JPH1171300A - ペプチドの用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【解決手段】Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質がリガン
ドとして認識するポリペプチドの用途。このリガンドポ
リペプチドは、プロラクチン分泌の促進および抑制作用
ならびに胎盤機能調節作用を有するため、（１）プロラ
クチン分泌促進剤として、卵巣機能低下症、精嚢発育不
全、更年期障害または甲状腺機能低下などのプロラクチ
ン分泌に関係する各種疾患の予防および治療薬として、
（２）プロラクチン分泌抑制剤として、下垂体腺腫瘍、
間脳腫瘍、月経異常、自己免疫疾患、プロラクチノー
マ、不妊症、インポテンスなどのプロラクチン分泌に関
係する各種疾患の予防および治療薬として、（３）胎盤
機能調節作用剤として、絨毛癌、胞状奇胎、侵入奇胎、
流産、胎児の発育不全、糖代謝異常、脂質代謝異常また
は分娩誘発の予防または治療薬として有用である。 【効果】プロラクチン分泌促進剤として、卵巣機能低下
症、精嚢発育不全、更年期障害、甲状腺機能低下などの
プロラクチン分泌に関係する各種疾患の予防および治療
薬として有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、生理活性ペプチド
の用途に関する。さらに詳しくは、本発明は、Ｇ蛋白質
共役型レセプター（受容体と呼ぶこともある）蛋白質に
対するリガンド・ポリペプチドを含有するプロラクチン
分泌調節剤および胎盤機能調節剤などに関する。

【０００２】

【従来の技術】多くのホルモンや神経伝達物質は細胞膜
に存在する特異的なレセプターを通じて生体の機能を調
節している。これらのレセプターの多くは共役している
グアニンヌクレオチド結合性蛋白質（guanine nucleoti
de-binding protein、以下、Ｇ蛋白質と略称する場合が
ある）の活性化を通じて細胞内のシグナル伝達を行う。
また、これらのレセプターは、７個の細胞膜貫通領域を
有する共通した構造をもっていることから、Ｇ蛋白質共
役型レセプターあるいは７回膜貫通型レセプター（７Ｔ
ＭＲ）と総称される。このようなホルモンや神経伝達物
質とＧ蛋白質共役型レセプターによる生体の機能を調節
する経路の一つとして視床下部−下垂体系がある。これ
は、視床下部ホルモン（向下垂体性ホルモン）によって
下垂体からの下垂体ホルモンの分泌が調節され、血中に
放出された下垂体ホルモンを介して標的細胞・器官の機
能調節が行われるものである。この経路によって、ホメ
オスタシスの維持や生殖系、個体の発達、代謝、成長の
調節などの生体にとって重要な機能調節が行われてい
る。下垂体ホルモンは視床下部ホルモンと標的内分泌腺
より分泌される末梢ホルモンによるポジティブフィード
バック機構またはネガティブフィードバック機構によっ
て分泌調節されている。下垂体に存在する各種のレセプ
ター蛋白質は、視床下部−下垂体系を調節する上で中心
的な役割を担っている。

【０００３】また、これらのホルモン、因子およびその
レセプターは、視床下部−下垂体系だけに限局して存在
するのではなく、一般に脳内に広く分布することが知ら
れている。このことから、視床下部ホルモンと呼ばれて
いる物質が、中枢神経系においては神経伝達物質あるい
は神経調節物質として機能していると考えられている。
また、末梢組織においても同様に分布し、それぞれ重要
な機能を担っていると考えられている。従来、上記Ｇ蛋
白質共役型レセプター蛋白質のうち、それに対するリガ
ンドが未知であるＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質のリ
ガンドを決定する手段としては、リガンドが公知である
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質との一次構造上の類似
性を頼りに、推定する方法しかなかった。最近、リガン
ドが不明な、いわゆるオーファンＧ蛋白質共役型レセプ
ター蛋白質の一種であるＬＣ１３２あるいはＯＲＬ−１
をコードするｃＤＮＡをＣＨＯ細胞に導入し、該レセプ
ター細胞内情報伝達系を構築し、該レセプター蛋白質に
対するアゴニストと同様の細胞内情報伝達シグナルを検
出することにより、該レセプター蛋白質に対する新規オ
ピオイド・ペプチド・リガンドを探索した例が報告され
ている（Reinsheid, R. K. et al. , Science、270巻、
792-794頁、1995年；Menular, J.-C., et al. , Nature
377巻、532-535頁、1995年）。しかし、これらの場
合、公知のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質との類似性
やそのレセプター蛋白質の組織分布から、それに対する
リガンドはオピオイドペプチドのファミリーに属するペ
プチドリガンドであることが予測されていた。即ち、オ
ピオイドレセプターを介して生体に作用する物質につい
ての研究・開発の歴史は長く、種々のアンタゴニストお
よびアゴニストが既に開発されていた。そこで、人為的
に合成した化合物群の中からこのＬＣ１３２またはＯＲ
Ｌ−１に対するアゴニストをスクリーニングし、これを
プローブとしてそのアゴニストと同様な細胞内情報伝達
系の活性化物質を探索し、これを精製し、リガンドとし
ての構造を決定している。

【０００４】しかし、この例のようにオーファンＧ蛋白
質共役型レセプター蛋白質のうち、それに対するリガン
ドがおおよそでも推定されるものはほとんどないのが現
状である。特に、公知のレセプター蛋白質ファミリーと
類似性が低い、オーファンＧ蛋白質共役型レセプター蛋
白質の場合には、それに対するリガンドに関する情報が
ほとんどないために、そのリガンドを特定することは勿
論のこと、推定することすら困難であった。そのような
リガンドが未知の、オーファンＧ蛋白質共役型レセプタ
ー蛋白質の一つとして、ｐｈＧＲ３（または ＧＰＲ１
０と呼ばれることもある）遺伝子によってコードされる
ヒト型レセプター蛋白質〔ゲノミックス（Genomics），
第29巻，第335頁（1995年）〕、およびそれに対応する
ラット型レセプター蛋白質ＵＨＲ−１〔バイオケミカル
・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケー
ション（Biochem. Biophy. Res. Commun.），第209巻，
第606頁（1995年）〕が知られている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】下垂体、中枢神経系お
よび膵臓β細胞等で発現しているオーファンＧ蛋白質共
役型レセプターに対するリガンドは、医薬として有用で
あると考えられるが、その構造および機能については明
らかにされていない。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、オーファ
ンＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質の一つである、ｐｈ
ＧＲ３をコードするｃＤＮＡを発現させた細胞を用い、
特異的な細胞刺激（シグナル伝達）活性の測定等を指標
に、該レセプター蛋白質がリガンドとして認識するウシ
由来のポリペプチドをスクリーニングし、そのアミノ酸
配列およびＤＮＡ配列を決定した。ウシ由来の該ポリペ
プチドをコードするＤＮＡをプライマーとして用い、Ｐ
ＣＲ（polymerase chain reaction）法により該ポリペ
プチドをコードするウシ、ヒトおよびラット由来のｃＤ
ＮＡを単離し、そのラット由来のｃＤＮＡ配列を基にプ
ライマーを作成し、ＰＣＲ法により、マウス由来の該ポ
リペプチドをコードするｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ配
列を単離することに成功した。さらに、本発明者らは、
これらのｃＤＮＡ配列を基にｐｈＧＲ３およびＵＨＲ−
１に対するリガンドとして機能する生理活性ペプチドを
同定することに成功した。また、同定した該生理活性ペ
プチドを合成し、その生理作用の解析を進めた結果、該
生理活性ペプチドが、下垂体に対しプロラクチンの放出
を調節する作用および胎盤機能を調節する作用などを有
することを見いだした。

【０００７】すなわち、本発明は、（１）Ｇ蛋白共役型
レセプター蛋白質に対するリガンドペプチドまたはその
塩を含有するプロラクチン分泌調節剤、（２）Ｇ蛋白共
役型レセプター蛋白質に対するリガンドペプチドまたは
その塩が、配列番号：７３で表されるアミノ酸配列と同
一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリ
ペプチドまたはそのアミド、エステルもしくはその塩で
ある上記（１）記載のプロラクチン分泌調節剤、（３）
配列番号：７３で表されるアミノ酸配列が、配列番号：
５、８、４７、５０、６１または６４である上記（２）
記載のプロラクチン分泌調節剤、（４）プロラクチン分
泌促進剤である上記（１）記載のプロラクチン分泌調節
剤、（５）プロラクチン分泌抑制剤である上記（１）記
載のプロラクチン分泌調節剤、（６）卵巣機能低下症、
精嚢発育不全、更年期障害または甲状腺機能低下の予防
または治療薬である上記（４）記載のプロラクチン分泌
促進剤、（７）下垂体腺腫瘍、間脳腫瘍、月経異常、自
己免疫疾患、プロラクチノーマ、不妊症、インポテン
ス、無月経症、乳汁漏症、末端肥大症、キアリ・フロン
メル症候群、アルゴンツ・デル・カスティロ症候群、フ
ォーベス・アルブライト症候群、リンパ腫、シーハン症
候群または精子形成異常の予防または治療薬である上記
（５）記載のプロラクチン分泌抑制剤、（８）Ｇ蛋白共
役型レセプター蛋白質に対するリガンドペプチドまたは
その塩を含有する胎盤機能調節剤、（９）繊毛癌、胞状
奇胎、侵入奇胎、流産、胎児の発育不全、糖代謝異常、
脂質代謝異常または分娩誘発の予防または治療薬である
上記（８）記載の胎盤機能調節剤、（１０）畜産哺乳動
物の乳汁の分泌促進剤である上記（４）記載のプロラク
チン分泌促進剤、（１１）プロラクチン分泌機能の検査
薬である上記（１）記載のプロラクチン分泌調節剤、お
よび（１２）性欲促進剤である上記（４）記載のプロラ
クチン分泌促進剤などに関する。

【０００８】

【発明の実施の形態】本明細書および図面において、塩
基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−
ＩＵＢ Commision on Biochemical Nomenclature によ
る略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくもの
であり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異
性体が存在する場合は、特に明示しなければＬ体を示す
ものとする。 ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸 ｃＤＮＡ ：相補的デオキシリボ核酸 Ａ ：アデニン Ｔ ：チミン Ｇ ：グアニン Ｃ ：シトシン ＲＮＡ ：リボ核酸 ｍＲＮＡ ：メッセンジャーリボ核酸 ｄＡＴＰ ：デオキシアデノシン三リン酸 ｄＴＴＰ ：デオキシチミジン三リン酸 ｄＧＴＰ ：デオキシグアノシン三リン酸 ｄＣＴＰ ：デオキシシチジン三リン酸 ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸 ＥＤＴＡ ：エチレンジアミン四酢酸 ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム ＥＩＡ ：エンザイムイムノアッセイ

【０００９】ＧｌｙまたはＧ ：グリシン ＡｌａまたはＡ ：アラニン ＶａｌまたはＶ ：バリン ＬｅｕまたはＬ ：ロイシン ＩｌｅまたはＩ ：イソロイシン ＳｅｒまたはＳ ：セリン ＴｈｒまたはＴ ：スレオニン ＣｙｓまたはＣ ：システイン ＭｅｔまたはＭ ：メチオニン ＧｌｕまたはＥ ：グルタミン酸 ＡｓｐまたはＤ ：アスパラギン酸 ＬｙｓまたはＫ ：リジン ＡｒｇまたはＲ ：アルギニン ＨｉｓまたはＨ ：ヒスチジン ＰｈｅまたはＦ ：フェニルアラニン ＴｙｒまたはＹ ：チロシン ＴｒｐまたはＷ ：トリプトファン ＰｒｏまたはＰ ：プロリン ＡｓｎまたはＮ ：アスパラギン ＧｌｎまたはＱ ：グルタミン ｐＧｌｕ ：ピログルタミン酸 Ｍｅ ：メチル基 Ｅｔ ：エチル基 Ｂｕ ：ブチル基 Ｐｈ ：フェニル基 ＴＣ ：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキ
サミド基

【００１０】また、本明細書中で繁用される置換基、保
護基および試薬を下記の記号で表記する。 ＢＨＡ：ベンズヒドリルアミン ｐＭＢＨＡ：ｐ−メチルベンズヒドリルアミン Ｔｏｓ：ｐ−トルエンスルフォニル ＣＨＯ：ホルミル ＨＯＮＢ：Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネンー２，３
−ジカルボキシイミド ＯｃＨｅｘ：シクロヘキシルエステル Ｂｚｌ：ベンジル Ｃｌ₂−Ｂｚｌ：ジクロロベンジル Ｂｏｍ：ベンジルオキシメチル Ｚ：ベンジルオキシカルボニル Ｂｒ−Ｚ：２−ブロモベンジルオキシカルボニル Ｂｏｃ：ｔ−ブチルオキシカルボニル ＤＣＭ：ジクロロメタン ＨＯＢｔ：１−ヒドロキシベンズトリアゾール ＤＣＣ：Ｎ、Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸 ＤＩＥＡ：ジイソプロピルエチルアミン Ｆｍｏｃ：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル ＤＮＰ：ジニトロフェニル Ｂｕｍ：ターシャリーブトキシメチル Ｔｒｔ：トリチル

【００１１】本明細書において、「実質的に同一」と
は、蛋白質の活性、例えば、リガンドと受容体の結合活
性や生理的な特性などが、実質的に同じであることを意
味する。従って、「実質的に同一」のアミノ酸配列と
は、蛋白質の活性、例えば、リガンドと受容体の結合活
性や生理的な特性などが、実質的に同じである（著しい
変化を生じていない）状態が保たれる範囲の変異を有し
ていてもよいアミノ酸配列を意味する。一般に、ポリペ
プチド配列中におけるアミノ酸の置換、欠失あるいは挿
入（付加）などの変異は、そのポリペプチドの生理的な
特性や化学的な特性に大きな（著しい）変化をもたらさ
ないことがしばしばあることは、よく知られた事実であ
る。該置換の例としては、あるアミノ酸が性質（特性）
の似ている他のアミノ酸で置換されたものが挙げられ、
一般的には、特性の類似性が強いアミノ酸相互間で置換
が行われる場合ほど、その置換が置換前の元のポリペプ
チドにおよぼす特性の変化は小さいと考えられている。
アミノ酸は、その特性の類似性を一つの基準にして例え
ば次のようなクラスに分類される。（i）非極性（疎水
性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイ
シン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプト
ファン、メチオニンなどが挙げられる。（ii）極性（中
性）アミノ酸としてはグリシン、セリン、スレオニン、
システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミンなど
が挙げられる。（iii）陽電荷をもつ（塩基性）アミノ
酸としてはアルギニン、リジン、ヒスチジンなどが挙げ
られる。（iv）負電荷をもつ（酸性）アミノ酸として
は、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
本明細書中で対象とするアミノ酸配列中のアミノ酸の
「実質的に同一」な置換物としては、例えばそのアミノ
酸が属するクラスのうち特性の似ている他のアミノ酸類
から選ばれることが多い。本発明においては、元の（無
変異の）ポリペプチドの生理的な特性や化学的な特性に
重大な（著しい）変化をもたらさないような置換、欠失
あるいは挿入等のアミノ酸配列における変異の結果得ら
れるポリペプチド（変異型ポリペプチド）は、そのよう
な変異を有していない元の（無変異の）ポリペプチドと
実質的に同一であると見なされ、またその変異型ポリペ
プチドのアミノ酸配列は、元の（無変異の）ポリペプチ
ドのアミノ酸配列と実質的に同一であると見なされる。
なお、本発明におけるポリペプチド中の構成アミノ酸
は、Ｄ体またはＬ体のいずれであってもよいが、特にこ
とわらない限り通常はＬ体が好ましい。

