク質(4 6,47)は、TCR 刺激後にGrb-2/Sos と会合することが見出され、これはレセプタ ー刺激後の膜へのGrb-2/Sos の移動の原因であるかも知れない。実際には、Ｔ細 胞中の膜へのSos のリクルートは、繊維芽細胞で実証された予め形成されたGrb- 2/Sos 複合体の膜への局在化より複雑であるかも知れない。最近の研究は、Ｔ細 胞中ではGrb-2とSos との相互作用を抗原レセプターの活性化後に誘導しうるこ と、およびこの会合は、Grb-2 SH2 ドメインとShc からのホスホチロシン含有ペ プチドとの相互作用によりインビトロで増強させることができたことを示してい る(48)。これは、構成系と誘導系の両方でのGrb-2 単独の膜リクルートがRas 活 性化を生じなかったという本発明者らの知見と一致する。 Grb-2 がSos の立体構造の変化を誘導し、それによりその触媒活性を活性化さ せる可能性は、変異させたSH3 結合性領域でのGrb-2 とSos との間の検出可能な 相互作用の不存在下でMSosE がRas 経路を完全に活性化させることができること からみて、もはや考えられない。これは、インビトロでのSos へのGrb-2 結合が 、グアニンヌクレオチド交換活性に測定可能な影響を及ぼさないことを示すデー タ(49)と一致する。さらに、生物物理学的研究では、Grb-2 SH3 ドメインがホス ホチロシンペプチドへのGrb-2 SH2 結合の後に立体構造変化を示さないことが示 された(50)。実際、哺乳動物細胞におけるデータとは異なり、ショウジョウバエ (Drosophila)Sosの先端（apical）膜局在化はDrk とは独立していることが示さ れ、ショウジョウバエSos プレックストリン(pleckstrin)ホモロジー領域とセベ ンレス(Sevenless)レセプターそれ自体との間の相互作用が示された(51)。Sos Ｃ末 端ドメインの除去は、Sos 活性を強めることが示された。これは、Sos Ｃ末端へ のGrb-2 結合が負の調節領域を除去するかも知れないことを示唆している(26,51 )。しかし、Sos Ｃ末端ドメインの欠失は、Sos を活性化しない可能性があり、 むしろ、MAPK族のメンバーによるホスホリル化の部位を除去するかも知れず、こ れはフィードバックループにおいてSos を負に制御するかも知れない(52)。さら に、通常は触媒ドメインと並列しているSos Ｃ末端ドメイン全体の欠失は、正規 ではない立体構造変化を誘導することがあり、触媒活性がより高くなるか、また は触媒ドメインのRas への接近性がより大きくなる。 TCR 活性化におけるVav の役割も不明のままである。突然変異Vav アレレを含 有するES細胞による胚盤胞(blastocyst)相補性を利用した分析が、最近TCR によ るシグナリングにおけるVav の役割と関係していた。Vav の活性化は、通常はTC R レセプター刺激後に存在する追加のシグナルを必要とするが、我々のデータは 、Vav がＴ細胞中でRas に対する膜リクルートGEF ではないことを示唆している 。このイオノマイシンの存在下でミリストイル化Vav の発現により引き出された 低水準のシグナリングならびにイオノマイシンの不存在下での可溶性Vav の低い 基底活性は、Vav がSH2、SH3、プレックストリンホモロジー、およびロイシンに 富むドメインを含むタンパク質−タンパク質相互作用に重要な多様なモチーフを 含有しているので、恐らく膜への他のシグナリング成分のリクルートにより生じ たと考えられる。実際、Vav はまた細胞骨格成分、細胞形状および運動性(motil ity)を変化させるのに必須のRho/Rac 特異低GEF としての役割も果たすことがあ る。Vav GEF 基質特異性の正確な規定とその各種ドメインの役割が、Ｔ細胞活性 化におけるVav の正確な役割を規定するのに必要である。 別の研究が、Grb-2 がSos を細胞膜に結合させる機能を果たし、その構成的GE F 活性を膜会合Ras に発揮させることができるという仮説と一致する。Grb-2 の 役割および成長（増殖）因子レセプターとSos との間の相互作用を媒介するシグ ナリング経路におけるその挿入に対する原理(rationale)は、最初は余分または 奇異であると見なされるかもしれない。