JPH1156338A - リンス液定量装置付細胞分離セット - Google Patents
リンス液定量装置付細胞分離セットInfo
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- JPH1156338A JPH1156338A JP9244875A JP24487597A JPH1156338A JP H1156338 A JPH1156338 A JP H1156338A JP 9244875 A JP9244875 A JP 9244875A JP 24487597 A JP24487597 A JP 24487597A JP H1156338 A JPH1156338 A JP H1156338A
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- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
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Abstract
作において、簡便な操作で、正確にリンス液を定量可能
なリンス液定量装置付細胞分離セットを提供する。 【解決手段】 少なくとも、特定の細胞を捕捉するフィ
ルター4に、該フィルターに液体を導入する導管2と、
該フィルターから液体を排出する導管5が接続してお
り、該フィルター4の上流に、一定量のリンス液を一旦
貯留した後、そのリンス液を排出してフィルターにリン
ス液を導入するためのリンス液定量装置3が配置されて
いることを特徴とするリンス液定量装置付細胞分離セッ
ト。 【効果】 本発明のリンス液定量装置付血液回路では、
電子天秤等を使用しないため飛躍的にリンス操作を簡便
化できるだけでなく、正確なリンス液定量による除去対
象細胞の除去及び回収必要細胞の回収が再現性良く行え
る。
Description
の細胞を分離回収或いは除去する装置に関する。
血球、血小板、白血球を選択的に取り出し、治療に必要
な血球成分を輸血する成分輸血が行われるようになっ
た。また最近では、白血病などの造血器腫瘍及び固形癌
の化学療法における副作用である造血障害に対して、末
梢血、骨髄、臍帯血の中の造血幹細胞を移植することが
盛んに行われている。そのほとんどの場合、細胞は移植
前まで凍結保存されるが、保存スペース、解凍時の破壊
赤血球による副作用が問題となるため、通常凍結前に赤
血球除去が行われている。従来、血液から治療に必要な
血球成分を分離する方法として、比重液(例えばファル
マシア社製Ficoll)を用いる比重遠心法が採用さ
れている。本法は比重液に原料細胞を重層させる際に液
面を乱してはならない等、非常に熟練を要する煩雑な操
作である。最近では、簡便法として、フィルター法が散
見されるようになった。具体的には、特開昭54−11
9016号公報、特開昭57−145662号公報等
で、血液中の回収必要細胞をフィルターに捕捉し、フィ
ルター内に残存した除去対象細胞をリンス液で洗い流し
た後、フィルターに振動を与えながら回収液をフィルタ
ーに通液することにより回収必要細胞を回収する方法、
また特開昭60−193468号公報等で、血液中の除
去対象細胞をフィルターに捕捉し、フィルター内に残存
した回収必要細胞をリンス液で洗って回収する方法など
が提案されている。前者の場合、フィルター内の除去対
象細胞を除くリンス操作時、リンス量が少ないと除去対
象細胞を十分除けず、リンス量が多いと回収必要細胞が
濾材内部に押し込まれ回収率低下を招いてしまう。また
後者の場合、フィルター内に残存する回収必要細胞を回
収するリンス操作時、リンス量が少ないと回収必要細胞
を十分回収できず、リンス量が多いと除去対象細胞が濾
材から漏出して除去率低下を招く。そこで、一般には、