【００１２】本発明におけるポリペプチドは、Ｇ蛋白共
役型レセプター蛋白質に対するリガンドペプチドまたは
その塩、即ちＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に結合す
ることができるリガンドポリペプチドまたはその塩であ
り、具体的には例えば、配列番号：７３で表されるアミ
ノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を
含有するポリペプチドまたはそのアミド、エステルもし
くはその塩（以下、単にリガンドポリペプチドまたはポ
リペプチドと略称する場合がある）が挙げられる。配列
番号：７３で表される該アミノ酸配列として好ましく
は、配列番号：５、８、４７、５０、６１または６４で
表されるアミノ酸配列が挙げられ、とりわけ、配列番
号：６１または６４で表されるアミノ酸配列、さらに好
ましくは、配列番号：６４で表されるアミノ酸配列が挙
げられる。本発明における該ポリペプチドとしては、ヒ
トや温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、
ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）のあらゆる組織（例え
ば、下垂体、膵臓、脳、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、
胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管、血管、
心臓など）または細胞などに由来するポリペプチドであ
って、具体的には例えば、配列番号：７３で表わされる
アミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配
列、好ましくは、配列番号：５、８、４７、５０、６１
または６４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質
的に同一のアミノ酸配列を含有するものであればよい。
例えば、本発明における該リガンドポリペプチドとして
は、配列番号：７３で表わされるアミノ酸配列、好まし
くは、配列番号：５、８、４７、５０、６１または６４
で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドなどの
他に、配列番号：７３で表わされるアミノ酸配列、好ま
しくは、配列番号：５、８、４７、５０、６１または６
４で表されるアミノ酸配列と約５０〜９９．９％（好ま
しくは７０〜９９．９％、より好ましくは８０〜９９．
９％、さらに好ましくは９０〜９９．９％）の相同性を
有するアミノ酸配列を含有し、配列番号：７３で表わさ
れるアミノ酸配列、好ましくは、配列番号：５、８、４
７、５０、６１または６４で表されるアミノ酸配列を含
有するポリペプチドと実質的に同質の活性を有するポリ
ペプチドなどが挙げられる。該活性としては、例えばレ
セプター結合活性、シグナル伝達活性など、該リガンド
ポリペプチドが有する活性が挙げられる。活性が「実質
的に同質」とは、該レセプター結合活性などの特性が同
質であることを示す。従って、該レセプター結合活性に
は著しくない程度の強弱が認められてもよく、また、該
リガンドポリペプチドの分子量における相違は問題では
ない。ヒトや温血動物の同じ属由来の実質的に同一のペ
プチドが、由来する種の違い（例えば、人種間の違い
等）によりそのペプチドの本質的でないアミノ酸配列上
の差異が認められることがあるが、本発明における該ポ
リペプチドとしては、本質的でないアミノ酸配列上の差
異によるこれらのペプチドも包含する。

【００１３】本発明のリガンドポリペプチドまたはその
アミド、エステルもしくはその塩（以下、単にリガンド
ポリペプチドまたはポリペプチドと略称する場合があ
る）、その製造法および用途を以下にさらに詳細に説明
する。本発明のリガンドポリペプチドとして、具体的に
は例えば、配列番号：７３で表わされるアミノ酸配列を
含有するラット、ウシ、ヒトまたはマウス由来のポリペ
プチドなどが挙げられる。（なお、配列番号：７３にお
いて第１０番目のXaaはAlaまたはThr、第１１番目のXaa
はGlyまたはSer、第２１番目のXaaはH、Gly、またはGly
Argを示す。） また、本発明の該リガンドポリペプチドには、 （i）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列中の１個
以上１５個以下、好ましくは１個以上１０個以下、より
好ましくは１個以上５個以下のアミノ酸が他のアミノ酸
で置換されたアミノ酸配列、 （ii）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列中の１個
以上１５個以下、好ましくは１個以上１０個以下、より
好ましくは１個以上５個以下のアミノ酸が欠失したアミ
ノ酸配列、 （iii）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列に１個
以上１５個以下、好ましくは１個以上１０個以下、より
好ましくは１個以上５個以下のアミノ酸が付加した（挿
入された）アミノ酸配列、さらには、（iv）上記（i）,
（ii）または（iii）のポリペプチド中の構成アミノ酸
（特にその側鎖）に修飾を有するアミノ酸配列を含有す
るポリペプチド、またはそのアミド、エステルもしくは
その塩も含まれる。上記（iii）のポリペプチドのうち
好ましくは、配列番号：７３で表されるアミノ酸を含有
するポリペプチドおよび配列番号：７３で表されるアミ
ノ酸配列を含有するポリペプチドのＮ末端に、配列番
号：７４で表されるペプチドがさらに付加したアミノ酸
配列を含有するポリペプチドなどを挙げることができ
る。本発明の該リガンドポリペプチドは、そのアミノ酸
配列中に上記（i）ないし（iv）の置換、欠失、付加、
修飾などを意図的または偶発的に施すことにより、熱や
プロテアーゼに対する安定型リガンドポリペプチドや、
該リガンドポリペプチドの有する生理活性が高まった高
活性型リガンドポリペプチドに変異（変換）させること
が可能である。本発明における該リガンドポリペプチド
またはそのアミド、エステルもしくはその塩は、これら
変異型リガンドポリペプチドも包含する。

【００１４】本明細書において、ペプチドの標記は、そ
の慣例に従い、左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ
末端（カルボキシル末端）として記載する。本発明のポ
リペプチド中の構成アミノ酸における修飾の例として
は、例えば、ＧｌｎのＮ端側が生体内で切断され、該Ｇ
ｌｎがピログルタミン酸化したものなどが挙げられる。
本発明におけるポリペプチド、例えば配列番号：７３で
表されるポリペプチドは、Ｃ末端アミノ酸残基のα−カ
ルボキシル基が、通常はカルボキシル基（-COOH)または
カルボキシレート(-COO^-)であるが、Ｃ末端アミノ酸残
基の該カルボキシル基がアミド（-CONH₂)またはエステ
ル(-COOR)であってもよい。 -COOR で表される該エステ
ルのＲとしては、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピ
ル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ_1-6アル
キル基、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ_3-8
シクロアルキル基、フェニル、α−ナフチルなどのＣ
_6-12アリール基、ベンジル、フェネチルなどのフェニル
Ｃ_1-2アルキル基、ベンズヒドリルなどのジフェニル−
Ｃ_1-2アルキル、もしくはα−ナフチルメチルなどのα
−ナフチル−Ｃ_1-2アルキルなどのＣ_7-14アラルキル基
のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオ
キシメチルエステルなどが挙げられる。また、本発明に
おけるポリペプチド、例えば配列番号：７３で表される
ポリペプチドが、Ｃ末端以外にカルボキシル基またはカ
ルボキシレートを有している場合、それらの基がアミド
化またはエステル化されているポリペプチドも本発明の
ポリペプチドに含まれる。この場合のエステルとして
は、例えば前述のＣ末端アミノ酸残基のエステルなどと
同様である。本発明のリガンドポリペプチドとしては特
にＣ末端アミノ酸残基のカルボキシル基がアミドである
ペプチドが好ましい。なかでも、配列番号：５、８、４
７、５０、６１、６４で表されるアミノ酸配列を有する
ポリペプチドのＣ末端アミノ酸残基のカルボキシル基が
アミドであるポリペプチドが好ましい。本発明のポリペ
プチドの塩としては、生理学的に許容される塩基（例え
ばアルカリ金属など）や酸（有機酸、無機酸）との塩が
用いられるが、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩
が好ましい。このような塩としては例えば無機酸（例え
ば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるい
は有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル
酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ
酸、シュウ酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼン
スルホン酸）との塩などが用いられる。

【００１５】本発明のリガンドポリペプチドまたはその
アミド、エステルもしくはその塩は、（i）ヒトや温血
動物の組織または細胞からポリペプチドを精製する方法
によって製造することができ、また、（ii）公知のポリ
ペプチド合成法に準じて製造することもできる。さらに
また、（iii）該ポリペプチドをコードするＤＮＡを含
有する形質転換体を培養する方法（後述）によって製造
することもできる。 （i）該リガンドポリペプチドを、ヒトや温血動物の組
織または細胞から製造する場合、ヒトや温血動物の組織
または細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出を行
い、該抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換ク
ロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー
などのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精
製単離することができる。 （ii）該リガンドポリペプチドは、自体公知のポリペプ
チドの合成法に従って製造することもできる。ペプチド
の合成法としては、例えば固相合成法、液相合成法のい
ずれによってもよい。即ち、蛋白質を構成し得る部分ペ
プチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成
物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより
目的のペプチドを製造することができる。この場合の公
知の縮合方法や保護基の脱離方法としては例えば、以下
の〜に記載された方法が挙げられる。 M. Bodanszky および M.A. Ondetti： ペプチド シ
ンセシス (Peptide Synthesis), Interscience Publish
ers, New York (1966年) SchroederおよびLuebke： ザ ペプチド(The Peptid
e), Academic Press, NewYork (1965年) 泉屋信夫他： ペプチド合成の基礎と実験、 丸善(株)
（1975年） 矢島治明 および榊原俊平： 生化学実験講座 1、 タ
ンパク質の化学IV、 205、(1977年) 矢島治明監修、続医薬品の開発 第14巻 ペプチド合成
広川書店

【００１６】上記（ii）の該リガンドポリペプチドの合
成法として具合的には、例えば次の方法などが挙げられ
る。該リガンドポリペプチドのアミド体を合成するに
は、アミド形成に適したペプチド合成用樹脂を用いると
よい。そのような樹脂としては例えば、クロロメチル樹
脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹
脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルア
ルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、
PAM樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセト
アミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−
（2',4'-ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェ
ノキシ樹脂、４−（2',4'-ジメトキシフェニル−Fmocア
ミノエチル）フェノキシ樹脂などが挙げられる。このよ
うな樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を公知の適
当な保護基で保護したアミノ酸を、自体公知の各種縮合
方法に従い、目的とするペプチドの配列通りに該樹脂上
で縮合させる。反応の最後に樹脂からペプチドを切り出
すとともに各種保護基を除去し、目的のポリペプチドを
取得することができる。 前述の保護されたアミノ酸を
縮合させるには、ペプチド合成に使用できる各種活性化
試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類
がよい。カルボジイミド類としてはDCC、N,N'-ジイソプ
ロピルカルボジイミド、N-エチル-N'-(3-ジメチルアミ
ノプロリル）カルボジイミドなどが挙げられる。これら
による活性化には、ラセミ化抑制添加剤（例えば、HOB
t)とともに保護されたアミノ酸を直接樹脂に添加するか
または、対称酸無水物またはHOBtエステルあるいはHOOB
tエステルとしてあらかじめ保護されたアミノ酸の活性
化を行ったのちに樹脂に添加することができる。保護さ
れたアミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒
としては、ペプチド縮合反応に使用可能な公知の溶媒か
ら適宜選択すればよい。該溶媒としては、例えばＮ，Ｎ
−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミ
ド、Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチ
レン、クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリ
フルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスル
ホキシドなどのスルホキシド類、ピリジンなどの三級ア
ミン類、ジオキサン、テトラヒドロフランなどのエーテ
ル類、アセトニトリル、プロピオニトリルなどのニトリ
ル類、酢酸メチル、酢酸エチルなどのエステル類あるい
はこれらの適宜の混合物などが挙げられる。該縮合反応
における反応温度は、公知のペプチド結合形成反応に使
用可能な温度範囲から適宜選択すればよく、通常約−２
０℃〜５０℃の範囲が挙げられる。該活性化されたアミ
ノ酸誘導体は、通常１.５〜４倍過剰で用いられる。縮
合反応の達成度は公知のニンヒドリン反応を用いて確認
することができ、その結果、縮合が不十分な場合には保
護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことによ
り十分な縮合を行うことができる。反応を繰り返しても
十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセ
チルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化
し、後の反応に影響をおよぼさないようにすることもで
きる。

【００１７】該ペプチド合成の際の原料となるアミノ酸
のアミノ基の保護基としては、例えば、Ｚ、Boc、tert
−アミルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボ
ニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Cl-Z、
Br-Z、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロア
セチル、フタリル、ホルミル、２−ニトロフェニルスル
フェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Fmocなどが
挙げられる。カルボキシル基の保護基としては、例えば
前述のＣ_1-6アルキル基、Ｃ_3-8シクロアルキル基、Ｃ
_7-14アラルキル基の他、２−アダマンチル、４−ニトロ
ベンジル、４−メトキシベンジル、４−クロロベンジ
ル、フェナシル基およびベンジルオキシカルボニルヒド
ラジド、tert−ブトキシカルボニルヒドラジド、トリチ
ルヒドラジドなどが挙げられる。セリンおよびスレオニ
ンの水酸基は、例えばエステル化またはエーテル化によ
って保護することができる。このエステル化に適する基
としては例えばアセチル基などの低級（Ｃ_1-6）アルカ
ノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオ
キシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸か
ら誘導される基などが挙げられる。また、エーテル化に
適する基としては、例えばベンジル基、テトラヒドロピ
ラニル基、tert−ブチル基などである。チロシンのフェ
ノール性水酸基の保護基としては、例えばBzl、Cl₂-Bz
l、２−ニトロベンジル、Br-Z、tert−ブチルなどが挙
げられる。ヒスチジンのイミダゾールの保護基として
は、Tos、４-メトキシ-2,3,6-トリメチルベンゼンスル
ホニル、DNP、ベンジルオキシメチル、Bum、Boc、Trt、
Fmocなどが挙げられる。

【００１８】本発明における該リガンドポリペプチドま
たはそのアミド、エステルもしくはその塩としては、例
えば、上記した配列番号：７３で表されるアミノ酸配列
と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する
ポリペプチドと同様の作用（下垂体機能調節作用、中枢
神経機能調節作用、膵臓機能調節作用、プロラクチン分
泌調節作用、胎盤機能調節作用など、とりわけプロラク
チン分泌調節作用または胎盤機能調節作用）を有してい
る限り、そのアミノ酸配列に変異を有するどのようなペ
プチドであってもよい。このようなペプチドとしては例
えば、配列番号：７３で表されるアミノ酸配列を有する
ペプチドから１ないし１５個以下のアミノ酸が欠失した
アミノ酸配列を有するペプチドを挙げることができる。
具体的には例えば、（ａ）配列番号：７３で表されるア
ミノ酸配列の第２番目から第２１番目のアミノ酸配列を
有するペプチド、（ｂ）配列番号：７３で表されるアミ
ノ酸配列の第３番目から第２１番目のアミノ酸配列を有
するペプチド、（ｃ）配列番号：７３で表されるアミノ
酸配列の第４番目から第２１番目のアミノ酸配列を有す
るペプチド、（ｄ）配列番号：７３で表されるアミノ酸
配列の第５番目から第２１番目のアミノ酸配列を有する
ペプチド、（ｅ）配列番号：７３で表されるアミノ酸配
列の第６番目から第２１番目のアミノ酸配列を有するペ
プチド、（ｆ）配列番号：７３で表されるアミノ酸配列
の第７番目から第２１番目のアミノ酸配列を有するペプ
チド、（ｇ）配列番号：７３で表されるアミノ酸配列の
第８番目から第２１番目のアミノ酸配列を有するペプチ
ド、（ｈ）配列番号：７３で表されるアミノ酸配列の第
９番目から第２１番目のアミノ酸配列を有するペプチ
ド、（ｉ）配列番号：７３で表されるアミノ酸配列の第
１０番目から第２１番目のアミノ酸配列を有するペプチ
ド、（ｊ）配列番号：７３で表されるアミノ酸配列の第
１１番目から第２１番目のアミノ酸配列を有するペプチ
ド、（ｋ）配列番号：７３で表されるアミノ酸配列の第
１２番目から第２１番目のアミノ酸配列を有するペプチ
ド、（ｌ）配列番号：７３で表されるアミノ酸配列の第
１３番目から第２１番目のアミノ酸配列を有するペプチ
ド、（ｍ）配列番号：７３で表されるアミノ酸配列の第
１４番目から第２１番目のアミノ酸配列を有するペプチ
ド、（ｎ）配列番号：７３で表されるアミノ酸配列の第
１５番目から第２１番目のアミノ酸配列を有するペプチ
ドなどが好ましい。さらに、配列番号：７４で表される
アミノ酸配列を有するペプチドなども好ましい。配列番
号：７３で表されるアミノ酸配列としてより好ましい、
配列番号：５、８、４７、５０、６１または６４につい
ても、配列番号：７３で表されるアミノ酸配列について
例示したものと同様である。本発明におけるリガンドポ
リペプチドは、さらに、他の蛋白質（例、機能または性
質がよく知られている公知の蛋白質）との融合蛋白質で
あってもよい。

