JPH1169999A - 播種性マイコバクテリウム・アビウム複合体感染を検出するための多重化ｐｃｒアッセイ - Google Patents
播種性マイコバクテリウム・アビウム複合体感染を検出するための多重化ｐｃｒアッセイInfo
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 マイコバクテリウム・アビウム複合体（ＭＡ
Ｃ）生物に特異的な核酸プライマーおよびプローブ、生
物学的試料中のＭＡＣ生物の検出および識別のための核
酸増幅方法におけるそれらの使用、並びにＭＡＣを含ん
で成る種々の生物を検出および識別するための診断キッ
トを提供する。 【解決手段】 前記プライマーおよびプローブは、MacS
equivar 遺伝子領域、Ｍ．アビウム19 kD タンパク質遺
伝子領域およびＭ．イントラセルラーレリボソームタン
パク質sl遺伝子領域のうちの２つ以上に特異的なオリゴ
ヌクレオチドである。
Ｃ）生物に特異的な核酸プライマーおよびプローブ、生
物学的試料中のＭＡＣ生物の検出および識別のための核
酸増幅方法におけるそれらの使用、並びにＭＡＣを含ん
で成る種々の生物を検出および識別するための診断キッ
トを提供する。 【解決手段】 前記プライマーおよびプローブは、MacS
equivar 遺伝子領域、Ｍ．アビウム19 kD タンパク質遺
伝子領域およびＭ．イントラセルラーレリボソームタン
パク質sl遺伝子領域のうちの２つ以上に特異的なオリゴ
ヌクレオチドである。
Description
【０００１】
【発明が属する技術分野】本発明は、マイコバクテリウ
ム・アビウム（Mycobacterium avium）複合体（ＭＡ
Ｃ）生物に特異的な核酸プライマーおよびプローブ、並
びに生物学的試料中の前記生物の検出および識別のため
の核酸増幅方法におけるそれらの使用に関する。本発明
はＭＡＣを含んで成る種々の生物を検出・識別するため
の診断キットにも関する。
ム・アビウム（Mycobacterium avium）複合体（ＭＡ
Ｃ）生物に特異的な核酸プライマーおよびプローブ、並
びに生物学的試料中の前記生物の検出および識別のため
の核酸増幅方法におけるそれらの使用に関する。本発明
はＭＡＣを含んで成る種々の生物を検出・識別するため
の診断キットにも関する。
【０００２】
【従来の技術】マイコバクテリウム・アビウム複合体
（ＭＡＣ）は、その多くがＭ．アビウムまたはＭ．イン
トラセルラーレ（M. intracellulare）として分類され
る多数の生物から成る。加えて、それらがＭ．アビウム
とＭ．イントラセルラーレの両方の性質を有するため
に、あるいはそれらが別のマイコバクテリウムとＭ．ア
ビウムまたはＭ．イントラセルラーレのいずれかとの複
合性質を有するために、正しく分類することができない
多数の生物がＭＡＣの中に存在する〔Wayne 他、Intern
ational J. Systematic Bacteriol., 43(3):482-489 (1
993)〕。
（ＭＡＣ）は、その多くがＭ．アビウムまたはＭ．イン
トラセルラーレ（M. intracellulare）として分類され
る多数の生物から成る。加えて、それらがＭ．アビウム
とＭ．イントラセルラーレの両方の性質を有するため
に、あるいはそれらが別のマイコバクテリウムとＭ．ア
ビウムまたはＭ．イントラセルラーレのいずれかとの複
合性質を有するために、正しく分類することができない
多数の生物がＭＡＣの中に存在する〔Wayne 他、Intern
ational J. Systematic Bacteriol., 43(3):482-489 (1
993)〕。
【０００３】マイコバクテリウム・アビウム複合体は少
なくとも26の血清型から成る。それらの生物は初め、特
異的に凝集させる抗血清の存在下でのそれらの凝集によ
り定義された（それらの細胞壁表面抗原との免疫反応を
通して）。Ｍ．アビウムは血清型１〜６、８〜11および
21を含むと考えられ、そしてＭ．イントラセルラーレは
血清型７、12〜17、19、20、25を含むと考えられている
〔Wayne 他、Clin. Microbiol. Rev. 5:1-25 (1992) お
よびH. Saito他、J. Clin. Microbiol., 28:1694-1697
(1990)〕。
なくとも26の血清型から成る。それらの生物は初め、特
異的に凝集させる抗血清の存在下でのそれらの凝集によ
り定義された（それらの細胞壁表面抗原との免疫反応を
通して）。Ｍ．アビウムは血清型１〜６、８〜11および
21を含むと考えられ、そしてＭ．イントラセルラーレは
血清型７、12〜17、19、20、25を含むと考えられている
〔Wayne 他、Clin. Microbiol. Rev. 5:1-25 (1992) お
よびH. Saito他、J. Clin. Microbiol., 28:1694-1697
(1990)〕。
【０００４】Frothingham 他〔J. Bacteriol., 175(1
0):2818-2825 (1993) 〕は、それらの生物を更に配列型
（sequevar）に分類した。配列型分類は、ＭＡＣを代表
する生物の参考株の16s-23s rRNA内部転写スペーサー領
域を配列決定することにより得られた。遺伝子配列に基
づくこの分類体系は、非Ｍ．アビウム非Ｍ．イントラセ
ルラーレＭＡＣ株の中の広範囲の遺伝子多様性を明らか
にした。Frothingham 他は、それらの参考株を、Ｍ．ア
ビウム生物についてはMav-A からMav-D まで、Ｍ．イン
トラセルラーレについてはMin-A 、そしてアビウム階級
区分にもイントラセルラーレ階級区分にも当てはまらな
い全てのＭ．アビウム複合体株についてはMAC-A からMA
C-H までに分類した〔Frothingham 他、J. Infect. Dis
eases, 169:305-312 (1994) も参照のこと〕。
0):2818-2825 (1993) 〕は、それらの生物を更に配列型
（sequevar）に分類した。配列型分類は、ＭＡＣを代表
する生物の参考株の16s-23s rRNA内部転写スペーサー領
域を配列決定することにより得られた。遺伝子配列に基
づくこの分類体系は、非Ｍ．アビウム非Ｍ．イントラセ
ルラーレＭＡＣ株の中の広範囲の遺伝子多様性を明らか
にした。Frothingham 他は、それらの参考株を、Ｍ．ア
ビウム生物についてはMav-A からMav-D まで、Ｍ．イン
トラセルラーレについてはMin-A 、そしてアビウム階級
区分にもイントラセルラーレ階級区分にも当てはまらな
い全てのＭ．アビウム複合体株についてはMAC-A からMA
C-H までに分類した〔Frothingham 他、J. Infect. Dis
eases, 169:305-312 (1994) も参照のこと〕。
【０００５】ＭＡＣの菌群により引き起こされる感染
は、特にエイズ（AIDS）にかかっている個体（特に極端
に低いCD4 数を有するそれらの個体）において、重要な
臨床問題となっている。Yakrus他〔J. Clin. Microbio
l., 28:926-929 (1990)〕は播種性疾患に最も頻繁に関
連するＭＡＣ生物を同定した：Ｍ．アビウム血清型４
（40％）、Ｍ．アビウム血清型８（17％）、型分類でき
ないＭＡＣ（13％）、およびＭ．アビウム血清型１（９
％）。
は、特にエイズ（AIDS）にかかっている個体（特に極端
に低いCD4 数を有するそれらの個体）において、重要な
臨床問題となっている。Yakrus他〔J. Clin. Microbio
l., 28:926-929 (1990)〕は播種性疾患に最も頻繁に関
連するＭＡＣ生物を同定した：Ｍ．アビウム血清型４
（40％）、Ｍ．アビウム血清型８（17％）、型分類でき
ないＭＡＣ（13％）、およびＭ．アビウム血清型１（９
％）。
【０００６】播種性ＭＡＣの実験室診断は慣例的には培
養方法論に基づいている。ＭＡＣ培養方法は労力、材料
および資財集中的であり、そして決定的診断には比較的
長い時間を要する。このため、ＭＡＣ感染の検出にはポ
リメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）試験が有利であろう。
養方法論に基づいている。ＭＡＣ培養方法は労力、材料
および資財集中的であり、そして決定的診断には比較的
長い時間を要する。このため、ＭＡＣ感染の検出にはポ
リメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）試験が有利であろう。
【０００７】標的核酸のＰＣＲによる増幅は、標的ＤＮ
Ａ配列の迅速且つ高感度の検出を可能にする。増幅され
た核酸は、非同位体検出方法を使って容易に検出される
濃度に蓄積する。ＰＣＲ技術は理論上、実施者がただ１
つの標的を含むかもしれない試料中の特定の標的核酸を
同定できるようにする。
Ａ配列の迅速且つ高感度の検出を可能にする。増幅され
た核酸は、非同位体検出方法を使って容易に検出される
濃度に蓄積する。ＰＣＲ技術は理論上、実施者がただ１
つの標的を含むかもしれない試料中の特定の標的核酸を
同定できるようにする。
【０００８】Kulski他〔J. Clin. Microbiol., 33:668
(1995)〕は、マイコバクテリウム属の仲間を検出するた
めの並びにＭ．ツベルクローシス、Ｍ．アビウムおよび
Ｍ．イントラセルラーレを検出・識別するためのＰＣＲ
技術の使用を研究した。この研究者らは、16s rRNA遺伝
子の複数領域とMPB 70遺伝子の一領域を同時増幅させて
Ｍ．ツベルクローシス、Ｍ．アビウムおよびＭ．イント
ラセルラーレを検出・識別した。
(1995)〕は、マイコバクテリウム属の仲間を検出するた
めの並びにＭ．ツベルクローシス、Ｍ．アビウムおよび
Ｍ．イントラセルラーレを検出・識別するためのＰＣＲ
技術の使用を研究した。この研究者らは、16s rRNA遺伝
子の複数領域とMPB 70遺伝子の一領域を同時増幅させて
Ｍ．ツベルクローシス、Ｍ．アビウムおよびＭ．イント
ラセルラーレを検出・識別した。
【０００９】Abed他〔Res. Microbiol., 146:405, 199
5〕は、16s 〜23s rRNAスペーサー領域全体を増幅さ
せ、そしてRAPDフィンガープリンティングの二次技術を
使って11のマイコバクテリウム種に属する56の株を識別
した。それらのＰＣＲプライマーは遺伝子間領域の外側
に存し、それらの正および逆プライマーはそれぞれ16s
rRNA遺伝子と23s rRNA遺伝子にターゲティングされた
（特異的に向けられた）。
5〕は、16s 〜23s rRNAスペーサー領域全体を増幅さ
せ、そしてRAPDフィンガープリンティングの二次技術を
使って11のマイコバクテリウム種に属する56の株を識別
した。それらのＰＣＲプライマーは遺伝子間領域の外側
に存し、それらの正および逆プライマーはそれぞれ16s
rRNA遺伝子と23s rRNA遺伝子にターゲティングされた
（特異的に向けられた）。
【００１０】Barry 他（欧州特許公開No. 0395292 ）お
よびRossau他（欧州特許公開No. 0525095 ）は、全16s
〜23s 遺伝子間領域の増幅、および16s 〜23s 遺伝子間
領域内の配列に対して特異的に向けられたプローブを使
った細菌生物の診断試験を記載している。Abed他と同
様、Barry 他とRossau他により使われたプライマーは16
s または23s rRNAをコードする遺伝子中に存在する配列
に対して特異的に向けられた。
よびRossau他（欧州特許公開No. 0525095 ）は、全16s
〜23s 遺伝子間領域の増幅、および16s 〜23s 遺伝子間
領域内の配列に対して特異的に向けられたプローブを使
った細菌生物の診断試験を記載している。Abed他と同
様、Barry 他とRossau他により使われたプライマーは16
s または23s rRNAをコードする遺伝子中に存在する配列
に対して特異的に向けられた。
【００１１】Booth 他〔Infection and Immunity, 61
(4):1509 (1993) 〕は、Ｍ．アビウム、Ｍ．ツベルクロ
ーシスおよびＭ．イントラセルラーレの19 kD （キロダ
ルトン）タンパク質遺伝子間に高度の相同性を見出し
た。遺伝子レベルでのこの高度の相同性は、タンパク質
レベルにも存続する。Nair他〔Molecular Microbiolog
y,6(11):1431 (1992) 〕は、Ｍ．イントラセルラーレ遺
伝子が血清活性リポタンパク質をコードすることを証明
した。このリポタンパク質は血清学的に活性な19 kD
Ｍ．ツベルクローシスタンパク質のＭ．イントラセルラ
ーレ相同体であると考えられた。
(4):1509 (1993) 〕は、Ｍ．アビウム、Ｍ．ツベルクロ
ーシスおよびＭ．イントラセルラーレの19 kD （キロダ
ルトン）タンパク質遺伝子間に高度の相同性を見出し
た。遺伝子レベルでのこの高度の相同性は、タンパク質
レベルにも存続する。Nair他〔Molecular Microbiolog
y,6(11):1431 (1992) 〕は、Ｍ．イントラセルラーレ遺
伝子が血清活性リポタンパク質をコードすることを証明
した。このリポタンパク質は血清学的に活性な19 kD
Ｍ．ツベルクローシスタンパク質のＭ．イントラセルラ
ーレ相同体であると考えられた。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】ＭＡＣの存在を検出す
るためのアッセイをデザインする時、当業者らはＭＡＣ
を構成するが非ＭＡＣ生物と交差反応しない全ての生物
を検出するプライマーとプローブの組合せを選択するた
めに相当な努力を迫られる。
るためのアッセイをデザインする時、当業者らはＭＡＣ
を構成するが非ＭＡＣ生物と交差反応しない全ての生物
を検出するプライマーとプローブの組合せを選択するた
めに相当な努力を迫られる。
【００１３】
【課題を解決するための手段】本発明は、それらの生物
の少なくとも２つの、好ましくは３つの遺伝子領域を同
時増幅するために用いることができる、ＭＡＣ生物に特
異的なプライマーおよびプローブを提供することによ
り、それらの課題を解決する。
の少なくとも２つの、好ましくは３つの遺伝子領域を同
時増幅するために用いることができる、ＭＡＣ生物に特
異的なプライマーおよびプローブを提供することによ
り、それらの課題を解決する。
【００１４】
【発明の実施の形態】一態様では、本発明はＭＡＣ生物
からの核酸を増幅させる方法に関する。この方法は、Ｍ
ＡＣ生物からの核酸を含む疑いのある試料を、前記ＭＡ
Ｃ核酸が増幅されるような条件下で、４種類のヌクレオ
シド三リン酸、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、並びに次の
３つの遺伝子領域：MacSequevar 遺伝子領域、Ｍ．アビ
ウム19キロダルトンタンパク質遺伝子領域およびＭ．イ
ントラセルラーレリボソームタンパク質ｓ１遺伝子領域
のうちの２つ以上に特異的なオリゴヌクレオチドプライ
マーのセット、と接触させることを含んで成る。
からの核酸を増幅させる方法に関する。この方法は、Ｍ
ＡＣ生物からの核酸を含む疑いのある試料を、前記ＭＡ
Ｃ核酸が増幅されるような条件下で、４種類のヌクレオ
シド三リン酸、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、並びに次の
３つの遺伝子領域：MacSequevar 遺伝子領域、Ｍ．アビ
ウム19キロダルトンタンパク質遺伝子領域およびＭ．イ
ントラセルラーレリボソームタンパク質ｓ１遺伝子領域
のうちの２つ以上に特異的なオリゴヌクレオチドプライ
