JPH11513498A - 生体分子の標的用リガンドを同定するための核磁気共鳴の使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、特定の標的分子に結合する化合物の同定方法を提供する。本発明の方法は、ａ）¹⁵Ｎ−標識標的分子の第１の２次元¹⁵Ｎ／¹Ｈ ＮＭＲ相関スペクトルを発生させるステップ、ｂ）前記した標識標的分子を１つの化学化合物または化学化合物の混合物に作用させるステップ、ｃ）ステップｂ）で１つの化合物または化合物の混合物に作用させた標識標的分子の第２の２次元¹⁵Ｎ／¹Ｈ ＮＭＲ相関スペクトルを発生させるステップ、及びｄ）第１の２次元¹⁵Ｎ／¹ＨＮＭＲ相関スペクトルと第２の２次元¹⁵Ｎ／¹Ｈ ＮＭＲ相関スペクトルを比較して第１と第２のスペクトルの違いを調べ、その違いから標的分子に結合したリガンドである１つまたはそれ以上の化合物の存在を同定するステップを含む。

Description

【発明の詳細な説明】生体分子の標的用リガンドを同定するための核磁気共鳴の使用 発明の技術分野 本発明は、標的生体分子に結合するリガンドを同定及び設計するために、２次 元¹⁵Ｎ／¹Ｈ ＮＭＲ相関スペクトル分析を用いて生物活性について化合物をス クリーニングする方法及び結合または解離定数を測定する方法に関する。発明の背景 新規リード薬物を発見するための最も有力な方法のひとつは、合成化学物質及 び天然物のデータベースを無作為にスクリーニングして特定の標的物質に結合す る化合物を発見する方法（即ち、前記標的のリガンドの同定）である。この方法 を用いて、標的分子と物理的結合を形成する能力または標的分子の機能を変更す る能力に基づいてリガンドを同定することができる。 物理的結合を求めている場合には、典型的には標的物質をリガンドであろうと 推測される１つまたはそれ以上の化合物に作用させ、標的物質と前記した１つま たはそれ以上の化合物との間で複合体が形成されるかどうか調べるべくアッセイ が行われ る。前記アッセイでは、当業界では公知のように、複合体形成の指標となる標的 分子の概略的変化（例えば、サイズ、電荷及び移動度の変化）を試験する。 機能的変化を調べる場合には、標的分子に関連する生物学的もしくは化学的事 象（例えば、酵素触媒反応、受容体媒介の酵素活性化）を測定することができる アッセイ条件を確立する。変化を確認するためには、標的分子を試験化合物に作 用させる前及びその後に標的分子の機能を調べる。 既存の物理的及び機能的アッセイは、治療用化合物を設計するために使用され る新規リード薬物を同定するために首尾良く使用されてきた。しかしながら、こ れらのアッセイには正確さ、信頼性及び効率を妥協せざるを得ない固有の限界が ある。 既存のアッセイの重大な欠点は、「偽陽性」の問題である。典型的な機能的ア ッセイでは、「偽陽性」は、アッセイを誘発するが所望の生理学的応答を引き出 すのには有効でない化合物で生ずる。典型的な物理的アッセイでは、例えば標的 に結合するものの非特異的に結合する（例えば、非特異的結合）化合物で生ずる 。偽陽性は、想定リガンドをより高濃度でスクリーニングしたときに特に生じや すい問題である。なぜならば、多く の化合物は前記高濃度では非特異的な影響を受けるからである。 同様に、既存のアッセイには、実際には標的に対するリガンドである化合物が アッセイにおいて陰性の結果を示す「偽陰性」の問題もある。偽陰性は、典型的 には、試験化合物の標的に対する結合または解離定数に比して余りにも高いか（ 毒性が生ずる）または余りにも低い濃度の試験化合物をアッセイで使用したとき に生ずる。 既存のアッセイの別の重大な欠点は、アッセイにより得られる情報量に限度が あることである。既存のアッセイは、標的分子に結合するかまたは標的分子から 応答を引き出す化合物を正確に同定できるとしても、標的分子上の特定結合サイ トに関する情報も試験化合物と標的分子間の構造／活性関係に関する情報も提供 しない。上記した情報を提供できないことは、スクリーニングアッセイを更なる 研究のためのリードを同定するために使用するときに特に問題である。 最近、有機溶媒の巨大分子上の結合サイトを同定するためにＸ線結晶学を使用 することが示唆された。しかしながら、この方法では標的上の異なるサイトの相 対結合アフィニティーを測定することができない。この方法は、高濃度の有機溶 媒の存在 下でも変性しない非常に安定な標的タンパク質に対して使用されるのみである。 また、この方法は、化学的に多種多様の化合物を迅速に試験するためのスクリー ニング方法ではなく、個々の結晶構造を測定するのに長時間を要するためにほん の数種の有機溶媒の結合サイトをマッピングするためにのみ使用される。 化合物は、標的生体分子の機能を変える新規薬物の設計に使用し得るリードを 同定するためにスクリーニングにかけられる。これらの新規化合物は同定された リードと構造的に類似しているか、または前記リード化合物の１つまたはそれ以 上の複合体を形成し得る。既存のスクリーニング方法には固有の諸問題があるた めに、既存の方法が新規薬物の設計に殆ど役立たないことが多い。 特定の標的に対して特異的に結合するリガンドを同定及び設計するために化合 物をスクニリーニングする新しい、迅速で、効率的で、正確且つ信頼性ある方法 の提供が常に要望されている。発明の要旨 第１に、本発明は、特定の標的分子に結合するリガンドを同定するために生物 活性に関して化合物をスクリーニングする方 法を提供する。本発明の方法は、 ａ）¹⁵Ｎ−標識標的分子の第１の２次元¹⁵Ｎ／¹Ｈ ＮＭＲ相関スペクトルを発 生させするステップ、 ｂ）前記した標識標的分子を１つまたはそれ以上の化学化合物に作用させるステ ップ、 ｃ）ステップｂ）で１つまたはそれ以上の化合物に作用させた標識標的分子の第 ２の２次元¹⁵Ｎ／¹Ｈ ＮＭＲ相関スペクトルを発生させるステップ、及び ｄ）第１の２次元¹⁵Ｎ／¹Ｈ ＮＭＲ相関スペクトルと第２の２次元¹⁵Ｎ／¹Ｈ ＮＭＲ相関スペクトルを比較して第１と第２のスペクトルの違いを調べ、その違 いから標的分子に結合したリガンドである１つまたはそれ以上の化合物の存在を 同定するステップを含む。 本発明の方法のステップｂ）において２種以上の化合物、すなわち化合物の混 合物をスクリーニングし、標的分子単独から発生させたスペクトルと混合物の存 在下での標的分子から発生させたスペクトルの違いを調べる場合には、前記混合 物中に含まれるどの化合物または化合物の組み合わせが標的分子に結合するかを 同定するために追加のステップを実施する。これらの 追加のステップは、 ｅ）¹⁵Ｎ−標識標的分子を前記混合物中の各化合物に個別に作用させるステップ 、 ｆ）個別に各化合物に作用させた標識標的化合物の２次元¹⁵Ｎ／¹Ｈ ＮＭＲ相 関スペクトルを発生させるステップ、及び ｇ）ステップｆ）で発生させた各スペクトルと標的分子単独から発生させた第１ スペクトルを比較して第１スペクトルと各化合物のスペクトルの違いを調べ、そ の違いから標的分子に結合したリガンドである化合物の存在を同定するステップ を含む。 ２次元相関スペクトルにおける特定の¹⁵Ｎ／¹Ｈシグナルの化学シフト値は標 的分子中の原子団（例えば、アミドのＮ−Ｈ原子、またはポリペプチド中の特定 のアミノ酸残基のペプチド結合）の既知の特定位置に対応しているのて、本発明 の方法によりどの化合物が特定の標的分子に結合しているか同定することも、標 的分子上のリガンドの特定結合サイトを決定することもできる。 第２に、本発明は、所与のリガンド及びその標的分子の解離定数Ｋ_Dを測定す る方法を提供する。この方法は、 ａ）¹⁵Ｎ−標識標的分子の第１の２次元¹⁵Ｎ／¹Ｈ ＮＭＲ 相関スペクトルを発生させるステップ、 ｂ）前記した標識標的分子を濃度の異なるリガンドに作用させるステップ、 ｃ）ステップｂ）の各濃度のリガンドにおいて２次元¹⁵Ｎ／¹Ｈ ＮＭＲ相関ス ペクトルを発生させるステップ、 ｄ）ステップｃ）で発生させた各スペントルをステップａ）で発生させた第１ス ペクトルと比較するステップ、及び ｅ）その違いから、式 に従って標的分子とリガンド間の解離定数を算出するステップを含む。 本発明の利点は、本発明の方法により、すでにリガンドに結合している第２分 子の存在下で標的分子と１つのリガンド間の解離定数を測定することができるこ とである。このことは、リガンドの標的分子基質への結合を測定する「ウエット ケミカル」分析法を用いる従来方法では通常不可能である。 この好ましい実施態様では、リガンドの解離定数を測定する方法は第２の結合 リガンドの存在下で実施され得る。この実施 態様によれば、¹⁵Ｎ標識標的物質は、標的が試験化合物に作用する前に第２リガ ンドに結合している。 本発明の方法によれば１つのリガンドと標的分子間の結合の存在も第２の結合 リガンドの存在下での特定の結合サイトも調べることができるので、リガンドか ら構成される２つ以上の結合部分を含む薬物を本発明の方法により設計すること ができる。 本発明の方法は、標的分子に結合する第１及び次のリガンドを同定するために 、上記した２次元¹⁵Ｎ／¹Ｈ ＮＭＲ相関スペクトルによるスクリーニング方法 を使用する。標的分子と２個以上のリガンドの複合体を形成し、この複合体の３ 次元構造を好ましくはＮＭＲ分光分析法及びＸ線結晶学を用いて測定する。３次 元構造は、リガンドの他のリガンドに対する及び標的分子に対する立体配向を調 べるために使用される。 立体配向に基づいて、リガンドを相互に結合して薬物を形成する。有機化学分 野で公知の結合角及び結合長の情報の原理に基づいてリガンドの立体配向を別の リガンド及び標的分子に対して維持することにより、適切な結合基を選択する。 従って、分子設計方法は、標的分子に対する第１のリガンド部分を２次元¹⁵Ｎ ／¹Ｈ ＮＭＲ相関分光分析法を用いて同定 し、標的分子に対する次のリガンド部分を２次元¹⁵Ｎ／¹Ｈ ＮＭＲ相関分光分 析法を用いて同定し、標的分子に対して第１及び次のリガンド部分の複合体を形 成し、前記複合体の３次元構造、よって標的分子上の第１及び次のリガンド部分 の立体配向を調べ、リガンド部分の立体配向を維持すべく第１及び次のリガンド 部分を結合して薬物を形成することからなる。 次のリガンド部分の同定は、第１リガンドの存在または不在下で実施され得る （例えば、第２リガンドを同定するために、標的分子は試験化合物に作用させる 前に第１リガンドに結合され得る）。 好ましい実施態様では、スクリーニング方法または設計方法において使用され る標的分子はポリペプチドである。ポリペプチドは好ましくは、ポリペプチドを コートするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを用いて形質転換された宿主細 胞を、組換え産生されたポリペプチドが¹⁵Ｎで標識されるように¹⁵Ｎの同化可能 源を含む培地中で培養することにより、該宿主細胞から組換え型で産生される。図面の簡単な説明 本明細書の一部をなす図面において、 図１は、均一に¹⁵Ｎ−標識されたヒトパピローマウィルスＥ２のＤＮＡ結合ド メインの¹⁵Ｎ／¹Ｈ相関スペクトルを示す。スペクトル（８０複合ポイント（ｃ ｏｍｐｌｅｘ ｐｏｉｎｔｓ）、４スキャン／ｆｉｄ）は、２０ｍＭホスフェー ト（ｐＨ６．