JPH06508509A

JPH06508509A - 応答要素組成物およびそれを用いるアッセイ

Info

Publication number: JPH06508509A
Application number: JP4508797A
Authority: JP
Inventors: スコブ，ヘンリィ　エム．; エバンス，ロナルド　エム．; ウメソノ，カズヒコ
Original assignee: ザ　ソールク　インスチチュート　フォア　バイオロジカル　スタディズ
Priority date: 1991-03-19
Filing date: 1992-03-13
Publication date: 1994-09-29
Also published as: CA2100584A1; US20030099926A1; DE69231689D1; EP0576590A1; EP0576590B1; AU1657892A; ATE199169T1; DE69231689T2; WO1992016546A1; US6492137B1; EP0576590A4; AU668683B2; US7189510B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】２１、細胞はＣＶ−１，ＣＯ３，Ｆ９．ＣＨＯ。

ＨｅＬａ、ＮＩＨ３Ｔ３．ＨｕＴｕ８０．Ｒａ　ｔ　２線維芽細胞、　ＨＴ１０８０．　Ｔ、ニワトリ胚線維芽細胞、ウズラＱＴ６．　またはショウジヨウバエ・シュナイダーＳ２細胞から選択されるタイプの哺乳類、鳥類または昆虫細胞である請求項２０記載の細胞。

２２、関心遺伝子の発現を制御する方法において、請求項２０記載の細胞を適当なリガンドおよびその関連受容２体の存在下または不存在下に培養することを含む方法。

２３、ステロイド／サイロイドスーパーファミリー受容体のメンバーに対するリガンドのアゴニストとしての試験化合物の活性を試験する方法において。

（ａ）ステロイド／サイロイドスーパーファミリー受容体のメンバーの存在下、またさらに試験化合物の存在下もしくは不存在下に、請求項２０記載の細胞を培養し、ついて。

２４、ステロイド／サイロイドスーパーファミリー受容体のメンバーに対するリガンドのアンタゴニストとしての試験化合物の活性を試験する方法において。

（ａ）ステロイド／サイロイドスーパーファミリー受容体のメンバー、および上記リガンドの存在下、またさらに、（１）試験化合物の存在下もしくは（ｉｉ）試験化合物の不存在下に、請求項２０記載の細胞を培養し、ついて。

（ｂ）（ｉ）および（ｉｉ）培養工程時に発現した関心蛋白質の量を比較することを含む方法。

２５、ステロイド／サイロイドスーパーファミリー受容体の第一のメンバーに対するリガンドへの応答性が、ステロイド／サイロイドスーパーファミリーの少なくとも一つのメンバーに独特の経路を介して生じるか否かを。

上記スーパーファミリーの他のメンバーに比較して、識別する方法において。

請求項１８記載のベクターを上記第一受容体に対するリガンドと接触させ、そして第一および第二の受容体の発現ベクターの比率を変動させ、ついで第一の受容体と第二の受容体の比率を増大させた場合の、上記リガンドによる上記応答要素の転写活性の修飾に対する効果を測定することを含む方法。

２６、ステロイド／サイロイドスーパーファミリーのオーファン受容体のメンバーに対するリガンドとして作用する化合物を同定するための化合物のスクリーニング方法において。

上記化合物を請求項２０記載の細胞と接触させ、この場合、上記細胞はステロイド／サイロイドスーパーファミリーの受容体の上記メンバーに対する発現ベクターでさらにトランスフェクトし、上記受容体は、その同系リガンドの存在下に、配列：５−ＲＧＢＮＮＭ−［（Ｎ）、−ＲＧＢＮＮＭＩアー３゛（式中、それぞれＲは独立にＡまたはＧから選択され。

それぞれＢは独立にＧ、ＣまたはＴから選択され、それぞれＮは独立にＡ、Ｔ、ＣまたはＧから選択され、それぞれＭは独立にＡまたはＣから選択される。ただしヌクレオチドのそれぞれの−ＲＧＢＮＮＭ−基の少なくとも４つのヌクレオチドは配列−ＡＧＧＴＣＡ−の相当する位置におけるヌクレオチドと同一である。

Ｘは０または２から１５までの整数であり、ｙは少なくともｌである）を有する実質的に純粋なりＮＡに結合可能であり。

ついて、レポーター蛋白質の発現の修飾をアッセイすることを含む方法。

明　細　書応答要素組成物およびそれを用いるアッセイ本発明は９合衆国国立健康研究所の助成より政府の支援を受けて行われたものである。合衆国政府はこの発明に関し所定の権利を有する。

関連出願本出願は、係属中の、　１９８９年１１月１６日付出願、一連番号第４３８．７５７号の一部継続出願であり、原出願の内容はすべて参考として本明細書に導入される。

発明の分野本発明は、ステロイド／サイロイドホルモン受容体として知られる該受容体およびそれらの同系応答要素のスーパーファミリーに関する。さらに詳しくは９本発明は。

プロモーターの転写活性の制御に使用できる新規な応答要素の発見に基づくものである。

発明の背景真核生物の分子生物学における中心的問題は、特異的なりＮＡ−結合蛋白質が細胞の機能および運命に影響する調節配列にとのように結合するかである。ステロイド／サイロイドホルモン受容体は、このような細胞機能および運命にある役割を演じていると考えられるリガンド−依存性転写因子のスーパーファミリーを形成する。たとえば、これらの受容体は、特異的エンハンサ−配列（以下、ホルモン応答要素、またはＨＲＥという）を含有する標的遺伝子に細胞外ホルモンシグナルを導入することが知られている。各受容体はりガント−結合ドメインおよびＤＮＡ−結合ドメインを含有する。受容体はリガンドか結合すると、コンフォーメーション変化を受ける。このコンフォーメーション変化が、受容体−リガント複合体のその同系応答要素への結合を可能にし、それにより関連プロモーターの転写活性を調節する。プロモーターの転写活性化が、操作的に関連した構造遺伝子の転写を駆動する。

ホルモン受容体たとえば糖質コルチコイド受容体（ＧＲ）の配列比較および変異分析により、転写活性化および抑制、核局在、ＤＮＡ結合、ならびにホルモン結合に関係する機能性ドメインが同定されてきた。転写を活性化するのに必要なりＮＡ結合ドメインは、６６〜６８アミノ酸から構成され、その中の９個のシスティン（Ｃ。

〜Ｃ，）を含む約２０部位は異なる受容体間で不変である。

この受容体スーパーファミリーのメンバーのモジュール構造が一つのドメインの他のドメインへの転換２機能的キメラ受容体の創製を可能にする。

これまでに同定されたホルモン応答要素は一般に構造的に類似しているが、実際１機能的には異なっている。

応答要素は、ＧＲ［すなわち、糖質コルチコイド応答要素（ＧＲＥ）］、エストロゲン受容体［すなわち、エストロゲン応答要素（ＥＲＥ）］　、およびサイロイドホルモン受容体［すなわち、サイロイドホルモン応答要素（ＴＲＥ）］について、詳細にその特徴が検討され、それぞれ、　「半部位」のパリンドローム対から構成されることか示されている［Ｅｖａｎｓ、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４０：８８９（１９８８）＋Ｇｒｅｅｎ　＆　Ｃｈａｍｂｏｎ、Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　４：３０９（１９８８）］　。

至適化された偽またはコンセンサス応答要素では、　ＧＲＥとＥＲＥには、半部位につき２つのヌクレオチドでしか相違しない［Ｋｌｏｃｋら、Ｎａｔｕｒｅ　３２９ニア３４（１９８７）　］　。一方、ＥＲＥとＴＲＥには同一の半部位を認めることができるが、それらのスペーシングは異なっている［Ｇｌａｓｓら、Ｃｅ１１５４：３１３（１９８８）］　、しかも、ＴＲＥはＣＶ−１細胞中にトランスフェクトされたレチノイン酸による転写活性化の仲介を示すが、トランスフェクトされていない細胞では応答を示さないことか明らかにされている［Ｕｍｅｓｏｎｏら、３３６：２６２（１９８８）　］　、換言すれば、ＴＲおよびＲＡＲの両受容体がＴＲＥを活性化できる。

しかしなから、現在まで、ステロイド／サイロイドスーパーファミリー受容体のわずか数個のメンバーについての応答要素しか同定されていない。このスーパーファミリーの多くの池のメンバーの応答要素、またそれらの間に関係があるとしても、その関係については全く報告本発明者らは、ステロイド／サイロイドスーパーファミリー受容体のいくつかのメンバーのリガンドに細胞内プロモーターの転写活性化および／または抑制の応答性を付与する機能をもつ応答要素であるＤＮＡセグメントを発見した。本発明者らはまた１本発明の応答要素の転写活性修飾作用は、ステロイド／サイロイドスーパーファミリー受容体のいくつかのメンバーについてのリガンドの存在下にすべての哺乳動物細胞に生じることを発見した。これは本発明の応答要素によって認識される様々なホルモン受容体がこれらの細胞のすべてに内在的に存在することを示している。

ＧＲＥ、ＥＲＥおよびＴＲＥについて本技術分野において以前報告されていたのとは異なり、ここに開示される新規な応答要素はＧＲＥ、ＥＲＥおよびＴＲＥについて以前報告されていたパリンドローム配列ではなくて。

縦列反復配列を存する。さらに１本発明の応答要素は。

以前に報告されている応答要素（ＧＲＥ、ＥＲＥおよびＴＨＥ）に比べて、非同系受容体による転写活性化をはるかに受けにくい。

本発明の応答要素および機能性プロモーターからなる転写制御領域を使用することにより、転写（この場合。

発現も）かプロモーターの制御下に置かれ、転写活性化かステロイド／サイロイドスーパーファミリー受容体のいくつかのメンバーについてのリガンドに応答する（またそれによって修飾される）遺伝子を含有する組換えＤＮＡベクターの提供が可能になる。

図１は、マウスβＲＡＲプロモーター領域および第一エクソンの配列を表す。ＴＡＴＡおよび−ＡＧＧＴＣＡ−モチーフには下線を付し、第一エキソン接続部位は矢印で示す。

図２（ａ）は、ＲＡＲβＲＡ応答要素配列、ならびにβレチノイン酸応答要素を含む配列の５′末端からの一連の欠失のインビボ分析を示す。

図２（ｂ）は１本明細書に記載の実験に用いられたβレチノイン酸応答要素を含むオリゴヌクレオチドの配列を示す。

図３は、いくつかのホルモン応答要素についての配列を示し、この種の配列のトリヨードサイロニン（Ｔ３）およびレチノイン酸（ＲＡ）に対する応答性をまとめる。

図４は、ＭＨＣ−ＴＲＥのＲＡＲＥ中への相互交換を例示する。

図５は１合成直接反復ホルモン応答要素の、ビタミンＤ３　（ＶＤ３）、）ＩＪヨードサイロニン（Ｔ３）およびレチノイン酸（ＲＡ）による選択的トランスアクティベーションを例示する。