しかし、この形態の誘導可能なリンカー (linker)で媒介される二量体化は、生物学で普通に見られるものであり、これは ２つの利点を持つことを提示しておく。まず、生物学的応答を媒介するために特 異的接触がGrb-2 の片側で保持されるに違いないので、これはレセプターとSos との相互作用の生物学的特異性を向上させる。第二に、生物学的応答はGrb-2 と の２つの結合のいずれかの解離により停止させることができるので、リンカー媒 介二量体化はシグナル変換にとってより有利な動力学を生ずる。レセプターとの Grb-2 のインビボの解離速度がSos とのGrb-2 の解離速度と似ていると、解離速 度の二倍の増加が実現されよう。現時点では、インビトロでの個々のペプチドの 溶液測定だけが利用可能であり(56,57)、高い非対称相互作用がこの形態の媒介 二量体化に有利な動力学を低下させよう。この形態の誘導された二量体化を利用 する他の生物学的プロセスは、IL-2および TGFベータ(58,59)のような成長因子 によるレセプターのヘテロ二量体化、およびTAF により媒介される転写活性化剤 とTBP との間の容易になった相互作用を含む。Sos の条件的アレレを作るには、 膜へのSos の局在化を誘導するために合理的に設計されたCID を用いて、この天 然形態のリンカー媒介二量体化を模した。 膜へのSos の局在化を誘導的に調節するための条件的アレレの使用は、膜への Sos 単独のリクルートはRas 活性化を生ずることを明らかに実証している。誘導 可能な活性化もこの経路の長い活性化から生ずるかも知れない補償またはフィー ドバックシグナルを最小限にし、直ぐのおよび長期の両方のRas 活性化に続く事 象の経時的な分析を可能にしよう。ここに実証したRas の誘導可能な活性化に加 えて、膜局在化によるチロシンキナーゼのSrc 様群メンバーの誘導可能な調節も 達成された。これは、多様なシグナル変換事象を研究する際のCID 媒介タンパク 質の局在化の利用を例示する。このGEF のリガンド誘導活性化法は、ベシクル（ 小胞）輸送、分泌、および細胞骨格性再配列に含まれるような他のRas 様GTP 結 合性タンパク質の特異的調節にも適用しうる方法を示す。 実施例１に関する参考文献 実施例2 ：Src 群チロシンキナーゼの標的化可能な条件的アレレ材料および方法 プラスミドクローン ．本研究で使用した発現プラスミドは図5A以下に示される。 PCR により作成されたこれら作成物の全部について配列決定した。タンパク質発 現はインフルエンザ赤血球凝集素エピトープ標識(12CA5)(7)を用いたウェスタン ブロット分析により確かめた。マウスLck，FynおよびLyn鋳型、それぞれm-lck,p mTF およびlynAF からであった(18,19)。プライマーをXho I(5'プライマー)また はSal I(3'プライマー)部位でフランキングし(flanked)、得られた断片をpKS(St ratagene)中にサブクローンニングし、配列決定し、既述のSF1E（SF1系）または JFIE(MF1 系)(5)のSal I 部位中にサブクローンニングした。RSV-N17Ras(20)が 優性−負のHarvey Ras変異体である。 リポータープラスミドNF-AT-SX，IL-2-SX，AP-1-SX，NF κB-SXおよびOct/OAP -SXは記載されたものである(5)。簡単に説明すると、これらは分泌アルカリ性ホ スファターゼ(SEAP)発現を椎進する最小インターロイキン２(IL-2)プロモーター [-70〜+47(21)]の上流側でクローン化された各種の転写因子に対する多結合部位 を含んでいる。細胞系および組織培養 ．Jurkat-TAg細胞，J.RT-T3.5 細胞(22)およびCOS(サル腎 臓)細胞をこれらの研究に使用した。Jurkat-TAg細胞およびCOS 細胞はサルウイ ルス40大腫瘍抗原を含み、この抗原はサルウイルス40開始点(origin)を含むプラ スミドの複製が可能である。J.RT-T3.5 はJurkat細胞の、TCR β鎖欠損サブクロ ーン(20)である。全細胞を増殖させ、10％(vol/vol)ウシ胎児血清、10 mM Hepes (pH 7.4)およびペニシリン／ストレプトマイシン加 RPM1 1640培地中でエレクト ロポレーションした。