JPH11514842A - 遺伝子治療用修飾ステロイドホルモンおよびそれらの使用法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ステロイドホルモンリセプターの変異蛋白質を提供する。これらの変異蛋白質は遺伝子薬剤として有用である。特に、これらの変異蛋白質は遺伝子治療における発現制御に有用である。さらに、本発明は、所望の変異ステロイドホルモンをコードするプラスミド、並びにそれらプラスミドをトランスフェクトされた細胞を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 遺伝子治療用修飾ステロイドホルモンおよびそれらの使用法発明の背景 本発明は、修飾されたステロイドリセプターが組織内で遺伝子発現を制御する ことによる遺伝子治療に関する。 細胞内リセプターは、ステロイドホルモン、甲状腺ホルモンおよびビタミンＡ およびＤの核効果（nuclear effects）を媒介する関連蛋白質のスーパーファミ リーである（Evans，Science 240：889-895（1988））。特定の細胞内リセプタ ーの細胞における存在は、その細胞が同起源のホルモンの標的であることを規定 する。細胞内リセプターの作用機構は、特定のリガンドに暴露されるまでそれら のリセプターが標的細胞の細胞質または核に潜伏して残ることに関連する（Beat o，Cell 56：335-344（1989）；O'Malley，et al.，Biol．Reprod．46：163-167 （1992））。ホルモンとの相互作用は、次に、最後には活性化されたリセプター と他の蛋白質または標的遺伝子の制御要素との特異的結合に通じる分子の事象で あるカスケードを誘導する。その結果の遺伝子転写制御に対する正または負の効 果は、細胞種および標的遺伝子のプロモーターコンテクストにより決定される。 ステロイドホルモンおよびステロイドリセプターの場合は、そのような複合体 が遺伝子転写の活性化または抑制を包含する複雑な細胞内事象の制御に必要であ る。例えば、卵巣ホルモンであるエストロジェンおよびプロゲステロンは、部分 的に、メスの生殖組織の分化、成長および機能に関連した複雑な細胞内事象の制 御に必要である。同様に、テストステロンはオスの生殖組織の分化、成長および 機能に関連した複雑な細胞内事象の制御に必要である。 さらに、これらのホルモンは、生殖性内分泌系の悪性疾患の発生および増殖に おいて重要な役割を果たす。生殖性ステロイドエストロジェン、テストステロン 、およびプロゲステロンは、さまざまなホルモン依存性癌、乳癌（Sunderland， et al.，J．Clin．Oncol．9：1283-1297（1991））、卵巣癌（Rao，et al.，End ocr．Rev．12：14-26（1991））、子宮癌（Driecer，et al.，Cancer Investiga tion 10：27-41（1992））、およびおそらく前立腺癌（Daneshgari，et al.，Ca nc er 71：1089-1097（1993））に関与する。さらに、閉経後の骨粗鬆症の発症はエ ストロジェンの生産の低下に関連する（Barzel，Am．J．Med．85：847-850（198 8））。 さらに、コルチコステロイドは、炎症および免疫の潜在的なよく証明されてい る媒体である。それらは、莫大な液性因子の生産および放出に対して、および免 疫および炎症応答に関連するさまざまな細胞成分の分配および増殖に対して深い 効果を及ぼす。例えば、ステロイドは、サイトカイン（ＩＬ−１，ＩＬ−２，Ｉ Ｌ−３，ＩＬ−６，ＩＬ−８，ＴＮＦ−α，ＩＦＮ−γ）、化学媒体（エイコシ ノイド、ヒスタミン）、および酵素（ＭＭＰｓ）の生産および組織への放出を阻 害し、且つマクロファージおよび内皮細胞の活性化を直接妨害する。これらの物 理的な事象の大規模な制御低下により、コルチコステロイドは、炎症応答の正味 の抑圧効果を有し、そして従って、さまざまな免疫性および炎症性疾患（リウマ チ性関節炎、乾癬、喘息、アレルギー性鼻炎等）の処置に広範囲に使用されてき た。 治療上の利益のほかには、しかしながら、ステロイド治療に関連した幾つかの 重大な副作用がある。これらは、消化性潰瘍、筋肉萎縮、高血圧、骨粗鬆症、心 臓疾患等を含む。そのような副作用は、治療剤としてのステロイドの利用性を妨 げてきた。 通常、ステロイドホルモンの生物学的活性は、ホルモンおよび組織特異的細胞 内リセプターにより直接媒介される。リガンドは血液リンパ系により体を通して 分配される。ホルモンは自由にすべての膜を越えて拡散するが、組織特異的細胞 内リセプターを含むそれら細胞においてのみ、その生物学的活性を表す。 リガンドが無い場合には、不活性なステロイドホルモンリセプター、例えばグ ルココルチコイド（”ＧＲ”）、ミネラルコルチコイド（”ＭＲ”）、アンドロ ジェン（”ＡＲ”）プロゲステロン（”ＰＲ”）およびエストロジェン（”ＥＲ ”）リセプターは、リセプターを含む大きな複合体中で差し押さえられ、熱ショ ック蛋白質（”ｈｓｐ”）９０、ｈｓｐ７０およびｈｓｐ５６および他の蛋白質 も同様である。Smith，et al.，Mol．Endo．7：4-11（1993）。生理学上不活性 な 形態のオリゴマー複合体の細胞内の極在は、細胞内か核の何れかであることが示 された。Picard，et al.，Cell Regul．１：291-299（1992）；Simmons，et al. ，J．Biol．Chem．265：20123-20130（1990）。 そのアゴニストまたはアンタゴニストリガンドへの結合に際して、リセプター はコンフォメーションを変化させて阻害性ヘテロオリゴマー複合体から解離する 。Allan，et al.，J．Biol．Chem．267：19153-19520（1992）；Allan，et al. ，P．N．A．S．89：11750-11754（1992）。ＧＲおよび他の関連系、例えばＡＲ ，ＭＲおよびＰＲの場合、ホルモンの結合は熱ショック蛋白質および他の蛋白質 の解離および複合体からのモノマーリセプターの放出を引き出す。O'Malley，et al.，Biol．Reprod．46：163-167（1992）。遺伝分析からの研究およびインビ トロプロテアーゼ消化実験から、アゴニストにより誘導されたリセプター構造の コンフォメーションの変化はアンタゴニストにより誘導された変化と同様である が異なることが示される。Allan，et al.，J．Biol．Chem．267：19153-19520（ 1992）；Allan，et al.，P．N．A．S．89：11750-11754（1992）；Vegeto，et a l.，Cell 69：703-713（1992）。しかしながら、両者のコンフォメーションの変 化はｈｓｐ結合と相容いれない。 リセプター構造のコンフォメーション変化に続き、リセプターはＤＮＡと相互 作用することができる。研究は、このリセプターのＤＮＡ結合形態がダイマーで あることを示す。ＧＲホモダイマーの場合には（Tsai，et al.，Cell 55：361-3 69（1988））、これにより、標的遺伝子プロモーターの制御領域において、特定 のＤＮＡ部位にリセプターが結合可能になる。Beato，Cell 56：335-344（1989 ）。これらの短いヌクレオチドストレッチは、パリンドローム、インバーテッド または繰り返しリピートとして並ぶ。同上。特異性は配列および繰り返された配 列の距離により決定される。Umesono，et al.，Cell 57：1139-1146。ＤＮＡへ のリセプターの結合に続き、ホルモンはリセプターが転写装置に特異的に相互作 用することを可能にする第２の機能を媒介するために必要である。そのような相 互作用は遺伝子発現の正または負の制御の何れかを提供することができ、即ち、 ステロイドリセプターはリガンド結合転写因子であり、特定の遺伝子の発現を活 性 化するばかりでなく抑制もすることができる。しかしながら、抑制はＤＮＡ結合 を必要としないことが研究により示された。 例えば、それらの細胞内リセプターに結合した場合に、コルチコステロイドは 、その産物が炎症の症状における馴化と進行に重要な役割を果たすさまざまな遺 伝子の転写に影響する。そのような遺伝子は、サイトカイン、化学物質および酵 素をコードする遺伝子を包含する。これら遺伝子の転写は、遺伝子の発現を制御 する転写因子および／または制御配列に依存して抑制または活性化されうる。現 在、転写レベルにおいてさまざまな遺伝子の発現に対するグルココルチコイドの 効果を記録する莫大な報告がある。 特に、グルココルチコイドリセプターは、遺伝子発現の正および負の両方の制 御が可能なリガンド依存性転写因子のファミリーのメンバーである（Beato，FAS EB J．５：2044-2051（1991）；Pfahl，Endocr．Rev．14：651-658（1993）；Sc hule，et al.，Trends Genet．７：377-381（1991））。その不活性化形態にお いて、ＧＲはｈｓｐ９０並びに他の蛋白質（Denis，et al.，J．Biol．Chem．26 2：11803-11806（1987）；Howard，et al.，J．Biol．Chem．263：3474-3481（1 988）；Mendel，et al.，J．Biol．Chem．261：3758-3763（1986）；Rexin，et al.，J．Biol．Chem．267：9619-9621（1992）；Sanchez，et al.，J．Biol．Ch em．260：12398-12401（1985））、およびｈｓｐ５６（Lebea，et al.，J．Biol ．Chem．267：4281-4284（1992）；Pratt，J．Steroid Biochem．Mol．Biol．46 ：269-279（1993）；Rexin，J．Biol．Chem．267：9619-9621（1992）；Sanchez ，J．Biol．Chem．265：22067-22070（1990）；Yem，J．Biol．Chem．267：2868 -2871（1992））を包含する大きなヘテロダイマー複合体の一部である。アゴニ ストの結合は、リセプターの活性化、ｈｓｐ９０および他の蛋白質からの解離を 刺激し（Denis，et al.，Nature 333：686-688（1988）；Sanchez，et al.，J． Biol．Chem．262：6986-6991（1987））、そして核の転移を刺激し、トランス活 性化およびトランス抑制の両者に必要不可欠である。 ステロイドスーパーファミリーの幾つかのメンバーのクローニングは、異種細 胞系におけるホルモン依存性転写の再構成を促進し、そしてＧＲ活性化および抑 制機構の描写を促進してきた。次に、変異体およびキメラリセプターを用いたイ ンビボおよびインビトロの研究は、ステロイドホルモンリセプターが構造上およ ひ機能上規定されたドメイン内に編成されたモジュラー蛋白質であることを証明 した。ＧＲの欠失変異体は、トランス活性化ドメインがアミノ酸２７２から４０ ０の間に位置するＮ末端アミノ酸配列に位置することを決定した。Jonat，et al .，Cell 62：1189-1204（1990）。十分に規定された６６アミノ酸ＤＮＡ結合ド メイン（”ＤＢＤ”）が、遺伝学および生化学のアプローチを用いて同定されて 詳細に研究された。Lucibello，et al.，EMBO J．9：2827-2834（1990）。該リ セプターのカルボキシル末端部分に位置するリガンドまたはホルモン結合ドメイ ン（”ＬＢＤ”）は約３００アミノ酸からなる。Kerppola，et al.，Mol．Cell Biol．13：3782-3791（1993）。ＬＢＤは詳細な部位特異的変異導入に従わなか ったが、なぜなら、このドメインは複合体３次構造に折り畳まれるらしく、結合 した際にエフェクターを取り囲む特定の疎水性ポケットを創製するからである。 この特徴は、ＬＢＤドメインの全構造に影響するアミノ酸残基をリガンドとの直 接接触に関与するアミノ酸残基から識別する場合の困難を作り出す。ＬＢＤは、 リセプターダイマー形成、核極在、ｈｓｐの相互作用およびリセプターのトラン ス活性化配列に必要な配列も含む。Fuller，et al.，FASEB J．5：3092-3099（1 991）。 遺伝子活性化の機構は、抑制の機構よりもはるかによく理解されている。トラ ンス活性化に関しては、プロゲステロン（Allan，et al.，Proc．Natl．Acad．S ci．USA 89：11750-11754（1992））およびエストロジェン（Beekman，et al.， Mol．Endocrinol．7：1266-1274（1993））リセプターの活性化に必要であると 推測されるのに匹敵するリガンドの誘導されたコンフォメーション変化が、リガ ンドの転写活性化機能の十分な活性化に必要である（Hollenberg and Evans，Ce ll 55：899-906（1988）；Webster，et al.，Cell 54：199-207，（1988））。 さらに、コンフォメーションの変化は、リセプターの転写装置の他の成分との相 互作用に必要である。トランス活性化は、グルココルチコイド応答要素（”ＧＲ Ｅ”）に結合したリセプターダイマーにより媒介される。そのようなトランス活 性化は、ホモダイマー形成により散漫に生じる。これは、Ｄ−ループとして知ら れているリセプターの第２ジンクフィンガー内の領域により主に達成される。Um esono，et al.，Cell 57：1139-1146（1989）；Dahlman-Wright，et al.，J．Bi ol．Chem．266：3107-3112（1991）。次に、その結果のホモダイマーはパリンド ロームＧＲＥに結合して転写活性化の進行を開始する。Evans，Science 240：88 9-895（1988）；Cato，et al.，J．Steroid Biochem．Mol．Biol．43：63-68（1 992）。 一方、トランス抑制は、ＡＰ−１およびＡＰ−２を包含し、転写アクチベータ ーとしてのそれらの機能の実行を妨害する他の転写因子との相互作用を通してリ セプターのモノマー形態により媒介されるらしい。Hoeck，et al.，EMBO J．13 ：4087-4095（1994）。研究は、リセプターのダイマー形態によるトランス抑制 も示す。モノマー経路の場合、研究は、リセプターとＡＰ−１との直接の蛋白質 −蛋白質相互作用により形成される変異不活性化複合体を通すかまたは第３のパ ートナーを通して、ＡＰ−１がＧＲ制御プロモーターのホルモン依存性活性化を 妨害することを示唆する。Miner，et al.，Cell Growth Differ．2：525-530（1 991）；Pfahl，Endocrine Rev．14：651-658（1993）。リセプターのモノマー形 態により仲介されるそのようなＡＰ−１およびＮＦ_K−Ｂのトランス抑制は、Ｄ ＮＡ結合ドメインの存在に依存する。それは、リセプターがＤＮＡに結合する能 力に依存しない。ダイマー形態のリセプターの場合には、そのようなＧＲ仲介ト ランス抑制の機構が他のトランス作用因子のためのシス作用要素とオーバーラッ プする配列へのＧＲの結合を含み、それによりその同族要素でそれを置換するか または同族要素への結合を阻害することを幾つかの研究が示唆する（Akerblom， et al.，Science 241：350-353（1988）；Drouin，et al.，Mol．Cell．Biol．9 ：5305-5314（1989）；Oro，et al.，Cell 55：1109-1114，（1988）；Stromste dt，et al.，Mol．Cell．Biol．11：3379-3383，（1991））。 上記のとおり、ＧＲと他のトランス作用因子との直接または間接の相互作用に 帰するＧＲ仲介トランス抑制はＤＮＡ結合活性の阻害およびまたは能力をもたら す（Celada，et al.，J．Exp．Med．177：691-698（1993）：Diamond，et al.， Science 249：1266-1272（1990）；Jonat，et al.，Cell 62：1189-1204（1990 ）；Kutoh，et al.，Mol．Cell Biol．12：4955-4969（1992）；Lucibello，et al.，Embo J．9：2827-2834（1990）；Ray，et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．U SA 91：752-756（1994）；Schule，et al.，Cell．62：1217-1226（1990）；Tve rberg，et al.，J．Biol．Chem．267：17567-17573（1992）；Yang-Yen，et al. ，Cell 62：1205-1215（1990）；Lucibello，et al.，EMBO J．2827-2834（1990 ））。これらのモデルは、リセプターの活性化、ｈｓｐ９０からの解離、および 核転移を刺激するリガンド結合を必要とする。これらの機構がトランス活性化に 必要な同じリガンド誘導コンフォメーション変化に依存するか否かは明らかでな い。しかしながら、トランス活性化欠損変異体はＡＰ−１依存性プロモーターを 抑制することから、リガンドのトランス活性化機能はＡＰ−１活性の抑制に必要 でないことが示唆される。Yang-Yen，et al.，Cell 62：1205-1215（1990）。さ らに、同様の研究から、リガンドのトランス活性化機能はＮＦ_K−Ｂ活性の抑制 に必要ないことも示唆される。 トランス抑制機構を解読する試みにおいて、テトラデカノイルホルボール酢酸 （”ＴＰＡ”）応答要素を含むＡＰ−１応答遺伝子のＧＲ仲介抑制における結合 したリガンドの役割を研究が論じた。これら遺伝子の抑制は、ＧＲとｃ−Ｊｕｎ との直接の相互作用の結果であること（Diamond，et al.，Science 249：1266-1 272（1990）；Lucibello，et al.，EMBO J．9：2827-2834（1990）；Schule，et al.，Cell 62：1217-1226（1990）；Touray，et al.，Oncogene 6：1227-1234 （1991）；Yang-Yen，et al.，Cell 62：1205-1215（1990））またはｃ−Ｆｏｓ との直接の相互作用の結果であること（Kerppola，et al.，Mol．Cell．Biol．1 3：3782-3791（1992））が提唱されたが、これらはＡＰ−１トランス活性化複合 体の成分である。