JPH11511649A

JPH11511649A - Ｃｄ１６−ｉｉ変異体

Info

Publication number: JPH11511649A
Application number: JP8533162A
Authority: JP
Inventors: シュンロー
Original assignee: アプライドリサーチシステムズアーズホールディングエヌ．ヴィ．
Priority date: 1995-05-03
Filing date: 1996-05-03
Publication date: 1999-10-12
Also published as: CA2219988A1; WO1996034953A3; KR100464923B1; WO1996034953A2; CA2219988C; EP0954576A2; EP1734119A3; KR19990008285A; AU5908396A; US6444789B1; US5998166A; EP1734119A2; AU697991B2

Abstract

(57)【要約】ヒトＣＤ16−II変異体、それらをコードするＤＮＡを自己免疫疾患、及び炎症性疾患の治療及び／又は予知への適用、並びにそれらを含有する薬剤組成物を開示する。また新規なポリペプチドの配列を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】ＣＤ16−II変異体発明の分野本発明は、ヒトのＣＤ16−IIタンパク質変異体、それらをコードするＤＮＡ塩基配列、それらの自己免疫疾患及び炎症性疾患の治療及び／又は診断への使用、及びそれを含有する薬剤組成物に関する。背景技術の説明ＣＤ16［ＦｃγレセプターIII（ＦｃγＲ−III）と呼ばれる］は免疫グロブリンＧ（IgＧ）に対する低親和性レセプターである。免疫グロブリンのＦｃ部の他のレセプター（ＦｃγＲ−Ｉ、ＦｃγＲ−II、ＦｃεＲ−Ｉ）とともに、ＣＤ16 は自己免疫及び炎症反応の媒介において重要な役割を有する。ＣＤ16に対するモノクロナール抗体を使用した研究により、循環系からの免疫複合体の取り込み、及び抗体依存性細胞媒介型細胞障害（ＡＤＣＣ）の媒介におけるこのレセプターの役割が判明した（Van de Winkel et al.，Immunol ．Today ，14，1993年，215 〜221 頁参照）。IgＧがＣＤ16と結合することにより、ＮＫ／ＬＧＬ細胞の活性化を引き起こし、ＡＤＣＣを誘発する。高レベルの可溶型ＣＤ16が存在するとＡＤＣＣを停止することができる。多発性骨髄腫の患者の可溶型ＣＤ16のレベルは、健常人と比較して著しく低下していることが発見された（Mathiot et al.，J ．Clin．Immunol.，13，(1)，19 93年，41〜48頁参照）。さらに骨髄腫患者の可溶型ＣＤ16レベルの低下は段階に依存していることが観測され、段階Ｉの骨髄腫患者と段階II＋IIIの骨髄腫患者との間に高い有意差があった。このように血清中の可溶型ＣＤ16の測定値は骨髄腫の診断及び予知のマーカーとなり、これは疾患の新規な免疫調節性療法を規定し、手引きとするのに便利である。さらにＣＤ16はヒトの血清及びその他の体液中に存在し、炎症部位で高レベル化することが発見された（Fleit et al.，Blood ，79，(10)，1992年，2721〜27 28頁参照）。 Ravetch らによってヒトＣＤ16にはそれぞれＣＤ16−Ｉ及びＣＤ16−IIと表わされるタイプ１とタイプ２の少なくとも２つのアイソフォームが存在することが明らかにされた（J ．Exp．Med.，170，1989 年 481〜497 頁参照）。これら２つのＣＤ16のアイソフォームはヒトＣＤ16のタイプ１とタイプ２で、それぞれＣＤ 16−Ｉ及びＣＤ16−IIと表わされる。これら２つのＣＤ16のアイソフォームは２つに分かれているが関連している遺伝子のＮＡ１とＮＡ２によってコードされている。 