【００１９】本発明におけるリガンドポリペプチドをコ
ードするＤＮＡとしては、本発明における配列番号：７
３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一
のアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードする塩
基配列を含有するものであればいかなるものであっても
よい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリ
ー、組織・細胞由来のｃＤＮＡ、組織・細胞由来のｃＤ
ＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライ
ブラリーに使用するベクターはバクテリオファージ、プ
ラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであって
もよい。また、組織・細胞よりＲＮＡ画分を調製したも
のを用いて直接ＲＴ-ＰＣＲ（reverse transcription P
CR）法によって増幅することもできる。より具体的に
は、配列番号：１または配列番号：４４のアミノ酸配列
を含有するラット全脳あるいはウシ視床下部由来のポリ
ペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：２で
表わされる塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。
ここで、配列番号：２において第１２９番目のＲはＧま
たはＡを、第１７９番目および２４０番目のＹはＣまた
はＴを示す。第１７９番目のＹがＣのとき、配列番号：
１で表されるアミノ酸配列をコードし、第１７９番目の
ＹがＴのとき、配列番号：４４で表されるアミノ酸配列
をコードする。

【００２０】また、配列番号：３、４、５、６、７、
８、９または１０で表されるアミノ酸配列を含有するウ
シ由来ポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列
番号：１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７また
は１８で表わされる塩基配列を有するＤＮＡなどが用い
られる。ここで、配列番号：１１、１３、１４、１５の
第６３番目のＲおよび配列番号：１２、１６、１７、１
８の第２９番目のＲはＧあるいはＡを示す。また、配列
番号：４５、４７、４８、４９、５０、５１または５２
で表されるラット由来ポリペプチドをコードするＤＮＡ
としては、配列番号：４６、５３、５４、５５、５６、
５７または５８で表される塩基配列を有するＤＮＡなど
が用いられる。さらに、配列番号：５９、６１、６２、
６３、６４、６５または６６で表されるヒト由来ポリペ
プチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：６０、
６７、６８、６９、７０、７１または７２で表される塩
基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。また、本発明
における配列番号：１、配列番号：４４で表されるアミ
ノ酸配列を含有するウシ型ポリペプチド、配列番号：４
５で表されるアミノ酸配列を含有するラット型ポリペプ
チド、または配列番号：５９で表されるアミノ酸配列を
含有するヒト型ポリペプチドをコードするＤＮＡの中で
例えば６個以上９０個以下（好ましくは６個以上６０個
以下、より好ましくは９個以上３０個以下、さらに好ま
しくは１２個以上３０個以下）の部分塩基配列を含有す
るＤＮＡ断片はＤＮＡ検出プローブとしても好ましく用
いられる。

【００２１】（iii）本発明におけるポリペプチドをコ
ードするＤＮＡは、以下の遺伝子工学的手法によって製
造することもできる。本発明のポリペプチドを完全にコ
ードするＤＮＡのクローニング（クローン化）は、以下
の方法に従って行えばよい。即ち、（１）該ポリペプチ
ドの部分塩基配列を有するＤＮＡを合成し、これをプラ
イマーとしてＰＣＲ法によって該ポリペプチドを完全に
コードするＤＮＡを増幅するか、または、（２）ｃＤＮ
ＡもしくはゲノムＤＮＡ、またはそのＤＮＡ断片を適当
なベクターに組み込んで得られるＤＮＡライブラリー
を、例えば該リガンドポリペプチドの一部あるいは全領
域を有するＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識
したものとハイブリダイゼーションを行うことにより選
別すればよい。該ハイブリダイゼーションの方法は、例
えば Molecular Cloning （２nd ed.；J. Sambrook et
al., Cold SpringHarbor Lab. Press, 1989）などに記
載の方法に従って行えばよい。また、ＤＮＡライブラリ
ーとして市販のものを使用する場合は、添付の使用説明
書に記載の方法に従って行えばよい。クローン化された
該ポリペプチドをコードするＤＮＡは、そのまま使用し
ても、または所望により制限酵素で消化した後もしくは
リンカーＤＮＡを付加した後に使用してもよい。該ＤＮ
Ａは、その５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧ
を有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴ
ＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これら
の翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮ
Ａアダプターを用いて付加することもできる。

【００２２】該ポリペプチドをコードする塩基配列を有
するＤＮＡを含有する発現ベクターは、例えば、（イ）
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを含有するＤ
ＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、（ロ）この
ＤＮＡ断片を公知の適当な発現ベクター中のプロモータ
ー配列の下流に連結することにより製造することができ
る。該ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド
（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵ
Ｃ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１
０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド
（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバ
クテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイル
ス，バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどが用いら
れる。該プロモーターとしては、目的のポリペプチドを
コードする遺伝子の発現に用いる宿主において、適切に
機能するプロモーターであればいかなるものでもよい。
形質転換する際の宿主がエシェリヒア属菌である場合
は、trp プロモーター、lac プロモーター、recＡプロ
モーター、λＰＬプロモーター、lpp プロモーターなど
が、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモ
ーター、ＳＰＯ２プロモーター、penＰプロモーターな
ど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、
ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロ
モーターなどが好ましい。宿主が動物細胞である場合に
は、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウイルスのプ
ロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートシ
ョックプロモーター、サイトメガロウイルスプロモータ
ー、ＳＲαプロモーターなどがそれぞれ好ましく挙げら
れる。なお、目的のポリペプチドをコードする遺伝子を
効率よく発現させるためには、エンハンサーを使用する
ことが好ましい。

【００２３】また、必要に応じて、宿主に合ったシグナ
ル配列を、ポリペプチドまたはその部分ペプチドのＮ端
末側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合
は、アルカリフォスファターゼ・シグナル配列、ＯmpＡ
・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合
は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シ
グナル配列などが、宿主が酵母である場合は、メイテイ
ングファクターα・シグナル配列、インベルターゼ・シ
グナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、例え
ばインシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン
・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞ
れ利用できる。このようにして構築されたポリペプチド
またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡを含有する
ベクターを用いて、形質転換体を製造する。

【００２４】形質転換する際の宿主としては、例えば公
知のエシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫、動
物細胞などが挙げられる。。該エシェリヒア属菌の具体
例としては、例えばエシェリヒア・コリ（Escherichia
coli）Ｋ１２・ＤＨ１〔プロシージングズ・オブ・ザ・
ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ
・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），
第60巻，160頁（1968年)〕，ＪＭ１０３〔ヌクイレック
・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Research），第
9巻，309頁（1981年）〕，ＪＡ２２１〔ジャーナル・オ
ブ・モレキュラー・バイオロジー（Journal of Molecul
ar Biology）〕，第120巻，517頁（1978年）〕，ＨＢ１
０１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジ
ー，第41巻，459頁（1969年）〕，Ｃ６００〔ジェネテ
ィックス（Genetics），第39巻，440頁（1954年）〕な
どが挙げられる。該バチルス属菌の具体例としては、例
えばバチルス・サチルス（Bacillus subtilis）ＭＩ１
１４〔ジーン（gene），第24巻，255頁（1983年）〕，
２０７−２１〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー
（Journal of Biochemistry），第95巻，87頁（1984
年）〕などが挙げられる。

【００２５】該酵母としては、例えばサッカロマイセス
セレビシエ（Saccaromyces cerevisiae)ＡＨ２２，Ａ
Ｈ２２Ｒ^-，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ
−１２などが挙げられる。該昆虫としては、例えばカイ
コの幼虫などが挙げられる〔前田ら、ネイチャー（Natu
re），第315巻，592頁（1985年）〕。該動物細胞として
は、例えばサル細胞ＣＯＳ−７，Ｖero，チャイニーズ
ハムスター細胞ＣＨＯ，ＤＨＦＲ遺伝子欠損チャイニー
ズハムスター細胞ＣＨＯ（ｄｈｆｒ^-ＣＨＯ細胞），マ
ウスＬ細胞，マウスミエローマ細胞，ヒトＦＬ細胞など
が挙げられる。エシェリヒア属菌を形質転換するには、
例えばプロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエ
ー，第69巻，2110頁（1972年）や ジーン，第17巻，107
頁（1982年）などに記載の方法に従って行なえばよい。
バチルス属菌を形質転換するには、例えばモレキュラー
・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Molecular
＆ General Genetics），第168巻，111頁（1979年）な
どに記載の方法に従って行えばよい。酵母を形質転換す
るには、例えばプロシージングズ・オブ・ザ・ナショナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユ
ーエスエー，第75巻，1929頁（1978年）などに記載の方
法に従って行なえばよい。昆虫細胞を形質転換するに
は、例えばバイオ／テクノロジー（Bio/Technology），
第6巻, 47頁（1988年）などに記載の方法に従って行な
えばよい。動物細胞を形質転換するには、例えばヴィロ
ロジー（Virology），第52巻，456頁（1973年）に記載
の方法に従って行なわれる。このようにして、ポリペプ
チドをコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質
転換された形質転換体を得ることができる。

【００２６】宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌で
ある形質転換体を培養する際の培地としては液体培地が
好ましく、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素
源、窒素源、無機物その他を含有するよう調製される。
該炭素源としては、例えばグルコース、デキストリン、
可溶性澱粉、ショ糖などが、該窒素源としては、例えば
アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカ
ー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイシ
ョ抽出液などの無機または有機物質が、該無機物として
は、例えば塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、
塩化マグネシウムなどが挙げられる。また、該培地中に
は、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを必要
に応じて添加してもよい。該培地のｐＨは形質転換体が
生育するｐＨであればいずれでもよいが、ｐＨは通常約
５〜８が好ましい。

【００２７】エシェリヒア属菌を培養する際の培地とし
ては、例えばグルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地
〔ミラー（Miller），ジャーナル・オブ・エクスペリメ
ンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Journa
l of Experiments in Molecular Genetics），431頁，C
old Spring Harbor Laboratory, New York 1972年〕が
好ましい。必要によりプロモーターを効率よく働かせる
ために、例えば３β−インドリルアクリル酸のような薬
剤を培地に加えて培養してもよい。宿主がエシェリヒア
属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時
間行い、必要により、通気や撹拌を加えることもでき
る。宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４
０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を
加えることもできる。宿主が酵母である形質転換体を培
養する際、培地としては、例えばバークホールダー（Bu
rkholder）最小培地〔Bostian, K. L. ら、プロシージ
ングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サ
イエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl.
Acad. Sci. ＵＳＡ），第77巻，4505頁（1980年）〕や
０.５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Bitter, G. A.
ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエ
ー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），第81巻，5330
頁（1984年）〕が挙げられる。培地のｐＨは約５〜８に
調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５℃で
約２４〜７２時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加え
ることもできる。

【００２８】宿主が昆虫である形質転換体を培養する
際、培地としては、Grace's Insect Medium（Grace, T.
C.C.,ネイチャー（Nature）,第195巻，788頁（1962
頁））に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加
えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６.２〜６.
４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３
〜５日間行い、必要に応じて通気や撹拌を加えることも
できる。宿主が動物細胞である形質転換体を培養する
際、培地としては、例えば約５〜２０％の胎児牛血清を
含むＭＥＭ培地〔サイエンス（Seience），第122巻，50
1頁（1952年）〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジー（Virol
ogy），第８巻，396頁（1959年）〕，ＲＰＭＩ １６４
０培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカ
ル・アソシエーション（The Jounal of the American M
edical Association），第199巻，519頁（1967年）〕，
１９９培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ
・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン（Proceedi
ng of the Society for the Biological Medicine），
第73巻，１頁（1950年）〕などが挙げられる。ｐＨは約
６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０℃〜４０
℃で約１５〜６０時間行い、必要に応じて通気や撹拌を
加えることもできる。

【００２９】上記培養物（培養液および培養菌体あるい
は培養細胞）からポリペプチドを分離精製するには、例
えば下記の方法に従って行なえばよい。該ポリペプチド
が、培養菌体中あるいは培養細胞中に蓄積される場合
は、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、こ
れを適当な緩衝液に懸濁後、公知の超音波処理、リゾチ
ーム処理および／または凍結融解処理などによって菌体
あるいは細胞を破壊した後、公知の遠心分離やろ過など
の操作により、目的のポリペプチドまたはその部分ペプ
チドは、抽出液として得ることができる。該緩衝液の中
には、尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤や、ト
リトンＸ−１００（和光純薬（株）など、登録商標：
以下、ＴＭと省略することがある）などの界面活性剤を
必要に応じて添加して用いてもよい。一方、培養液中に
ポリペプチドが分泌される場合には、培養後、まず培養
菌体あるいは培養細胞と培養上清とを公知の方法により
分離し、培養上清として得ることができる。得られる培
養上清または抽出液中に含まれる、ポリペプチドの精製
は、自体公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行な
うことができる。これらの公知の分離、精製法として
は、（１）塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方
法、（２）透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法およびＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として
分子量の差を利用する方法、（３）イオン交換クロマト
グラフィーなどの荷電の差を利用する方法、（４）アフ
ィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利
用する方法、（５）逆相高速液体クロマトグラフィーな
どの疎水性の差を利用する方法、（６）等電点電気泳動
法やクロマトフォーカシングなどの等電点の差を利用す
る方法などが挙げられる。

【００３０】該ポリペプチドが遊離体で得られる場合に
は、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって
塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には自
体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体
または他の塩に変換することができる。なお、該ポリペ
プチドの精製前または精製後、これに公知の方法に従い
適当な蛋白質修飾酵素を作用させることにより、該ポリ
ペプチドに任意の修飾を加えたり、該ポリペプチド中の
配列を部分的に除去することもできる。該蛋白質修飾酵
素としては、例えばトリプシン、キモトリプシン、アル
ギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリ
コシダーゼなどが挙げられる。。このようにして得られ
る変異ポリペプチドの活性は、レセプターとの結合実験
や特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイ法などに
より測定することができる。

【００３１】さらにまた、本発明におけるリガンドポリ
ペプチドは、プロラクチン分泌の調節作用、つまり、プ
ロラクチン分泌の促進および抑制作用を有する。即ち、
本発明におけるリガンドポリペプチドは、後述の実施例
から明らかなように、まずプロラクチン分泌の促進作用
を有するため、プロラクチン分泌不全に関係する各種疾
患の予防および治療薬に用いることができる。一方、本
発明におけるリガンドポリペプチドは、そのレセプター
蛋白質との親和性が強いため、投与量が増えるとプロラ
クチン分泌に対し脱感作（desensitization）が起こる
結果、プロラクチン分泌を抑制する作用も有する。この
場合、プロラクチン過剰分泌に関係する各種疾患の予防
および治療薬に用いることができる。従って、本発明に
おけるリガンドポリペプチドは、プロラクチン分泌促進
剤として、卵巣機能低下症、精嚢発育不全、更年期障
害、甲状腺機能低下などのプロラクチン分泌に関係する
各種疾患の予防および治療薬として有用である。さら
に、本発明におけるリガンドポリペプチドは、プロラク
チン分泌促進作用に基づき、性欲促進作用（フェロモン
的作用）を有するため、性欲促進剤としても有用であ
る。また、本発明におけるリガンドポリペプチドは、プ
ロラクチン分泌抑制剤として、下垂体腺腫瘍、間脳腫
瘍、月経異常、自己免疫疾患、プロラクチノーマ、不妊
症、インポテンス、無月経症、乳汁漏症、末端肥大症、
キアリ・フロンメル（Chiari-Frommel）症候群、アルゴ
ンツ・デル・カスティロ（Argonz-del Castilo）症候
群、フォーベス・アルブライト（Forbes-Albright）症
候群、リンパ腫またはシーハン症候群または精子形成異
常などのプロラクチン分泌に関係する各種疾患の予防お
よび治療薬として有用である。また、本発明におけるリ
ガンドポリペプチドは、プロラクチン分泌抑制作用に基
づいて、避妊薬としても有用である。その他、本発明に
おけるリガンドポリペプチドは、プロラクチン分泌機能
を調べるための検査薬としても、また、牛、ヤギ、ブタ
などの畜産哺乳動物の乳汁の分泌促進剤などの動物薬と
しても有用であり、さらには該畜産哺乳動物体内で有用
物質を生産させ、これをその乳汁中への分泌することに
よる有用物質生産などへの応用も期待される。さらにま
た、本発明におけるリガンドポリペプチドは、胎盤機能
調節作用を有するため、絨毛癌、胞状奇胎、侵入奇胎、
流産、胎児の発育不全、糖代謝異常、脂質代謝異常また
は分娩誘発の予防または治療薬としても有用である。