エレクトロポレーションおよびSEAPアッセイ ．Jurkat-TAg細胞を、リポータープ ラスミドNF-AT-SXまたはその誘導体の１つ(5,23)２〜３μg、「ドッキングタン パク質」MF1EまたはMF3Eを含むpBJ5発現ベクター１μg、およびSrc 群キナーゼ の１つまたは対照作成物ＳF1を含有するpBJ5 2 μg と共にエレクトロポレーシ ョンした(Bio-Rad Gene Pulser，960 μF および250 V、0.4 cm幅キュベット 中)。別の方法では、１μg のMF1Lckを２μg のリポーターと共に共トランスフ ェクションした。COS 細胞については、上記量の半量を使用した。J.RT-T3.5 細 胞については、発現プラスミドRSV-TAg(24)0.2 μg を共トランスフェクション して発現を高めた。24時間後、細胞の一部づつをFK1012AMA またはマイトジェン の希釈液（１μｍイオノマイシン＋ホルボール12−ミリステート13−アセテート および25 ng/ml）プラス１μM 非反応性、単量体対照リガンドFK506-M(5)で刺激 した。20時間後、上清を(5)に報告のようにしてSEAPについて検定し、データを マイトジェン刺激に対する相対値として示す。各データ点を２回反復実施し、デ ータは２回の実験の平均値である。全試薬をエタノールに溶解させ、培養液中の 溶媒の最大濃度は0.1 ％を決して超えなかった。活性化の動力学 ．抗TCR モノクローナル抗体(mAb)UCHT1（Sigma）被覆したマイ クロタイターのウェルを、ホスフェート緩衝食塩水(PBS)１ml当たり10μg のmAb と共に37℃で１時間インキュベーションし、ウシ胎児血清１％を含有するPBS 中で37℃で１時間ブロックした。細胞をこれらのウェルまたはマイトジェンもし くはFK-1012 を含有する未処理のウェルに分注した。マイクロタイターのウェル から細胞の一部を時間点ごとに取り出し、最後の時間点まで凍結した。データは ２回反復実施した２つの実験値の平均値として示す。結果 Src キナーゼを膜に可逆的にリクルートさせることができるように、ミリスト イル化標的化ペプチドをFyn、Lck およびLyn のＮ末端から除去し、これをFKBP1 2で置換した(図5A)(8,25)。また、FKBP12(5)のｎ＝１〜３コピーが続くv-src か らのＮ末端ミリストイル化標的化ペプチドからなる膜結合ドッキングタンパク質 、MFnEも設計した。下流シグナリング事象に焦点を当てるため、上流側の調節性 事象[例、キナーゼ活性化におけるCsk ホスホリル化およびCD45脱ホスホリル化( 図5B)]の影響を排除することが必要であると推論した。従って、キメラLck(SF1L ck)、Fyn(SF1Fyn)およびLyn(SF1Lyn)を、それらの調節性Ｃ末端チロシン残基を 除去することにより調節解除した（図5A）。論理的に、CID FK1012(5,26)の投与 は、ヘテロおよびホモ二量体の生成に至るべきである（図5C）。 この手段の可能性を実証するために、Jurkat-TAg細胞(24)をいくつかのFKBP-1 2 含有作成物の１つおよびSEAP遺伝子がNF-AT 転写因子(23,27)の制御下にある リポータープラスミド(NF-AT-SX)と共に共トランスフェクションした。このリポ ーターのNF-AT 依存性転写は、カルシニューリンとRas の両方を必要とし、サイ クロスポリンＡおよびFK506(31)で阻害される二股分岐シグナリング経路を経て 抗原レセプターにより誘発される。従って、いくつかの点で、これはＴリンパ球 の活性化要件を忠実に模している。細胞質ゾル性FKBP12-Fynキメラ(SF1Fyn)また はドッキングタンパク質(MF1E)をJurkat-TAg細胞中にトランスフェクションする と、FK1012の全濃度でNF-AT 活性は検出不可能である（図6A）。しかし、ドッキ ングタンパク質およびFKBP12-FynキメラをJurkat-TAg細胞中に共トランスフェク ションすると、FK1012は１nM程度の低濃度でシグナリングを活性化する。 「野生型」Fyn、SF1Fynwtの膜リクルートは、シグナリングには不十分である （図6A）。