Scallon らによって、ＣＤ16−ＩとＣＤ16−IIは構造及び細胞での発現において区別できることが明らかにされた（PNAS USA，86，5079〜5083頁，1989年７月）。ＣＤ16−Ｉは好中球及び単核白血球の表面に優勢に発現し、一方ＣＤ16−II はマクロファージ、ナチュラルキラー細胞及び大顆粒リンパ球（ＮＫ／ＬＧＬ）の表面に優勢に発現する。さらにこれらのＣＤ16の２つのタイプは、２つの別個の機構を経て細胞表面に会合する。ＣＤ16タイプＩは、グリコシル−ホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）結合によって細胞表面に会合し、ＣＤ16タイプIIは約20強のアミノ酸で膜に固定される。さらに成熟ＣＤ16のＮ末端の研究により、18番目のメチオニン残基が成熟タンパク質のＮ末端残基として同定された。このように、最初の翻訳産物は17個のアミノ酸からなるシグナルペプチドを含有する。ＣＤ16−IIの膜貫通領域は209 番目のアミノ酸から229 番目のアミノ酸の範囲にあり、一方ＣＤ−Ｉは膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインが欠落していることが報告されている。 203 番目の単一のアミノ酸（アイソフォームＩではSer であり、タイプIIでは Phe である。）により、膜固定機構が決まることが解明された（Lanier et al. ，Sciense ，246，1989 年，1611〜1613頁参照）。 FIG.１から明らかなように、以前よりヒトＣＤ16−Ｉの多形性が報告されているが、ＣＤ16−IIをコードするもう１つの核酸配列は現在までに１つしか発表されていない（Ravetch et al.，J ．Exp．Med.，170，1989 年，481 〜497 頁参照）。近年、HuizingaらはＣＤ16−Ｉの不足が新生児同種免疫好中球減少症に関係するという証拠を発表した（Blood ，76，1990年，1927頁以下参照）。 Bredius らはＣＤ16−Ｉ−ＮＡ１はＣＤ16−Ｉ−ＮＡ２よりもIgＧ１の媒介する食作用が21〜25％高いことを詳細に報告した（Immunologoy ，83，1994年，62 ４頁以下参照）。可溶型ＣＤ16の循環レベルは多発性骨髄腫において減少することが報告されており、また骨髄腫細胞上のｓＣＤ16の阻害効果とアメリカヤマゴボウのレクチン（ＰＷＭ）が誘導するＢ細胞の増殖が報告されている（Hoover et al.，J ．Cil. Inve. ，95(1)，1995 年，241 〜247 頁、及びTeillaud et al.,Blood ，82(10) ，15 1993年11月をそれぞれ参照）。欧州特許出願公開第343,950 号は概して可溶性で膜結合型のヒトＦｃγＲ−II Ｉのポリペプチドとそれをコードする核酸を開示し、特にＣＤ16−Ｉ変異体の配列とＣＤ16−IIの配列を図示している。この特許出願はさらにこれらのポリペプチドの様々な用途を記載している。本明細書に引用した文献のいずれによっても本願の請求項に記載の発明の特許性が否定されるわけではなく、またそれらの内容及び公表日についての全ての記述は出願時に知りえた情報に基づいたもので、それらが正確であると認めるものではない。発明の要約本発明は新規なヒトＣＤ16−II変異体クローンの発見に基づく。ヒトＣＤ16− II変異体クローンをアイソフォーム特異的にデザインしたオリゴヌクレオチドプライマーを用いたRT-PCR（逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応）に基づく手法により単離した。詳細には、ＣＤ16−IIはプールしたヒトの肺組織のＲＮＡ抽出物からRT-PCRにより増幅した。これらのＣＤ−II変異体は自己免疫疾患と炎症性疾患のための治療手段及び／又は診断手段を提供する。