５）、１０ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）及び１０％酸化ジュ ウテリウム（Ｄ₂Ｏ）中に０．５ｍＭのＥ２を含むサンプルで得たものである。 図２は、最終試験化合物を添加前（薄い複数の等高線）及び添加後（濃い単一 等高線）の、均一に¹⁵Ｎ−標識されたヒトパピローマウィルスＥ２のＤＮＡ結合 ドメインの¹⁵Ｎ／¹Ｈ相関スペクトルを示す。化合物の最終濃度は１．０ｍＭで あった。他の条件はすべて図１に記載の通りである。結合時に有意な変化を示す 特定残基を図示する。 図３は、第２の試験化合物を添加前（薄い複数の等高線）及び添加後（濃い単 一等高線）の、均一に¹⁵Ｎ−標識されたヒトパピローマウィルスＥ２のＤＮＡ結 合ドメインの¹⁵Ｎ／¹Ｈ相関スペクトルを示す。化合物の最終濃度は１．０ｍＭ であった。他の条件はすべて図１に記載の通りである。結合時に有意な変化を示 す特定残基を図示する。 図４は、試験化合物を添加前（薄い複数の等高線）及び添加後（濃い単一等高 線）の、均一に¹⁵Ｎ−標識されたストロメライシンの触媒ドメインの¹⁵Ｎ／¹Ｈ 相関スペクトルを示す。化合物の最終濃度は１．０ｍＭであった。スペクトル（ ８０複合ポイント、８スキャン／ｆｉｄ）は、２０ｍＭＴＲＩＳ（ｐＨ７．０） 、２０ｍＭＣａＣｌ₂及び１０％Ｄ₂Ｏ中に０．３ｍＭのＳＣＤを含むサンプルで 得たものである。結合時に有意な変化を示す特定残基を図示する。 図５は、試験化合物を添加前（薄い複数の等高線）及び添加後（濃い単一等高 線）の、均一に¹⁵Ｎ−標識されたＲＡＦペプチド（残基５５−１３２）のＲａｓ 結合ドメインの¹⁵Ｎ／¹Ｈ相関スペクトルを示す。化合物の最終濃度は１．０ｍ Ｍであった。スペクトル（８０複合ポイント、８スキャン／ｆｉｄ）は、２０ｍ Ｍホスフェート（ｐＨ７．０）、１０ｍＭＤＴＴ及び１０％Ｄ₂Ｏ中に０．３ｍ ＭのＲＡＦ断片を含むサンプルで得たものである。結合時に有意な変化を示す特 定残基を図示する。 図６は、試験化合物を添加前（薄い複数の等高線）及び添加後（濃い単一等高 線）の、均一に¹⁵Ｎ−標識されたＦＫＢＰの¹⁵Ｎ／¹Ｈ相関スペクトルを示す。 化合物の最終濃度は１．０ ｍＭであった。スペクトル（８０複合ポイント、４スキャン／ｆｉｄ）は、５０ ｍＭホスフェート（ｐＨ６．５）、１００ｍＮａＣｌ及び１０％Ｄ₂Ｏ中に０． ３ｍＭのＦＫＢＰを含むサンプルで得たものである。結合時に有意な変化を示す 特定残基を図示する。 図７は、Ｅ２のＤＮＡ結合ドメインのＮＭＲ誘導構造の第１描写を示す。対称 ダイマーの２つのモノマーは頭−尾様式で配向しており、各モノマーのＮ−及び Ｃ−末端（１つのモノマーについてはＮ及びＣ、他方のモノマーについてはＮ^* 及びＣ^*）を図示する。リボンには、第１の試験化合物に結合したときに有意な 化学シフト変化（Δδ（¹Ｈ）＞０．０４ｐｐｍ、Δδ（¹⁵Ｎ）＞０．１ｐｐｍ ）を示す残基を示す。これらの残基はＥ２のＤＮＡ認識ヘリックスに対応する。 わかりやすくするために特定残基に番号を付した。 図８は、Ｅ２のＤＮＡ結合ドメインのＮＭＲ誘導構造の第２描写を示す。対称 ダイマーの２つのモノマーは頭−尾様式で配向しており、各モノマーのＮ−及び Ｃ−末端（１つのモノマーについてはＮ及びＣ、他方のモノマーについてはＮ^* 及びＣ^*）を図示する。リボンには、第２の試験化合物に結合したときに 有意な化学シフト変化（Δδ（¹Ｈ）＞０．０４ｐｐｍ、Δδ（¹⁵Ｎ）＞０．１ ｐｐｍ）を示す残基を示す。これらの残基は主にダイマー界面領域に位置する。 わかりやすくするために特定残基に番号を付した。 図９は、ストロメライシンの触媒ドメインのＮＭＲ誘導構造の描写を示す。Ｎ −及びＣ−末端を図示する。リボンには、試験化合物に結合したときに有意な化 学シフト変化（Δδ（¹Ｈ）＞０．０４ｐｐｍ、Δδ（¹⁵Ｎ）＞０．１ｐｐｍ） を示す残基を示す。これらの残基はＳ１'結合サイトの一部を形成するか、また は空間的にこのサイトに近接している。わかりやすくするために特定残基に番号 を付した。 図１０は、ストロメライシンの作用ドメインに結合した第１及び第２リガンド の３元複合体のリボンプロットを示す。発明の詳細な説明 本発明は、治療目的の標的分子に結合するリガンドを同定するための迅速且つ 効率的なスクリーニング方法を提供する。 リガンドは、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光分析法を用いてデータベース中のリガ ンド化合物を添加したときの標的分子の化学シフトの変化を追跡して、標的分子 （例えば、タンパク質、核 酸等）に対する分子の結合を試験することにより同定される。 標的分子の化学シフトの変化をリガンド濃度の関数として分析すると、リガン ドの生体分子に対する結合アフィニティーも測定される。 各リガンドに対する結合サイトの位置は、リガンドを添加したときに変化する 生体分子の化学シフトの分析とリガンドと生体分子間の核オーバーハウザー効果 （ＮＯＥ）から決定される。 上記した方法により同定されるリガンド間の構造／活性の関係についての情報 を利用して、標的分子に対するリガンドとして使用される新規薬物を設計するこ とができる。例えば、所与の標的分子に対して２つ以上のリガンドが同定された 場合、これらのリガンドと標的分子との複合体が形成される。リガンドの他のリ ガンドに対する及び標的分子に対する立体配向は３次元構造から誘導される。立 体配向は、２つのリガンドの結合サイト間の距離とこれらのサイトに対する各リ ガンドの配向を規定する。 上記した立体配向データを用いて、２つ以上のリガンドを相互に結合させて新 規リガンドを形成する。結合は、リガンドの他のリガンドに対する及び標的分子 に対する立体配向を維持す る方法で実施される。 本発明のＮＭＲをベースとする発見方法には多くの利点がある。第１に、本発 明の方法は、標的分子に対する結合を直接調べることによりリガンドを同定する ので、偽陽性の問題が有意に減少する。本発明の方法は標的分子に対する特定結 合サイトを同定するので、化合物が高濃度の標的分子に非特異的に結合するため に生ずる偽陽性の問題が解消される。 第２に、本発明の方法は広範囲の解離定数で標的分子に特異的に結合する化合 物を同定できるので、偽陰性の問題も有意に減少する。化合物に対する解離また は結合定数は本発明の方法により測定することができる。 本発明の他の利点は、本発明の発見方法から提供される各リガンドに関するデ ータが豊富でありかつ詳細であることに起因する。 結合したリガンドの位置がリガンドを添加したときに変化する標的分子の化学 シフトの分析及びリガンドと生体分子間の核オーバーハウザー効果から決定され 得るので、ターゲットに既に結合している第１リガンドの存在下で第２リガンド の結合を測定することができる。各種リガンドの結合サイトを同時に測 定できることから、当業者は、１）リガンド間の負または正の協同結合を規定す ることができ、２）リガンドの他のリガントに対する及び結合サイトに対する配 向を適切に維持しながら２つ以上のリガンドを結合して単一の化合物とすること により、新規薬物を設計することができる。 更に、複数の結合サイトが存在する場合には、標的分子の化学シフトの変化を 添加したリガンドの濃度の関数として分析することにより、各結合サイトの異な る結合サイトに対する相対アフィニティーを測定することができる。所与の化合 物に構造的に類似する複数の化合物を同時にスクリーニングすることにより、リ ガンドについての詳細な構造／活性関係の情報を得ることができる。 第１に、本発明は、特定の標的分子に結合するリガンドを同定するための化合 物のスクリーニング方法を提供する。この方法は、 ａ）¹⁵Ｎ−標識標的分子の第１の２次元¹⁵Ｎ／¹Ｈ ＮＭＲ相関スペクトルを発 生させするステップ、 ｂ）前記した標識標的分子を１つまたはそれ以上の化合物に作用させるステップ 、 ｃ）ステップｂ）で１つまたはそれ以上の化合物に作用させた標識標的分子の第 ２の２次元¹⁵Ｎ／¹Ｈ ＮＭＲ相関スペクトルを発生させるステップ、及び ｄ）第１の２次元¹⁵Ｎ／¹Ｈ ＮＭＲ相関スペクトルと第２の２次元¹⁵Ｎ／¹Ｈ ＮＭＲ相関スペクトルを比較して第１と第２のスペクトルの違いを調べ、その違 いから標的分子に結合した１つまたはそれ以上のリガンドの存在を同定するステ ップを含む。 本発明の方法のステップｂ）において２種以上の化合物をスクリーニングし、 スペクトルの違いを観察する場合には、どの化合物が標的分子に結合するかを同 定するために追加のステップを実施する。これらの追加のステップは、個別に各 化合物について２次元¹⁵Ｎ／¹Ｈ ＮＭＲ相関スペクトルを発生させ、各スペク トルと第１スペクトルを比較して、比較したスペクトル間に標的分子に結合した リガンドの存在を示す違いがあるかどうか調べることからなる。 任意の¹⁵Ｎ−標識標的分子を本発明の方法で使用することができる。医化学に おいてタンパク質が重要であるので、好ましい標的分子はポリペプチドである。 標的分子は当業界で公知 の手段を用いて¹⁵Ｎで標識され得る。好ましい実施態様では、標的分子は形質転 換された宿主細胞を用いて形質転換型で調製され得る。特に好ましい実施態様で は、標的分子はポリペプチドである。高分解ＮＭＲスペントルを与え且つ部分的 にもしくは均一に¹⁵Ｎで標識され得るポリペプチドが使用され得る。均一に¹⁵Ｎ −標識されたポリペプチド標的分子の調製例は、実施例に記載されている。 十分量の均一に¹⁵Ｎ−標識されたポリペプチドを調製するための好ましい方法 は、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを用いて 宿主細胞を形質転換し、形質転換された細胞を¹⁵Ｎの同化可能源を含む培地で培 養することである。¹⁵Ｎの同化可能源は当業界で公知である。好ましい源は¹⁵Ｎ Ｈ₄Ｃｌである。 特定のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターの調製 方法は当業界で公知である。また、宿主細胞を前記ベクターで形質転換する方法 及び形質転換された細胞を培養してポリペプチドを発現させる方法も当業界で公 知である。 本発明のスクリーニング方法の第１ステップでは、標識された標的分子の２次 元¹⁵Ｎ／¹Ｈ ＮＭＲ相関スペクトルを発生 すなわち取得する。２次元¹⁵Ｎ／¹Ｈ ＮＭＲ相関スペクトルを発生させる方法 は当業界で公知である（例えば、Ｄ．Ａ．Ｅｇａｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ ｙ，３２（８）：１９２０−１９２７（１９９３）、Ｂａｘ，Ａ．，Ｇｒｚｅｓ ｉｅｋ，Ｓ．，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，２６（４）：１３１−１３８（１ ９９３）参照）。 本発明のスクリーニング方法で典型的に記録されるＮＭＲスペクトルは、２次 元¹⁵Ｎ／¹Ｈ異核一量子相関（ＨＳＱＣ）スペクトルである。タンパク質の骨格 アミドに対応する¹⁵Ｎ／¹Ｈシグナルは通常うまく分解されるので、各アミドの 化学シフトの変化をモニターすることは容易である。 