電子天秤を用いた重量測定やポンプでの流量定量、或い
はリンス液の減少量をリンスボトルの目盛りで計ること
で適量のリンスを行っていた。しかし、前者の場合、作
業が煩雑で、現場によっては、装置を置くスペースを確
保できない、或いは装置がない等、実施するには難があ
る。また、後者の場合、リンスボトルの目盛りは最小で
も50mL刻みで、細胞分離や細胞除去で一般に行われ
ているリンス量は数mLから50mL以下の為、正確さ
に欠け、性能低下を招く。一方、小児向けに薬液を定量
する装置付きの血液回路(テルモ社製テルフュージョン
定量輸液セット、川澄化学工業社製定量筒付輸液セッ
ト)が販売されているが、特定の細胞を分離或いは除去
するフィルターと組み合わせたものは現在までにない。
分離或いは除去操作において、簡便な操作で、正確にリ
ンス液を定量可能なリンス液定量装置付細胞分離セット
を提供することにある。
を解決すべく、鋭意検討した結果、本発明を完成させた
ものである。即ち、本発明は少なくとも、特定の細胞を
捕捉するフィルターに、該フィルターに液体を導入する
導管と、該フィルターから液体を排出する導管が接続し
ており、該フィルターの上流に、一定量のリンス液を一
旦貯留した後、そのリンス液を排出してフィルターにリ
ンス液を導入するためのリンス液定量装置が配置されて
いることを特徴とするリンス液定量装置付細胞分離セッ
トである。本発明で言うフィルターとは、細胞集団中の
特定の細胞を選択的に捕捉するが他の成分は捕捉し難い
フィルターであり、濾材を容器に充填したものが挙げら
れる。濾材としては、水不溶性であればいかなる材質で
も使用可能であるが、成形性、滅菌性や細胞毒性が低い
という点で好ましいものを例示すると、ポリエチレン、
ポリプロピレン、ポリスチレン、アクリル樹脂、ナイロ
ン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアクリルア
ミド、ポリウレタン等の合成高分子、アガロース、セル
ロース、酢酸セルロース、キチン、キトサン、アルギン
酸塩等の天然高分子、ハイドロキシアパタイト、ガラ
ス、アルミナ、チタニア等の無機材料、ステンレス、チ
タン等の金属があげられる。また、濾材の形状としては
粒状、繊維塊、織布、不織布、平板、スポンジ状多孔質
体等があげられるが、体積あたりの表面積が大きいとい
う点で繊維塊、織布、不織布、スポンジ状多孔質体が好
ましい。また、これらの濾材はこのままでも用いられる
が、必要に応じ、アミノ酸、ペプチド、糖タンパク(抗
体、接着分子等のバイオリガンドを含む)といった、特
定の細胞に親和性のあるリガンドを固定してもよい。ま
た、フィルターに血小板通過性を付与する場合、例えば
特公平6−51060号公報で提案されているように、
ヒドロキシエチルメタクリレートを主成分とする合成高
分子等で濾材表面を改質してもよい。
導管(以下上流側導管と呼ぶ)とは、細胞集団をフィル
ターに導入するためにフィルターの入り口側に接続され
た中空管であり、フィルターから液体を排出する導管
(以下下流側導管と呼ぶ)とは、濾液をフィルターから
排出するためにフィルターの出口側に接続された中空管
である。細胞集団から回収必要細胞をフィルターに捕捉
し、リンス液で除去対象細胞を洗い流した後、捕捉され
た回収必要細胞を回収液で回収する細胞分離操作で、細
胞集団と同方向にフィルターに回収液を通液する場合、
上流側導管を通る液体は細胞集団、リンス液、回収液で
あり、下流側導管を通る液体は細胞集団とリンス液の濾
液及び回収細胞液である。一方、細胞集団と逆方向にフ
ィルターに回収液を通液する場合、上流側導管を通る液
体は細胞集団、リンス液、回収細胞液であり、下流側導
管を通る液体は細胞集団とリンス液の濾液及び回収液で
ある。また、細胞集団から除去対象細胞をフィルターに
捕捉し、リンス液で回収必要細胞を洗い流す細胞除去操