ＣＤ16−II変異体は以前に公表されたＣＤ16−II配列の天然の変異体であるので、本発明のポリペプチドは先に公表されたＣＤ16−IIの全ての用途に使用することができる。本明細書に記載された全ての文献から明らかにされたＣＤ16−IIの有用性については、欧州特許出願公開第343,950 号に記載の通りである。本発明の主な対象は、それぞれ配列番号１、２、３及び４のアミノ酸配列からなるポリペプチドである。 FIG.３に示すように、本発明もう１つの対象は、４種のポリペプチドをコーディングするＤＮＡ塩基配列を含むＤＮＡ分子であり、このＤＮＡ分子は実質的に同一のヌクレオチド配列を包含する。ここで「実質的に同一のヌクレオチド配列」は、遺伝子コードの縮重により、所定のアミノ酸配列をコードする他の全ての核酸配列をも含む。同一ポリペプチドをコードするが遺伝子コードの公知の縮重により天然の配列と異なる別のヌクレオチド配列は、以前に調製された変異体又は本発明のポリペプチドの非変異体をコードするＤＮＡの部位特異的突然変異誘発により調製することができる。部位特異的突然変異誘発により、所望の突然変異のＤＮＡ配列をコードする特異的なオリゴヌクレオチド配列及び十分な数の隣接するヌクレオチドを用いると、変異体を生成することができ、もって十分な大きさ及び配列複雑性を有するプライマー配列を提供することができる。プライマー配列は、改編された欠失の連結部分の両側に安定な二本鎖を形成する。約20〜25のヌクレオチドからなり、改編する配列の各側に約５〜10の相補ヌクレオチドを有するプライマーが特に好ましい。一般に部位特異的突然変異誘発の技法は、例えばAdelman らのDNA ，2: 183（ 1983年）に例示されているように公知であり、その内容を本明細書に含ませる。後述するように、部位特異的突然変異誘発の技法では、一般的に一本鎖及び二本鎖で存在するファージベクターを用いる。特定部位の突然変異誘発に便利な典型的なベクターは、Ｍ13ファージのようなベクターや、例えばMessing らのThird Cleveland Symposium on Macromolesules and Recombinant DNA ，A．Walton 編集，Elsevier，Amsterdam（1981 年）に記載されたようなベクターを含む。これらのファージは市販されていて入手が容易であり、それらの利用法は当業者に広く知られている。また一本鎖ＤＮＡを得るのに、一本鎖ファージの複製起点を含有するプラスミドベクターを使用することもできる（Veira et al.，Meth ．Enzy mol. ，153:3（1987 年））。一般に本明細書に記載した方法による特定部位の突然変異誘発は、まずその配列中に該当タンパク質をコードするＤＮＡ塩基配列を有する一本鎖ベクターを得ることにより行う。所望の突然変異を有するオリゴヌクレオチドプライマーは自動化ＤＮＡ／オリゴヌクレオチド合成により調製する。このプライマーを一本鎖タンパク質配列含有ベクターとアニーリングし、E.coli polymerase ＩクレノウフラグメントのようなＤＮＡ複製酵素を作用させ、突然変異を有する鎖を合成する。こうして突然変異させた配列の相補鎖は所望の突然変異を有することになる。このヘテロ二本鎖ベクターでE.coli JM101細胞のような適当な細胞を形質転換させ、変異した配列の組み合わせを有する組み替えベクターを含有するクローンを得る。上述したように、本発明のタンパク質は自己免疫疾患及び炎症性疾患の治療及び／又は診断に利用できる。従って、本発明のさらにもう１つの目的は、自己免疫疾患及び炎症性疾患の治療用薬剤の製造に上記タンパク質を使用することである。薬剤は、本発明のタンパク質及び１以上の薬事基準に適合した担体及び／又は賦形剤を含有する薬剤組成物の形態で提供するのが好ましい。このような薬剤組成物も本発明の実施態様の１つである。本発明を添付図面を参照して以下の実施例により詳細に説明するが、本発明はそれらに限定されるものではない。