上記したスペクトルを発生させるとき、大きな水シグナルは勾配を妨害するこ とにより抑制される。多数の化合物に関するＮＭＲデータ（例えば、合成された または天然に存在する小さな有機化合物のデータベース）の取得を助けるために 、サンプル充填機を用いる。このサンプル充填機を用いると、全部で６０個のサ ンプルを無人で流すことができる。こうして、典型的な取得パラメーター（自由 誘導減衰（ｆｉｄ）当たり４スキャン）を用いて、１００〜１２０のＨＳＱＣス ペクトルを２４ 時間で得ることができる。 ＮＭＲデータの処理を助けるために、コンピユータープログラムを使用して複 数の２次元ＮＭＲデータ（ルーチン−自動相（ｒｏｕｔｉｎｅ−ａｕｔｏｍａｔ ｉｃａｌｌｙ ｐｈａｓｅ）２次元ＮＭＲデータを含む）を変換し、自動的に処 理する。個々のＨＳＱＣスペクトルをすぐに検分し、添加化合物用のビヒクル（ ＤＭＳＯ）を含むものの添加化合物そのものを含まない対照サンプルのＨＳＱＣ スペクトルと比較するようにデータをフォーマッティングすることにより、デー タは容易に分析され得る。２次元¹⁵Ｎ／¹Ｈ相関スペクトルを発生させる方法の 詳細は実施例に記載されている。 ¹⁵Ｎ−標識標的分子（ポリペプチド）の代表的な２次元¹⁵Ｎ／¹Ｈ相関スペク トルを図１に示す（Ｅ２タンパク質のＤＮＡ結合ドメイン）。 第１のスペクトルを取得したら、標識された標的分子を１つまたはそれ以上の 試験化合物に作用させる。２つ以上の試験化合物を同時に試験する場合には、複 数の小分子のような化合物のデータベースを使用することが好ましい。典型的に はそのような分子を予め重水素化したジメチルスルホキシドに溶解する。 データベース中の化合物は所要または所望により業者から購入することもできる し、製造することもできる。 個々の化合物を、特にサイズ（分子量＝１００〜３００）及び分子の違いに基 づいて選択することができる。広範囲の結合サイトと相互作用する化合物を発見 する可能性を最大限とするために、異なる形態（例えばフラットな芳香族環、皺 のよった脂肪族環、一重、二重もしくは三重結合を有する直鎖または分枝鎖脂肪 族化合物）及び多様の官能基（例えば、カルボン酸、エステル、エーテル、アミ ン、アルデヒド、ケトン及び各種複素環）を有する化合物を集める。 本発明のＮＭＲスクリーニング方法では、約０．１〜約１０．０ｍＭの範囲の リガンド濃度を使用することができる。この濃度で、酸性または塩基性である化 合物は緩衝されたタンパク質溶液のｐＨを有意に変化させることができる。化学 シフトはｐＨ変化及び直接的な結合相互作用に応じて変化し、よってリガンドの 結合ではなくｐＨ変化の結果として起こる「偽陽性の」化学シフト変化を観察す ることができる。従って、緩衝された溶液のｐＨがリガンドを添加しても変化し ないようにしなければならない。ｐＨをコントロールする１つの手段を下記する 。 化合物を、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中の１．０Ｍ及び０．１Ｍスト ック溶液として２６３°Ｋで保存する。これは、水溶液中のリガンドの溶解度が 限られているから必要である。ＤＭＳＯ溶液のｐＨを直接調節することはできな い。更に、ＨＣｌ及びＮａＯＨはＤＭＳＯ中で不溶性塩を形成するので、別の酸 及び塩基を使用しなければならない。下記する方法が安定なｐＨをもたらすこと が判明した。 ＤＭＳＯ中の１．０Ｍストック溶液を５０ｍＭホスフェート（ｐＨ７．０）で １：１０に希釈する。こうして希釈した溶液アリコートのｐＨを測定する。アリ コートのｐＨに変化が見られないときには（すなわち７．０が保たれているとき には）、ＤＭＳＯストック溶液を１：１０に希釈して０．１Ｍ溶液とすることに より作業溶液を調製し、その溶液を保存する。 希釈したアリコートのｐＨが７．０未満のときには、エタノールアミンを１． ０ＭストックＤＭＳＯ溶液に添加し、該ストック溶液を更にリン酸緩衝液で１： １０に希釈して別のアリコートを作成し、このアリコートのｐＨを再び調べる。 希釈したアリコートのｐＨが７．０よりも高いときには、酢酸を１．０Ｍスト ックＤＭＳＯ溶液に添加し、該ストック溶液 を更にリン酸緩衝液で１：１０に希釈して別のアリコートを作成し、このアリコ ートのｐＨを再び調べる。 エタノールアミン及び酢酸はＤＭＳＯに可溶性であり、適切量を添加して水性 緩衝液に移したときにｐＨが変化しないようにする。ｐＨの調節は、所望の結果 が得られるまで繰り返し行われる交互作用（ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ）工程であ る。 この手順は、実験で使用する低濃度（０．１〜１０ｍＭ）でまたは異なる／よ り弱い緩衝系でｐＨの変化が観察されないように１．０Ｍストック溶液の１：１ ０希釈物（１００ｍＭリガンド）で実施されることに留意されたい。 ¹⁵Ｎ−標識標的分子を１つまたはそれ以上の試験化合物に作用させた後、第２ の２次元¹⁵Ｎ／¹Ｈ ＮＭＲ相関スペクトルを発生させる。第２スペクトルを上 記と同様に発生させる。次いで、第１と第２のスペクトルを比較して、２つのス ペクトルの間に何らかの違いがあるかを調べる。リガンドの存在の指標となる２ 次元¹⁵Ｎ／¹Ｈ ＮＭＲ相関スペクトルの違いは、標的分子中の¹⁵Ｎ−標識サイ トに対応する。これらの違いは、当業界で公知の標準的な方法により測定される 。 例えば、図２、３、４、５及び６は、各種標的分子を各種試 験化合物に作用させる前及びその後の相関スペクトルの比較を示す。上記した試 験をどのように実施したかについては実施例２及び３に後記した。 ２次元¹⁵Ｎ／¹Ｈ ＮＭＲ相関スペクトル中の特定シグナルは、標的分子中の 特定の窒素及びプロトン原子に対応する（例えば、タンパク質中のアミノ酸残基 のアミド）。例えば、図２から分かるように、試験化合物に作用させたＥ２のＤ ＮＡ結合ドメインの２次元¹⁵Ｎ／¹Ｈ ＮＭＲ相関スペクトルの化学シフトは、 １５（Ｉ１５）、２１（Ｙ２１）、２２（Ｒ２２）及び２３（Ｌ２３）残基にお いて生ずる。 図２から分かるように、リガンドの結合は１５位のイソロイシン（Ｉｌｅ）残 基、２１位のチロシン（Ｔｙｒ）残基、２２位のアルギニン（Ａｒｇ）残基及び ２３位のロイシン（Ｌｅｕ）残基を含んでいた。従って、本発明の方法は、リガ ンドと標的分子の間の特定結合サイトを同定するためにも使用することができる 。 各化合物への結合に係わるタンパク質の領域は、化合物を添加したときに変化 する複数の特定アミドシグナルから同定される。これらのシグナルは、十分に確 立されている多くの異核多 次元ＮＭＲ実験を用い、標準的な手順によりタンパク質の各アミド基に帰属され る。 タンパク質により強く結合する分子を発見するために、構造／活性の関係に基 づいて試験するための分子が、タンパク質に結合したときの第１回のリードに関 する第１回のスクリーン及び／または構造の情報からの選択される。例えば、第 １回のスクリーニングにより、リガンドが同定され、それらのリガンドすべてが 芳香族環を含むとすると、次回スクリーニングでは他の芳香族分子を試験化合物 として使用する。 実施例２に後記するように、ストロメライシンの触媒ドメインに対する結合に ついての第１回スクリーニングアッセイでは、２つのビアリール化合物がリガン ドとして同定された。そこで、第２回スクリーニングでは、種々のビアリール誘 導体を試験化合物として使用した。 第２組の試験化合物について、まず１ｍＭの濃度でスクリーニングにかけ、ア フィニティーを示す試験化合物の結合定数を測定する。タンパク質に結合する最 良のリガンドを機能アッセイで得た結果と比較する。適切なリガンドである上記 化合物を化学的に修飾して、最終的には新規な薬物を発見することがで きる類似化合物を製造する。 更に、本発明は、標的分子と該標的分子に結合するリガンド間の解離定数を測 定する方法を提供する。この方法は、 ａ）¹⁵Ｎ−標識標的分子の第１の２次元¹⁵Ｎ／¹Ｈ ＮＭＲ相関スペクトルを発 生させるステップ、 ｂ）前記した標識標的分子を濃度の異なるリガンドで滴定するステップ、 ｃ）ステップｂ）の各濃度のリガンドで２次元¹⁵Ｎ／¹Ｈ ＮＭＲ相関スペクト ルを発生させるステップ、 ｄ）ステップａ）で発生させた第１スペクトルとステップｃ）で発生させた他の すべてのスペクトルを比較して、これらのスペクトルの違いをリガンド濃度の変 化の関数として定量するステップ、及び ｅ）その違いから、標的分子とリガンド間の解離定数（Ｋ_D）を算出するステッ プを含む。 医化学での重要性から、上記方法で使用される好ましい標的分子はポリペプチ ドである。１つの好ましい実施態様では、リガンドの解離定数を測定する方法は 第２リガンドの存在下で実施され得る。この実施態様では、¹⁵Ｎ−標識標的分子 を、該 分子を試験化合物に作用させる前に第２リガンドに結合させる。 タンパク質の¹⁵Ｎ／¹Ｈ化学シフトをリガンド濃度の関数として追跡すること により、結合または解離定数を測定する。既知濃度の標的分子（［Ｐ］₀）を既 に同定されている既知濃度のリガンド（［Ｌ］₀）と混合し、２次元¹⁵Ｎ／¹Ｈ相 関スペクトルを取得する。このスペクトルから、観察された化学シフト値（δ_{ob s} ）を得る。リガンドの濃度を可能ならば標的分子の飽和点まで変化させるべく 上記方法を繰り返す。飽和の時点で飽和の極限化学シフト値（δ_sat）を測定す る。 標的分子が飽和している場合には、特定リガントの標的分子に対する結合の解 離定数は下記式により計算される。 上記式中、［Ｐ］_oは標的分子の総モル濃度であり、［Ｌ］_oはリガンドの総モル 濃度であり、ｘは式 （ここで、δ_freeは遊離種の化学シフトであり、δ_obsは観察された化学シフト 値であり、Δは飽和（δ_sat）の場合の極 限化学シフト値とリガンドを含まない（δ_free）標的分子のの化学シフトの差で ある）に従って決まる。 次いで、解離定数を、測定データに対するベストフィットが標準の曲線当ては め統計法を用いて得られるまでその値を変化させることにより測定する。δ_sat が直接既知でない場合には、Ｋ_D及びδ_satを変化させて同じ曲線当てはめ法にか ける。 本発明の方法を、各種リガンドの各種標的分子に対する結合または解離アフィ ニティーを測定するために使用した例は、後記実施例２及び３に記載されている 。 好ましい標的分子、スペクトルを発生させる手段及びスペクトルを比較する手 段は上記と同じである。 設計方法の第１ステップでは、特定の標的分子に結合する２つまたはそれ以上 のリガンドを同定する。そのようなリガンドの同定は、上記した２次元¹⁵Ｎ／¹ Ｈ ＮＭＲ相関スペクトルを用いて実施する。 ２つ以上のリガンドが別々のサイトで標的分子に結合すると同定されたなら、 標的分子とリガンドとの複合体が形成される。リガンドが２つのとき、複合体は ３元複合体である。リガンドが３つまたはそれ以上のときには、４元及び他の複 合体が形成 される。 複合体は、リガンドが標的に結合し得る条件下で標的分子を各種リガンドと同 時にまたは逐次に混合することにより形成される。上記条件を決定する方法は当 業界で公知である。 