マーのセット、と接触させることを含んで成る。
【００１５】別の態様では、本発明はＭＡＣ生物からの
核酸を増幅させて検出する方法に関する。この方法は、
ＭＡＣ生物からの核酸を含む疑いのある試料を、前記核
酸が増幅されるような条件下で、４種類のヌクレオシド
三リン酸、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、並びに次の３つ
の遺伝子領域：MacSequevar 遺伝子領域、Ｍ．アビウム
19キロダルトンタンパク質遺伝子領域およびＭ．イント
ラセルラーレリボソームタンパク質ｓ１遺伝子領域のう
ちの２つ以上に特異的なオリゴヌクレオチドプライマー
のセット、と接触させることを含んで成る。次いで増幅
生成物を変性せしめ、検出する。
核酸を増幅させて検出する方法に関する。この方法は、
ＭＡＣ生物からの核酸を含む疑いのある試料を、前記核
酸が増幅されるような条件下で、４種類のヌクレオシド
三リン酸、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、並びに次の３つ
の遺伝子領域：MacSequevar 遺伝子領域、Ｍ．アビウム
19キロダルトンタンパク質遺伝子領域およびＭ．イント
ラセルラーレリボソームタンパク質ｓ１遺伝子領域のう
ちの２つ以上に特異的なオリゴヌクレオチドプライマー
のセット、と接触させることを含んで成る。次いで増幅
生成物を変性せしめ、検出する。
【００１６】更に別の態様では、本発明はマイコバクテ
リウム・アビウム複合体（ＭＡＣ）の別の生物からＭ．
アビウムを検出し識別する方法であって、ＭＡＣ生物か
らの核酸を含む疑いのある試料を、ヌクレオチド配列：
5' CCC TGA GAC AAC ACT XGGTCC GTC C 3' （ここでＸ
はＣ以外の任意のヌクレオチドである）を含むオリゴヌ
クレオチドプローブと接触せしめ、そして前記試料中に
存在する核酸と前記プローブとの間で形成された複合体
の存否を検出することを含んで成る方法に関する。
リウム・アビウム複合体（ＭＡＣ）の別の生物からＭ．
アビウムを検出し識別する方法であって、ＭＡＣ生物か
らの核酸を含む疑いのある試料を、ヌクレオチド配列：
5' CCC TGA GAC AAC ACT XGGTCC GTC C 3' （ここでＸ
はＣ以外の任意のヌクレオチドである）を含むオリゴヌ
クレオチドプローブと接触せしめ、そして前記試料中に
存在する核酸と前記プローブとの間で形成された複合体
の存否を検出することを含んで成る方法に関する。
【００１７】本発明の様々な他の目的および利点は下記
の発明の詳細な説明から明らかであろう。非ＭＡＣマイ
コバクテリアと交差反応しない全てのＭＡＣ生物を検出
する核酸同時増幅方法の開発は非常に興味をかき立て
る。本出願人らは、ＭＡＣ生物からの核酸の増幅および
／または検出に関する本発明に到達するまでに幾つかの
障害を克服した。
の発明の詳細な説明から明らかであろう。非ＭＡＣマイ
コバクテリアと交差反応しない全てのＭＡＣ生物を検出
する核酸同時増幅方法の開発は非常に興味をかき立て
る。本出願人らは、ＭＡＣ生物からの核酸の増幅および
／または検出に関する本発明に到達するまでに幾つかの
障害を克服した。
【００１８】本発明では、多重化方式において互いに適
合でき、従ってＭＡＣ生物からの核酸を増幅するための
同時増幅アッセイに用いることができる３つの遺伝子領
域を同定した。それらの３つの遺伝子領域は、Ｍ．アビ
ウム、Ｍ．イントラセルラーレおよび非Ｍ．アビウム非
Ｍ．イントラセルラーレＭＡＣ生物に見つかる MacSequ
evar（MSqv）遺伝子領域；Ｍ．アビウム19キロダルトン
タンパク質（MAV19K）遺伝子領域；およびＭ．イントラ
セルラーレリボソームタンパク質ｓｌ（rpsl）遺伝子領
域である。それらの領域の２つ以上に特異的なプライマ
ーを使って、試料調製、増幅および／または検出の際の
問題により起こる偽陰性結果の検出を可能にする内部陽
性対照（ＩＰＣ）の存在下で、多重化方式で増幅を行う
ことができる。
合でき、従ってＭＡＣ生物からの核酸を増幅するための
同時増幅アッセイに用いることができる３つの遺伝子領
域を同定した。それらの３つの遺伝子領域は、Ｍ．アビ
ウム、Ｍ．イントラセルラーレおよび非Ｍ．アビウム非
Ｍ．イントラセルラーレＭＡＣ生物に見つかる MacSequ
evar（MSqv）遺伝子領域；Ｍ．アビウム19キロダルトン
タンパク質（MAV19K）遺伝子領域；およびＭ．イントラ
セルラーレリボソームタンパク質ｓｌ（rpsl）遺伝子領
域である。それらの領域の２つ以上に特異的なプライマ
ーを使って、試料調製、増幅および／または検出の際の
問題により起こる偽陰性結果の検出を可能にする内部陽
性対照（ＩＰＣ）の存在下で、多重化方式で増幅を行う
ことができる。
【００１９】本発明はＭＡＣ生物からの核酸を増幅する
方法に関する。本発明の方法では、前記ＭＡＣ生物の核
酸を含む疑いのある生物学的試料を、前記３つの遺伝子
領域の２つ以上に特異的なプライマーセットと接触させ
ることにより、ＭＡＣゲノムの特定の遺伝子領域が増幅
される。好ましくは、それらの３つの遺伝子領域の全部
に特異的なプライマーセットを使ってそれらの３つの遺
伝子領域を同時増幅させる。該プライマーに加えて、試
料中に存在するどんなＭＡＣ生物でも増幅されたその標
的核酸を有するような条件下で、前記生物学的試料をＰ
ＣＲ試薬、例えば４種類のヌクレオシド三リン酸および
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼと接触させる。本発明での使
用に適するプライマーの例としては、第１表に示される
ものが挙げられるが、それらに限定されない。
方法に関する。本発明の方法では、前記ＭＡＣ生物の核
酸を含む疑いのある生物学的試料を、前記３つの遺伝子
領域の２つ以上に特異的なプライマーセットと接触させ
ることにより、ＭＡＣゲノムの特定の遺伝子領域が増幅
される。好ましくは、それらの３つの遺伝子領域の全部
に特異的なプライマーセットを使ってそれらの３つの遺
伝子領域を同時増幅させる。該プライマーに加えて、試
料中に存在するどんなＭＡＣ生物でも増幅されたその標
的核酸を有するような条件下で、前記生物学的試料をＰ
ＣＲ試薬、例えば４種類のヌクレオシド三リン酸および
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼと接触させる。本発明での使
用に適するプライマーの例としては、第１表に示される
ものが挙げられるが、それらに限定されない。
【００２０】
【表１】
【００２１】着目の３遺伝子領域に特異的な別のプライ
マーセットは、当業者により容易に決定することができ
よう。
マーセットは、当業者により容易に決定することができ
よう。
【００２２】ＭＡＣの核酸が増幅されさえすれば、既知
の検出方法を使って、増幅された標的核酸の存否を検出
することができる。例えば、増幅された遺伝子領域に特
異的なオリゴヌクレオチドプローブを使って、増幅され
た標的核酸を検出することができる。当業者らは、使用
したプライマーセットを仮定すれば増幅された遺伝子領
域を検出するのに適当であるオリゴヌクレオチドプロー
ブを容易に同定することができる。本発明における使用
に適当であるオリゴヌクレオチドプローブとしては、限
定的でなくして第１表に記載のオリゴヌクレオチドが挙
げられる。
の検出方法を使って、増幅された標的核酸の存否を検出
することができる。例えば、増幅された遺伝子領域に特
異的なオリゴヌクレオチドプローブを使って、増幅され
た標的核酸を検出することができる。当業者らは、使用
したプライマーセットを仮定すれば増幅された遺伝子領
域を検出するのに適当であるオリゴヌクレオチドプロー
ブを容易に同定することができる。本発明における使用
に適当であるオリゴヌクレオチドプローブとしては、限
定的でなくして第１表に記載のオリゴヌクレオチドが挙
げられる。
【００２３】本発明はまた、ＭＡＣの別の生物からＭ．
アビウムを検出し識別する方法にも関する。これは、Ｍ
ＡＣ生物の核酸を含む疑いのある試料を、ヌクレオチド
配列：5' CCC TGA GAC AAC ACT XGG TCC GTC C 3' （こ
こでＸはＣ以外の任意のヌクレオチドである）を含むオ
リゴヌクレオチドプローブと接触せしめることにより達
成される。好ましくは、ＸはＧまたはＵである。そのよ
うなプローブは16s 〜23s rRNA遺伝子間領域に特異的で
あり且つＭ．アビウム特異的である。Ｃから別の任意ヌ
クレオチドへの一塩基置換は、プローブの特異性を変更
し、Ｍ．アビウムに対して高特異的にする。
アビウムを検出し識別する方法にも関する。これは、Ｍ
ＡＣ生物の核酸を含む疑いのある試料を、ヌクレオチド
配列：5' CCC TGA GAC AAC ACT XGG TCC GTC C 3' （こ
こでＸはＣ以外の任意のヌクレオチドである）を含むオ
リゴヌクレオチドプローブと接触せしめることにより達
成される。好ましくは、ＸはＧまたはＵである。そのよ
うなプローブは16s 〜23s rRNA遺伝子間領域に特異的で
あり且つＭ．アビウム特異的である。Ｃから別の任意ヌ
クレオチドへの一塩基置換は、プローブの特異性を変更
し、Ｍ．アビウムに対して高特異的にする。
【００２４】ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使った
核酸の増幅および検出のための一般原理と条件は非常に
良く知られており、その詳細は米国特許第4,683,195 号
（Mullis他）、同第4,683,202 号（Mullis）および同第
4,965,188 号（Mullis他）をはじめとする多数の文献中
に提供されている。よって、上記技術の教示とその中に
与えられる特別の教示を参照すれば、当業者は播種性
Ｍ．アビウム複合体を検出するためにＭＡＣ生物の２以
上の遺伝子領域を同時増幅させることによって本発明を
実施するのは何ら難しくないはずである。
核酸の増幅および検出のための一般原理と条件は非常に
良く知られており、その詳細は米国特許第4,683,195 号
（Mullis他）、同第4,683,202 号（Mullis）および同第
4,965,188 号（Mullis他）をはじめとする多数の文献中
に提供されている。よって、上記技術の教示とその中に
与えられる特別の教示を参照すれば、当業者は播種性
Ｍ．アビウム複合体を検出するためにＭＡＣ生物の２以
上の遺伝子領域を同時増幅させることによって本発明を
実施するのは何ら難しくないはずである。
【００２５】「オリゴヌクレオチド」という語は、１ま
たは複数のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレ
オチドから成る分子、例えばプライマー、プローブ、お
よび検出しようとする核酸断片のことを言う。
たは複数のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレ
オチドから成る分子、例えばプライマー、プローブ、お
よび検出しようとする核酸断片のことを言う。
【００２６】「プライマー」という語は、天然に存在す
るにせよ合成的に製造されるにせよ、核酸鎖（すなわち
鋳型）に相補的なプライマー伸長生成物の合成が誘導さ
れるような条件（そのような条件には、別のＰＣＲ試薬
の存在、並びに適当な温度およびｐＨが含まれる）下に
置いた時に合成の開始点として働くことができるオリゴ
ヌクレオチドのことである。
るにせよ合成的に製造されるにせよ、核酸鎖（すなわち
鋳型）に相補的なプライマー伸長生成物の合成が誘導さ
れるような条件（そのような条件には、別のＰＣＲ試薬
の存在、並びに適当な温度およびｐＨが含まれる）下に
置いた時に合成の開始点として働くことができるオリゴ
ヌクレオチドのことである。
【００２７】プライマーは、最大の増幅効率のために好
ましくは一本鎖であるが、所望であれば二本鎖領域を含
むことができる。それはＤＮＡポリメラーゼの存在下で
伸長生成物の合成を開始させるのに十分な程長くなけれ
ばならない。各プライマーの正確なサイズは、意図する
使用目的、プライマーの濃度および配列、標的配列の複
雑さ、反応温度、並びにプライマーの起源に依存して異
なるだろう。本発明で使用するプライマーは通常12〜60
ヌクレオチドであり、好ましくは16〜40ヌクレオチドを
有するだろう。より好ましくは、各プライマーは18〜35
ヌクレオチドを有する。
ましくは一本鎖であるが、所望であれば二本鎖領域を含
むことができる。それはＤＮＡポリメラーゼの存在下で
伸長生成物の合成を開始させるのに十分な程長くなけれ
ばならない。各プライマーの正確なサイズは、意図する
使用目的、プライマーの濃度および配列、標的配列の複
雑さ、反応温度、並びにプライマーの起源に依存して異
なるだろう。本発明で使用するプライマーは通常12〜60
ヌクレオチドであり、好ましくは16〜40ヌクレオチドを
有するだろう。より好ましくは、各プライマーは18〜35
ヌクレオチドを有する。
【００２８】本発明に有用なプライマーは、既知の技術
と装置、例えばABI DNA 合成装置（Applied Biosystems
から入手可能）またはBiosearch 8600シリーズもしくは
8800シリーズ合成装置（Milligen-Biosearch, Inc,から
入手可能）を使って調製することができる。この装置を
使う手順は周知であり、例えば米国特許第4,965,188号
明細書（Gelfand 他）に記載されている。生物学的源か
ら単離された天然に存在するプライマーも有用であるか
もしれない（例えば制限エンドヌクレアーゼ消化物）。
と装置、例えばABI DNA 合成装置（Applied Biosystems
から入手可能）またはBiosearch 8600シリーズもしくは
8800シリーズ合成装置（Milligen-Biosearch, Inc,から
入手可能）を使って調製することができる。この装置を
使う手順は周知であり、例えば米国特許第4,965,188号
明細書（Gelfand 他）に記載されている。生物学的源か
ら単離された天然に存在するプライマーも有用であるか
もしれない（例えば制限エンドヌクレアーゼ消化物）。
【００２９】本明細書中で用いる時、「プローブ」とは
標的核酸の核酸配列に実質的に相補的であり且つ増幅さ
れた標的核酸の検出または捕捉に用いられるオリゴヌク
レオチドである。
標的核酸の核酸配列に実質的に相補的であり且つ増幅さ
れた標的核酸の検出または捕捉に用いられるオリゴヌク
レオチドである。
【００３０】本発明では、配列特異的プライマーおよび
プローブが提供される。例えば、５′末端か３′末端の
いずれかへのヌクレオチドの付加により（前記ヌクレオ
チドは標的配列に相補的であるかまたは非相補的であ
る）、追加の配列特異的プライマーおよびプローブを調
製できることは当業者に明白であろう。そのような組成
物は本発明の範囲内である。
プローブが提供される。例えば、５′末端か３′末端の
いずれかへのヌクレオチドの付加により（前記ヌクレオ
チドは標的配列に相補的であるかまたは非相補的であ
る）、追加の配列特異的プライマーおよびプローブを調
製できることは当業者に明白であろう。そのような組成
物は本発明の範囲内である。
【００３１】本発明において使われるプライマーおよび
／またはプローブは、所望により標識することができ
る。当該技術分野で既知の方法を使って、プライマーお
よび／またはプローブを特異的結合リガンド（例えばビ
オチン）、酵素（例えばグルコースオキシダーゼ、ペル
オキシダーゼ、ウリカーゼ、およびアルカリホスファタ
ーゼ）、放射性同位体、高電子密度試薬、色素原、蛍光