図面の簡単な説明 FIG.１は、本発明のＣＤ16変異体を含む種々のＣＤ16変異体の配列アラインメントを示す。アラインメントはPC/Gene ソフトウェアを使用して行った。「＊」印はそのアラインメントの部位が「完全に保存されている」ことを示し、「・」印はその部位が「良く保存されている」ことを示し、空白は、その部位が保存されていないことを示す。ＣＤ16Ｉ−１は、Simmons et al.，Nature，333，1988 年，568 〜570 頁に報告されたヒトＣＤ16−Ｉアミノ酸配列である（配列番号５）。ＣＤ16Ｉ−２は、Peltz et al.，PANAS USA ，86，1989年，1013〜1017頁に報告されたヒトＣＤ16−Ｉアミノ酸配列である（配列番号６）。ＣＤ16Ｉ−３は、Scallon et al.，PANAS USA ，86，1989年，5079〜5083頁に報告されたヒトＣＤ16−Ｉアミノ酸配列である（配列番号７）。ＣＤ16Ｉ−４は、Lanier，Science ，246，1989 年，1611〜1613頁に報告されたヒトＣＤ16−Ｉアミノ酸配列である（配列番号８）。ＦＣＧ３ｈｕｍａｎは、Ravetch et al.，J.Exp.Med.，170，1989 年，48 １〜487頁に報告されたヒトＣＤ16−IIアミノ酸配列である（配列番号９）。ＣＤ16Ｉ−１、ＣＤ16Ｉ−２、ＣＤ16Ｉ−３及びＣＤ16Ｉ−４はそれぞれ本発明のタンパク質のＣＤ16−IIアミノ酸配列の配列番号1、２、３及び４に相当する。 FIG.２は、ヒトＣＤ16の逆転写酵素を用いたポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）増幅を示す。パネルＡはアイソフォーム特異的オリゴヌクレオチドプライマーを示す。「タイプＩ」と記された線上のプライマー［ＣＤ16p1（配列番号17のヌクレオチド７〜21）及びＣＤ16p5（配列番号11）］は公表されたヒトＣＤ−Ｉの配列からデザインした。また「タイプII」と記された線上のプライマー［ＣＤ16p1（配列番号17のヌクレオチド７〜21）及びＣＤ16p6（配列番号12）］はヒトＣＤ−II の配列からデザインした。１つのミスマッチとして示されたものは、ＣＤ16アイソフォーム特異的オリゴヌクレオチドプライマーの３´側末端の829 番目のＧがＡになった点である。ＣＤ16−ＩとＣＤ16−IIの３´側ＰＣＲプライマーの融点（Ｔ_m）は、それぞれ53. 9と46.3℃である。パネルＢはエンドヌクレアーゼDra Ｉを用いて行ったＣＤ16のクローンの制限酵素切断解析の結果を示す。ＣＤ16−ＩとＣＤ16−IIのバンドパターンが可視化されており、左のパネルはＣＤ16p1とＣＤ16p5のプライマー対を用いたＰＣＲ増幅で得られたタイプＩクローンを示し、右のパネルはＣＤ16p1とＣＤ16p6のプライマー対を用いたＰＣＲ増幅で得られたタイプIIクローンを示す。 FIG.３は、本発明のＣＤ16−II変異体の核酸塩基配列の比較を示す。はじめの４つの配列（配列番号12、13、14及び15）は、本発明の４つの変異体をコードするものであり、終わりの配列はRavetch et al.，J ．Exp．Med.，170，1989 年， 481 〜487 頁に報告された既知のものである（配列番号16）。保存されたヌクレオチドはダッシュの並びで示し、変化したものはアルファベットの小文字で綴ってある。 FIG.４は、ＣＨＯ細胞中でＣＤ16−II変異体の発現ベクターとして使用するプラスミドｐｃＤＮＡＩ／ｎｅｏ−ｓＣＤ16−IIの制限酵素切断地図、及びそのコーディング部分のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列（配列番号17及び18）を示す。 FIG.５は、E.coli中でＣＤ16−II変異体の発現ベクターとして使用するプラスミドｐＥＴ11（Swa Ｉ）−ＣＤ16−IIの制限酵素切断地図、及びそのコーディング部分のヌクレオチド配列とアミノ酸配列（配列番号19及び20）を示す。