予想通り、FK1012媒介膜リクルートおよび３個のFKBP12をを含有する SF3Fynwtの架橋(crosslinking)は効果的にシグナリングした。また、膜で束縛さ れ、調節解除されたFyn(MF1Fyn)は、FK1012とは独立してシグナリングを活性化 した(イオノマイシンおよびホルボール12−ミリステート13−アセテート活性化 に対して約40％)(参照７および９)。 いくつかのSrc 群メンバーの中で可能性ある具体化を検討するため、Fyn、Lck およびLyn のシグナリングを活性化する能力について比較した。Lck はわずか ではあるが、再現性をもって活性化し、この系では低めのFK1012濃度でFyn また はLyn より良好に活性化した。これに対し、調節解除されたFyn およびLyn の膜 リクルートがシグナリングを活性化する効力には著しい差異がない（図6B）。Ly n は主にＢ細胞特異的であるが(32)、人工的に細胞膜を標的とした時にはＴ細胞 中で明らかにシグナリングすることができる。これらの結果は、Src 群メンバー のキナーゼドメインがその特異的役割に著しくは寄与していないかも知れず、こ れらのキナーゼを活性化する特異的メカニズムが生物学的特異性に重要であるこ とを示唆している。 FK1012により誘導されるシグナリングにおけるSrc ホモロジー(SH)２および３ ドメインの役割を、SH3 およびSH2 ドメインの一方または両方が欠損した一連の Fyn およびLck 変異体を作成することにより検討した。MF3Eを、各種Fyn もしく はLck 作成物またはキナーゼ欠損突然変異体の１つと共にJurkat細胞単独中に共 トランスフェクションした（図5Aおよび6C，6D）。これらの結果は、キナーゼド メインがシグナリングに必要なだけでなく、十分であるのに対し、SH3 ドメイン とSH2 ドメインはどちらもシグナリングの誘導には必要なく、実際には阻害する ことがあることを示している。これらのＮ末端ドメインが必要ないことは、SH3 またはSH3 会合シグナリング分子の膜リクルートがシグナリングを起こすという 形式的な可能性を排除するものである。 既に示したように、完全なTCR またはTCR 複合体のξ鎖の架橋は、NF-AT、Oct /OAP およびAP-1を含むIL-2遺伝子の転写誘導に必要な転写因子のサブセットを 活性化するのに対し、NF−κB 因子の活性化はコスティミュレートリ(costimula tory)シグナルを必要とする(5,33)。誘導可能なFyn またはLck が因子の類似群 を活性化することができるか否かを検定するため、各種のリポータープラスミド をMF3EおよびSF1FynまたはSF1Lckと一緒にJurkat-TAg細胞中に共トランスフェク ションした（それぞれ図7Aおよび7B）。FK1012を添加すると、NF-AT、Oct/OAP およびAP-1の各応答性リポーターだけが活性化され、NF−κB 応答性リポーター およびIL-2エンハンサー含有リポーターは完全に不活性であった。また、Fyn ま たはLck により誘導されたNF-AT 依存性転写は、Ca²⁺調節されたホスファターゼ カルシニューリン(23,24,25)の強力な阻害剤であるFK506 で阻止され、優性負の Ras のRSV-N17 Ras が誘導を完全に阻止するため、機能的Ras 活性を必要とする (図7C)(20)。最後に、Fyn およびLck の活性化の動力学（速度）を検査し、これ を直接TCR 刺激またはマイトジェン刺激のそれと比較した。リポーター酵素分泌 の合計レベルは、TCR 刺激細胞の方がFyn またはLck 刺激細胞より数倍高いが、 いずれの場合もリポーター活性は３時間で最初に測定可能であり、FK1012活性化 シグナリングがリポーターのそれに匹敵しうることを実証している（図7D）。従 って、複数の基準で、FK1012によるFyn またはLck の誘導はTCR媒介刺激を忠実 に再現するようである。 Fyn またはLck シグナリングのTCR 複合体への依存性を検討するため、SF1Fyn またはSF1Lck＋MF3EをJurkat細胞のJ.RT-T3.5(22)のTCR サブクローン中に一時 的にトランスフェクションした。これらの細胞はTCR β鎖を持たないので、細胞 膜にTCR 複合体を集めず、集合していないTCR 複合体サブユニットの小胞体(ER) 中での分解または保持の増大を生ずる(36)。