発明の詳細な説明本発明によれば、配列：５’−ＲＧＢＮＮＭ−［（Ｎ）、−ＲＧＢＮＮＭ］アー３（式中、それぞれＲは独立にＡまたはＧから選択され。

それぞれＢは独立にＧ、ＣまたはＴから選択され、それぞれＮは独立にＡ、Ｔ、ＣまたはＧから選択され、それぞれＭは独立にＡまたはＣから選択される。ただしヌクレオチドのそれぞれの−ＲＧＢＮＮＭ−基の少なくとも４つのヌクレオチドは配列−ＡＧＧＴＣＡ−の相当する位置におけるヌクレオチドと同一てあり、Ｘは０または２から１５までの整数であり、ｙは少なくとも１である）を有する実質的に純粋なりＮＡを提供する。

また２本発明の応答要素は、配列５−ＡＧＧＴＣＡ−［（Ｎ）、−ＡＧＧＴＣＡＩアー３（式中、Ｎ、ｘおよびｙは上に定義した通りであって。

ヌクレオチドのそれぞれの−ＡＧＧＴＣＡ−基のヌクレオチドの１または２は上に示した定義に一致するように異なるヌクレオチドで置換することかでき、すなわち。

第一のヌクレオチドはＧで置換することができ、その基の第三のヌクレオチドはＣまたはＴで置換することができ、その基の第四のヌクレオチドはＡ、ＧまたはＣて置換することができ、その基の第五のヌクレオチドはＡ。

ＧまたはＴて置換することができ、その基の第六のヌクレオチドはＣて置換することかできる）を育する実質的に純粋なりＮＡと記載することもてきる。

本発明の他の実施態様によれば２本発明は、上述の応答要素が９通常はステロイド／サイロイドスーパーファミリー受容体のメンバーについてのリガンドによって転写活性化および／または抑制を受けないプロモーターに機能的に連結してなるＤＮＡ構築体であって、ＤＮＡおよびプロモーターは適当なりガントおよびその関連受容体の存在下に上記プロモーターに転写活性化および／または抑制活性を付与するように機能的に連結されたＤＮＡ構築体を提供する。上述の構築体はついて、転写すべき遺伝子に機能的に連結することができる。得られた遺伝子含有ＤＮＡ構築体はついで発現用ベクターに導入できる。得られたベクターはついで、適当な宿主細胞（こトランスフオームすることができる。

上述のベクターを合作する細胞はついで、適当なリガンドおよびその関連受容体の存在または不存在に応答して、関心遺伝子の発現の制御に使用できる。

本発明のさらに他の実施態様によれば１本発明は。

（本発明の応答要素が応答する）ステロイド／サイロイドスーパーファミリー受容体のメンバーに対するリガンドのアゴニストとしての試験化合物の活性を試験する方法において。

（ａ）ステロイド／サイロイドスーパーファミリー受容体のメンバーの存在下、またさらに試験化合物の存在下もしくは不存在下に、（上述したような）細胞を培養し。

ついで。

（ｂ）試験化合物の存在下もしくは不存在下における培養時に発現した関心蛋白質の量を比較する。

ことを含む方法を提供する。

本発明のさらに他の実施態様によれば９本発明は。

（本発明の応答要素か応答する）ステロイド／サイロイドスーパーファミリー受容体のメンバーに対するリガンドのアンタゴニストとしての試験化合物の活性を試験する方法において。

（ａ）ステロイド／サイロイドスーパーファミリー受容体のメンバー、および本発明の応答要素に応答する上記受容体に対するリガンドの存在下、またさらに、（ｉ）試験化合物の存在下もしくは（ｉｉ）試験化合物の不存在下に。

（上述したような）細胞を培養し、ついで。

（ｂ）（ｉ）および（ｉｉ）培養工程時に発現した関心蛋白質の量を比較する。

ことを含む方法を提供する。

本発明の他の実施態様によれば１本発明は、ステロイド／サイロイドスーパーファミリー受容体の第一のメンバーに対するリガンドへの応答性か、ステロイド／サイロイドスーパーファミリーの少なくとも一つのメンバーに独特の経路を介して生じるか否かを、ステロイド／サイロイドスーパーファミリーの他のメンバーに比較して。

識別する方法において。

（上述したような）本発明の応答要素を含有するベクターをステロイド／サイロイドスーパーファミリー受容体の上記第一のメンバーに対するリガンドと接触させ。

そして第一および第二の受容体の発現ベクターの比率を変動させ。

第一の受容体発現ベクターと第二の受容体発現ベクターの比率を増大させた場合の、ステロイド／サイロイドスーパーファミリー受容体の第一のメンバーに対する上記リガンドによる上記応答要素の転写活性化および／または抑制に対する作用を測定する。

ことを含む方法を提供する。

本発明の他の実施態様によれば２本発明は、ステロイド／サイロイドスーパーファミリー受容体のメンバーに対するリガンドとして作用する化合物を同定するための化合物のスクリーニング方法において。

上記化合物を、（上述したような）細胞と接触させ。

この場合その細胞はさらにステロイド／サイロイドスーパーファミリー受容体の上記メンバーの発現ベクターでトランスフェクトされていて、また上記受容体はその同系リガンドの存在下に本発明の応答要素と結合可能であり、ついてそのレポーター蛋白質の発現の調節をアッセイすることを含む方法を提供する。

本明細書および請求の範囲では、技術的な語句が取上げられるか、ここで使用される場合の意味を以下に明白に定義する。

ｒＲＡＲβ」または［βＲＡＲＪはいずれも、レチノイン酸受容体βを指す。

ｒＶＤＲＥ」はビタミンＤ２応答要素を意味する。

ｒＴＲＥ」はサイロイドホルモン応答要素を意味する。

「Ｔ、」はトリヨードサイロニンを意味する。

ｒＣＡＴＪはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼを意味する。

ｒＬＵｃ」はホタルルシフェラーゼを意味する。

「β−Ｇａ　Ｎはβ−ガラクトシダーゼを意味する。

「ＣＯ８」はＴ抗原（Ｔａｇ）を発現するサル腎細胞を意味する［たとえば、　Ｇｌｕｚｍａｎ、　Ｃｅ１１．２３：　１７５（１９８１）参照］。

ｒＣＶ−ＮはｒＣＶ−ＩＪと呼ばれる細胞系からのマウス腎細胞を意味する。ＣＶ−１はＣＯ８の親系統である。５Ｖ４０Ｔ抗原（Ｔａｇ）を発現するようにトランスフオームされたＣｏＳ細胞と異なり、ＣＶ−１はＴ抗原を発現しない。

「転写割面領域」または「転写制御要素Ｊは、プロモーターの転写活性にリガンド応答性を付与するようにプロモーターに機能的に連結された応答要素を含むＤＮＡセグメントをいう。

「機能的に連結される」とは、連結されたＤＮＡセグメント間の連鎖（すなわちＤＮＡセグメント）により。

連結セグメントの一方の他に対する記載の効果が発生可能であることを意味する。本明細書に述べる多様な目的での機能的な連結の達成は９本技術分野における通常の熟練者には、とくに本明細書の教示により、よく知られているところである。

「リガンドに自然には不応答なプロモーター」とは。

本発明の応答要素が組換えＤＮＡ法または遺伝子操作法により、それからの転写の方向に応じて、プロモーターからなるＤＮＡセグメント中に接合または挿入（プロモ−ターの上流）され、リガンドに機能的に応答するプロモーターに転写活性を付与するようにプロモーターに連結されないと、リガンドが細胞内で観察可能な程度のプロモーターからの転写の増大を生じないことを意味する。

「実質的な配列ホモロジー」とは１本明細書に開示され請求された実際の配列かられずかな配列変異を存するが、同し機能を維持するＤＮＡまたはＲＮＡ配列を指す。

「ステロイド／サイロイドスーパーファミリー受容体のメンバー」とは、リガンド依存性転写因子として作動するホルモン結合蛋白質を意味し、特異的なリガンドがまだ同定されていないが、確認されているステロイド／サイロイドスーパーファミリー受容体（以下、オーファン受容体という）のメンバーも包含する。このような蛋白質はそれぞれ、標的遺伝子中の特異的ＤＮＡ配列に結合する固有の能力を有する。結合後、その遺伝子の転写活性は同系ホルモン（リガンド）の存在または不存在によって修飾される。これらの該受容体すべてのＤＮＡ結合ドメインは、６６〜６８アミノ酸残基からなり、９個のシスティンを含む約２０個の不変アミノ酸残基を有する点て類似している。このスーパーファミリーのメンバーは。

これらの診断的アミノ酸残基を含有する蛋白質として同定できる。これは既知のステロイド受容体たとえばヒト糖質コルチコイド受容体（アミノ酸４２１〜４８６　）　、エストロゲン受容体（アミノ酸１８５〜２５０　）、鉱質コルチコイド受容体（アミノ酸６０３〜６６８　）　、ヒトレチノイン酸受容体（アミノ酸８８〜１５３）のＤＮＡ結合ドメインの部分である。このスーパーファミリーのメンバーのＤＮＡ結合ドメインの高度に保存されたアミノ酸は次の通りである。

Ｃｙ　ｓ−Ｘ−Ｘ−Ｃｙ　ｓ−Ｘ−Ｘ−Ａｓ　ｐ”　−Ｘ−Ａｌａ”−Ｘ−Ｇｌｙ”−Ｘ−Ｔｙｒ”−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｃｙ　ｓ−Ｘ−Ｘ−Ｃｙ　５−Ｌｙｓ” 　−Ｘ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｘ−Ａｒｇ”　−ＸＸ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ −（Ｘ−Ｘ−）Ｃｙｓ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−（Ｘ−ＸＸ−Ｘ−）Ｃｙｓ−Ｘ− Ｘ−Ｘ−Ｌｙｓ−Ｘ−Ｘ−Ａｒｇ−Ｘ−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ−Ｘ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ” −Ｘ−Ｘ−Ｌｙｓ”　−Ｃｙｓ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｇｌｙ”−Ｍｅｔ式中、ＸはＤＮＡ結合ドメイン内の非保存的アミノ酸を意味し、星印を付したアミノ酸残基はほぼ普遍的に保存されているが、一部の確認されたホルモン受容体では変異が認められるもので、括弧に括った残基は任意残基（すなわちＤＮＡ結合ドメインは、最低６６アミノ酸長を有するか、数個の付加的残基を含むことができる）である。ステロイド／サイロイドスーパーファミリー受容体のメンバーの例には、糖質コルチコイド受容体、鉱質コルチコイド受容体、プロゲステロン受容体、アンドロゲン受容体、ビタミンＤ３受容体等、さらにレチノイド受容体たとえばＲＡＲα、ＲＡＲβ、ＲＡＲγ等、サイロイド受容体たとえばＴＲα、ＴＲβ等、ならびにそれらの構造および性質により上に定義したスーパーファミリーのメンバーであると考えられる他の遺伝子産物が包含される。オーファン受容体の例としては、ＨＮＦ４　［たとえば、５ｌａｄｅｋら、Ｇｅｎｅ　＆　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　４：２３５３−２３６５（１９９０）参照］、Ｃ０ＵＰファミリー受容体［たとえば。