実施例酵素及び試薬ヒト肺ポリＡ⁺ＲＮＡはClontech社から購入した。モロニーマウス白血病ウィルスＲＮａｓｅＨ^-逆転写酵素（Ｍ−ＭＬＶＨ^-ＲＴ）はBRL Life Technologie s,INC 社から購入した。Vent^TMＤＮＡポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、及び修飾酵素はそれぞれNew England Biolabs 社から購入した。Sequenase Vers ion 2.0 はUS Biochemicals 社から購入した。サブクローニングに用いたプラスミド、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ＋ＳＫはStraregene社から購入し、製造者の推奨する方法で使用した。オリゴヌクレオチドプライマーのデザインＣＤ16のタイプＩ及びタイプIIを増幅するために、アイソフォーム特異的オリゴヌクレオチドプライマーを次のようにデザインした。ＣＤ16p1はタイプＩ及びタイプIIの両方の５´ＰＣＲプライマーとして、ＡＴＧＴＧＧＣＡＧＣＴＧＣＴＣ（配列番号17のヌクレオチド７〜21）。ＣＤ16p5及びＣＤ16p6はタイプＩ及びタイプIIの両方の３´ＰＣＲプライマーとして、それぞれＣＴＧＣＴＧＣＣＡＣＴＧＣＴＣ（配列番号21）、及びＣＴＧＣＴＧＣＴＡＣＴＧＣＴＣ（配列番号22）。これらのプライマーは、ＣＤ16の各アイソフォームを所定のアニーリング温度の下、すなわちタイプＩは53.9℃、タイプIIは46.3℃（FIG.２）で特異的に増幅するようにデザインした。ｃＤＮＡの合成とＰＣＲ増幅ヒトの肺の組織から調製したＲＮＡをfirst strandｃＤＮＡ合成の鋳型とした。２μのポリＡ＋ＲＮＡ、2.5 μｇのオリゴ（ｄＴ）プライマー、500 mMのｄＮＴＰｓ、50mMのTris-HCl，pH8.8 で75mMのＫCl、10mMのDithiothreitol、３mMの MgCl₂、及び100 ユニットのM-MLV H RTを含有する50μｌの反応混合液を調製した。反応を停止させるために、500 ml mMのＥＤＴＡを５ｍｌ混合液に添加した。反応後の混合液は等量フェノール／クロロホルム／ＩＡＡ（25：24：１）中で抽出し、３倍量のエタノールで沈殿させた。沈殿した生成物は10μｌのＴＥに再び懸濁し、１ｍｌをＰＣＲ増幅に使用した。ＰＣＲ増幅は、200 μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、10mMのＫCl、20mMのTris-HCl，pH8.8、10mmの(NH₄)₂SO₄、２mMのMgSO₄、0.1 ％のTrito n X-100、１μl のμl（上記）ｃＤＮＡ、及び４ユニットのVent^TMを含有する10 0 ｍｌの反応混合液中で行った。温度サイクルは、GeneAmP PCR System 9600（P erkin Elmer社）を使用し、(1)99℃で10分間インキュベートし、(2)(a)94℃で45 秒間、(b)54℃（タイプＩ）又は46℃（タイプII）で１分間、及び(c)75℃で１分間のサイクルを25回繰り返すようにプログラムした。アガロースゲル電気泳動の後、得られたＰＣＲ産物をフェノール／クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿し、pBluescript＋ＳＫでサブクローニングするのに適合する制限末端を得るかさらにキャラクタライゼーションするためにBamH Ｉで切断した。ＣＤ16−IIクローンのキャラクタライゼーションＰＣＲ産物のクローニングとシークエンシングは標準の分子的プロトコルに従って行った（Sambrook et al.，Molecular Cloning--A Laboratory Manual，Col d Spring Harbor Laboratory Press，1989年）。