JPH1169968A - 細胞分離装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 小型で安価な細胞分離装置により短時間で目
的の細胞を分離する。 【解決手段】 細胞分離装置１は、少なくとも一部の内
面が導電性であり、細胞懸濁液である試料３１の容器で
もある試験管３、試験管３から廃液を排出したり洗浄液
を注入するとともに電極となるアスピレータ５、試験管
３に正電圧、アスピレータ５に負電圧をそれぞれ印加す
る直流電源装置９、を備えることを特徴とする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、細胞分離装置に係
り、特に血液等の細胞懸濁液から細胞を分離する細胞分
離装置に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、被検者のリンパ球から分離したＤ
ＮＡに基づいて遺伝子診断が行われている。遺伝子診断
の最終的な目的は、被検者の遺伝子を総体的に解読（ゲ
ノムの解読）して、遺伝性疾患を発見することである
が、現時点では、当該遺伝子の塩基配列の全てを解析し
ているのではなく、（ａ）遺伝子内の塩基の数に欠失ま
たは付加がないか、（ｂ）遺伝子内の塩基置換等の変異
が生じていないか、（ｃ）遺伝子と密接に連鎖したＤＮ
Ａ部位に塩基の欠失、付加または置換等の変異が生じて
いないかどうかが調べられ診断が行われている。

【０００３】遺伝子診断の実際の手順は、次の過程を含
む。 （１）採取した被検者の抹消血からリンパ球を分離し、
ＤＮＡを抽出する。 （２）抽出したＤＮＡを特定の制限酵素で切断する。ク
ラスII制限酵素は、２本鎖ＤＮＡの４，５，６個の塩基
対の２回転対称構造を認識して特定位置でＤＮＡを切断
することができる。このクラスII制限酵素は、約３００
種知られており、これらの酵素により切断される塩基配
列は約６０種類ある。ＤＮＡ上での切断の割合は、６塩
基対を認識する制限酵素ではおよそ４千塩基対毎に１
回、４塩基対を認識する制限酵素ではおよそ２６０塩基
対毎に１回、と計算されている。従って、目的により各
種の制限酵素が選択されて使用される。

【０００４】（３）制限酵素で切断された２本鎖ＤＮＡ
断片は、アガロースゲル電気泳動にかけてサイズに応じ
て分画される。実際のアガロースゲル電気泳動におい
て、ＤＮＡ断片はその大きさに応じた易動度で移動し、
アガロースゲル内に連続した帯状に分離される。アルカ
リ変性により２本鎖ＤＮＡを単鎖とする。

【０００５】（４）中和後、サザントランスファーによ
りアガロースゲル内の分離パターンをそのままニトロセ
ルロースフィルタ上へ毛細管現象により移行させる。熱
処理によりフィルタ上に単鎖ＤＮＡ断片を固定する。

【０００６】（５）ニトロセルロースフィルタ上の帯状
に分画されたＤＮＡ断片の中から、目的とする遺伝子ま
たはＤＮＡ断片を探し当てるため、³²Ｐまたは非放射性
マーカーなどで標識した最も適したＤＮＡプローブとハ
イブリダイゼーションを行う。フィルタ上の帯状の単鎖
ＤＮＡと単鎖プローブＤＮＡとの間に相補性のある塩基
配列が存在すれば、水素結合により標識プローブはフィ
ルタ上に固定される。結合にあずからないプローブを洗
浄により除去する。

【０００７】（６）オートラジオグラフィにより目的と
したＤＮＡ断片をＸ線フィルム上に銀粒子のバンドとし
てとらえる。この様な遺伝子診断に用いるリンパ球を血
液から分離するには、通常遠心分離器を用いた密度勾配
分離法により行われている。

【０００８】図３は、従来の遠心分離器による細胞分離
の過程を説明する図である。図３に示すように、遠心分
離器により、血漿、リンパ球、及び赤血球に分離し、こ
れから分取したリンパ球を生理食塩水等で洗浄を繰り返
し、分離上澄み、分離沈殿物を除去して、目的の細胞を
分離していた。

【０００９】この分離作業には、遠心分離器を使用し
て、血液の分離、分取した白血球の２回の洗浄を必要と
し、１回の遠心分離器の動作時間を５分としても、容器
から廃液の排出、洗浄液の注入等の作業を含めて、３０
分以上の時間を必要としていた。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】上記のように、従来の
遠心分離法により目的の血球細胞濃縮懸濁液を得るに
は、３０分以上の時間がかかるという問題点があった。
また、遠心分離装置は、大型で高価であるため、小さな
実験室には導入が困難であるという問題点があった。