ＧＲのＤＮＡ結合ドメインはこの相互作用に必要であるが、こ のドメイン内のほとんどの変異がインビボにおけるリプレッサー活性の損矢をも たらすからである（Diamond，et al.，Science 249：1266-1272（1990）；Jonat ，et al.，Cell 62：1189-1204（1990）；Lucibello，et al.，EMBO J．9：2827 -2834（1990）；Schule，et al.，Cell 62：1217-1226（1990）；Yang-Yen，et al. ，Cell 62：1205-1215（1990））。 ＤＮＡ結合ドメインは、コラゲナーゼプロモーターからのインビトロ転写の阻 害およびコラゲナーゼＴＰＡ応答要素へのＪｕｎ−Ｆｏｓヘテロダイマーの結合 の阻害に必要でもある（Mordacq，et al.，Genes Dev．3：760-769（1989））。 しかしながら、リガンド結合ドメインの欠失または削除もリプレッサー活性の損 矢をもたらす（Jonat，et al.，Cell 62：1189-1204（1990）；Schule，et al. ，Cell 62：1217-1226（1990）；Yang-Yen，et al.，Cell 62：1205-1215（1990 ））ことから、リガンド結合はＡＰ−１活性の阻害に貢献するかまたは変調する ことが示唆される。 コラゲナーゼプロモーターのＧＲ仲介トランス抑制におけるリガンドの役割を 試験するさらなる研究は、近位のジンクフィンガーの第１のシステイン残基がチ ロシンに置き換わったリガンド不含変異ＧＲによる効果的なリセプター仲介トラ ンス抑制を見いだした。Liu，et al.，Mol．Cell．Bio．15：1005-1013（1995） 。そのような研究から、リガンドの残存またはＤＮＡへのリセプターの直接の結 合のいずれも必要ないこと、即ち、ＧＲによるＡＰ−１活性の抑制はリガンド非 依存性であることが示唆される。発明の概要 出願人は、核酸配列の発現を制御する、修飾されたステロイドホルモンリセプ ターの構築が有用であると決定した。特定すれば、これらの修飾により、修飾さ れたステロイドホルモンリセプターのトランス活性化およびトランス抑制機能の 制御が可能になる。そのような修飾により、天然に生じるリガンドとは劇的に異 なる構造を有するさまざまなリガンドにリセプターが結合可能になる。これは、 非天然（non-natural）リガンド、抗−ホルモンおよび非自生（non-native）リ ガンドの結合を含む。 これらの修飾はＧＲのリガンド結合ドメイン内に生じてＧＲの天然リガンド結 合能力を排除する。これらの修飾されたステロイドリセプターは正常なトランス 活性化活性およびトランス抑制活性を示すが、しかしながら、そのような活性の 刺激は非天然且つ外因性または内因性に適用されたリセプターによる活性化を通 して生じる。修飾は、ＰＲのリガンド結合ドメイン内においても生じて、ＰＲの 天然リガンド結合能力を排除する。ＧＲ結合ドメインを、修飾されたＰＲ結合ド メインにより置換すると、非天然リガンドを通したＧＲ応答性遺伝子発現の刺激 が可能になる。 ＧＲのＤＮＡ結合ドメインへの修飾に伴うＧＲリガンド結合ドメインへの他の 修飾は、ステロイドホルモンがその天然リガンドによりトランス活性化を開始さ せる能力を排除する。代わりに、そのような修飾により、修飾されたリセプター は非天然のリガンドを結合して遺伝子発現のトランス抑制制御を刺激することが 可能になるが、トランス活性化は刺激しない。同様に、トランス制御ドメインへ の修飾に伴い同じリガンド結合ドメインの修飾を用いることにより、修飾された リセプターは非天然リガンドの結合が可能になりトランス活性化を刺激すること が可能になるが、遺伝子発現のトランス抑制は刺激しない。 他の修飾はリガンド結合ドメインを完全に除去して、構成的に活性なステロイ ドリセプターを創製する。そのような修飾により、遺伝子転写の制御に対して連 続したトランス活性化効果およびトランス抑制効果を引き起こす。さらに、トラ ンス活性化またはトランス抑制機能の何れかを選択的に排除する修飾は構成的に 活性なステロイドリセプターに取り込まれて、それにより、構成的に遺伝子発現 をトランス抑制またはトランス活性化する。さらに、他の修飾は、その天然リガ ンドを認識するかまたは修飾された場合に非天然リガンドを認識するリガンド結 合ドメインを用いるが、リガンド結合ドメインとは通常対合しないＤＮＡ結合ド メインおよびトランス制御ドメインに融合される。そのような構築物は、野生型 リセプター蛋白質中においてリガンド結合ドメインと通常は対合しない遺伝子の 発現を制御することができる。 これらの修飾リセプターは、組換え遺伝子産物の発現レベルの制御のために特 別のＤＮＡ発現ベクターをデザインすることにより、発現することができる。遺 伝子制御蛋白質のステロイドリセプターファミリーは、そのような分子の理想的 なセットである。これらの蛋白質は、そのリガンドがステロイドからレチノイド 、脂肪酸、ビタミン、チロイドホルモンおよび他の現在同定されていない小分子 に わたりうるリガンド活性化転写因子である。これらの化合物はリセプターに結合 して転写を活性化または抑制する。 これらのリセプターは、それらの構造が天然に生じるかまたは天然に生じるリ ガンドとは異なるさまざまなリガンドを結合するように修飾される。リセプター 変異体をスクリーニングすることにより、宿主細胞の内在性リセプターを活性化 しないリガンドに応答するリセプターを選択することができる。即ち、所望のト ランス遺伝子の制御は、あつらえたリセプターに結合して制御するリガンドを用 いて達成されうる。これは、修飾されたリセプターを取り込んで発現する細胞を 用いてのみ生じる。 遺伝子発現の制御を生じさせる修飾ステロイドホルモンリセプターの能力を利 用することにより、これらの遺伝子構築物は、治療用遺伝子薬剤として使用する ことができる。これらの修飾されたリセプターは、トランス活性化または抑制の いずれかにおいて遺伝子制御レベルをコントロールする必要がある場合の遺伝子 治療において有用である。ホルモンの刺激に対する不適切な再生または応答に関 連した疾患の数は、これらの構築物の医学上および生物学の重要性をきわだたせ る。 修飾されたステロイドホルモンリセプターの特性により、治療上の利益を維持 している間はステロイドの有害な作用が回避されうる。特に、ステロイドの投与 は毒性の問題を引き起こす。ステロイドの有害な作用は特定の遺伝子のインビボ におけるトランス活性化またはトランス抑制に帰しうる。これらの毒性作用はト ランス活性化およびトランス抑制の両者の結果でありうるか、または根本的にそ のうちのひとつに帰する。本発明は、ステロイド治療の置換のための遺伝子薬剤 としての主食されたＧＲ分子の使用を特徴とする。これらの合成リセプターは、 内在性リセプターの機能と同様な機能を保持しているが、別のリガンドに応答す ることにより、現在用いられているステロイド治療に帰因する毒性副作用の幾つ かを排除する。 ステロイドの毒性を回避するがそれでもなお治療作用を示すＧＲ構築物のこの 能力は、該構築物が関節炎、喘息、老人性痴呆症またはパーキンソン病を含む多 くの疾患の処置に使用されることを可能にする。さらに、該構築物はホルモンの 刺激に対する不適切な生産または応答、例えばホルモン依存性乳癌、卵巣癌、子 宮癌、前立腺癌および閉経後の骨粗鬆症が存在する場合の疾患の予防または治療 に有用でありうる。また、これらの構築物は、共トランスフェクトされる発現ベ クターと共に使用されることにより、遺伝子スイッチとして機能する。遺伝子ス イッチの詳細な説明については、米国出願番号第07/939,246号、Vegeto，et al. ，および米国特許第5,364,791号、Vegeto et al.，を参照されたく、これらの全 体は図面も含めて引用により編入される。 さらに、該構築物はヒトにおける遺伝子置換治療、およびヒトの疾患を研究す るために使用されるトランスジェニック動物モデルに有用でありうる。トランス ジェニックモデルは、同じく、化学および物理発癌物質および腫瘍プロモーター の作用を治療するための新たな治療方法の評価および探索に使用されうる。上記 構築物は、ステロイリドホルモンリセプターアンタゴニストとステロイリドホル モンアゴニストを識別するためにも使用できる。アンタゴニストまたはアゴニス ト活性のそのような認識は上記構築物で形質転換された細胞を用いて実施されう る。 第１の側面において、本発明は、修飾されたグルココルチコイドリセプター融 合蛋白質を特徴とする。該融合蛋白質リセプターは、そのリガンド結合ドメイン を、変異させたＰＲリガンド結合ドメインで置換したＧＲである。この融合蛋白 質は非天然リガンドの結合により活性化されることが可能であるが、天然または 合成のグルココルチコイドまたは他の天然または合成ステロイドによっては活性 化されない。該融合蛋白質は、ＤＮＡ結合ドメインおよびトランス制御ドメイン を含むグルココルチコイドリセプター領域を含む。トランス制御ドメインはグル ココルチコイド応答性遺伝子発現をトランス活性化するかまたはトランス抑制す ることができる。そのような変異および融合蛋白質は異なるリセプターからそし て異なる種から創製することができ、そしてそれでもなお同じ生理作用を達成す る。即ち、本発明は、本明細書に記載されているグルココルチコイドリセプター または種に限定されない。 グルココルチコイドリセプター領域に加えて、融合蛋白質は、非天然リガンド を結合することができる変異プロゲステロンリガンド結合領域も含む。変異リガ ンド結合領域は、プロゲステロンのリセプターリガンド結合ドメインの約４２か ら５４のカルボキシル末端のアミノ酸を欠くことにより変異させる。変異プロゲ ステロンリセプターリガンド結合領域は、プロゲステロンリセプターのアミノ酸 約６４０から８９１からなる。他の態様はアミノ酸６４０−９１７からなり、一 方他の態様はアミノ酸６４０−９２０からなる。当業者であれば、さまざまな変 異が所望の機能を達成するために創造されうることを認識するであろう。 本明細書にて用いられる用語「融合蛋白質」は、天然において別々に生じる２ つ以上の蛋白質またはそれらの断片からなる。組み合わせは天然に見いだされる とおりの蛋白質またはそれらの断片の全アミノ酸配列の間でありうる。グルココ ルチコイド−プロゲステロン融合蛋白質リセプターの場合には、融合蛋白質はグ ルココルチコイドリセプターとプロゲステロンリセプターの部分からなる。この 組み合わせは、各蛋白質またはそれらの断片の全アミノ酸配列を含みうる。例え ば、グルココルチコイドープロゲステロン融合蛋白質は、プロゲステロンのリガ ンド結合ドメインおよびグルココルチコイドのＤＮＡ結合ドメインおよびトラン ス制御ドメインを含んでよい。これは例示であり限定することを意味しない。 上記に加え、他の融合蛋白質を構築することができる。有用な構築物は、（１ ）内因性リガンドに結合するリガンド結合ドメイン、および（２）天然において はリガンド結合ドメインに対合しないＤＮＡ結合ドメインおよび／またはトラン ス制御ドメインを含む融合蛋白質を含む。そのような構築物は活性化または抑制 のいずれかにおいて、通常はリガンド結合ドメインにより制御されない他の遺伝 子の発現の制御を可能にする。当業者であれば、本発明の範囲内の上記融合蛋白 質の他の可能な変更物が存在することを認識するであろう。 本明細書にて用いられる用語「非天然リガンド」は、リセプターのリガンド結 合ドメインには通常結合することができる化合物を示すが、内因性リガンドでは ない。該リセプターは内在供給されないならば、リガンドに暴露されない。これ は、動物またはヒトにおいて通常は見いだされないリガンドまたは化合物である 。 非天然は、遺伝子治療が意図される場合の特定生物（ヒトまたは動物）において 天然に見いだされないリガンドも含む。これらのリガンドは修飾されたリガンド 結合ドメインへの結合によりリセプターを活性化する。活性化は、直接結合また はリセプターを伴う幾つかの形態に関連して特定のリガンド−リセプター相互作 用を通して生じうる。 本明細書にて用いられる「天然リガンド」は、リセプターのリガンド結合ドメ インに通常は結合する化合物を意味し、内因性である。この場合のリセプターは 内因性でリセプターに暴露される。天然リガンドは、ストロイド、レチノイド、 脂肪酸、ビタミン、甲状腺ホルモン、並びに上記の合成変更物を包含する。これ はほんの例示であり非限定であることを意味する。 本明細書で用いられる用語「リガンド」は、通常はリセプターのリガンド結合 ドメインと相互作用することによりリセプターを活性化するあらゆる化合物を示 す。リガンドは、修飾されたリセプターに特異的に結合することが可能な分子ま たは分子の集合体を包含する。用語「特異的な結合」は、当業界において周知の とおり、リセプターに結合した標識リガンドが非標識リガンドの付加によりリセ プターから完全に置換されうることを意味する。 非自生（non-natural）リガンドおよび非天然（non-native）リガンドの例は 以下を含む：１１β−（４−ジメチルアミノフェニル）−１７β−ヒドロキシル −１７α−プロピニル−４，９−エストラジエン−３−ワン（ＲＵ４８６または ミフェプリピーストン（Mifepripeestone））；１１β−（４−ジメチルアミノ フェニル）−１７α−ヒドロキシ−１７β−（３−ヒドロキシプロピル）１３α −メチル−４，９−ゴナジエン−３−ワン（ＺＫ９８２９９またはオナプリスト ン（Onapristone））；１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキ シ−１７α−（１−プロピニル）−４，９−エストラジエン−３−ワン（ＺＫ１ １２９９３）；１１β−（４−ジメチルアミノフェニル）−１７β−ヒドロキシ −１７α−（３−ヒドロキシ−１（Ｚ）−プロペニル−エストラ−４，９−ジエ ン−３−ワン（ＺＫ９８７３４）；（７β、１１β、１７β）−１１−（４−ジ メチルアミノフェニル）−７−メチル−４’，５’−ジヒドロスピロ［エステル −４，９−ジエン−１７，２’（３’Ｈ）−フラン］−３−ワン（Ｏｒｇ３１８ ０６）；（１１β、１４β、１７α）−４’，５’−ジヒドロ−１１−（４−ジ メチル−アミノフェニル）−［スピロエストラ−４，９−ジエン−１７，２’（ ３’Ｈ）−フラン］−３−ワン（Ｏｒｇ３１３７６）；５α−プレグナン−３， ２−ジワン。 本明細書にて用いられる用語「結合（binding）」または「結合した（bound） 」は、非天然または天然の何れかにおいて、対応するリセプターとリガンドの共 有または非共有による対合（association）、付着（attaching）、接続（connec ting）または接合（linking）を示す。リガンドとリセプターは、与えられた構 造上の部位内において相補性および特異性により相互作用する。結合は、静電結 合、疎水性結合、水素結合、核酸分子上の特定の部位を用いたインターカレーシ ョンまたは形成されるらせん構造により対合する成分を包含するが限定されない 。 用語「グルココルチコイドリセプター」は、グルココルチコイドリガンドに応 答するステロイドホルモンリセプターを示す。グルココルチコイドリセプターは 、それらの配列が互いに関連することを示唆する公知のステロイドリセプターで あるステロイドホルモンリセプタースーパーファミリーの一部である。そのよう なリセプターの代表例は、エストロジェン、プロゲステロン、ビタミンＤ、ニワ トリのオバルブミン上流のプロモータートランス因子、エクジソン、ヌル（Nurr ）−１およびオーファンリセプター、グルココルチコイド−α、グルココルチコ イド−β、ミネラルコルチコイド、アンドロジェン、甲状腺ホルモン、レチノイ ン酸（retinoic acid）、およびレチノイドＸを含む。これらのリセプターは、 ＤＮＡ結合ドメイン、リガンド結合ドメイン、並びにトランス制御ドメインから なる。 グルココルチコイドリセプターは遺伝子発現を正または負の両方に制御するこ とが可能なリガンド依存性転写因子である。リセプターとリガンドの相互作用は 、最終的には活性化されたリセプターと標的遺伝子の制御要素との特定の対合に 通じる分子事象のカスケードを含む。非活性化形態において、そのようなリセプ ターは、リセプター、熱ショック蛋白質および他の蛋白質を含む大きな複合体を 形 成する。 用語「グルココルチコイドリセプター領域」は、上記定義された完全グルココ ルチコイドリセプターの断片または一部を示す。グルココルチコイドリセプター 領域は、天然リセプター蛋白質の完全または部分活性を保持してよい。例えば、 グルココルチコイドリセプター領域はＤＮＡ結合ドメインとトランス制御ドメイ ンのみを含み、リガンド結合ドメインを含まなくても、その逆でもよい。これは 、ほんの例示であり限定を意味しない。 本明細書にて用いられる用語「リセプター結合ドメイン」または「リセプター 結合領域」は、適切なホルモンまたはリガンドを結合して最終的には活性化され たリセプターと標的遺伝子の制御要素との特定の対合に通じる分子事象のカスケ ードを誘導するステロイドホルモンリセプター蛋白質の一部を示す。これは、限 定されないが、遺伝子転写制御に対する正または負の作用を含む。リガンド結合 ドメインへのリガンドの結合はリセプター構造内のコンフォメーションの変化を 誘導する。該コンフォメーション変化は、リセプター複合体からの熱ショック蛋 白質の解離およびモノマーリセプターの放出、並びに異なる３次または３次元構 造を含む。生じるコンフォメーション変化は、リガンド結合ドメインに結合する ステロイドリセプターおよびリガンドに特異的である。 例えば、グルココルチコイドリセプターに関しては、グルココルチコイドホル モンが結合する場合に生じるコンフォメーション変化は、ホモダイマー形成、即 ち２つの同一のＧＲ分子間のダイマー形成を可能にする。しかしながら、他のス テロイドリセプターとの間のヘテロダイマー形成、即ち、例えばＧＲとＥＲの２ つの分子の間のダイマー形成が生じる可能性がある。そのようなダイマー形成に よりリセプターはＤＮＡと結合することが可能になるか、または他の転写因子を 結合することにより制御作用を誘導する。 本明細書にて用いられる用語「ＤＮＡ結合ドメイン」は、標的遺伝子の制御領 域において特定のＤＮＡ配列を結合するステロイドホルモンリセプター蛋白質の 一部を示す。このドメインは、パリンドローム、倒置または繰り返しのリピート として並んだ短いヌクレオチドストレッチを結合することができる。そのような 結合は特定のリガンドに依存して遺伝子発現を活性化し、且つそのようなリガン ド結合によりコンフォメーション変化を活性化する。抑制のためには、ＤＮＡ結 合は必要ない。 