助剤、燐光成分またはフェリチンで標識することができ
る。好ましくは標識は特異的結合リガンドである。より
好ましくは標識はビオチンもしくはその誘導体、ストレ
プトアビジンもしくはその誘導体、またはハプテンであ
る。
／またはプローブは、所望により標識することができ
る。当該技術分野で既知の方法を使って、プライマーお
よび／またはプローブを特異的結合リガンド（例えばビ
オチン）、酵素（例えばグルコースオキシダーゼ、ペル
オキシダーゼ、ウリカーゼ、およびアルカリホスファタ
ーゼ）、放射性同位体、高電子密度試薬、色素原、蛍光
助剤、燐光成分またはフェリチンで標識することができ
る。好ましくは標識は特異的結合リガンドである。より
好ましくは標識はビオチンもしくはその誘導体、ストレ
プトアビジンもしくはその誘導体、またはハプテンであ
る。
【００３２】「ＰＣＲ試薬」とは、ＰＣＲに不可欠であ
ると考えられる試薬のいずれか、すなわち、各標的核酸
のためのプライマーセット、ＤＮＡポリメラーゼ（好ま
しくは耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ）、ＤＮＡポリメラー
ゼ補因子、および１または複数のデオキシリボヌクレオ
シド−５′−三リン酸（dNTP's）のことである。ＰＣＲ
に使われる他の任意の試薬および材料については後述す
る。それらの試薬は個別に、試験キットの一部分とし
て、または試験装置の試薬室の中に、提供することがで
きる。
ると考えられる試薬のいずれか、すなわち、各標的核酸
のためのプライマーセット、ＤＮＡポリメラーゼ（好ま
しくは耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ）、ＤＮＡポリメラー
ゼ補因子、および１または複数のデオキシリボヌクレオ
シド−５′−三リン酸（dNTP's）のことである。ＰＣＲ
に使われる他の任意の試薬および材料については後述す
る。それらの試薬は個別に、試験キットの一部分とし
て、または試験装置の試薬室の中に、提供することがで
きる。
【００３３】ＤＮＡポリメラーゼは、プライマーと鋳型
の複合体においてプライマーの３′−ヒドロキシ末端に
デオキシヌクレオシド一リン酸分子を付加する酵素であ
るが、この付加は鋳型依存形式である。一般に、伸長生
成物の合成は、新しく合成された鎖の５′から３′方向
において、合成が終結するまで進行する。有用なＤＮＡ
ポリメラーゼとしては、例えば、Ｅ．コリＤＮＡポリメ
ラーゼＩ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、クレノウポリメ
ラーゼ、逆転写酵素、および当業界で既知の他のものが
挙げられる。好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼはそれが
熱に安定であることを意味する耐熱性であり、そして高
い温度で、特にＤＮＡ鎖のプライミングおよび伸長に使
われる高温において優先的に活性である。より詳しく
は、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、本明細書中に記載の
ポリメラーゼ連鎖反応に用いられる高温において実質的
に不活性でない。そのような温度は多数の反応条件、例
えばｐＨ、ヌクレオチド組成、プライマーの長さ、塩濃
度および当業界で既知の他の条件によって異なるだろ
う。
の複合体においてプライマーの３′−ヒドロキシ末端に
デオキシヌクレオシド一リン酸分子を付加する酵素であ
るが、この付加は鋳型依存形式である。一般に、伸長生
成物の合成は、新しく合成された鎖の５′から３′方向
において、合成が終結するまで進行する。有用なＤＮＡ
ポリメラーゼとしては、例えば、Ｅ．コリＤＮＡポリメ
ラーゼＩ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、クレノウポリメ
ラーゼ、逆転写酵素、および当業界で既知の他のものが
挙げられる。好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼはそれが
熱に安定であることを意味する耐熱性であり、そして高
い温度で、特にＤＮＡ鎖のプライミングおよび伸長に使
われる高温において優先的に活性である。より詳しく
は、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、本明細書中に記載の
ポリメラーゼ連鎖反応に用いられる高温において実質的
に不活性でない。そのような温度は多数の反応条件、例
えばｐＨ、ヌクレオチド組成、プライマーの長さ、塩濃
度および当業界で既知の他の条件によって異なるだろ
う。
【００３４】多数の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが技術の
現状において報告されており、それらとしては、米国特
許第4,965,188 号（Gelfand 他）および同第4,889,818
号（Gelfand 他）明細書中に詳述されたものが挙げられ
る。特に有用なポリメラーゼは様々なテルムス菌種、例
えばテルムス・アクアティカス（Thermus aquaticu
s）、テルムス・テルモフィラス（Thermus thermophilu
s）、テルムス・フィリフォルミス（Thermus filiformi
s）およびテルムス・フラブス（Thermus flavus）から
得られるものである。他の有用な耐熱性ポリメラーゼ
は、テルモコッカス・リテラリス（Thermococcus liter
alis）、ピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furi
osus）、テルモトガ種（Thermotoga sp.）およびWO-A-8
9/06691 （1989年７月27日公開）に記載のものをはじめ
とする様々な生物源から得られる。幾つかの有用な耐熱
性ポリメラーゼが市販されており、例えばPerkin Elmer
からAmpliTaq（商標）, Tth およびUlTma （商標）、St
ratageneからPfu 、並びにNew England Biolabs からVe
ntおよびDeep-Vent が市販されている。生物体から天然
ポリメラーゼを単離する技術、および組換え技術を用い
て遺伝子操作された酵素を生産する技術も多数知られて
いる。
現状において報告されており、それらとしては、米国特
許第4,965,188 号（Gelfand 他）および同第4,889,818
号（Gelfand 他）明細書中に詳述されたものが挙げられ
る。特に有用なポリメラーゼは様々なテルムス菌種、例
えばテルムス・アクアティカス（Thermus aquaticu
s）、テルムス・テルモフィラス（Thermus thermophilu
s）、テルムス・フィリフォルミス（Thermus filiformi
s）およびテルムス・フラブス（Thermus flavus）から
得られるものである。他の有用な耐熱性ポリメラーゼ
は、テルモコッカス・リテラリス（Thermococcus liter
alis）、ピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furi
osus）、テルモトガ種（Thermotoga sp.）およびWO-A-8
9/06691 （1989年７月27日公開）に記載のものをはじめ
とする様々な生物源から得られる。幾つかの有用な耐熱
性ポリメラーゼが市販されており、例えばPerkin Elmer
からAmpliTaq（商標）, Tth およびUlTma （商標）、St
ratageneからPfu 、並びにNew England Biolabs からVe
ntおよびDeep-Vent が市販されている。生物体から天然
ポリメラーゼを単離する技術、および組換え技術を用い
て遺伝子操作された酵素を生産する技術も多数知られて
いる。
【００３５】ＤＮＡポリメラーゼ補因子とは、酵素の活
性がそれに依存する非タンパク質化合物のことである。
よって、補因子が存在しなければ酵素は触媒的に不活性
である。多数の物質が既知の補因子であり、例えばその
非限定例として、マンガンおよびマグネシウムの塩、例
えば塩化物、硫酸塩、酢酸塩および脂肪酸塩が挙げられ
る。塩化マグネシウムおよび硫酸マグネシウムが好まし
い。
性がそれに依存する非タンパク質化合物のことである。
よって、補因子が存在しなければ酵素は触媒的に不活性
である。多数の物質が既知の補因子であり、例えばその
非限定例として、マンガンおよびマグネシウムの塩、例
えば塩化物、硫酸塩、酢酸塩および脂肪酸塩が挙げられ
る。塩化マグネシウムおよび硫酸マグネシウムが好まし
い。
【００３６】ＰＣＲに更に必要であるのは、２以上のデ
オキシリボヌクレオシド−５′−三リン酸、例えばdAT
P, dCTP, dGTP, dTTPおよびdUTPのうちの２以上であ
る。好ましくは４種の一般的三リン酸（dATP, dCTP, dG
TPおよびdTTP）が一緒に使用される。
オキシリボヌクレオシド−５′−三リン酸、例えばdAT
P, dCTP, dGTP, dTTPおよびdUTPのうちの２以上であ
る。好ましくは４種の一般的三リン酸（dATP, dCTP, dG
TPおよびdTTP）が一緒に使用される。
【００３７】本明細書中に記載のＰＣＲ試薬は、標的核
酸の増幅を提供するのに適当な濃度で供給されそしてＰ
ＣＲに使われる。増幅に必要であるプライマー、ＤＮＡ
ポリメラーゼ、補因子およびデオキシリボヌクレオシド
−５′−三リン酸の最小量並びに各々の最適範囲は当業
界で周知である。ＤＮＡポリメラーゼの最小量は通常少
なくとも約0.5 単位／100 μL 溶液であり、約２〜約25
単位／100 μL 溶液が好ましく、約７〜約20単位／100
μL 溶液がより好ましい。与えられた増幅系には他の量
が有用なことがある。「１単位」は、本明細書中では74
℃で30分間の間に伸長核酸鎖の中に10ナノモルの全ヌク
レオチド（dNTPs ）を取り込むのに必要とされる酵素活
性の量として定義される。増幅に用いる各プライマーの
最小量は少なくとも約0.075 マイクロモル濃度であり、
約0.1 〜約２マイクロモル濃度が好ましいが、他の量も
当業界で既知である。補因子は通常約２〜約15ミリモル
濃度の量で存在する。各dNTPの量は通常約0.25〜約3.5
ミリモル濃度である。
酸の増幅を提供するのに適当な濃度で供給されそしてＰ
ＣＲに使われる。増幅に必要であるプライマー、ＤＮＡ
ポリメラーゼ、補因子およびデオキシリボヌクレオシド
−５′−三リン酸の最小量並びに各々の最適範囲は当業
界で周知である。ＤＮＡポリメラーゼの最小量は通常少
なくとも約0.5 単位／100 μL 溶液であり、約２〜約25
単位／100 μL 溶液が好ましく、約７〜約20単位／100
μL 溶液がより好ましい。与えられた増幅系には他の量
が有用なことがある。「１単位」は、本明細書中では74
℃で30分間の間に伸長核酸鎖の中に10ナノモルの全ヌク
レオチド（dNTPs ）を取り込むのに必要とされる酵素活
性の量として定義される。増幅に用いる各プライマーの
最小量は少なくとも約0.075 マイクロモル濃度であり、
約0.1 〜約２マイクロモル濃度が好ましいが、他の量も
当業界で既知である。補因子は通常約２〜約15ミリモル
濃度の量で存在する。各dNTPの量は通常約0.25〜約3.5
ミリモル濃度である。
【００３８】ＰＣＲ試薬は、任意の適当な緩衝剤（多数
が当業界で既知である）を使って、約７〜約９の範囲内
のｐＨを有する緩衝溶液中に、個別にもしくは種々に組
み合わせてまたは全部一緒に供給することができる。
が当業界で既知である）を使って、約７〜約９の範囲内
のｐＨを有する緩衝溶液中に、個別にもしくは種々に組
み合わせてまたは全部一緒に供給することができる。
【００３９】ＰＣＲにおいて使用できる他の試薬として
は、例えば、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼに特異的な抗体
が挙げられる。抗体は増幅前に前記ポリメラーゼを抑制
するために使用することができる。本発明に有用な抗体
は、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼに特異的であり、約50℃
より低い温度でＤＮＡポリメラーゼの酵素活性を抑制
し、そして高い温度で失活する抗体である。有用な抗体
としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体お
よび抗体断片が挙げられる。好ましくは抗体はモノクロ
ーナルである。本発明において有用な抗体は、既知の方
法、例えばHarlow他、Antibodies: A Laboratory Manua
l, Cold Spring Harbor, NY (1988)に記載された方法を
使って調製することができる。
は、例えば、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼに特異的な抗体
が挙げられる。抗体は増幅前に前記ポリメラーゼを抑制
するために使用することができる。本発明に有用な抗体
は、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼに特異的であり、約50℃
より低い温度でＤＮＡポリメラーゼの酵素活性を抑制
し、そして高い温度で失活する抗体である。有用な抗体
としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体お
よび抗体断片が挙げられる。好ましくは抗体はモノクロ
ーナルである。本発明において有用な抗体は、既知の方
法、例えばHarlow他、Antibodies: A Laboratory Manua
l, Cold Spring Harbor, NY (1988)に記載された方法を
使って調製することができる。
【００４０】代表的なモノクローナル抗体は米国特許第
5,338,671 号明細書（Scalice 他）に記載されている。
常用の手順と、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレ
クション（ATCC）（Rockville, MD ）に寄託されたハイ
ブリドーマ細胞系HB 11126または11127 のいずれかを含
む出発材料を使って、当業者は２つのモノクローナル抗
体を容易に得ることができる。モノクローナル抗体は、
ＤＮＡポリメラーゼに対してモル比約５：１〜約500 ：
１の量で存在する。
5,338,671 号明細書（Scalice 他）に記載されている。
常用の手順と、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレ
クション（ATCC）（Rockville, MD ）に寄託されたハイ
ブリドーマ細胞系HB 11126または11127 のいずれかを含
む出発材料を使って、当業者は２つのモノクローナル抗
体を容易に得ることができる。モノクローナル抗体は、
ＤＮＡポリメラーゼに対してモル比約５：１〜約500 ：
１の量で存在する。
【００４１】ＭＡＣ生物からのものを包含する標的核酸
は、様々な起源、例えば末梢血単核細胞（RBMC）、全
血、呼吸系液体、リンパおよび糞便のいずれからも得る
ことができる。一般に、標的核酸はプライマーや他のＰ
ＣＲ試薬との接触に利用できるようにする通常のやり方
で抽出される。標的核酸が二本鎖であるなら、プライミ
ングが起こる前に二本鎖を分離しなければならない。変
性は熱処理、物理的処理または化学的処理といった任意
の既知技術を使って行うことができる。
は、様々な起源、例えば末梢血単核細胞（RBMC）、全