【００１１】以上の問題点に鑑み本発明の目的は、遠心
分離法に依らず目的の細胞を濃縮した細胞濃縮懸濁液を
得ることができる細胞濃縮装置を提供することである。
また本発明の別の目的は、短時間で目的の細胞を濃縮し
た細胞濃縮懸濁液を得ることができる細胞濃縮装置を提
供することである。また本発明の別の目的は、小型で安
価な細胞分離装置を提供することである。

【００１２】

【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
に本発明は次の構成を有する。すなわち請求項１記載の
発明は、細胞懸濁液から細胞を分離する細胞分離装置で
あって、前記細胞懸濁液を収容する容器と、この細胞懸
濁液に浸された第１および第２の電極と、これら第１お
よび第２の電極間に直流電圧を印加する直流電源と、を
備えたことを要旨とする細胞分離装置である。

【００１３】また請求項２記載の発明は、請求項１に記
載の細胞分離装置において、前記第１の電極は、前記容
器の少なくとも内面の一部に設けられた導電性物質によ
り構成され、この第１の電極に前記直流電源より正電圧
が印加されることを要旨とする。

【００１４】また請求項３記載の発明は、請求項１また
は請求項２に記載の細胞分離装置において、前記第２の
電極は、前記容器内に浸されたアスピレータの少なくと
も一部の表面に設けられた導電性物質により構成された
ことを要旨とする。

【００１５】また請求項４記載の発明は、請求項１ない
し請求項３に記載の細胞分離装置において、前記第１お
よび第２の電極間に介在する絶縁体をさらに設けたこと
を要旨とする。

【００１６】（作用）動物細胞は、細胞表面に露出する
解離基（リン脂質、多糖類など）により負の荷電を持っ
ている。この負に荷電した細胞は、他の荷電粒子と同様
に電界下で泳動する。この泳動の速度は、表面電荷、溶
媒の誘電率、及び電界の強さの積に比例し、溶媒の粘度
に反比例するヘルムホルツの式に従い、生理的な平衡塩
類溶液中では、１Ｖ／ｃｍの電界下で１秒間に１μｍ前
後の泳動を示す。

【００１７】本発明は、この細胞表面の負電荷に着目
し、細胞を含む懸濁液に浸した２つの電極間に直流電圧
を印加することにより、正極に細胞を吸引・吸着させる
ことにより細胞を分離するものである。

【００１８】目的の細胞を正極に吸着した後廃液を排出
し、通電を停止して生理的な平衡塩類溶液を洗浄液とし
て容器に注入すると、電極から分離した細胞が懸濁、分
散される。必要に応じて上記の通電、吸引・吸着、廃液
の排出、通電停止、洗浄液の注入懸濁を繰り返すことも
可能である。

【００１９】

【発明の実施の形態】次に図面を参照して、本発明の実
施の形態を詳細に説明する。図１は、本発明に係る細胞
分離装置の構成を示す装置概念図である。同図におい
て、細胞分離装置１は、分離すべき細胞を含む懸濁液で
ある試料３１を収容する容器であるとともに正極となる
試験管３、負極となるとともに試験管３から廃液を排出
したり洗浄液を注入したりするためのアスピレータ５、
テフロンチューブ７、試験管３およびアスピレータ５に
直流電圧を印加する直流電源装置９、ポンプ１１、電磁
弁ユニット１３、廃液タンク１５、洗浄液タンク１７、
振動ユニット１９、振動伝達子２１、電流計２３、冷却
パイプ２５、クーリングユニット２７、コントローラ２
９を備えて構成されている。

【００２０】試験管３は、試料３１を収容する容器であ
るとともに正極となるものであり、少なくとも内面の一
部が導電性の材料により形成されたものを用いる。この
ため、試験管を導電性の材料で作成したり、ガラスなど
の絶縁体製試験管の内面に導電性皮膜を被着させたもの
を用いる。そしてこの試験管の内面を構成する材料とし
ては、金（Ａｕ）、白金（Ｐｔ）、カーボン（Ｃ）等の
細胞に影響を及ぼさない材質が好ましい。試験管３の導
電部は直流電源装置９の正極に接続されている。

【００２１】なお試験管をステンレス、銅等の金属で作
成し、その内面を金、白金等でメッキを施したり、スパ
ッタリング等により皮膜を形成しても良い。アスピレー
タ５も試験管３と同様の材質を用い、その少なくとも一
部の表面は負極として作用させるため、金（Ａｕ）、白
金（Ｐｔ）、カーボン（Ｃ）等の細胞に影響を及ぼさな
い導電性材質でおおわれていて、電流計２３を介して直
流電源装置９の負極に接続されている。

【００２２】テフロンチューブ７は、アスピレータ５の
内部に挿通され、その先端部７ａは丸く成形され、アス
ピレータ５の先端より５ｍｍ程度突出するように配置さ
れている。このテフロンチューブ７により、試験管３と
アスピレータ５との短絡を防止することができる。