【００３２】本発明におけるポリペプチドを前述の医薬
または動物薬として使用する場合は、常套手段に従って
実施すればよい。例えば、必要に応じて糖衣を施した錠
剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤な
どとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学
的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤など
の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、該ポリ
ペプチドまたはその塩を生理学的に認められる担体、香
味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤など
とともに一般に認められた製薬実施に要求される単位用
量形態で混和することによって製造することができる。
これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当
な容量が得られるようにするものである。

【００３３】錠剤、カプセル剤などに混和することがで
きる添加剤としては、例えばゼラチン、コーンスター
チ、トラガントガム、アラビアゴムのような結合剤、結
晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラ
チン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マ
グネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカ
リンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油または
チェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形
態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさら
に油脂のような液状担体を含有することができる。注射
のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活
性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油な
どを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施にした
がって処方することができる。注射用の水性液として
は、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を
含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニト
ール、塩化ナトリウムなど）などが挙げられ、適当な溶
解補助剤、例えばアルコール（例えば、エタノール）、
ポリアルコール（例えばプロピレングリコール、ポリエ
チレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例えばポ
リソルベート８０（^TM）、ＨＣＯ−５０）などと併用し
てもよい。油性液としてはゴマ油、大豆油などがあげら
れ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアル
コールなどと併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、
リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤
（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインな
ど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチ
レングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアル
コール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合して
もよい。調整された注射液は通常、適当なアンプルに無
菌的に充填される。このようにして得られる製剤は安全
で低毒性であるので、例えばヒトや哺乳動物（例えば、
マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、
ウシ、ネコ、イヌ、サル、マントヒヒ、チンパンジーな
ど）に対して投与することができる。本発明におけるポ
リペプチドの投与量は、症状などにより差異はあるが、
経口投与する場合、一般的に成人の甲状腺機能低下症患
者（体重６０ｋｇに対し）においては、一日につき通常
約０.１から１００ｍｇ、好ましくは約１.０から５０ｍ
ｇ、より好ましくは約１.０から２０ｍｇである。非経
口的に投与する場合は、その１回の投与量は投与対象、
症状、投与方法などによっても異なるが、例えば注射剤
の形では成人の甲状腺機能低下症患者（体重６０ｋｇに
対し）においては、一日につき通常約０.０１から３０
ｍｇ程度、好ましくは約０.１から２０ｍｇ程度、より
好ましくは約０.１から１０ｍｇ程度を静脈注射により
投与すればよい。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当た
りに換算した量を投与することができる。

【００３４】Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質は、例え
ば、以下に示す方法によって調製することができる。Ｇ
蛋白質共役型レセプター蛋白質としては、ヒトや温血動
物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ブタ、ヒツ
ジ、ウシ、サルなど）のあらゆる組織（例えば、下垂
体、膵臓、脳、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、
骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管、血管、心臓な
ど）または細胞などに由来するＧ蛋白質共役型レセプタ
ー蛋白質であって、配列番号：１９、２０、２１、２２
または２３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくはこ
れらのアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含
有するものであれば如何なるものであってもよい。即
ち、本発明におけるＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質と
しては、配列番号：１９、２０、２１、２２または２３
で表わされるアミノ酸配列を含有する蛋白質などの他
に、配列番号：１９、２０、２１、２２または２３で表
わされるアミノ酸配列と約９０〜９９．９％の相同性を
有するアミノ酸配列を含有し、配列番号：１９、２０、
２１、２２または２３で表わされるアミノ酸配列を含有
する蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが
挙げられる。これらの蛋白質が示す活性としては、例え
ばリガンド結合活性、シグナル伝達などが挙げられる。
実質的に同質とは、リガンド結合活性などが性質的に同
質であることを示す。したがって、リガンド結合活性の
強さなどの強弱、レセプター蛋白質の分子量などの量的
要素は異なっていてもよい。

【００３５】Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質として、
さらに具体的には、配列番号：１９または（および）配
列番号：２０で表わされるアミノ酸配列を含有するヒト
下垂体由来のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、配列番
号：２２で表わされるアミノ酸配列を含有するマウス膵
臓由来のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、配列番号：
２３で表わされるアミノ酸配列を含有するマウス膵臓由
来のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質などが挙げられ
る。そして、配列番号：１９および配列番号：２０で表
わされるアミノ酸配列を含有するヒト下垂体由来のＧ蛋
白質共役型レセプター蛋白質としては、具体的には配列
番号：２１で表わされるアミノ酸配列を含有するヒト下
垂体由来のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質などが挙げ
られる。また、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質として
は、配列番号：１９、２０、２１、２２または２３で表
わされるアミノ酸配列中の１以上３０個以下、より好ま
しくは１個以上１０個以下のアミノ酸が欠失したアミノ
酸配列、配列番号：１９、２０、２１、２２または２３
で表わされるアミノ酸配列に１個以上３０個以下、より
好ましくは１個以上１０個以下のアミノ酸が付加したア
ミノ酸配列、配列番号：１９、２０、２１、２２または
２３で表わされるアミノ酸配列中の１個以上３０個以
下、より好ましくは１個以上１０個以下のアミノ酸が他
のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を含有する蛋白質
なども挙げられる。

【００３６】ここで、配列番号：２１で表されるアミノ
酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含
有する蛋白質は、ヒト下垂体由来Ｇ蛋白質共役型レセプ
ター蛋白質の全アミノ酸配列を含有するものである。配
列番号：１９または（および）配列番号：２０で表され
るアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸
配列を含有する蛋白質は、該配列番号：２１で表される
アミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配
列を含有する蛋白質の断片あるいは部分ペプチドであ
る。さらに、配列番号：２２または配列番号：２３で表
されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ
ノ酸配列を含有する蛋白質は、マウス膵臓由来のＧ蛋白
質共役型レセプター蛋白質であるが、配列番号：１９ま
たは（および）配列番号：２０で表されるアミノ酸配列
に非常に高い類似性を示す（実施例８、特に〔図１
５〕）ことから、配列番号：２２または２３で表される
アミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配
列を含有する蛋白質も同様に、配列番号：２１で表され
るアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸
配列を含有する蛋白質の断片あるいは部分ペプチドの中
に含まれる。即ち、上述の配列番号：２１で表されるア
ミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列
を含有する蛋白質もしくは後述する該蛋白質の部分ペプ
チドまたはその塩は、配列番号：１９、２０、２２また
は２３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に
同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩をも
含むものである。さらに、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋
白質には、Ｎ末端のMetが保護基（例えば、ホルミル
基、アセチル基などのＣ_1-6アシル基など）で保護され
ているもの、ＧｌｕのＮ端側が生体内で切断され、該Ｇ
ｌｎがピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸
の側鎖が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル
基などのＣ_1-6アシル基など）で保護されているもの、
あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質などの複合蛋
白質なども含まれる。

【００３７】Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の塩とし
ては、上記したリガンドポリペプチドと同様のものが挙
げられる。Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその
塩または該部分ペプチドは、ヒトや温血動物の組織また
は細胞から自体公知の蛋白質の精製方法によって製造す
ることもできるし、前述のポリペプチドをコードするＤ
ＮＡを含有する形質転換体を培養する方法と同じ方法に
よっても製造することができる。また、前述のペプチド
合成法に準じて製造することもできる。該製造法につい
ては、WO96/05302の実施例３，４，６および１７に詳細
に記載されている。Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の
部分ペプチドとしては、例えば、Ｇ蛋白質共役型レセプ
ター蛋白質分子のうち、細胞膜の外に露出している部位
などが用いられる。具体的には、〔図３〕、〔図４〕、
〔図９〕、〔図１３〕または〔図１６〕で示される本発
明におけるＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質の疎水性プ
ロット解析において細胞外領域（親水性（Hydrophili
c）部位）であると分析された部分を含むペプチドであ
る。また、疎水性（Hydrophobic）部位を一部に含むペ
プチドも同様に用いることができる。個々のドメインを
個別に含むペプチドも用い得るが、複数のドメインを同
時に含む部分のペプチドでも良い。Ｇ蛋白質共役型レセ
プター蛋白質の部分ペプチドの塩としては、上記したリ
ガンドポリペプチドの塩と同様のものが用いられる。

【００３８】Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコード
するＤＮＡとしては、配列番号：１９、２０、２１、２
２または２３のアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同
一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター
蛋白質をコードする塩基配列を含有するものであればい
かなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノ
ムＤＮＡライブラリー、組織・細胞由来のｃＤＮＡ、組
織・細胞由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのい
ずれでもよい。ライブラリーに使用するベクターはバク
テリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミド
などいずれであってもよい。また、組織・細胞よりＲＮ
Ａ画分を調製したものを用いて直接ＲＴ-ＰＣＲ法によ
って増幅することもできる。具体的には、配列番号：１
９のアミノ酸配列を含有するヒト下垂体由来のＧ蛋白質
共役型レセプター蛋白質をコードするＤＮＡとしては、
配列番号：２４で表わされる塩基配列を有するＤＮＡな
どが用いられる。配列番号：２０のアミノ酸配列を含有
するヒト下垂体由来のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質
をコードするＤＮＡとしては、配列番号：２５で表わさ
れる塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。配列番
号：２１のアミノ酸配列を含有するヒト下垂体由来のＧ
蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするＤＮＡとし
ては、配列番号：２６で表わされる塩基配列を有するＤ
ＮＡなどが用いられる。配列番号：２２のアミノ酸配列
を含有するマウス膵臓由来のＧ蛋白質共役型レセプター
蛋白質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：２７で
表わされる塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：２３のアミノ酸配列を含有するマウス膵臓由
来のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするＤＮ
Ａとしては、配列番号：２８で表わされる塩基配列を有
するＤＮＡなどが用いられる。

【００３９】Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を完全に
コードするＤＮＡのクローニングの方法、用い得るベク
ター、プロモーター、宿主、形質転換方法、培養方法、
分離精製の方法については上記したリガンドポリペプチ
ドの場合と同様である。例えば、後述する実施例５で得
られるプラスミドｐｈＧＲ３を制限酵素SalIで消化し、
ｈＧＲ３をコードするｃＤＮＡの完全長の翻訳枠部分を
取り出す。これを同じくSalI消化後に自己閉環を防止す
るためにＢＡＰ(Bacterial Alkaline Phosphatase)処理
を施した動物細胞用発現ベクターpAKKO-111等とライゲ
ーション反応を行う。ライゲーション反応完了後は反応
液の一部を用いて大腸菌ＤＨ５等を形質転換する。得ら
れた形質転換体のうち、ｈＧＲ３をコードするｃＤＮＡ
が発現ベクターにあらかじめ組み込んであるＳＲαなど
のプロモーターに対して順方向に挿入されているものを
制限酵素切断によるマッピングあるいは塩基配列の決定
によって選別しそのプラスミドＤＮＡを大量に調製す
る。 作成した発現ベクターのＤＮＡを用い、リン酸カ
ルシウム法あるいはリポソーム法などにもとづく動物細
胞への遺伝子導入用のキットを用いてＣＨＯ dhfr^-細胞
に導入してＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質（ｈＧＲ
３）高発現ＣＨＯ細胞株を得る。 得られたＣＨＯ細胞
を核酸不含の選択培地でCO₂インキュベーターで３７
℃、５％CO₂の条件下で１〜４日培養することによりＧ
蛋白質共役型レセプター蛋白質（ｈＧＲ３）を産生させ
る。 該ＣＨＯ細胞からＧ蛋白質共役型レセプター蛋白
質あるいはその部分ペプチドに対する抗体を担体に架橋
させて作製されたアフィニティーカラムあるいはＧ蛋白
質共役型レセプター蛋白質に対するリガンドを担体に架
橋させたアフィニティーカラムを用いてＧ蛋白質共役型
レセプター蛋白質を分離精製する。 このようにして得
られるＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質の活性は標識し
たリガンドとの結合実験および特異抗体を用いたエンザ
イムイムノアッセイなどにより測定することができる。

【００４０】Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対する
リガンドの決定方法について、以下にさらに具体的に説
明する。上記したＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もし
くはその塩または該部分ペプチドもしくはその塩は、Ｇ
蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するリガンドを探索
しまたは決定するための試薬として有用である。即ち、
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチ
ドと、試験化合物とを接触させることを特徴とするＧ蛋
白質共役型レセプター蛋白質に対するリガンドの決定方
法を提供する。試験化合物としては、公知の他のレセプ
ター蛋白質に対するリガンド（例えば、アンギオテンシ
ン、ボンベシン、カナビノイド、コレシストキニン、グ
ルタミン、セロトニン、メラトニン、ニューロペプチド
Ｙ、オピオイド、プリン、バソプレッシン、オキシトシ
ン、ＶＩＰ（バソアクティブ インテスティナル アン
ド リレイテッド ペプチド）、ソマトスタチン、ドー
パミン、モチリン、アミリン、ブラジキニン、ＣＧＲＰ
（カルシトニンジーンリレーティッドペプチド）、ロイ
コトリエン、パンクレアスタチン、プロスタグランジ
ン、トロンボキサン、アデノシン、アドレナリン、αお
よびβ−chemokine（ＩＬ−８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、
ＧＲＯγ、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、ＰＦ４、ＩＰ１
０、ＧＣＰ−２、ＭＣＰ−１、ＨＣ１４、ＭＣＰ−３、
Ｉ−３０９、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥ
Ｓなど）、エンドセリン、エンテロガストリン、ヒスタ
ミン、ニューロテンシン、ＴＲＨ、パンクレアティック
ポリペプタイド、ガラニンなど）の他に、例えばヒトや
温血動物（例えば、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ヒツ
ジ、サルなど）の組織抽出物、細胞培養上清などが用い
られる。例えば、該組織抽出物、細胞培養上清などをＧ
蛋白質共役型レセプター蛋白質に添加し、細胞刺激活性
などを測定しながら分画し、最終的に単一のリガンドを
得ることができる。

【００４１】具体的には、上記したＧ蛋白質共役型レセ
プター蛋白質もしくはその塩、または該部分ペプチドも
しくはその塩を用いるか、または組換え型レセプター蛋
白質の発現系を構築し、該発現系を用いたレセプター結
合アッセイ系を用いることによって、Ｇ蛋白質共役型レ
セプター蛋白質に結合して細胞刺激活性（例えば、アラ
キドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊
離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシ
トールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリ
ン酸化、ｃ−ｆｏｓ活性化、細胞外ｐＨの低下などを促
進する活性または抑制する活性）を有する化合物（例え
ば、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合
物、発酵生産物など）またはその塩を決定する方法を提
供する。細胞刺激活性の測定としては上記した中でも特
にアラキドン酸遊離を促進する活性または抑制する活性
を測定するのが好ましい。