血、呼吸系液体、リンパおよび糞便のいずれからも得る
ことができる。一般に、標的核酸はプライマーや他のＰ
ＣＲ試薬との接触に利用できるようにする通常のやり方
で抽出される。標的核酸が二本鎖であるなら、プライミ
ングが起こる前に二本鎖を分離しなければならない。変
性は熱処理、物理的処理または化学的処理といった任意
の既知技術を使って行うことができる。
【００４２】増幅は、好ましくは、反応混合物を所望の
設定時間に渡り制御方式で温度循環させるように、連続
した自動方式で行われる。この目的で多数の機器が開発
されており、当業者に入手可能である。好ましくは、米
国特許第5,229,297 号明細書に記載の化学試験パックの
ような、密閉した反応容器中で増幅が行われる。前記容
器は米国特許第5,089,233 号明細書に記載の機器を使っ
て処理される。
設定時間に渡り制御方式で温度循環させるように、連続
した自動方式で行われる。この目的で多数の機器が開発
されており、当業者に入手可能である。好ましくは、米
国特許第5,229,297 号明細書に記載の化学試験パックの
ような、密閉した反応容器中で増幅が行われる。前記容
器は米国特許第5,089,233 号明細書に記載の機器を使っ
て処理される。
【００４３】増幅された核酸は多数の既知の方法、例え
ば米国特許第4,965,188 号明細書（Gelfand 他）に記載
の方法で検出することができる。例えば、増幅された核
酸はサザンブロッティング、ドットブロット技術、また
は標識プローブを用いる非同位体オリゴヌクレオチド捕
捉検出技術を使って検出することができる。あるいは、
適当に標識されたプライマーを使って増幅を行い、その
標識の検出手順および検出装置を使って、増幅されたプ
ライマー伸長生成物を検出することができる。
ば米国特許第4,965,188 号明細書（Gelfand 他）に記載
の方法で検出することができる。例えば、増幅された核
酸はサザンブロッティング、ドットブロット技術、また
は標識プローブを用いる非同位体オリゴヌクレオチド捕
捉検出技術を使って検出することができる。あるいは、
適当に標識されたプライマーを使って増幅を行い、その
標識の検出手順および検出装置を使って、増幅されたプ
ライマー伸長生成物を検出することができる。
【００４４】好ましい態様では、増幅された標的核酸
は、検出用に標識されており且つ増幅された標的と直接
的または間接的にハイブリダイズすることができるオリ
ゴヌクレオチドプローブを使って検出される。該プロー
ブは可溶性であっても固体支持体に取り付けられてもよ
い。本発明において複数のプローブを用いる時、該プロ
ーブは固体支持体の異なる位置に取り付けることができ
る。あるいは、該プローブを混合物として固体支持体の
同じ位置に取り付けることができる。別の好ましい態様
では、標的核酸を増幅させるのに使われるプライマーの
うちの１つまたは複数が、例えば特異的結合成分によっ
て標識される。標識プライマーが中に取り込まれている
生じたプライマー伸長生成物を、プローブを使って捕捉
することができる。該プローブにハイブリダイズした増
幅標的の検出は、当業界で周知である適当な検出装置お
よび手順を使って標識付プローブの存在または増幅され
た標識付標的の存在を検出することにより行うことがで
きる。標識によっては、検出装置を使わずに目で見るこ
とができるものもある。
は、検出用に標識されており且つ増幅された標的と直接
的または間接的にハイブリダイズすることができるオリ
ゴヌクレオチドプローブを使って検出される。該プロー
ブは可溶性であっても固体支持体に取り付けられてもよ
い。本発明において複数のプローブを用いる時、該プロ
ーブは固体支持体の異なる位置に取り付けることができ
る。あるいは、該プローブを混合物として固体支持体の
同じ位置に取り付けることができる。別の好ましい態様
では、標的核酸を増幅させるのに使われるプライマーの
うちの１つまたは複数が、例えば特異的結合成分によっ
て標識される。標識プライマーが中に取り込まれている
生じたプライマー伸長生成物を、プローブを使って捕捉
することができる。該プローブにハイブリダイズした増
幅標的の検出は、当業界で周知である適当な検出装置お
よび手順を使って標識付プローブの存在または増幅され
た標識付標的の存在を検出することにより行うことがで
きる。標識によっては、検出装置を使わずに目で見るこ
とができるものもある。
【００４５】より好ましい態様では、標的核酸を増幅さ
せるのに用いるプライマーの１つまたは複数がビオチン
により標識され、増幅されたビオチン化標的核酸が固体
支持体に取り付けられたプローブにハイブリダイズせし
められる。次いで、それらを酸化剤（例えば過酸化水
素）および適当な色素形成性組成物の存在下でストレプ
トアビジン−ペルオキシダーゼ接合体と接触させること
により、結合した標識が検出される。例えば、有用な色
素形成試薬として、テトラメチルベンジジンおよびその
誘導体、並びにロイコ色素、例えば米国特許第4,089,74
7 号明細書（Bruschi ）に記載のトリアリールイミダゾ
ールロイコ色素が挙げられる。
せるのに用いるプライマーの１つまたは複数がビオチン
により標識され、増幅されたビオチン化標的核酸が固体
支持体に取り付けられたプローブにハイブリダイズせし
められる。次いで、それらを酸化剤（例えば過酸化水
素）および適当な色素形成性組成物の存在下でストレプ
トアビジン−ペルオキシダーゼ接合体と接触させること
により、結合した標識が検出される。例えば、有用な色
素形成試薬として、テトラメチルベンジジンおよびその
誘導体、並びにロイコ色素、例えば米国特許第4,089,74
7 号明細書（Bruschi ）に記載のトリアリールイミダゾ
ールロイコ色素が挙げられる。
【００４６】好ましくは、増幅および検出は、汚染の危
険性を減らすために、密閉容器中で実施される。工程中
に反応容器を開けることなく、増幅と検出の両方を米国
特許第5,229,297 号明細書に記載の密閉反応容器中で実
施することができる。
険性を減らすために、密閉容器中で実施される。工程中
に反応容器を開けることなく、増幅と検出の両方を米国
特許第5,229,297 号明細書に記載の密閉反応容器中で実
施することができる。
【００４７】本明細書中で時間に関して用いる時、
「約」という語は時間限界の±10％を表し、そして温度
に関して用いる時、「約」という語は±５℃を表す。下
記の実施例は本発明の幾つかの態様を例示するために与
えられるのであって、本発明を限定するものであると解
釈してはならない。
「約」という語は時間限界の±10％を表し、そして温度
に関して用いる時、「約」という語は±５℃を表す。下
記の実施例は本発明の幾つかの態様を例示するために与
えられるのであって、本発明を限定するものであると解
釈してはならない。
【００４８】
【実施例】ＭＡＣ生物を検出するため並びにＭ．アビウ
ム、Ｍ．イントラセルラーレおよび非Ｍ．アビウム非
Ｍ．イントラセルラーレＭＡＣ生物を識別するために、
下記のプライマーおよびプローブを使った。
ム、Ｍ．イントラセルラーレおよび非Ｍ．アビウム非
Ｍ．イントラセルラーレＭＡＣ生物を識別するために、
下記のプライマーおよびプローブを使った。
【００４９】
【表２】
【００５０】
【表３】
【００５１】プライマーとプローブは下記の標的遺伝子
領域に対して作製した： １） MacSequevar 領域（MSqv）（16S-23S 遺伝子間領
域） ２） Ｍ．アビウムの19キロダルトンタンパク質遺伝子
領域（MAV19K） ３） Ｍ．イントラセルラーレのリボソームタンパク質
sl遺伝子領域（rpsl）
領域に対して作製した： １） MacSequevar 領域（MSqv）（16S-23S 遺伝子間領
域） ２） Ｍ．アビウムの19キロダルトンタンパク質遺伝子
領域（MAV19K） ３） Ｍ．イントラセルラーレのリボソームタンパク質
sl遺伝子領域（rpsl）
【００５２】MSqv領域から選ばれたプライマー類は、
Ｍ．アビウム、Ｍ．イントラセルラーレおよびＭ．アビ
ウムにもＭ．イントラセルラーレにも分類されない他の
全てのＭＡＣ生物（非Ｍ．アビウム非Ｍ．イントラセル
ラーレＭＡＣ生物）からの核酸の特異的増幅を可能にす
る。増幅されさえすれば、MSqv P1.21c, MSqv-MAC, MSq
v P1またはMSqv 1.3c プローブのうちの１つを使って、
それらの生物の標的核酸を検出することができる。加え
て、Ｍ．アビウムのみを検出するMSqv-Av プローブを使
って、Ｍ．アビウムをＭ．イントラセルラーレからおよ
び他の非Ｍ．アビウムＭＡＣ生物から識別することがで
きる。MAV19kプライマーおよびプローブはＭ．アビウム
の核酸に特異的であり、一方rpslプライマーおよびプロ
ーブは非Ｍ．アビウムＭＡＣ生物、典型的にはＭ．イン
トラセルラーレの核酸に特異的である。
Ｍ．アビウム、Ｍ．イントラセルラーレおよびＭ．アビ
ウムにもＭ．イントラセルラーレにも分類されない他の
全てのＭＡＣ生物（非Ｍ．アビウム非Ｍ．イントラセル
ラーレＭＡＣ生物）からの核酸の特異的増幅を可能にす
る。増幅されさえすれば、MSqv P1.21c, MSqv-MAC, MSq
v P1またはMSqv 1.3c プローブのうちの１つを使って、
それらの生物の標的核酸を検出することができる。加え
て、Ｍ．アビウムのみを検出するMSqv-Av プローブを使
って、Ｍ．アビウムをＭ．イントラセルラーレからおよ
び他の非Ｍ．アビウムＭＡＣ生物から識別することがで
きる。MAV19kプライマーおよびプローブはＭ．アビウム
の核酸に特異的であり、一方rpslプライマーおよびプロ
ーブは非Ｍ．アビウムＭＡＣ生物、典型的にはＭ．イン
トラセルラーレの核酸に特異的である。
【００５３】それらのプライマーおよびプローブは、既
知の出発原料と手順を用いて、Applied Biosystems Mod
el 380B 、標準ホスホロアミダイト化学を用いる３カラ
ムＤＮＡ合成装置、およびＡＢＩ１μモルスケール・フ
ァーストサイクルプロトコールを使って調製した。ヌク
レオシド−３′−ホスホロアミダイトおよびヌクレオシ
ド誘導化細孔制御ガラス支持体はApplied Biosystemsか
ら入手した。プライマーは上記に示した配列を有した。
２つのテトラエチレングリコールスペーサーに続いて１
つの市販のデュポン社製ビオチンホスホロアミダイトに
より、それらの５′末端を機能性にした。米国特許第4,
914,210 号明細書に従って、２つのテトラエチレングル
コールスペーサーに続いて１つのアミノジオール連結基
によりプローブの３′末端を機能性にした。全ての精製
は核酸精製カラムに続いて逆相HPLC技術を使って実施し
た。
知の出発原料と手順を用いて、Applied Biosystems Mod
el 380B 、標準ホスホロアミダイト化学を用いる３カラ
ムＤＮＡ合成装置、およびＡＢＩ１μモルスケール・フ
ァーストサイクルプロトコールを使って調製した。ヌク
レオシド−３′−ホスホロアミダイトおよびヌクレオシ
ド誘導化細孔制御ガラス支持体はApplied Biosystemsか
ら入手した。プライマーは上記に示した配列を有した。
２つのテトラエチレングリコールスペーサーに続いて１
つの市販のデュポン社製ビオチンホスホロアミダイトに
より、それらの５′末端を機能性にした。米国特許第4,
914,210 号明細書に従って、２つのテトラエチレングル
コールスペーサーに続いて１つのアミノジオール連結基
によりプローブの３′末端を機能性にした。全ての精製
は核酸精製カラムに続いて逆相HPLC技術を使って実施し
た。
【００５４】ＰＣＲアッセイ条件：ＰＣＲ増幅および検
出はJohnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc.プ
ロセッサーを使って実施し、これは米国特許第5,089,23
3 号、同第5,380,489 号および同第5,229,297 号明細書
に記載のパウチシステムを含んだ。標的ＤＮＡのＰＣＲ
増幅用のアニール／伸長温度を70℃で40秒間に設定し、
そして変性温度を96℃で５秒間に設定する２段階ＰＣＲ
法を使った。標的を増幅させるのに40サイクルを使い、
その後で反応混合物を含むＰＣＲブリスターを103 ℃で
２分間加熱してTaq ポリメラーゼを不活性化した。
出はJohnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc.プ
ロセッサーを使って実施し、これは米国特許第5,089,23
3 号、同第5,380,489 号および同第5,229,297 号明細書
に記載のパウチシステムを含んだ。標的ＤＮＡのＰＣＲ
増幅用のアニール／伸長温度を70℃で40秒間に設定し、
そして変性温度を96℃で５秒間に設定する２段階ＰＣＲ
法を使った。標的を増幅させるのに40サイクルを使い、
その後で反応混合物を含むＰＣＲブリスターを103 ℃で
２分間加熱してTaq ポリメラーゼを不活性化した。
【００５５】 ＰＣＲミックス： ・塩化マグネシウム（mM） 4 ・プライマー (μM)、各 0.4 ・グリセロール濃度（％ v/v） 9.5 ・dNTP（合計mM）（dATP, dCTP, dGTPおよび dTTP−各0.3 mM） 1.2 ・バックグラウンド（子ウシ胸腺）ＤＮＡ（μｇ／反応） 5 ・Taq mAb ブレンド（Taq に対するモル比） 55:1 ・Taq ポリメラーゼ（単位／75μL 反応液） 12 ・陽性対照標的（コピー／試験） 10 ・Tris-HCl（mM） 18 ・塩化カリウム（mM） 54 ・IV型ゼラチン（μｇ／ml） 108 ・EDTA（mM） 0.725 ・Tween 20 0.02 ％
【００５６】ＰＣＲミックス中で使われるモノクローナ
ル抗体はテルムス・アクアティカスからのＤＮＡポリメ
ラーゼに特異的であるTP1-12.2とTP4-9.2 の混合物であ
った。それらの抗体は米国特許第5,338,671 号明細書中
に詳細に記載されている。
ル抗体はテルムス・アクアティカスからのＤＮＡポリメ
ラーゼに特異的であるTP1-12.2とTP4-9.2 の混合物であ
った。それらの抗体は米国特許第5,338,671 号明細書中
に詳細に記載されている。
【００５７】Ｔ．アクアティカスからの組換えＤＮＡポ
リメラーゼは既知の手順、例えば欧州特許公開EP-A-0 4
82 714に記載されたものを使って調製し、これは約250,
000単位／mgタンパク質の活性を有した。
リメラーゼは既知の手順、例えば欧州特許公開EP-A-0 4
82 714に記載されたものを使って調製し、これは約250,
000単位／mgタンパク質の活性を有した。
【００５８】標的のＰＣＲ増幅が完了したら、４〜７個
の離れたプローブビーズスポットに結合させた別個の標
的特異的捕捉プローブに増幅生成物をハイブリダイズせ
しめた。各スポットは約１ミクロンのポリスチレンビー
ズに共有結合で取り付けられた独特の捕捉プローブから
成った。この捕捉プローブは、次のようにしてポリ〔ス
チレン−コ−３−（ｐ−ビニルベンジルチオ）プロピオ
ン酸〕（モル比95：５、平均直径１μｍ）の粒子に取り
付けた。まず、前記粒子の水中懸濁液を２−（Ｎ−モル
ホリノ）エタンスルホン酸緩衝剤（0.1 モル濃度、pH
6）で２回洗浄し、次いで固形分約10％になるように懸
濁した。緩衝剤（0.1 モル濃度）中固形分3.33％に希釈
された洗浄済粒子の試料（3.3 ml）を、１−（３−ジメ
チルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸
塩（84mg／ml水、2.1 ml）および適当なプローブ（44.4