複合体が形成されたら、その３次元構造を調べる。３次元構造を測定する任意 の手段が使用される。そのような手段は公知であり、例えばＮＭＲ及びＸ線結晶 学であり、これらの方法が好ましい。３次元の二重及び三重共鳴ＮＭＲをストロ メライシンの触媒ドメインに結合した２つのリガンドの３次元構造を測定するた めに使用した例が、後記実施例４に詳細に記載されている。 ３次元構造を分析すると、リガンドの他のリガンドに対する及び標的分子の配 置に対する立体配向が分かる。まず、各リガンドの標的分子に対する立体配向か ら、結合に直接関与するリガンドの部分（例えば、標的結合サイトと相互作用す る部分）を同定することができ、結合サイトから突出しており続く結合手順で使 用され得る各リガンドの部分を同定することができる。 第２に、立体配向データを、各リガンドの他のリガンドに対する相対位置をマ ッピングするために使用される。言い換えれ ば、空間的に配向されたリガンド間の離散距離を計算することができる。 第３に、立体配向データは、複数のリガンドと標的間の３次元関係をも規定す る。すなわち、リガンド間の絶対距離を計算する他、これらのリガンドの角配向 をも測定することができる。 リガンド及び標的の立体配向がわかれば、２つ以上のリガンドを結合してすべ てのリガンドを含む単一物質とするリンカーを選択することができる。リンカー は、単一物質の各リガンド部分を標的に対して適切な配向で維持するために必要 な距離及び角配向に基づいて設計される。 適当なリンカーの３次元構造は、当業者に公知であるかまたは容易に確認する ことができる。理論的には２つ以上のリガンドを任意の距離及び３次元投影で相 互に結合させることが可能であるとしても、実際には距離及び投影にある制限を 設けることが好ましい。好ましい実施態様では、リガンドは約１５オングストロ ーム（Å）未満、より好ましくは約１０Å未満、更に好ましくは約５Å未満の距 離離れている。 適当なリンカー基が同定されれば、リガンドをそのリンカーで結合させる。リ ガンドを結合させる手段は当業界で公知であ り、リガンド及びリンカー基それ自体の化学構造に依存する。リガンドは、標的 分子への結合に直接関与しないリガンドの部分を使用して互いに結合している。 本発明の方法を用いて設計された薬物であるストロメライシンの蛋白分解活性 を阻害する薬物の設計の詳細については、後記実施例４に記載している。 下記実施例に本発明の好ましい実施態様を示すが、これら実施例は明細書及び 請求の範囲を限定するものではない。実施例１ 均一に¹⁵Ｎ−標識された標的分子の調製 Ａ．ストロメライシン ヒトストロメライシンは、軟骨のタンパク質分解に関与すると考えられている ４４７アミノ酸のタンパク質である。軟骨がタンパク質分解すると、関節軟骨が 分解損失し、骨関節症及びリウマチ様関節炎では関節機能の低下が見られる。こ のタンパク質は、Ｎ−末端潜在の及びプロペブチドドメイン、ホモペキシンに類 似のＣ−末端ドメイン及び内部の触媒ドメインを含めた一連のドメインを有する 。 研究で、約８０個のアミノ酸のＮ−末端プロ配列を除去する と、プロ酵素は４５ｋＤａ成熟酵素に変換されることが判明している。また、研 究から、触媒ドメインを適切に折りたたむためにも阻害剤と相互作用するために も、Ｃ−末端ホモペキシン相同ドメインが必要でないことが判明している（例え ば、Ａ．Ｉ．Ｍａｒｃｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０：６４７６−６４８ ３（１９９１）参照）。そこで、ストロメライシンの８１−２５６アミノ酸残基 の内部セグメントを、ストロメライシンに結合し、ストロメライシンの阻害剤と して作用する可能性のある化合物を同定するために使用されるタンパク質断片と して選択した。 本発明の方法を使用するためには、ペプチド骨格が同位体的に¹⁵Ｎを多く含む ストロメライシンの８１−２５６断片（配列番号１）を調製する必要があった。 このために、タンパク質断片の産生をコードするプラスミドを大腸菌株に挿入し 、遺伝子工学的に修飾した細菌菌株を¹⁵ＮＨ₄Ｃｌ及び¹³Ｃ−グルコースに富む 制限培地で増殖させた。 培地から同位体を多く含むタンパク質断片を単離し、精製した後試験化合物の 結合を評価するための基礎として使用した。これらの方法の手順を以下に記載す る。 ヒト皮膚繊維芽細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ １５０７）を、Ｃｌａｒｋら、Ａ ｒｃｈｉｖ. Ｂｉｏｃｈｅｍ． ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓ．，２４１：３６− ４５（１９８５）に記載されている手順を用いて、増殖し、誘導した。総ＲＮＡ を、Ｐｒｏｍｅｇａ ＲＮＡｇｅｎｔｓ（登録商標）総ＲＮＡ単離システムキッ ト（カタログ番号Ｚ５１１０、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．，２８００ Ｗｏｏ ｄｓ Ｈｏｌｌｏｗ Ｒｏａｄ，マディソン，ウィスコンシン州 ５３７１１− ５３９９）を用い、製造業者の指示に従って、１ｇの細胞から単離した。１μｇ 部分のＲＮＡを８０℃で５分間熱変性後、ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＲＮＡ ＰＣＲキット（カタログ番号Ｎ８０８−００１７，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙ ｓｔｅｍｓ／Ｐｅｒｋ ｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，７６１ Ｍａｉｎ Ａｖｅｎｕｅ， ノーウォーク，コネティカット州 ０６８５９−０１５６）を用い、製造業者の 指示に従って、逆転写ＰＣＲにかけた。 入れ子（nested）ＰＣＲを、第１プライマー（Ａ） GAAATGAAGAGTCTTCAA （配列番号３）及び（Ｂ） GCGTCCCAGGTTCTGGAG （配列番号４）を用い、９４℃×２分間、４５℃×２分間 及び７２℃×３分間の条件下で３５サイクル施 して実施した。続いて、内部プライマー（Ｃ） ATACCATGGCCTATCCATTGGATGGAGC （配列番号５）及び（Ｄ） ATAGGATCCTTAGGTCTCAGGGGAGTCAGG （配列番号６）を用い、すぐ上に記載したと 同じ条件下で３０サイクル施して再増幅して、ヒトストロメライシンのアミノ酸 残基１−２５６をコードするＤＮＡを生じさせた。 次いで、ＰＣＲ断片を、製造業者の指示に従ってＰＣＲクローニングベクター ｐＴ７ブルー（Ｒ）（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，５９７ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄ ｒｉｖｅ，マディソン，ウィスコンシン州 ５３７１１）にクローニングした。 生じたプラスミドをＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩで切断し、ストロメライシン断片を 製造業者の指示に従ってＮｏｖａｇｅｎ発現ベクターｐＥＴ３ｄ(Ｎｏｖａｇｅ ｎ，Ｉｎｃ.，５９７ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，マディソン，ウィスコン シン州 ５３７１１)にサブクローニングした。 アミノ酸残基８１−２５６プラス開始メチオニンをコードする成熟ストロメラ イシン発現構築物を、１−２５６発現構築物からＰＣＲ増幅法により調製した。 生じたＰＣＲ断片を、上記したように製造業者の指示に従って、まず Ｎｏｖａ ｇｅｎ ｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｒ）ベクターにクローニングし、次いでＮｏｖａｇｅｎ ｐＥ Ｔ３ｄベクターにサブクローニングして、プラスミド（ｐＥＴＳＴ−８３−２５ ６）を調製した。この最終プラスミドは、本プラスミドがヒトストロメライシン の配列の８１番目の、より前の２つアミノ酸で始まるペプチド配列をコードする 点を除いて、Ｑｉ−Ｚｈｕａｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１：１１２ ３１−１１２３５（１９９２）に記載されているものと同一である。 プラスミドｐＥＴＳＴ−８３−２５６を、製造業者の指示に従って大腸菌株Ｂ Ｌ２１（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，５９７ Ｓｃｉｅ ｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，マディソン，ウィスコンシン州 ５３７１１）に形質転換 して、発現株ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳ／ｐＥＴＳＴ−２５５−１を得た 。 予備培養培地を、脱イオン水１５０ｍｌにＮａ₂ＨＰ₄・７Ｈ₂Ｏ１．６９８ｇ 、ＫＨ₂ＰＯ₄０．４５ｇ、ＮａＣｌ０．０７５ｇ、¹⁵ＮＨ₄Ｃｌ０．１５０ｇ、^{1 3} Ｃ−グルコース０．３００ｇ、１Ｍ−ＭｇＳＯ₄水溶液３００μｌ及びＣａＣｌ₂ 水溶液１５μｌを溶解して調製した。 こうして調製した予備培養培地の溶液を滅菌し、５００ｍｌ容の滅菌バフルフ ラスコに移した。予備培養培地に細菌菌株を接種する直前に、１００％エタノー ル中に３４ｍｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含む溶液１５０μｌ及び２０ｍ ｇ／ｍｌのアンピシリンを含む溶液１．５ｍｌをフラスコ内容物に添加した。 次いで、遺伝的に修飾した大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳ／ｐＥＴ ＳＴ−２５５−１のグリセロールストック１ｍｌをフラスコ内容物に接種した。 フラスコ内容物を、光学密度が０．６５になるまで３７℃で振とうした(２２５ ｒｐｍ)。 発酵栄養培地を、脱イオン水９６０４ｍｌにＮａ₂ＨＰ₄・７Ｈ₂Ｏ１１３．２ ８ｇ、ＫＨ₂ＰＯ₄３０ｇ、ＮａＣｌ５ｇ及び１％ ＤＦ−６０消泡剤１０ｍｌを 溶解して調製した。この溶液をＮｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆ ｉｃ Ｍｉｃｒｏｓ Ｆｅｒｍｅｎｔｅｒ（Ｅｄｉｓｏｎ，ニュージャージー州 ）に入れ、１２１℃で４０分間滅菌した。 培養培地を接種する直前に、以下の成分、すなわち¹⁵ＮＨ₄Ｃｌの１０％水溶 液１００ｍｌ、¹³Ｃ−グルコースの１０％水溶液１００ｍｌ、１Ｍ−ＭｇＳＯ₄ 水溶液２０ｍｌ、１Ｍ− ＣａＣｌ₂水溶液１ｍｌ、チアミン塩酸塩（１０ｍｇ／ｍｌ）の水溶液５ｍｌ、 １００％エタノール中に３４ｍｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含む溶液１０ ｍｌ及び前記クロラムフェニコール溶液に溶解させた１．