Ｍｉｙａｊｉｍａら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１６：１１０５７−１１０７４（１９８８）：　Ｗａｎｇ　ら、Ｎａｔｕｒｅ　３４０：１６３−１６６（１９８９）　］　、　Ｍｌｏｄｚｉｋら、Ｃｅ１１６０：２１１−２２４（１９９０）およびＬａｄｉａｓ　ら、５ｃｉｅｎｃｅ　２５１：５６１−５６５（１９９１）＋：記載サすタヨウナＣＯＵ　Ｐ様受容体およびＣ０ＵＰホモローグ、クルトラスピラクル受容体［たとえば、ＯｒＯら、Ｎａｔｕｒｅ　３４７：２９８−３０１（１９９０）参照コ等を挙げることができる。

ステロイド／サイロイドスーパーファミリーのホルモン受容体の「適当なりガント」とは、その同系受容体との組合わせで、同系受容体が結合する応答要素の転写的活性化に有効な特異的リガント（すなわち、ＲＡ／ＲＡＲ／ＲＡＲＥ、ビタミンＤ３／ビタミンＤ３受容体／　Ｖ　Ｄ　ＲＥ　、Ｔ　＊　／　Ｔ　Ｒ／　Ｔ　ＲＥ　、　エストロゲン／ＥＲ／ＥＲＥ等）をいう。

本明細書に現れる各種ヌクレオチド配列中に存在するヌクレオチドは１本技術分野で慣用される通常の一文字表示（Ａ、Ｇ、Ｔ、ＣまたはＵ）で示す。

本明細書および請求の範囲におけるギリシャ文字表示は、アルファ、ベータ等、または場合により、相当するギリシャ文字記号（α、β等）を使用する。

本発明の応答要素は、２個またはそれ以上の「半部位」から構成されることができる。この場合、各半部位は。

半部位記列中における少なくとも４個のヌクレオチドが。

配列−ＡＧＧＴＣＡ−の相当する位置において同一であることを条件に、配列− ＲＧ　Ｂ　ＮＮＭ−を含む。半部位の一つが好ましい配列−ＡＧＧＴＣＡ−と２つのヌクレオチドで相違する場合には、応答要素の他の半部位は好ましい配列と同一であるか、または好ましい配列から１ヌクレオチドを越えて変異しないことが好ましい。半部位の対の３゛半部位（下流半部位）は、好ましい配列から高々ｌヌクレオチドまでの変異であることが、現時点ては好ましい。

本発明によって意図される応答要素の例は、たとえば。

−ＡＧＧＴＣＡ−、−ＧＧＴＴＣＡ−、−ＧＧＧＴＴＡ−。

−ＧＧＧＴＧＡ−、−ＡＧＧＴＧＡ−、−ＧＧＧＴＣＡ−等から選択される配列を有する半部位の様々な組合わせから誘導される。

本発明の応答要素中に使用されるスペーサーヌクレオチド配列は、Ｃ，Ｔ、ＧまたはＡの任意の組合わせとすることがてきる。

本発明によって意図される応答要素の例には。

５’−ＡＧＧＴＣＡ−ＡＧＧ−ＡＧＧＴＣＡ−３゛。

５−ＧＧＧＴＧＡ−ＡＴＧ−ＡＧＧＡＣＡ−３’　。

５’−ＧＧＧＴＧＡ−ＡＣＧ−ＧＧＧＧＣＡ−３’　。

５’−ＧＧＴＴＣＡ−ＣＧＡ−ＧＧＴＴＣＡ−３’　。

５′−ＡＧＧＴＣＡ−ＣＡＧＧ−ＡＧＧＴＣＡ−３′　。

５’−ＡＧＧＴＧＡ−ＣＡＧＧ−ＡＧＧＴＣＡ−３’　。

５’−ＡＧＧＴＧＡ−ＣＡＧＧ−ＡＧＧＡＣＡ−３’　。

５’−ＧＧＧＴＴＡ−ＧＧＧＧ−ＡＧＧＡＣＡ−３°　。

５’−ＧＧＧＴＣＡ−ＴＴＴＣ−ＡＧＧＴＣＣ−３’　。

５’−ＡＧＧＴＣＡ−ＣＣＡＧＧ−ＡＧＧＴＣＡ−３’　。

５−ＡＧＧＴＧＡ−ＡＣＡＧＧ−ＡＧＧＴＣＡ−３’　。

５’−ＧＧＴＴＣＡ−ＣＣＧＡＡ−ＡＧＴＴＣＡ−３’　。

５−ＧＧＴＴＣＡ−ＣＣＧＡＡ−ＡＧＴＴＣＡ−３’　。

５’−ＡＧＧＴＣＡ−ＣＴＧＡＣ−ＡＧＧＧＣＡ−３’　。

５’−ＧＧＧＴＣＡ−ＴＴＣＡＧ−ＡＧＴＴＣＡ−３’　。

５−ＡＡＧＣＴＴＡＡＧ−ＧＧＴＴＣＡ−ＣＣＧＡＡ−ＡＧＴＴＣＡ−ＣＴＣＡＧＣＴＴ−３’　。

５−ＡＡＧＣＴＴＡＡＧ−ＧＧＴＴＣＡ−ＣＣＧＡＡ−ＡＧＴＴＣＡ−ＣＴＣＧＣＡＴＡＧＣＴＴ−３’　。

５’−ＡＡＧＣＴＴＡＡＧ−ＧＧＴＴＣＡ−ＣＣＧＡＡ−ＡＧＴＴＣＡ−ＣＴＣＧＣＡＴＡＴＡＴＴＡＧＣＴＴ−３′　。

等かある。

本発明によって意図される現時点て好ましい応答要素の例には。

５−ＡＧＧＴＣＡ−ＡＧＧ−ＡＧＧＴＣＡ−３’　。

５−ＡＧＧＴＣＡ−ＣＡＧＧ−ＡＧＧＴＣＡ−３’　。

５’−ＡＧＧＴＧＡ−ＣＡＧＧ−ＡＧＧＴＣＡ−３’　。

５’−ＡＧＧＴＣＡ−ＣＣＡＧＧ−ＡＧＧＴＣＡ−３’　。

５’−ＡＧＧＴＧＡ−ＡＣＡＧＧ−ＡＧＧＴＣＡ−３’　。

等がある。これらは、天然には認められていない合成配列であり、したがって広範囲のレポーターシステムに適用可能であること（すなわち、これらの応答要素の使用は、配列の起源に基づく種優先性によって限定されることがない）から、とくに好ましい。

本発明の転写制御領域の部分であるプロモーターに関しては、プロモーターの転写活性が本発明の応答要素（プロモーターから上流に適当に配置された場合）によって修飾可能である限り、実際上、任意のプロモーターが使用できる。このようなプロモーターには、マウス乳癌ウィルスのΔ−ＭＴＶプロモーター、単純ヘルペスチミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーター、基底シミアンウィルスＳＶ４０プロモーター、ショウジヨウバエアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）プロモーター等がある。

現時点で好ましいものは活性に応答要素を要求するプロモーターである。

実際に、関心ある任意の蛋白質またはポリペプチドか。

本発明の発現ベクターでトランスフオームした細胞によって製造できる。このような蛋白質には、ホルモン、リンホカイン、受容体または受容体サブユニット、免疫グロブリン鎖等が包含される。指標蛋白質たとえばＬＵＣ。

ＣＡＴ、およびβ−Ｇａｌも製造可能である。

本発明によってトランスフオームできる細胞のタイプには、哺乳類細胞、鳥類細胞、昆虫細胞等、たとえばＣＶ−１，ＣＯ３，Ｆ９．ＰＩ３．ＣＨＯ，ＨｅＬａ。

ＮｒＨ３Ｔ３．ＨｕＴｕ８０．Ｒａｔ２線維芽細胞、　ＨＴ１０８０、　Ｔ、ニワ）　ＩＪ胚線維芽細胞、ウズラＱＴ６．　ショウジヨウバエ・シュナイダーＳ２細胞等がある。

試験化合物の、ステロイド／サイロイドスーパーファミリー受容体のメンバーに対するリガンドのアゴニストまたはアンタゴニストとしての活性を測定するための本発明の方法は本技術分野の熟練者によく知られている標準アッセイ技術を使用して実施できる［たとえばＭａｎｇｅ　１ｓｄｏｒｆら、Ｎａｔｕｒｅ　３４５：２２４−２２９（１９９０）参照］。

本発明のアッセイ方法によるスクリーニングが意図される試験化合物には９本発明の応答要素を介して転写活性を修飾する受容体の能力に影響できる可能性のある任意の化合物が包含される。

ステロイド／サイロイドスーパーファミリーの受容体の第一のメンバーに対するリガンドへの応答性が第一の受容体に（そのスーパーファミリーの他のメンバーに関して）独特な経路を介して起こるか否か、または池のある経路を介して起こるかの識別を可能にする本発明の特定の実施態様によれば、第一の受容体の経路を介する上記リガンドへの応答性は上記第一の受容体の発現の増大の関数としてのトランスアクティベーション量の増加を生じ、一方、第二の受容体の経路を介する上記リガンドへの応答性は上記第二の受容体の発現の増大の関数としてのトランスアクティベーションのレベルの低下を生じる（第一の受容体の活性化に必要なリガンドに対する第二の受容体による競合によって起こる）。

本明細書の主題に関連する受容体、アッセイ法、および他の主題については、以下の引例に記載されている。

これらは、参考として２本明細書に導入する。すなわち。

共通に譲渡された合衆国特許出願一連番号笛１０８．４７１号（１９Ｂ７年１０月２０日出願）およびＰＣＴとして公開された国際公開Ｗ　Ｏ８８，０３１６８号、共通に譲渡された合衆国特許出願一連番号笛２７６、５３６号（１９８８年１１月３０日出願）および欧州特許出願として公開された公開第０３２５８４９号。