シークエンスデータは標準のプロトコルにしたがった核酸解析プログラムＵＷＧＣＧ（version 7.3）を使用して解析した。ＣＤ16のRT-PCR増幅アイソフォーム特異的ＰＣＲプライマーを使用することにより、ＣＤ16−Ｉ及びＣＤ16−IIをRT-PCRにより特異的に増幅した。ＣＤ16−ＩとＣＤ16−IIの塩基配列の比較は、これらの98％が一致することを示す。ＣＤ16−Ｉを増幅するために、アイソフォーム特異的オリゴヌクレオチドプライマーをデザインし、ヒトの肺組織のｍＲＮＡから精製したｃＤＮＡを使用して特定の条件下でＰＣＲ増幅を行った。タイプＩとタイプIIのアイソフォーム特異的オリゴヌクレオチドプライマーは、遺伝子の３´側の翻訳されていないヌタレオチド822 番目から836 番目の領域から選んだ。なおその領域では、ヌクレオチド829 番目に１つのミスマッチ（タイプＩではＧ、タイプIIではＡ）が見られた（FIG.２のパネルＡ参照）。ランダムに選び出した14個のクローンをエンドヌクレアーゼDra Ｉで切断することにより、タイプＩ及びタイプIIを同定した（FIG.２のパネルＢ参照）。ＣＤ16−Ｉ及びＣＤ16−IIの配列の高い相同性のために、特定のアイソフォーム単離のためのアイソフォーム特異的オリゴヌクレオチドプライマーを使用したクローニング法が可能となった。ＣＤ１６−Ｉ及びＣＤ１６−IIのヌクレオチド配列が98％の相同性を有するため、アイソフォーム特異的オリゴヌクレオチドプライマーの15量体（15mers）をデザインし、特定の条件下（プライマーと鋳型のアニーリング温度をタイプＩとタイプIIはそれぞれ54℃と46℃とする）でＰＣＲ増幅を行う。これらのアニーリング条件により、54℃でＣＤ16p5とタイプＩ鋳型ｃＤＮＡの完全なマッチを、46℃でＣＤ16p6とタイプII鋳型ｃＤＮＡの完全なマッチを安定させることができる。ヌクレオチド＃829（オリジナルのｃＤＮＡの番号による）における１つのミスマッチを利用して（Ravetch et al.，J ．Exp.M ed. ，170，1989 年，481 〜487 頁参照）、中央のヌクレオチド＃829（タイプＩはＧ、タイプIIはＡ）と、その上流の７つのヌクレオチド及びその下流の７つのヌクレオチドとの合計15個のヌクレオチドから、サブタイプ−Ｉとサブタイプ− II（FIG.２のパネルＡ参照）の特異性を維持するように15量体のＰＣＲプライマーをデザインした。サブタイプ−Ｉとサブタイプ−IIをパネルＢ（FIG.２のパネルＢ）に示すように単離し、その後解析した。ＣＤ16−IIのクローンの配列解析ＣＤ１６−Ｉの多形変異体に加えて、同様の配列の変化をＣＤ１６−IIに発見した（FIG.３の核酸、及びFIG.１のアミノ酸配列を参照）。ヌクレオチド全長の配列解析を行った結果、タイプＩのｃＤＮＡクローンは停止コドンを234 番目に有するのに対し、タイプIIのｃＤＮＡは234 番目にArg のコドンを有し、停止コドンを255 番目に有することが判明した。FIG.３に示すように、25個のヌクレオチドの変化を観察した。これらの25個のミスマッチのうち、17個はコドンの変化の原因になっており（FIG.３及びFIG.１参照）、残り８個の変化はサイレントミューテーションであった。25個の変化のうち、21個はアデニン又はチミンからシトシン又はグアニンになっていた。そのうち４個の変化はチミンからアデニンになっていた。アミノ酸配列の推定から、タイプＩに見られる変化のほとんどがタイプIIでも生じることが明らかになった（17個中７個、FIG.１参照）。さらにタイプ−IIの翻訳領域には10個の他の変化が観察された。しかし、IgＧ結合に不可欠なレセプターの細胞外ドメイン中の９残基（Hibbs et al.，J ．