本明細書で用いられる用語「トランス制御ドメイン」は、遺伝子発現をトラン ス活性化またはトランス抑制することができるステロイドホルモンリセプター蛋 白質のそれらの部分を示す。これは、抑制または活性化の何れかに必要なリセプ ターの異なる領域、または抑制および活性化の両者に必要なリセプターの領域を 含むはずである。そのような領域は空間上異なる。上記はほんの例示であり非限 定を示す。トランス抑制のためには、一つの機構におけるこのドメインは、遺伝 子発現を妨害または抑制するための蛋白質／蛋白質相互作用を代わりに引き起こ すダイマー形成に関与する。リガンド結合ドメインへのリガンドの結合によりリ セプターが活性化される場合、そのような制御が生じる。リセプターのコンフォ メーション変化は、遺伝子発現を抑制するトランス制御ドメインの別の部分を伴 うダイマーを形成することができる。さらに、抑制はリセプターのモノマー形態 を通して生じうるが、しかしながら、ＤＮＡ結合は必要でない（以下を参照され たい）。 用語「トランス活性化」、「トランス活性」または「トランス活性化する」は 、最終的には活性化されたリセプターと標的遺伝子の制御要素との特定の対合に 通じる分子事象のカスケードを引き起こすリセプターと、ホルモンまたはリガン ドの相互作用による、遺伝子転写制御に対する正の作用を示す。トランス活性化 は、非天然並びに天然リガンドの相互作用から生じうる。ホルモンリセプターと 相互作用することにより転写応答を促進するステロイドアゴニスト化合物は、ト ランス活性化を引き起こしうる。転写に対するそのような正の作用は、標的遺伝 子のプロモーター内の特定の認識配列への活性化リセプターの結合により転写を 活性化することを含む。活性化されたリセプターはＤＮＡと特異的に相互作用す ることができる。ホルモンまたはリガンドで活性化されたリセプターは、特定の ＤＮＡ配列と、または標的遺伝子の制御領域においてホルモン応答要素と対合す る。トランス活性化は転写速度を変えるか、または特定の遺伝子の転写を誘導す る。 それは、生じる転写の速度および／または量の増加を意味する。 本明細書にて用いられる用語「トランス抑制する（transrepress）」、「トラ ンス抑制（transrepression）」または「トランス抑制する（transrepressing） 」は、活性化されたリセプターと他の転写因子例えばＮＦ_K−ＢまたはＡＰ−１ との特定の対合に最終的には通じる分子事象のカスケードを誘導するリセプター と、ホルモンまたはリガンドとの相互作用による、遺伝子転写制御に対する負の 作用を示す。トランス抑制は非天然並びに天然リガンドの相互作用から生じうる 。ステロイドホルモンリセプターと相互作用するアンタゴニストおよびアゴニス ト化合物は、トランス抑制を引き起こしうる。リガンドがリセプターに結合した ならば、コンフォメーションの変化が生じる。トランス抑制は２つの異なる機構 、即ちリセプターのダイマーおよびモノマー形態を通して生じうる。トランス抑 制のためのリセプターのモノマー形態の使用は、ＤＮＡ結合ドメインの存在に依 存するが、ＤＮＡを結合するリセプターの能力には依存しない。トランス抑制の ためのリセプターのダイマー形態の使用は、シス要素とオーバーラップするリセ プター結合応答要素に依存する。トランス抑制は転写速度を変えるか、または特 定の遺伝子の転写を阻害する。特定の抑制は生じる転写の速度および／または量 を低下させる。 本明細書にて用いられる用語「プロゲステロンリセプター」は、ホルモンプロ ゲステロンに応答するかまたはホルモンプロゲステロンにより活性化されるステ ロイドホルモンリセプターも示す。プロゲステロンは、上記定義されるとおり、 ステロイドホルモンリセプタースーパーファミリーの一部である。プロゲステロ ンリセプターは、同じ遺伝子に由来する２つの異なるが関連する形態として存在 しうる。該生成物の生成方法は、転写の開始、スプライシングの変更または転写 停止を変更しうる。これらのリセプターは、ＤＮＡ結合、リガンド結合並びにト ランス制御ドメインからなる。プロゲステロンリセプターは遺伝子発現を制御す ることができる、リガンド依存性転写因子でもある。プロゲステロンリセプター とリガンドの相互作用は、最終的に標的遺伝子の制御要素と活性化されたリガン ドの特定の対合に通じる分子事象のカスケードを誘導する。 用語「修飾された」、「修飾」、「変異」または「変異した」は、その天然に 生じる野生型形態からのリセプターの変更を示す。これは、野生型または天然に 生じる配列とは異なるような、リセプターの一次配列の変更を含む。本発明にお いて用いられる変異ステロイドホルモンリセプターは、ステロイドホルモンリセ プタースーパーファミリーのあらゆるメンバーの変異でありうる。例えば、ステ ロイドホルモンは、該蛋白質のカルボキシル末端上のアミノ酸の欠失により変異 されうる。通常、該蛋白質のカルボキシル末端から約１から約１２０のアミノ酸 の欠失は、本発明において有用な変異ステロイドホルモンリセプターを提供する 。当業者は、しかしながら、カルボキシル末端アミノ酸の短い欠失が特定のステ ロイドホルモンリセプター蛋白質の有用な変異体を創製するのに必要であろうこ とを認識するであろう。多の変異または欠失が、興味のあるステロイドリセプタ ーの多のドメイン、例えばＤＮＡ結合ドメインまたはトランス制御ドメイン内に 作成されうる。 例えば、プロゲステロンリセプター蛋白質の変異体は、カルボキシル末端アミ ノ酸約１から６０のアミノ酸の欠失を含む。本発明の好ましい態様において、４ ２のカルボキシル末端アミノ酸をプロゲステロンリセプター蛋白質から欠失させ る。同様に、ＤＮＡ結合ドメインまたはトランス制御ドメイン内のひとつまたは それ以上のアミノ酸の変異は遺伝子発現の制御を変更することができる。 当業者は、変異および／または欠失の組み合わせが所望の応答を得るために可 能であることを認識するであろう。これは、同じかまたは異なるドメインに対す る二重の点変異を含むであろう。さらに、変異は全体的に遺伝子産物を不活性化 する遺伝子座への遺伝損傷である「ヌル変異」も含む。 一つの例は、ＧＲ内に変異を取り込むことにより所望の作用を生成するＧＲ構 築物の生成である。これは、限定されないが、ラットのＧＲのアミノ酸４２１か ら４８１に対する変異により、ＧＲＥ依存性プロモーター構築物の発現を活性化 する能力を保持したままで、ＡＰ−１およびＮＦ_K−Ｂに依存するプロモーター 構築物をトランス抑制するＧＲの能力を排除することを含む。トランス活性化を 生じるが活性を抑制しないそのような変異は、１）４２５位のセリンをグリシン に代えること、４３６位のロイシンをバリンに代えること、および４７８および ４７９位のチロシンとアスパラギンをそれぞれロイシンとグリシンに代えること を含む。これは、ほんの例示であり限定ではない。当業者は、多の変異を創製す ることにより所望の効果を提供することに気づくであろう。そのような変異はヒ トＧＲ構築物において使用することができる。 変異は、ＧＲのダイマー形成と相互作用するＧＲのＤＮＡ結合ドメインのＤル ープ内に生じさせることもできる。これらの変異は、トランス活性化してなお効 率よくトランス抑制も促進するＧＲの能力を排除する。ラットのＧＲの場合、そ のような変異は野生型ラットＧＲより良好にさえトランス抑制する。トランス抑 制活性を引き出すがトランス活性化活性は引き出さないそのような変異は、４５ ８位におけるアラニンのスレオニンへの変化、４５４位および４５８位における アスパラギンおよびアラニンのそれぞれアスパラギン酸およびスレオニンへの変 化、および４６０位および４６２位におけるアルギニンおよびアスパラギン酸の それぞれアスパラギン酸およびシステインへの変化を含む。上記の変異領域は、 日常の方法論、例えば、天然リガンド活性は伴わずに非天然リガンド活性は伴う リガンド結合ドメインを得るための欠失または変異分析またはそれらの均等物に より、ヒトにおいてさらにより正確に定義されうる。上記はほんの例示であり、 非限定を意味する。 用語変異はあらゆる他の誘導体を含む。本明細書にて用いられる用語「誘導体 」は、同様の構造の他のペプチドまたは化合物から生成されたかまたは修飾され たペプチドまたは化合物を示す。これは、一またはそれ以上の工程により生成さ れうる。本明細書にて用いられる用語「修飾された」または「修飾」は、化合物 または分子の組成または構造の変化を示す。しかしながら、誘導され修飾された 化合物または分子の活性は、親化合物または分子の活性に比して、保持されるか 、高められるか、または増加される。これは、ペプチドの配列中の一つのアミノ 酸の変化またはひとつまたはそれ以上の非天然に生じるアミノ酸または他の化合 物の取り込みを含むはずである。これは、化学物質本体内の変化、水素の配置に おける変化、またはあらゆる種類の化学変更を含む。さらに、本明細書において 用 いられる「類似体」は他の構造がにている化合物を示す。類似体は必然的にアイ ソマーではない。上記は例示であり限定ではない。 本明細書において用いられる用語「核酸配列」、「遺伝子」、「核酸」または 「核酸カセット」は、一時的、永久にまたはエピソームにより細胞内に取り込ま れた後に蛋白質またはペプチドまたはＲＮＡを発現することができる興味のある 遺伝物質を示す。核酸は、核酸が転写されて、必要であれば細胞内で蛋白質に翻 訳されるように、他の必要な要素とともにベクター内に位置上連続して並べるこ とができる。 本明細書において用いられる用語「遺伝物質」は、ＤＮＡまたはＲＮＡの連続 する断片を示す。標的細胞に導入される遺伝物質はあらゆるＤＮＡまたはＲＮＡ でありうる。例えば、核酸は、（１）標的細胞中に通常見いだされ、（２）標的 される中には通常見いだされるが、標的細胞中で生理学上適切なレベルでは発現 されず、（３）標的細胞中で通常見いだされるが、特定の病理条件において最適 なレベルでは発現されず、（４）標的細胞中で通常見いだされず、（５）標的細 胞中で通常発現されるかまたは発現されない遺伝子の新規な断片、（６）標的細 胞中で発現されるかまたは発現されない遺伝子の合成修飾物、（７）標的細胞中 での発現のために修飾されてよいあらゆる他のＤＮＡおよび（８）上記のあらゆ る組み合わせでありうる。 本明細書にて用いられる用語「遺伝子発現」または「核酸発現」は、転写およ び翻訳過程からの遺伝物質の遺伝子産物を示す。発現は、遺伝子から転写される ｍＲＮＡ分子から翻訳されたポリペプチド鎖を示す。ＲＮＡ転写物が翻訳されな ければ、例えば、ｒＲＮＡ，ｔＲＮＡ，ＲＮＡ分子が遺伝子産物に相当する。 グルココルチコイド−プロゲステロン融合蛋白質リセプターの発現は、細胞表 面蛋白質、細胞質蛋白質または核蛋白質として発現されうる。「細胞表面蛋白質 」は、発現される場合に、蛋白質が全部または一部細胞膜を貫通することを意味 し、細胞表面上にも露出される。細胞質蛋白質は、細胞質内に完全に含まれる蛋 白質を意味し、そして核または細胞表面を貫通しない。「核蛋白質」に関しては 、発現された場合に核膜を全部または一部貫通する蛋白質を意味し、細胞質に露 出す るか、または細胞核内に完全に含まれて核膜には付着せず細胞質の露出しなくて よい。 本発明の第２の側面は、修飾されたグルココルチコイドリセプター蛋白質を特 徴とする。修飾されたグルココルチコイドリセプター蛋白質は、ＤＮＡ結合ドメ イン、トランス制御ドメインおよび変異リガンド結合ドメインを含む。修飾され た蛋白質は、変異リガンド結合ドメインにより非天然リガンドを結合することが できる。変異リガンドドメインは、リガンド結合ドメインから約２−５のカルボ キシル末端アミノ酸を欠失させることにより創製される。好ましい態様において 、修飾されたグルココルチコイドリセプター態様は、リガンド結合ドメインの７ ６２および７６３のアミノ酸を欠失させて、７５２および７５３のアミノ酸を置 換または変更することにより変異されうる。置換されたアミノ酸７５２および７ ５３は両方アラニンに変更することができる。 本発明の第３の側面は、修飾されたグルココルチコイドリセプター蛋白質を特 徴とする。この蛋白質は、構成的に遺伝子発現をトランス活性化またはトランス 抑制することが可能である。リセプター蛋白質は、リガンド結合ドメインを除去 することにより変異される。本明細書にて用いられるとおり、用語「構成的」は 、リガンドの必要無しに連続して遺伝子発現を活性化または抑制する能力を示す 。 本発明の第４の側面は、修飾されたグルココルチコイドリセプター蛋白質を特 徴とする。この蛋白質は、非天然リガンドを結合することができる。修飾された リセプターは、ＤＮＡ結合ドメイン、変異トランス制御ドメインおよび変異リガ ンド結合ドメインを含むグルココルチコイドリセプター領域を含む。変異トラン ス制御ドメインは遺伝子発現をトランス活性化することができるが遺伝子発現を トランス抑制することはできない。 例えば、変異リガンド結合ドメインは上記のとおりに変異される。ラットＧＲ の変異トランス制御ドメインは、４２５位のセリンをグリシンに代え、４３６位 のロイシンをバリンに代え、そして４７８および４７９位のチロシンおよびアス パラギンをロイシンおよびグリシンに代えることにより変異される。そのような 変異はヒトＧＲにおいて用いることができる。 本発明の第５の側面は、非天然リガンドに結合することが可能な、修飾された グルココルチコイドリセプター蛋白質を特徴とする。この修飾されたリセプター は、変異ＤＮＡ結合ドメイン、トランス制御ドメインおよび変異リガンド結合ド メインを含む。この変異ＤＮＡ結合ドメインはトランス活性化を妨害するが、Ｄ ＮＡ結合がそのような活性化に必要だからである。トランス制御ドメインは遺伝 子発現をトランス活性化することが可能であるが、遺伝子抑制をトランス活性化 することはできない。そのような活性は、変異結合リガンドの非自生（non-natu ral）リガンドとの結合に際して生じる。 例えば、変異リガンド結合ドメインは上記のとおりに変異される。ラットのＧ Ｒ変異ＤＮＡ結合ドメインは、４５８位のアラニンをスレオニンに代え、４５４ および４５８位のアスパラギンおよびアラニンをアスパラギン酸およびスレオニ ンにそれぞれ代え、４６０および５６２位のアルギニンおよびアスパラギン酸を アスパラギン酸およびシステインに代えることにより、変異される。そのような 変異はヒトＧＲにおいて使用可能である。 本発明の第６の側面は、融合蛋白質リセプターを含む上記修飾グルココルチコ イドリセプターの一つをコードする核酸配列を特徴とする。核酸は、一時的に、 永久にまたはエピソームにより細胞中に取り込まれた後に、蛋白質、またはペプ チドまたはＲＮＡを発現することが可能な遺伝物質である。 本発明の第７の側面は、上記修飾グルココルチコイドリセプターの核酸配列を 含むベクターを特徴とする。ベクターは、一時的に、永久にまたはエピソームに より細胞中または組織中において該核酸を発現することができる。一つの例にお いて、ベクターは構成的に活性なＧＲのためのｐＧＲ０４０３Ｒおよび変異ラッ トＧＲのためのｐＧＲ０３８５と呼ばれるプラスミドである。 本明細書にて用いられる用語「ベクター」は、標的細胞を直接形質転換するた めにデザインされた遺伝物質からなる構築物を示す。ベクターは、核酸カセット 中の核酸が転写されて必要であればトランスフェクト細胞中で翻訳されるように 、他の必要な要素と位置上連続して配置された複数の遺伝要素を含む。本明細書 で用いられる用語ベクターは、核酸、例えばプラスミド、コスミッド、ファージ ミッ ドまたはバクテリオファージ由来のＤＮＡを示し、核酸のひとつまたはそれ以上 の断片が挿入されるかまたはクローン化されて特定の蛋白質をコードしてよい。 本明細書で用いられる用語「プラスミド」は、染色体外遺伝物質、通常は染色体 ＤＮＡとは別個に複製可能な環状二本鎖ＤＮＡからなる構築物を示す。 ベクターは、ひとつまたはそれ以上の唯一の制限部位を含むことができ、そし てクローン化配列が再生されるように、規定された宿主または生物中で自己複製 することができてよい。ベクター分子は、選択可能なように検出されるかまたは 容易に検出される宿主生物上に幾つかのよく定義された表現型を授けることがで きる。ベクターは、直鎖状または環状の配列を有してよい。ベクターの成分は、 限定されないが、（１）ＤＮＡ；（２）治療用または所望の産物をコードする配 列；および（３）転写、翻訳、ＲＮＡプロセッシング、ＲＮＡ安定化および複製 のための制御要素を含むＤＮＡ分子である。 ベクターの目的は、細胞または組織中で核酸配列の発現を提供することである 。発現は、挿入された遺伝子または核酸配列の効率よい転写を含む。発現産物は 、蛋白質、ポリペプチドまたはＲＮＡであってよい。核酸配列は、核酸カセット 中に含むことができる。核酸の発現は、連続的、構成的または制御されることが できる。ベクターは、バクテリア中でのプラスミドの複製のためおよびバクテリ ア中でのプラスミドの保持のための選択のための原核生物要素として使用するこ ともできる。 本発明において、好ましいベクターは、適切な間隔で以下の要素を連続して結 合することにより機能的な発現を可能にする：プロモーター、５’ｍＲＮＡリー ダー配列、翻訳開始部位、発現されるべき配列を含む核酸カセット、３’ｍＲＮ Ａ非翻訳領域、およびポリアデニル化シグナル配列。本明細書にて用いられる用 語「発現ベクター」は、異種細胞中で組換え蛋白質を生成するのに必要なすべて の情報を含むＤＮＡベクターを示す。 さらに、本明細書にて用いられる用語「ベクター」は、ウイルスベクターも含 む。この意味における「ウイルスベクター」は、ベクター内のウイルスゲノムの 一部を含む事によりウイルス粒子中に物理的に取り込まれるもの、例えばパッケ ージングシグナルであり、単なるＤＮＡでも、あるいはウイルス核酸の一部から 取られた配置遺伝子（located gene）でもない。即ち、ウイルスゲノムの一部は 本発明のベクター中に存在することができるが、その部分はウイルス粒子へのベ クターの取り込みを引き起こさず、即ち、感染性ウイルス粒子を生成することは できない。 本明細書にて用いられる用語「ベクター」は、ＤＮＡの染色体外（エピソーム による）複製が可能なＤＮＡ配列要素も含みうる。エピソームによる複製が可能 なベクターは、染色体外分子として維持されて、複製することができる。これら のベクターは、単純な分解により除去されないが連続して複製される。これらの 要素は、ウイルスゲノムまたは哺乳類のゲノムに由来してよい。これらは、以下 に記載のとおり、延期されたかまたは「永続的な」発現を提供する。 本明細書にて用いられる用語「永続的な発現」は、エピソームによる（即ち、 染色体外）複製を可能にする遺伝要素と共に細胞中に遺伝子を導入することを意 味する。これは、宿主細胞の染色体への新規遺伝物質の組み込み無しに明らかに 安定な細胞形質転換に通じうる。 