共通に譲渡された合衆国特許出願一連番号笛３７０．４０７号（１９８９年６月２２日出願、この出願には、γ−レチノイン酸受容体をコードするｃＤＮＡを撃留するプラスミドのブダペスト協定による寄託が掲示されている。この寄託は１９８９年６月２２日に行われ、　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ受人番号４０６２３号が付されている）　、　Ｚｅｌｅｎｔら、Ｎａｔｕｒｅ　３３９ニア１４（１９８９）　、Ｐｅｔｋｏｖｉｃｈ　ら、Ｎａｔｕｒｅ　３３０：４４４（１９８７）　、　Ｂｒａｎｄら、Ｎａｔｕｒｅ　３３２：８５０（１９８８）である。

本発明の応答要素からなるＤＮＡセグメントは比較的短いので、これらは合成的に、すなわち本技術分野でよく知られているように、ＤＮＡシンセサイザー上で応答要素含有オリゴヌクレオチドを合成することによって提供できる。合成応答要素には、ＤＮＡ発現ベクター中の。

転写活性を増大させ所望の遺伝子の転写を駆動するためのプロモーターの上流部位への挿入に便利なように、そのオリゴマーの３“および５′末端に制限エンドヌクレアーゼ部位を設けることか、多くの場合きわめて望ましい。本技術分野の通常の熟練者には明らかなように９本発明の応答要素は、他の応答要素と同様に、方向に依存せず、また広範囲の位置非依存性を示す。すなわち１本発明の応答要素はいずれの方向でも機能し１作動するプロモーターの約３０ヌクレオチド上流から約１０．０００ヌクレオチド上流までの任意の便利な位置に配置できる。

本発明の応答要素からなる転写制御領域を用いる発現系を使用するのに好ましい細胞は、哺乳類細胞たとえばＣｏＳ細胞およびＣＶ−１細胞である。ＣＯ３−１（以下ＣＯ３という）細胞は５Ｖ４０Ｔ抗原（Ｔａｇ）を発現するマウス腎臓細胞であり、一方、ＣＶ−１細胞はＳＶ４０Ｔａｇを発現しない。ＣＶ−１細胞は、低レベルのβＲＡＲを産生ずるほかは、内因性の糖質コルチコイドもしくは鉱質コルチコイドまたは池の既知のステロイド／サイロイドスーパーファミリーのホルモン受容体のメンバーを欠くので２便利である。すなわち２本発明の転写制御領域の制御下にある異種遺伝子からなる適当な発現ベクターでの遺伝子トランスファーを介して、これらの宿主細胞を、ステロイド／サイロイドスーパーファミリー受容体のメンバーに対するリガンドによる誘導に応答して所望の蛋白質を大量に産生ずるトランスフオーム細胞に変換できる。

ＳＶ４０複製の起源を含有する発現プラスミドは。

ＳＶ４０Ｔａｇを発現する任意の宿主細胞中で高コピー数に増幅できる。したがって、ＳＶ４０複製の起源をもつ発現プラスミドはＣＯ８細胞中で複製可能であるが、ｃｖ−１細胞中では複製できない。高コピー数によって得られる発現の増加は望ましいものではあるが、ここに記載されたアッセイ系に必須ではない。宿主として特定の細胞の使用も必須ではないが、現時点ではとくに便利であるという点からＣＶ−１細胞が好ましい。

本発明を、参考としての以下の非限定的実施例により。

さらに詳細に説明する。

以下は、マウスＲＡＲβ遺伝子のプロモーター中の配列はレチノイン酸（ＲＡ）応答性を付与し、これらの配列は３つのＲＡ受容体サブクラス（すなわちアルファー。

ベーターおよびガンマ−ＲＡＲ）に対して特異的な標的であることを示す。ＲＡ応答要素（ＲＡＲＥ）はエストロゲンまたは糖質コルチコイドによる有意な転写活性化を仲介しないか、ビタミンＤ受容体またはサイロイドホルモン受容体による転写活性化を弱く（約１オーダー以上低い）仲介する（同系リガンドとの複合）。

λベクターＥＭＢＬａ中のマウス肝ゲノムＤＮＡライブラリー（Ｃ１ｏｎｅｔｅｃｈ　）をヒトＲＡＲβｃ　ＤＮＡクローンＢ　１−　ＲＡ　Ｒｅ　［Ｂｅｎｂｒｏｏｋら、Ｎａｔｕｒｅ　３３３：　６６９−６７２（１９８８）参照］のＢａｍＨＩ　−５ｐｈ　Ｉフラグメントてスクリーニングして、ＲＡＲβ遺伝子中のＲＡＲＥを局限した。使用したプローブは、βＲＡＲ遺伝子に独特な第一エキソンの配列のみを含有する。２０　ｋｂ挿入体を撃留するクローン（約１０　ｋｂの上流配列、完全第一エキソン、および１Ｏｋｂの第一イントロンを含有）を単離し、第一エキソンを囲む領域をサブクローニングし、ジブオキソ配列分析に付した。第一エキソンおよび近位５’　ＤＮＡを含むこのクローンの部分の配列を図１に示す。これはマウスβＲＡＲプロモーター領域および第一のエキソンの配列を表示する。ＴＡＴＡおよび−ＡＧＧＴＣＡ−モチーフには下線を付す。第一エキソン接合部位は矢印で示す。

上述のようにして単離したゲノムフラグメントの１０ｋｂ上流領域を、β−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子に、ＲＡＲβ翻訳開始コドンの丁度下流にインフレイムに融合した（図２参照。βレチノイン酸応答要素を包含する配列の５゛末端からの一連の欠失による。

ＲＡＲβＲＡ応答要素のインビボ解析を示す）。マウスＲＡＲβ遺伝子とβ−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子の間の連結部の配列は示された通りである。番号を付したアミノ酸はネイティブなＲＡＲβ翻訳産物に相当する。制限部位の略号は次の通りである：Ｎ＝ＮｏｔＩ。

Ｘ＝Ｘｈｏ　Ｉ、　Ｋ＝Ｋｐｎ　Ｉ、５＝Ｓａｌ　Ｉ、　Ｎｈ＝Ｎｈｅ　Ｉ。

５ｃ＝ＳａｃＩＩ。点線はプラスミドの配列を示す。

ＲＡＲ−ＰＬ−βＧＡＬはＲＡＲ発現ベクターでコトランスフエクトされたサル腎臓ＣＶ−を細胞中に導入した。酵素活性はレチノイン酸付加によって誘導され、ゲノムＤＮＡのこの領域はレチノイン酸に応答する機能性プロモーターを含むことを指示した。これは、ゲノムクローン中の指示した位置に特定部位の突然変異誘発によってＳａｔ　Ｉ制限部位を導入し、ついて１０　ｋｂゲノムフラグメントを切り出して、β−ガラクトシダーゼベクターｐＬＳＶ　［ｐＧＨｌｏｌの誘導体；　Ｈｅｒｍａｎら、　ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１４ニア１３０（１９８６）］中にクローン化し、オリゴ付加によってＳａｌ　Ｉおよびポリリンカー配列を含むように修飾し、ＲＡＲ−ＰＬ−βＧＡＬを得ることによって達成された。

ＲＡＲ−ＰＬ−βＧＡＬの５゛末端からの一連の欠失により、ＲＡ誘導を仲介する配列は、２　ｋｂ　Ｎｈｅ　Ｉ　−５ａｃＩＩフラグメント内に存在することか明らかである（図２ａおよび以下の表参照）。この領域のサブフラグメントを。

マウス乳癌ウィルスプロモーターを含み、天然のＧＲ応答要素か欠失したエンハンサ−依存性ルシフェラーゼレポータープラスミドＤＭＴＶ−ＬＵＣ［Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇら。

Ｃｅ１ｌ　５５：８９９−９０６（１９８８）参照］中にクローニングした。

１８３　ｂｐ　ＳｍａＩフラグメント（図１参照）は、この異種プロモーターにいずれの方向でも、レチノイン酸応答性を付与することかできる（以下の表に示すデータ参照）。

この領域から誘導されるオリゴヌクレオチド配列（図２ｂ参照）をついで、ＲＡ応答要素を、ＤＭＴＶ−ＬＵＣまたはＤＭＴＶ−ＣＡＴ中においてさらに同定するために使用した（以下の表に示すデータ参照）。図２ｂには。

これらの実験に用いたβレチノイン酸応答要素を含むオリゴヌクレオチドの配列を示す。最後の下部の塩基はＲＡＲβプロモーターに対して異種であり、Δ−ＭＴＶベクターの唯一のＨｉｎｄＩ［Ｉ部位への挿入を可能にするために包含された。

サイロイドホルモン応答要素（ＴＲＥ）はｃｖ−ｉ細胞中にトランスフェクトされたＲＡＲによる転写活性化を仲介することが示されていたが、一方非トランスフエクト細胞は応答を示さない［Ｕｍｅｓｏｎｏら、Ｎａｔｕｒｅ　３３６：２６２−２６５（１９８８）参照］。驚くべきことに、Δ−ＭＴＶ−ＣＡＴ構築体 βＲＥ　１．　βＲＥ２．およびβＲＥ３　（図２参照）はコトランスフエクトされたＲＡＲ発現ベクターがなくても１強力なＲＡ依存性の誘導を示した。ＲＡＲ−α発現ベクターのコトランスフエクションはわずか２倍の誘導の増大を生じたか、これはＣＶ−１細胞かβＲＥを含むベクターの効率的な活性化に十分てはあるか。

以前に検討されたＴＲＥの活性化の閾値より明らかに低い低レベルの内因性ＲＡ受容体しか発現しなかったことを示している。以下の細胞系の検討により、すへてかトランスフェクトされたＲＡＲ発現ベクターなしで、　ＲＡ依存性様式てβ ＲＡＲＥを効率的にトランスアクティベートすることが可能てあった。すなわち、ＣＨＯ。

ＨｅＬａ、ＮＩＨ３Ｔ３．Ｒａｔ２線維芽細胞、　ＨＴＩＯ８０、Ｔ　（ヒトリンパ系）、ニワトリ胚線維芽細胞、およびウズラＱＴ６細胞である。試験された細胞系でこの活性を発現しない細胞系はまだない。

配列βＲＥ　１．　βＲＥ２．およびβＲＥ３の検査で（図２ｂ参照）６ｂｐモチーフの縦列反復を同定する。これらの反復の間の１１　ｂｐの中心から中心までの分離はＤＮＡヘリックスの１回転である。５−または３°半部位のいずれかの単一コピーを含有する構築体（βＲＥ４およびβＲＥ　５）は、ＲＡＲ発現ベクターのコトランスフエクション時にのみ機能的である（図２ｄ参照）。これは、ＲＡＲＥがクローン化ｃＤＮＡから発現した３種のすべてのＲＡＲサブタイプの真正な標的であるのみでなく、これらの半部位はΔ−ＭＴＶプロモーターに関しては最小ＲＡ応答要素として働くこともできることを指示している。見掛は上、ＲＡＲβ遺伝子の単−半部位要素は、ＴＲ，ＥＲ，および／または受容体スーパーファミリーの他のメンバーに逆に応答するようにみえる。

