JPH1171299A - ヘモペキシンを含有する抗真菌剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】新規な抗真菌剤を提供する。 【解決手段】ヘモペキシンを含有する抗真菌剤

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明が属する技術分野】本発明は、ヘモペキシン（He
mopexin）を含有する抗真菌剤に関する。

【０００２】

【先行技術】真菌類が増殖するためには、真菌細胞内へ
の鉄成分の取り込みが必須であるが、通常、生体内では
血液中のトランスフェリンが鉄イオン（Ｆｅ³⁺）の取り
込みを阻害して抗菌的に作用する一方で、ヘミン等の鉄
錯体やヘモグロビン等の鉄結合性蛋白はそれら自身が細
胞内へ取り込まれることによって、トランスフェリンの
抗菌作用に対して阻害的に作用することが知られている
（Infection and Immunity, Nov.,Vol.62,No11(199
4)）。しかし、このような鉄成分が関与する真菌の増殖
メカニズムに対して臨床上効果的に作用する抗真菌剤は
これまで知られていない。なお細菌（bacteria）類につ
いては、その鉄成分取り込みによる細胞増殖に対する抗
菌作用が報告されている（Infection and Immunity, Ma
r.1986, Vol.,51,No.3(1986)）。そこでは、被験薬物と
して人由来の各種鉄結合性蛋白が記載されているが、実
際に抗菌作用が確認されているのはトランスフェリン、
アルブミン、及びハプトグロビンだけである。ヘモペキ
シンについては、それらと同様の効果があるものとして
併記されてはいるものの、単にヘマチンとの結合性を確
認しているに過ぎず、細菌に対する抗菌作用について何
ら具体的に実証されてはいない。まして真菌に対するヘ
モペキシンの抗菌作用については示唆すらされていな
い。ヘモペキシンは、分子量約７〜８万で５５４個のア
ミノ酸からなる血液中の急性相反応性蛋白であり、臨床
的には、通常、各種疾患の検査における一測定指標とし
て知られている（日本臨床５３巻１９９５年増刊号）
が、これまでその抗真菌作用については全く報告例がな
い。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】人体への安全性が高い
と考えられる新規な抗真菌剤の開発が要望されている。

【０００４】

【課題を解決するための手段】上記課題に鑑み本発明者
らは検討した結果、ヘモペキシンに抗真菌作用があるこ
とを見出し、本発明を完成した。本発明は、（１）ヘモ
ペキシンを含有することを特徴とする抗真菌剤、（２）
真菌細胞の鉄錯体および／または鉄結合性蛋白の取り込
みを阻害する、前記（１）の抗真菌剤、（３）鉄錯体が
ヘミン、鉄結合性蛋白がヘモグロビンである、前記
（２）の抗真菌剤、（４）さらにトランスフェリンを含
有する、前記（１）〜（３）のいずれかに記載の抗真菌
剤を提供する。

【０００５】本発明者らはまず、実験的にある種の真菌
を感染させたマウスの血清中の変化について調べた所、
意外にも感染が起こると血清中に強い抗菌力が出現し、
またその抗菌力は感染が進むにしたがって増大すること
を発見した。そこで真菌感染に伴って何らかの抗真菌性
物質が出現しているものと予想し、感染マウス血清中か
らその物質を単離精製し、構造解析した結果、その物質
が、ヒトやラットでも報告されているヘモペキシンであ
ることを見出した。ちなみにマウスのヘモペキシンにつ
いてはこれまで報告例がない。さらに単離したヘモペキ
シンの薬理作用について調べたところ、ヘモペキシン
が、真菌細胞のヘミンやヘモグロビンの取り込みを阻害
する結果、トランスフェリンの抗真菌作用を維持させる
働きがあることを見出した。よって、ヘモペキシンは、
抗真菌剤の活性成分として有用である。