本明細書にて用いられる用語「安定な発現」は、標的細胞の染色体への遺伝物 質の組み込みに関し、該細胞中で遺伝物質の永久成分になる。安定な組み込みの 後の遺伝子発現は、細胞の特徴および安定な形質転換に通じる複製により生じる その子孫を永久に変更することができる。 本発明の第８の側面は、上記の修飾されたグルココルチコイドリセプターに関 する核酸配列を含むベクターを含有するトランスフェクト細胞を特徴とする。本 明細書にて用いられる用語「トランスフェクトされた」または「トランスフェク ション」は、任意の細胞を外来ＤＮＡに暴露することによる、外来ＤＮＡの任意 の細胞への取り込みを意味する。これは、さまざまな送達方法による、例えばベ クターまたはプラスミドを通した、ＤＮＡの導入を含む。 トランスフェクションの方法は、マイクロインジェクション、ＣａＰＯ₄沈殿 、リポソーム融合（例えば、リポフェクション）、エレクトロポレーションまた は遺伝子銃の使用を含んでよい。それらは、単なる例示であり限定することを意 味 しない。本明細書にて用いられる用語「トランスフェクション」は、細胞へのＤ ＮＡの導入方法（例えば、ＤＮＡ発現ベクター）を示す。細胞への侵入に続き、 トランスフェクトされたＤＮＡは：（１）宿主ゲノムと組換え；（２）エピソー ムとして個別に複製し；（３）除去前の複製無しにエピソームとして保持されて よい。細胞は、自然にＤＮＡを取り込むことができてよい。自然にＤＮＡを取り 込むことができない特定の細胞はさまざまな処置を必要とするが、上記のとおり 、細胞膜を越えたＤＮＡの運搬を誘導するためである。 本発明の第９の側面は、上記のとおり、修飾されたグルココルチコイドリセプ ターの核酸配列を含むベクターで形質転換された細胞を特徴とする。本明細書に て用いられる用語「形質転換された」または「形質転換」は、遺伝子運搬機構に よる細胞の特徴（発現された表現型）における一時的か、安定な、または永久の 変化を示す。遺伝物質は、特定の遺伝子産物を発現するかまたは内在遺伝子産物 の発現または作用を変更する形態において、細胞中に導入される。 本明細書にて用いられる用語「安定」は、組み込まれて標的細胞中において遺 伝物質の永久成分となる場合の標的細胞染色体への遺伝子導入を示す。安定な形 質転換の後の遺伝子発現は、安定な形質転換に通じる細胞の特徴を永久に変化さ せることができる。エピソームによる形質転換は、導入された遺伝子が宿主細胞 に取り込まれないが染色体外要素として複製される場合の、安定な形質転換の変 更物である。これは、細胞の特徴の明らかに安定な形質転換に通じうる。本明細 書にて用いられる「一時的」は、遺伝子を細胞に導入することにより、核酸を発 現させることを示し、例えば、細胞は特定の蛋白質、ペプチドまたはＲＮＡ等を 発現する。導入された遺伝子は宿主細胞ゲノムに組み込まれず、したがって一定 の期間後に細胞から排除される。一時的発現は、一時的なトランスフェクション の期間の間の遺伝子産物の発現に関する。一時的発現は、限定された寿命期間を 有するトランスフェクト細胞も示す。 形質転換は、選択可能なマーカーを含むベクターで細胞を共トランスフェクト する場合の、以下に記載のインビボ技術またはエクスビボ技術により実施するこ とができる。この選択可能なマーカーを用いることにより、形質転換されること になるそれら細胞を選択する。当業者には、形質転換の研究に用いられる選択可 能なマーカーの種類はよく知られている。形質転換は、組織または細胞の選択に おいて優勢に核酸の発現を制御するために、組織特異的でありうる。 細胞の形質転換は、蛋白質およびＲＮＡを含むさまざまな遺伝子産物の生成に 関連してよい。これらの産物は、細胞内または細胞外構造要素、リガンド、ホル モン、神経伝達物質、成長制御因子、酵素、血清蛋白質、リセプター、小分子量 化合物のキャリアー、薬剤、免疫変調剤、オンコジーン、腫瘍サプレッサー、毒 素、腫瘍抗原、抗原、アンチセンス阻害剤、三重鎖形成阻害剤、リボザイムとし て、またはそれらの活性を変調するための細胞構造上のリガンド認識特異的構造 決定基として機能してよい。他の例は、核酸カセットの議論における前の記載に 見いだされうる。形質転換細胞により発現された産物は、核酸カセットの核酸に 依存する。このリストは単なる例示であり限定を意味しない。本発明において、 発現される核酸は、上記のとおり融合蛋白質であるか、またはその変更物である か、または本明細書にて開示された他のあらゆるリセプター蛋白質である。 一つの態様において、形質転換細胞は筋肉細胞である。用語「筋肉」は、筋原 細胞、骨格筋、心筋、および平滑筋細胞を含む筋原細胞を示す。筋肉細胞または 組織は、インビボ、インビトロまたは組織培養中において筋肉組織に分化するこ とができる。他の態様において、形質転換細胞は肺細胞である。本明細書にて用 いられる用語「肺細胞」は、肺システムに関連した細胞を示す。肺細胞は、イン ビボ、インビトロまたは組織培養でもありうる。 さらに他の態様において、形質転換細胞は関節に関連した細胞である。用語「 関節に関連した細胞」は、関節を含む細胞および非細胞物質のすべてであり（た とえば、膝または肘）、関節の正常な機能に関与するか、または病理条件によっ ては関節内に存在する。これらは、関節カプセル例えば滑膜、滑液、滑膜細胞（ タイプＡ細胞およびタイプＢの滑膜細胞を含む）；関節の軟骨成分例えば軟骨細 胞、軟骨の細胞外マトリックス；骨構造例えば骨、骨の骨膜、骨膜細胞、骨芽細 胞、破骨細胞；免疫成分例えば炎症性細胞、リンパ球、肥満細胞、単球、好酸球 ；他の細胞様繊維芽細胞；および上記の組み合わせに関連した物質を含む。形質 転換 すれば、これらの細胞は融合蛋白質を発現する。当業者は、あらゆる細胞が形質 転換を受けることが可能であり、且つ本発明の範囲内にあることを即座に悟るで あろう。 本発明の第１０の側面は、修飾されたグルココルチコイドリセプターをコード する核酸配列を含むベクターで細胞を形質転換するための方法を特徴とする。こ の方法は、細胞を形質転換するのに十分な量の時間細胞をベクターに接触させる ことにより、インサイチュにて細胞を形質転換する工程を含む。上記のとおり、 形質転換はインビボまたはエクスビボでありうる。形質転換されれば、細胞は変 異グルココルチコイドリセプターを発現する。この方法は、ベクターを導入する 方法およびベクターを取り込ませる方法を包含する。本明細書にて用いられる「 取り込ませる」および「導入する」は、上記の形質転換に関して論じられたとお り、ベクターが細胞内において治療用遺伝子産物を発現できるように、細胞にベ クターを取り込むかまたは運搬することを示す。 本発明の第１１の側面は、上記修飾グルココルチコイドリセプターを用いる方 法を特徴とする。この方法は、目的の修飾グルココルチコイドリセプターをコー ドする核酸配列を含むベクターで細胞を形質転換する工程を含む。形質転換され た細胞は、変位グルココルチコイドリセプターを発現することができる。リセプ ターは、非天然リガンドによりグルココルチコイド応答遺伝子を制御することが でき、そのような制御はトランス活性化かトランス抑制である。本明細書にて用 いられる用語「グルココルチコイド応答遺伝子」は、グルココルチコイドリセプ ターの活性化によりその発現が制御される遺伝子を示す。そのような制御は、遺 伝子発現の正および負両方の制御を含む。これは、ＧＲＥ（グルココルチコイド 応答要素）制御された遺伝子も含む。 この使用方法は、融合蛋白質を用いた遺伝子置換法、融合蛋白質を用いた遺伝 子治療法、および同じ工程が用いられる融合蛋白質の投与法を包含する。本明細 書にて用いられる用語「遺伝子置換」は、インビボにおいて動物にて発現される ことが可能な核酸配列を供給することであって、それにより、該動物において失 ったかまたは欠損している内在性遺伝子の機能を提供または増大させる。 該使用方法は、ＧＲＥ制御された遺伝子を活性化するために修飾グルココルチ コイドリセプターを用いる方法も含む。そのような遺伝子は、修飾グルココルチ コイドリセプターと共にトランスフェクトされうる。そのような共トランスフェ クションは、ＧＲＥ制御された遺伝子の活性化された発現を可能にする。さらに 、該使用方法は、組織特異的送達系の使用およびｍＲＮＡ安定化構築物の使用を 含む。 本発明は、上記投与法を特徴とする。そのような方法は、ポリペプチド、蛋白 質またはＲＮＡの供給物をヒト、動物または組織培養または細胞に投与するため の方法を含む。上記ベクターのこれらの使用方法は、効果的な量のベクターをヒ ト、動物または組織培養に投与する工程を含む。本明細書にて用いられる用語「 投与する」または「投与」は、ベクターまたはキャリアーＤＮＡの体内への導入 ルートを示す。上記方法および下記方法のベクターは、さまざまな方法により投 与されてよい。投与は、静脈内、組織内注射、局所、経口または遺伝子銃または ハイポスプレー（hypospray）装置によってよい。投与は、標的組織に直接であ ることができ、例えば、滑膜または細胞への直接の注射またはシステム送達であ りうる。これらは単なる例示であり非限定である。 投与は、さまざまな方法、例えばリポソーム、プロテオリポソーム、リン酸カ ルシウム共沈殿されたＤＮＡ、マクロ分子複合体とカップルさせたＤＮＡ、ＤＮ Ａ運搬体、ミクロ弾丸（micro-projectile）にコートしたＤＮＡ、コートされた プラスミド、直接のミクロ注射並びに組織移植による筋肉組織への直接の遺伝子 運搬を含む。ベクターの直接の遺伝子運搬は、マイクロインジェクション、エレ クトロポレーション、リポソーム、プロテオリポソーム、リン酸カルシウム共沈 殿、組織移植、レトロウイルスベクター、マクロ分子複合体にカップルさせたＤ ＮＡ、ＤＮＡ運搬体、遺伝子銃およびミクロ弾丸による投与でありうる。例えば 、引用により編入される国際公開番号９３／１８７５９号を参照されたい。好ま しい態様は直接注射による。投与のルートは、筋肉内、エアロゾル、経口、局所 、全身、接眼レンズ、腹腔内、くも膜下および／または流体スペースを含む。 本明細書にて用いられる用語「効果的な量」は、十分なレベルのポリペプチド 、 蛋白質またはＲＮＡを生じるようにヒト、動物または組織培養細胞へ投与される 十分なベクターを示す。当業者は、十分なレベルの蛋白質、ポリペプチドまたは ＲＮＡが特定のベクターの意図される使用に依存することを認識する。これらの レベルは、投与、処置または予防接種並びに意図される用途に依存して異なるで あろう。 本発明の好ましい態様において、上記変異グルココルチコイドリセプターを用 いる方法は、非天然リガンドとしてＲＵ４８６を用いることにより遺伝子発現を 制御する。このリガンドは、変異されたプロゲステロンまたはグルココルチコイ ドリガンド結合ドメインを結合してリセプターのトランス制御ドメインを活性化 することができる。ＲＵ４８６は、適当なグルココルチコイド応答遺伝子を活性 化または抑制することができる。これは単なる例示であって限定することを意味 しない。当業者は、他の非天然リガンドが使用可能であることを認識するであろ う。 該使用方法は、グルココルチコイド応答遺伝子またはＧＲＥ制御された遺伝子 または遺伝子構築物のトランス活性化を制御することができる。さらに、該使用 方法は、グルココルチコイド応答遺伝子例えばメタロプロティナーゼ、インター ロイキン、シクロオキシゲナーゼおよびサイトカインのトランス抑制を制御する ことができる。そのような遺伝子は他の刺激に応答するが、これらの遺伝子はス テロイドにより抑制される。典型的には、第一の刺激薬無しに、ステロイドはそ のような遺伝子の基礎転写に対してほとんど効果を有さない。ＩＬ−２，ＩＬ− ６，ＩＬ−８，ＩＣＡＭ−１，ＶＣＡＭ−１等の遺伝子はステロイドにより抑制 されてきた。ＡＰ−１またはＮＦ_K−Ｂに依存するあらゆる遺伝子転写が、本発 明により抑制される。 本発明の第１２の側面は、関節炎の治療法を特徴とする。この方法は、関節に 関連した細胞を上記ベクターにより形質転換することを含む。ベクターは、修飾 されたグルココルチコイドリセプター蛋白質をコードする核酸を含む。関節に関 連した細胞中で発現されたなら、変異蛋白質は、非天然リガンドによりグルココ ルチコイド応答遺伝子またはトランスフェクトされたＧＲＥ制御遺伝子構築物を 含むＧＲＥ制御遺伝子をトランス活性化またはトランス抑制することができる。 関節に関して、本発明の方法により治療されうる疾患は、関節炎として当業者 には知られている疾患を含む。これは、炎症の進行によりもたらされる病理生理 学的症状；関節の細胞要素の肥大または不適切な増殖；関節への損傷；外科手術 またはけがの後の関節を含む必須構造の修復、再生および回収の増強；およびそ の他の後天的な関節の疾患を含む。例えば、病理生理学症状の治療においては、 製剤を含むかまたは含まない薬学上の用量のベクターを関節に注射することによ り関節構造を含む細胞に、製剤を含むかまたは含まないベクターを導入する。該 ベクター中の核酸カセットは、蛋白質、ポリペプチドまたはＲＮＡをコードする 。ベクターは、関節内の適当な細胞から取られて、蛋白質、ポリペプチドまたは ＲＮＡを発現する。本発明の好ましい態様は、関節内の一時的または永久の発現 を包含する。これは、発現を安定化させるのに好ましいが、疾患の進行に応答し て発現レベルを調節できるからである。 関節内の細胞にベクターを投与する事により治療されうる特定の疾患は、さま ざまな関節炎、虚血性壊死、または関節を含む構造の修復および再生を必要とす るけがを含む。治療されうるさまざまな種類の関節炎は限定されないが、腱炎； 滑液包炎；結合組織炎；骨の外傷；軟組織の炎症；分解性関節炎；外傷性疾患； 神経障害性関節症；代謝疾患；滑膜腫瘍；色素性絨毛結節性滑膜炎；出血性疾患 ；敗血性疾患；結晶誘導疾患（通風）；免疫複合疾患および脈管炎；全身性エリ テマトーデス；ライター症候群；乾癬；強直性脊椎炎；強皮症；および腸疾患の 炎症を含む。本発明の特定の態様において、抗炎症サイトカインは、ＩＬ−４， ＩＬ−１０またはＴＧＦ−βを含めて発現させることができる。 流体スペースに関連した細胞は、製剤化ＤＮＡ発現ベクターを細胞に取り込む 。「取り込む」は、製剤化ＤＮＡ発現ベクターが細胞内で治療用遺伝子産物、即 ち変異リセプターを発現するように、製剤化ＤＮＡ発現ベクターを細胞に取り込 むかまたは運搬することを示す。重要なのは、取り込みは、必須ではないがＤＮ Ａ発現ベクターの組み込みまたはＤＮＡ発現ベクターのエピソーム複製を含んで よい。この意味における取り込みは、分解または他の区画への転移により排除さ れ る前に細胞においてＤＮＡ発現ベクターを短期間維持することを含む。 取り込みは細胞による核酸カセットの発現であり、一時的発現であるか、永久 の発現であるか、または安定な発現の何れかである。本明細書にて用いられる用 語「一時的発現」は、特定の蛋白質、ペプチドまたはＲＮＡ等を発現するために 細胞内に遺伝物質を導入することに関する。導入された遺伝物質は宿主細胞ゲノ ムに組み込まれないかまたは宿主細胞により複製されないが、したがって、分解 または他の区画への転移により一定期間後に細胞から排除される。これらの用語 は、前に詳細に定義されている。 本発明の第１３の側面は、喘息の治療法を特徴とする。この方法は、上記ベク ターによる肺または肺システム関連細胞の形質転換を含む。該ベクターは、融合 蛋白質をコードする核酸を含む。肺細胞中で発現されたなら、変異リセプターは 、適当なグルココルチコイド応答遺伝子および／またはＧＲＥ制御されたトラン ス遺伝子の非天然リガンドによる発現をトランス活性化またはトランス抑制する ことができる。 一つの態様において、上記治療法は、非天然リガンドとしてＲＵ４８６に使用 を引き起こす。トランス活性化およびトランス抑制は、変異グルココルチコイド リセプターはＲＵ４８６により活性化された場合に生じうる。融合蛋白質へのリ ガンドの結合に応答してトランス抑制またはトランス活性化された遺伝子は上に 記載される。 本発明の第１４の側面は、本発明のベクターを細胞が含むトランスジェニック マウスを特徴とする。これらの細胞は、胚細胞または体細胞を含む。トランスジ ェニック動物モデルは、潜在的な化学および物理発癌物質および腫瘍プロモータ ーによる効果に関して新規な治療の方法を評価および探索する、分子発癌現象お よび疾患の理解に有用でありうる。 さらに好ましい態様は、修飾されたグルココルチコイドリセプターのベクター を含むトランスジェニック動物を提供する。「トランスジエニック動物」は、同 じ種からのさらにひとつ以上のコピー遺伝子をゲノムが含む動物を意味するか、 または他の種のひとつ以上の遺伝子、例えば本明細書に記載され且つ当業界にお いて公知の遺伝子操作またはクローニング技術により導入された変異グルココル チコイドリセプターをコードする遺伝子を含むゲノムを有する動物を意味する。 トランスジェニック動物は、発育した動物またはその動物のあらゆる子孫からの 胚にベクターが導入された場合の結果である動物を含みうる。本明細書にて用い られる用語「子孫」は、トランスジェニック動物の直接の子孫並びに次の子孫の あらゆる子孫を含む。即ち、当業者は、２つの異なるトランスジェニック動物が 作成されて各々が異なる遺伝子を利用して交配したならば、その結果の子孫の幾 つかは２つまたはそれ以上の導入遺伝子を含む可能性が存在する。当業者は、交 配を制御することにより、複数の導入遺伝子を含むトランスジェニック動物が作 成可能であることを容易に認識するであろう。図面の簡単な説明 図１は、本実験に使用された変異導入およびスクリーニング戦略を示す。 図２は、ＵＰ−１変異体の機能および構造上の特徴を示す。 図３は、変異ヒトプロゲステロンリセプターのウエスタン分析を示す。 図４は、野生型および変異ヒトプロゲステロンリセプター構築物の転写活性お よびホルモン結合分析を示す。 図５は、変異ヒトプロゲステロンリセプターの転写活性の特異性を示す。 図６は、哺乳類細胞への変異ヒトプロゲステロンリセプターの一時的トランス フェクションを示す。 図７は、ＧＲ−ＰＲ融合構築物を描写する。 図８は、ラットおよびヒトのＧＲ二重点変異構築物を描写する。 図９は、構成的に活性な変異ＧＲ蛋白質を発現するプラスミドｐＧＲ０４０３ Ｒをコードする核酸配列を示す。 図１０は、構成的に活性な変異ＧＲ蛋白質を発現するプラスミドｐＧＲ０４０ ３Ｒを描写する。 図１１は、変異ヒトおよびラットＧＲ並びにそれぞれの野生型リセプターへの リガンド結合に対する応答して生じるＣＡＴ蛋白質の量を示す。 図１２は、活性化トランス制御ドメインを伴う融合蛋白質の模式図である。 図１３は、遺伝子スイッチの模式図である。 図面は必ずしもスケールどおりではない。