９ｇのアンピシリンを 、予め滅菌してから発酵容器内容物に添加した。得られた溶液のｐＨを４Ｎ−Ｈ₂ ＳＯ₄水溶液を添加して７．００に調整した。 上記した振とうフラスコスケール法により調製した大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３ ）／ｐＬｙｓＳ／ｐＥＴＳＴ−２５５−１の予備培養物を発酵槽内容物に添加し 、光学密度が０．４８になるまで細胞を増殖させた。この間、必要に応じて４Ｎ −Ｈ₂ＳＯ₄または４Ｎ−ＫＯＨを添加して発酵槽内容物のｐＨを自動的に７．０ に維持した。発酵槽内容物の溶存酸素濃度を、その濃度が５５％未満になると撹 拌速度が速くなる縦続ループを用いて５５％以上に維持した。空気を７標準リッ トル／分（ＳＬＰＭ）で発酵槽内容物に供給し、培養温度を処理中３７℃に維持 した。 細胞を４℃、１７，０００×ｇで１０分間遠心することにより収集し、生じた 細胞ペレットを集め−８５℃で保存した。生細胞収量は３．５ｇ／ｌであった。 細胞溶菌液の可溶性及び不 溶性部分をドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(ＳＤＳ −ＰＡＧＥ)により分析したところ、約５０％の¹⁵Ｎ−ストロメライシンが可溶 性相に認められた。 上記のようにして調製した同位体標識ストロメライシン断片を、Ｙｅら、Ｂｉ ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１：１１２３１−１１２３５（１９９２）に記載され ている方法の変法を用いて精製した。 収集した細胞を、１ｍＭのＭｇＣｌ₂、０.５ｍＭのＺｎＣｌ₂、２５単位／ｍ ｌのＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）酵素、及び１μｇ／ｍｌの４−（２−アミ ノエチル）−ベンゼンスルホニルフロリド（“ＡＥＢＳＦ”）と１μｇ／ｍｌの Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ（登録商標）と１μｇ／ｍｌのＡｐｒｏｔｉｎｉｎ（登録商 標）と１μｇ／ｍｌのＰｅｐｓｔａｔｉｎ（登録商標）とからなる阻害剤混合物 を含む２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）ナトリウムアジド溶液 に懸濁させた。なお、ＡＥＢＳＦ、Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ(登録商標)、Ａｐｒｏｔ ｉｎｉｎ（登録商標）及びＰｅｐｓｔａｔｉｎ(登録商標)は１７ Ｓｔｒａｔｈ ｍｏｒｅ Ｒｏａｄ、ナティック、マサチューセッツ州 ０１７６０に所在のＡ ｍｅｒｉｃａｎ Ｉｎｔｅｒｎａ ｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌから市販されている。 生じた混合物を１時間緩やかに撹拌してから、４℃に冷却した。その後、細胞 を５０％の使用率（ｄｕｔｙ ｃｙｃｌｅ）で音波破壊した。得られた溶菌液を １４，０００ｒｐｍで３０分間遠心し、不溶性分画のペレットを後続の処理（後 記参照）のために−８０℃で凍結した。 固体の硫酸アンモニウムを飽和の２０％のポイントまで上清に添加し、生じた 溶液を７００ｍｌフェニルセファロース高速流動（“Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ”）カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，８００ Ｃｅｎｔｅ ｎｎｉａｌ Ａｖｅ．，Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ １３２７，ピスカタウェー，ニュージ ャージー州 ０８８５５）に充填した。充填前に、セファロースカラムを５０ｍ Ｍ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（４℃でｐＨ７．６）、５ｍＭ−ＣａＣｌ₂及び１ Ｍ−（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄で平衡化した。充填したカラムに直線勾配の（ＮＨ₄）₂Ｓ Ｏ₄水溶液及びＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．６）中のＣａＣｌ₂水溶液を流 して溶離させた。前記（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄水溶液の濃度は１Ｍから０Ｍに漸減させ 、前記ＣａＣｌ₂水溶液の濃度は５ｍＭから２０ｍＭに漸増させた。 溶出液の活性分画をＡｍｉｃｏｎ撹拌セル（Ａｍｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．，７２ Ｃｈｅｒｒｙ Ｈｉｌｌ Ｄｒｉｖｅ，ビバリー，マサチューセッサ州 ０１９ １５）に集め、濃縮した。濃縮したサンプルを、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ カラム、１０ｍＭのＣａＣｌ₂を含む５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ(４℃でｐＨ８ ．２)を用いて最初の緩衝液中に一晩透析した。 次いで、透析したサンプルをＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦカラムに充填し、 最初の緩衝液及び２００ｍＭ−ＮａＣｌからなる直線勾配で溶離させた。同位体 標識したストロメライシンの精製可溶性分画を濃縮し、４℃で保存した。 ペレットを８Ｍのグアニジン−ＨＣｌに可溶化した。生じた溶液を２０，００ ０ｒｐｍで２０分間遠心し、上清を、５０ｍＭ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６ ）、１０ｍＭ−ＣａＣｌ₂、０．５ｍＭ−ＺｎＣｌ₂、及び１μｇ／ｍｌのＡＥＢ ＥＦと１μｇ／ｍｌのＬｅｕｐｅｐｔｉｎ（登録商標）と１μｇ／ｍｌのＡｐｒ ｏｔｉｎｉｎ（登録商標）と１μｇ／ｍｌのＰｅｐｓｔａｔｉｎ（登録商標）と からなるフォールディング緩衝液中に滴下した。フォールディング緩衝液の容量 は上清の容量の１０倍とした。上清及びフォールディング緩衝液の混合物を ２０，０００ｒｐｍで３０分間遠心した。 上記遠心から得た上清を４℃で保存し、ペレットに上記したグアニジン−ＨＣ ｌ中への可溶化、緩衝液中でのリフォールディング及び遠心のステップを２回施 した。３回の遠心の各々から得られた最終上清を合わせ、２０％飽和のポイント まで固体の硫酸アンモニウムを添加した。こうして不溶性分画から誘導された溶 液を、固体分画について上記したようにフェニルセファロース及びＱ−セファロ ースを用いて精製した。 精製した可溶性及び不溶性分画を合わせて、元の細胞ペースト１ｇ当たり約１ ．８ｍｇの精製した同位体標識ストロメライシン８１−２５６分画を得た。 Ｂ．ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ２阻害剤 パピローマウィルスは、性器いぼ及び子宮頸癌を引き起こす小ＤＮＡウィルス の科である。ＨＰＶのＥ２タンパク質はウィルス転写を調節し、ウィルスの複製 に必要とされている。従って、Ｅ２のＤＮＡへの結合をブロックする分子はＨＰ Ｖに対する有用な治療剤となり得る。ＤＮＡではなくタンパク質を標的として選 択したのは、より選択性の物質はＤＮＡよりもむしろタンパク質に結合するだろ うと予測されるからである。 ヒトパピローマウイルスＥ２のＤＮＡ−結合ドメインを、Ｅ２をコードする完 全長ＤＮＡからＰＣＲ法を用いてクローニングし、Ｔ７発現系を用いて細菌にお いて過剰発現させた。均一に¹⁵Ｎ−標識されたタンパク質を、¹⁵Ｎ−標識塩化ア ンモニウムを含有する最少培地で増殖させた細菌から単離した。このタンパク質 を、緩衝液（５０ｍＭ−Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ−ＮａＣｌ、１ｍＭ−ＥＤＴＡ、 ｐＨ＝８．３）で予め平衡化したセファロース高速流動カラムを用いて細菌細胞 溶菌液から精製した。 タンパク質を、緩衝液中１００→５００ｍＭのＮａＣｌの直線勾配で溶離し、 プールし、ｐＨ７．０でＭｏｎｏ−Ｓカラムにかけた。タンパク質を塩勾配（１ ００→５００ｍＭ）で溶離し、０．３ｍＭまで濃縮し、アジ化ナトリウム（０． ５％）を含むＴＲＩＳ緩衝（５０ｍＭ、ｐＨ＝７．０）Ｈ₂Ｏ／Ｄ₂Ｏ（９／１） 溶液に交換した。 Ｃ．ＲＡＦ ＲＡＦタンパク質の均一に¹⁵Ｎ−標識したＲａｓ結合ドメインを、Ｅｍｅｒｓ ｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３４（２１）：６９１１−６９１８（１９ ９５）に記載されている ように調製した。 Ｄ．ＦＫＢＰ 均一に¹⁵Ｎ−標識した組換えヒトＦＫ結合タンパク質（ＦＫＢＰ）を、Ｌｏｇ ａｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．,２３６：６３７−６４８（１９９４）に記載 されているように調製した。実施例２ ２次元¹⁵Ｎ／¹Ｈ ＮＭＲ相関スペクトル分析を用いる化合物のスクリーニング ストロメライシンの触媒ドメインを実施例１の手順に従って調製した。スクリ ーニングアッセイで使用したタンパク質溶液は、ＴＲＩＳ緩衝（５０ｍＭ、ｐＨ ＝７．０）Ｈ₂Ｏ／Ｄ₂Ｏ（９／１）溶液中にストロメライシンの均一に¹⁵Ｎ−標 識した触媒ドメイン（０.３ｍＭ）、アセトヒドロキサム酸(５００ｍＭ)、Ｃａ Ｃｌ₂(２０ｍＭ)、及びアジ化ナトリウム(０.５％)を含むものであった。 ２次元¹⁵Ｎ／¹Ｈ ＮＭＲ相関スペクトルを、三重共鳴プローブ及びＢｒｕｋ ｅｒサンプル充填機を備えたＢｒｕｋｅｒ ＡＭＸ５００ ＮＭＲ分光光度計を 用いて２９℃で発生させた。¹⁵Ｎ／¹Ｈ ＨＳＱＣスペクトルを、掃引幅２００ ０Ｈｚ （¹⁵Ｎ，ｔ１）及び８３３３Ｈｚ（¹Ｈ，ｔ２）を用いて８０×１０２４複合点 として得た。データは、スキャン間の遅延を１秒とし、自由誘導減衰（ｆｉｄ） 当たり８スキャンとして収集した。すべてのＮＭＲスペクトルをＳｉｌｉｃｏｎ Ｇｒａｐｈｉｃｓコンピューターでインハウスで作成されたソフトウェアを用 いて処理し、分析した。 上記した¹⁵Ｎ−標識ストロメライシン標的分子について第１の２次元¹⁵Ｎ／¹ Ｈ−ＮＭＲ相関スペクトルを得た。ついで、ストロメライシン標的を試験化合物 のデータベースに作用させた。化合物のストック溶液を１００ｍＭ及び１Ｍで調 製した。また、１サンプル当たり８〜１０種の化合物を各化合物を１００ｍＭの 濃度で含む組み合わせライブラリーも作成した。 １００ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ＝７．０）で１／１０倍希釈してもｐＨ変化 が生じないように、１Ｍストック溶液のｐＨを酢酸及びエタノールアミンで調節 した。ｐＨの調節は重要である。