【０００６】本発明のヘモペキシン含有抗真菌剤は、通
常、注射等の非経口投与が可能である。使用するヘモペ
キシンとしては、ヒト由来または遺伝子組換えで作成さ
れたヘモペキシンが例示される。一製剤中のヘモペキシ
ンの含有量は、通常、対象疾患・患者、投与剤形等を考
慮して適宜設定され、例えば約０．５〜５ｇである。ま
た本発明の抗真菌剤は、任意にその他の抗真菌性薬物及
び医薬用添加剤を含有していてもよい。抗真菌性薬物と
しては、例えば、アンフォテシリンＢ、フルシトシン、
フルコナゾール、イトラコナゾール、トランスフェリン
等が例示される。本発明の抗真菌剤の効能・効果として
は例えば、クリプトコックス、カンシダ、アスペルギル
ス、ヒアロホーラ、ホンセカエア、コクシジオイデス等
による真菌血症、真菌性髄膜炎、呼吸器真菌症、消化管
真菌症、尿路真菌症、黒色真菌症等が期待される。本発
明はさらに、血液中のヘモペキシンの濃度変化や挙動等
を測定することを特徴とする、新規抗真菌性薬物の探索
方法を提供する。該方法によれば、それ自身は必ずしも
真菌に対する直接的な抗菌作用を有さないが、体内投与
後、全身的にあるいは真菌細胞付近でヘモペキシン濃度
を高めることにより、間接的に生体の抗菌力を増大させ
得る薬物がスクリーニングされる。そのような抗真菌性
薬物の化学構造は特に制限されず、例えばヘモペキシン
のプロドラッグ等でもよい。該探索方法は、ラットやマ
ウス等の動物または人を使って、IN VITRO又はIN VIVO
にて実施可能である。以下に本発明の実施例を示す。

【０００７】

【実施例】

参考例１（ヘモペキシンの単離精製） （１）マウスの感染：８週齢以上のJcl/ICR系雌マウス
に対して、C. albicans (KE-2株)を尾静脈より接種して
全身感染を起こさせた。 （２）ヘモペキシンの単離精製 １．マウスを感染させた後、48時間後に全採血して血清
を得た。 ２．血清をカラムクロマト処理（Blue Sepharose (CL-6
B)、ファルマシア社商品名）して、活性体をアルブミン
と共に、ＫＰＢ（ＫＣｌ含有リン酸バッファー）で溶出
させた。溶出液をさらにFPLC（ファルマシア社商品名）
でイオン交換クロマト(Mono Qカラム、ファルマシア社
商品名)にかけ、アルブミンと活性体を分離した。活性
画分は1 M KClで溶出した。この溶出液をさらにFPLCで
ゲルろ過 (Superose 12、ファルマシア社商品名)した。 ３．ろ液を逆相クロマト(300C₈HG-5 Develosil、野村化
学社商品名)にかけ、1本のピークにして精製蛋白を得
た。 （３）ヘモペキシンの構造確認 得られた精製蛋白をリジンエンドペプチダーゼ（Lysyl
Endopeptidase，シグマ社製）で分解し、得られた３つ
のフラグメントＡ、Ｂ及びＣについて内部アミノ酸配列
をエドマン（Edman）分解法によって決定し、ホモロジ
ー検索を行って調べた結果、各フラグメント（図１参
照）がヒト及びラットのヘモペキシンのアミノ酸配列
（図２参照）と高い相同性を示した。具体的には、フラ
グメントＡ（ＧＧＮＮＬＶ）がラットのヘモペキシン中
に、フラグメントＢの一部（ＳＧＡＱＡＴ）がヒト及び
ラットのヘモペキシン中に、フラグメントＣの一部（Ｓ
ＬＧＰＮ）がヒトのヘモペキシン中にそれぞれ確認され
た。さらに、精製蛋白のＮ末のアミノ酸配列（２５〜２
７位：ＰＬＰ）がヒト及びラットのヘモペキシン中にも
確認された。以上の結果から、この精製蛋白は、マウス
のヘモペキシンであると断定した。