4 OD／mlナノ純水、983 μl ）と混合した。生じた懸濁
液を断続的に混合しながら湯浴中50℃で約２時間加熱し
た後、遠心分離した。（エチレンジニトリロ）四酢酸二
ナトリウム塩（0.0001モル濃度）を含むトリス（ヒドロ
キシメチル）アミノメタン緩衝剤（0.01モル濃度、pH
8）で粒子を３回洗浄し、そして固形分４％になるよう
にその中に再懸濁した。次いでそれらを固形分２％に希
釈し、WO-A-92/16659 に記載の通りに調製した試験装置
中でのヒートシール可能なポリエチレンポリエステルラ
ミネート（コロナ放電により処理したもの）への適用の
ために0.2 ％のポリ〔メチルアクリレート−コ−２−ア
クリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸ナトリウ
ム塩−コ−２−アセトアセトキシエチルメタクリレー
ト〕（重量比90：４：６）と混合した。
の離れたプローブビーズスポットに結合させた別個の標
的特異的捕捉プローブに増幅生成物をハイブリダイズせ
しめた。各スポットは約１ミクロンのポリスチレンビー
ズに共有結合で取り付けられた独特の捕捉プローブから
成った。この捕捉プローブは、次のようにしてポリ〔ス
チレン−コ−３−（ｐ−ビニルベンジルチオ）プロピオ
ン酸〕（モル比95：５、平均直径１μｍ）の粒子に取り
付けた。まず、前記粒子の水中懸濁液を２−（Ｎ−モル
ホリノ）エタンスルホン酸緩衝剤（0.1 モル濃度、pH
6）で２回洗浄し、次いで固形分約10％になるように懸
濁した。緩衝剤（0.1 モル濃度）中固形分3.33％に希釈
された洗浄済粒子の試料（3.3 ml）を、１−（３−ジメ
チルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸
塩（84mg／ml水、2.1 ml）および適当なプローブ（44.4
4 OD／mlナノ純水、983 μl ）と混合した。生じた懸濁
液を断続的に混合しながら湯浴中50℃で約２時間加熱し
た後、遠心分離した。（エチレンジニトリロ）四酢酸二
ナトリウム塩（0.0001モル濃度）を含むトリス（ヒドロ
キシメチル）アミノメタン緩衝剤（0.01モル濃度、pH
8）で粒子を３回洗浄し、そして固形分４％になるよう
にその中に再懸濁した。次いでそれらを固形分２％に希
釈し、WO-A-92/16659 に記載の通りに調製した試験装置
中でのヒートシール可能なポリエチレンポリエステルラ
ミネート（コロナ放電により処理したもの）への適用の
ために0.2 ％のポリ〔メチルアクリレート−コ−２−ア
クリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸ナトリウ
ム塩−コ−２−アセトアセトキシエチルメタクリレー
ト〕（重量比90：４：６）と混合した。
【００５９】プローブへの生成物のハイブリダイゼーシ
ョン（ハイブリッド形成）は58℃で起こった。ハイブリ
ダイゼーション段階に続いて、ストレプトアビジン−西
洋ワサビペルオキシダーゼ (SA−HRP)接合体（ビオチン
化生成物に結合する）を添加し、次いで洗浄段階を行
い、そして最後にロイコ色素を添加した。機器を使って
（反射密度、デルタDrとして）または目視での採点によ
り、色素の強度を評価した。
ョン（ハイブリッド形成）は58℃で起こった。ハイブリ
ダイゼーション段階に続いて、ストレプトアビジン−西
洋ワサビペルオキシダーゼ (SA−HRP)接合体（ビオチン
化生成物に結合する）を添加し、次いで洗浄段階を行
い、そして最後にロイコ色素を添加した。機器を使って
（反射密度、デルタDrとして）または目視での採点によ
り、色素の強度を評価した。
【００６０】 ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ接合体溶液： ・３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（mM） 100 ・NaH2PO4 （mM） 29 ・NaCl（mM） 75 ・４′−ヒドロキシアセトアニリド（mM） 10 ・カゼイン（Sigma Technical Grade ）（mg／ml） 5 (0.5％)
【００６１】 洗浄配合物： ・NaH2PO4 （mM） 29 ・NaCl（mM） 373 ・デシル硫酸ナトリウム（mM） 25
【００６２】ロイコ色素分散液：ビーズスポットの色を
標準カラーチャートと比較することにより、目視カラー
スコアを決定した。目視カラースコアには、青色の強度
に関する値（「８」は高陽性スコアであり、「０」は陰
性スコアである）を与えた。「０」と「２」の間のカラ
ースコアは陰性であると指定した。２より大きく且つ４
より小さいカラースコアは、疑わしい（低）陽性である
と見なした。４〜８のカラースコアは陽性であると指定
した。他の試薬および原料は商業源から入手したかまた
は容易に入手可能な出発原料と常用手順を使って調製し
た。
標準カラーチャートと比較することにより、目視カラー
スコアを決定した。目視カラースコアには、青色の強度
に関する値（「８」は高陽性スコアであり、「０」は陰
性スコアである）を与えた。「０」と「２」の間のカラ
ースコアは陰性であると指定した。２より大きく且つ４
より小さいカラースコアは、疑わしい（低）陽性である
と見なした。４〜８のカラースコアは陽性であると指定
した。他の試薬および原料は商業源から入手したかまた
は容易に入手可能な出発原料と常用手順を使って調製し
た。
【００６３】実施例１：プライマーおよびプローブの選
択 Ａ．副産物生成の最小化 多重プライマーセットを使った標的核酸の同時増幅はし
ばしば問題となる。プライマー二量体や他の「ゼロサイ
クル」人工産物のような副産物の形成という形で現れる
プライマー相互作用が、増幅効率とアッセイ感度の低下
を引き起こし得る。標的核酸に対する配列相同性と「オ
リゴ」（National BioSciences, Inc.,Plymouth, MN）
を使ったコンピューター分析に基づいて一端プライマー
が選択されたら、様々なプライマーの組合せを試験して
（標的の不在下で）検出可能な副産物の形成が起こるか
どうかを調べた。一般に、プライマーの二つ一組の組合
せを最初に標準ＰＣＲ条件下で試験して、どんなプライ
マー組合せがプライマー二量体または着目の特定生成物
と競合し得る望ましくない他の副産物を生成しやすいか
を調べた。
択 Ａ．副産物生成の最小化 多重プライマーセットを使った標的核酸の同時増幅はし
ばしば問題となる。プライマー二量体や他の「ゼロサイ
クル」人工産物のような副産物の形成という形で現れる
プライマー相互作用が、増幅効率とアッセイ感度の低下
を引き起こし得る。標的核酸に対する配列相同性と「オ
リゴ」（National BioSciences, Inc.,Plymouth, MN）
を使ったコンピューター分析に基づいて一端プライマー
が選択されたら、様々なプライマーの組合せを試験して
（標的の不在下で）検出可能な副産物の形成が起こるか
どうかを調べた。一般に、プライマーの二つ一組の組合
せを最初に標準ＰＣＲ条件下で試験して、どんなプライ
マー組合せがプライマー二量体または着目の特定生成物
と競合し得る望ましくない他の副産物を生成しやすいか
を調べた。
【００６４】上述の二つ一組のプライマー組合せから得
られた結果に基づいて、好ましいプライマーおよびプラ
イマーペアを使って、ＰＣＲマスターミックスが望まし
くない副産物を形成することなく長期間に渡り室温で保
存できるかどうかを調べた。適切な塩類、グリセロー
ル、Taq ポリメラーゼ、Taq 抗体、子牛胸腺ＤＮＡ、塩
化マグネシウムおよびプライマーを含む完全ＰＣＲ混合
物を調製した。次の各組合せにおいて複数のプライマー
セットを使用した：Msqv F4/R5, MAV 19k F1/R1,IPC F1
/R1またはMsqv F2/R5, MAV 19k F1/R1, IPC F1/R1。完
全ＰＣＲミックスを精製済標的ＤＮＡの存在下または不
在下で室温にて保存した（パウチ内で０，４および８時
間）。
られた結果に基づいて、好ましいプライマーおよびプラ
イマーペアを使って、ＰＣＲマスターミックスが望まし
くない副産物を形成することなく長期間に渡り室温で保
存できるかどうかを調べた。適切な塩類、グリセロー
ル、Taq ポリメラーゼ、Taq 抗体、子牛胸腺ＤＮＡ、塩
化マグネシウムおよびプライマーを含む完全ＰＣＲ混合
物を調製した。次の各組合せにおいて複数のプライマー
セットを使用した：Msqv F4/R5, MAV 19k F1/R1,IPC F1
/R1またはMsqv F2/R5, MAV 19k F1/R1, IPC F1/R1。完
全ＰＣＲミックスを精製済標的ＤＮＡの存在下または不
在下で室温にて保存した（パウチ内で０，４および８時
間）。
【００６５】適当な時点で、パウチプロセッサーを使っ
てＰＣＲ反応を実施した。増幅生成物を１％アガロース
ゲル中で電気泳動し、次いで臭化エチジウム（Sigma Ch
emical, St.Louis, MO）でゲルを染色して、ＰＣＲ反応
の増幅効率を同定した。MsqvF4/R5, MAV 19k F1/R1 お
よび IPC F1/R1のプライマー組合せが、処理前にＰＣＲ
ミックスを室温で２〜８時間インキュベートした時の副
産物生成が最少〜無であった。
てＰＣＲ反応を実施した。増幅生成物を１％アガロース
ゲル中で電気泳動し、次いで臭化エチジウム（Sigma Ch
emical, St.Louis, MO）でゲルを染色して、ＰＣＲ反応
の増幅効率を同定した。MsqvF4/R5, MAV 19k F1/R1 お
よび IPC F1/R1のプライマー組合せが、処理前にＰＣＲ
ミックスを室温で２〜８時間インキュベートした時の副
産物生成が最少〜無であった。
【００６６】Ｂ．同時増幅用のプライマー組合せの選択 ５種類の異なるアニール／伸長温度を使って、標的特異
的生成物の形成を最大にし且つ副産物の形成を最小にす
る条件を決定した。単一のプライマーペアとして使用す
るにせよ他のプライマーペアと重ねて使用するにせよ、
生成物検出スコアが同等であるプライマーセットを同定
した（生成物のゲル電気泳動と臭化エチジウム染色に基
づいて）（第２表）。好ましいプライマーセットは、最
も広いアニール／伸長温度範囲に渡って強い生成物ゲル
バンドを与えるものであった。各プロセッサーを様々な
アニール／伸長温度に設定し、標的がもはや増幅されな
い温度を決定した。個々のプライマーのアニール／伸長
温度効能と最も良く一致するプライマーの組合せを、更
なる試験に選んだ。実施例１Ａに記載した通りにＰＣＲ
ミックスを調製した。Msqv F4/R5, MAV 19k F1/R1, IPC
F1/R1の多重プライマー組合せをMsqv F2/R5, MAV 19k
F1/R1, IPC F1/R1と比較することにより、各アニール／
伸長温度設定での同等のＰＣＲ（ゲルバンド）シグナル
に関して、どちらのMsqv正プライマーが他方のものより
強固な増幅を可能にするかを決定した。各多重化システ
ムの４つの複製パウチを各パウチプロセッサーにかけ
た。
的生成物の形成を最大にし且つ副産物の形成を最小にす
る条件を決定した。単一のプライマーペアとして使用す
るにせよ他のプライマーペアと重ねて使用するにせよ、
生成物検出スコアが同等であるプライマーセットを同定
した（生成物のゲル電気泳動と臭化エチジウム染色に基
づいて）（第２表）。好ましいプライマーセットは、最
も広いアニール／伸長温度範囲に渡って強い生成物ゲル
バンドを与えるものであった。各プロセッサーを様々な
アニール／伸長温度に設定し、標的がもはや増幅されな
い温度を決定した。個々のプライマーのアニール／伸長
温度効能と最も良く一致するプライマーの組合せを、更
なる試験に選んだ。実施例１Ａに記載した通りにＰＣＲ
ミックスを調製した。Msqv F4/R5, MAV 19k F1/R1, IPC
F1/R1の多重プライマー組合せをMsqv F2/R5, MAV 19k
F1/R1, IPC F1/R1と比較することにより、各アニール／
伸長温度設定での同等のＰＣＲ（ゲルバンド）シグナル
に関して、どちらのMsqv正プライマーが他方のものより
強固な増幅を可能にするかを決定した。各多重化システ
ムの４つの複製パウチを各パウチプロセッサーにかけ
た。
【００６７】
【表４】
【００６８】使用した標的はＭ．アビウム（Ａ４株、血
清型４）20コピー／試験、10コピーＩＰＣ／試験であっ
た。２つの選択できる多重化ＭＡＣアッセイシステムが
第２表に示される：Msqv F4/R4, 19k F1/R1, IPC F1/R1
と、Msqv F2/R5, 19k F1/R1,IPC F1/R1。
清型４）20コピー／試験、10コピーＩＰＣ／試験であっ
た。２つの選択できる多重化ＭＡＣアッセイシステムが
第２表に示される：Msqv F4/R4, 19k F1/R1, IPC F1/R1
と、Msqv F2/R5, 19k F1/R1,IPC F1/R1。
【００６９】各系で標的を増幅できないアニール／伸長
温度が72℃以上であること、あるいは、内部陽性対照が
70℃より下でその標的を増幅しなかったことが証明され
た。ＭＡＣ特異的プライマー系は、広範囲のアニール／
伸長温度（68℃〜71℃）に渡り十分に働いた。
温度が72℃以上であること、あるいは、内部陽性対照が
70℃より下でその標的を増幅しなかったことが証明され
た。ＭＡＣ特異的プライマー系は、広範囲のアニール／
伸長温度（68℃〜71℃）に渡り十分に働いた。
【００７０】実施例２：ＭＡＣアッセイの感度 ＰＣＲに基づくＭＡＣアッセイは、１遺伝子コピー感度
を有することが証明された。Ｍ．アビウムおよびＭ．イ
ントラセルラーレからの塩化セシウム精製済ＤＮＡ試料
は、実施例２の実験のためにT. Hellyer氏（アーカンサ
ス大学、LittleRock ）から提供された。それらの試料
中に含まれるＤＮＡを吸光光度測定により定量し、そし
てA260/A280 吸光度比を算出することによりその純度を
決定した。1.8 以上の比は高純度のＤＮＡを表す。マイ
コバクテリア１ゲノムあたり10フェントグラムのＤＮＡ
の値に基づいて、ゲノムの数／μL 試料を推定した。こ
のＭＡＣアッセイ用の全ての標的遺伝子は、ゲノムあた
り１コピーの標的を含むような単一コピー遺伝子として
見つかった。この精製ＤＮＡをTris−EDTA緩衝液,pH 8.
5（担体として10μg/ml最終濃度の子ウシ胸腺担体ＤＮ
Ａを含む）中に希釈した。1 ×107 〜1 ×108 ゲノム／
μL のストック（標的）ＤＮＡを、このストック液20μ
L をＰＣＲに使用した時に試験１回あたりに生成する標
的コピー数が10コピーであるように、0.5 コピー／μL
に希釈した。ＭＡＣアッセイは、その時間の約60％に単
一ゲノムコピーを検出することができ、そしてその時間
のほぼ100 ％に３ゲノムコピーを検出することができた
（ポアソン標本抽出分布を仮定して予想される通り）。
を有することが証明された。Ｍ．アビウムおよびＭ．イ
ントラセルラーレからの塩化セシウム精製済ＤＮＡ試料
は、実施例２の実験のためにT. Hellyer氏（アーカンサ
ス大学、LittleRock ）から提供された。それらの試料
中に含まれるＤＮＡを吸光光度測定により定量し、そし
てA260/A280 吸光度比を算出することによりその純度を
決定した。1.8 以上の比は高純度のＤＮＡを表す。マイ
コバクテリア１ゲノムあたり10フェントグラムのＤＮＡ
の値に基づいて、ゲノムの数／μL 試料を推定した。こ
のＭＡＣアッセイ用の全ての標的遺伝子は、ゲノムあた
り１コピーの標的を含むような単一コピー遺伝子として
見つかった。この精製ＤＮＡをTris−EDTA緩衝液,pH 8.