作の場合、上流側導管を通る液体は、細胞集団とリンス
液であり、下流側導管を通る液体は細胞集団とリンス液
の濾液である。また導管の途中に、細胞分離性能を最大
限に発揮できるように、ローラークランプ、オリフィス
チューブ等、細胞集団、リンス液の流速を制御する手段
を具備していてもよい。回収必要細胞と除去対象細胞を
含む細胞集団の例としては、骨髄、末梢血、臍帯血或い
はこれらを遠心分離等により粗分離したものが挙げられ
る。回収必要細胞と除去対象細胞の組み合わせの例をい
くつか示す。回収必要細胞が白血球であり、除去対象細
胞が赤血球、血小板の場合、白血球はフィルターに捕捉
され、フィルター内に残存した赤血球、血小板をリンス
液で洗い流し、回収液にてフィルターに捕捉された白血
球が回収される。また、回収必要細胞がTリンパ球であ
り、除去対象細胞が赤血球、血小板、顆粒球、単球、B
リンパ球の場合、Tリンパ球はフィルターに捕捉され、
フィルター内に残存した赤血球、血小板、顆粒球、単
球、Bリンパ球をリンス液で洗い流し、回収液にてフィ
ルターに捕捉されたTリンパ球が回収される。また、回
収必要細胞がCD34陽性細胞であり、除去対象細胞が
赤血球、血小板、CD34陰性細胞である場合、CD3
4陽性細胞はフィルターに捕捉され、フィルター内に残
存した赤血球、血小板、CD34陰性細胞をリンス液で
洗い流し、回収液にてフィルターに捕捉されたCD34
陽性細胞が回収される。また、回収必要細胞が赤血球、
血小板であり、除去対象細胞が白血球の場合、白血球は
フィルターに捕捉され、フィルターを通過した赤血球、
血小板を回収し、更にフィルター内に残存した赤血球、
血小板をリンス液で洗い流して回収する。また、回収必
要細胞が赤血球であり、除去対象細胞が白血球、血小板
の場合、白血球、血小板はフィルターに捕捉され、フィ
ルターを通過した赤血球を回収し、更に、フィルター内
に残存した赤血球をリンス液で洗い流して回収する。ま
た、血小板製剤中の血小板が回収必要細胞で、白血球が
除去対象細胞の場合、白血球はフィルターに捕捉され、
フィルターを通過した血小板を回収し、更にフィルター
内に残存した血小板をリンス液で洗い流して回収する。
集団をフィルターで濾過した後のリンス操作時、一定量
のリンス液を計りとるためのもので、リンス液を一旦貯
留した後、そのリンス液を排出し、フィルターにリンス
液を導入してフィルター内の除去対象細胞或いは回収必
要細胞を洗い流すことができるものである。その好まし
い例としてリンス液定量装置にエア流通用アダプターを
具備したものが挙げられる。これは液体の貯留及び排出
の操作を簡便に行うことができる。本発明で言うエア流
通用アダプターとは、一般に用いられている混注用アダ
プター(ゴム栓)、クランプ付きの短いチューブの先端
に除菌フィルターが接続されたもの等を言い、通常は閉
じていて、リンス操作時に、前者の場合は除菌フィルタ
ーの付いた針等を刺すことにより、後者の場合はクラン
プ等を開くことにより、エアを装置内から排出してリン
ス液を装置内に貯留して定量したり、エアを装置内に導
入して装置内のリンス液をフィルターに流したりできる
アダプターである。更に、リンス液定量装置の中に、血
液中のアグリゲート除去用のメッシュを具備した場合、
メッシュチャンバーとリンス液定量装置が兼用できるた
め、血液回路がシンプルになりより好ましい。ここで言
うアグリゲート除去用のメッシュとは、血液中のマイク
ロアグリゲート及びマクロアグリゲート除去用に一般に
用いられているものでよい。細胞による目詰まりを起こ
さず、アグリゲートを有効に除去するメッシュの規格と
して、100〜400メッシュ、30〜200μmのオ
ープニングが好ましい。リンス液定量装置を期待するリ
ンス量と同じ内容量にするか、或いはリンス液定量装置
に期待するリンス量のところに線を付けておけば、簡便