本発明の特定の特徴は、明瞭化およ び簡潔化のために、スケールを誇張するかまたは模式形態で示されてよい。発明の詳細な説明 以下は、遺伝子治療のための変異ステロイドリセプターを用いた本発明の実施 例である。当業者には容易に理解されるとおり、開示された本発明に対して本発 明の範囲および精神から離れることなく、さまざまな置換および修飾がなされて よい。即ち、これらの実施例は例示の目的で提供され、任意の様式に発明を限定 することを意図しない。 以下は、本発明の好ましい態様の特定例である。これらの実施例は、本発明の 分子スイッチ機構が如何にしてさまざまな細胞または動物モデルの構築物におい て使用できるか、そしてそのような分子スイッチ機構を使用して如何に遺伝子発 現の制御をトランス活性化またはトランス抑制できるかを例示する。分子スイッ チ分子の有用性は本明細書において記載されて、Vegeto，et al.，により「変異 ステロイドホルモンリセプター、それらの使用法および遺伝子治療のための分子 スイッチ」（上記）と題した係属中の出願および「Ｃ末端のホルモン結合ドメイ ンの削除を有するプロゲステロンリセプター」（上記）と題するVegeto，et al. ，の米国特許内で強調される。そのようなセクション（図面を含む）は引用によ り特別に本明細書に編入される。ヒトプロゲステロンリセプターのリガンド結合ドメインの変異導入および特徴 酵母株 サッカロミセスセレビシエ株ＢＪ３５０５（ＭＡＴα、ｐｅｐ４：ＨＩＳ３、 ｐｒｂ１−△１．６Ｒ、ｈｉｓ３△２００、ｌｙｓ２−８０１、ｔｒｐｌ−△１ ０１、ｕｒａ３−５２、ｇａｌ２、（ＣＵＰ１））を用いた（酵母遺伝子ストッ クセンター、バークレー、ＣＡ）。すべての酵母の形質転換は、酢酸リチウム形 質転換プロトコルにしたがった（Ito，et al.，J．Bacteriol．153：163-168，1 983）。 ＰＣＲ反応はＹＥｐｈＰＲ−Ｂ ＤＮＡ鋳型（ｈＰＲ形態ＢのｃＤＮＡ（Misr ahi，et al.，Biochem．Bioph．Res．Comm．143：740-748，1987）を含むＹＥｐ ５２ＡＧＳＡ由来の酵母発現プラスミドを酵母メタロチオネイン−ＣＵＰ１プロ モーターの下流に挿入した）を用い、そして３つの異なるセットのプライマーを 用いて実施した。第２鎖の重合反応の忠実度を低下させるために、1.5mM MgCl₂ 、0.1mM dNTPsおよびpH8.2の条件のバッファーを用いた。約２００の第一形質転 換体を各々の領域特異的ライブラリーから得た。酵母変異スクリーニング 特定の亜領域において変異したｈＰＲ分子の各ライブラリーのコロニーを保存 して、大量のＤＮＡを調製して、リポータープラスミドＹＲｐＰＣ３ＧＳ＋を有 する酵母細胞を形質転換するのに用いたが、該プラスミドは大腸菌のＬａｃ−Ｚ 遺伝子に結合したＣＹＣ１プロモーターの上流に２つのＧＲＥ／ＰＲＥ要素を含 む（Mak，et al.，J．Biol．Chem．265：20085-20086，1989）。形質転換細胞は 、２％グルコース、０．５％カザミノ酸（カザミノ酸の５％ストック溶液はいつ も使用前にオートクレーブしてトリプトファンを破壊した）、６．７ｇ／ｌ酵母 窒素塩基（アミノ酸無し）および１００μＭ ＣｕＳＯ₄を含む１．５％寒天プ レート（ＣＡＡ／Ｃｕプレート）にプレートして２日間３０℃において生育させ た。これらのコロニーは次に、図１に示されるとおりに、０．１６ｇ／ｌの５− ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（Ｘ−Ｇａｌ ，β−ガラクトシダーゼ活性の指示薬）を含みホルモンを含むかまたは含まない プレートにレプリカプレートし、１日間３０℃にして生育させて、次に暗黒下で 室温下で２日間生育させた。インビトロアッセイのための酵母培養物の成長 ＹＦｐｈＰＲＢおよびリポータープラスミドを含むサッカロミセスセレビシエ 細胞を一晩３０℃において２％グルコースを含む最初培地中で生育させた。細胞 を新鮮な培地にサブカルチャーして初期の対数中期（Ｏ．Ｄ．₆₀₀＝１．０）に なるまで生育させた。リセプターの誘導は、培養物への１００μＭ硫酸銅の添加 により開始した。１．５００×における１０分間の遠心分離により細胞を回収し て適切なバッファーに再懸濁した。酵母抽出物の分析のためのこの工程および続 くすべての工程は４℃において行った。転写アッセイ リポーターおよび発現プラスミドを含む酵母細胞を、一晩、実施例３における 上記のとおり１００μＭ硫酸銅の存在下で生育させた。細胞密度がＯ．Ｄ．₆₀₀ ＝１．０に到達したら、ホルモンを培養物に加えた。４時間のインキュベーショ ン後、酵母抽出物を調製して前に記載されたとおり（Miller，J．M．Miller編纂 、３５２−３５５、１９７２）に、β−ガラクトシダーゼ活性に関してアッセイ した。 一般的に、本発明に有用なリポーターは、転写レベルの適切な測定を可能にす るあらゆるものである。好ましいリポーターシステムは、構造遺伝子に融合させ た酵母イソ−１−チトクロームＣ近位プロモーター要素からなるリポーターベク ターを含むが、該構造遺伝子は、β−ガラクトシダーゼ、ガラクトキナーゼおよ びＵＲＡ３からなる群から選択される。より好ましくは、ベクターはリポーター 応答要素のための挿入部位からなる。β−ガラクトシダーゼを転写活性指示薬と して含むベクターは親ベクターＰＣ２から誘導されるが、ガラクトキナーゼを含 むベクターはＹＣｐＲ１から誘導される。好ましくは、構造遺伝子は大腸菌を起 源とする。ウエスタン免疫ブロッティング 転写アッセイに関して上記されたとおりに酵母細胞を生育させた。ウエスタン ブロット分析のための酵母抽出物は、ＴＥＤＧ＋塩中に細胞沈殿を再懸濁するこ とにより調製した。細胞懸濁液を等量のガラスビーズと混合してミクロ遠心分離 管中でボルテックスにより破壊した。ホモジェネートは１２，０００×ｇ１０分 間で遠心分離した。上清を回収して、ウシ血清アルブミンを標準として蛋白質濃 度を定量した。酵母抽出物を、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム−７％ポリアク リルアミドゲルにより解析して以前に記載された方法により（McDonnell，et al .，Nol．Cell．Biol．9：3517-3523，1989）イモビロン膜に移した。ｈＰＲのＡ およびＢ形態のＮ−末端ドメインにたいして作成したモノクローナル抗体（ＪＺ Ｂ３９）を用いて、固相ラジオイムノアッセイを実施した。ホルモン結合競合アッセイ ＰＲ合成の誘導は、培養液への１００μＭ ＣｕＳＯ₄の添加により開始して 、インキュベーションを６時間続けた。細胞沈殿物は、１μｇ／ｍｌロイペプチ ン、１０μｇ／ｍｌ ＰＭＳＦおよび１０μｇ／ｍｌペプスタチンを含むＴＥＳ Ｈバッファー中に懸濁した。細胞懸濁液を等量のガラスビーズ（０．５ｍｍ；B ．Braun Instruments）と混合して、ミクロ遠心分離管中でボルテックスにより 破壊した。ホモジェネートを１２，０００×ｇで１０分間遠心分離して上清をさ らに１００，０００×ｇで３０分間遠心分離して細胞質分画を得た。１００μｇ の全蛋白質を含む希釈された酵母抽出物（２００μｌ）を一晩４℃において［³ Ｈ］リガンドとともに１００倍量の非標識リガンド不在下（全結合）または存在 下（非特異的結合）にてインキュベートした。結合したステロイドと遊離のステ ロイドを、デキストランコートチャコール懸濁液（０．５％ ノリットＡ、０． ０５％デキストラン、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ７．４および１ｍＭ ＥＤＴＡ）５００μｌの付加により分離した。特異的結合は、全結合から非特異 的結合を差し引くことにより決定した。スキャッチャード分析は前にMak，et al .，J．Biol.Chem．264：21613-21618（1989）により記載されたとおりに実施し た。部位特異的変異導入 変異体ＹＥｐｈＰＲ−Ｂ８７９およびＹＥｐｈＰＲ−Ｂ８９１を、Dobson，et al.，J．Biol．Chem．264：4207-4211（1989）に記載された方法に従い調製し た。CJ236細胞にmpPR90（ｈＰＲのｃＤＮＡを含むＭ１３プラスミド）を感染さ せた。その結果得たウリジン含有一本鎖ＤＮＡを、アミノ酸880および892にそれ ぞれ対応するＴＧＡ停止コドンを含む２０マーのオリゴヌクレオチドにアニール させた。哺乳類発現ベクターの構築 哺乳類発現ベクターｐｈＰＲ−Ｂは、ｈＰＲ−ＢのｃＤＮＡに結合させたヒト 成長ホルモンプロモーターの上流にＳＶ４０エンハンサー配列を含む。このベク ターはＳａｌＩおよびＥｃｏＲＩにより消化した。６．１ｋｂ断片（ベクター配 列およびｈＰＲの５’−１．５ｋｂを含む）をゲルにより精製して、ＹＥｐｈＰ Ｒ−Ｂ８９１の２．１ｋｂ断片（リセプターの３’−末端を含む）に連結した。 その結果のプラスミドｐｈＰＲ−Ｂ８９１はｈＰＲの形態Ｂから４２アミノ酸を 削除したバージョンをコードする。哺乳類細胞の一時的トランスフェクションおよびＣＡＴ−アッセイ チミジンキナーゼプロモーターに連結したチロシンアミノトランスフェラーゼ 遺伝子からのＰＲＥ／ＧＲＥを２コピー含むクロラムフェニコールアセチルトラ ンスフェラーゼ（ＣＡＴ）リポータープラスミド（ＰＲＥＴＫＣＡＴ）５μｇを 、５μｇの野生型または変異リポーターＤＮＡと共に一時的共コトランスフェク ション実験において用いた。一時的トランスフェクションおよびＣＡＴアッセイ は、Tsai，et al.，Cell 57：443-448（1989）に記載されたとおりに実施した。ｈＰＲ−Ｂのホルモン結合ドメインの変異導入 リガンド結合およびホルモン依存性トランス活性化に必須のｈＰＲ ＨＢＤ内 のアミノ酸を特定するために、変異ｈＰＲ分子のライブラリーを創製して、該変 異体を、酵母中の再構成されたプロゲステロン−応答転写系に導入した。この系 は、多数の変異クローンのスクリーニングおよび直接の可視による表現型同定を 可能にした。 ＮａｅＩ，ＡｖｒＩＩおよびＥｃｏＮＩに関する唯一の制限部位をｈＰＲのｃ ＤＮＡ中に創製して、３９６，２０９および４００ヌクレオチドの３つのカセッ トを得た（それぞれ、領域１，２および３）。ＰＣＲ変異導入のために、３セッ トのプライマー（領域１のための１６＋７、領域２のための５＋４および領域３ のための６＋１３）を、ＹＥｐｈＰＲ−ＢをＤＮＡ鋳型として用いる重合反応に おいて用いた。ＰＣＲ後に得られた断片は、適切な酵素で消化して、ゲル精製し て、そして親プラスミドＹＥｐｈＰＲ−Ｂに連結した。連結混合物を用いること により、バクテリア細胞を形質転換して、ＨＢＤ中にランダムに変異を入れたｈ ＰＲ分子のライブラリーを得た。各々のライブラリーからの５μｇのＤＮＡを用 いて、リポータープラスミドＹＲｐＰＣ３ＧＳ＋を有する酵母細胞を形質転換し て、１００μｇのＣｕＳＯ₄を含むＣＡＡプレート上においてトリプトファンお よびウラシル栄養要求性に関して形質転換体を選択した。次に、これらをホルモ ン含有ＣＡＡプレート上にて複製させた。「亢進変異（uo-mutations）」に関す るスクリーニングにより、ホルモン非依存性転写活性を伴うリセプター変異、ま たはリガンドへの親和合性が増加したリセプター変異（これらのクローンは１０ ０倍未満のホルモンで生育させた場合に青色のままでいるべきである）あるいは ＲＵ４８６またはグルココルチコイド類似体への応答が変更されてリセプター変 異の同定が可能になる。「抑制変異（down-mutations）」スクリーニングにおい ては、リガンド存在下で転写不活性なリセプター変異が検出された。 変異ＤＮＡ鋳型を精製するために使用される方法の性質のため、第一に得られ たライブラリーの質を決定する必要があった。これは、変異導入により生じた無 効な変異の数を見積もることにより評価された。我々は、転写不活性化リセプタ ー（白色コロニー）の生じる頻度をコロニー全体数に比較して評価した。この頻 度は約７％であった。 初期形質転換は、抗プロゲスチンＲＵ４８６を含むプレート上にレプリカプレ ートされた。野生型リポーターはこのホルモンにより活性化されない（図１）。 このスクリーニング戦略を用いることにより、該抗ホルモンに応答して顕著な転 写活性を示した単一コロニーを同定した。興味を引いたのは、プロゲステロンの 存在下でレプリカプレートされた場合に、同じコロニーが転写活性を示さなかっ た。該コロニーを精製して表現型を確認した。該クローンからの発現ベクターの 追い立て（eviction）は非変異リセプターの再導入に続き、表現型は完全に発現 ベクターに関しており二次変異の結果ではないことが証明された。さらに、ＵＰ −１と呼ばれる変異プラスミドは大腸菌を通る経路により酵母から救済され（Wa rd，Nucl．Acids Res．18：5319（1990））、そして精製された。このＤＮＡは 、次に、リポータープラスミドのみを含む酵母に再導入した。期待されたとおり 、該変異表現型は安定であり、そしてリセプター発現プラスミドに直接関連して いた。ＵＰ−１変異の特徴付け リセプター変異を同定するために用いるプレートアッセイは普通定性アッセイ である。ＵＰ−１の特性をさらに特徴付けするために、リセプター変異の活性を 、 転写アッセイにおいて野生型リセプターの活性と比較した。この方法において、 野生型または変異リセプターのいずれか並びにプロゲステロン応答リポーターで 形質転換した酵母細胞は、一晩１００μＭのＣｕＳＯ₄存在下で生育させた。細 胞が１．０のＯ．Ｄ．_600nmに到達したら、プロゲステロンまたはＲＵ４８６を 追加して、４時間後に遠心分離により回収した。該細胞の細胞質中のβ−ガラク トシダーゼ活性を次に測定した。 図２のパネル（Ａ）に関して、野生型リポーターでアッセイした場合には、１ μＭのＲＵ４８６は弱い転写誘導剤であるが、プロゲステロンは１μＭにおいて ６０倍おり大きい転写誘導を引き起こした。しかしながら、この状況は、該変異 体を分析した際に逆転しなかった。この場合、ＲＵ４８６は極めて可能性のある アクチベーターであるが、プロゲステロンは効果的でなかった。興味を引いたの は、ＲＵ４８６の存在下で該変異体により達成された活性は、プロゲステロンの 存在下でアッセイされた野生型と同じ桁の強度であった。特異性におけるこの逆 転は、これらのリガンドがリセプターに相互作用することによる機構が基本的に 異なることを明確に示す。 図２は、野生型および変異ＤＮＡのＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。2636位 のシトシンは変異ＤＮＡにはないので、よって、シフトさせた解読枠を創製して Ｃ-2636欠失の３６ヌクレオチド下流に停止コドンを生成させた。野生型および ＵＰ−１リセプターの模式構造は、変異リセプターに唯一の１２Ｃ−末端アミノ 酸の描写によっても示される。保存されたアミノ酸および構造上類似のアミノ酸 は、それぞれ、アポストロフィーおよび星印によりマークされる。 ＵＰ−１のＤＮＡ配列分析は、塩基2636における単一のヌクレオチドの欠失を 同定した（図２Ｂ）。この変異は、３６ヌクレオチド下流に停止コドンを生じさ せる解読枠のシフトをもたらす。結果として、野生型リセプターは５４の真正ア ミノ酸が削除され、そして新規な１２アミノ酸がＣ末端に付加されている。変異ヒトプロゲステロンリセプターのウエスタン分析 図３は、変異ｈＰＲのウエスタン分析を示す。リポータープラスミドおよび野 生型（ｙｈＰＲ−Ｂまたは変異（ＵＰ−１））ｈＰＲを有する酵母細胞を一晩、 １００μＭのＣｕＳＯ₄の存在（レーン３から５および７から９）または不在（ レーン２から６）下でＣＡＡ培地中で生育させた。１μＭのプロゲステロンおよ び１μＭのＲＵ４８６を示されたとおりに加えて、細胞をさらに４時間生育させ た。酵母抽出物を上記のとおりに調製した。５０ｇの蛋白質抽出物を、０．１％ ＳＤＳ−７％ポリアクリルアミドゲル上で泳動させた。ｈＰＲのＡおよびＢ形 態を含むＴ４７Ｄ核抽出物５０μｇも陽性対照として泳動した（レーン１）。分 子量マーカーの位置を示す。 変異リセプターがＤＮＡ配列から予測されたとおりに合成されたことを確認し 、そして同じ主要な分解産物が変異表現型に必要であった可能性を排除するため に、ＵＰ−１および野生型リセプターのウエスタンイムノブロット分析を実施し た。図３に示すとおり、変異リセプターはゲル中で早く挙動したことから、ＤＮ Ａ配列から予測された分子量を確認した。野生型リセプター（ｙｈＰＲ−Ｂ）は １１４ｋＤａ蛋白質として泳動されたが、変異リセプターは５ｋＤａと小さかっ た（レーン２および３と６および７を比較されたい）。１００μＭのＣｕＳＯ₄ の細胞培養物への添加は、野生型および変異ｈＰＲ両者の合成を同じ程度に増加 させた。主要な分解産物は検出されなかった。プロゲステロンおよびＲＵ４８６ の存在下では、ホルモン誘導によるリセプターのリン酸化のために、ｙｈＰＲ− Ｂのバンドはシフトした。対照的に、ＲＵ４８６は野生型ＰＲの上へのシフトを わずかな程度で誘導した（レーン４および５）。ＵＰ−１変異に関して、ＲＵ４ ８６で処理すると、このホルモン依存性上方シフトが観察された（レーン８およ び９）。即ち、ＰＲのＣ末端はＲＵ４８６の不活性化に必要であるらしい。結果 として、この配列の除去はＲＵ４８６をアゴニストにすることが可能なはずであ る。ホルモン結合分析 図４は、野生型および変異ｈＰＲ構築物の転写活性およびホルモン結合分析を 示す。ｈＰＲ構築物は、リセプター分子の模式描写と共に左側を記録する。酵母 細胞を１００μＭのＣｕＳＯ₄存在下で生育させた。転写分析は上記の通りに行 った。実験は３重に行い、転写活性は蛋白質に関して標準化した。ホルモン結合 アッセイは２０ｎＭの［³Ｈ］プロゲステロンまたは２０ｎＭ［³Ｈ］ＲＵ４８６ の存 在下で実施した。 ＵＰ−１変異リセプターのＲＵ４８６およびプロゲステロンへの親和性が変わ るか否かを測定するために、ＵＰ−１変異リセプターの飽和結合分析を実施した 。結合データのスキャッチャード分析から、野生型および変異リセプターの両者 は、それぞれ４および３ｎＭにおいてＲＵ４８６への同様の親和性を有すること が示された。図４に示すとおり、変異リセプター分子はプロゲステロンに結合す る能力を矢った。即ち、プロゲステロンおよびＲＵ４８６に関するｈＰＲによる アミノ酸接触は異なる。ｈＰＲ−Ｂの欠失変異の発生 図２Ｂに示すとおり、ＤＮＡ配列決定から、ＵＰ−１クローン内のフレームシ フト変異がリセプター蛋白質中の二重変異を創製したことが明らかになった。即 ち、修飾されたＣ末端アミノ酸配列および４２のアミノ酸の削除である。観察さ れた表現型にどの変異が最終的に必要であるかを同定するために、２つの新たな リセプター変異体をインビトロにて構築した：アミノ酸８８０に対応する停止コ ドンを含むＹＥｐｈＰＲ−Ｂ８７９、およびアミノ酸８９２において停止コドン を含むＹＥｐｈＰＲ−Ｂ８９１。