of Immunoligy，152，199 4 年,4466 〜4474頁による）、131 番目のTrp 、143 〜146 番目のGln-Asn-Gly- Lys（配列番号６〜９の残基143 〜146 ）、148 〜150 番目のArg-Lys-Tyr 、168 番目のGly は変化せずに残っていた。２つの重要なモチーフである143 〜146 番目のGln-Asn-Gly-Lys（配列番号６〜９の残基143 〜146 ）と148 〜150 番目のArg-Lys-Tyr との間に位置する147 番目のグリシンはアスパラギン酸に変化して、保存されていた。明らかに少なくともIgＧ結合特性を厳密に変化させることなく147 番目のグリシンはアラニンに変異する。ＣＤ１６−IIの４つの変異体のうち最後の１つは、膜貫通ドメインと推定される中に突然変異（214 番目のVal がAla に）が観察され、保存されていた。しかし、膜貫通ドメイン中のモチーフLeu-Phe-Ala-Val-As p-Thr-Gly-Leu（配列番号６〜９の218 〜225 番目の残基）は以前に報告された配列と一致した。このアミノ酸モチーフは、ヒトとマウスのＣＤ１６、及びヒトとマウスとラットのＦｃεＲＩａで完全に保存されていた。ＣＤ16−IIをＣＨＯ細胞とE.Coliで発現させるための遺伝子工学以下の手順は、本発明のいずれのＣＤ16−II変異体（以下の一般的なＣＤ１６ −IIであっても）の発現及び精製に適用できる。可溶型ＣＤ16−II（ｓＣＤ16−II）をＣＨＯ細胞で発現させるために、オリゴヌクレオチドプライマーＣＤ16p14 はＧＧＧＡＡＴＴＣＡＡＡＡＧＡＡＴＧＡＴＧＡＧＡＴＧＧＴ（配列番号23）とデザインする。ＣＤ16p14 はPhe コドンの後にＴＧＡ停止コドンが挿入されるようにデザインする（Phe ＃203 はＣＤ16−II に特徴的）。ＣＤ16p1とＣＤ16p14 はＣＤ16−IIの可溶型を増幅するのに用いる（FIG.４参照）。自然に生成したＣＤ16−IIの可溶型の正確なＣ末端は、分子の細胞外部分を含有するように設計された先端を切ったような形の可溶型ＣＤ16− IIを選択することにより解析されているが、未だ決定されていない。 E.coliでのｓＣＤ16−II発現のために、オリゴヌクレオチドプライマー、ＣＤ 16−（Swa Ｉ）及びＣＤ16Ｎ233 は、それぞれＴＴＴＧＧＡＴＣＣＡＡＧＣＴＴＡＧＴＴＴＧＴＣＴＴＣＡＣＡＧＡＧＡＡＡＴＡＧＡＧＡＣＣＴ（配列番号24）及びＴＴＴＡＴＴＴＡＡＡＴＧＣＧＴＡＣＴＧＡＡＧＡＴＣＴＣＣＣＡＡＡＧ（配列番号25）とデザインする。ＣＤ16−（Swa Ｉ）及びＣＤ16Ｎ233 プライマーは、E.Coliにおいて成熟タンパク質で、また膜貫通ドメインを含有するアミノ酸配列＃18から＃233（FIG.５参照）を生成するようにデザインする。メトトレキセート（ＭＴＸ）増幅はＣＤ16−IIのＣＨＯ細胞での発現に使用する。ｐｃＤＮＡＩ／ｎｅｏ−ｓＣＤ16−II（FIG.４参照）プラスミドのラージスケールＤＮＡ調製はQuiagen カラムを使用して行い、次いでエタノール沈殿し、ＭＴＸ選択のためのＤαベクター（ＤＨＦＲ遺伝子を含む）とのコトランスフェクションによる安定なトランスフェクションに使用する。ＣＨＯ感染性核酸はプールし、５μＭのＭＴＸで十分に増幅する。精製のためのｓＣＤ16を生成するために、最も生産性が高いｓＣＤ16生成プールを選択し、ＭＴＸフリーの基礎培地（ＪＲＨ、Bioscences社）又はＭＴＸフリー低タンパク培地（ＳＦＭ−II、Gibco 社）で培養する。培養培地は24、48、72時間に集め、IgＧアフィニティークロマトグラフィーで精製する。ｓＣＤ16−IIの解析は、ＯＤ₂₈₀、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法、ＥＬＩＺＡ法、ウェスタンブロッティング法、アミノ酸組成の解析、Ｎ末端配列分析で行った。