に一定量を計り取ることができる。その場合、リンス液
定量装置の容器は、外観で液面がわかるような透明度を
持つ材質が好ましい。また、リンス液定量装置の容器に
計量用の目盛りを付けることにより、任意の量のリンス
液を計量できる。細胞分離操作において、細胞集団をフ
ィルターに流す方向と同方向に回収液をフィルターに通
液する場合、回収液をリンス液定量装置に貯留できるた
め、回収液の定量或いは計量も可能である。本発明の最
も基本的な様態を図1に示す。1はフィルターに液体を
導入する導入口であり、2はその導管である。3はリン
ス液定量装置、4は特定の細胞を捕捉するフィルターで
ある。5はフィルターから液体を排出する導管、6はそ
の排出口で、7及び8で示すクランプを付属させること
ができる。本発明における血液回路は、無菌的に操作す
るために閉鎖系になっていることが好ましい。例えば、
細胞分離では、フィルターの上流側から下流側へ回収液
を流す場合、図1の液体導入口1の上流側に細胞集団を
貯留する手段とリンス液を貯留する手段と回収液を貯留
する手段が接続され、液体排出口6の下流側にフィルタ
ーを通った濾液を回収する手段とフィルターを通った回
収液を回収する手段が接続される。また、フィルターの
下流側から上流側へ回収液を流す場合、回収液を貯留す
る手段とフィルターを通った回収液を回収する手段が入
れ替わった態様となる。細胞除去の場合、図1の液体導
入口1の上流側に細胞集団を貯留する手段とリンス液を
貯留する手段が接続され、液体排出口6の下流側にフィ
ルターを通った濾液を回収する手段が接続された態様と
なる。
が、本発明はこれらにより限定されるものではない。
細胞分離セットを、図2を用いて例示する。 血液回路 図2の9は血液バッグ、10は生理食塩水ボトル、11
は血液導管、12はリンス液導管、13、14、16は
クランプ、15はY字管、17、19は三方活栓、18
は細胞回収バッグ、20は回収液バッグ、21はドレイ
ンバッグである。本回路では、フィルターの下流側から
回収液をフィルターに通液して回収を行う。尚、リンス
液定量装置3には、図3及び図4に示すエア流通用アダ
プター及びメッシュ付のものを使用した。メッシュは袋
状になっており、細胞集団中のアグリゲートを除去す
る。図3の22は液体導入口、23はエア流通用アダプ
ター、24は容器本体、25はメッシュ、26は液体排
出口である。この場合のリンス液定量装置は、リンス液
が充満したところで10cm3を定量できる容量のもの
を用いた。 細胞分離フィルター 上容器と下容器からなり、組み立てた後の内寸が縦30
mm、横30mm、高さ12mm(有効濾過断面積9c
m2、内容積11cm3)で液体流出口と液体流入口を最
長対角線上に持つポリカーボネート製容器の入口側か
ら、第1層目に平均繊維径12μm、目付100g/m
2のポリエステル不織布25枚を、第2層目に平均繊維
径2.3μm、目付60g/m2のポリエステル不織布
12枚を、上容器と下容器の周辺で挟み込むように充填
して容器入口側空間と出口側空間に分離した。尚、本細
胞分離フィルター内に充填された不織布の空隙率は0.
81で、充填密度は、第1層目が0.29g/cm3、
第2層目が0.22g/cm3であった。また、該細胞
分離フィルターに血小板通過性を付与する目的で、親水
性ポリマーのコーティングを行った。即ち、ヒドロキシ
エチルメタクリレート・ジメチルアミノエチルメタクリ
レート共重合体(モル比で97:3)の1%エタノール
溶液を該細胞分離フィルターの液体流入口から通液し、
窒素ガスで余分なポリマー溶液をパージした後、60℃
で8時間以上真空乾燥機で乾燥させた。 使用方法 三方活栓17を細胞回収バッグ18の方向が閉、三方活
栓19を回収液バッグ20の方向が閉になるよう切り替
え、クランプ13、16を開けて、CPD加ヒト臍帯全
血20cm3を、落差(流速約5cm3/分)によりフィ