ＥＲ，ＧＲのＣＶ−１細胞中ての構築体βＲＥＩとのコトランスフエクションは、適当なリガンドの不存在または以後の添加では、見るへき活性化を生じなかった。しかしながら、ｃｖ−ｉ細胞の、ＴＲおよびビタミンＤ受容体（ＶＤ３Ｒ）、構築体βＲＥＩとのコトランスフェクションはそれらの同系応答要素を弱く（約１０〜２０倍未満）活性化した。

表に指示した構築体各５ｇを、ＣＶ−１細胞中にＲ３Ｖ−ＬＵＣまたはＲ３Ｖ− βＧＡＬのいずれかとともにトランスフェクトして、トランスフェクション効率を正常化した。表中の各位は、　１０−７ＭＲＡ　（βＧＡＬ実験）または１０ −’ＭＲＡ　（ルシフェラーゼ実験）での処理プレートの二重の測定値を、溶媒処理のみのプレートと比較して示す。１８３　Ｓｍａ　Ｉ制限フラグメント（図１に示す）をΔ−ＭＴＶプロモーターに対して正方向（Ｆ）または逆方向（Ｒ）のいずれかに挿入した。（ＮＲ）構築体は、ＲＡに非応答であったＲＡＲβプロモーター中βＲＥＩの２４ｂｌ）３’　に局在する４５　ｂｐオリゴ配列を含有する。

プラスミドをＣＶ−１細胞にトランスフェクトし。

１０−７Ｍ　ＲＡを添加しまたは添加しないで、β−ガラクトシダーゼ活性をアッセイした。負の応答は２倍またはそれ未満の誘導で、正の誘導は７倍またはそれ以上であった。

細胞は、　１０ｃｍの皿の中に取り、５ｇのレポータープラスミド、１〜２ｇのＲ３Ｖ−ＬＵＣ（ａ）、　またはＲ３Ｖ−βＧＡＬもしくはｐｃＨｌｌｏ　（ｃおよびｄ）、担体ＤＮＡとしてＩ）ＧＥＭ４．ならびにａおよびｄに示した実験については、１ｇのＲ３Ｖ−ＲＡＲ発現ベクターまたは同量のナンセンス転写体を発生するＲ３Ｖベクターを含むＤ　Ｎ　Ａ　ＩＯｇでトランスフェクトした。

細胞はレチノイン酸添加１日後に収穫した。ＣＡＴアッセイはすへて等量のβ− ガラクトシダーゼ活性を示し、β−ＧＡＬアッセイはルシフェラーゼ活性に正常化した。

構築体　増大倍数ＲＡＲ−ＰＬ−βＧＡＬ　Ｉ　４ＲＡＲ−ＤＸＮ−βＧＡＬ　２２ＲＡＲ−ＤＮｈＳｃ−βＧＡＬ　２ＤＭＴＶ−ＬＵＣ２ＤＭＴＶ−Ｓｍａ１８３　Ｆ−ＬＵＣ１０ＤＭＴＶ−Ｓｍａ１８３　Ｒ−ＬＵＣ９ＤＭＴＶ−ＬＵＣ２ＤＭＴＶ−（ＮＲ）−ＬＵＣ２以下のコトランスフエクションアッセイに使用した受容体発現プラスミドは、以前に報告されている。

ｐＲ３ｈＴＲβ　［Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ８６：３４９４−３４９８（１９８９）参照］、ｐＲ３ｈＲＡＲα［Ｇｉｇｕｅｒｅ　ら、Ｎａｔｕｒｅ　３３０：　６２４−６２９（１９８７）参照］、ｐＲ３ｈＲＡＲβおよびｐ　Ｒｓ　ｈ　ＲＡ　Ｒ７［Ｉｓｈｉｋａｗａら、Ｍｏｌ。

Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、　４　：８３７−８４４（１９９０）参照］ならびにｐＲ３ｈＶＤＲ［５ｃｈｕｌｅら、Ｃｅ１ｌ　６１：４９７−５０４（１９９０）］　である。基底レポータープラスミドΔＳＶ−ＣＡＴはＴＫ−ＣＡＴ中のＴＫプロモーター［Ｄａｍｍら、Ｎａｔｕｒｅ　３３９：５９３−５９７（１９８９）　］をＳＶ４０初期プロモーターのｓｐｈ　ｌ−Ｈｌｎｄ　ｌ［フラグメントて置換することによって構築した。

ここで使用したすべての組換えＣＡＴレポータープラスミドは、ＳＶ４０プロモーターの上流の唯一のＨｉｎｄＩＩ［部位で指示したオリゴヌクレオチドの単一コピーを撃留する。

挿入されたオリゴヌクレオチドの同一性は配列決定によって確認した。ＣｏＳ細胞中てのレポーター蛋白質の産生を改良するため、プラスミドＣＤＭ８　［５ｅｅｄ、Ｂ、ら。

Ｎａｔｕｒｅ　３２９：８４０−８４２（１９８７）］を修飾し新しい真核生物発現ベクターｐＣＭＸを調製した。ＣＤ８をＩＪｌｕ　Ｉおよび５ｔｕＩｔ’切断して、ＣＭＶ／Ｔ７ブロモー９　＋、ＳＶ、１０／１１ｔイントロン／ポリＡシグナル、ポリオーマ−ウィルスエンハンサ−／起源、およびＳＶ４０エンハンサー／起源をコードするＤＮＡフラグメントを放出した。得られたフラグメントをＰｖｕ　ＩＩ消化Ｐ　Ｕ　Ｃ１９の大フラグメントにリゲートした。内部欠失はＤＣＭ８部分に存在する唯一のＢａｍＨｒとＢｅｔ　Ｉ部位の間に導入した。

Ｘａｂ　Ｉ部位に隣接したスタファー配列は５　’　−Ｋｐｎ　Ｉ　／Ａｓｐ７１８−εｃｏＲＶ　−ＢａｍＨＩ　−Ｍｓｃ　Ｉ　−Ｎｈｅ　Ｉ　−３’　をコードする合成ポリリンカー、ついて蛋白翻訳の万能終結シグナルとして機能てきる５−ＴＡＧＧＴＡＧＣＴＡＧ−３’　のストレッチで置換した。ルシフェラーゼ［ｄｅ　Ｗｅｔら、Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、７：７２５−７３７（１９８７）コならびにヒトＴＲβ、ＲＡＲαおよびＶＤＲのコード配列をｐＣＭＸのポリリンカー領域に置き、それぞれｐＣＭＸ−ＬＵＣ，ｐＣＭＸ−ｈＴＲβ。

１）　ＣＭ　Ｘ　−ｂ　ＲＡ　ＲａおよびｐＣＭＸ−ｈＶＤＲを発生させた。ＲＡＲαの翻訳開始部位はコンセンサス翻訳開始シグナルをコードする合成リンカ −を結合させて、ＡＣＣＡＣＣＡＴＣ；に修飾させた［Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇら、Ｃｅ１ｌ　５５：８９９−９０６（１９８８）　］。この修飾により、インビトロ網状赤血球溶解質翻訳系で判定して、受容体翻訳の収率の著しい上昇を生じた。

コトランスフエクションアッセイには、サル腎臓細胞系ＣＶ−１を、１０％炭末 −樹脂二重スブリット仔ウシウシ血清補充ダルベツコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）中に維持した。トランスフェクションはＵｍｅｓｏｎｏらによってＣｅ１ｌ　５７：１１３９−１１４６（１９８９）に報告されたリン酸カルシウム沈殿法に従い、０．５μｇのｐＲＳ受容体発現プラスミド、１．０μｇのレポーターＣＡＴプラスミド、内部対照としての５μｇのｐＲＡＳ−βＣＡＬ　［Ｕｍｅｓｏｎｏら。

Ｃｅ１ｌ　５７：１１３９−１１４６（１９８９）　］　、および８．５μｇの担体プラスミドｐＵｃＩ９を用いて実施した。細胞を８時間トランスフェクトし、ついでＤＮＡ沈殿を洗浄後、細胞をさらに３６時間、リガント（Ｔａ、１００　ｎＭ　；　ＲＡ、１　ｕＭ　；１、２５−（ＯＨ）２ビタミンＤ　ｚ、　１００　ｎ　Ｍ　）の存在下または非存在下にインキュベートした。細胞抽出物は、　Ｕｍｅｓｏｎｏら（前出）の記載に従い、βＧＡＬおよびＣＡＴアッセイのために調製した。Ｆ９奇形癌細胞のトランスフェクションは、細胞を１２時間ＤＮＡ沈殿の存在下にインキュベートし、ＲＡをｌμＭ加えてさらに２４時間インキュベートして細胞を収穫するほかは、同様の方法を用いて行った。受容体、ｐＲＡＳ−βＧＡＬおよびｐＵｃ１９を、それぞれ２．５および４μｇ使用した。

ＤＮＡ結合アッセイには、ＣＯＳ細胞をｌＯ％仔ウシウシ血清を含むＤＭＥＭ中で培養し、リン酸カルシウム法により、２０μｇのｐＣＭＸ受容体発現プラスミドて６時間トランスフェクトし、ついてグリセロールショックに付した。トランスフェクトされたＣＯ８細胞をさらに４８時間インキュベートし、細胞を収穫して抽出物を調製し。

ＤＮＡ結合アッセイをＤａｍｍら、Ｎａｔｕｒｅ　３３９：５９３−５９７（１９８９）の記載に従って実施した。抽出物は２０ｍＭＨＥ　Ｐ　Ｅ　５（ｐＨ７，４）、０．４　ＭＫＣＩ、２ｍＭＤＴＴおよび２０％グリセロール中に調製した。同様の方法を用いてＦ９幹細胞から全細胞抽出物を調製した。結合には、５ μｇ（ＣＯ３）または１０μｇ　（Ｆ９）の蛋白質を氷上で２０分間、最初は２０ｍＭＨＥ　Ｐ　Ｅ　Ｓ、　８０ＭＫ　ＣＩ　。

１ｍＭＤＴＴ、０．１　％ＮＰ４０．　２．５　μｇ　ポリｄｌ／ｄＣ。

および１０％グリセロール中（コールドコンペティターオリゴヌクレオチドを包含させる場合は、このプレインキュヘーション時に添加した）でインキュベートした。ついて、　４０ｆｍｏｌｅの３２ｐ−標識オリゴヌクレオチドプローブ（１〜２　ＸＩＯ５ｃｐｍ、ａ−”　Ｐ−ｄ　ＣＴＰの存在下クレノーポリメラーゼを用いた充填反応によって調製）を反応混合物に加え１次に室温で３０分インキュベートした。