【００４２】Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質に結合す
るリガンドを決定する具体的な方法としては、 標識した試験化合物を、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋
白質もしくはその塩に接触させた場合における、標識し
た試験化合物の該蛋白質もしくはその塩に対する結合量
を測定することを特徴とするＧ蛋白質共役型レセプター
蛋白質に対するリガンドの決定方法、 標識した試験化合物を、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋
白質を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた
場合における、標識した試験化合物の該細胞または該膜
画分に対する結合量を測定することを特徴とするＧ蛋白
質共役型レセプター蛋白質に対するリガンドの決定方
法、 標識した試験化合物を、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋
白質をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養す
ることによって細胞膜上に発現したＧ蛋白質共役型レセ
プター蛋白質に接触させた場合における、標識した試験
化合物の該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対する結
合量を測定しすることを特徴とするＧ蛋白質共役型レセ
プター蛋白質に対するリガンドの決定方法、 試験化合物を、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を含
有する細胞に接触させた場合における、Ｇ蛋白質共役型
レセプター蛋白質を介した細胞刺激活性（例えば、アラ
キドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊
離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシ
トールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリ
ン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、細胞外ｐＨの低下などを
促進する活性または抑制する活性など）を測定すること
を特徴とするＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対する
リガンドの決定方法、および 試験化合物を、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコ
ードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することに
よって細胞膜上に発現したＧ蛋白質共役型レセプター蛋
白質に接触させた場合における、Ｇ蛋白質共役型レセプ
ター蛋白質を介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン
酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊離、細胞
内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリ
ン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、
ｃ−ｆｏｓの活性化、細胞外ｐＨの低下などを促進する
活性または抑制する活性など）を測定することを特徴と
する方法を挙げることができる。

【００４３】該リガンドの決定方法を以下に具体的に説
明する。まず、リガンド決定方法に用いるＧ蛋白質共役
型レセプター蛋白質としては、上記したＧ蛋白質共役型
レセプター蛋白質または該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋
白質の部分ペプチドを含有するものであれば何れのもの
であってもよいが、動物細胞を用いて大量発現させたＧ
蛋白質共役型レセプター蛋白質が適している。Ｇ蛋白質
共役型レセプター蛋白質を製造するには、前述の方法が
用いられるが、該蛋白質をコードするＤＮＡを哺乳動物
細胞や昆虫細胞で発現することにより行うことができ
る。目的部分をコードするＤＮＡ断片には相補ＤＮＡが
用いられるが、必ずしもこれに制約されるものではな
い。例えば、遺伝子断片や合成ＤＮＡを用いてもよい。
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするＤＮＡ断
片を宿主動物細胞に導入し、それらを効率よく発現させ
るためには、該ＤＮＡ断片を昆虫を宿主とするバキュロ
ウイルスに属する核多角体病ウイルス（nuclear polyhe
drosis virus；ＮＰＶ）のポリヘドリンプロモーター、
ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモ
ーター、メタロチオネインプロモーター、ヒトヒートシ
ョックプロモーター、サイトメガロウイルスプロモータ
ー、ＳＲαプロモーターなどの下流に組み込むのが好ま
しい。発現したレセプターの量と質の検査はそれ自体公
知の方法で行うことができる。例えば、文献〔Nambi，
P．ら、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミ
ストリー（J. Biol. Chem.）,267巻,19555〜19559頁,19
92年〕に記載の方法に従って行うことができる。

【００４４】したがって、リガンド決定方法において、
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはＧ蛋白質共役型
レセプター蛋白質の部分ペプチドを含有するものとして
は、それ自体公知の方法に従って精製したＧ蛋白質共役
型レセプター蛋白質または該Ｇ蛋白質共役型レセプター
蛋白質の部分ペプチドであってもよいし、該蛋白質を含
有する細胞を用いてもよく、また該蛋白質を含有する細
胞の膜画分を用いてもよい。リガンド決定方法におい
て、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有する細胞を
用いる場合、該細胞をグルタルアルデヒド、ホルマリン
などで固定化してもよい。固定化方法はそれ自体公知の
方法に従って行うことができる。Ｇ蛋白質共役型レセプ
ター蛋白質を含有する細胞としては、Ｇ蛋白質共役型レ
セプター蛋白質を発現した宿主細胞をいうが、該宿主細
胞としては、大腸菌、枯草菌、酵母、昆虫細胞、動物細
胞などが挙げられる。膜画分としては、細胞を破砕した
後、それ自体公知の方法で得られる細胞膜が多く含まれ
る画分のことをいう。細胞の破砕方法としては、Potter
−Elvehjem型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワ
ーリングブレンダーやポリトロン（Kinematica社製）に
よる破砕、超音波による破砕、フレンチプレスなどで加
圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる
破砕などが挙げられる。細胞膜の分画には、分画遠心分
離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が
主として用いられる。例えば、細胞破砕液を低速（５０
０ｒｐｍ〜３０００ｒｐｍ）で短時間（通常、約１分〜
１０分）遠心し、上清をさらに高速（１５０００ｒｐｍ
〜３００００ｒｐｍ）で通常３０分〜２時間遠心し、得
られる沈澱を膜画分とする。該膜画分中には、発現した
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質と細胞由来のリン脂質
や膜蛋白質などの膜成分が多く含まれる。

【００４５】該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有
する細胞や膜画分中のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質
の量は、１細胞当たり１０³〜１０⁸分子であるのが好ま
しく、１０⁵〜１０⁷分子であるのが好適である。なお、
発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合活性（比
活性）が高くなり、高感度なスクリーニング系の構築が
可能になるばかりでなく、同一ロットで大量の試料を測
定できるようになる。Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質
に結合するリガンドを決定する前記の〜の方法を実
施するためには、適当なＧ蛋白質共役型レセプター画分
と、標識した試験化合物が用いられる。Ｇ蛋白質共役型
レセプター画分としては、天然型のＧ蛋白質共役型レセ
プター画分か、またはそれと同等の活性を有する組換え
型Ｇ蛋白質共役型レセプター画分などが望ましい。ここ
で、同等の活性とは、同等のリガンド結合活性などを示
す。標識した試験化合物としては、〔³Ｈ〕、
〔¹²⁵Ｉ〕、〔¹⁴Ｃ〕、〔³⁵Ｓ〕などで標識した上記の
試験化合物などが好適である。

【００４６】具体的には、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋
白質に結合するリガンドの決定方法を行うには、まずＧ
蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有する細胞または細
胞の膜画分を、決定方法に適したバッファーに懸濁する
ことによりレセプター標品を調製する。バッファーに
は、ｐＨ４〜１０（望ましくはｐＨ６〜８）のリン酸バ
ッファー、トリス−塩酸バッファーなどのリガンドとレ
セプターとの結合を阻害しないバッファーであればいず
れでもよい。また、非特異的結合を低減させる目的で、
ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ−８０^TM（花王−アトラス
社）、ジギトニン、デオキシコレートなどの界面活性剤
やウシ血清アルブミンやゼラチンなどの各種蛋白質をバ
ッファーに加えることもできる。さらに、プロテアーゼ
によるレセプターやリガンドの分解を抑える目的でＰＭ
ＳＦ、ロイペプチン、Ｅ−６４（ペプチド研究所製）、
ペプスタチンなどのプロテアーゼ阻害剤を添加すること
もできる。０.０１ｍｌ〜１０ｍlの該レセプター溶液
に、一定量（５０００ｃｐｍ〜５０００００ｃｐｍ）の
〔³Ｈ〕、〔¹²⁵Ｉ〕、〔¹⁴Ｃ〕、〔³⁵Ｓ〕などで標識し
た試験化合物を共存させる。非特異的結合量（ＮＳＢ）
を知るために大過剰の未標識の試験化合物を加えた反応
チューブも用意する。反応は０℃から５０℃、望ましく
は４℃から３７℃で２０分から２４時間、望ましくは３
０分から３時間行う。反応後、ガラス繊維濾紙等で濾過
し、適量の同バッファーで洗浄した後、ガラス繊維濾紙
に残存する放射活性を液体シンチレーションカウンター
あるいはγ−カウンターで計測する。全結合量（Ｂ）か
ら非特異的結合量（ＮＳＢ）を引いたカウント（Ｂ−Ｎ
ＳＢ）が０ｃｐｍを越える試験化合物を本発明における
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するリガンドとし
て選択することができる。

【００４７】Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質に結合す
るリガンドを決定する前記の〜の方法を実施するた
めには、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を介する細胞
刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン
遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内
ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変
動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、細
胞外ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性
など）を公知の方法または市販の測定用キットを用いて
測定することができる。具体的には、まず、Ｇ蛋白質共
役型レセプター蛋白質を含有する細胞をマルチウェルプ
レート等に培養する。リガンド決定を行なうにあたって
は前もって新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適
当なバッファーに交換し、試験化合物などを添加して一
定時間インキュベートした後、細胞を抽出あるいは上清
液を回収して、生成した産物をそれぞれの方法に従って
定量する。細胞刺激活性の指標とする物質（例えば、ア
ラキドン酸など）の生成が、細胞が含有する分解酵素に
よって検定困難な場合は、該分解酵素に対する阻害剤を
添加してアッセイを行なってもよい。また、ｃＡＭＰ産
生抑制などの活性については、フォルスコリンなどで細
胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産生
抑制作用として検出することができる。

【００４８】Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質に結合す
るリガンド決定用キットは、Ｇ蛋白質共役型レセプター
蛋白質またはその塩、その部分ペプチドまたはその塩、
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有する細胞、ある
いはＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有する細胞の
膜画分を含有するものである。リガンド決定用キットの
例としては、次のものが挙げられる。 １．リガンド決定用試薬 測定用緩衝液および洗浄用緩衝液 Hanks' Balanced Salt Solution（ギブコ社製）に、０.
０５％のウシ血清アルブミン（シグマ社製）を加えたも
の。孔径０.４５μｍのフィルターで濾過滅菌し、４℃
で保存するか、あるいは用時調製しても良い。 Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質標品 Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を発現させたＣＨＯ細
胞を、１２穴プレートに５×１０⁵個／穴で継代し、３
７℃、５％ＣＯ₂、９５％ａｉｒで２日間培養したも
の。 標識試験化合物 市販の〔³Ｈ〕、〔¹²⁵Ｉ〕、〔¹⁴Ｃ〕、〔³⁵Ｓ〕などで
標識した化合物、または適当な方法で標識化したもの。
適当な溶媒または緩衝液に溶解したものを４℃あるいは
−２０℃にて保存し、用時に測定用緩衝液にて１μＭに
希釈する。水に難溶性を示す試験化合物については、ジ
メチルホルムアミド、ＤＭＳＯ、メタノール等に溶解す
る。 非標識試験化合物 標識化合物を同じものを１００〜１０００倍濃い濃度に
調製する。

【００４９】２．測定法 １２穴組織培養用プレートにて培養したＧ蛋白質共役
型レセプター蛋白質を発現させた細胞を、測定用緩衝液
１ｍｌで２回洗浄した後、４９０μｌの測定用緩衝液を
各穴に加える。 標識試験化合物を５μｌ加え、室温にて１時間反応さ
せる。非特異的結合量を知るためには非標識試験化合物
を５μｌ加えておく。 反応液を除去し、１ｍｌの洗浄用緩衝液で３回洗浄す
る。細胞に結合した標識試験化合物を０.２Ｎ ＮａＯ
Ｈ−１％ＳＤＳで溶解し、４ｍｌの液体シンチレーター
Ａ（和光純薬製）と混合する。 液体シンチレーションカウンター（ベックマン社製）
を用いて放射活性を測定する。

【００５０】本願明細書の配列表の配列番号は、以下の
配列を示す。 〔配列番号：１〕ｐＢＯＶ３に含まれるウシ視床下部由
来リガンドポリペプチドの全長アミノ酸配列を示す。 〔配列番号：２〕ウシ視床下部由来リガンドポリペプチ
ドｃＤＮＡの全塩基配列を示す。 〔配列番号：３〕ウシ視床下部由来リガンドポリペプチ
ドを精製し、P-3画分のＮ末端配列分析をした結果得ら
れたアミノ酸配列を示す。配列番号：１の第２３〜５１
番目のアミノ酸配列に対応している。 〔配列番号：４〕ウシ視床下部由来リガンドポリペプチ
ドを精製、P-2画分のＮ末端配列分析をした結果得られ
たアミノ酸配列を示す。配列番号：１の第３４〜５２番
目のアミノ酸配列に対応している。 〔配列番号：５〕ウシ視床下部由来リガンドポリペプチ
ドのアミノ酸配列を示す。配列番号：１の第２３〜５３
番目のアミノ酸配列に対応している。 〔配列番号：６〕ウシ視床下部由来リガンドポリペプチ
ドのアミノ酸配列を示す。配列番号：１の第２３〜５４
番目のアミノ酸配列に対応している。 〔配列番号：７〕ウシ視床下部由来リガンドポリペプチ
ドのアミノ酸配列を示す。配列番号：１の第２３〜５５
番目のアミノ酸配列に対応している。 〔配列番号：８〕ウシ視床下部由来リガンドポリペプチ
ドのアミノ酸配列を示す。配列番号：１の第３４〜５３
番目のアミノ酸配列に対応している。 〔配列番号：９〕ウシ視床下部由来リガンドポリペプチ
ドのアミノ酸配列を示す。配列番号：１の第３４〜５４
番目のアミノ酸配列に対応している。 〔配列番号：１０〕ウシ視床下部由来リガンドポリペプ
チドのアミノ酸配列を示す。配列番号：１の第３４〜５
５番目のアミノ酸配列に対応している。

【００５１】〔配列番号：１１〕ウシ視床下部由来リガ
ンドポリペプチド（配列番号：３）をコードするＤＮＡ
の塩基配列を示す。 〔配列番号：１２〕ウシ視床下部由来リガンドポリペプ
チド（配列番号：４）をコードするＤＮＡの塩基配列を
示す。 〔配列番号：１３〕ウシ視床下部由来リガンドポリペプ
チド（配列番号：５）をコードするＤＮＡの塩基配列を
示す。 〔配列番号：１４〕ウシ視床下部由来リガンドポリペプ
チド（配列番号：６）をコードするＤＮＡの塩基配列を
示す。 〔配列番号：１５〕ウシ視床下部由来リガンドポリペプ
チド（配列番号：７）をコードするＤＮＡの塩基配列を
示す。 〔配列番号：１６〕ウシ視床下部由来リガンドポリペプ
チド（配列番号：８）をコードするＤＮＡの塩基配列を
示す。 〔配列番号：１７〕ウシ視床下部由来リガンドポリペプ
チド（配列番号：９）をコードするＤＮＡの塩基配列を
示す。 〔配列番号：１８〕ウシ視床下部由来リガンドポリペプ
チド（配列番号：１０）をコードするＤＮＡの塩基配列
を示す。 〔配列番号：１９〕ｐ１９Ｐ２に含まれるヒト下垂体由
来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質ｃＤＮＡ断片にコー
ドされるヒト下垂体由来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白
質の部分アミノ酸配列を示す。 〔配列番号：２０〕ｐ１９Ｐ２に含まれるヒト下垂体由
来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質ｃＤＮＡ断片にコー
ドされるヒト下垂体由来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白
質の部分アミノ酸配列を示す。