なぜならば、ｐＨがわずかにでも変化すると生 体分子の化学シフトが変化し、ＮＭＲデータの解釈を難しくする可能性があるか らである。 データベース中の化合物をサイズ（分子量＝１００〜３００） 及び分子の違いに基づいて選択した。広範囲にわたる結合サイトと相互作用する 化合物を発見する可能性を最大現とするためには、コレクション中の分子は様々 な形態(例えば、フラットな芳香族環、皺がよった脂肪族環、一重、二重もしく は三重結合を有する直鎖及び分枝鎖脂肪族化合物)及び様々な官能基(例えばカル ボン酸、エステル、エーテル、アミン、アルデヒド、ケトン及び各種複素環)を 持っていた。 ＮＭＲサンプルは、各化合物を１００ｍＭの濃度で含む化合物混合物のＤＭＳ Ｏストック溶液４μｌを均一に¹⁵Ｎ−標識したタンパク質のＨ₂Ｏ／Ｄ₂Ｏ（９／ １）緩衝溶液０．４ｍｌに添加することにより調製した。ＮＭＲサンプル中の各 化合物の最終濃度は約１ｍＭであった。 第１回のスクリーニングにおいて、ストロメライシンの触媒ドメインに結合す る２つの化合物を見つけた。これらの化合物は両方ともビアリール部分を含む。 こうした第１回目の最初のヒットに基づいて、複数の構造的に類似の化合物をス トロメライシンに対してテストした。ビアリール化合物の構造は以下の構造式Ｉ により表される。 Ｒ₁〜Ｒ₃及びＡ₁〜Ａ₃の定義については表１を参照されたい。 第２回のスクリーニングにおいて、アセトヒドロキサム酸の飽和量（５００ｍ Ｍ）の存在下または非存在下での結合を調べた。 多くのビアリール化合物がストロメライシンの触媒ドメインに結合することが 判明した。図４に、ストロメライシンにビアリール試験化合物を作用させる前及 びその後の代表的な２次元¹⁵Ｎ／¹Ｈ ＮＭＲ相関スペクトルを示す。図４から 明らかなように、化合物はＷ１２４、Ｔ１８７、Ａ１９９及びＧ２０４と命名し たサイトのような¹⁵Ｎ−サイトに化学シフトを生じさせた。 これらのサイトは、配列番号１の１２４位のトリプトファン（ＴｒＰ）残基、 １８７位のトレオニン（Ｔｈｒ）残基、１９９位のアラニン（Ａｌａ）残基及び ２０４位のグリシン（Ｇｌｙ）残基に対応する。図９は、ＮＭＲ結合データとス トロメライシンの触媒ドメインのＮＭＲ誘導３次元構造の図の相関関係を示す。 特定リガンドの特定結合サイトを位置決定できることは本 発明の利点である。 数種の化合物のみがヒドロキサム酸の存在下でストロメライシンに結合した。 従って、数種の化合物の結合アフィニティーがヒドロキサム酸の存在下で増強さ れた（すなわち、協同的である）。これらの結果は、他の分子の存在下でタンパ ク質に結合する化合物を同定できるという本発明のスクリーニングアッセイの別 の重要な可能性を例示している。 構造Ｉを有する各種ビアリール化合物を、異なる濃度でストロメライシンへの 結合について試験した。各濃度で発生した¹⁵Ｎ／¹Ｈスペクトルを評価し、スペ クトルの違いを化合物濃度の関数として定量した。これらの違いから、結合また は解離定数(Ｋ_D)を当業界で公知の標準的な方法に従って算出した。これらの試 験の結果を表１に示す。表１中のＲ₁〜Ｒ₃及びＡ₁〜Ａ₃の位置は上記構造式Ｉを 参照されたい。 表１のデータから、本発明の方法がリガンドと標的分子間の解離または結合定 数を測定するために使用されることが分かる。 本発明のＮＭＲスクリーニングアッセイの別の利点は、２次元¹⁵Ｎ／¹Ｈ Ｎ ＭＲ相関スペクトルにおいて観察された化学シフトを標的分子配置の他のスペク トルまたは投影と相関させ得ることである。そのような相関の代表的な結果を図 ９に示す。図９には基質分子との結合が最も確実に起こるであろうポリペプチド の領域が示されている。この図では、ストロメライシン における（表１の）化合物１に対する見かけ結合領域が示されている。 Ｅ２タンパク質のＤＮＡ−結合ドメインへの結合について、データベースから の化合物を同様にスクリーニングした。試験した化合物は以下の構造式IIを有す るものであった。 Ｒ₁〜Ｒ₄及びＡの定義については表２を参照されたい。 ＮＭＲ実験は、三重共鳴プローブ及びＢｒｕｋｅｒサンプル充填機を備えたＢ ｒｕｋｅｒ ＡＭＸ５００ ＮＭＲ分光光度計を用いて２９℃で実施した。¹⁵Ｎ ／¹Ｈ ＨＳＱＣスペクトルを、掃引幅２０００Ｈｚ（¹⁵Ｎ，ｔ１）及び８３３ ３Ｈｚ（¹Ｈ，ｔ２）を用いて８０×１０２４複合点として得た。データは、ス キャン間の遅延を１秒とし、自由誘導減衰(ｆｉｄ)当たり４スキャンとして収集 した。すべてのＮＭＲスペクトルをＳｉｌｉｃｏｎ Ｇｒａｐｈｉｃｓコンピュ ーターで処理し、分析した。 図２及び図３はそれぞれ、Ｅ２のＤＮＡ結合ドメインを第１ 及び第２の試験化合物に作用させる前及び後の代表的な２次元¹⁵Ｎ／¹Ｈ ＮＭ Ｒ相関スペクトルを示す。 図２から明らかなように、第１の化合物はＩ１５、Ｙ２１、Ｒ２２及びＬ２３ と命名されるサイトのような¹⁵Ｎ−サイトに化学シフトを生じさせた。これらの サイトは、配列番号６の１５位のイソロイシン（Ｉｌｅ）残基、２１位のチロシ ン（Ｔｙｒ）残基、２２位のアルギニン（Ａｒｇ）残基及び２３位のロイシン（ Ｌｅｕ）残基に相当する。 図３から明らかなように、第２の化合物はＩ６、Ｇ１１、Ｈ３８及びＴ５２と 命名される特定の¹⁵Ｎ−サイトに化学シフトを生じさせた。これらのサイトは、 配列番号６の６位のイソロイシン（Ｉｌｅ）残基、１１位のグリシン（Ｇｌｙ） 残基、３８位のヒスチジン（Ｈｉｓ）残基及び５２位のトレオニン（Ｔｈｒ）残 基に相当する。 図７及び図８は、上記したＮＭＴＲ結合データとＥ２のＤＮＡ−結合ドメイン のＮＭＲ誘導３次元構造の図との相関関係を示す。 数種の構造的に類似の化合物は、１ｍＭの濃度でスクリーニングしたときタン パク質の化学シフトの変化を生じさせた。化 合物の添加時に２組の明確なアミド共鳴が変化することが見られた。１組のシグ ナルは２つのモノマー間に形成されるβ−バレル中に位置するアミドに相当し、 他組のシグナルはＤＮＡ結合サイトの近くに位置するアミドに相当する。 例えば、２個のフェニル環を有し、該環を連結する炭素に結合したカルボン酸 を有する化合物のみが、ＤＮＡ結合サイトのアミドの化学シフトを変化させた。 対照的に、ベンゾフェノン及びフェノキシフェニル含有化合物のみがβ−バレル （ｂａｒｒｅｌ）に結合した。他の化合物では両組のシグナルの化学シフトの変 化を生じさせたが、量を変えることにより各組のシグナルはシフトされた。この ことから、２つの明確な結合サイトの存在が示唆される。 リガンド濃度の関数として化学シフトの変化をモニターすることにより、２つ の結合サイトに対する結合定数をも測定した。これらの試験結果を下記表２にま とめて示す。 注：Ａ欄の”−ａ”は原子が存在しないこと、すなわちビフェニル結合を示す。 ＲＡＦタンパク質の均一に¹⁵Ｎ−標識したＲａｓ結合ドメインを実施例１に記 載されているように調製し、上記したＮＭＲ手順に従って２次元¹⁵Ｎ／¹Ｈ Ｎ ＭＲ相関スペクトル分析を用いてスクリーニングした。代表的な試験結果を図５ に示す。図５には、試験化合物を作用させる前及びその後の２次元¹⁵Ｎ／¹Ｈ ＮＭＲ相関スペクトルを示す。 均一に¹⁵Ｎ−標識したＦＫＢＰを実施例１に記載されているように調製し、上 記したＮＭＲ手順に従って２次元¹⁵Ｎ／¹Ｈ ＮＭＲ相関スペクトル分析を用いてスクリーニングした。代表的な試験結果を図 ６に示す。図６には、試験化合物に作用させる前及びその後の２次元¹⁵Ｎ／¹Ｈ ＮＭＲ相関スペクトルを示す。実施例３ ＮＭＲ、酵素、フィルター結合及びゲルシフトスクリーニングアッセイの比較 本発明のＮＭＲ法により測定したリガントの各種生体分子に対する結合定数を 、複数の従来方法で得た結果と比較するために試験を実施した。 第１の試験では、本発明のＮＭＲ法及び従来の酵素アッセイにより結合定数を 測定した。標的分子は、実施例１の手順に従って調製したストロメライシンの触 媒ドメインであった。ＮＭＲ結合定数Ｋ_Dは、実施例２に記載の２次元¹⁵Ｎ／¹Ｈ ＮＭＲ相関スペクトルを用いて得た。こうして得たＫ_D値を、酵素アッセイで 測定した阻害定数Ｋ_Iと比較した。 酵素アッセイでは、発蛍光団とクエンチング剤の分離を引き起こすペプチド分 解時の蛍光増加を追跡することにより蛍光基質の分解速度を測定した。酵素活性 を、各種濃度のアセトヒド ロキサム酸とビアリール化合物のマトリックスを用いて測定した。アッセイは、 Ｍａｔａｙｏｓｈｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ：２４７：９５４−９５８（１９９０） に記載の蛍光基質特性を使用し、Ｈ．Ｗｅｉｎｇａｒｔｅｎら、Ａｎａｌ．Ｂｉ ｏｃｈｅｍ．，１４７：４３７−４４０（１９８５）に記載の方法の改変である 。 アセトヒドロキサム酸の濃度を０．０〜１．０Ｍの範囲で８段階で変え、化合 物の濃度を６段階で変え、全体で４８点で試験した。各化合物の濃度は溶解性及 び活性により変化させた。 アセトヒドロキサム酸それ自体を滴定することを除いて、すべてのＮＭＲ測定 を５００ｍＭのアセトヒドロキサム酸の存在下で実施した。化学シフトが添加し たリガントに応じて変化することが観察されたことから、解離定数を求めた。次 いで、標準的な手順に従って阻害データから阻害定数を求めた。 これらの試験結果を下記表３にまとめて示す。この表には、ＮＭＲ誘導解離定 数（Ｋ_D）と蛍光基質を用いる酵素アッセイで測定した阻害定数（Ｋ_I）とを比較 して示す。 表３のデータから、本発明のＮＭＲ法はリガンドの標的生体分子に対する解離 または結合定数の迅速、効率的且つ正確な測定方法を提供することが分かる。２ つの方法で測定した結合定数の比較から、試験した化合物の活性が同じランクに 位置づけられる。すなわち、２つの方法で測定した所与の基質に対する値は同一 ではないが、これらの値は相互に比例している。 第２の実験で、Ｅ２のＤＮＡ−結合ドメインのその標的ＤＮＡに対する結合結 果を従来方法で得、本発明の方法で得た結果と比較した。標的は、実施例１の手 順に従って調製したＥ２のＤＮＡ−結合ドメインであった。ＮＭＲスクリーニン グアッセイ及びリガンド解離定数を測定するためのＮＭＲ法は実施例２に記載の ように実施した。 ＮＭＲ法による結合定数を、ＤＮＡの標的への結合を測定する物理的フィルタ ー結合アッセイの結果と比較した。高処理量フィルター結合アッセイは、上記実 施例２に従って調製したＥ２を用いて実施した。³³Ｐ−標識ＤＮＡは、３個の高 アフィニティーＥ２結合サイト及び１つの低アフィニティーＥ２結合サイトを含 むＨＰＶ−１１ゲノムをＰＳＰ−６５プラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ，マディソン ，ウィスコンシン州）に挿入して形成した１０，３２９塩基対プラスミドからな るものであった。 複数の化合物について、ＮＭＲで測定した異なるサイトの結合アフィニティー をフィルター結合アッセイで測定したＥ２のＤＮＡへの結合の抑制と比較した。 上記した表２から明らかなように、フィルター結合アッセイで測定した活性は、 ＤＮＡ結合サイトのアミドから求めた結合アフィニティーと密接に相関するが、 β−バレルサイトで測定したアフィニティーとは相関しなかった。これは、各サ イトの相対位置に一致する。 