ホルモン結合データ（図４を参照されたい）か ら、これらの削除されたリセプターの両方がＲＵ４８６を結合するがプロゲステ ロンを結合しないことが示された。インビボで試験する場合、両変異リセプター は、ＲＵ４８６の存在下で、酵母で生じる変異ＵＰ−１に匹敵するレベルに転写 を活性化した。期待されたとおり、両変異はプロゲステロンの存在下では不活性 であった。即ち、観察された表現型は、ＵＰ−１分子中の第２の部位の変異によ らなかった。また、８８０から８９１までの１２の付加的アミノ酸は変異体の活 性に必要では無かった。さらに、Ｃ末端の４２アミノ酸はプロゲステロンがリセ プターに結合するのに必要であるが、最後の５４アミノ酸はＲＵ４８６結合に必 要ないことが明らかである。即ち、アンタゴニストは天然リセプター分子におい て異なるアミノ酸に接触して、アゴニストに対して異なるリセプターコンフォメ ーションを誘導するらしい。 上記欠失変異に加えて、Ｃ末端アミノ酸配列中の他の欠失がＲＵ４８６により 結合活性を提供したが、プロゲステロンによっては提供しなかった。そのような 欠失は：（１）プロゲステロンリセプターのアミノ酸１−９１７を残す１６アミ ノ酸の欠失、および（２）プロゲステロンリセプターのアミノ酸１−９２０を残 す１３アミノ酸の欠失を含む。一時的トランスフェクションアッセイにおけるＴ ＡＴＡ−ＣＡＴ発現を伴うリセプター結合領域の使用は、１６アミノ酸欠失、即 ち、アミノ酸６４０−９１７、および１３アミノ酸欠失、即ち、アミノ酸６４０ −９２０によるＣＡＴ発現を示した。ＵＰ−１変異の転写活性化のためのステロイド特異性 図５は、変異ｈＰＲの転写活性の特異性を示す。パネル（Ａ）において、示さ れたとおりの異なる濃度のプロゲステロン、ＲＵ４８６、Ｏｒｇ３１８０６およ びＯｒｇ３１３７６の存在下で、野生型およびＵＰ−１変異リセプターの転写活 性をアッセイした。 転写アッセイは、２つの合成アンタゴニスト、Ｏｒｇ３１８０６およびＯｒｇ ３１３７６を用いて実施したが、これらアンタゴニストは潜在的な抗プロゲスチ ンである。図５Ａに示すとおり、これら両化合物により該変異リセプターを活性 化した。濃度依存活性の曲線はＲＵ４８６を用いて得られた曲線と類似していた ことから、変異リセプターに関するこれら２つのアンタゴニストの親和性はＲＵ ４８６の親和性と類似することが示唆される。野生型リセプターを用いてアッセ イした場合、これら化合物は、１μＭにおいてのみＲＵ４８６のように、最小の 転写活性を有し、部分アゴニストと同じように挙動した（３−１０％プロゲスチ ン活性）。即ち、ｈＰＲのＣ末端の阻害効果は他のリセプターアンタゴニストに およぶ。 パネル（Ｂ）においては、野生型およびＵＰ−１変異リセプターの転写活性を 、１μＭのプロゲスチン（Ｐ）、ＲＵ４８６（ＲＵ）、Ｒ５０２０（Ｒ）、デキ サメタソン（Ｄ）、コルチゾル（Ｃ）、エストラジオール（Ｅ）、タモキシフェ ン（ＴＸ）、またはナフォキシジン（Ｎ）の存在下でアッセイした（図５Ｂを参 照されたい）。合成アゴニストＲ５０２０はＵＰ−１変異に効果を有さなかった ことから、プロゲスチンおよびＲ５０２０のようなアゴニストは結合のために天 然 リセプターのＣ末端を必要とし、結果的に削除されたＵＰ−１リセプターを認識 し損なうことが示唆される。酵母細胞に侵入することが知られている他のステロ イド、例えばエストラジオール、抗エストロジェンタモキシフェンおよびナフォ キシジン、デキサメタソンおよびコルチゾルは変異リセプターを活性化する可能 性があるかもしれない。試験されたすべてのステロイドは、野生型または変異リ セプターのいずれかにより不活性になることが見いだされた。即ち、変異リセプ ターの活性化は抗プロゲスチンに特異的である。哺乳類細胞中の変異リセプターの転写活性 図６は、哺乳類細胞への変異ｈＰＲの一時的トランスフェクションを示す。パ ネル（Ａ）においては、記載されたとおりに（Tsai，et al.，1989）ポリブレン トランスフェクション法を用いてＰＲＥＴＫＣＡＴリセプタープラスミドと共に ｐｈＰＲ−ＢおよびｐＨＰＲ−Ｂ８９１リセプターでＨｅＬａ細胞を一時的にト ランスフェクトした。１００ｎＭのプロゲステロンまたはＲＵ４８６の存在また は不在下で、回収前に４８時間細胞を生育させた。ＣＡＴアッセイは上記のとお りに実施した。パネル（Ｂ）においては、ＣＶ−１細胞を（Ａ）におけるとおり に、一時的にトランスフェクトした。 図６に関しては、ヒト子宮ＨｅＬａ細胞とサルの腎臓ＣＶ−１繊維芽細胞の両 者で変異リセプター活性をアッセイした。変異体ｐｈＰＲ−８９１は、ｐｈＰＲ −Ｂベクターの完全長ＰＲ挿入物を、ＹＥｐｈＰＲ−Ｂ８９１の削除されたＰＲ のｃＤＮＡで置き換えることにより、構築した。その結果のリセプター変異体ｐ ｈＰＲ−Ｂ８９１は、ｈＰＲ−Ｂ形態の４２アミノ酸の削除である。変異体８９ １および野生型リセプターで、ＧＲＥ／ＰＲＥ要素２コピーを含むＰＲＥＴＫＣ ＡＴリポータープラスミドと共に、ＨｅＬａ細胞をトランスフェクトした。 期待されたとおり、１０^-7Ｍのプロゲステロンの存在下で野生型ＰＲはＣＡＴ 遺伝子の転写を活性化した（図６Ａ）。基底転写レベルは高かったが、プロゲス テロンを培地面に加えた場合は３から４倍の転写誘導が検出された。対照的に、 ＲＵ４８６存在下では誘導は生じなかった。これらの実験において検出された高 い基底レベルの転写は、野生型ｈＰＲに対するＲＵ４８６の効果を覆い隠すかま たは変更するかもしれない。 一方、１０^-7ＭのＲＵ４８６存在下で８９１変異体をインキュベートした場合 に、ＣＡＴ活性の誘導が観察された（図６Ａ）。同じ濃度のプロゲステロンは活 性を有さなかった。 細胞種特異的因子はステロイドホルモンのトランス活性化ドメインの活性に影 響を与えることができる。この可能性を評価するために、野生型および変異リセ プターをＣＶ−１細胞にトランスフェクトした。同様の結果が得られたが、即ち 、プロゲステロンは野生型リセプターを活性化し、ＲＵ４８６は８９１変異リセ プターを活性化した（図６Ｂ）。 ｐｈＰＲ−Ｂ８９１プラスミドから合成された蛋白質は、哺乳類細胞において 正確な分子量であった。変異リセプターをＣＯＳＭ６細胞にトランスフェクトし た。細胞抽出物に関するウエスタン分析から、８９１変異体が期待されたとおり に、野生型ｈＰＲよりも短い蛋白質４２アミノ酸に対応する１０９ｋＤａの蛋白 質として合成された。即ち、ＲＵ４８６は、酵母再構成系および哺乳類細胞にお いても、削除されたＢ−リセプターのアゴニストとして作用する。トランス活性 化の機構は変異リセプターのＣ末端テイルを必要とせず、そして試験された３種 において保存されている。変異ヒトＧＲ−ＰＲ融合蛋白質リセプターの構築、特徴付けおよび分析 プラスミドの構築 上記のとおりに、変異ヒトプロゲステロンリセプターを構築して特徴付けした 。ヒトＰＲのリガンド結合ドメインの変異導入は上記概要されたのと同じ方法で 実施した。変異プロゲステロンリガンドの特徴付けにより、塩基2636において単 一のヌクレオチド欠失を同定した。この変異は、停止コドンの３６ヌクレオチド 下流を生じる解読枠のシフトをもたらした。結果として、野生型リガンドは、５ ４の真正アミノ酸を削除されて、１２の新規なアミノ酸をｃ末端に付加される。 末端における４２のアミノ酸削除はＲＵ４８６への結合を可能にし、そして上記 のとおり特徴付けられた。 ＧＲ−ＰＲ融合蛋白質リガンドおよび野生型ＧＲをコードするプラスミドＤＮ Ａを、以下のとおりに構築した。各々の挿入変異体は制限酵素BamHIおよびXhoI で消化し、SV40アデニル化シグナルの３’側を周囲に配置させた。その結果の断 片をアガロースゲル上で単離した。ＧＲのアミノ末端コーディング部分を含む挿 入変異体の大きな断片、即ち、トランス制御およびＤＮＡ結合領域、およびプラ スミド全体を、上記調製したｈＰＲ欠失変異体のカルボキシル末端コーディング 配列の小さな断片に連結した。その結果得られる、ｈＰＲリガンド結合ドメイン において欠失を含むプラスミドの配列を決定して、ＧＲ−ＰＲ変異構築物の保全 性を保証した。 さらに、変異ラットまたはヒトＧＲおよび野生型ラットまたはヒトＧＲをコー ドするプラスミドＤＮＡも構築した。ラットのプラスミドｐＧＲ０３８５（また はｐｒＣＳ１．Ｃ）およびその野生型ｐＧＲ０３８４を上記の方法により構築し た。上記プラスミドの構築、変異および特徴付けに関する詳細は、Lanz and Rus coni，Endocrinology 135：2183-2195（1994）に見いだすことができ、それら全 体は図面も含めて引用により編入される。ラットおよびヒト変異ＧＲの特徴付け により、リガンド結合ドメイン中の二重点変異が同定された。ラット構築物にお いては、アミノ酸７７０、７７１のメチオニンおよびロイシンをアラニンおよび アラニンで置換した。アミノ酸７８０および７８１は削除した。ヒト構築物にお いては、アミノ酸７６２および７６３を削除した。アミノ酸７５２および７５３ はアラニンで置換した。置換および欠失の両者による変化は、ラットまたはヒト ＧＲリガンド結合ドメインのカルボキシル末端部分においてであった。挿入変異 体は制限酵素BamHIおよびXhoIにより消化して、ＳＶ４０のポリアデニル化シグ ナルの３’側を周囲に配置させて、その結果の断片をアガロースゲルから単離し た。ラットまたはヒトＧＲのアミノ末端コーディング部分を含む一つの挿入変異 体の大きな断片とプラスミド全体を、変異リガンド結合ドメインのカルボキシル 末端コーディング配列の小さな断片と連結した。その結果得られる、リガンド結 合ドメインにおいて欠失を含むプラスミドの配列を決定して、ラットまたはヒト ＧＲ変異体の保全性を保証した。 さらに、上記方法も用いて、構成的に活性なリセプターとＧＲ変異をコードす るプラスミドＤＮＡ、即ちｐＧＲ０４０３Ｒ構築した（図９および１０）。挿入 変異体は適当な制限酵素で消化した。その結果の断片をアガロースゲルから単離 した。ＧＲのアミノ末端コーディング部分を含む一つの挿入変異体の大きな断片 、即ちトランス制御ドメインおよびＤＮＡ結合ドメインとプラスミド全体を、変 異ＧＲリガンド結合ドメインを含む他の挿入変異体の小さな断片と連結した。そ の結果得られるプラスミドの配列を決定して、変異構築物の保全性を保証した。細胞培養、トランスフェクションおよびＣＡＴおよびルシフェラーゼ活性のアッ セイ ５％二酸化炭素を含む湿潤雰囲気中で１０％ウシ胎児血清（”ＦＢＳ”）を含 むダルベッコ修飾イーグル培地においてＣＶ−１細胞を維持した。市販のカチオ ン剤リポフェクタミンを用いて細胞をトランスフェクトした。簡単に言えば、Ｄ ＮＡをリポフェクタミン剤と混合して細胞に加えた。５時間後、ＤＮＡ混合物を 取り出して、１０％ＦＢＳ含有生育培地で置換して、細胞を５％二酸化炭素含有 雰囲気に戻した。１８時間後、細胞をさまざまな濃度のステロイドで約２４時間 処理して、次に回収した。 この方法において、ＣＶ１細胞は野生型リセプターまたは変異リセプターのい ずれかおよびグルココルチコイド応答リポーター構築物で形質転換した。転写活 性化を測定するために、２つの合成ＧＲＥボックスおよびＴＡＴＡボックスを含 むＣＡＴリポーターを用いた。転写抑制を測定するために、２つの構築物を用い た。第１は、炎症により誘導可能な転写因子ＡＰ−１の結合部位２コピー、次に チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターをＣＡＴに連結させて含む。第２は、炎 症により誘導可能な転写因子ＮＦ_K−Ｂの結合部位２コピー、次にＴＡＴＡボッ クスをルシフェラーゼ遺伝子に連結させて含む。ＣＡＴ発現はＥＬＩＳＡアッセ イを用いて製造者の指示書に従い定量した。ルシフェラーゼ活性は、市販のルシ フェラーゼアッセイを製造者の指示書に従い用いて測定した。ＣＶ１細胞を用いたインビトロトランスフェクション ＣＶ１細胞へのインビトロトランスフェクションを通して、ＧＲ−ＰＲ融合蛋 白質リセプターおよび変異ラットＧＲを生物活性に関してアッセイした。対照と して、野生型ヒトＧＲおよび野生型ラットＧＲを発現するベクターを用いた。こ れら実験の結果から、野生型ヒトおよび野生型ラットＧＲはデキサメタソンに応 答しておよび最小にはＲＵ４８６により転写活性化される。対照的に、変異ラッ トＧＲ（ＣＳ１．ＣＤ）はＲＵ４８６により転写活性化されるがデキサメタソン により活性化されない。同様に、ＧＲ−ＰＲ融合蛋白質リセプターもＲＵ４８６ により活性化されてデキサメタソンにより活性化されない。図１１は、特定のリ ガンドに応答して生成されたＣＡＴ蛋白質の量を例示する。インビトロ転写抑制研究 変異ラットＧＲおよびヒトＧＲ−ＰＲ構築物により仲介される転写抑制を試験 した。合成活性化要素の転写制御下で生成されたＣＡＴ蛋白質の量を測定した。 特に２つのリポーターを試験したが、ＴＲＥ２ｔｋＣＡＴはＣＡＴに結合した チミジンキナーゼプロモーターに融合させたＡＰ−１を含む。用いられた第２の リポーターはＮＦ_K−Ｂ−ｌｕｃプラスミドであり、ルシフェラーゼに融合させ た２つのＮＦ_K−Ｂ結合部位を含む。これらのプロモーターは炎症誘導可能なプ ロモーターであり、且つ野生型および変異ＧＲ構築物が転写を抑制する能力を評 価するために用いられた。 細胞をトランスフェクトして、野生型ラットまたはヒトＧＲまたは変異ラット （ＣＳ１．ＣＤ）またはヒトＧＲのいずれかを伴うＣＶ１細胞とした。ステロイ ドリセプターへの結合を可能にするためにｄｅｘまたはＲＵ４８６により予め処 理された細胞を、次にホルボールエステルＴＰＡで刺激してＡＰ−１およびＮＦ_K −Ｂを活性化した。相手の細胞はＴＰＡで刺激せず、そして対照細胞もｄｅｘ またはＲＵ４８６のいずれも受容しなかった。 結果は、ＲＵ４８６処理により、ＣＳ１．ＣＤトランスフェクト細胞中のＣＡ Ｔ蛋白質レベルおよびルシフェラーゼ活性の低下がもたらされたことを示した。 ｄｅｘ処理はＣＡＴレベルおよびルシフェラーゼに効果を有さなかった。これは 予測されなかった結果であるが、ｄｅｘが変異ラットＧＲのＣＳ１．ＣＤまたは ヒトＧＲのリガンド結合ドメインに結合しないからである。野生型ＧＲでトラン スフェクトされた細胞においてはｄｅｘおよびＲＵ４８６の両者がＣＡＴ蛋白質 レベルおよびルシフェラーゼ活性の低下を引き起こした。そのような結果は予測 されなかったが、野生型ＧＲがｄｅｘおよびＲＵ４８６の両者に結合するからで ある。 ＲＵ４８６は変異ＧＲを通して作用してＡＰ−１作動遺伝子の転写を抑制する 。ＡＰ−１およびＮＦ_K−Ｂは前炎症遺伝子の発現を作動させるし、ＲＵ４８６ は変異を通して作用するかまたはＡＰ−１およびＮＦ_K−Ｂ作動遺伝子の転写を 抑制するから、抗炎症の仲介が存在した。変異ＧＲ発現および検出 ３つの抗体を得て、ウエスタンブロット分析において、部分精製された組換え ＧＲを認識するのに用いた。上記抗体を用いて、トランスフェクト細胞からの野 生型ＧＲおよび変異ＧＲ蛋白質またはラット滑膜組織からのＧＲを検出するため の実験を実施した。 これら抗体はＨｅＬａ細胞抽出物からのヒトＧＲを検出することもできた。顕 著なレベルのＧＲが２００μｇより低い全細胞抽出物で検出された。滑膜組織で は免疫反応性も検出され、そして野生型と変異ＧＲ蛋白質を区別するために抗体 を調製する。トランス活性化およびトランス抑制研究 上記実験に加えて、ルシフェラーゼ遺伝子に融合させたＮＦ_K−Ｂ結合部位を 有するベクターをラットの滑膜性間接に注射してＴＮＦ−αで処理したかまたは しなかった。ＴＮＦ−αは、炎症を誘導してその適当なＤＮＡ配列へのＮＦ_K− Ｂ結合を促進するサイトカインである。該ＤＮＡ構築物を用いると、ＴＮＦ−α 処理はＴＮＦ−αおよび外因性誘導ルシフェラーゼ遺伝子の転写の増加をもたら す。滑膜組織におけるルシフェラーゼ活性はプラスミドのトランスフェクション 無しに検出されない。また、ＴＮＦ不在下でプラスミドを注射された滑膜組織に おいてルシフェラーゼ活性は存在しない。組織を０．１または１ｎＭのＴＮＦに 暴露した場合にルシフェラーゼレベルの６倍増加が生じた。これは、野生型また は変異ＧＲ機能のための容易に検出可能なインビボマーカーとして機能する。ＧＲのリガンド結合ドメイン内の二重点変異の構築、特徴付けおよび分析 ヒトＧＲのリガンド結合ドメインの変異導入 アミノ酸７５２および７５３のアラニンへの変化およびアミノ酸７６２および ７６３の欠矢を伴うヒトＧＲのｃＤＮＡを含むプラスミドを構築した。このプラ スミドｐＳＴＣ−ｈＧＲ−ＣＳ１／ＣＤは以下のとおりに構築した。野生型グル ココルチコイドホルモンリセプタープラスミドを制限酵素NsiIとXbaIで消化して 、変異される領域を周辺に置いた。その結果の断片を、アガロースゲルから単離 した。小さな断片を制限酵素EcoRIとSspIで消化して３つの断片を生じさせた。 これらの断片をアガロースゲルから単離した。 合成断片：5'-AAT TCC CCG AGG CGG CAG CTG AAA TCA TCA CCA ATC AGA TCT-3 'を合成して、EcoRI-SspI断片を置き換えた。大きな断片、NsiI-EcoRI断片、Ssp I-XbaI断片および上記合成EcoRI-SspI断片を一緒に連結した。その結果のプラス ミドは上記置換および欠失を有する。リガンド結合ドメインにおけるＧＲ変異の特徴付け 変異の保全性を保証するため、変異ヒトＧＲを含むプラスミドを配列決定した 。上記のさらなる実験は変異ヒトＧＲを特徴付けるために行った。上記のウエス タン分析およびホルモン結合を実施して、構築物の特徴、即ち、蛋白質の細胞発 現および転写活性化または抑制のステロイド特異性を保証した。哺乳類細胞内の変異リセプターの転写活性 １０％ウシ胎児血清（”ＦＢＳ”）を含むダルベッコ修飾イーグル培地におい て、５％二酸化炭素湿潤雰囲気中で３7℃にてＬＭＴＫ^-細胞を維持した。図面も 含めて引用により編入されるKawai et al.，Mol．Cell．Bio．４：91-1172（198 4）に記載されたポリブレン法で細胞をトランスフェクトした。ハンクスバッフ ァー塩溶液（”ＨＢＳＳ”）中での２５％グリセロールショック後、細胞をＨＢ ＳＳで２回洗浄して、ホルモンまたは溶剤を含む培地を加えた。この細胞を４８ 時間培養した。抽出物は凍結乾燥により作成した。ＣＡＴアッセイは２５μｇ蛋 白質および１６時間のインキュベーション時間でアッセイした。図面も含めて引 用により編入されるSeed et al.，Gene 67：271（1988）に記載されたとおりに ＣＡＴ活性をアッセイした。構成的活性変異ＧＲの構築、特徴付けおよび分析 ヒトＧＲのリガンド結合ドの変異導入 ステロイドリガンド結合ドの欠失は以下のとおりに作成した。