予想外なことに、Fyn（ 図8A）また はLck の膜リクルートは、機能性TCR の不存在下でシグナリングを開始した。こ れを調査するため、SF1Fynまたはキナーゼ欠損SF1FynΔK ＋MF3Eを非リンパ球CO S 細胞中にトランスフェクションした（図8A）。やはり、Fyn の膜リクルートは シグナリングに十分であったが、キナーゼ欠損SF1FynΔK はそのシグナリング能 力が不足していた。これらの結果は、Src 群キナーゼによるシグナリングは抗原 レセプター複合体を迂回することができるかもしれないことを示している。実施例２の参考文献 請求の範囲 １．第１の多量体化できるキメラタンパク質および第２の多量体化できるキメラ タンパク質をコードする組み換えDNA 配列を含み、かつこれらを発現することが できる遺伝子工学処理された細胞であって、 その各キメラタンパク質が、同一でも異なっていてもよいドメインを含み、こ のドメインは所定の多価リガンドに結合してキメラタンパク質分子およびこれが 結合することができる多価リガンドからなる多量体を形成することができ、ここ でこのリガンドの存在下で、 (a) 該遺伝子工学処理された細胞がトランスフォーミング遺伝子を含む少なく とも１つのDNA 配列を調節可能に発現するか、 (b) 該多量体が細胞膜に結合するか、または (c) 該多量体が細胞分解ドメインを腫瘍サプレッサーまたはウイルス性タンパ ク質に結合させる。 ２．哺乳動物起源のものである請求の範囲第１項記載の遺伝子工学処理された細 胞。 ３．ヒト起源のものである請求の範囲第２項記載の遺伝子工学処理された細胞。 ４．最終的に分化していない請求の範囲第２項記載の遺伝子工学処理された細胞 。 ５．２以上の異なるキメラタンパク質をコードする組み換えDNA 配列を含む請求 の範囲第１項記載の遺伝子工学処理された細胞。 ６．該リガンドの存在に応答性の少なくとも１つのDNA 要素の転写制御下の１ま たは２以上の遺伝子を含み、その細胞内で該遺伝子がリガンドの存在下で調節可 能に発現される請求の範囲第１項記載の遺伝子工学処理された細胞。 ７．該遺伝子の少なくとも１つがトランスフォーミング遺伝子、膜を標的とする トランスフォーミング遺伝子産物に対する遺伝子、または膜を標的としうるトラ ンスフォーミング遺伝子産物に対する遺伝子である、請求の範囲第６項記載の遺 伝子工学処理された細胞。 ８．標的タンパク質および多量体化リガンドに結合することができるキメラタン パク質をコードする第１の組み換えDNA 配列、および分解標的化ドメインと多量 体化リガンドに結合することができるドメインとを含むキメラタンパク質をコー ドする第２の組み換えDNA 配列、を含み、かつこれらを発現することができる、 請求の範囲第１項記載の遺伝子工学処理された細胞。 ９．２つのキメラタンパク質をコードする複数の組み換えDNA 配列を含み、かつ これらを発現することができ、その各キメラタンパク質は、多量体化リガンドに 結合することができるドメインを含み、第１のキメラタンパク質はさらに腫瘍サ プレッサーまたはウイルス性タンパク質に結合することができるドメインを含み 、第２のキメラタンパク質はさらに分解標的化ドメインを含む、請求の範囲第１ 項記載の遺伝子工学処理された細胞。 10．所定のリガンドに結合することができるレセプタードメインと、 (a) トランスフォーミング遺伝子産物、 (b) 腫瘍サプレッサーまたはウイルス性タンパク質に結合することができるド メイン、 (c) 膜標的化ドメイン、または (d) 細胞分解に対する標的化ドメイン とを含有するキメラタンパク質をコードする組み換えDNA 配列。 11．請求の範囲第10項記載の組み換えDNA 配列によりコードされるキメラタンパ ク質。 12．膜を標的とするシグナルに連結したトランスフォーミング遺伝子またはその トランスフォーミング部分を含む組み換えDNA 配列。 13．請求の範囲第12項記載の組み換えDNA 配列によりコードされるキメラタンパ ク質。