【００５２】〔配列番号：２１〕ｐｈＧＲ３に含まれる
ヒト下垂体由来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質ｃＤＮ
Ａにコードされるヒト下垂体由来Ｇ蛋白質共役型レセプ
ター蛋白質の全アミノ酸配列を示す。 〔配列番号：２２〕ｐＧ３−２およびｐＧ１−１０にそ
れぞれ含まれるマウス膵臓β細胞株ＭＩＮ６由来Ｇ蛋白
質共役型レセプター蛋白質ｃＤＮＡ断片の塩基配列から
導きだした塩基配列（配列番号：２７）を有するマウス
膵臓β細胞株ＭＩＮ６由来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋
白質ｃＤＮＡ断片にコードされるマウス膵臓β細胞株Ｍ
ＩＮ６由来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の部分アミ
ノ酸配列を示す。 〔配列番号：２３〕ｐ５Ｓ３８にコードされるマウス膵
臓β細胞株ＭＩＮ６由来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白
質の部分アミノ酸配列を示す。 〔配列番号：２４〕ｐ１９Ｐ２に含まれるヒト下垂体由
来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質ｃＤＮＡ断片の塩基
配列を示す。 〔配列番号：２５〕ｐ１９Ｐ２に含まれるヒト下垂体由
来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質ｃＤＮＡ断片の塩基
配列を示す。 〔配列番号：２６〕ｐｈＧＲ３に含まれるヒト下垂体由
来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質ｃＤＮＡの全塩基配
列を示す。 〔配列番号：２７〕ｐＧ３−２およびｐＧ１−１０にそ
れぞれ含まれるマウス膵臓β細胞株ＭＩＮ６由来Ｇ蛋白
質共役型レセプター蛋白質ｃＤＮＡ断片の塩基配列をも
とに導き出したマウス膵臓β細胞株ＭＩＮ６由来Ｇ蛋白
質共役型レセプター蛋白質ｃＤＮＡ断片の塩基配列を示
す。 〔配列番号：２８〕ｐ５Ｓ３８に含まれるマウス膵臓β
細胞株ＭＩＮ６由来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質ｃ
ＤＮＡ断片の塩基配列を示す。 〔配列番号：２９〕Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を
コードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成Ｄ
ＮＡ 〔配列番号：３０〕Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を
コードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成Ｄ
ＮＡ

【００５３】〔配列番号：３１〕Ｇ蛋白質共役型レセプ
ター蛋白質をコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使
用した合成ＤＮＡ 〔配列番号：３２〕Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を
コードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成Ｄ
ＮＡ 〔配列番号：３３〕Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を
コードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成Ｄ
ＮＡ 〔配列番号：３４〕Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を
コードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成Ｄ
ＮＡ 〔配列番号：３５〕本発明のウシ視床下部由来リガンド
ポリペプチドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに
使用した合成ＤＮＡ（Ｐ５−１） 〔配列番号：３６〕本発明のウシ視床下部由来ポリガン
ドリペプチドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに
使用した合成ＤＮＡ（Ｐ３−１） 〔配列番号：３７〕本発明のウシ視床下部由来リガンド
ポリペプチドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに
使用した合成ＤＮＡ（Ｐ３−２） 〔配列番号：３８〕本発明のウシ視床下部由来リガンド
ポリペプチドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに
使用した合成ＤＮＡ（ＰＥ） 〔配列番号：３９〕本発明のウシ視床下部由来リガンド
ポリペプチドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに
使用した合成ＤＮＡ（ＰＤＮ） 〔配列番号：４０〕本発明のウシ視床下部由来リガンド
ポリペプチドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに
使用した合成ＤＮＡ（ＦＢ）

【００５４】〔配列番号：４１〕本発明のウシ視床下部
由来リガンドポリペプチドをコードするｃＤＮＡのスク
リーニングに使用した合成ＤＮＡ（ＦＣ） 〔配列番号：４２〕本発明のウシ視床下部由来リガンド
ポリペプチドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに
使用した合成ＤＮＡ（ＢＯＶＦ） 〔配列番号：４３〕本発明のウシ視床下部由来リガンド
ポリペプチドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに
使用した合成ＤＮＡ（ＢＯＶＲ） 〔配列番号：４４〕ウシゲノム由来リガンドポリペプチ
ドの全長アミノ酸配列を示す。 〔配列番号：４５〕ｐＲＡＶ３に含まれるラット型リガ
ンドポリペプチドの全長アミノ酸配列を示す。 〔配列番号：４６〕ラット型リガンドポリペプチドｃＤ
ＮＡの全塩基配列を示す。 〔配列番号：４７〕ラット型リガンドポリペプチドのア
ミノ酸配列を示す。配列番号：４５の第２２〜５２番目
のアミノ酸配列に対応している。 〔配列番号：４８〕ラット型リガンドポリペプチドのア
ミノ酸配列を示す。配列番号：４５の第２２〜５３番目
のアミノ酸配列に対応している。 〔配列番号：４９〕ラット型リガンドポリペプチドのア
ミノ酸配列を示す。配列番号：４５の第２２〜５４番目
のアミノ酸配列に対応している。 〔配列番号：５０〕ラット型リガンドポリペプチドのア
ミノ酸配列を示す。配列番号：４５の第３３〜５２番目
のアミノ酸配列に対応している。

【００５５】〔配列番号：５１〕ラット型リガンドポリ
ペプチドのアミノ酸配列を示す。配列番号：４５の第３
３〜５３番目のアミノ酸配列に対応している。 〔配列番号：５２〕ラット型リガンドポリペプチドのア
ミノ酸配列を示す。配列番号：４５の第３３〜５４番目
のアミノ酸配列に対応している。 〔配列番号：５３〕ラット型リガンドポリペプチド（配
列番号：４７）をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：５４〕ラット型リガンドポリペプチド（配
列番号：４８）をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：５５〕ラット型リガンドポリペプチド（配
列番号：４９）をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：５６〕ラット型リガンドポリペプチド（配
列番号：５０）をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：５７〕ラット型リガンドポリペプチド（配
列番号：５１）をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：５８〕ラット型リガンドポリペプチド（配
列番号：５２）をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：５９〕ｐＨＯＢ７に含まれるヒト型リガン
ドポリペプチドの全長アミノ酸配列を示す。 〔配列番号：６０〕ヒト型リガンドポリペプチドｃＤＮ
Ａの全塩基配列を示す。

【００５６】〔配列番号：６１〕ヒト型リガンドポリペ
プチドのアミノ酸配列を示す。配列番号：５９の第２３
〜５３番目のアミノ酸配列に対応している。 〔配列番号：６２〕ヒト型リガンドポリペプチドのアミ
ノ酸配列を示す。配列番号：５９の第２３〜５４番目の
アミノ酸配列に対応している。 〔配列番号：６３〕ヒト型リガンドポリペプチドのアミ
ノ酸配列を示す。配列番号：５９の第２３〜５５番目の
アミノ酸配列に対応している。 〔配列番号：６４〕ヒト型リガンドポリペプチドのアミ
ノ酸配列を示す。配列番号：５９の第３４〜５３番目の
アミノ酸配列に対応している。 〔配列番号：６５〕ヒト型リガンドポリペプチドのアミ
ノ酸配列を示す。配列番号：５９の第３４〜５４番目の
アミノ酸配列に対応している。 〔配列番号：６６〕ヒト型リガンドポリペプチドのアミ
ノ酸配列を示す。配列番号：５９の第３４〜５５番目の
アミノ酸配列に対応している。 〔配列番号：６７〕ヒト型リガンドポリペプチド（配列
番号：６１）をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：６８〕ヒト型リガンドポリペプチド（配列
番号：６２）をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：６９〕ヒト型リガンドポリペプチド（配列
番号：６３）をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：７０〕ヒト型リガンドポリペプチド（配列
番号：６４）をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。

【００５７】〔配列番号：７１〕ヒト型リガンドポリペ
プチド（配列番号：６５）をコードするＤＮＡの塩基配
列を示す。 〔配列番号：７２〕ヒト型リガンドポリペプチド（配列
番号：６６）をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：７３〕本発明のリガンドポリペプチドのア
ミノ酸配列を示す。ここで、第１０番目のXaaはAlaまた
はThr、第１１番目のXaaはGlyまたはSer、第２１番目の
XaaはH、Gly、またはGlyArgを示す。 〔配列番号：７４〕本発明のリガンドポリペプチド断片
のアミノ酸配列を示す。ここで、第３番目のXaaはAlaま
たはThrを示し、第５番目のXaaはGlnまたはArgを示し、
第１０番目のXaaはIleまたはThrを示す。 〔配列番号：７５〕本発明のラット型リガンドポリペプ
チドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した
合成ＤＮＡ（ＲＡ） 〔配列番号：７６〕本発明のラット型リガンドポリペプ
チドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した
合成ＤＮＡ（ＲＣ） 〔配列番号：７７〕本発明のラット型リガンドポリペプ
チドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した
合成ＤＮＡ（ｒＦ） 〔配列番号：７８〕本発明のラット型リガンドポリペプ
チドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した
合成ＤＮＡ（ｒＲ） 〔配列番号：７９〕本発明のヒト型リガンドポリペプチ
ドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合
成ＤＮＡ（Ｒ１） 〔配列番号：８０〕本発明のヒト型リガンドポリペプチ
ドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合
成ＤＮＡ（Ｒ３）

【００５８】〔配列番号：８１〕本発明のヒト型リガン
ドポリペプチドをコードするｃＤＮＡのスクリーニング
に使用した合成ＤＮＡ（Ｒ４） 〔配列番号：８２〕本発明のヒト型リガンドポリペプチ
ドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合
成ＤＮＡ（ＨＡ） 〔配列番号：８３〕本発明のヒト型リガンドポリペプチ
ドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合
成ＤＮＡ（ＨＢ） 〔配列番号：８４〕本発明のヒト型リガンドポリペプチ
ドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合
成ＤＮＡ（ＨＥ） 〔配列番号：８５〕本発明のヒト型リガンドポリペプチ
ドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合
成ＤＮＡ（ＨＦ） 〔配列番号：８６〕本発明のヒト型リガンドポリペプチ
ドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合
成ＤＮＡ（５Ｈ） 〔配列番号：８７〕本発明のヒト型リガンドポリペプチ
ドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合
成ＤＮＡ（３ＨＮ） 〔配列番号：８８〕ラット型Ｇ蛋白質共役型レセプター
蛋白質（ＵＨＲ−１）をコードするｃＤＮＡのスクリー
ニングに使用した合成ＤＮＡ（ｒＲＥＣＦ） 〔配列番号：８９〕ラット型Ｇ蛋白質共役型レセプター
蛋白質（ＵＨＲ−１）をコードするｃＤＮＡのスクリー
ニングに使用した合成ＤＮＡ（ｒＲＥＣＲ） 〔配列番号：９０〕Ｇ３ＰＤＨ，ＵＨＲ−１，リガンド
の増幅に使用した合成ＤＮＡ（ｒ１９Ｆ）

【００５９】〔配列番号：９１〕Ｇ３ＰＤＨ，ＵＨＲ−
１，リガンドの増幅に使用した合成ＤＮＡ（ｒ１９Ｒ） 〔配列番号：９２〕抗原として使用したリガンドポリペ
プチドのＮ末端側ペプチド（ペプチド−I） 〔配列番号：９３〕抗原として使用したリガンドポリペ
プチドのＣ末端側ペプチド（ペプチド−II） 〔配列番号：９４〕抗原として使用したリガンドポリペ
プチドの中央部分のペプチド（ペプチド−III） 〔配列番号：９５〕ラット型Ｇ蛋白質共役型レセプター
蛋白質（ＵＨＲ−１）をコードするｃＤＮＡのスクリー
ニングに使用した合成ＤＮＡ 〔配列番号：９６〕ラット型Ｇ蛋白質共役型レセプター
蛋白質（ＵＨＲ−１）をコードするｃＤＮＡのスクリー
ニングに使用した合成ＤＮＡ 〔配列番号：９７〕後述の実施例４８でプライマーとし
て用いられた合成ＤＮＡ 〔配列番号：９８〕後述の実施例４８でプライマーとし
て用いられた合成ＤＮＡ 〔配列番号：９９〕後述の実施例４８でプライマーとし
て用いられた合成ＤＮＡ

【００６０】後述の実施例２で得られた形質転換体エシ
ェリヒア コリ（Escherichia coli)ＩＮＶαＦ’／ｐ
１９Ｐ２および実施例４で得られた形質転換体エシェリ
ヒアコリ（Escherichia coli)ＩＮＶαＦ’／ｐＧ３−
２は、それぞれ平成６年８月９日から通商産業省工業技
術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）にそれぞれ寄
託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４７７６およびＦＥＲＭ ＢＰ
−４７７５として寄託されており、また平成６年８月２
２日から財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）にそれぞれＩＦ
Ｏ １５７３９およびＩＦＯ １５７４０として寄託さ
れている。後述の実施例５で得られた形質転換体エシェ
リヒア コリ（Escherichia coli) ＪＭ１０９／ｐｈＧ
Ｒ３は、平成６年９月２７日から通商産業省工業技術院
生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）に寄託番号ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−４８０７として寄託されており、また平成６
年９月２２日から財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）にＩＦ
Ｏ １５７４８として寄託されている。後述の実施例８
で得られた形質転換体エシェリヒア コリ（Escherichi
a coli) ＪＭ１０９／ｐ５Ｓ３８は、平成６年１０月２
７日から通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所
（ＮＩＢＨ）に寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４８５６とし
て寄託されており、また平成６年１０月２５日から財団
法人発酵研究所（ＩＦＯ）にＩＦＯ １５７５４として
寄託されている。後述の実施例２０で得られた形質転換
体エシェリヒア コリ（Escherichia coli) ＪＭ１０９
／ｐＢＯＶ３は、平成８年２月１３日から通商産業省工
業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）に寄託番
号ＦＥＲＭ ＢＰ−５３９１として寄託されており、ま
た平成８年１月２５日から財団法人発酵研究所（ＩＦ
Ｏ）にＩＦＯ １５９１０として寄託されている。後述
の実施例２９で得られた形質転換体エシェリヒア コリ
（Escherichia coli) ＪＭ１０９／ｐＲＡＶ３は、平成
８年９月１２日から通商産業省工業技術院生命工学工業
技術研究所（ＮＩＢＨ）に寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５
６６５として寄託されており、また平成８年９月３日か
ら財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）にＩＦＯ １６０１２
として寄託されている。後述の実施例３２で得られた形
質転換体エシェリヒア コリ（Escherichia coli) ＪＭ
１０９／ｐＨＯＶ７は、平成８年９月１２日から通商産
業省工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）に
寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５６６６として寄託されてお
り、また平成８年９月５日から財団法人発酵研究所（Ｉ
ＦＯ）にＩＦＯ １６０１３として寄託されている。後
述の実施例３３で得られた形質転換体エシェリヒア コ
リ（Escherichia coli) ＪＭ１０９／ｐｍＧＢ３は、平
成９年３月５日から通商産業省工業技術院生命工学工業
技術研究所（ＮＩＢＨ）に寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５
８５２として寄託されており、また平成９年２月１９日
から財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）にＩＦＯ １６０５
９として寄託されている。

【００６１】

【実施例】以下に実施例を示して、本発明をより詳細に
説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものでは
ない。

【００６２】

【参考例１】Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコード
するＤＮＡを増幅させるための合成ＤＮＡプライマーの
製造 公知のヒト由来ＴＲＨレセプター蛋白質（ＨＴＲＨ
Ｒ）、ヒト由来ＲＡＮＴＥＳレセプター蛋白質（Ｌ１０
９１８、ＨＵＭＲＡＮＴＥＳ）、ヒトバーキットリンパ
腫由来リガンド不明レセプター蛋白質（Ｘ６８１４９、
ＨＳＢＬＲ１Ａ）、ヒト由来ソマトスタチンレセプター
蛋白質（Ｌ１４８５６、ＨＵＭＳＯＭＡＴ）、ラット由
来μ−オピオイドレセプター蛋白質（Ｕ０２０８３、Ｒ
ＮＵ０２０８３）、ラット由来κ−オピオイドレセプタ
ー蛋白質（Ｕ００４４２、Ｕ００４４２）、ヒト由来ニ
ューロメジンＢレセプター蛋白質（Ｍ７３４８２、ＨＵ
ＭＮＭＢＲ）、ヒト由来ムスカリン作動性アセチルコリ
ンレセプター蛋白質（Ｘ１５２６６、ＨＳＨＭ４）、ラ
ット由来アドレナリンα₁Ｂレセプター蛋白質（Ｌ０８
６０９、ＲＡＴＡＡＤＲＥ０１）、ヒト由来ソマトスタ
チン３レセプター蛋白質（Ｍ９６７３８、ＨＵＭＳＳＴ
Ｒ３Ｘ）、ヒト由来Ｃ₅ａレセプター蛋白質（ＨＵＭＣ
５ＡＡＲ）、ヒト由来リガンド不明レセプター蛋白質
（ＨＵＭＲＤＣ１Ａ）、ヒト由来リガンド不明レセプタ
ー蛋白質（Ｍ８４６０５、ＨＵＭＯＰＩＯＤＲＥ）およ
びラット由来アドレナリンα₂Ｂ（Ｍ９１４６６、ＲＡ
ＴＡ２ＢＡＲ）の第１膜貫通領域付近のアミノ酸配列を
コードするｃＤＮＡの塩基配列を比較し、類似性の高い
部分を見いだした。