別の試験では、ＮＭＲで測定した結合の結果は、当業界で公知の方法を用いる 従来のゲル−シフトアッセイで得た結果と類似していた。ゲル−シフトアッセイ は、完全長Ｅ２と２つのＥ ２結合サイトを含む³³Ｐ−標識６２塩基対ＤＮＡ断片とを含むＧＳＴ融合タンパ ク質を用いて実施した。 上記方法により、ゲル−シフトアッセイで正の結果を示した多数の化合物を同 定した。しかしながら、正の結果の幾つかはＤＮＡに結合することに起因するも のと考えられた。何故ならば、この場合、本発明のＮＭＲ法を用いるとＥ２タン パク質への結合は認められなかったからである。化合物を添加したときタンパク 質よりもＤＮＡの化学シフトが変化することが立証されているように、上記化合 物は実際にはＥ２よりもむしろＤＮＡに結合することが分かった。これらのデー タから、本発明の更に別の利点が偽陽性の発現率を最小にし得ることであるが分 かる。実施例４ ストロメライシンの強力な非ペプチド阻害剤の設計 ストロメライシンの触媒ドメインに結合する新規リガンドを設計するために試 験を実施した。ストロメライシンは自己分解されるので、ストロメライシンの分 解をブロックする阻害剤を探した。そのような阻害剤を用いれば、酵素の他のサ イトに結合する他の強力なリガンドを容易にスクリーニングできるであ ろう。 他の結合サイトをスクリーニングする際に化合物を選択するときに用いられる 基準は、主にリガンドのサイズに基づいた。飽和（酵素の＞９８％占有率）する に十分な溶解度を有し酵素を阻害する最小のリガンドを探した。 ストロメライシンの触媒ドメインのクローニング、発現及び精製を実施例１に 記載した手順を用いて実施した。新規リガントを設計する場合の第１ステップは 、ストロメライシン標的に結合した第１リガンドを同定することであった。その 同定は、上記した２次元¹⁵Ｎ／¹Ｈ ＮＭＲ相関スクリーニング法に従って実施 した。 一般式Ｒ−（ＣＯ）ＮＨＯＨを有する多数のヒドロキサム酸を、実施例２に記 載の手順を用いてストロメライシンへの結合についてスクリーニングした。試験 した化合物のうち、アセトヒドロキサム酸［ＣＨ₃（ＣＯ）ＮＨＯＨ］が選択基 準に最もよく適合した。この化合物は１７ｍＭというストロメライシンに対する 結合アティニティーを示し、良好な水溶性を示した。５００ｍＭの濃度で、アセ トヒドロキサム酸は酵素の分解を抑制し、他の有力なリガンドのスクリーニング に使用し得る。 設計方法の第２ステップは、アセトヒドロキサム酸の結合サイトとは異なるサ イトで標的ストロメライシンに結合する第２のリガンドを同定することであった 。このために、飽和量のアセトヒドロキサム酸の存在下でストロメライシンに結 合する能力について複数の化合物をスクリーニングした。この第２同定ステップ の手順の詳細及び結果は実施例２に記載した通りである。 これらの試験から第２リガンドとして同定された化合物は表１の化合物No.４ であり（実施例２参照）、この化合物を次の設計ステップで使用した。 設計方法の第３ステップでは、標的ストロメライシン、第１リガンド及び第２ リガンドの３元複合体を構築した。このために、ストロメライシン標的を複合体 を形成し得る条件で２つのリガンドに作用させた。次いで、３元複合体の３次元 構造を下記のＮＭＲ分光分析法を用いて調べた。 ３元複合体中のストロメライシンの¹Ｈ、¹³Ｃ及び¹⁵Ｎ骨格共鳴を、複数の３ 次元二重及び三重共鳴ＮＭＲスペクトルを分析して帰属させた（Ａ．Ｂａｘら、 Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，２６：１３１−１３８（１９９３））。隣接スピ ン 系のＣ^α共鳴を、それぞれＦ１（¹⁵Ｈ）、Ｆ２（¹³Ｃ）及びＦ３（¹Ｈ）の各デ ィメンジョンにおいて１７７３Ｈｚ（３５．０ｐｐｍ）、３７８８Ｈｚ（３０． １ｐｐｍ）及び８３３３Ｈｚ（１６．６７ｐｐｍ）の同一スペクトル幅で記録し た３次元（３Ｄ）ＨＮＣＡスペクトル（Ｌ．Ｋａｙら、Ｊ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏ ｎ．，８９：４９６−５１４（１９９０））及びＨＮ（ＣＯ）ＣＡ（Ａ．Ｂａｘ ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．ＮＭＲ，１：９９（１９９１）スペクトルの分析から同定し た。 データマトリックスは、ＨＮＣＡスペクトルの場合には３８（ｔ₁）×４８（ ｔ₂）×１０２４（ｔ₃）複合点であり、ＨＮ（ＣＯ）ＣＡスペクトルの場合には ３２（ｔ₁）×４０（ｔ₂）×１０２４（ｔ₃）複合点であった。両方のスペクト ルを１６スキャン／インクレメントで取得した。３次元ＣＢＣＡ（ＣＯ）ＮＨス ペクトル（Ｓ．Ｇｒｚｅｓｉｅｋら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１４： ６２６１−６２９３（１９９２））を、３２（ｔ₁，¹⁵Ｎ）×４８（ｔ₂，¹³Ｃ） ×１０２４（ｔ₃，¹Ｈ）複合点及び３２スキャン／インクレメントで集めた。ス ペクトル幅は、¹⁵Ｎ、¹³Ｃ及び¹Ｈの各ディメンジョンで１７７３Ｈｚ（３５． ０ｐｐｍ）、７５７５．８Ｈｚ（６０．２ ｐｐｍ）及び８３３３Ｈｚ（１６．６７ｐｐｍ）であった。 ３つのスペクトルすべてについて、¹Ｈキャリア周波数は水の共鳴に設定し、^{1 5} Ｎキャリア周波数は１１９．１ｐｐｍに設定した。¹³Ｃキャリア周波数は、Ｈ ＮＣＡ及びＨＮ（ＣＯ）ＣＡ実験の場合には５５．０ｐｐｍ、ＣＢＣＡ（ＣＯ） ＮＨ実験の場合には４６．０ｐｐｍに設定した。 骨格の帰属を、¹⁵Ｎ−分離３次元ＮＯＥＳＹ−ＨＳＱＣスペクトル及び３次元 ＨＮＨＡ−Ｊスペクトルで観察された交差ピークの分析により確認した。¹⁵Ｎ− 分離３次元ＮＯＥＳＹ−ＨＳＱＣスペクトル（Ｓ．Ｆｅｓｉｋら、Ｊ．Ｍａｇｎ ．Ｒｅｓｏｎ．，８７：５８８−５９３（１９８８）、Ｄ．Ｍａｒｉｏｎら、Ｊ ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ.，１１１：１５１５−１５１７（１９８９））は、 ８０ｍｓのスピンロック時間（ｍｉｘｉｎｇ ｔｉｍｅ）で集めた。１６スキャ ン／インクレメントで全部で６８（ｔ₁，¹⁵Ｎ）×９６（ｔ₂，¹Ｈ）×１０２４ （ｔ₃，¹Ｈ）複合点を集め、スペクトル幅は、¹⁵Ｎディメンジョンに対しては１ ７７３Ｈｚ（３５．０ｐｐｍ）、¹Ｈディメンジョンに対しては６６６６．６Ｈ ｚ（ｔ₂，¹Ｈ，１３．３ｐｐｍ）及び８３３３Ｈｚ（１６．７ｐｐｍ）であっ た。 ³ＪＨＮαカップリング定数を得るためにも使用された３次元ＨＮＨＡ−Ｊス ペクトル（Ｇ．Ｖｕｉｓｔｅｒら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１５：７ ７７２−７７７７（１９９３））を、３５（ｔ₁，¹⁵Ｎ）×６４（ｔ₂，¹Ｈ）× １０２４（ｔ₃，¹Ｈ）複合点及び３２スキャン／インクレメントで取得した。ス ペクトル幅及びキャリア周波数は、¹⁵Ｎ−分離ＮＯＥＳＹ−ＨＳＱＣスペクトル と同一であった。幾つかのＨ^βシグナルをＨＮＨＢ実験により帰属させた。掃引 幅は、３２（ｔ₁，¹⁵Ｎ）×９６（ｔ₂，¹Ｈ）×１０２４（ｔ₃，¹Ｈ）複合点で 取得した¹⁵Ｎ−分離ＮＯＥＳＹ−ＨＳＱＣスペクトルの場合と同一であった。 ¹Ｈ及び¹³Ｃ化学シフトを、殆どすべての側鎖共鳴に対して帰属させた。３次 元ＨＣＣＨ−ＴＯＣＳＹスペクトル（Ｌ．Ｋａｙら、Ｊ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ ．，１０１ｂ：３３３−３３７（１９９３））を、¹³Ｃ同位体スピンロックの場 合にはＤＩＰＳＩ−２シークエンス（Ｓ．Ｒｕｃｋｅｒら、Ｍｏｌ．Ｐｈｙｓ． ，６８：５０９（１９８９））を用いて１３ｍｓのスピンロック時間で取得した 。全部で９６（ｔ₁，¹³Ｃ）× ９６（ｔ₂，¹Ｈ）×１０２４（ｔ₃，¹Ｈ）複合データ点を、１０６３８Ｈｚ（７ ０．８ｐｐｍ，ｗ１）、４０００Ｈｚ（６．６７ｐｐｍ，ｗ２）及び４８４４Ｈ ｚ（８．０７ｐｐｍ，ｗ３）のスペクトル幅を用いて１６スキャン／インクレメ ントで集めた。キャリア位置は、４０ｐｐｍ、２．５ｐｐｍ、並びに¹³Ｃ、間接 的に検出される¹Ｈ及び測定される¹Ｈの各ディメンジョンに対する水の周波数で あった。 別の３次元ＨＣＣＨ−ＴＯＣＳＹ実験を、１２２．５ｐｐｍで¹³Ｃ−キャリア を用いて実施し、芳香族残基を帰属させた。スペクトルを、５２６３Ｈｚ（３５ ．０ｐｐｍ，ｗ１）、３１８０Ｈｚ（５．３０ｐｐｍ，ｗ２）及び１０，０００ Ｈｚ（１６．７ｐｐｍ，ｗ３）のスペクトル幅を用いて、３６（ｔ₁，¹³Ｃ）× ４８（ｔ₂，¹Ｈ）×１０２４（ｔ₃，¹Ｈ）複合点で得た。キャリア位置は、１２ ２．５ｐｐｍ、７．５ｐｐｍ、並びに¹³Ｃ、間接的に検出される¹Ｈ及び測定さ れる¹Ｈの各ディメンジョンに対する水周波数であった。 ¹³Ｃ−分離３次元ＮＯＥＳＹ−ＨＭＱＣスペクトル（Ｓ．Ｆｅｓｉｋら、Ｊ． Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．，８７：５８８−５９３（１９８８）、Ｄ．Ｍａｒｉｏ ｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅ ｍ．Ｓｏｃ．，１１１：１５１５−１５１７（１９８９））を、７５ｍｓのスピ ンロック時間で記録した。１６スキャン／インクレメントで全部で８０（ｔ₁，^{1 3} Ｃ）×７２（ｔ₂，¹Ｈ）×１０２４（ｔ₃，¹Ｈ）複合データ点を、１０６３８ Ｈｚ（７０．４９ｐｐｍ，ｗ１）、６６６６．６Ｈｚ（１３．３ｐｐｍ，ｗ２） 及び８３３３．３Ｈｚ（１６．６７ｐｐｍ，ｗ３）のスペクトル幅に亘って集め た。¹Ｈキャリア周波数を水の共鳴に設定し、¹³Ｃキャリア周波数を４０．０ｐ ｐｍとした。 バリン残基及びロイシン残基のメチル基の立体特異的帰属を、断片的に¹³Ｃ− 標識したタンパク質サンプルの高分解¹Ｈ，¹³Ｃ−ＨＳＱＣスペクトル（Ｇ．Ｂ ｏｄｅｎｈａｕｓｅｎら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙ．Ｌｅｔｔ．，６９：１８５− １８９（１９８０））において観察された¹³Ｃ−¹³Ｃ一重結合カップリングパタ ーンに基づく生合成法（Ｎｅｒｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２８：７５１０−７５ １６（１９８９））により得た。スペクトルを、２００（¹³Ｃ，ｔ₁）×２０４ ８（¹Ｈ，ｔ₂）複合点で５０００Ｈｚ（３９．８ｐｐｍ，¹³Ｃ）及び８３３３Ｈ ｚ（１６．６７ｐｐｍ，¹Ｈ）のスペクトル幅に亘って取得した。キャリア位置 は、¹³Ｃディメンジョンに対しては２０．０ ｐｐｍ、¹Ｈディメンジョンに対しては水の周波数であった。 ２つのリガンドとタンパク質間のＮＯＥを検出するために、３次元の¹²Ｃ−濾 過，¹³Ｃ−編集ＮＯＥＳＹスペクトルを集めた。パルススキームは、ＮＯＥＳＹ −ＨＭＱＣシークエンス（Ｓ．Ｆｅｓｉｋら、Ｊ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．