ｓＣＤ16−IIのE.coli発現のために、イソプロピルチオ−β−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）誘導ＢＬ２１／ＤＥ３細胞を溶解バッファー中でインキュベートし、可溶性物質はＳＤＳ−ＰＡＧＥ法とポリクローナル抗ｈＣＤ16抗血清を用いてウェスタンブロッティング法で解析した。 E.coliで発現した可溶型ＣＤ16−IIは、Ｎ末端配列分析を用いて確認した。定期刊行物、抄録、米国又は外国で発行又は公開された特許出願、特許公報等の全ての参考文献（文献中の全てのデータ、表、図、文書を含む）は、本明細書の記載の一部を構成するものとする。上記の具体的実施例により本発明の一般的性質は明らかであり、また当業者であれば過度の実験を行うことなく、一般的概念を逸脱せずに様々な用途のために具体的実施例を容易に変更できる。このような変更は、具体的実施例の均等の範囲内である。記載の作用を実施するための手段及び材料は、本発明から逸脱することなく様々な他の形態をとりうる。本明細書で使用した専門用語は説明の目的で使われたものであり、本発明を制限するものではない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:91）

Claims

【特許請求の範囲】１．配列番号１、配列番号２、配列番号３、及び配列番号４から選ばれたアミノ酸配列を含むことを特徴とするポリペプチド。２．配列番号１のアミノ酸配列を含むことを特徴とするポリペプチド。３．配列番号２のアミノ酸配列を含むことを特徴とするポリペプチド。４．配列番号３のアミノ酸配列を含むことを特徴とするポリペプチド。５．配列番号４のアミノ酸配列を含むことを特徴とするポリペプチド。６．請求項１に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列を含むことを特徴とする単離されたＤＮＡ分子。７．請求項２に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列を含むことを特徴とする単離されたＤＮＡ分子。８．請求項３に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列を含むことを特徴とする単離されたＤＮＡ分子。９．請求項４に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列を含むことを特徴とする単離されたＤＮＡ分子。 10．請求項５に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列を含むことを特徴とする単離されたＤＮＡ分子。 11．自己免疫疾患又は炎症性疾患の治療方法において、請求項１に記載のポリペプチドを投与することを特徴とする方法。 12．自己免疫疾患又は炎症性疾患の治療方法において、請求項２に記載のポリペプチドを投与することを特徴とする方法。 13．自己免疫疾患又は炎症性疾患の治療方法において、請求項３に記載のポリペプチドを投与することを特徴とする方法。 14．自己免疫疾患又は炎症性疾患の治療方法において、請求項４に記載のポリペプチドを投与することを特徴とする方法。 15．自己免疫疾患又は炎症性疾患の治療方法において、請求項５に記載のポリペプチドを投与することを特徴とする方法。 16．請求項１に記載のポリペプチド、及び１以上の薬事的基準に適合した担体及び／又は賦形剤を含有することを特徴とする薬剤組成物。 17．請求項２に記載のポリペプチド、及び１以上の薬事的基準に適合した担体及び／又は賦形剤を含有することを特徴とする薬剤組成物。 18．請求項３に記載のポリペプチド、及び１以上の薬事的基準に適合した担体及び／又は賦形剤を含有することを特徴とする薬剤組成物。 19．請求項４に記載のポリペプチド、及び１以上の薬事的基準に適合した担体及び／又は賦形剤を含有することを特徴とする薬剤組成物。 20．請求項５に記載のポリペプチド、及び１以上の薬事的基準に適合した担体及び／又は賦形剤を含有することを特徴とする薬剤組成物。