この欠失は、す べてのステロイド結合特性を排除する蛋白質のカルボキシル末端部分の大きな部 分を除去した。上記方法を用いることにより、ｐＧＲ０４０３Ｒプラスミド（図 ９および１０）を構築した。この変異は、構成的に活性なリセプターを生じた。 この変異体はグルココルチコイドホルモンの存在または不在下でＣＡＴリセプタ ー遺伝子の転写を活性化することができる。さらに、この変異体はＮＦ_K−Ｂ− ルシフェラーゼ構築物の転写を抑制することもできる。リガンド結合ドメイン内のＧＲ変異の特徴付け 変異の保全性を保証するため、変異ヒトＧＲを含むプラスミドｐＧＲ０４０３ Ｒ（図１０）を配列決定した（図９）。変異ヒトＧＲを特徴付けるため上記のさ らなる実験を行った。上記のウエスタン分析およびホルモン結合を実施して、構 築物の特徴、即ち、蛋白質の細胞発現、転写活性化または抑制のステロイド特異 性の欠如および構成的発現に比した遺伝子発現の基底レベルを保証した。哺乳類細胞内の変異リセプターの転写活性 構成的に活性な変異ＧＲ構築物を上記のとおりに調製した。リセプターはリガ ンド結合ドメインをもたず、細胞内で発現されるとｄｅまたはＲＵ４８６の不在 下でＡＰ−１作動遺伝子の転写を抑制する。インビトロの試験は、構成的に活性 なＧＲ変異体は、トランスフェクトした場合に、グルココルチコイド応答要素を 伴うプロモーターを構成的に活性化し、そしてＡＰ−１含有プロモーターを抑制 することを示した。ＧＲのＤＮＡ結合ドメインまたはトランス制御ドメイン内の変異の構築、特徴付 けおよび分析 ＧＲのＤＮＡ結合ドメインまたはトランス制御ドメインの変異導入 トランス抑制活性無しでトランス活性化活性を得るために、以下の構築物を作 成した。変異リガンド結合ドメインは上記のとおりに変異させた。Lanz，et al. ，Endocrinology 135：2183-2195（1994）による方法の詳細は、図面も含めて引 用 により編入される。変異ＤＮＡ結合ドメインは、４２５位のセリンをグリシンに 、４３６位のロイシンをバリンに、そして４７８および４７９位のチロシンおよ びアスパラギンをロイシンおよびグリシンに変化させることにより変異させた。 トランス活性化無しでトランス抑制活性を得るために、以下の構築物を作成し た。変異リガンド結合ドメインは上記のとおりに変異させた。変異トランス制御 ドメインは、４５８位のアラニンをスレオニンに、４５４および４５８位のアス パラギンおよびアラニンをそれぞれアスパラギン酸およびスレオニンに、そして ４６０および５６２位のアルギニンおよびアスパラギン酸をそれぞれアスパラギ ンおよびシステインに変化させることにより変異させた。ＤＮＡ結合ドメインまたはトランス制御ドメイン内のＧＲ変異の特徴付け 変異の保全性を保証するために、変異ＧＲを含むプラスミドを配列決定した。 変異ＧＲ構築物を特徴付けるため上記のさらなる実験を行った。上記のウエスタ ン分析およびホルモン結合を実施して、構築物の特徴、例えば、細胞内の蛋白質 の発現および転写活性化または抑制のステロイド特異性を保証した。哺乳類細胞内の変異リセプターの転写活性 上記変異ＧＲ構築物を調製した。２つの異なるリセプター構築物は、変異ＤＮ Ａ結合ドメインまたは変異トランス制御ドメインのいずれかを有する。細胞内で 発現される場合に、ＤＮＡ結合ドメイン変異を有するトランス抑制のみの構築物 は、ｄｅｘまたはＲＵ４８６の存在下でＡＰ−１およびＮＦ_K−Ｂ作動遺伝子の 転写を抑制する。転写の活性化は観察されなかった。インビトロ試験は、トラン スフェクトされた場合にＧＲ変異体はＡＰ−１およびＮＦ_K−Ｂ含有プロモータ ーを抑制してグルココルチコイド応答遺伝子を活性化しないことを示す。 変異トランス制御ドメインを有するトランス活性化のみの構築物に関して、さ まざまなステロイドの存在下で転写活性化が観察された。ｄｃｘまたはＲＵ４８ ６の存在下で、ＡＰ−１またはＮＦ_K−Ｂ作動遺伝子のトランス抑制は観察され なかった。インビトロ試験は、トランスフェクトされた場合にＧＲ変異体はリガ ンド刺激に応答してグルココルチコイド応答遺伝子を活性化することを示すが、 ＡＰ−１またはＮＦ_K−Ｂ遺伝子の抑制は観察されなかった。ニワトリ、ラットおよび哺乳類のプロゲステロンリセプター ニワトリ、ラットおよび哺乳類のプロゲステロンリセプターは容易に利用可能 であり、同じＤＮＡ制御配列への結合により機能する。ニワトリおよびラットの プロゲステロンリセプターは、しかしながら異なるスペクトルのリガンドを結合 し、ヒトプロゲステロンリセプターと相互作用するものとは異なる親和性を有す る。即ち、ニワトリおよびラットのプロゲステロンリセプターは、ヒトにおいて トランス遺伝子制御剤として使用することができる。さらに、ニワトリまたはラ ットのプロゲステロンリセプターは活性化するが外来のヒトプロゲステロンリセ プターは活性化しない特定のリガンドのスクリーニングに使用可能である。リガ ンドの例は、５α−プレグナン−３，２０−ジオン（ジヒドロプロゲステロン） であり、ニワトリおよびラットのプロゲステロンリセプターは極めてよく結合す るがヒトプロゲステロンリセプターには大変に僅かにしか結合しない。 非修飾のニワトリまたはラットプロゲステロンリセプターはヒトまたは他の哺 乳類からの異なるスペクトルのリガンド結合親和性を既に授けられ、そしてその 天然形態で使用できるが、より効果的なリセプターを創製するためにさらに変異 プロゲステロンリセプターを選択するように努力することが重要である。ニワト リ、ラットおよびヒトプロゲステロンリセプターの違いは、僅かなアミノ酸の違 いによる。即ち、他の変異を人工的に導入することができる。これらの変異はリ セプターの差異を高めるはずである。リガンドに関するリセプター変異のスクリ ーニングは、親和性の変化が生じるさまざまなリセプターを生成する。プロゲス テロン変異体の最初のスクリーニングは、中間レベルのリガンドを用いることに より実施した。ひとつの変異体はプロゲステロン親和性を完全に喪失していたが 、ほぼ野生型と同じ効率で合成リガンドＲＵ４８６を結合した。ＲＵ４８６はプ ロゲステロン機能のアンタゴニストであると通常考えられるが、この特異的変異 体を用いる試験の場合にはアゴニストになった。該リガンドは合成物であるから 、遺伝子治療により治療されるヒトまたは動物において見いだされる可能性のあ る化合物を代表しない。ＲＵ４８６はこの場合にアゴニストとして働くが、抗グ ルココルチコイドとしての潜在的な副作用のために理想的ではない。さらに、そ れ は、野生型ヒトプロゲステロンにも結合する。即ち、それは、再生および内分泌 不全の不所望な副作用も有する。 このアプローチはプロゲステロンリセプターに限定されないが、すべてのリガ ンド活性化転写因子が同様の機構を通して作用すると信じられているからである 。当業者は、ステロイドスーパーファミリーの他のメンバーの同様なスクリーニ ングがさまざまな分子スイッチを提供することを認識するであろう。例えば、化 合物、１，２５−ヂヒドロキシ−ビタミンＤ₃はビタミンＤリセプターを活性化 するが、化合物、２4，２５−ジヒドロキシ−ビタミンＤはしない。ビタミンＤ リセプターの変異体を生成することができ、２４，２５−ジヒドロキシ−ビタミ ンＤに結合した場合に転写活性化されるが、１，２５−ビタミンＤ₃によては活 性化されない。トランスジェニック動物 修飾されたグルココルチコイドリセプターをトランスジェニック動物の生成に 用いることができる。トランスジェニック動物を作成するためのさまざまな方法 が知られており、Leder and Stewartの1988年４月12日に発行された米国特許第4 ,736,866号およびPalmiter and Bannister，Annual Review of Genetics，20：4 65-499を含む。例えば、上記変異グルココルチコイドリセプターは発現される組 換え遺伝子を含む核酸カセットと組み合わせることができる。例えば、ラクトフ ェリンは基礎的プロモーター、例えばチミジンキナーゼプロモーターの制御下で グルココルチコイド応答要素を隣接させて配置することができる。このベクター は、構成的に変異グルココルチコイドリセプターを発現するベクターと共に動物 生殖細胞系に導入する。これら２つのベクターを組み合わせて一つのベクターに することも可能である。トランスジェニック動物内での組換え遺伝子の発現は、 薬学用量のＲＵ４８６をトランスジェニック動物に投与することによりオンまた はオフにする。このホルモンは、トランス遺伝子の転写を特異的に活性化するよ うに機能する。この用量は、発現レベルを制御するように調節することができる 。当業者は、このプロトコルがさまざまな遺伝子に有用で有りうること、即ち、 トランスジェニック動物において任意の与えられた遺伝子産物の一時的な発現の 制御 に有用であることを、容易に認識するであろう。使用方法 細胞形質転換 本発明の一つの態様は、変異リセプターをコードする核酸で形質転換した細胞 を含む。細胞を形質転換したなら、細胞は核酸によりコードされる蛋白質、ポリ ペプチドまたはＲＮＡを発現するであろう。細胞は限定されないが、関節、肺、 筋肉および皮膚を含む。これは、あらゆる様式に限定することを意図しない。 核酸がＲＮＡに転写されることができて必要な場合に形質転換細胞中で蛋白質 またはポリペプチドに翻訳されるように、興味のある遺伝物質を含む核酸を宿主 またはベクターの配置上連続して並べる。形質転換細胞中での核酸カセット内の この配置により、さまざまな変異グルココルチコイド蛋白質およびポリペプチド を発現させることができる。 形質転換はインビボまたはエクスビボ技術のいずれかにより行うことができる 。当業者はそのような形質転換技術に精通している。エクスビボ技術による形質 転換は、選択可能なマーカーを含むＤＮＡにより細胞を共トランスフェクトする ことを含む。この選択可能なマーカーを用いることにより、形質転換された細胞 を選択する。 例えば、筋肉疾患の遺伝子治療のための一つのアプローチは、罹患した個人か ら筋原細胞を取り出し、インビトロにてそれらを遺伝的に変化させ、そして受容 位置にそれらを再移植することである。エクスビボのアプローチは、筋原細胞を 回収し、該筋原細胞を培養し、該筋原細胞を誘導またはトランスフェクトし、そ してトランスフェクトされた筋原細胞を罹患した個人に導入することを含む。 筋原細胞はあらゆる方法により得てよい。それらは、形質転換された筋原細胞 を後に注射された個人から取ってもよいし、あるいは他の源から回収して、形質 転換し、そして目的の個人に注射することもできる。 エクスビボにて筋原細胞を回収したなら、それらは、核酸運搬体を含む培地に 接触させて、筋原細胞の取り込みおよび形質転換に適切な条件下で十分な時間培 地内に培養筋原細胞を維持することにより、形質転換してよい。次に、細胞懸濁 液を組織に注射することにより、筋原細胞を適切な位置に導入してよい。当業者 は、細胞懸濁液が、該細胞の生存性維持に必要な塩、バッファーまたは栄養；細 胞安定性を保証するための蛋白質；および移植された細胞の血管形成および成長 を促進する因子を含んでよい。 別法として、形質導入後に適切な位置に外科移植されてよいプラスチック、繊 維またはゼラチンからなるマトリックス上にて、回収した筋原細胞をエクスビボ 生育させてよい。このマトリックスは移植細胞の血管形成および成長を促進する 因子を含浸させてよい。次に、細胞を再移植することができる。投与 本明細書にて用いられる投与は、ベクターまたはＤＮＡキャリアーの体内への 導入ルートを示す。投与は、静脈内、筋肉内、局所、または経口送達法を含んで よい。投与は標的組織に直接的であるかまたは全身送達による。 特に、本発明は、疾患治療のため、またはあらゆる特定の核酸配列を発現でき る製剤化ＤＮＡが発現ベクターの投与のために使用できる。投与は、上記制御可 能なベクターを投与することも含む。ベクターのそのような投与は、疾患を治療 するのに用いることができる。好ましい態様は標的組織への直接の注射または全 身投与である。 第２の必須工程は、遺伝子産物を発現できる場所である標的細胞の核へのＤＮ Ａベクターの送達である。本発明において、これは製剤化により達成される。製 剤は、精製されたＤＮＡベクターまたは他の製剤化要素例えば脂質、蛋白質、糖 質、合成の有機または無機化合物に対合させたＤＮＡベクターからなりうる。そ のような製剤要素の例は、限定されないが、リポソーム形成可能な脂質、カチオ ン性脂質、親水性ポリマー、ポリカチオン（例えば、プロタミン、ポリブレン、 スペルミジン、ポリスチレン）、標的細胞上のリセプターを認識するペプチドま たは合成リガンド、エンドソーム溶解を誘導可能なペプチドまたは合成リガンド 、核への物質を標的とすることが可能なペプチドまたは合成リガンド、ゲル、緩 慢放出性マトリックス、可溶性または不溶性粒子、並びにリストされていない他 の製剤要素を含む。これは、送達、取り込み、安定性、およびまたは細胞におけ る 遺伝物質の発現を高める製剤要素を含む。 選択されたあらゆるベクター構築物の送達および製剤化は、発現ベクターの特 定の用途に依存する。通常、用いられた各々のベクター構築物のための特定の製 剤化は、特定の標的組織に関するヴェクター取り込みに焦点を合わせ、効率の証 明に続く。取り込みの研究は、ベクターの細胞内取り込みおよび選択された阻止 行特異的ＤＮＡの発現を評価するための特異的アッセイを含む。そのようなアッ セイは、取り込み後の標的ＤＮＡの位置も決定し、発現された蛋白質の安定状態 濃度の保持に関する要求を確立する。効果および細胞毒性を、次に試験すること ができる。毒性は、細胞生存性を含むのみならず細胞機能も含む。 流体スペースに関連した細胞によるＤＮＡ取り込みは、流体スペースへの精製 ＤＮＡ調製物の単なる注射後に細胞外スペースからＤＮＡを取り出す唯一の能力 を有する。この方法によるＤＮＡの発現は数カ月の間維持できる。 飲食作用を経たナノメーターサイズの粒状複合体への製剤化によるＤＮＡ取り 込みは、細胞外スペースから外来遺伝子を取り出す細胞種の範囲を増大させる。 製剤は、ＤＮＡとの非共有複合体を形成して細胞膜を通したＤＮＡ運搬を指示 することが可能なＤＮＡ運搬体も含む。これは、飲食作用および高められたエン ドソーム放出を含む工程の配置を含んでよい。運搬体は核膜を通したＤＮＡの運 搬も含むことが好ましい。例えば、以下を参照されたく、それらすべては引用に より編入される：（１）Woo et al.，1992年３月20日に出願の「ＤＮＡ運搬体シ ステムと使用法」と題する米国特許07/855,389号；（２）Woo et al.，1993年３ 月19日出願の「ＤＮＡ運搬体システムおよび使用法」と題するPCT/US93/02725（ 米国および他の国を指定）；（３）代理人記録番号205/012を付されているがま だ米国出願番号は付されていない、1993年12月４日に出願された「ＤＮＡ運搬体 システムと使用法」と題するWoo et al.，の一部継続出願。 さらに、細胞または組織特異的プロモーターを含むことにより、送達は細胞特 異的または組織特異的でありうる。さらに、ｍＲＮＡ安定化配列（３’ＵＴＲの ）を用いることにより、安定化された修飾リセプター分子を提供することができ る。そのような安定化配列はｍＲＮＡの半減期を増加させて、細胞または組織特 異的 となりうる。上記は米国特許第5,298,422号（Schwartz et al.）および１９９４ 年３月９日に出願された「発現ベクター系と使用法」と題する米国出願番号第08 /209,846号（Schwartz et al.）に記載されている。両者は、図面も含めて引用 により全体を編入される。 ＤＮＡ運搬体系を包含する好ましい投与法において、ＤＮＡ運搬体系は、表面 リガンドに共有結合させたＤＮＡに非共有結合可能な結合分子とのＤＮＡ結合複 合体を有する。該表面リガンドは、細胞表面リセプターに結合することができ、 且つ飲食作用、飲作用またはポトサイトース（potocytosis）への侵入を刺激す ることができる。さらに、第２ＤＮＡ結合複合体は、ＤＮＡに非共有結合するこ とができ、且つ核リガンドに共有結合する。核リガンドは、核核を通して運搬体 系を認識および運搬することができる。さらに、ＤＮＡに非共有結合可能でもあ る第３ＤＮＡ結合複合体を使用してもよい。第３結合分子は、飲食作用後にエン ドソームの溶解またはエンドソームからの複合体の高められた放出を誘導する要 素に共有結合する。該結合分子はスペルミン、スペルミン誘導体、ヒストン、カ チオン性ペプチドおよび／またはポリリジンでありうる。Szoka，C．F.，Jr．et al.，Bioconjug．Chem．4：85-93（1993）；Szoka，F．C．Jr．et al.，P.N.A. S.，90：893-897（1993）を参照されたい。 直接の遺伝子運搬は極めて効果的であった。関節組織へのＤＮＡの直接の注射 が注射エリアにおける遺伝子発現をもたらすことを実験が示す。変異リセプター を含むプラスミドの関節スペースへの注射は延長された期間の遺伝子発現をもた らす。注射されたＤＮＡは非組み込み染色体外状況を存続させるらしい。運搬の この手段は好ましい態様である。 送達のために使用される製剤も、リポソームまたはカチオン脂質によってよい 。リポソームは細胞膜を形成する脂質と同じ様式で配列した脂質からなる中空の 球体小胞である。それらは、水溶性化合物をトラップするための内部水性スペー スを有し、そして直径０．０５から数ミクロンの大きさの範囲である。幾つかの 研究は、リポソームは核酸を細胞に送達すること、および核酸は生物活性を維持 することを示した。カチオン脂質製剤、例えばＤＯＴＭＡを取り込んだ製剤は、 対 応する蛋白質の生成を生じる細胞にＤＮＡ発現ベクターを送達することが示され た。脂質製剤は、組成物中で非毒性かつ生物分解性であってよい。それらは、長 い循環半減期を有し、認識分子は組織への標的のためにそれら表面に容易に付着 されうる。最後に、リポソームに基づく薬剤の液体懸濁液または凍結乾燥製剤の いずれかにおける経済的に効果のある製造は、この技術の受容可能な薬剤送達系 としての実施可能性を証明した。Szoka，F．C.，Jr．et al.，Pharm．Res.，7： 824-834（1990）；Szoka，F．C.，Jr．et al.，Pharm．Res.，9：1235-1242（19 92）。 選択された送達法は、核または細胞質の蓄積および最適用量をもたらすべきで ある。用量は疾患および投与ルートに依存するが、１−１０００μｇ／ｋｇ体重 の間であるべきである。このレベルは、標準法により容易に決定される。それは 、多かれ少なかれ最適用量に依存しうる。治療の期間は疾患の兆候にわたり伸び 、たぶん連続する。投与の回数は、疾患、製剤および臨床試験からの効果データ に依存する。 