5（担体として10μg/ml最終濃度の子ウシ胸腺担体ＤＮ
Ａを含む）中に希釈した。1 ×107 〜1 ×108 ゲノム／
μL のストック（標的）ＤＮＡを、このストック液20μ
L をＰＣＲに使用した時に試験１回あたりに生成する標
的コピー数が10コピーであるように、0.5 コピー／μL
に希釈した。ＭＡＣアッセイは、その時間の約60％に単
一ゲノムコピーを検出することができ、そしてその時間
のほぼ100 ％に３ゲノムコピーを検出することができた
（ポアソン標本抽出分布を仮定して予想される通り）。
【００７１】
【表５】
【００７２】第３表は、陽性シグナルを生じる試験の百
分率を、ＰＣＲ増幅を行った試料あたりの推定平均標的
ＤＮＡコピー数と比較した多重化パウチアッセイの結果
を示す（精製ＤＮＡは担体ＤＮＡを含むTris/EDTA 緩衝
液中に希釈した）。Msqv P1,MAV19k P1およびIPC-1P
（内部陽性対照）プローブビーズスポットを、パウチの
検出ブリスター内の離れた所に配置した。ビオチン化生
成物を標的特異的プローブピーズスポットに結合せしめ
た。ストレプトアビジン−ＨＲＰ洗浄、非特異的結合Ｈ
ＲＰを除去するための第二の洗浄、そして最後にロイゴ
色素洗浄を使って、結合生成物を検出した。ＰＣＲで増
幅されたプローブ特異的生成物を含むビーズスポットの
上で色素生成が起こった。精製された標的ＤＮＡはＭ．
アビウム分離株 #177 、血清型２からのものであった。
MSqv F4/R2とMAV19k F1/R1およびIPC プライマーを使っ
て多重化ＰＣＲを実施した。Ｍ．アビウム分離株 177で
１遺伝子コピー感度が観察された。
分率を、ＰＣＲ増幅を行った試料あたりの推定平均標的
ＤＮＡコピー数と比較した多重化パウチアッセイの結果
を示す（精製ＤＮＡは担体ＤＮＡを含むTris/EDTA 緩衝
液中に希釈した）。Msqv P1,MAV19k P1およびIPC-1P
（内部陽性対照）プローブビーズスポットを、パウチの
検出ブリスター内の離れた所に配置した。ビオチン化生
成物を標的特異的プローブピーズスポットに結合せしめ
た。ストレプトアビジン−ＨＲＰ洗浄、非特異的結合Ｈ
ＲＰを除去するための第二の洗浄、そして最後にロイゴ
色素洗浄を使って、結合生成物を検出した。ＰＣＲで増
幅されたプローブ特異的生成物を含むビーズスポットの
上で色素生成が起こった。精製された標的ＤＮＡはＭ．
アビウム分離株 #177 、血清型２からのものであった。
MSqv F4/R2とMAV19k F1/R1およびIPC プライマーを使っ
て多重化ＰＣＲを実施した。Ｍ．アビウム分離株 177で
１遺伝子コピー感度が観察された。
【００７３】
【表６】
【００７４】第４表は、MSqv P1, rpsl P1およびIPC-1P
（内部陽性対照）プローブビーズスポットを、パウチの
検出ブリスター内に離れて配置した。実験プロトコール
は明らかな変更以外は第３表に示した実験のものと同じ
であった。精製標的ＤＮＡはKevin Nash氏（L.A. Child
rens Hospital, Los Angeles, CA）により提供された
Ｍ．イントラセルラーレ血清型16（ATCC 13950）のもの
であった。精製ＤＮＡを完全生物体から抽出し、100 ℃
で30分間加熱し、そして標準的フェノール／クロロホル
ム法を使ってＤＮＡを精製した。MSqv F4/R5とrpsl F1/
R1およびIPC プライマーを使って多重化ＰＣＲを実施し
た。MSqvプライマー／プローブセットを使った時に１遺
伝子コピー感度が観察されたが、rpslプライマーおよび
プローブセットを使った時の感度はほぼ５分の１であっ
た。
（内部陽性対照）プローブビーズスポットを、パウチの
検出ブリスター内に離れて配置した。実験プロトコール
は明らかな変更以外は第３表に示した実験のものと同じ
であった。精製標的ＤＮＡはKevin Nash氏（L.A. Child
rens Hospital, Los Angeles, CA）により提供された
Ｍ．イントラセルラーレ血清型16（ATCC 13950）のもの
であった。精製ＤＮＡを完全生物体から抽出し、100 ℃
で30分間加熱し、そして標準的フェノール／クロロホル
ム法を使ってＤＮＡを精製した。MSqv F4/R5とrpsl F1/
R1およびIPC プライマーを使って多重化ＰＣＲを実施し
た。MSqvプライマー／プローブセットを使った時に１遺
伝子コピー感度が観察されたが、rpslプライマーおよび
プローブセットを使った時の感度はほぼ５分の１であっ
た。
【００７５】実施例３：複数の分離株から得られたＭ．
アビウム標的ＤＮＡを使ったＭＡＣアッセイの感度 ６つの患者分離株からのＭ．アビウム標的ＤＮＡを、２
プライマーセット（MacSqvおよびMAV19k）を使って上述
のＰＣＲプロトコールに従って増幅させ、次いで別々の
標的特異的プローブビーズの上で生成物を捕捉した。Cs
Cl精製済ＤＮＡはアーカンサス大学のT. Hellyer氏から
提供された。各生物体からのＤＮＡを上述した通りに希
釈し、パウチシステムにおいて試験した。第５Ａ表に示
す通り、ＭＡＣアッセイシステムを使って各分離株につ
いて１遺伝子コピー感度が得られ、そして第５Ｂ表に示
す通り、対応する３遺伝子コピー感度が得られた。
アビウム標的ＤＮＡを使ったＭＡＣアッセイの感度 ６つの患者分離株からのＭ．アビウム標的ＤＮＡを、２
プライマーセット（MacSqvおよびMAV19k）を使って上述
のＰＣＲプロトコールに従って増幅させ、次いで別々の
標的特異的プローブビーズの上で生成物を捕捉した。Cs
Cl精製済ＤＮＡはアーカンサス大学のT. Hellyer氏から
提供された。各生物体からのＤＮＡを上述した通りに希
釈し、パウチシステムにおいて試験した。第５Ａ表に示
す通り、ＭＡＣアッセイシステムを使って各分離株につ
いて１遺伝子コピー感度が得られ、そして第５Ｂ表に示
す通り、対応する３遺伝子コピー感度が得られた。
【００７６】
【表７】
【００７７】第５Ａ表から明らかなように、その時間の
約60％に陽性結果が観察された（１遺伝子コピーについ
てのポアソン統計学により予測される通り）。どの場合
でも、陽性シグナルを生じる試験の率は60％付近に集ま
っており、これは該アッセイが或る範囲のＭ．アビウム
（血清型および患者分離株）に渡って１遺伝子コピー感
度を示すことを指摘する。MSqvセットを使った時に分離
株A8について100 ％陽性結果が観察されたことは、この
試料が１遺伝子コピーよりもわずかに多くを含むかもし
れないことを示す。
約60％に陽性結果が観察された（１遺伝子コピーについ
てのポアソン統計学により予測される通り）。どの場合
でも、陽性シグナルを生じる試験の率は60％付近に集ま
っており、これは該アッセイが或る範囲のＭ．アビウム
（血清型および患者分離株）に渡って１遺伝子コピー感
度を示すことを指摘する。MSqvセットを使った時に分離
株A8について100 ％陽性結果が観察されたことは、この
試料が１遺伝子コピーよりもわずかに多くを含むかもし
れないことを示す。
【００７８】
【表８】
【００７９】これらの実験条件は第５Ａ表のものと同じ
であった。使用した標的希釈液は第５Ａ表と同じ系列希
釈からのであった。この場合、試験あたりほぼ３ゲノム
コピー数では、100 ％陽性結果が観察された。100 ％陽
性を生じなかった唯一のセットは、患者分離株A4を使っ
たMAV19kプライマー／プローブセットであった。
であった。使用した標的希釈液は第５Ａ表と同じ系列希
釈からのであった。この場合、試験あたりほぼ３ゲノム
コピー数では、100 ％陽性結果が観察された。100 ％陽
性を生じなかった唯一のセットは、患者分離株A4を使っ
たMAV19kプライマー／プローブセットであった。
【００８０】実施例４：包括試験（ＭＡＣの中の生物の
同定） ＭＡＣに入る各血清型からの数株を自家増殖させ、加熱
により細胞を溶解させ、本発明者らの係属中の米国特許
出願第08/306,870号明細書中に開示されたプライマー捕
捉技術を使ってＤＮＡを精製した（モノマーおよびポリ
マー組成物並びにそれらの調製方法に関する米国特許第
5,434,270 号と同第5,523,368 号明細書も参照のこ
と）。得られたＤＮＡを、個別に、またはMAV19k（もし
くはrpsl）と組み合わせて、あるいは両者と内部陽性対
照（IPC ）プライマーセットと組み合わせて、MacSqv正
および逆プライマーセットの種々の組合せを使ったＰＣ
Ｒ増幅における標的として使用した。ＰＣＲ反応あたり
10〜5000ゲノムコピー数の標的ＤＮＡレベルを使って試
験を実施した。
同定） ＭＡＣに入る各血清型からの数株を自家増殖させ、加熱
により細胞を溶解させ、本発明者らの係属中の米国特許
出願第08/306,870号明細書中に開示されたプライマー捕
捉技術を使ってＤＮＡを精製した（モノマーおよびポリ
マー組成物並びにそれらの調製方法に関する米国特許第
5,434,270 号と同第5,523,368 号明細書も参照のこ
と）。得られたＤＮＡを、個別に、またはMAV19k（もし
くはrpsl）と組み合わせて、あるいは両者と内部陽性対
照（IPC ）プライマーセットと組み合わせて、MacSqv正
および逆プライマーセットの種々の組合せを使ったＰＣ
Ｒ増幅における標的として使用した。ＰＣＲ反応あたり
10〜5000ゲノムコピー数の標的ＤＮＡレベルを使って試
験を実施した。
【００８１】ＭＡＣプライマーおよびプローブを試験す
るために用いた包括パネルを下記に記載する。ＭＡＣ生
物をそれらの血清型番号に従って表にまとめる。対応す
る配列型も記載する。下記の表で用いる配列型の用語法
は次の通りであった："na"は配列型が決定されなかった
ことを示す。"Mav" はＭ．アビウムに該当する配列型を
表す。"Min" はＭ．イントラセルラーレに該当する配列
型を表す。"MAC" は"Mav" にも"Min" にも分類されなか
ったＭＡＣ配列型を表す。血清型１〜６、８〜11および
21を有する生物はＭ．アビウムである。血清型７，12〜
20および22〜26を有する生物は、Wayne 他（前掲）によ
るとＭ．イントラセルラーレか、またはＭ．アビウム種
にもＭ．イントラセルラーレ種にも属さないＭＡＣ生物
のいずれかであると推測された。
るために用いた包括パネルを下記に記載する。ＭＡＣ生
物をそれらの血清型番号に従って表にまとめる。対応す
る配列型も記載する。下記の表で用いる配列型の用語法
は次の通りであった："na"は配列型が決定されなかった
ことを示す。"Mav" はＭ．アビウムに該当する配列型を
表す。"Min" はＭ．イントラセルラーレに該当する配列
型を表す。"MAC" は"Mav" にも"Min" にも分類されなか
ったＭＡＣ配列型を表す。血清型１〜６、８〜11および
21を有する生物はＭ．アビウムである。血清型７，12〜
20および22〜26を有する生物は、Wayne 他（前掲）によ
るとＭ．イントラセルラーレか、またはＭ．アビウム種
にもＭ．イントラセルラーレ種にも属さないＭＡＣ生物
のいずれかであると推測された。
【００８２】ＰＣＲ増幅および検出は、上述したプロセ
ッサーと自臓式パウチシステムおよび条件を使って実施
した。観察された目視カラースコアと一緒に第６表に示
すようなビーズ固定化プローブを使って生成物を捕捉し
た。
ッサーと自臓式パウチシステムおよび条件を使って実施
した。観察された目視カラースコアと一緒に第６表に示
すようなビーズ固定化プローブを使って生成物を捕捉し
た。
【００８３】
【表９】
【００８４】第６表は、ＭＡＣ包括パネルを使った多重
化増幅／検出試験フォーマットにおいて、MSqv F4/R5お
よびMav 19k プライマーをIPC プライマーと組み合わせ
た時に得られた結果を示す。MSqvプライマーセットと対
応するプローブは、表に記載したＭＡＣパネル内の全生
物の検出を可能にした。このMSqvプライマーセットは、
MAV19kとIPC プライマーおよびプローブを使った多重化
アッセイにおいてＭ．アビウム特異的プローブ（MSqv-A
v ）を使った時に、パネル中のＭ．アビウム生物の包括
検出も可能にした（データは示してない）。MAV19kセッ
トは、Ｍ．アビウム生物のみの検出を可能にし、株1784
-286の検出には失敗した。結果が単一パウチに基づいて
いる株1784-286を除いて、全ての結果は二重反復パウチ
試験結果に基づく。（第６表に相当する実験ではMAV19k
により株1784-286は同定されなかったが、多数の他の実
験において同定された。）
化増幅／検出試験フォーマットにおいて、MSqv F4/R5お
よびMav 19k プライマーをIPC プライマーと組み合わせ
た時に得られた結果を示す。MSqvプライマーセットと対
応するプローブは、表に記載したＭＡＣパネル内の全生
物の検出を可能にした。このMSqvプライマーセットは、
MAV19kとIPC プライマーおよびプローブを使った多重化
アッセイにおいてＭ．アビウム特異的プローブ（MSqv-A
v ）を使った時に、パネル中のＭ．アビウム生物の包括
検出も可能にした（データは示してない）。MAV19kセッ
トは、Ｍ．アビウム生物のみの検出を可能にし、株1784
-286の検出には失敗した。結果が単一パウチに基づいて
いる株1784-286を除いて、全ての結果は二重反復パウチ
試験結果に基づく。（第６表に相当する実験ではMAV19k
により株1784-286は同定されなかったが、多数の他の実
験において同定された。）
【００８５】
【表１０】
【００８６】第７表は、MSqv F2/R5プライマーセットと
MAV19k, rpslおよびIPC プライマーセットとを使って得
られた同時増幅結果を示す。２より大きい全てのカラー
スコアは、指摘のプローブを使った時の陽性結果を表
す。この多重化システムを使ってＭＡＣ複合体に含まれ
る生物を種のレベルで同定した時、MacSqvプライマーセ
ット（およびMacSqv−MAC プローブ）はパネル内の全て
の生物を同定する。rpslプライマーセット（およびプロ
ーブ）は先行研究者によりＭ．イントラセルラーレであ
ると見なされた全ての生物を同定し、そしてMav19kプラ
イマーセット（およびプローブ）はパネル内のＭ．アビ
ウム生物を同定する。
MAV19k, rpslおよびIPC プライマーセットとを使って得
られた同時増幅結果を示す。２より大きい全てのカラー
スコアは、指摘のプローブを使った時の陽性結果を表
す。この多重化システムを使ってＭＡＣ複合体に含まれ
る生物を種のレベルで同定した時、MacSqvプライマーセ
ット（およびMacSqv−MAC プローブ）はパネル内の全て
の生物を同定する。rpslプライマーセット（およびプロ
ーブ）は先行研究者によりＭ．イントラセルラーレであ
ると見なされた全ての生物を同定し、そしてMav19kプラ
イマーセット（およびプローブ）はパネル内のＭ．アビ
ウム生物を同定する。
【００８７】多数のあいまいな株を指摘の包括パネル上
に表した。例えば、Frothingham, 1993 （前掲）、Sait
o （前掲）およびWayne, 1993 （前掲）をＤＮＡ配列決
定、Gen-Probe プローブ法、HPLCおよび／またはＭＡＣ
参考株を種で分類するための生化学的方法に使用した
時、Ｍ．アビウムにもＭ．イントラセルラーレにも上手
く適合しない幾つかの株が存在した。従って、それらの
株の多数を「ＭＡＣ」生物として特徴づけた。
に表した。例えば、Frothingham, 1993 （前掲）、Sait
o （前掲）およびWayne, 1993 （前掲）をＤＮＡ配列決
定、Gen-Probe プローブ法、HPLCおよび／またはＭＡＣ
参考株を種で分類するための生化学的方法に使用した
時、Ｍ．アビウムにもＭ．イントラセルラーレにも上手
く適合しない幾つかの株が存在した。従って、それらの
株の多数を「ＭＡＣ」生物として特徴づけた。
【００８８】下記の株はWayne, 1993 （前掲）によりHP
LC分析を使ってＭ．イントラセルラーレとして同定され
た：12645, 23393, Melnick および1217。それらの同一
株はたとえ上述の研究者らのやり方でGen-Probe Ｍ．イ
ントラセルラーレプローブを使った時にGen-Probe 陰性
であっても、第７表に記載のrpslプライマーおよびプロ
ーブセットを使ってＭ．イントラセルラーレとして同定
された。
LC分析を使ってＭ．イントラセルラーレとして同定され
た：12645, 23393, Melnick および1217。それらの同一
株はたとえ上述の研究者らのやり方でGen-Probe Ｍ．イ
ントラセルラーレプローブを使った時にGen-Probe 陰性
であっても、第７表に記載のrpslプライマーおよびプロ
ーブセットを使ってＭ．イントラセルラーレとして同定
された。
【００８９】次の株は上述の研究者によりHPLC分析とGe
n-Probe を使ってＭ．イントラセルラーレとして同定さ
れた：W552, Darden, AT 545 Findley, CDC 1195。それ
らの株はrpslシステムによってもＭ．イントラセルラー
レとして同定された。
n-Probe を使ってＭ．イントラセルラーレとして同定さ
れた：W552, Darden, AT 545 Findley, CDC 1195。それ
らの株はrpslシステムによってもＭ．イントラセルラー
レとして同定された。
【００９０】残りのあいまいな株P-49と5154 O'Connor
は、上述の研究者らにより正しく特徴づけることがまだ
できなかった。第７表では、それらの２つの株はＭＡＣ