【００６３】また、公知のマウス由来リガンド不明レセ
プター蛋白質（Ｍ８０４８１、ＭＵＳＧＩＲ）、ヒト由
来ボンベジンレセプター蛋白質（Ｌ０８８９３、ＨＵＭ
ＢＯＭＢ３Ｓ）、ヒト由来アデノシンＡ２レセプター蛋
白質（Ｓ４６９５０、Ｓ４６９５０）、マウス由来リガ
ンド不明レセプター蛋白質（Ｄ２１０６１、ＭＵＳＧＰ
ＣＲ）、マウス由来ＴＲＨレセプター蛋白質（Ｓ４３３
８７、Ｓ４３３８７）、ラット由来ニューロメジンＫレ
セプター蛋白質（Ｊ０５１８９、ＲＡＴＮＥＵＲＡ）、
ラット由来アデノシンＡ１レセプター蛋白質（Ｍ６９０
４５、ＲＡＴＡ１ＡＲＡ）、ヒト由来ニューロキニンＡ
レセプター蛋白質（Ｍ５７４１４、ＨＵＭＮＥＫＡ
Ｒ）、ラット由来アデノシンＡ３レセプター蛋白質（Ｍ
９４１５２、ＲＡＴＡＤＥＮＲＥＣ）、ヒト由来ソマト
スタチン１レセプター蛋白質（Ｍ８１８２９、ＨＵＭＳ
ＲＩ１Ａ）、ヒト由来ニューロキニン３レセプター蛋白
質（Ｓ８６３９０、Ｓ８６３７１Ｓ４）、ラット由来リ
ガンド不明レセプター蛋白質（Ｘ６１４９６、ＲＮＣＧ
ＰＣＲ）、ヒト由来ソマトスタチン４レセプター蛋白質
（Ｌ０７０６１、ＨＵＭＳＳＴＲ４Ｚ）およびラット由
来ＧｎＲＨレセプター蛋白質（Ｍ３１６７０、ＲＡＴＧ
ＮＲＨＡ）の第６膜貫通領域付近のアミノ酸配列をコー
ドするｃＤＮＡの塩基配列を比較し、類似性の高い部分
を見いだした。

【００６４】上記の（ ）内の略語はDNASIS Gene/Prot
einシークエンスデータベース（ＣＤ０１９、日立ソフ
トウエアエンジニアリング）を用いて GenBank/EMBL Da
ta Bank を検索した際に示される整理番号であり、それ
ぞれ通常Accession Numberおよびエントリーネームと呼
ばれるものである。ただし、ＨＴＲＨＲは特開平７−３
０４７９７号に記載されている配列である。特に、多く
のレセプター蛋白質をコードするｃＤＮＡで一致する塩
基部分を基準とし、その他の部分においてもなるべく多
くのレセプターｃＤＮＡと配列の一致性を高めるために
混合塩基の導入を計画した。この配列をもとに、共通す
る塩基配列に相補的である配列番号：２９または配列番
号：３０で表わされる塩基配列を有する合成ＤＮＡ２本
を作成した。 〔合成ＤＮＡ〕 ５'−ＣＧＴＧＧ（ＧまたはＣ）Ｃ（ＡまたはＣ）Ｔ
（ＧまたはＣ）（ＧまたはＣ）ＴＧＧＧＣＡＡＣ（Ａ、
Ｇ、ＣまたはＴ）（ＣまたはＴ）ＣＣＴＧ−３'（配列
番号：２９） ５'−ＧＴ（Ａ、Ｇ、ＣまたはＴ）Ｇ（ＡまたはＴ）
（ＡまたはＧ）（ＡまたはＧ）ＧＧＣＡ（Ａ、Ｇ、Ｃま
たはＴ）ＣＣＡＧＣＡＧＡ（ＧまたはＴ）ＧＧＣＡＡＡ
−３'（配列番号：３０） （ ）内は合成時に複数の塩基に混合して合成する。

【００６５】

【実施例１】ヒト下垂体由来ｃＤＮＡを用いたＰＣＲ法
による受容体ｃＤＮＡの増幅 ヒト下垂体由来ｃＤＮＡ（QuickClone、クロンテック
社）を鋳型として用い、参考例１で合成したＤＮＡプラ
イマーを用いてＰＣＲ法による増幅を行った。反応液の
組成は、合成ＤＮＡプライマー（配列：５’プライマー
配列および３’プライマー配列）各１μＭ、鋳型ｃＤＮ
Ａ １ｎｇ、０.２５ｍＭ ｄＮＴＰｓ、Ｔａｑ ＤＮＡ
polymerase １μｌおよび酵素に付属のバッファーで、
総反応溶液量は１００μｌとした。増幅のためのサイク
ルはサーマルサイクラー（パーキン・エルマー社）を用
い、９５℃・１分、５５℃・１分、７２℃・１分のサイ
クルを３０回繰り返した。Ｔａｑ ＤＮＡ polymerase
を添加する前に、残りの反応液を混合し、９５℃・５
分、６５℃・５分の加熱を行った。増幅産物の確認は
１.２％アガロースゲル電気泳動およびエチジウムブロ
マイド染色によって行った。

【００６６】

【実施例２】ＰＣＲ産物のプラスミドベクターへのサブ
クローニングおよび挿入ｃＤＮＡ部分の塩基配列の解読
による新規レセプター蛋白質候補クローンの選択 実施例１で行なったＰＣＲ後の反応産物は０.８％の低
融点アガロースゲルを用いて分離し、バンドの部分をカ
ミソリで切り出した後、熱融解、フェノール抽出、エタ
ノール沈殿を行ってＤＮＡを回収した。ＴＡクローニン
グキット（インビトロゲン社）の処方に従い、回収した
ＤＮＡをプラスミドベクターｐＣＲ^TMII（ＴＭは登録商
標を意味する）へサブクローニングした。これを大腸菌
ＩＮＶαＦ’ competent cell（インビトロゲン社）に
導入して形質転換したのち、ｃＤＮＡ挿入断片を持つク
ローンをアンピシリンおよびＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天
培地中で選択し、白色を呈するクローンのみを滅菌した
つま楊枝を用いて分離し、形質転換体エシェリヒア コ
リ（Escherichia coli) ＩＮＶαＦ’／ｐ１９Ｐ２を得
た。個々のクローンをアンピシリンを含むＬＢ培地で一
晩培養し、自動プラスミド抽出装置（クラボウ社）を用
いてプラスミドＤＮＡを調製した。調製したＤＮＡの一
部を用いてＥｃｏＲＩによる切断を行い、挿入されてい
るｃＤＮＡ断片の大きさを確認した。残りのＤＮＡの一
部をさらにＲＮａｓｅ処理、フェノール・クロロフォル
ム抽出し、エタノール沈殿によって濃縮した。塩基配列
の決定のための反応は DyeDeoxy Terminator Cycle Seq
uencing Kit（ＡＢＩ社）を用いて行い、蛍光式自動シ
ーケンサーを用いて解読し、得られた塩基配列の情報は
ＤＮＡＳＩＳ（日立システムエンジニアリング社）を用
いて行った。下線で示した部分は合成プライマーに相当
する部分である。決定した塩基配列〔配列番号：２４
（図１の塩基配列から下線部分を除いた塩基配列）およ
び配列番号：２５（図２の塩基配列から下線部分を除い
た塩基配列）〕をもとにホモロジー検索を行なった結
果、形質転換体Ｅ. Ｃｏｌｉ ＩＮＶαＦ’／ｐ１９Ｐ
２の保有するプラスミドｐ１９Ｐ２に挿入されたｃＤＮ
Ａ断片が新規Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコード
することが分かった。それをさらに確認するために、Ｄ
ＮＡＳＩＳ（日立システムエンジニアリング社）を用
い、塩基配列をアミノ酸配列に変換した〔配列番号：１
９（図１のアミノ酸配列から下線部分を除いたアミノ酸
配列）および配列番号：２０（図２のアミノ酸配列から
下線部分を除いたアミノ酸配列）〕。疎水性プロット
〔図３および図４〕およびアミノ酸配列に基づくホモロ
ジー検索を行ない、ニューロペプチドＹ受容体等との相
同性を見いだした〔図５〕。

【００６７】

【実施例３】マウス膵臓β細胞株ＭＩＮ６からのpoly
(Ａ)⁺ＲＮＡ画分の調製およびｃＤＮＡの合成 マウス膵β細胞株ＭＩＮ６（Jun-ichi Miyazaki et al.
Endocrinology, Vol.127, No.1, p126-132）よりグア
ニジンイソチオシアネート法により Total ＲＮＡを調
製後（Kaplan B.B. et al., Biochem. J. 183, 181-184
（1979）)、ｍＲＮＡ精製キット（ファルマシア社）を
用いて、 poly(Ａ)⁺ＲＮＡ画分を調製した。次に、poly
(Ａ)⁺ＲＮＡ画分５μｇにプライマーとしてランダムＤ
ＮＡヘキサマー（ＢＲＬ社）を加え、モロニイマウス白
血病ウイルスの逆転写酵素（ＢＲＬ社）により、添付バ
ッファーを用いて相補ＤＮＡを合成した。反応後の産物
はフェノール：クロロホルム（１：１）で抽出し、エタ
ノール沈殿を行った後、３０μｌのＴＥに溶解した。

【００６８】

【実施例４】ＭＩＮ６由来ｃＤＮＡを用いたＰＣＲ法に
よる受容体ｃＤＮＡの増幅と塩基配列の決定 実施例３でマウス膵β細胞株ＭＩＮ６より調製したｃＤ
ＮＡ ５μｌを鋳型として使用し、参考例１で合成した
ＤＮＡプライマーを用いて実施例１と同条件でＰＣＲ法
を行った。得られたＰＣＲ産物は実施例２に記載の方法
と同様にして、プラスミドベクターｐＣＲ^TMIIにサブク
ローニングし、プラスミドｐＧ３−２を得た。このプラ
スミドで大腸菌ＩＮＶαＦ’を形質転換し、形質転換体
エシェリヒア コリ（Escherichia coli)ＩＮＶαＦ’
／ｐＧ３−２を得た。また、マウス膵β細胞株ＭＩＮ６
より調製したｃＤＮＡ ５μｌを鋳型として使用し、Lib
ert, Fら（Science 244:569-572, 1989）に記載されて
いる合成ＤＮＡプライマー、すなわち、 ５'−ＣＴＧＴＧ（ＣまたはＴ）Ｇ（ＣまたはＴ）（Ｇ
またはＣ）ＡＴ（ＣまたはＴ）ＧＣＩＩＴ（Ｇまたは
Ｔ）ＧＡ（ＣまたはＴ）（ＡまたはＣ）Ｇ（Ｇまたは
Ｃ）ＴＡＣ−３'（配列番号：３１） 〔Ｉはイノシンを示す。〕で表される合成プライマーお
よび ５'−Ａ（ＧまたはＴ）Ｇ（ＡまたはＴ）ＡＧ（Ａまた
はＴ）ＡＧＧＧＣＡＧＣＣＡＧＣＡＧＡＩ（Ｇまたは
Ｃ）（ＡまたはＧ）（ＣまたはＴ）ＧＡＡ−３'（配列
番号：３２） 〔Ｉをイノシンを示す。〕で表される合成プライマーを
用いて、実施例１と同条件でＰＣＲ法を行った。得られ
たＰＣＲ産物は実施例２に記載の方法と同様にして、プ
ラスミドベクターｐＣＲ^TMIIにサブクローニングし、プ
ラスミドｐＧ１−１０を得た。

【００６９】塩基配列の決定のための反応は DyeDeoxy
Terminator Cycle Sequencing Kit（ＡＢＩ社）を用い
て行い、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読し、得ら
れた塩基配列の情報はＤＮＡＳＩＳ（日立システムエン
ジニアリング社）を用いて行った。ｐＧ３−２およびｐ
Ｇ１−１０の配列をもとにマウス膵β細胞株ＭＩＮ６由
来のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするＤＮ
Ａの塩基配列（配列番号：２７）およびこれにコードさ
れるアミノ酸配列（配列番号：２２）を〔図６〕および
〔図７〕に示した。下線で示した部分は合成プライマー
に相当する部分である。決定した塩基配列〔図６〕およ
び〔図７〕をもとにホモロジー検索を行なった結果、得
られたｃＤＮＡ断片が新規Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋
白質をコードすることが分かった。それをさらに確認す
るために、ＤＮＡＳＩＳ（日立システムエンジニアリン
グ社）を用い、塩基配列をアミノ酸配列に変換した後
〔図６〕および〔図７〕、疎水性プロットを行なったと
ころ、６個の疎水性領域の存在が確認できた〔図９〕。
また、アミノ酸配列を実施例２で得たｐ１９Ｐ２と比較
したところ、〔図８〕に示すとおり高い相同性を見いだ
した。その結果、ｐＧ３−２およびｐＧ１−１０にコー
ドされるマウス膵β細胞株ＭＩＮ６由来Ｇ蛋白質共役型
レセプター蛋白質とヒト下垂体由来ｐ１９Ｐ２にコード
されるＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質は由来する動物
種は異なるが、同一のリガンドを認識するレセプター蛋
白質であることが強く示唆された。

【００７０】

【実施例５】ヒト下垂体由来ｃＤＮＡライブラリーから
のレセプター蛋白質の全コード領域を含むｃＤＮＡのク
ローニング ヒト下垂体由来ｃＤＮＡライブラリーとしては、クロー
ンテック社製のλｇｔ１１ファージベクターを使ったラ
イブラリーを用いた（クローンテック、ＣＬＨＬ１１３
９ｂ）。２×１０⁶ｐｆｕ（プラーク・フォーミング・
ユニット）分のヒト下垂体ｃＤＮＡライブラリーを、硫
酸マグネシウムで処理した大腸菌Ｙ１０９０^-と混ぜ、
３７℃、１５分間インキュベートした後、０.５％アガ
ロース（ファルマシア社）ＬＢを加え、１.５％寒天
（和光純薬社）ＬＢプレート(５０μg/ml Ampicilin含
有）に播いた。プラークのできたプレートにニトロセル
ロースフィルターを置き、フィルター上にプラークを転
写した。このフィルターをアルカリ処理することによっ
て変性させた後、８０℃、３時間の加熱によってＤＮＡ
の固定を行った。このフィルターを、５０％ formamid
e，５×ＳＳＰＥ，５× Denhardt's溶液，０.１％ ＳＤ
Ｓ，１００μg/ml salmon sperm ＤＮＡを含むバッファ
ー中で以下に述べるプローブと４２℃で一晩インキュベ
ートし、ハイブリダイズさせた。プローブとしては、実
施例２で得られたプラスミドｐ１９Ｐ２に挿入されたＤ
ＮＡ断片をＥｃｏＲＩで切断し、回収後、ランダムプラ
イムＤＮＡラベリングキット（アマシャム社）を用いて
〔³²Ｐ〕ｄＣＴＰ（デュポン社）を取り込ませることに
よって標識して用いた。洗浄は、２×ＳＳＣ，０.１％
ＳＤＳで５５℃、１時間行い、その後、−８０℃でオー
トラジオグラフィを行ってハイブリダイズするプラーク
を検出した。