【００２３】直流電源装置９は、コントローラ２９から
オン・オフおよび電圧、電流の制御が可能なプログラマ
ブル直流電源装置であり、試験管３とアスピレータ５と
の間に直流電圧を印加する。

【００２４】ポンプ１１は、試験管３の内部から廃液タ
ンク１５へ、または洗浄液タンク１７から試験管３の内
部へ、廃液または洗浄液を輸送するものである。電磁弁
ユニット１３は、ポンプ１１の接続先を廃液タンク１５
または洗浄液タンク１７に切り替えるものであり、コン
トローラ２９の制御により動作する。

【００２５】廃液タンク１５は、試験管３で細胞を分離
した廃液や、洗浄後の廃液を回収して貯留するタンクで
ある。洗浄液タンク１７は、分離した細胞を洗浄する洗
浄液（希釈液）を供給するタンクである。洗浄液として
は、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、市販のＲＰＭ
Ｉ１６４０のような細胞培養用培地などを用いる。洗浄
液は、溶液の電気伝導度、細胞に対する浸透圧が既知
で、かつ細胞毒性の少ないものであればよい。

【００２６】振動ユニット１９は、試験管３の内部の試
料中の細胞を攪拌してまんべんなく分離できるように、
試験管３またはアスピレータ５を振動させるために用い
る。振動ユニット１９は、コントローラ２９からの制御
により、振動を開始したり、停止したりすることができ
る。振動ユニット１９の振動は、細胞分離のための通電
中、および電極に吸着した細胞を洗浄液に懸濁させると
きに行い、これ以外は、振動ユニット１９の振動は停止
される。本実施の形態では、アスピレータ５を振動させ
ているが、試験管３を振動させてもよい。振動子として
は、圧電素子、磁気歪み振動子等が用いられる。

【００２７】振動伝達子２１は、振動ユニット１９の振
動をアスピレータ５に伝達するための部材である。電流
計２３は、試験管３とアスピレータ５との間に印加され
る電圧により流れる電流を測定するものであり、その測
定値は、コントローラ２９に送られ、電極間短絡の検出
や、細胞分離の制御等に使用しても良い。

【００２８】冷却パイプ２５は、試験管３の周囲に巻回
されたパイプであり、その両端はクーリングユニット２
７に接続されている。冷却パイプ２５の中にはクーリン
グユニット２７で冷却された冷却液が流れ、試験管３の
内部に収容された試料３１の温度上昇を防ぐことができ
る。

【００２９】クーリングユニット２７は、冷却パイプ２
５に冷却液を供給するものであり、氷水を容れた容器か
ら冷えた水を冷却水として供給する簡易型から、ペルチ
ェ効果を利用した電子冷却装置により冷却液を冷却する
高精度なクーリングユニットまで用途に応じて設置すれ
ばよい。また、上記冷却パイプを用いる代わりに、試験
管３を冷却恒温水槽に浸漬する方法も考えられる。

【００３０】コントローラ２９は、細胞分離装置１全体
を制御するユニットであり、マイクロプロセッサ等を使
用して、細胞分離の過程を全て自動制御するようにして
もよい。

【００３１】次に、図２のフローチャートを参照して、
細胞分離装置１を使用して血液から血球を分離する場合
の操作手順を説明する。まず、分離目的が白血球のみで
あり、赤血球の混入を防ぎたい場合には、予め血液サン
プルに市販の溶血剤（コールター・カウンター試薬、ヘ
マトロン「エルマ」、ユニ・ティ・パック「コールタ
ー」など）を混入し所定時間放置して赤血球を溶血させ
る（ステップＳ１０１）。このステップＳ１０１の溶血
過程は、白血球とともに赤血球も分離する場合には、省
略される。

【００３２】次いで、血液サンプル（試料）３１を試験
管３に注入し、この血液サンプルに浸るようにアスピレ
ータ５をセットする（ステップＳ１０３）。このとき、
必要に応じてクーリングユニット２７を動作させ、試験
管３を冷却してもよい。

【００３３】次いで、試験管３とアスピレータ５との間
に直流電源装置９により直流電圧を印加し通電するとと
もに振動ユニット１９の振動を開始させ、アスピレータ
５を振動させる（ステップＳ１０５）。このときの電界
強度（電圧勾配）は１０〜４００Ｖ／ｃｍを目安とし、
通電時間は５〜６０秒とするが、これに限定されない。
但し、電圧印加条件が強すぎると、細胞が融合したり破
壊されることがあるので注意を要する。

【００３４】この通電により負の膜電荷を有する血球細
胞が正極である試験管３の内壁に吸着される。またアス
ピレータ５の振動により試験管３の内部の血液サンプル
３１が攪拌され、まんべんなく血球が分離される。