生物として特徴付けられる。Frothingham, 1993 （前
掲）は、16s-23s 内部転写スペーサー領域を配列決定
し、それらの２つの株の遺伝子配列がＭ．アビウムのも
のともＭ．イントラセルラーレのものとも似ていないこ
とを発見した。
は、上述の研究者らにより正しく特徴づけることがまだ
できなかった。第７表では、それらの２つの株はＭＡＣ
生物として特徴付けられる。Frothingham, 1993 （前
掲）は、16s-23s 内部転写スペーサー領域を配列決定
し、それらの２つの株の遺伝子配列がＭ．アビウムのも
のともＭ．イントラセルラーレのものとも似ていないこ
とを発見した。
【００９１】MAV19K系はＭ．アビウム生物のみを同定し
た。また、Ｍ．アビウム 1784-286株は疑わしい結果を
与えた（第６表において使った同一試料のストックであ
った）。全ての可視カラースコア値は、（特定のプロー
ブビーズについての）２つのパウチ間の平均カラースコ
アに基づいている。星印（＊）は２つの複製物のカラー
スコア間に大きな偏差があることを示す。MSqv系はパネ
ル上の全生物の検出を可能にした。
た。また、Ｍ．アビウム 1784-286株は疑わしい結果を
与えた（第６表において使った同一試料のストックであ
った）。全ての可視カラースコア値は、（特定のプロー
ブビーズについての）２つのパウチ間の平均カラースコ
アに基づいている。星印（＊）は２つの複製物のカラー
スコア間に大きな偏差があることを示す。MSqv系はパネ
ル上の全生物の検出を可能にした。
【００９２】MacSqv, MAV 19k およびrpsLプライマー＆
プローブを含む多重化アッセイを実施すると、種のレベ
ルで、ＭＡＣ複合体に含まれる生物をＭ．アビウム、
Ｍ．イントラセルラーレ、または非Ｍ．アビウム非Ｍ．
イントラセルラーレＭＡＣとして正しく同定することが
できる。
プローブを含む多重化アッセイを実施すると、種のレベ
ルで、ＭＡＣ複合体に含まれる生物をＭ．アビウム、
Ｍ．イントラセルラーレ、または非Ｍ．アビウム非Ｍ．
イントラセルラーレＭＡＣとして正しく同定することが
できる。
【００９３】実施例５：包括試験（非ＭＡＣマイコバク
テリアの核酸を使って測定） 多数のマイコバクテリアが高度のゲノム相同性を有す
る。これはＭＡＣ特異的プライマーおよびプローブをデ
ザインするのにやりがいを起こさせる。ＭＡＣについて
のＤＮＡアッセイは、Ｍ．アビウム複合体に含まれるそ
れらの生物体に対して高い特異性を持ち、且つ非ＭＡＣ
マイコバクテリアに対しては特異性がないものでなけれ
ばならない。
テリアの核酸を使って測定） 多数のマイコバクテリアが高度のゲノム相同性を有す
る。これはＭＡＣ特異的プライマーおよびプローブをデ
ザインするのにやりがいを起こさせる。ＭＡＣについて
のＤＮＡアッセイは、Ｍ．アビウム複合体に含まれるそ
れらの生物体に対して高い特異性を持ち、且つ非ＭＡＣ
マイコバクテリアに対しては特異性がないものでなけれ
ばならない。
【００９４】
【表１１】
【表１２】
【００９５】* Daniel Amsterdam, Ph.D., Erie Countr
y Medical Center, Bukkalo, NY から得た（その他の全
生物体はKevin Nash, Ph.D., L.A. Children's Hospita
l, LosAngeles, CA から得た）。
y Medical Center, Bukkalo, NY から得た（その他の全
生物体はKevin Nash, Ph.D., L.A. Children's Hospita
l, LosAngeles, CA から得た）。
【００９６】第８表は、MSqv F4/R5, MAV 19k F1/R1 お
よびIPC プライマーを使って３×10 8 の非ＭＡＣマイコ
バクテリアからのＤＮＡ／mlをチャレンジした。３つの
プローブ特異的ビーズスポットを検出ブリスター中の別
々の場所に置いた。MAV 19kP1およびMsqv-Av はＭ．ア
ビウム特異的であり、そしてMSqv P1 はＭＡＣ中の全て
の生物に特異的である。プライマー／プローブ系はいず
れも、Ｍ．アビウム複合体中に含まれるもの以外のどん
なマイコバクテリアとも交差反応しなかった。Ｍ．ヘモ
フィルム（M. haemophilum）およびＭ．マルモエンセ
（M. malmoense）の追加の株を使って、最初のパネル試
験（MAC 080196）を繰り返した（MAC 080296）。rpslプ
ライマー／プローブ系についての包括結果は、非ＭＡＣ
マイコバクテリアとの交差反応性を全く示さない。
よびIPC プライマーを使って３×10 8 の非ＭＡＣマイコ
バクテリアからのＤＮＡ／mlをチャレンジした。３つの
プローブ特異的ビーズスポットを検出ブリスター中の別
々の場所に置いた。MAV 19kP1およびMsqv-Av はＭ．ア
ビウム特異的であり、そしてMSqv P1 はＭＡＣ中の全て
の生物に特異的である。プライマー／プローブ系はいず
れも、Ｍ．アビウム複合体中に含まれるもの以外のどん
なマイコバクテリアとも交差反応しなかった。Ｍ．ヘモ
フィルム（M. haemophilum）およびＭ．マルモエンセ
（M. malmoense）の追加の株を使って、最初のパネル試
験（MAC 080196）を繰り返した（MAC 080296）。rpslプ
ライマー／プローブ系についての包括結果は、非ＭＡＣ
マイコバクテリアとの交差反応性を全く示さない。
【００９７】
【表１３】
【表１４】
【００９８】第９表は、MSqv F4/R5, MAV19k F1/R1およ
びIPC プライマーを使って１mlあたり３×108 生物体
（マイコバクテリア以外の）からのＤＮＡをチャレンジ
せしめた時に得られた結果を示す。非マイコバクテリア
ＤＮＡは検出されなかった（対照としてＭ．アビウムを
使った）。
びIPC プライマーを使って１mlあたり３×108 生物体
（マイコバクテリア以外の）からのＤＮＡをチャレンジ
せしめた時に得られた結果を示す。非マイコバクテリア
ＤＮＡは検出されなかった（対照としてＭ．アビウムを
使った）。
【００９９】実施例６：ＭＡＣ特異的プローブ中に１塩
基置換を作ることによるＭ．アビウム特異的プローブの
作製
基置換を作ることによるＭ．アビウム特異的プローブの
作製
【０１００】
【表１５】
【０１０１】上記の表は、16s 〜23s rRNA遺伝子間領域
中の５つの25 nt (nt ＝ヌクレオチド）MSqvプローブの
配列と与えられた配列の標的特異性を表す。MSqv-Av は
Ｍ．アビウム特異的であり、その他は全てＭＡＣ特異的
である。MSqv-Av プローブがＭＡＣまたはＭ．イントラ
セルラーレを同定できないのは、MSqv-Av の３′末端か
ら10 nt 上流のＣからＧへの（またはＣからＵへの）１
塩基置換のためである。MSqv-Av プローブを２つの異な
る場合において合成し、その新たな各合成をＭＡＣ生物
のパネルに対して試験した。各場合において、１塩基
（ＣからＧへの）置換は、前の広域（ＭＡＣ）特異的プ
ローブをＭ．アビウム種生物からの標的ＤＮＡだけを認
識する高特異的プローブに変更するのに十分なくらいプ
ローブを変更した。この同じ場所の「Ｃ」を置き換える
のに「Ｕ」を使った第三の合成も、同様にアビウムのみ
の特異性をもたらした。このことは、132 位の「Ｃ」
を、該プローブがＭ．アビウム種のみを同定する別の任
意塩基に変更することにより、25 nt プローブ（例えば
P1.21c）が十分に不安定化されることを示唆するだろ
う。この132 位の１塩基「Ｃ」は広域ＭＡＣパネルの同
定の重要な鍵であり、この１塩基を「Ｃ」から別の塩基
に変更すると、この25 nt プローブがＭ．アビウム特異
的になる。
中の５つの25 nt (nt ＝ヌクレオチド）MSqvプローブの
配列と与えられた配列の標的特異性を表す。MSqv-Av は
Ｍ．アビウム特異的であり、その他は全てＭＡＣ特異的
である。MSqv-Av プローブがＭＡＣまたはＭ．イントラ
セルラーレを同定できないのは、MSqv-Av の３′末端か
ら10 nt 上流のＣからＧへの（またはＣからＵへの）１
塩基置換のためである。MSqv-Av プローブを２つの異な
る場合において合成し、その新たな各合成をＭＡＣ生物
のパネルに対して試験した。各場合において、１塩基
（ＣからＧへの）置換は、前の広域（ＭＡＣ）特異的プ
ローブをＭ．アビウム種生物からの標的ＤＮＡだけを認
識する高特異的プローブに変更するのに十分なくらいプ
ローブを変更した。この同じ場所の「Ｃ」を置き換える
のに「Ｕ」を使った第三の合成も、同様にアビウムのみ
の特異性をもたらした。このことは、132 位の「Ｃ」
を、該プローブがＭ．アビウム種のみを同定する別の任
意塩基に変更することにより、25 nt プローブ（例えば
P1.21c）が十分に不安定化されることを示唆するだろ
う。この132 位の１塩基「Ｃ」は広域ＭＡＣパネルの同
定の重要な鍵であり、この１塩基を「Ｃ」から別の塩基
に変更すると、この25 nt プローブがＭ．アビウム特異
的になる。
【０１０２】
【表１６】
【０１０３】第10表は、１塩基（残基132 の）置換がプ
ローブ特異性を十分に変更することを表す。MSqv F4/R5
プライマーセットとIPC プライマーセットを使って上述
した通りにＰＣＲ増幅および検出を行った。MacSequeva
r プローブの識別番号（ＩＤ）がカラム項目として示さ
れる。対応する重要な塩基位置が示され、Frothingham
Mav-A 配列型整列〔Frothingham, J. Infect. Disease
s, 169:308 (1994)〕に従って表示される。パネル中の
生物から得られた増幅生成物を、第10表に記載の様々な
プローブ特異的ビーズスポットを使って検出した。IPC
シグナルは全ての場合で陽性であった（示してない）。
配列型Mav-A およびMav-B はＭ．アビウム対照として用
いられ、一方パネル中の他の全ての生物はＭＡＣであっ
た（Ｍ．アビウム以外の種）。残基137 および138 のと
ころの１塩基または２塩基置換は、ＭＡＣ生物の広域パ
ネル（Ｍ．アビウムを含む）を同定するプローブ特異性
を変更しなかった。Frothingham 他（前掲）は、Mav 配
列型と MAC（またはMin ）配列型との間で変異するのは
残基137 〜139 のところであると説明し、残基132 のと
ころのＭ．アビウムと他の種との間の変異は同定しなか
った。
ローブ特異性を十分に変更することを表す。MSqv F4/R5
プライマーセットとIPC プライマーセットを使って上述
した通りにＰＣＲ増幅および検出を行った。MacSequeva
r プローブの識別番号（ＩＤ）がカラム項目として示さ
れる。対応する重要な塩基位置が示され、Frothingham
Mav-A 配列型整列〔Frothingham, J. Infect. Disease
s, 169:308 (1994)〕に従って表示される。パネル中の
生物から得られた増幅生成物を、第10表に記載の様々な
プローブ特異的ビーズスポットを使って検出した。IPC
シグナルは全ての場合で陽性であった（示してない）。
配列型Mav-A およびMav-B はＭ．アビウム対照として用
いられ、一方パネル中の他の全ての生物はＭＡＣであっ
た（Ｍ．アビウム以外の種）。残基137 および138 のと
ころの１塩基または２塩基置換は、ＭＡＣ生物の広域パ
ネル（Ｍ．アビウムを含む）を同定するプローブ特異性
を変更しなかった。Frothingham 他（前掲）は、Mav 配
列型と MAC（またはMin ）配列型との間で変異するのは
残基137 〜139 のところであると説明し、残基132 のと
ころのＭ．アビウムと他の種との間の変異は同定しなか
った。
【０１０４】上記の各カラムに示した１残基は132 位に
見つかり、そして示される２残基はFrothingham 他（前
掲）により記載されたようなＭ．アビウム（Mav-A ）配
列型の137 位と138 位に見つかった（左から右に）。IP
C 結果は示してないが、全ての場合に陽性IPC シグナル
が観察された。
見つかり、そして示される２残基はFrothingham 他（前
掲）により記載されたようなＭ．アビウム（Mav-A ）配
列型の137 位と138 位に見つかった（左から右に）。IP
C 結果は示してないが、全ての場合に陽性IPC シグナル
が観察された。
【０１０５】残基132 に集中したプローブをデザインし
た。残基132 に「Ｃ」が置かれそして残基137 と138 に
「ＣＧ」が置かれている25 nt プローブ（プローブ MSq
v P1.21cのように）を使った時、プローブは試験パネル
内のＭ．アビウム、Ｍ．イントラセルラーレおよび非
Ｍ．アビウム非Ｍ．イントラセルラーレＭＡＣ生物の広
域スペクトルとハイブリダイズする能力を保持してい
る。しかしながら、残基137 と138 に同じ「ＣＧ」配置
を維持しながら残基132 を「Ｇ」または「Ｕ」に変更す
ると（それぞれプローブMSqv-Av またはMSqv-Urasil の
ように）、プローブはＭ．アビウム生物とだけハイブリ
ダイズし、ＭＡＣ中の他の生物とはハイブリダイズする
ことができない。それらの25 nt ＭＡＣ特異的プローブ
（P1.21c, P1.3c, MAC）を使う時、132 位に塩基「Ｃ」
を有することが重要である。この１塩基を別の塩基に変
更すると（P1.21cからMAC-AvまたはMAC-Uracilへ切り換
えるとわかるように) 、25 nt プローブはＭ．アビウム
特異的になる。よって、MSqv-Av プローブを使って、別
のＭＡＣ生物からＭ．アビウム生物を識別することがで
きる。
た。残基132 に「Ｃ」が置かれそして残基137 と138 に
「ＣＧ」が置かれている25 nt プローブ（プローブ MSq
v P1.21cのように）を使った時、プローブは試験パネル
内のＭ．アビウム、Ｍ．イントラセルラーレおよび非
Ｍ．アビウム非Ｍ．イントラセルラーレＭＡＣ生物の広
域スペクトルとハイブリダイズする能力を保持してい
る。しかしながら、残基137 と138 に同じ「ＣＧ」配置
を維持しながら残基132 を「Ｇ」または「Ｕ」に変更す
ると（それぞれプローブMSqv-Av またはMSqv-Urasil の
ように）、プローブはＭ．アビウム生物とだけハイブリ
ダイズし、ＭＡＣ中の他の生物とはハイブリダイズする
ことができない。それらの25 nt ＭＡＣ特異的プローブ
（P1.21c, P1.3c, MAC）を使う時、132 位に塩基「Ｃ」
を有することが重要である。この１塩基を別の塩基に変
更すると（P1.21cからMAC-AvまたはMAC-Uracilへ切り換
えるとわかるように) 、25 nt プローブはＭ．アビウム
特異的になる。よって、MSqv-Av プローブを使って、別
のＭＡＣ生物からＭ．アビウム生物を識別することがで
きる。
【０１０６】小型（88nt〜100 nt）生成物を増幅させる
ことおよび種レベルで生物を同定するために小型プロー
ブを使うことには、幾つかの有利な点がある。それらの
利点としては、ＰＣＲ法を使用して小型の（約80〜100
nt）標的のほうが大型の標的よりも効率的に増幅できる
ことが挙げられる。加えて、小型の標的は大型の標的よ
りも苛酷な試料調製操作によって断片化しにくい。従っ
て、標的が小さければ、着目の遺伝子領域全体を増幅で
きる機会がより大きい。
ことおよび種レベルで生物を同定するために小型プロー
ブを使うことには、幾つかの有利な点がある。それらの
利点としては、ＰＣＲ法を使用して小型の（約80〜100
nt）標的のほうが大型の標的よりも効率的に増幅できる
ことが挙げられる。加えて、小型の標的は大型の標的よ
りも苛酷な試料調製操作によって断片化しにくい。従っ
て、標的が小さければ、着目の遺伝子領域全体を増幅で
きる機会がより大きい。
【０１０７】種レベルで生物を同定する方法は幾つかあ
る。１つの方法は、十分な変異性を含むゲノムの大部分
を増幅させることと、種特異的プローブをデザインする
ことを含んで成る。典型的には、単一のプライマーセッ
トを使って１つの大きな遺伝子領域を増幅させ、そして
複数の（種特異的）プローブを使って種特異的生成物を
同定する（例えば、WO 96/00298 を参照のこと）。別の
方法は、十分な変異性を含む１遺伝子領域を同定し、そ
して多重化（複合的）アッセイにおいて使用することが
できる複数の種特異的プライマーセットと種特異的プロ
ーブをデザインすることを伴う。更に別の方法は、複数
の遺伝子領域を同定し、それを使って種特異的プライマ
ーおよびプローブをデザインし、それを組み合わせて使
用した時に、種レベルで生物を同定する多重化アッセイ
を含んで成る。この一例は上述したものである（例え
ば、Ｍ．イントラセルラーレを同定するために使われる
rpsl遺伝子、Ｍ．アビウムを同定するために使われる M
AV 19k遺伝子）。
る。１つの方法は、十分な変異性を含むゲノムの大部分
を増幅させることと、種特異的プローブをデザインする
ことを含んで成る。典型的には、単一のプライマーセッ
トを使って１つの大きな遺伝子領域を増幅させ、そして
複数の（種特異的）プローブを使って種特異的生成物を
同定する（例えば、WO 96/00298 を参照のこと）。別の
方法は、十分な変異性を含む１遺伝子領域を同定し、そ
して多重化（複合的）アッセイにおいて使用することが
できる複数の種特異的プライマーセットと種特異的プロ
ーブをデザインすることを伴う。更に別の方法は、複数
の遺伝子領域を同定し、それを使って種特異的プライマ