受容体−ＤＮＡ複合体を、５％グリセロール含有５％ポリアクリルアミドゲルを通す電気泳動により、６Ｖ／ｃｍ。

室温て分割した。使用した条件下では、リガンドの包含は受容体蛋白質のＤＮＡ結合パターンを変化させなかった。

パリンドロームＴＲＥ　（ＴＲＥｐ）かＴ２およびレチノイン酸応答の両者を仲介することか以前明らかにされ。

ＴＲおよびＲＡＲか遺伝子の重複セットを調節できることか示唆されている［　Ｕｍｅｓａｗａら、Ｎａｔｕｒｅ　３３６：２６２−２６５（１９８８）］。共調節がＴＲＥの一般的な特徴であるかどうかを試験するために、Ｔよ一感受性ＭＨＣ遺伝子プロモーターの性質を調べた。すなわち、ＭＨＣα遺伝子プロモーターＥａＴＲＥ−ＣＡＴ　；　［ｚｕｍｏ　ら、Ｎａｔｕｒｅ　３３４：５３９− ５４２（１９８８）コの１６８　ｂｐ上セグメントカバーするレポータープラスミドを、ヒトのＲＡＲα、βもしくはγ［Ｇｉｇｕｅｒｅ　ら、Ｎａｔｕｒｅ　３３０：　６２４−６２９（１９８７）：　Ｉｓｈｉｋａｗａら。

Ｍｏ１．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、　４：８３７−８４４（１９９０）コまたはヒトＴＲβ［Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｊ、ＵＳＡ　８６：３４９４−３４９８（１９８９）］の発現プラスミドとともにＣＶ− １細胞中にコトランスフエクトした。受容体発現プラスミドの非存在下には、ＲＡまたはＴ３によるＣＡＴ酵素活性の刺激は認められなかった。しかしなからＴＲβの発現は、ラットＴＲαを用いた以前の結果［ｌｚｕｍｏら、前出］と一致する有意なＴ、応答を付与した。一方、ＲＡＲの３種のイソフオームのいずれか一つの産生はＲＡ応答を促進しなかったか、ＴＲＥｐをコードする類似のＣＡＴレポーター構築体はＴＲおよびＲＡＲ両者に応答する。

ＴＲＥｐとＭＨＣ−ＴＲＥの間のこの表現型の差の分子的基盤を理解するために、最小ＳＶ４０初期プロモーター（ΔＳＶ−ＣＡＴ）に基づ＜ＣＡＴレポーターのセットを調製した。ＴＲβ発現ベクターによるコトランスフエクション実験により、ＴＲＥｐまたは野生型ＭＨＣ配列（ＭＨＣ−Ｌ）のいずれかを撃留するプロモーターはＴ、に応答性を示すことが明らかにされた（図３ａ参照）。

図３に記載の標的ホルモン応答要素は１両端にオーバーハングしたテトラヌクレオチド（５−ａｇｃ　ｔ−３’）をもつ二重鎖オリゴヌクレオチドとして合成した。これらのオリゴヌクレオチドの単一コピーを、基底プロモーターＣＡＴ構築体、ΔＳＶ−ＣＡＴ中に存在する唯一のＨｉｎｄＩ［部位にクローニングした。

ヌクレオチド配列中の大文字部分は２合成品であるＴＲＥｐおよびｒＧＨ２１を除く天然のプロモーターに見出される配列に相当する。

ホールド体の文字はｒＡＧＧＴＣＡＪモチーフを指示し。

「Ｘ」はそのモチーフからのヌクレオチド置換を意味する。矢印間の数字はスペーサーのサイズ、カラム中の数字はＴＲβ（±７２　、１００　ｎ　Ｍ）またはＲＡＲａ（±ＲＡ、１μＭ）産生ＣＶ−１細胞中でホルモンによって刺激されたＣＡＴ酵素活性の誘導倍率を示す。Ｔ３およびＲＡによって基底構築体ΔＳＶ− ＣＡＴに観察された誘導はそれぞれ０．８および１．４倍である。

図３ａにおいて、ＴＲＥＩ）としたのは、効率的なＲＡＲＥとしても有効である（　Ｕｍｅｓｏｎｏら前出参照）至適化パリンドロームラット成長ホルモンＴＲＥ　（Ｇｌａｓｓら。

前出参照）である。ＭＨＣ−ＬはＭＨＣ遺伝子プロモーター（Ｇｌａｓｓら、前出参照）中の位置−ＸＸＸおよび−ＹＹＹに局在するＴＲＥをコートする。ＭＨＣ−ＳおよびＭＨＣ−Ｄは、ＭＨＣ−Ｌから括弧によって指示した欠失を含有する。

ＭＨＣ−Ｌはラット成長ホルモンＴＲＥおよびＴＲＥｐに類似することから、現実の応答要素はＡＧＧＴＣＡの部分パリンドロームからなることが提起されていた［図３参照、ｌｚｕｍｏら、前出およびＧｌａｓｓら、Ｃｅ１ｌ　５９：６９７−７０８（１９８９）参照コ。しかしながら、予測されたパリンドロームに相当する制限領域（ＭＨＣ−Ｓレポーター）はＴ、応答性を付与せず、この提起は正しくないことか示された。これに反し、隣接配列を包含するＭＨＣ配列のセグメント（ＭＨＣ−Ｄ）は完全な応答の回復を生し。

ＭＨＣ−ＴＲＥの最小境界を描出した。この配列の検査では、驚くべきことに、パリンドロームは見出せず、ヘキサマーのＡＧＧＴＧＡおよびＡＧＧＡＣＡの直接（すなわち、縦列）反復が確認される。

個々の半部位はそれぞれ、ＴＲＥｐ中のＡＧＧＴＣＡモチーフに類似するが、ＭＨＣ−ＴＲＥ中の半部位の方向性は異なっている。この要素のＴ３には応答し、　ＲＡには応答しない興味ある能力は、この配列の性質の詳細な検討によりホルモン応答についてのさらに詳細か明らかにされる可能性を示唆した。図３ｂに示すように。

ＭＨＣ−Ｎは野生型配列（ＭＨＣ−ＴＲＥ）の２３ヌクレオチドコアをコードする。ＭｌおよびＭ３は、提起された直接反復モチーフ中に特異的なヌクレオチド置換（影つき文字および矢印中の「Ｘ」て表示）を含むか、一方。

Ｍ２変異体は、推測されたパリンドローム中に特異的なヌクレオチド置換をもっている。ＴＲβ発現プラスミドの存在下または不存在下に調製したＣＯ８細胞抽出物を用いると、ＴＲβ蛋白質の３２ｐ標識ＭＨＣ−Ｎオリゴヌクレオチドへの特異的結合のゲル遅延アッセイによる検標識オリゴヌクレオチドを結合反応に加えたところ。

ＭＨＣ−ＮとＭ２はいずれもコンピートしたが、Ｍｌと〜１３はコンピートしなかった。これは、ＴＲβ結合部位の構築には、ｒＡＧＧＴＧＡ」およびｒＡＧＧＡｃＡ」の両者における２個のＧ残基の必要性を、明瞭に示している。中央の３つのヌクレオチドＡＧＧ　（推定パリンドロームの一部である）は、受容体結合に対する有意なインパクトなしには交換できない。これはまた、アビジン−ピオチンＤＮＡ結合アッセイによって得られた結合データ、およびＴＲをもつＭ　ＨＣα遺伝子プロモーター上のフットプリントパターンとも一致する［Ｆｌｉｎｋら、Ｊ。

Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２６５：１１２３３−１１２３７（１９９０）コ。期待通り、各構築体てのコトランスフエクションアッセイでは、ＭｌおよびＭ３はＴ２に対して完全にサイレントであるか２Ｍ２レポーターは、損傷されていても、Ｔ３応答を維持している（図３ｂ参照）。これらの観察はＭＨＣ−ＴＲＥかパリンドロームてはなく、４ヌクレオチドで分離されたｒＡＧＧＴＣＡＪ様の半部位の直接反復からなるとの考え方を支持する。

ＭＨＣ−ＴＲＥての結果から、以前に性質が調へられている他のＴＲＥについても同様に再検討した。Ｐｅｔｔｙら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２６５ニア３９５−７４００（１９９０）による最近の報告では、Ｔ、応答性リンゴ酸酵素遺伝子プロモーターに見出される短い２０ｂｐＤＮＡセグメントか、ＴＲによりフットプリンティングされた。この配列を最小ＳＶ４０プロモーター中に置くと、Ｔ２応答性か付与され、上記モデルに基づく直接反復モチーフを含有する（図３０参照）。この図では、リンゴ酸酵素ＴＲＥは転写開始部位から−ＸＸＸないし −ＹＹＹに相当する（ＰｅｔｔＹら、前出参照）。サイロイド応答要素はマウスマロニー白血病ウィルス（ＭＬＶ）ＬＴＲ（受容体結合アッセイおよびインビボ機能の両者による：ＭＬＶ−ＬＴＲ７４０はＳａｐらから採取）およびラット成長ホルモン遺伝子Ｔ　ＲＥ　［Ｂｒｅｎｔ　ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２６４：　１７８−１８２（１９８９）参照コに見出される。βＲＡＲＥは、　５ｕｃｏｖら［Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８７：５３９２−５３９８（１９９０）コによって報告されたβＲＥに相当する。

ＭＬＶ−ＬＴＲＩ：見出されたＴＲＥをＳＶ４０レポーター中に置くと、Ｔ２誘導能が付与される。ＭＨＣモデルに基づき、これらの配列にｒＡＧＧＴｃＡＪ様配列の直接反復が同定できる（図３０参照）。これに反し。

Ｂｒｅｎｔら（前出）によってＴＲＥ候補として提起されたラット成長ホルモン（ｒＧＨ）遺伝子配列はＳＶ４０レポーターに誘導能を付与しない（図３０参照）。しかしながら、以下に示すように、この配列はインビトロてＴＲと相互作用せず、したがって真正な応答要素ではない可能性がある。

ＴＲおよびＲＡＲの両者はパリンドロームＴＲＥに結合できるが［Ｕｍｅｓｏｎｏら、Ｎａｔｕｒｅ　３３６：２６２−２６５（１９８８）：Ｇｌａｓｓら、Ｃｅ１ｌ　５４：３１３−３２３（１９８８）およびＧｒａｕｐｎｅｒら。