ルター4に通液して白血球を捕捉し、濾液はドレインバ
ッグ21に回収する。続いて、クランプ13、16を閉
じる。次にリンス液定量装置3のエア流通用アダプター
23に針を刺し、クランプ14を開ければ装置内からエ
アが排出されて生理食塩水がリンス液定量装置3に導入
される。リンス液が充満したところでクランプ14を閉
じる。次に、クランプ16を開けると、リンス液定量装
置3にエアが導入されてリンス液が装置から排出され
る。装置内が空になるまでフィルター4に生理食塩水を
導入し、フィルター内に残存した赤血球、血小板を洗い
流した後、三方活栓17をリンス液定量装置3の方向が
閉になるよう切り替える。その後、三方活栓19をドレ
インバッグ21の方向が閉になるよう切り替え、市販の
10%デキストラン生理食塩水溶液(ミドリ十字「デキ
ストラン40注」)にヒト血清アルブミンを3%になる
ように添加した液体が60mL入った回収液バッグ20
を手で握りつぶしてフィルター4に通液し、細胞回収バ
ッグ18に回収する。 結果 同一の血液で、計5回処理して再現性を見た結果、白血
球回収率は75±4%(73%、70%、79%、74
%、77%)、赤血球除去率は92±2%(95%、9
4%、90%、90%、91%)、血小板除去率は86
±2%(83%、87%、86%、86%、87%)
で、再現性の良いデータが得られた。この場合の白血球
回収率、赤血球除去率、血小板除去率は以下の式より算
出した。 白血球回収率(%)=100×(回収細胞液中白血球数/元白血球数) 赤血球除去率(%)=100−100×(回収液細胞中赤血球数/元赤血球数) 血小板除去率(%)=100−100×(回収液細胞中血小板数/元血小板数) 白血球数は、濾過前血液(回収細胞数):チュルク液
(武藤化学薬品)=1:9で混和して核染色後、チュル
ク計算盤を用いて光学顕微鏡(オリンパス社製BH−
2)で検鏡してカウントした。赤血球、血小板は、自動
血球計数装置(東亜医用電子社製Sysmex K−4
500)でカウントした。
ンス液定量装置を使用しない場合を例示する。 血液回路 図2のリンス液定量装置3がない以外は、実施例1と同
じ。 細胞分離フィルター 実施例1と同じ。 使用方法 リンス液量を、生理食塩水ボトル10の目盛りの変化を
目視で読みとって計量した以外は、実施例1と同じ。 結果 実施例1と同様、同一の血液で、計5回処理して再現性
を見た結果、白血球回収率は70±12%(55%、7
0%、86%、75%、64%)、赤血球除去率は91
±8%(99%、93%、79%、87%、97%)、
血小板除去率は84±8%(91%、86%、71%、
82%、90%)であった。生理食塩水ボトル10の目
盛りは50mL刻みでリンス液10mLを読みとること
が難しく、実施例1に比べかなり性能にばらつきが見ら
れた。
の細胞分離セットを例示する。 血液回路 図1のリンス液定量装置3に図3及び図4の形状で、内
容量が25mLのものを使用した。 細胞分離フィルター 市販の白血球除去フィルター(旭メディカル社製セパセ
ル(登録商標)R−200(2))を使用した。 使用方法 MAP加濃厚赤血球80cm3入りの血液バッグを液体
導入口1に接続し、クランプ7、8を開けて、落差(流
速約5cm3/分)によりフィルター4に通液して白血
球、血小板を捕捉し、濾液は液体排出口から回収する。
続いて、クランプ8を閉じ、血液バッグを切り離し、生
理食塩水ボトルを液体導入口に接続する。次に、リンス
液定量装置3のエア流通用アダプターに針を刺し、生理
食塩水がリンス液定量装置に充満したところでクランプ
7を閉じる。最後に、クランプ8を開け、リンス液定量
装置3が空になるまでフィルター4に通液してフィルタ
ー内に残存する赤血球を回収する。 結果 同一の血液で、計5回処理して再現性を見た結果、白血
球除去率は3.35±0.101og(3.49、3.