ベクターに関して、ベクターの薬学上の用量および適当な細胞種における遺伝 子発現レベルは、限定されないが、（１）蛋白質の生成を増加させるか；（２） 蛋白質の生成を低下させるかまたは停止するか；（３）蛋白質の作用を阻害する か；（４）特定の細胞種の増殖または蓄積を阻害するか；そして（５）特定の細 胞種の増殖または蓄積を誘導するかの何れかに十分な蛋白質またはＲＮＡを含む 。一例として、関節において炎症性細胞の蓄積を引き起こす蛋白質を生成するな らば、この蛋白質の発現は阻害できるか、またはこの蛋白質の作用を干渉するか 、変更するかまたは変化させうる。エピソームベクターを用いた永続発現 以下の各々の実施例において、組換え遺伝子の一時的発現は所望の生物応答を 誘導する。幾つかの疾患においては、組換え遺伝子のより永続的な発現が望まれ る。これは、ＤＮＡの染色体外（エピソーム）の複製を可能にする要素をベクタ ー構造に添加することにより達成される。エピソーム複製可能なベクターは染色 体外分子として保持されて複製しうる。これらの配列は単純な分解により排除さ れないが、コピーされ続ける。エピソームベクターは延長されたかまたは永続の 発現を提供するが、必然的に安定または永続ではなく、関節における組換え遺伝 子の発現を提供する。安定な発現に対する永続は、疾患が時間につれて進行する ように、組換え遺伝子産物の薬学上の用量における調節を可能にすることが望ま れる。関節細胞内への遺伝子送達のための製剤 最初の実験は、関節細胞への遺伝子運搬のための製剤においてＤＮＡを用いた 。このＤＮＡは、分泌および飲作用により滑液を連続して再吸収して改編する滑 膜細胞の経過の間、該細胞により取り込まれる。遺伝子送達は、接触した細胞へ のＤＮＡベクターの侵入を高めるカチオン脂質、親水性（カチオン）ポリマーま たはポリカチオンで濃縮したＤＮＡベクターを用いて粒子にＤＮＡをパッケージ ングすることにより高められる。製剤は、エンドソーム放出を高めることが可能 な要素、例えばアデノウイルス、インフルエンザウイルスヘマグルチニン、合成 ＧＡＬＡペプチドまたはバクテリア毒素からの特定の表面蛋白質を取り込むこと により、細胞本体へのＤＮＡ侵入をさらに高めてよい。製剤は、関節内の細胞の 表面上にリセプターを結合することが可能であり、且つ取り込みおよび発現を高 めることが可能な要素を取り込んで、細胞へのＤＮＡベクターの侵入をさらに高 めてよい。別法として、ポリカチオンと複合させた粒子ＤＮＡは、単球または他 の炎症性細胞による食作用のための十分な基質でありうる。さらに、炎症してい る関節へ血管外遊出することができるＤＮＡベクターを含む粒子は、関節細胞へ の遺伝子運搬に用いることができる。当業者は、上記製剤が他の組織でも同様に 使用可能であることを認識するであろう。関節細胞へのステロイドリセプターの遺伝子運搬による「ステロイド応答」の誘 導 幾つかの関節炎のための現在の治療は、炎症応答を軽減するためのステロイド を含有する薬剤の投与を含む。ステロイドは、関節スペースへの直接の注射によ り全身または局所投与できる。 ステロイドは、細胞の細胞質内におけるリセプターへの結合により通常は機能 する。ステロイドリセプター複合体の形成はリセプター構造を変化させて、核へ の転移が可能になり、そして細胞ゲノム内で特定の配列に結合可能になり、そし て特定の遺伝子の発現を変更することが可能になる。ステロイドリセプターの遺 伝修飾は、このリセプターが非天然ステロイドを結合可能なようにすることがで きる。他の修飾は、天然または合成ステロイドの処置後に天然ステロイドリセプ ターが遺伝子発現を制御するのと同じ方法において、ステロイドの不在下でＤＮ Ａに結合して遺伝子発現を制御できることを意味する「構成的に活性」である変 異ステロイドリセプターの創製が可能になる。 特に重要なのは、関節炎の治療に利用可能な効果的な薬剤である、グルココル チコイド、例えばコルチゾン、ヒドロコルチゾン、プレドニソン、またはデキサ メタソンの作用である。関節炎を治療する一つのアプローチは、核酸カセットが 遺伝上修飾されたステロイドリセプター、例えば、グルココルチコイドの作用を 模倣するが作用のためにグルココルチコイドを必要としない遺伝修飾ステロイド リセプターを関節細胞内で発現するようなベクターを導入することである。これ は、上記融合リセプター蛋白質または他の変異グルココルチコイドリセプター、 例えば関節細胞内で構成的に活性なものの発現により達成される。これは、これ らの薬剤の全身の毒性無しにステロイドの治療効果を誘導する。 別法として、新規で通常は不活性なステロイドにより活性化されるステロイド リセプターの構築は、このリセプターを取り込む細胞のみに影響するはずの薬剤 の使用を可能にする。これらの戦略は、これらの薬剤に関連した極度の全身併発 症無しに関節炎に対するステロイドからの治療効果を得る。特に重要なのは、特 定の細胞種に対して個別にこれら標的遺伝子を標的として（例えば、滑膜細胞対 リンパ球）、これらの細胞の活性に影響する能力である。 遺伝子制御蛋白質のステロイドリセプターファミリーは、そのような分子の理 想的なセットである。これらの蛋白質は、そのリガンドがステロイドからレチノ イン酸、脂肪酸、ビタミン、甲状腺ホルモンおよび他の現在未同定の小分子にわ たる範囲でありうるリガンド活性化転写因子である。これらの化合物はリセプタ ーに結合して転写を活性化または抑制する。 本発明の好ましいリセプターは、グルココルチコイドリセプター、即ち融合蛋 白質リセプターの修飾である。これらのリセプターは、その構造が天然に生じる リガンドとは異なるさまざまなリガンドに結合可能になるように修飾されうる。 例えば、アミノ酸配列中の小さなＣ末端の変化および削除は、プロゲステロンリ セプターへのリガンド結合の親和性の変化をもたらす。リセプターの変異をスク リーニングすることにより、宿主細胞の内在リセプターを活性化しないリガンド に応答するように、リセプターをあつらえることができる。 しかしながら、当業者は、さまざまな変異、例えばカルボキシル末端アミノ酸 の短い欠失が特定のステロイドホルモンリセプター蛋白質の有用な変異体の創製 に必要であることを認識するであろう。変異されてよいステロイドホルモンリセ プターは、ステロイドホルモンリセプタースーパーファミリーからなるあらゆる リセプターであり、例えばエストロジェン、プロゲステロン、グルココルチコイ ド−α、グルココルチコイド−β、ミネラルコルチコイド、アンドロジェン、甲 状腺ホルモン、レチノイン酸、およびビタミンＤ３リセプターである。筋肉への直接のＤＮＡ送達 多くの異なる理由により異常な筋肉発達をもたらす疾患は、上記修飾グルココ ルチコイドリセプターを用いて治療することができる。これらの疾患は、変異リ セプター遺伝子産物の生成をもたらす本発明の変異グルココルチコイドリセプタ ーをコードする遺伝子の直接の送達を用いて治療することができる。抑制または 活性化できる遺伝子は前に詳細に概要を記載された。肺への直接のＤＮＡ送達 重病の喘息のための現在の治療は、喘息応答を阻害するステロイドを含む薬剤 の投与を含む。ステロイドは肺への直接の点滴または送達により全身または局所 投与できる。 特に重要なのは、喘息の治療に利用可能な最も効果的な薬剤である、グルココ ルチコイド、例えばコルチゾン、ヒドロコルチゾン、プレドニソン、またはデキ サメタソンの作用である。喘息を治療する一つのアプローチは、核酸カセットが 遺伝上修飾されたステロイドリセプター、例えば、グルココルチコイドの作用を 模倣するが作用のためにグルココルチコイドを必要としない遺伝修飾ステロイド リセプターを肺細胞内で発現するようなベクターを導入することである。これは 、上記融合リセプター蛋白質または他の変異グルココルチコイドリセプター、例 えば肺細胞内で構成的に活性なものの発現により達成される。これは、これらの 薬剤の全身の毒性無しにステロイドの治療効果を誘導する。 別法として、新規で通常は不活性なステロイドにより活性化されるステロイド リセプターの構築は、このリセプターを取り込む細胞のみに影響するはずの薬剤 の使用を可能にする。これらの戦略は、これらの薬剤に関連した極度の全身併発 症無しに喘息に対するステロイドからの治療効果を得る。特に重要なのは、特定 の細胞種に対して個別にこれら標的遺伝子を標的として（例えば、肺の肺胞）、 これらの細胞の活性に影響する能力である。 遺伝子制御蛋白質のステロイドリセプターファミリーは、そのような分子の理 想的なセットである。これらの蛋白質は、そのリガンドがステロイドからレチノ イン酸、脂肪酸、ビタミン、甲状腺ホルモンおよび他の現在未同定の小分子にわ たる範囲でありうるリガンド活性化転写因子である。これらの化合物はリセプタ ーに結合して転写を亢進制御（up-regulate）または抑制制御（down-regulate） する。 本発明の好ましいリセプターは、修飾されたグルココルチコイドリセプター。 これらのリセプターは、その構造が天然に生じるリガンドとは異なるさまざまな リガンドに結合可能になるように修飾されうる。例えば、アミノ酸配列中の小さ なＣ末端の変化および削除は、リガンドの親和性を変化させて機能を変化させる 。リセプターの変異をスクリーニングすることにより、宿主細胞自身のリセプタ ーを活性化しないリガンドに応答するように、リセプターをあつらえることがで きる。 しかしながら、当業者は、さまざまな変異、例えばカルボキシル末端アミノ酸 の短い欠失が特定のステロイドホルモンリセプター蛋白質の有用な変異体の創製 に必要であることを認識するであろう。変異されてよいステロイドホルモンリセ プターは、ステロイドホルモンリセプタースーパーファミリーからなるあらゆる リセプターであり、例えばエストロジェン、プロゲステロン、グルココルチコイ ド−α、グルココルチコイド−β、ミネラルコルチコイド、アンドロジェン、甲 状腺ホルモン、レチノイン酸、およびビタミンＤ３リセプターである。遺伝子スイッチとしての変異グルココルチコイドリセプター 上記方法に加えて、引用により編入される（図面も含む）、Vegeto et al.， による、「変異ステロイドホルモンリセプター、それらの使用法および遺伝子治 療のための分子スイッチ」と題された1992年９月２日出願の米国出願番号第07/9 39,246号に記載されたとおりに、変異グルココルチコイドリセプターを遺伝子ス イッチとして使用することができる。本発明の前記構築物を用いることにより、 グルココルチコイド応答要素（”ＧＲＥ”）含有プロモーターを使用して共トラ ンスフェクトされた標的の治療用遺伝子を発現することができる。ＧＲＥプロモ ーターは、本発明の構築物のリガンド結合ドメインの活性化に際して、治療用遺 伝子の発現を作動させるか、活性化するかまたはトランス活性化するであろう。 治療用蛋白質は分泌蛋白質、例えば抗延焼サイトカインでありうる。そのような 方法により、トランスフェクトされた組織へのより大規模な作用が可能になる。 当業者は、本発明が、目的を実行して記載された結果および利点、並びにその 内在物を得るために適合されることを容易に認識するであろう。本明細書に記載 された変異ステロイドリセプター、並びに方法、手続き、処理、分子、特定の化 合物は好ましい態様の代表であり、例示であり、発明の範囲を限定するために意 図されたものではない。その中の変更および他の使用は、請求の範囲により定義 される発明の範囲ないに包含されることを当業者は思い浮かべるであろう。 当業者は、発明の範囲および精神から離れることなく、本明細書に開示された 発明に対して変更のための置換および修飾がなされてよいことを、容易に認識す るであろう。 明細書に言及されたすべての特許および刊行物は、発明が属する分野のレベル を示唆する。すべての特許および刊行物は、個々の刊行物が特別に且つ個別に引 用により編入されるように、本明細書に取り込まれる。 配列表

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 35/76 Ａ６１Ｋ 35/76 38/00 48/00 48/00 Ｃ０７Ｋ 14/72 Ｃ０７Ｋ 14/72 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ツァイ，ミン−ジャー アメリカ合衆国テキサス州77005，ヒュー ストン，シャーロット 6014 (72)発明者 レデバー，ハリー・シー，ジュニアー アメリカ合衆国テキサス州77380，スプリ ング，ブッド・ロード 26001，ナンバー 2501 (72)発明者 キッテル，ジョゼフ・ディー，ジュニアー アメリカ合衆国テキサス州77090，ヒュー ストン，サイプレス・ステーション・ドラ イブ 601，ナンバー307

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ＤＮＡ結合ドメイン、および遺伝子発現をトランス活性化およびトランス 抑制することができるトランス制御ドメインからなるグルココルチコイドリセプ ター領域；および 非天然リガンドを結合することができる変異プロゲステロンリセプターリ ガンド結合領域 からなる融合蛋白質からなる、非天然リガンドを結合することができる、修飾さ れたグルココルチコイドリセプター。 ２．変異プロゲステロンリセプターリガンド結合領域が、プロゲステロンリセ プターリガンド結合ドメインの約４２から５４のアミノ酸の欠失により変異され ている、請求項１記載の修飾されたグルココルチコイドリセプター。 ３．変異プロゲステロンリセプターリガンド結合領域が、プロゲステロンリセ プターリガンド結合ドメインの６４０から８９１のアミノ酸からなる、請求項１ 記載の修飾されたグルココルチコイドリセプター。 ４．変異プロゲステロンリセプターリガンド結合領域が、プロゲステロンリセ プターリガンド結合ドメインの６４０から９１７のアミノ酸からなる、請求項１ 記載の修飾されたグルココルチコイドリセプター。 ５．変異プロゲステロンリセプターリガンド結合領域が、プロゲステロンリセ プターリガンド結合ドメインの６４０から９２０のアミノ酸からなる、請求項１ 記載の修飾されたグルココルチコイドリセプター。 ６．リガンド結合活性を持たないリガンド結合ドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン 、およびリガンド結合活性無しに構成的に遺伝子発現をトランス活性化またはト ランス抑制することができるトランス制御ドメインからなる、修飾されたグルコ コルチコイドリセプター。 ７．ＤＮＡ結合ドメイン、および遺伝子発現をトランス活性化することができ るがトランス抑制できない変異トランス制御ドメインからなるグルココルチコイ ドリセプター領域；および 変異リセプター結合ドメイン からなる、非天然リガンドを結合することができる、修飾されたグルココルチコ イドリセプター。 ８．ＤＮＡ結合ドメイン、および遺伝子発現をトランス抑制することができる がトランス活性化できない変異トランス制御ドメインからなるグルココルチコイ ドリセプター領域；および 変異リセプター結合ドメイン からなる、非天然リガンドを結合することができる、修飾されたグルココルチコ イドリセプター。 ９．ＤＮＡ結合ドメイン、トランス制御ドメイン、およびリガンド結合ドメイ ンの約２−５のカルボキシル末端アミノ酸を欠失することにより変異されており 且つ非天然リガンドを結合することができる変異リガンド結合ドメインからなる 、非天然リガンドを結合することができる、修飾されたグルココルチコイドリセ プター。 １０．リガンド結合ドメインの７６２および７６３のアミノ酸を欠失市、且つ ７５２位のアミノ酸をアラニンに変更し、そして７５３位のアミノ酸をアラニン に変更することにより変異された、請求項９記載の修飾されたグルココルチコイ ドリセプター。 １１．請求項１、６、７、８または９記載の修飾されたグルココルチコイドリ セプターをコードする核酸配列。 １２．請求項１、６、７、８または９記載の修飾されたグルココルチコイドリ セプターをコードする核酸配列を含み、且つ修飾グルココルチコイドリセプター を発現することができる、ベクター。 １３．請求項１２記載のベクターによりトランスフェクトされた細胞。 １４．請求項１２記載のベクターにより形質転換された細胞。 １５．請求項１２記載のベクターにより細胞を形質転換することからなり、但 し、形質転換細胞は非天然リガンドによるグルココルチコイド応答遺伝子の発現 を制御できる修飾グルココルチコイドリセプター蛋白質を発現する、修飾グルコ コルチコイドリセプター蛋白質の使用方法。 １６．非天然リガンドがＲＵ４８６である、請求項１５記載の方法。 １７．制御がグルココルチコイド応答遺伝子のトランス活性化である、請求項 １５記載の方法。 １８．制御がＮＦ_K−ＢおよびＡＰ−１制御される遺伝子のトランス活性化で ある、請求項１５記載の方法。 １９．形質転換細胞が筋肉細胞、肺細胞または滑膜細胞からなる群から選択さ れる、請求項１５記載の方法。 ２０．修飾されたグルココルチコイドリセプター蛋白質をコードする請求項１ ２記載のベクターでインサイチュにおいて関節関連細胞を形質転換する工程から なり、形質転換細胞は非天然リガンドによるグルココルチコイド応答遺伝子の発 現を制御できる修飾グルココルチコイドリセプター蛋白質を発現する、関節炎の 治療方法。 ２１．非天然リガンドがＲＵ４８６である、請求項２０記載の方法。 ２２．制御がグルココルチコイド応答遺伝子のトランス活性化である、請求項 ２０記載の方法。 ２３．制御がＮＦ_K−ＢおよびＡＰ−１制御される遺伝子のトランス活性化で ある、請求項２０記載の方法。 ２４．修飾されたグルココルチコイドリセプター蛋白質をコードする請求項１ ２記載のベクターでインサイチュにおいて肺細胞を形質転換する工程からなり、 形質転換細胞中で発現された修飾グルココルチコイドリセプター蛋白質は非天然 リガンドによるグルココルチコイド応答遺伝子の発現を制御できる、喘息の治療 方法。 ２５．非天然リガンドがＲＵ４８６である、請求項２４記載の方法。 ２６．制御がグルココルチコイド応答遺伝子のトランス活性化である、請求項 ２４記載の方法。 ２７．制御がＮＦ_K−ＢおよびＡＰ−１制御される遺伝子のトランス活性化で ある、請求項２４記載の方法。 ２８．細胞を形質転換するのに十分な時間請求項１２記載のベクターを細胞に 接触させる工程からなるが、但し形質転換された細胞がベクターによりコードさ れる修飾グルココルチコイドリセプター蛋白質を発現する、インサイチュにおけ る形質転換細胞の作成方法。 ２９．その細胞が請求項１２記載のベクターを含む、トランスジェニック動物 。 ３０．ｐＧＲ０４０３Ｒと称するプラスミド。 ３１．請求項３０記載のプラスミドにより形質転換された細胞。