【００３５】次いで、通電により血球細胞の正極への泳
動および吸着が終わると、通電状態を保持したまま、振
動ユニット１９の振動を停止させ、血球細胞が吸着され
た残りの廃液をポンプ１１によりアスピレータ５を通じ
て試験管３内から廃液タンク１５へ排出する（ステップ
Ｓ１０７）。このとき電磁弁ユニット１３は、ポンプ１
１と廃液タンク１５とが連通するように弁を切り替え
る。

【００３６】次いで、通電を止め、洗浄液を洗浄液タン
ク１７から試験管３へ注入する（ステップＳ１０９）。
このとき電磁弁ユニット１３は、ポンプ１１と洗浄液タ
ンク１７とが連通するように弁を切り替える。

【００３７】次いで、通電を止めた状態で、振動ユニッ
ト１９の振動によりアスピレータ５を振動させ、試料３
１を攪拌することにより正極に吸着した血球を洗浄液に
懸濁させる（ステップＳ１１１）。

【００３８】次いで、繰り返しが必要か否かを判定し
（ステップＳ１１３）、必要であればステップＳ１０５
へ戻る。繰り返しが必要でなければ、細胞分離を終了す
る。以上好ましい実施の形態について説明したが、これ
は本発明を限定するものではない。たとえば、絶縁性の
容器、例えばガラス製試験管に分離目的の細胞を含む細
胞懸濁液を収容し、この容器にそれぞれ直流電源の正
極、負極に接続された電極を浸して細胞分離を行うこと
も本発明の範囲内である。

【００３９】また、分離対象の細胞も、血液中の血球に
限らず、細胞懸濁液中の分離したい細胞に特異的に結合
する薬剤（例えば、抗体、遺伝子プローブなど）を試料
に添加することも可能である。これらの薬剤は、いずれ
も負の電荷を持っているため、細胞の薬剤結合量に応じ
た負電荷に対して懸濁液中の細胞の泳動速度が比例す
る。従って、これらの薬剤をマーカとして用いた細胞の
分離、濃縮も本発明の細胞分離装置により行うことがで
きる。

【００４０】

【発明の効果】以上説明したように請求項１記載の本発
明によれば、細胞懸濁液を収容した容器に、第１および
第２の電極を浸し、これらの電極間に直流電圧を印加す
ることにより、負の膜電荷を有する細胞を正極に泳動さ
せ吸着することにより、簡単な装置で短時間に懸濁液か
ら細胞を分離することができるという効果を奏する。

【００４１】また請求項２記載の本発明によれば、細胞
懸濁液を収容する容器の内面を正極とすることにより、
さらに細胞分離装置の構成が簡単となるという効果を奏
する。

【００４２】また請求項３記載の本発明によれば、容器
内に浸されたアスピレータを第２の電極とすることによ
り、さらに細胞分離装置の構成が簡単となるという効果
を奏する。

【００４３】また請求項４記載の本発明によれば、第１
および第２の電極間に介在する絶縁体をさらに設けたこ
とにより、電極間の短絡を防止することができ、円滑な
細胞分離を行うことができるという効果を奏する。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明に係る細胞分離装置の概念を示す構成図
である。

【図２】本発明に係る細胞分離装置による細胞分離過程
を説明するフローチャートである。

【図３】従来の遠心分離法による細胞分離を説明する図
である。

【符号の説明】

１…細胞分離装置、３…試験管、５…アスピレータ、７
…テフロンチューブ、９…直流電源装置、１１…ポン
プ、１３…電磁弁ユニット、１５…廃液タンク、１７…
洗浄液タンク、１９…振動ユニット、２１…振動伝達
子、２３…電流計、２５…冷却パイプ、２７…クーリン
グユニット、２９…コントローラ、３１…試料。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 細胞懸濁液から細胞を分離する細胞分離
   装置であって、 前記細胞懸濁液を収容する容器と、 この細胞懸濁液に浸された第１および第２の電極と、 これら第１および第２の電極間に直流電圧を印加する直
   流電源と、 を備えたことを特徴とする細胞分離装置。
2. 【請求項２】 前記第１の電極は、前記容器の少なくと
   も内面の一部に設けられた導電性物質により構成され、
   この第１の電極に前記直流電源より正電圧が印加される
   ことを特徴とする請求項１に記載の細胞分離装置。
3. 【請求項３】 前記第２の電極は、前記容器内に浸され
   たアスピレータの少なくとも一部の表面に設けられた導
   電性物質により構成されたことを特徴とする請求項１ま
   たは請求項２に記載の細胞分離装置。
4. 【請求項４】 前記第１および第２の電極間に介在する
   絶縁体をさらに設けたことを特徴とする請求項１ないし
   請求項３に記載の細胞分離装置。