36、3.28、3.41、3.23)、赤血球回収率
は98±1%(98、97、99、98、99)、血小
板除去率は97±1%(95、96、98、96、98
%)で、再現性の良いデータが得られた。この場合の白
血球除去率、赤血球除去率、血小板除去率は以下の式よ
り算出した。 白血球除去率=−1og(元白血球数/ドレイン中白血球数) 赤血球回収率(%)=100×(ドレイン中赤血球数/元赤血球数) 血小板除去率(%)=100−100×(ドレイン中血小板数/元血小板数) 元白血球数は、濾過前血液:チュルク液(武藤化学薬
品)=1:9で混和して核染色後、チュルク計算盤を用
いて光学顕微鏡(オリンパス社製 BH−2)で検鏡し
てカウントした。また、ドレイン中の白血球数は、濾過
後血液:溶血液(1.15%シュウ酸アンモニウムのリ
ン酸緩衝液)=1:2で混和し、10分放置。その後、
0.01%アクリジンオレンジ水溶液を1.1倍希釈で
加えて核染色。ノイパウェル計算盤を用いて蛍光顕微鏡
(Nikon社製MICROPHOT−FXA)で検鏡
してカウントした。赤血球、血小板は、自動血球計数装
置(東亜医用電子社製Sysmex K−4500)で
カウントした。
リンス液定量装置を使用しない場合を例示する。 血液回路 図1のリンス液定量装置3がない以外は、実施例2と同
じ。 細胞分離フィルター 実施例2と同じ。 使用方法 リンス液量を、生理食塩水ボトルの目盛りの変化を目視
で読みとって計量した以外は、実施例2と同じ。 結果 実施例2と同様、同一の血液で、計5回処理して再現性
を見た結果、白血球除去率は3.20±0.31%
(2.96、3.33、3.43、3.51、2.7
9)、赤血球回収率は97±3%(99%、98%、9
3%、94%、99%)、血小板除去率は95±3%
(97%、95%、91%、92%、98%)であっ
た。生理食塩水ボトルの目盛りは50mL刻みでリンス
液10mLを読みとることが難しく、実施例2に比べか
なり性能にばらつきが見られた。
は、電子天秤等を使用しないため飛躍的にリンス操作を
簡便化できるだけでなく、正確なリンス液定量による除
去対象細胞の除去及び回収必要細胞の回収が再現性良く
行える。
である。
模式図である。
Claims (5)
- 【請求項1】 少なくとも、特定の細胞を捕捉するフィ
ルターに、該フィルターに液体を導入する導管と、該フ
ィルターから液体を排出する導管が接続しており、該フ
ィルターの上流に、一定量のリンス液を一旦貯留した
後、そのリンス液を排出してフィルターにリンス液を導
入するためのリンス液定量装置が配置されていることを
特徴とするリンス液定量装置付細胞分離セット。 - 【請求項2】 リンス液定量装置に、エア流通用アダプ
ターを具備した請求項1記載のリンス液定量装置付細胞
分離セット。 - 【請求項3】 リンス液定量装置に、アグリゲート除去
用のメッシュを具備した請求項1記載のリンス液定量装
置付細胞分離セット。 - 【請求項4】 リンス液定量装置に、計量用の目盛りが
付与されている請求項1記載のリンス液定量装置付細胞
分離セット。 - 【請求項5】 リンス液定量装置が、回収液の定量可能
な構成である請求項1記載のリンス液定量装置付細胞分
離セット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24487597A JP4107519B2 (ja) | 1997-08-27 | 1997-08-27 | リンス液定量装置付細胞分離セット |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24487597A JP4107519B2 (ja) | 1997-08-27 | 1997-08-27 | リンス液定量装置付細胞分離セット |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1156338A true JPH1156338A (ja) | 1999-03-02 |
| JP4107519B2 JP4107519B2 (ja) | 2008-06-25 |
Family
ID=17125303
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP24487597A Expired - Lifetime JP4107519B2 (ja) | 1997-08-27 | 1997-08-27 | リンス液定量装置付細胞分離セット |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4107519B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002512968A (ja) * | 1998-04-27 | 2002-05-08 | アヴェンティス・ベーリング・エルエルシー | 完全濾過済安定化血液産物の調製方法 |
| US20210095240A1 (en) * | 2018-04-19 | 2021-04-01 | Aglaris Ltd | Cell separation chamber and cell separation system and method |
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1997
- 1997-08-27 JP JP24487597A patent/JP4107519B2/ja not_active Expired - Lifetime
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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