Ｎａｔｕｒｅ　３４０：６５３−６５６（１９８９）参照］、直接反復ＴＲＥはＴＲ特異的である。この制限の分子的性質を理解するため、以前に性質が調べられた天然のＲＡＲＥの構造を再評価した。最近、一つのこのような配列が、マウス（５ｕｃｏｖ　ら）およびヒト　［ｄｅ　Ｔｈｅら、Ｎａｔｕｒｅ　３４３：１７７−１８０（１９９０）　］　ＲＡ　Ｒβ遺伝子のプロモーター領域に確認された。興味あることに、このＲＡＲＥ　（βＲＡＲＥと命名）は直接反復モチーフからなり、ＲＡＲによって選択的に活性化されるが、ＴＲによっては活性化されない（５ｕｃｏｖら、前出）。直接反復ＴＲＥおよびＲＡＲＥモチーフの排他的認識および選択的応答の基盤をよりよく理解するために、一連の比較インビトロＤＮＡ結合および機能アッセイを実施した。

ゲル遅延アッセイでＲＡＲαおよびＴＲβの特異的ＤＮＡ結合を試験するために、プローブとして図３に掲げたオリゴヌクレオチドを使用した。βＲＡＲＥについては、模擬トランスフェクトＣＯ８細胞抽出物中で、かすかなバックグランド結合活性が検出された。ＴＲβ抽出物は２弱いかバックグランドを越えて検出可能な結合活性を含有した。しかしながら、ＲＡＲα抽出物で得られるシグナルは劇的に上昇した。ＭＨＣ−ＴＲＥに加えて、リンゴ酸酵素ＴＲＥおよびＭＬＶ− ＬＴＲはすべて。

Ｇｌａｓｓら［Ｃｅ１１５９：６９７−７０８（１９８９）　］　、　Ｓａｐら［Ｎａｔｕｒｅ３４０：２４２−２４４（１９８９）　］　、Ｐｅｔｔｙ　ら［Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６５ニア３９５−７４００（１９９０）］　、およびＦｌｉｎｋら［Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２６５：１１２３３−１１２３７（１９９０）］の以前の観察に一致し、すべて高親和性ＴＲβ結合部位である。

一方、ＴＲβは、（前述のように）トランスフェクション実験で同じ＜Ｔ、−依存性トランスアクティベーションを付与しないｒＧＨ２１プローブにきわめて貧弱な結合しか示さない（図３ｃ）。

最後に、ＲＡＲα蛋白質は、これらのＴＲＥのいずれとも、見るべき結合を示さなかった。いずれの場合も、インビボのトランスアクティベーションとインビトロのＤＮＡ結合から得られた結果は一致する。すなわちこれらの縦列ＨＲＥは９選択的ＴＲまたはＲＡＲ特異的結合およびアクティベーションの付与に固有の差を育し、実際にホルモンのクロストークを減弱させる。

ＭＨＣ−ＴＲＥ　（ＭＨＣ−Ｎ）に出発して、半部位スペーシング（ＭＣＨ＋１）、半部位配列（、ＭＨＣ−Ｔ）。

または両者（ＭＨＣ−Ｒ）に変異を導入するためのオリゴヌクレオチドのセットを設計した（図４ｂ）。これらのオリゴヌクレオチドの単一コピーを基底レポーター構築体ΔＳＶ−ＣＡＴ中に置き（図４ｂ中に「−」て示す）、ＣＡＴレポータープラスミドのセットをＴＲＥｐをコードする一つのプラスミドとともに生成させた。

ＴＲβまたはＲＡＲαの発現プラスミドをＣＶ−１細胞中に、変異ＨＲＥの単一コピーを含むΔＳＶ−ＣＡＴレポーターとともに平行コトランスインフエクションした。

ホルモン（ＲＡ、１　μＭ　；　Ｔｓ　、　１００　ｎＭ）の添加後。

細胞抽出物につき、コトランスフエクトｐＲＡＳ−βＧＡＬで産生されたβ−ガラクトシダーゼ活性を測定することにより、ＣＡＴ活性をアッセイした。図中、カラム中の数字はホルモンによるＣＡＴ活性の誘導レベルを指示する。

対照パリンドロームＴＲＥレポーターを用いると。

ＴＲβおよびＲＡＲαはそれぞれ１４および９倍の誘導を生じたが、一方、ＭＨＣ−ＮはＴ３応答を付与したもののＲＡ応答は付与しない。スペーシングを１ヌクレオチド増やすとＩ　Ｔ２応答は１０倍から２倍未満に低下し、逆にＲＡによる中等度ではあるか官憲な誘導（４倍）を付好なＴ３応答（１５倍）を生じたが、一方、ＲＡ応答は限界にすぎなかった（２．６倍）。これに反し、ＭＨＣ−Ｔの半部位のスペーシングの１ヌクレオチドの増加（ＭＨＣ−Ｒへ）は、効率的ＲＡＲＥを生じ（７，４倍のＲＡ誘導）、一方逆にＴ、応答性の鈍化が認められた（１．３倍）。スペーサー内へのヌクレオチドの挿入位置は自由で、ＭＨＣ−Ｔ変異とともにスペーサーの中央にさらにＧを有する（ＣＡＧＧがＣＡＧＧＧに）他の変異体の表現型はＭＨＣ−Ｒの場合と同一である。すなわち。

ｌヌクレオチドの挿入は（ＭＨＣ−ＴがＭＨＣ−Ｒへ）ＴＲＥのＲＡＲＥへの交換に十分なことから、半部位スペーシングは決定パラメーターとして指示される。

移動度シフトアッセイを用い、ＴＲβおよびＲＡＲαを発現するＣＯ８細胞からの抽出物のこれらの配列へのＤＮＡ結合能についても試験した。陽性のＴＲＥ（ＴＲＥｐ、ＭＨＣ−Ｎ、およびＭＨＣ−Ｔ）は、野生型より著しく良好なＭＨＣ −Ｔとの効率的競合を示した。

これに反し、ＲＡ応答要素（ＭＨＣ＋１．ＭＨＣ−Ｒ。

およびβＲＡＲＥ）は貧弱なコンペティターである。このパターンはインビポアクティベーンヨンのパターンと一致する（図４）。同しオリゴヌクレオチドを３２Ｐ−標識βＲＡＲＥに対するＲＡＲα結合の競合に使用した場合には、逆のパターンが得られた。すなわち、ＲＡ応答要素（ＴＲＥｐ、　βＲＡＲＥ、およびＭＨＣ−Ｒ）はすべて有効なコンペティターであるが、ＭＨＣ−ＴＲＥは全く競合しない。さらに、ＭＭＣ−Ｒと１ヌクレオチドしか違わないＭＨＣ−Ｔも効率的には競合しない。これは９機能的応答要素の発生における半部位スペーシングの役割の顕著な例を提供する。ＭＨＣ−Ｒの、ＴＲＥｐの場合に匹敵する結合親和性は、ＭＨＣ＋１およびＭＨＣ−Ｔのはるかに弱い親和性とともに、トランスフェクションアッセイからの結果とよく相関する（図４）。

２つの異なる受容体によるインビボトランスアクティベーションとインビトロＤＮＡ結合パターンの間の平行性は、ＴＲは４ヌクレオチドスペーサーでｒＡＧＧＴＣＡＪ様直接反復に結合し、一方、ＲＡＲは同じモチーフを認識するがそれは５ヌクレオチドのスペーシングをもつとの結論を強く支持するものである。

ラットオステオカルシン遺伝子プロモーターに見出されるＶＤＲＥの性質の最近の検討によれば［ｒＯ３Ｔ−ＶＤＲＥ：Ｄｅｍａｙ　ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６６：１２００８−１０１３（１９９０）；　およびＭａｒｋｏｓｅら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８７：ｌ７０１−１７０５（１９９０）参照］、接近した位置に３つのｒＡＧＧＴＣＡＪ関連配列の存在か明らかにされた（５’−ＣＴＧＧＧＴＧＡＡＴＧＡＧＧＡＣＡＴＴＡＣＴＧＡＣＣ −３’　）、ｒＯ３Ｔ−ＶＤＲＥの５゛部分はｒＧＧＧＴＧＡＪおよびｒＡＧＧＡＣＡＪの縦列反復を含有し、ＭＨＣ−ＴＲＥに類似する（図３）。ＴＲおよびＲＡＲ選択性に対する半部位スペーシングの重要な役割から、この観察が半部位は３つのヌクレオチドて分離されているＶＤＲＥにも拡大できるかを見るための試験を行った。

すなわち、スペーサーサイズか３，４または５と変動するｒＡＧＧＴｃＡ」の直接反復を作成することによって、１組の合成ホルモン応答要素を設計した（図５ａ）。

ＤＲ−３，ＤＲ−４，およびＤＲ−５はそれぞれｒＡＧＧＴｃＡ」ヘキサマーの完全縦列反復をコートしく図中に矢印で指示）、３．　４．および５ヌクレオチドで分離されている。ＧＤＲ−３，ＧＤＲ−４およびＧＤＲ−５は、半部位記列がｒＡＧＡＡＣＡ」、ＧＲＥ半部位に変化されたほかはＤＲオリゴヌクレオチドと同一である。

ＤＲ−４は直接反復中に４ヌクレオチド分離した２コピーのｒＡＧＧＴＣＡＪをコードするので、原則的には。

ＴＲＥである。ＤＲ−５はｌヌクレオチドの挿入により５ヌクレオチドのスペーサーを有し、ＲＡＲＥである。

同様に、スペーサーから１ヌクレオチドが欠失したＤＲ−３は、ＶＤＲＥの候補である。ＤＲ系と同一の構造をもつか、ＡＧＧＴＣＡに代えてＧＲＥの半部位（ＡＧ人ＡＣＡ）をコートするオリゴヌクレオチドも。

配列特異性の他の対照として合成した（すなわち。

ＧＤＲ系１図５ａり照）。

上述の戦略を用い、ＴＲβ、ＲＡＲα、およびＶＤＲについてこれらの人工的ＨＲＥのインビボトランスアクティヘーションおよびインビトロＤＮＡ結合の両者を試験した。ＤＲまたはＧＤＲオリゴヌクレオチドの単一コピーを基底プロモーターＣＡＴ構築体、ΔＳＶ−ＣＡＴに存在する唯一の旧ｎｄｌｌＩ部位にクローニングし、ＤＲ−３−ＣＡＴ、ＤＲ−４−ＣＡＴ、ＤＲ−５−ＣＡＴ。

ＧＤＲ−３−ＣＡＴ、ＧＤＲ−４−ＣＡＴ、およびＧＤＲ−５−ＣＡＴレポーターを生成させた。指示されたレポーター［（−）はΔＳＶ−ＣＡＴを示すコ　ｌ μｇを、ＣＶ−１細胞中に、０．５８ｇ　のＶＤＲ，ＴＲβ、またはＲＡＲαの発現プラスミドとともにコトランスフエクトした。同系リガンド（ＶＤ、およびＴ　２　、１００　ｎ　Ｍ　；ＲＡ、ｔμＭ）と３６時間インキュベートし、細胞を２　コトランスフエクトした対照レポーターｐＲＡＳ−βＧＡＬから産生されるβガラクトシダーゼ活性で正常化したのちＣＡＴアッセイ用に収穫した。リガンドの非存在下にΔ５Ｖ−ＣＡＴにより得られたＣＡＴ活性を各受容体について１とした。