【０００８】試験例（ヘモペキシンの抗真菌活性） （１）被験薬物 ・トランスフェリン(transferrin)：鉄イオン非結合型
のアポトランスフェリン(apo-transferrin，シグマ社製
ヒト由来)を生理食塩水(ＰＢＳ)で希釈して使用。 ・ヘミン(Hemin chloride)：シグマ社製牛由来のものを
ＰＢＳで希釈して使用。 ・ヘモペキシン：参考例１にて得られたものを使用。 （２）抗菌活性の測定 RPMI−１６４０組織培養用培地に、ヘモペキシン及び真
菌として C. albicans(Ca-15株) を加え（１×１０⁴Ｃ
ＦＵ／ｍｌ）、６％CO_2、３７℃の条件で、24時間培養
（Incubation）した。菌の増殖度合いは、マイクロプレ
ートリーダーによる濁度を吸光度(測定波長：590 nm)と
して測定することにより判定し、サンプルの抗菌活性は
希釈倍率で表示した。ヘモペキシンの抗菌作用は、一定
濃度（１００μｇ／ｍｌ）のアポトランスフェリン存在
下で、ヘミン添加量を変えながら調べた。さらにアポト
ランスフェリン活性のヘミン阻害に対する、ヘモペキシ
ンによる解除濃度（IC５０％）を調べた。

【０００９】（３）結果を図３および表１に示す。

【表１】Hemopexin(μg/ml) 1300 650 325 162.5 81.3 40.6 20.3 10.2 5.1 Hemin(μg/ml) 50 25 13 6.3 3.1 1.6 ＜1.56 ＜1.56 ＜1.56 図３から明らかなように、（１）トランスフェリン非存
在下では、菌は十分に増殖した；（２）アポトランスフ
ェリンだけを添加した場合には、菌増殖は顕著に抑制さ
れた；（３）アポトランスフェリン存在下にヘミンを添
加すると、その添加量の増加に応じて菌増殖傾向を示し
た；（４）アポトランスフェリン存在下にヘミンを添加
した場合でも、その系にさらにヘモペキシンを添加した
場合には菌増殖が抑制された。以上の結果から、ヘモペ
キシンがヘミンに対して阻害作用を示す結果、トランス
フェリンと共に抗真菌作用を示すことが分かった。ま
た、そのヘミン阻害作用は表１に示す通り濃度依存的で
ある。

【００１０】

【図面の簡単な説明】

【図１】マウス由来の精製蛋白をリジンエンドペプチダ
ーゼ（Lysyl Endopeptidase）で処理したものを、液体
クロマトグラフィーで測定した場合のグラフである。縦
軸は吸光度、横軸はピークの位置を表す。Ａ、Ｂ及びＣ
の各ピークは、各フラグメントを示し、それぞれのアミ
ノ酸配列はグラフ下に示す通りである。

【図２】文献記載のヒト由来ヘモペキシン（Human Hemo
pexin）及びラット由来ヘモペキシン(Rat Hemopexin)の
アミノ酸配列である（J.Med.Euol.,1988,27,102及びBio
chemistry 1991,30(3), 823参照）。

【図３】ヘミンのトランスフェリン阻害に対するヘモペ
キシンの影響を調べたグラフである。縦軸は菌の増殖を
示す吸光度、横軸はヘミン濃度を示す。また＋、−の各
グラフはそれぞれヘモペキシン存在下及び非存在下の場
合に該当する

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ヘモペキシンを含有することを特徴とする
   抗真菌剤。
2. 【請求項２】真菌細胞の鉄錯体および／または鉄結合性
   蛋白の取り込みを阻害する、請求項１記載の抗真菌剤。
3. 【請求項３】鉄錯体がヘミン、鉄結合性蛋白がヘモグロ
   ビンである、請求項２記載の抗真菌剤。
4. 【請求項４】さらにトランスフェリンを含有する、請求
   項１〜３のいずれかに記載の抗真菌剤。