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ０７Ｋ 19/00 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，Ｕ Ｇ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 クラブツリー，ジェラルド・アール アメリカ合衆国、カリフォルニア州94062、 ウッドサイド、ダーラム・ロード７ (72)発明者 スペンサー，デイビッド アメリカ合衆国、カリフォルニア州94024、 ロス・アルトス、アルボレーダ・ドライブ 345 (72)発明者 ホルシンガー，レスリー アメリカ合衆国、カリフォルニア州94305、 スタンフォード（番地なし）、スタンフォ ード・ユニバーシティ・メディカル・セン ター (72)発明者 グリーフ，イザベラ アメリカ合衆国、カリフォルニア州94305、 スタンフォード（番地なし）、スタンフォ ード・ユニバーシティ・メディカル・セン ター (72)発明者 シュライバー，スチュアート アメリカ合衆国、マサチューセッツ州 02115、ボストン、マールボロ・ストリー ト434

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．第１の多量体化できるキメラタンパク質および第２の多量体化できるキメラ タンパク質をコードする組替え体DNA 配列を含み、かつこれらを発現することが できる遺伝子工学処理された細胞であって、 その各キメラタンパク質が、同一でも異なっていてもよいドメインを含み、こ のドメインは所定の多価リガンドに結合してキメラタンパク質分子およびこれが 結合することができる多価リガンドからなる多量体を形成することができ、ここ でこのリガンドの存在下で、 (a) 該遺伝子工学処理された細胞が形質転換性遺伝子を含む少なくとも１つの DNA 配列を調節可能に発現するか、 (b) 該多量体が細胞膜に結合するか、または (c) 該多量体は細胞分解ドメインを腫瘍サプレッサーまたはウイルス性タンパ ク質に結合させる。 ２．哺乳動物起源のものである請求の範囲第１項記載の遺伝子工学処理された細 胞。 ３．ヒト起源のものである請求の範囲第２項記載の遺伝子工学処理された細胞。 ４．最終的に分化していない請求の範囲第２項記載の遺伝子工学処理された細胞 。 ５．２以上の異なるキメラタンパク質をコードする組替え体DNA 配列を含む請求 の範囲第１項記載の遺伝子工学処理された細胞。 ６．該リガンドの存在に応答性の少なくとも１つのDNA 要素の転写制御下の１ま たは２以上の遺伝子を含み、その細胞内で該遺伝子がリガンドの存在下で調節可 能に発現される請求の範囲第１項記載の遺伝子工学処理された細胞。 ７．該遺伝子の少なくとも１つが形質転換遺伝子、膜を標的とする形質転換遺伝 子産物に対する遺伝子、または膜を標的とする形質転換遺伝子産物である、請求 の範囲第６項記載の遺伝子工学処理された細胞。 ８．標的タンパク質および多量体化リガンドに結合することができるキメラタン パク質をコードする第１の組替え体DNA 配列、および分解をターゲットするドメ インと多量体化リガンドに結合することができるオメインとを含むキメラタンパ ク質をコードする第２の組替え体DNA 配列、を含み、かつこれらを発現すること ができる、請求の範囲第１項記載の遺伝子工学処理された細胞。 ９．２つのキメラタンパク質をコードする複数の組替え体DNA 配列を含み、かつ これらを発現することができ、その各キメラタンパク質は、多量体化リガンドに 結合することができるドメインを含み、第１のキメラタンパク質はさらに腫瘍サ プレッサーまたはウイルス性タンパク質に結合することができるドメインを含み 、第２のキメラタンパク質はさらに分解ターゲットするドメインを含む、請求の 範囲第１項記載の遺伝子工学処理された細胞。 10．所定のリガンドに結合することができるレセプタードメインと、 (a) 形質転換遺伝子産物、 (b) 腫瘍サプレッサーまたはウイルス性タンパク質に結合することができるド メイン、 (c) 膜をターゲットするドメイン、または (d) 細胞分解に対する標的ドメイン とを含有するキメラタンパク質をコードする組替え体DNA 配列。 11．請求の範囲第10項記載の組替え体DNA 配列によりコードされたキメラタンパ ク質。 12．膜をターゲットするシグナルに結合した形質転換遺伝子またはその形質転換 タンパク質を含む組替え体DNA 配列。 13．請求の範囲第12項記載の組替え体DNA 配列によりコードされたキメラタンパ ク質。