ＣＶ−１細胞中てのトランスフェクションアッセイから、ＤＲ−３は実際、新規なビタミンＤ３応答要素であることか明らかにされた（８．３倍誘導１図５ｂ参照）。

予期されたように、上述のモデルに基づ＜ＤＲ−３からのスペーサー中への１ヌクレオチドの挿入（ＤＲ４の生成）は、ビタミンＤ３とＴ３応答を相互に交換させる（ＤＲ−４を介してＴ３により２２倍の誘導２図５ｃ）。

半部位変異体ＧＤＲ−３およびＧＤＲ−４１；！ＶＤＲおよびＴＲの両者に対して完全に不活性である。ＤＲ−５か最良のＲＡ応答（９倍誘導）を付与するか、ＤＲ−３およびＤＲ−４も明瞭な活性を示す（図５ｄ）。以下に示すように、これは多分、受容体蛋白質の過剰発現の結果である。合成りＲホルモン応答要素のこれらの性質は。

異なる基底プロモーターたとえば単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ遺伝子プロモーターに移すことかできる。

ＤＲレポーターをＲＡ応答性のＦ９奇形癌幹細胞にトランスフェクトすると、ＤＲ−５のみか機能性ＲＡＲＥとして働く。同様に２図４の場合と同じセットのレポーターをＦ９細胞にトランスフェクトしたときは、ＭＨＣ−Ｒ（５ヌクレオチドスペーサー）とＴＲＥのみが２強力なＲＡＲＥである。これに反して、そのＲＡＲＥの前駆体（ＭＨＣ−Ｎ、ＭＨＣ＋１．ＭＨＣ−Ｔ）は不活性である。プローブとしてβＲＡＲＥを用い、Ｆ９幹細胞から調製した抽出物中で特異的蛋白質 −ＤＮＡ複合体が検出された。これは、ＲＡＲα−トランスフェクトＣＯ３細胞抽出物の場合と同一のＤＮＡ結合パターンを示す。

最後に２　これらの受容体蛋白質の一つを含有するＣＯ３細胞抽出物について、インビトロＤＮＡ結合アッセイを実施した。標識プローブとしてＤＲ−３，ＤＲ −４およびＤＲ−５を用いると、細胞中にそれぞれＶＤＲ，ＴＲβおよびＲＡＲ α蛋白質の発現に依存して、特異的蛋白質〜ＤＮＡ複合体か観察された。これらの研究はトランスアクティベーション実験と平行して行われ、ＤＲ−３、ＤＲ− ４およびＤＲ−５配列は、それぞれＶＤＲ。

ＴＲβおよびＲＡＲαに対する特異的結合応答要素であることを示している。

以上１本発明をその好ましい実施態様に関連して詳細に説明したが２本明細書に記載され、請求された本発明の精神および範囲内において、修飾および改変か可能であることを理解すべきである。

ＦＩＧ、１五雰↓ｖ０に附補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）平成５年９月６日

Claims

【特許請求の範囲】

１．配列：５′−ＲＧＢＮＮＭ−［（Ｎ）ｘ−ＲＧＢＮＮＭ］ｙ−３′（式中，それぞれＲは独立にＡまたはＧから選択され，それぞれＢは独立にＧ，ＣまたはＴから選択され，それぞれＮは独立にＡ，Ｔ，ＣまたはＧから選択され，それぞれＭは独立にＡまたはＣから選択される。ただしヌクレオチドのそれぞれの−ＲＧＢＮＮＭ −基の少なくとも４つのヌクレオチドは配列【配列があります】の相当する位置におけるヌクレオチドと同一である。ｘは０または２から１５までの整数であり，ｙは少なくとも１である）を有する実質的に純粋なＤＮＡ。
２．ｘは３〜５の範囲である請求項１に記載のＤＮＡ。
３．ｘは３である請求項２に記載のＤＮＡ。
４．それぞれの−ＲＧＢＮＮＭ−基は独立に，【配列があります】，【配列があります】，【配列があります】，【配列があります】，【配列があります】，または【配列があります】から選択される請求項３に記載のＤＮＡ。
５．スペーサー−（Ｎ）２−は，【配列があります】，【配列があります】，【配列があります】，または【配列があります】から選択される請求項４に記載のＤＮＡ。
６．配列：【配列があります】を有する請求項５に記載のＤＮＡ。
７．ｘは４である請求項２に記載のＤＮＡ。
８．それぞれの−ＲＧＢＮＮＭ−基は独立に，【配列があります】，【配列があります】，【配列があります】，【配列があります】，【配列があります】，または【配列があります】から選択される請求項７に記載のＤＮＡ。
９．スペーサー−（Ｎ）４−は，【配列があります】，【配列があります】，または【配列があります】から選択される請求項８に記載のＤＮＡ。
１０．配列：【配列があります】，または【配列があります】を有する請求項９に記載のＤＮＡ。
１１．ｘは５である請求項２に記載のＤＮＡ。
１２．それぞれの−ＲＧＢＮＮＭ−基は独立に，【配列があります】，【配列があります】，【配列があります】，【配列があります】，【配列があります】，または【配列があります】から選択される請求項１１に記載のＤＮＡ。
１３．スペーサー−（Ｎ）５−ドは，【配列があります】，【配列があります】，【配列があります】，【配列があります】，または【配列があります】から選択される請求項１２に記載のＤＮＡ。
１４．配列：【配列があります】，【配列があります】，【配列があります】，【配列があります】，または【配列があります】から選択される請求項１３に記載のＤＮＡ。
１５．通常はステロイド／サイロイドスーパーファミリーの受容体に対するリガンドによって転写活性化および／または抑制を受けないプロモーターに機能的に連結した請求項１記載のＤＮＡを含み，そのＤＮＡおよびそのプロモーターは適当なリガンドの存在下に上記プロモーターに転写活性化および／または抑制活性を付与するように機能的に連結されている，実質的に純粋なＤＮＡの構築体。
１６．プロモーターはマウス乳癌ウイルスのデルターＭＴＶプロモーター，ＳＶ４０初期プロモーター，単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーター，またはショウジョウバエアルコールデヒドロゲナーゼプロモーターである請求項１５に記載のＤＮＡ構築体。
１７．転写のために機能的に遺伝子に連結された請求項１５に記載のＤＮＡ構築体を含む実質的に純粋なＤＮＡの構築体。
１８．細胞中での関心蛋白質の発現のためのベクターであって，請求項１７記載の実質的に純粋なＤＮＡ構築体を含み，その場合の遺伝子は関心蛋白質をコードするベクター。
１９．関心蛋白質はルシフェラーゼ，クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ，またはβ−ガラクトシダーゼから選択される請求項２０記載のベクター。
２０．請求項１８記載のベクターでトランスフォームされた細胞。
２１．細胞はＣＶ−１，ＣＯＳ，Ｆ９，ＣＨＯ，ＨｅＬａ，ＮＩＨ３Ｔ３，ＨｕＴｕ８０，Ｒａｔ２線維芽細胞，ＨＴ１０８０．Ｔ，ニワトリ胚線維芽細胞，ウズラＱＴ６，またはショウジョウバエ・シュナイダーＳ２細胞から選択されるタイプの哺乳類，鳥類または昆虫細胞である請求項２０記載の細胞。
２２．関心遺伝子の発現を制御する方法において，請求項２０記載の細胞を適当なリガンドおよびその関連受容２体の存在下または不存在下に培養することを含む方法。
２３．ステロイド／サイロイドスーパーファミリー受容体のメンバーに対するリガンドのアゴニストとしての試験化合物の活性を試験する方法において，（ａ）ステロイド／サイロイドスーパーファミリー受容体のメンバーの存在下，またさらに試験化合物の存在下もしくは不存在下に，請求項２０記載の細胞を培養し，ついで，（ｂ）試験化合物の存在下もしくは不存在下における培養時に発現した関心蛋白質の量を比較することを含む方法。
２４．ステロイド／サイロイドスーパーファミリー受容体のメンバーに対するリガンドのアンタゴニストとしての試験化合物の活性を試験する方法において，（ａ）ステロイド／サイロイドスーパーファミリー受容体のメンバー，および上記リガンドの存在下，またさらに，（ｉ）試験化合物の存在下もしくは（ｉｉ）試験化合物の不存在下に，請求項２０記載の細胞を培養し，ついで，（ｂ）（ｉ）および（ｉｉ）培養工程時に発現した関心蛋白質の量を比較することを含む方法。
２５．ステロイド／サイロイドスーパーファミリー受容体の第一のメンバーに対するリガンドヘの応答性が，ステロイド／サイロイドスーパーファミリーの少なくとも一つのメンバーに独特の経路を介して生じるか否かを，上記スーパーファミリーの他のメンバーに比較して，識別する方法において，請求項１８記載のベクターを上記第一受容体に対するリガンドと接触させ，そして第一および第二の受容体の発現ベクターの比率を変動させ，ついで第一の受容体と第二の受容体の比率を増大させた場合の，上記リガンドによる上記応答要素の転写活性の修飾に対する効果を測定することを含む方法。
２６．ステロイド／サイロイドスーパーファミリーのオーファン受容体のメンバーに対するリガンドとして作用する化合物を同定するための化合物のスクリーニング方法において，上記化合物を請求項２０記載の細胞と接触させ，この場合，上記細胞はステロイド／サイロイドスーパーファミリーの受容体の上記メンバーに対する発現ベクターでさらにトランスフェクトし，上記受容体は，その同系リガンドの存在下に，配列：５′−ＲＧＢＮＮＭ−［（Ｎ）ｘ−ＲＧＢＮＮＭ］ｙ−３′（式中，それぞれＲは独立にＡまたはＧから選択され，それぞれＢは独立にＧ，ＣまたはＴから選択され，それぞれＮは独立にＡ，Ｔ，ＣまたはＧから選択され，それぞれＭは独立にＡまたはＣから選択される。ただしヌクレオチドのそれぞれの−ＲＧＢＮＮＭ −基の少なくとも４つのヌクレオチドは配列−ＡＧＧＴＣＡ−の相当する位置におけるヌクレオチドと同一である。ｘは０または２から１５までの整数であり，ｙは少なくとも１である）を有する実質的に純粋なＤＮＡに結合可能であり，ついで，レポーター蛋白質の発現の修飾をアッセイすることを含む方法。