，８ ７：５８８−５９３（１９８８）、Ｄ．Ｍａｒｉｏｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．，１１１：１５１５−１５１７(１９８９)）と連結した、２重¹³Ｃ−濾 過配列からなる（Ａ．Ｇｅｍｍｅｋｅｒら、Ｊ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ.，９６ ：１９９−２０４（１９９２））。スペクトルを８０ｍｓのスピンロック時間、 １インクレメント当たり１６スキャンでもって８０(ｔ₁，¹³Ｃ)×８０（ｔ₂，¹ Ｈ）×１０２４（ｔ₃，¹Ｈ）全複合点で記録した。スペクトル幅は８８６５Ｈｚ （１７．７３ｐｐｍ，ｗ１）、６６６７Ｈｚ（１３．３３ｐｐｍ，ｗ２）及び８ ３３３Ｈｚ（１６．６７ｐｐｍ，ｗ３）であり、炭素ディメンジョンに対するキ ャリア位置は４０．０ｐｐｍであり、両プロトンディメンジョンに対するキャリ ア位置は水の周波数であった。 溶媒とゆっくり交換するアミド基を同定するために、一連の¹Ｈ，¹⁵Ｎ−ＨＳ ＱＣスペクトル（Ｇ．Ｂｏｄｅｂｈａｕｓｅｎ ら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．，６８：１８５−１８９（１９８０） ）を、タンパク質をＤ₂Ｏに交換した後２５℃で２時間間隔で記録した。Ｄ₂Ｏを 添加してから２時間後から、第１のＦＳＱＣスペクトルの取得を開始した。 すべてのＮＭＲスペクトルをＢｒｕｋｅｒ ＡＭＸ５００またはＡＭＸ６００ ＮＭＲ分光光度計を用いて２５℃で記録した。ＮＭＲデータをＳｉｌｉｃｏｎ Ｇｒａｐｈｉｃｓコンピューターを用いて処理し、分析した。すべてのＮＭＲ 実験で、適宜記載（Ａ．Ｂａｘら、Ｊ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．，９９：６３８ （１９９２））されているようにパルス場勾配（ｐｕｌｓｅｄ ｆｉｅｌｄ ｇ ｒａｄｉｅｎｔ）を与え、溶媒シグナル及び人工的なスペクトル結果を抑制した 。間接的に検出されたディメンジョンの定積分検出を、Ｓｔａｔｅｓ−ＴＰＰＩ 法（Ｄ．Ｍａｒｉｏｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ.，１１１：１５１５− １５１７（１９８９））を用いて実施した。記載（Ｅ．Ｏｌｅｊｎｉｃｚａｋら 、Ｊ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．，８７：６２８−６３２（１９９０））されてい る直線予測法を使用した。 次いで、３元複合体の誘導された３次元構造を用いて、第１ 及び第２のリガンドの一方のリガンドに対する及び標的ストロメライシン分子に 対する立体配向を規定した。 ＮＯＥデータから誘導される距離抑制（ｄｉｓｔａｎｃｅｒｅｓｔｒａｉｎｓ ）を、下限を１．８Å及び上限をそれぞれ２．５Å、３．０Å、３．５Å、４． ０Å、４．５Å及び５．０Åとして、ＮＯＥ交差ピーク強度に基づいて６カテゴ リーに分類した。φねじれ角に対する抑制を、３次元ＨＮＨＡ−Ｊスペクトル（ Ｇ．Ｖｕｉｓｔｅｒら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ.，１１５：７７７２−７ ７７７（１９９３））から測定した³ＪＮＨα結合定数から誘導した。φ角度は 、³ＪＨＮＨα＞８．５Ｈｚの場合には１２０％±４０％に、³ＪＮＨα＞５Ｈｚ の場合には６０％±４０％に抑制された。 当初の構造に基づいてアミドをゆっくり交換するために同定される水素結合は 、２つの抑制、すなわちＨ−Ｏ距離の場合には１．８〜２．５Å及びＮ−Ｏ距離 の場合には１．８〜３．３Åにより規定された。構造を、Ｓｉｌｉｃｏｎ Ｇｒ ａｐｈｉｃｓコンピユーターにより、Ｘ−ＰＬＯＲ３．１プログラム(Ａ． Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ， １９９２)で、ハイブリッド距離幾何学−模擬アニーリング法（Ｍ．Ｎｉｌｇｅ ｓら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ.，２２９：３１７−３２４（１９８８））を用いて 計算した。 全体で１０３２個の推定プロトン間距離抑制をＮＯＥデータから誘導した。更 に、２１個の不明瞭な分子間距離抑制を３次元¹²Ｃ濾過，¹³Ｃ−編集ＮＯＥＳＹ スペクトルから誘導した。タンパク質を含めた１０３２個のＮＯＥ抑制のうち、 ３４１は残基間であり、４１０は主要配列中の５個未満のアミノ酸により分離さ れる残基間の逐次またはショートレンジであり、２８１は少なくとも５個のアミ ノ酸で分離される残基を含むロングレンジであった。 ＮＯＥ距離抑制に加えて、１４個のφ二面角抑制が、ＨＮＨＡ−Ｊスペクトル （Ｇ．Ｖｉｉｏｓｔｅｒら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１５：７７７２ −７７７７（１９９３））から求めた３つの結合カップリング定数（³ＪＨＮＨ α）から誘導された構造計算中に含まれた。実験的抑制は、６０個の水素結合に 相当する１２０個の距離抑制を含んでいた。水素結合に関与するアミドは、特徴 的な遅い交換速度及び水素結合の抑制なしに計算された最初のＮＭＲスペクトル からの水素結合の相手に 基づいて同定された。非冗長な実験的に誘導される抑制の総数は１１６６であっ た。 構造は、ＮＭＲ実験的抑制とうまく一致した。０．４Å以上の距離侵害も５度 以上の二面角侵害もなかった。また、ファンデルワールス反発力の偽装エネルギ ーは小さく、このことから構造は誤った原子間作用を欠いていた。 対応する理想化パラメーターらの結合−長さ及び結合−角度のずれが小さいこ とが示すように、ＮＭＲ構造は良好な共役結合幾何学的構造を示した。残基９３ 〜２４７の８つの構造の、平均座標からの平均の原子２乗平均偏差は、骨格原子 （Ｃ^a，Ｎ及びＣ’）の場合０．９３Åであり、非水素原子の場合はすべて１． ４３Åであった。 ストロメライシン、アセトヒドロキサム酸（第１リガンド）及び第２リガンド を含む３元複合体のリボンプロットを図１０に示す。構造は、他のマトリックス メタロプロテインナーゼの全ホールドと非常に類似しており、５−ストランドβ −シート及び３個のａ−ヘリックスから構成されている。 触媒亜鉛は結合ポケット中に位置していた。亜鉛は３つのヒスチジンとアセト ヒドロキサム酸の２つの酸素原子と配位して いた。第２リガンドのビアリール基は、第２ヘリックスと残基２１８〜２２３か ら形成されるループとの間のＳ１’ポケット中に位置していた。この深く且つ狭 いポケットには、リガンドとうまく作用させる疎水性残基がライニングされてい た。 上記したように調べた３元複合体の３次元構造及びストロメライシンに対する 、第２リガンドに構造的に類似している化合物（すなわち、他のビアリール化合 物）の結合について測定した構造／活性の関係に基づいて、アセトヒドロキサム 酸をビアリールに結合させる新規分子を設計した。 以下の表４に示すように、選択した当初のビアリール類は酸素リンカーを含み 、ビアリール結合に対してパラ位にＣＮを任意に存在するものであった。最初の リンカーは、長さの異なるメチレン単位を含んでいた。長さの異なるメチレン単 位を有するリンカーを用いて化合物を結合させる方法は当業界で公知である。 ＣＮ置換ビアリールがストロメライシンに対してうまく結合することから予測 されるように、ＣＮ誘導体は良好なストロメライシン抑制を示した。ストロメラ イシンを最高に抑制した化合物は、２つのメチレン単位を含むリンカーを含んで いた。 本発明を好ましい実施態様を参照しながら説明してきた。こ れらの実施態様により、請求の範囲及び明細書を限定されない。当業者ならば、 本発明の範囲及び思想を逸脱しない範囲で上記実施態様に変化、変更及び修正を 容易に加えることができる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 特定の標的分子に結合するリガンドである化合物を同定するための化合物 のスクリーニング方法であって、 ａ）¹⁵Ｎ−標識標的分子の第１の２次元¹⁵Ｎ／¹Ｈ ＮＭＲ相関スペクトルを発 生させるステップ、 ｂ）前記した標識標的分子を１つまたはそれ以上の化学化合物に作用させるステ ップ、 ｃ）ステップｂ）で１つまたはそれ以上の化合物に作用させた標識標的分子の第 ２の２次元¹⁵Ｎ／¹Ｈ ＮＭＲ相関スペクトルを発生させるステップ、及び ｄ）第１の２次元¹⁵Ｎ／¹Ｈ ＮＭＲ相関スペクトルと第２の２次元¹⁵Ｎ／¹Ｈ ＮＭＲ相関スペクトルを比較して第１と第２のスペクトルの違いを調べ、その違 いから標的分子に結合したリガンドである１つまたはそれ以上の化合物の存在を 同定するステップを含むことを特徴とする方法。 ２． ステップｂ）において¹⁵Ｎ−標識標的分子を化学化合物の混合物に作用さ せ、更にステップｄ）に続いて ｅ）¹⁵Ｎ−標識標的分子を個別に前記混合物中の各化合物に 作用させるステップ、 ｆ）個別に各化合物に作用させた標識標的分子の２次元¹⁵Ｎ／¹Ｈ ＮＭＲ相関 スペクトルを発生させるステップ、及び ｇ）ステップｆ）で発生した各スペクトルと第１スペクトルを比較して第１スペ クトルと各化合物のスペクトルの違いを調べ、その違いから標的分子に結合した リガンドである化合物の存在を同定するステップを含むことを特徴とする請求項 １に記載の方法。 ３． ２次元¹⁵Ｎ／¹Ｈ ＮＭＲ相関スペクトルの違いが標的分子中の特定の¹⁵ Ｎ−標識サイトの化学シフト及び前記¹⁵Ｎ−標識サイトに結合したプロトンの化 学シフトであることを特徴とする請求項１に記載の方法。 ４． 標的分子がポリペプチドである請求項１に記載の方法。 ５． 標的分子と前記標的分子に結合するリガンド間の解離定数を測定する方法 であって、 ａ）¹⁵Ｎ−標識標的分子の第１の２次元¹⁵Ｎ／¹Ｈ ＮＭＲ相関スペクトルを発 生させるステップ、 ｂ）前記した標識標的分子を濃度の異なるリガンドに作用させるステップ、 ｃ）ステップｂ）の各濃度のリガンドで２次元¹⁵Ｎ／¹Ｈ ＮＭＲ相関スペクト ルを発生させるステップ、 ｄ）ステップｃ）で発生させた各スペクトルをステップａ）で発生させた第１ス ペクトル及びステップｃ）で発生させた他のすべてのスペクトルと比較してスペ クトル間の違いをリガンド濃度の違いの変化の関数として定量するステップ、及 び ｅ）前記した違いから、式 ｛式中、［Ｐ］₀は標的分子の総モル濃度であり、［Ｌ］₀はリガンドの総モル濃 度であり、ｘは式 （ここで、δ_obs及びδ_freeはそれぞれリガンドの各濃度で測定した標的分子に 対する化学シフト値及びリガンド不在下での標的分子に対する化学シフト値であ り、Δは飽和量のリガンド及びδ_freeでの化学シフト間の差である）に従って決 定される結合種のモル濃度である｝ に従って標的分子とリガンド間の解離定数を算出するステップ を含むことを特徴とする方法。 ６． 標的分子がポリペプチドであることを特徴とする請求項５に記載の方法。 ７． 更にステップａ）の前に、標識標的分子を第２リガンドに結合させるステ ップを含むことを特徴とする請求項５に記載の方法。