ーおよびプローブをデザインし、それを組み合わせて使
用した時に、種レベルで生物を同定する多重化アッセイ
を含んで成る。この一例は上述したものである（例え
ば、Ｍ．イントラセルラーレを同定するために使われる
rpsl遺伝子、Ｍ．アビウムを同定するために使われる M
AV 19k遺伝子）。
【０１０８】種レベルで生物を同定する時に単一プライ
マーセットを使うことは利点がある。多重化方式におい
て複数のプライマーセットを使って標的を増幅させる
と、使用するプライマーの数に正比例してプライマー−
プライマー相互作用のポテンシャルが増加する。プライ
マー−プライマー相互作用は、副産物生成のためにアッ
セイ感度の低下を引き起こし得る。プライマー−プライ
マー相互作用のポテンシャルは、単一の（MSqv）プライ
マーセットと、各々ＭＡＣかＭ．アビウムのいずれかを
同定するための２つの特異的プローブを使うことによっ
て、最少になる。本発明では、種レベルでＭＡＣ生物の
３種の分類階級を同定するのに２つの標的特異的プライ
マーのみが必要となるのでプライマー相互作用のリスク
が最少のままで、追加のプライマーセット（および対応
するプローブ）を多重化システム（Ｍ．アビウム、Ｍ．
イントラセルラーレおよび広域ＭＡＣを同定するため
の）に導入することができる。
マーセットを使うことは利点がある。多重化方式におい
て複数のプライマーセットを使って標的を増幅させる
と、使用するプライマーの数に正比例してプライマー−
プライマー相互作用のポテンシャルが増加する。プライ
マー−プライマー相互作用は、副産物生成のためにアッ
セイ感度の低下を引き起こし得る。プライマー−プライ
マー相互作用のポテンシャルは、単一の（MSqv）プライ
マーセットと、各々ＭＡＣかＭ．アビウムのいずれかを
同定するための２つの特異的プローブを使うことによっ
て、最少になる。本発明では、種レベルでＭＡＣ生物の
３種の分類階級を同定するのに２つの標的特異的プライ
マーのみが必要となるのでプライマー相互作用のリスク
が最少のままで、追加のプライマーセット（および対応
するプローブ）を多重化システム（Ｍ．アビウム、Ｍ．
イントラセルラーレおよび広域ＭＡＣを同定するため
の）に導入することができる。
【０１０９】今まで本発明を明確化と理解のために幾分
詳細に記載してきたが、この開示を読めば本発明の真正
な範囲から逸脱することなく形態および細部に様々な変
更を行い得ることは当業者に明らかであろう。
詳細に記載してきたが、この開示を読めば本発明の真正
な範囲から逸脱することなく形態および細部に様々な変
更を行い得ることは当業者に明らかであろう。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ジョン アラン マックエルバー アメリカ合衆国，アイオワ 50322，デス モインズ，シックスティ フォース ス トリート 2800 (72)発明者 チャールズ ポール カートライト アメリカ合衆国，ミネソタ 55441，プリ マウス，マグノリア レーン ノース 15 (72)発明者 デビッド ロバート パターソン アメリカ合衆国，ニューヨーク 14607, ロチェスター，サイヤー ストリート 33
Claims (15)
- 【請求項１】 マイコバクテリウム・アビウム複合体
（ＭＡＣ）生物からの核酸を増幅させる方法であって、
ＭＡＣ核酸を含む疑いのある試料を、前記ＭＡＣ核酸が
増幅されるような条件下で、４種類のヌクレオシド三リ
ン酸、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、並びに次の３つの遺
伝子領域：MacSequevar 遺伝子領域、Ｍ．アビウム19キ
ロダルトンタンパク質遺伝子領域およびＭ．イントラセ
ルラーレリボソームタンパク質ｓｌ遺伝子領域のうちの
２つ以上に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーのセ
ット、と接触させることを含んで成る方法。 - 【請求項２】 前記３つの遺伝子領域の各々に特異的な
オリゴヌクレオチドプライマーのセットが用いられる、
請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 前記MacSequevar 遺伝子領域に特異的な
オリゴヌクレオチドプライマーのセットが、 MSqv F4／
MSqv R2, MSqv F4／MSqv R5, MSqv F2／MSqvR2 および
MSqv F2／MSqv R5 から成る群より選ばれる、請求項１
に記載の方法。 - 【請求項４】 前記プライマーのセットが MSqv F4／MS
qv R5 である、請求項３に記載の方法。 - 【請求項５】 前記Ｍ．アビウム19キロダルトンタンパ
ク質遺伝子領域に特異的なオリゴヌクレオチドプライマ
ーのセットが MAV19K F1／MAV19K R1 である、請求項１
に記載の方法。 - 【請求項６】 前記Ｍ．イントラセルラーレリボソーム
タンパク質ｓｌ遺伝子領域に特異的なオリゴヌクレオチ
ドプライマーのセットが rps1 F1／rps1 R1である、請
求項１に記載の方法。 - 【請求項７】 マイコバクテリウム・アビウム複合体
（ＭＡＣ）生物からの核酸を増幅させて検出する方法で
あって、 (i) ＭＡＣ核酸を含む疑いのある試料を、前記ＭＡＣ
核酸が増幅されるような条件下で、４種類のヌクレオシ
ド三リン酸、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、並びに次の３
つの遺伝子領域：MacSequevar 遺伝子領域、Ｍ．アビウ
ム19キロダルトンタンパク質遺伝子領域およびＭ．イン
トラセルラーレリボソームタンパク質ｓ１遺伝子領域の
うちの２つ以上に特異的なオリゴヌクレオチドプライマ
ーのセット、と接触させ； (ii) 前記増幅した核酸を変性させて一本鎖核酸にし；
そして (iii) 前記増幅したＭＡＣ核酸の存否を検出する ことを含んで成る方法。 - 【請求項８】 前記３つの遺伝子領域の各々に特異的な
オリゴヌクレオチドプライマーのセットが用いられる、
請求項７に記載の方法。 - 【請求項９】 前記検出が、増幅された遺伝子領域の各
々に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使って行わ
れる、請求項７に記載の方法。 - 【請求項１０】 ＭＡＣ生物の増幅に有用な診断キット
であって、 (i) MacSequevar 遺伝子領域に特異的なプライマーセ
ット； (ii) Ｍ．アビウム19キロダルトンタンパク質遺伝子領
域に特異的なプライマーセット； (iii) Ｍ．イントラセルラーレリボソームタンパク質ｓ
１遺伝子領域に特異的なプライマーセット；および (iv) 耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ を含んで成る診断キット。 - 【請求項１１】 マイコバクテリウム・アビウム複合体
（ＭＡＣ）の別の生物からＭ．アビウムを検出・識別す
る方法であって、ＭＡＣ生物からの核酸を含む疑いのあ
る試料を、ヌクレオチド配列：5' CCC TGA GAC AAC ACT
XGG TCC GTCC 3' （ここでＸはＣを除く任意のヌクレ
オチドである）を含むオリゴヌクレオチドプローブと接
触せしめ；そして前記試料中に存在する核酸と前記プロ
ーブとの間で形成された複合体の存否を検出することを
含んで成る方法。 - 【請求項１２】 次のオリゴヌクレオチド：MSqv F4 ；
MSqv F2 ；MSqv R5 ；MSqv R2 ；MSqv-Av ；MSqv P1.21
c ；MSqv-MAC；MSqv P1 ；MSqv 1.3c ；MAV19K F1 ；MA
V19K R1 ；MAV19K P1 ；rpsl F1 ；rpsl R1 ；およびrp
sl P1のうちの１つまたは複数を含んで成る組成物。 - 【請求項１３】 マイコバクテリウム・アビウムからの
核酸に選択的にハイブリダイズすることのできるオリゴ
ヌクレオチドプローブであって、ヌクレオチド配列：5'
CCC TGA GAC AAC ACT XGG TCC GTC C 3' （ここでＸは
Ｃ以外の任意のヌクレオチドである）を含んで成るオリ
ゴヌクレオチドプローブ。 - 【請求項１４】 ＸがＧまたはＵである、請求項１３に
記載のオリゴヌクレオチドプローブ。 - 【請求項１５】 ＸがＧである、請求項１３に記載のオ
リゴヌクレオチドプローブ。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US5076097P | 1997-06-25 | 1997-06-25 | |
| US60/050760 | 1997-06-25 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1169999A true JPH1169999A (ja) | 1999-03-16 |
| JP4298814B2 JP4298814B2 (ja) | 2009-07-22 |
Family
ID=21967251
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP17719998A Expired - Fee Related JP4298814B2 (ja) | 1997-06-25 | 1998-06-24 | 播種性マイコバクテリウム・アビウム複合体感染を検出するための多重化ｐｃｒアッセイ |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6465638B2 (ja) |
| EP (1) | EP0887425B1 (ja) |
| JP (1) | JP4298814B2 (ja) |
| AT (1) | ATE222606T1 (ja) |
| DE (1) | DE69807293T2 (ja) |
| DK (1) | DK0887425T3 (ja) |
| ES (1) | ES2183292T3 (ja) |
| PT (1) | PT887425E (ja) |
| SI (1) | SI0887425T1 (ja) |
Cited By (6)
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| WO2007129628A1 (ja) | 2006-05-02 | 2007-11-15 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | マイコバクテリウム・イントラセルラーレ検出用プライマー及びプローブ、並びにこれを用いたマイコバクテリウム・イントラセルラーレの検出方法 |
| WO2009145181A1 (ja) | 2008-05-28 | 2009-12-03 | 和光純薬工業株式会社 | マイコバクテリウム・イントラセルラー検出用プライマー及びプローブ、並びにこれを用いたマイコバクテリウム・イントラセルラーの検出方法 |
| EP2256218A1 (en) | 2004-04-26 | 2010-12-01 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | Probe and primer for tubercle bacillus detection, and method of detecting human tubercle bacillus therewith |
| EP2479273A2 (en) | 2006-12-18 | 2012-07-25 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | Primer and probe for detection of mycobacterium avium and method for detection of mycobacterium avium using the same |
| WO2019093530A1 (ja) * | 2017-11-13 | 2019-05-16 | 株式会社リコー | 検出判定用デバイス |
| JP2019092505A (ja) * | 2017-11-24 | 2019-06-20 | 株式会社リコー | 検出判定方法、検出判定装置、検出判定プログラム、及びデバイス |
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| US20020086289A1 (en) * | 1999-06-15 | 2002-07-04 | Don Straus | Genomic profiling: a rapid method for testing a complex biological sample for the presence of many types of organisms |
| CA2389533C (en) | 1999-12-15 | 2010-10-05 | Gen-Probe Incorporated | Methods and compositions for detection of mycobacterium avium complex species |
| FR2844970B1 (fr) | 2002-09-27 | 2005-03-25 | Bernard Favraud | Semelle d'usure pour article chaussant et article chaussant en resultant |
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| WO2007115059A2 (en) | 2006-03-29 | 2007-10-11 | Merial Limited | Vaccine against streptococci |
| US8309259B2 (en) | 2008-05-19 | 2012-11-13 | Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University | Electrochemical cell, and particularly a cell with electrodeposited fuel |
| CN102549834B (zh) | 2009-10-08 | 2015-03-11 | 流体公司 | 具有流管理系统的可再充电金属-空气电池 |
| CN102544638B (zh) | 2010-06-24 | 2015-07-15 | 流体股份有限公司 | 具有阶梯形支架燃料阳极的电化学电池 |
| CN102403525B (zh) | 2010-09-16 | 2016-02-03 | 流体公司 | 具有渐进析氧电极/燃料电极的电化学电池系统 |
| EP2966722B1 (en) | 2010-10-20 | 2018-08-29 | Fluidic, Inc. | Battery resetting process for scaffold fuel electrode |
| JP5908251B2 (ja) | 2010-11-17 | 2016-04-26 | フルイディック，インク．Ｆｌｕｉｄｉｃ，Ｉｎｃ． | 階層型アノードのマルチモード充電 |
| CN105219882A (zh) * | 2015-11-19 | 2016-01-06 | 北京利德曼生化股份有限公司 | 鸟胞内分枝杆菌复合群检测用引物和探针、以及其检测方法 |
| CN109565097A (zh) | 2016-07-22 | 2019-04-02 | 南特能源公司 | 电化学电池的除雾系统 |
| EP3491690B1 (en) | 2016-07-22 | 2020-07-15 | NantEnergy, Inc. | Moisture and carbon dioxide management system in electrochemical cells |
| WO2018051248A1 (en) | 2016-09-15 | 2018-03-22 | Fluidic, Inc. | Hybrid battery system |
| CA3041293A1 (en) | 2016-10-21 | 2018-04-26 | Nantenergy, Inc. | Corrugated fuel electrode |
| CN119481486A (zh) | 2018-06-29 | 2025-02-18 | 福恩能源公司 | 滚动膜片密封件 |
| CN120184457A (zh) | 2018-06-29 | 2025-06-20 | 福恩能源公司 | 金属空气电化学电池构架 |
| EP3966887B1 (en) | 2019-05-10 | 2025-07-02 | Form Energy, Inc. | Nested annular metal-air cell and systems containing same |
| EP3991234A4 (en) | 2019-06-28 | 2024-01-17 | Form Energy, Inc. | DEVICE ARCHITECTURES FOR METAL-AIR BATTERIES |
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1998
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