【００７１】このスクリーニングにより、３個の独立し
たプラークにハイブリダイゼーションのシグナルが認め
られた。この３個のクローンからそれぞれＤＮＡを調製
し、ＥｃｏＲＩで消化したものをアガロース電気泳動
後、スクリーニングに用いたものと同じプローブを用い
て、サザンブロットにより解析を行ったところ、各々約
０.７ｋｂ，０.８ｋｂ，２.０ｋｂのところにそれぞれ
ハイブリダイズするバンドを生じ、このうち約２.０ｋ
ｂのバンドを生じるもの（λｈＧＲ３）を選択した。λ
ｈＧＲ３のハイブリダイズするサイズのＥｃｏＲＩ断片
をプラスミドｐＵＣ１８のＥｃｏＲＩサイトにサブクロ
ーニングした後、このプラスミドで大腸菌ＪＭ１０９を
形質転換し、形質転換体 Ｅ.ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐ
ｈＧＲ３を得た。このプラスミドｐｈＧＲ３を、実施例
２で示された塩基配列から予想される制限酵素地図をも
とにして制限酵素地図を作製したところ、実施例２で示
されるレセプター蛋白質をコードするＤＮＡから予想さ
れるレセプター蛋白質の全長をコードするＤＮＡを保持
していることが分かった。

【００７２】

【実施例６】ヒト下垂体由来レセプター蛋白質ｃＤＮＡ
の塩基配列の決定 実施例５で得られたプラスミドｐｈＧＲ３に挿入したＥ
ｃｏＲＩ断片のうち、レセプター蛋白質をコードしてい
ると考えられるＥｃｏＲＩサイトからＮｈｅＩサイトま
での約１３３０ｂｐの塩基配列を決定した。具体的に
は、ＥｃｏＲＩ断片中に存在する制限酵素サイトを利用
して、不必要な部分を除き、または必要な断片をサブク
ローニングし、配列解析のための鋳型プラスミドを調製
した。塩基配列決定のための反応は Dye Deoxy Termina
tor Cycle Sequencing Kit（ＡＢＩ社）を用いて行い、
蛍光式ＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩ社）を用いて解読
し、データー解析にはＤＮＡＳＩＳ（日立ソフトウェア
エンジニアリング社）を使用した。ｐｈＧＲ３のコード
するＥｃｏＲＩサイト直後からＮｈｅＩサイトまでの塩
基配列を〔図１０〕および〔図１１〕に示した。そし
て、ヒト下垂体由来レセプタータンパク質をコードする
ＤＮＡの塩基配列は、〔図１０〕および〔図１１〕の塩
基配列の第１１８番目〜第１２２７番目の塩基配列（配
列番号：２６）に対応する。そして、これにコードされ
るレセプター蛋白質のアミノ酸配列は配列番号：２１で
表わされるアミノ酸配列であることが分かった。

【００７３】

【実施例７】ヒト下垂体由来レセプター蛋白質をコード
するｐｈＧＲ３を用いたノーザンハイブリダイゼーショ
ン 実施例５で得られたプラスミドｐｈＧＲ３にコードされ
るヒト下垂体由来レセプター蛋白質の下垂体での発現を
ｍＲＮＡレベルで検出するため、ノーザンブロットを行
った。ｍＲＮＡとしてはヒト下垂体ｍＲＮＡ（クローン
テック社）２.５μｇを用い、プローブは実施例５で用
いたものと同じものを用いた。また、ノーザンブロット
用のフィルターは、Nylon membrane（Pall Biodyne, U.
S.A.）を用い、ｍＲＮＡの泳動フィルターへの吸い上げ
は Molecular cloning, Cold Spring Harbor Laborator
y Press （1989）の方法に従って作製した。ハイブリダ
イゼーションは、上に述べたフィルターとプローブを５
０％ formamide，５×ＳＳＰＥ，５×Denhardt's溶液，
０.１％ ＳＤＳ，１００μg/ml salmon sperm ＤＮＡを
含むバッファー中で、４２℃一晩インキュベートした。
フィルターの洗浄は０.１×ＳＳＣ，０.１％ＳＤＳで５
０℃にて行い、風乾後３日間−８０℃でＸ線フィルム
（ＸＡＲ５，コダック）に感光させた。その結果を〔図
１２〕に示した。〔図１２〕から、ｐｈＧＲ３がコード
するレセプター遺伝子はヒト下垂体で発現していると考
えられる。

【００７４】

【実施例８】ＭＩＮ６由来ｃＤＮＡを用いたＰＣＲ法に
よる受容体ｃＤＮＡの増幅と塩基配列の決定 実施例３でマウス膵β細胞株ＭＩＮ６より調製したｃＤ
ＮＡ ５μｌを鋳型として使用し、実施例４で合成したL
ibert, F.ら（Science 244:569-572, 1989）に記載され
ている合成ＤＮＡプライマー、すなわち、 ５'−ＣＴＧＴＧ（ＣまたはＴ）Ｇ（ＣまたはＴ）（Ｇ
またはＣ）ＡＴ（ＣまたはＴ）ＧＣＩＩＴ（Ｇまたは
Ｔ）ＧＡ（ＣまたはＴ）（ＡまたはＣ）Ｇ（Ｇまたは
Ｃ）ＴＡＣ−３'（配列番号：３１） 〔Ｉはイノシンを示す。〕で表される合成プライマーお
よび ５'−Ａ（ＧまたはＴ）Ｇ（ＡまたはＴ）ＡＧ（Ａまた
はＴ）ＡＧＧＧＣＡＧＣＣＡＧＣＡＧＡＩ（Ｇまたは
Ｃ）（ＡまたはＧ）（ＣまたはＴ）ＧＡＡ−３'（配列
番号：３２） 〔Ｉをイノシンを示す。〕で表される合成プライマーを
用いて、実施例１と同条件でＰＣＲ法を行った。得られ
たＰＣＲ産物は実施例２に記載の方法と同様にして、プ
ラスミドベクターｐＣＲ^TMIIにサブクローニングし、プ
ラスミドｐ５Ｓ３８を得た。このプラスミドで大腸菌Ｊ
Ｍ１０９を形質転換し、形質転換体エシェリヒア コリ
（Escherichia coli)ＪＭ１０９／ｐ５Ｓ３８を得た。

【００７５】塩基配列の決定のための反応は DyeDeoxy
Terminator Cycle Sequencing Kit（ＡＢＩ社）を用い
て行い、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読し、得ら
れた塩基配列の情報はＤＮＡＳＩＳ（日立システムエン
ジニアリング社）を用いて行った。ｐ５Ｓ３８の配列を
もとにマウス膵β細胞株ＭＩＮ６由来のＧ蛋白質共役型
レセプター蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列（配列
番号：２８）およびこれにコードされるアミノ酸配列
（配列番号：２３）を〔図１４〕に示した。下線で示し
た部分は合成プライマーに相当する部分である。決定し
た塩基配列〔図１４〕をもとにホモロジー検索を行なっ
た結果、得られたｃＤＮＡ断片が新規Ｇ蛋白質共役型レ
セプター蛋白質をコードすることが分かった。それをさ
らに確認するために、ＤＮＡＳＩＳ（日立システムエン
ジニアリング社）を用い、塩基配列をアミノ酸配列に変
換した後〔図１４〕、疎水性プロットを行なったとこ
ろ、４個の疎水性領域の存在が確認できた〔図１６〕。
また、アミノ酸配列を実施例２で得たｐ１９Ｐ２および
実施例４で得たｐＧ３−２と比較したところ、〔図１
５〕に示すとおり高い相同性を見いだした。その結果、
ｐ５Ｓ３８にコードされるマウス膵β細胞株ＭＩＮ６由
来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質とｐ１９Ｐ２にコー
ドされるヒト下垂体由来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白
質は、由来する動物種は異なるが、同一のリガンドを認
識するレセプター蛋白質であることが強く示唆された。
また、ｐ５Ｓ３８にコードされるマウス膵β細胞株ＭＩ
Ｎ６由来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質とｐＧ３−２
およびｐＧ１−１０にコードされるマウス膵β細胞株Ｍ
ＩＮ６由来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質は、同一の
リガンドを認識するレセプター蛋白質であり、互いに近
縁なレセプター蛋白質（いわゆる、サブタイプ）である
ことが示唆された。

【００７６】

【実施例９】ｐｈＧＲ３発現ＣＨＯ細胞の作製 ヒト下垂体由来レセプター蛋白質の全長アミノ酸配列を
コードするcDNAを組み込んだプラスミドｐｈＧＲ３（実
施例５）を制限酵素Nco I で切断し、アガロースゲル電
気泳動後に約1kbの断片を回収した。回収した断片の両
端をDNA blunting kit（宝酒造）を用いて平滑化した
後、Sal Iリンカーを付加しさらにSal Iで処理した後、
pUC119のSal I siteに組み込んでプラスミドS10を得
た。S10をSalIおよびSac IIで処理することにより約700
bpの断片（N末端側のコード領域を含む）を調製した。
次にｐｈＧＲ３よりSac II およびNhe I で切り出され
る約700bpの断片（終始コドンを含むＣ末端側コード領
域を含む）を調製した。これらの２つの断片をSal Iお
よびNhe I処理した動物細胞発現用ベクタープラスミド
ｐＡＫＫＯ−１１１Ｈ（Biochim. Biophys. Acta, Hinu
ma, S., et al. 1219巻、251-259頁、1994年記載のpAKK
O1.11Hと同一のベクタープラスミド）に加えてligation
を行い全長レセプター蛋白質発現用プラスミドｐＡＫＫ
Ｏ−１９Ｐ２ を構築した。ｐＡＫＫＯ−１９Ｐ２で形
質転換した大腸菌を培養後、ＱＵＩＡＧＥＮ Maxiによ
って大量にｐＡＫＫＯ−１９Ｐ２のプラスミドＤＮＡを
調製した。そのうち20μｇのプラスミドＤＮＡを1mlの
滅菌ＰＢＳに溶解した後、ジーントランスファー（和光
純薬）のバイアルに入れ、十分にボルテックスを行うこ
とによってリポソームの形成を行わせた。24時間前に直
径10cmシャーレに1×10⁶個ずつ継代し、直前に新鮮な培
地に交換したＣＨＯdhfr^-細胞に125μlのリポソーム溶
液を添加し、一晩培養した。新鮮な培地に交換してさら
に一日培養した後、選択培地に交換して１日間培養し
た。形質転換体を効率良く選別するために、低細胞密度
で継代を行い、選択培地中で増殖してくる細胞のみを選
択し、全長レセプター蛋白質発現CHO細胞株 ＣＨＯ−１
９Ｐ２を樹立した。

【００７７】

【実施例１０】ＣＨＯ−１９Ｐ２細胞株での全長レセプ
ター蛋白質の発現量の転写レベルでの確認 Fast Track kit (Invitrogen社）を用い、キットの処方
にしたがってｐＡＫＫＯ−１９Ｐ２を導入して形質転換
したＣＨＯ細胞とｍｏｃｋ ＣＨＯ細胞からpoly(A)⁺RN
Aを調製した。このpoly(A)⁺RNAを0.02μｇ用い、RNA PC
R Kit (宝酒造）を用いてｃＤＮＡの合成を行った。用
いたプライマーの種類はrandom 9merで、反応液の全容
量は40μlとした。また、ｃＤＮＡ合成のネガティブコ
ントロールとして、リバーストランスクリプターゼを添
加しない反応液も準備した。最初、30℃で10分間のイン
キュベートを行ってプライマーからの伸長反応をある程
度行わせた。その後、42℃で３０分間インキュベートし
て十分に逆転写反応を進行させ、99℃で５分間加熱して
酵素を失活し、さらに5℃で５分間冷却した。逆転写反
応終了後に反応液の一部を回収し、蒸留水で希釈した
後、フェノール／クロロフォルム抽出、ジエチルエーテ
ル抽出を行った。これをエタノール沈殿し、一定量の蒸
留水に溶解したものをｃＤＮＡの試料とした。このｃＤ
ＮＡ溶液およびプラスミドＤＮＡ（ｐＡＫＫＯ−１９Ｐ
２）を段階的に希釈したものを作成し、全長レセプター
蛋白質に特異的なプライマーを用いてＰＣＲを行った。
全長レセプター蛋白質のコード領域の塩基配列に基づい
て作成したプライマーの配列は、５’側がＣＴＧＡＣＴ
ＴＡＴＴＴＴＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＧＣ（配列番号：３
３）、３’側がＡＡＣＡＣＣＧＡＣＡＣＡＴＡＧＡＣＧ
ＧＴＧＡＣＣ（配列番号：３４）である。ＰＣＲ反応
は、プライマー各1μMおよびTaq DNA polymerase (宝酒
造）0.5μl、酵素に添付の反応バッファーおよびdNTPs
と10μlの鋳型ＤＮＡ（ｃＤＮＡあるいはプラスミド溶
液）を用いて全容量100μlで行った。最初に94℃で２分
間熱処理を行って鋳型ＤＮＡの変性を十分に行った後
に、95℃で30秒、65℃で30秒、72℃で60秒のサイクルを
25回行った。反応終了後に10μlの反応液を用いてアガ
ロースゲル電気泳動を行い増幅産物の検出および量的な
比較を行った。その結果全長レセプター蛋白質をコード
するｃＤＮＡの配列から推定される大きさ（400bp）の
ＰＣＲ産物が、検出された〔図１７〕。リバーストラン
スクリプターゼを添加しなかった逆転写反応産物を鋳型
として用いたＰＣＲ反応液のレーンに特異的なバンドは
検出されず、ＣＨＯ細胞のゲノムＤＮＡ由来のＰＣＲ産
物である可能性は除外され、また、ｍｏｃｋ細胞のレー
ンにも特異的なバンドが出現しないことから、ＣＨＯ細
胞にもとから発現しているｍＲＮＡ由来ではないことが
確認された〔図１７〕。

【００７８】

【実施例１１】ラット全脳抽出液に含まれるＣＨＯ−１
９Ｐ２細胞株から特異的にアラキドン酸代謝物の遊離を
促進する活性の検出 ラット全脳よりペプチド粗画分を以下の方法で調整し
た。屠殺後、直ちに摘出したラット全脳を液体窒素にて
凍結、-80℃にて保存した。凍結保存したラット全脳20g
(ラット10匹分)を細かく砕き、蒸留水80mlで10分間煮沸
した。煮沸後、氷上にて急冷し、終濃度 1.0M となるよ
う酢酸を4.7ml加え、ポリトロン(20,000rpm、6min)を用
いてホモジナイズした。ホモジェネートは、一晩撹拌し
た後、遠心(10,000rpm、20min)により上清をとり、沈殿
物を1.0M酢酸40mlでホモジナイズし遠心にて再度上清を
得た。上清をまとめ、3倍量のアセトンを加え、氷上に3
0分間放置した後遠心(10,000rpm、20min)にて上清を回
収した。回収したアセトン上清は、エバポレーションに
て脱アセトン、濃縮を行った。濃縮された脱アセトン上
清に、2倍量の0.05%トリフルオロ酢酸(TFA)/H₂Oを加
え、ガラス製カラムに詰めた逆相C18カラム(Prep C18 1
25Å 10ml：ミリポア)に添加した。上清を添加後、0.05
%TFA/H₂O でカラムを洗浄、10%、20%、30%、40%、50%、
60% CH₃CN/0.05%TFA/H₂O で段階的に溶出し、それぞれ
の画分を10等分して凍結乾燥した。1匹分の全脳由来の
乾燥標品を、ジメチルスルホキシド(DMSO)20μlにて溶
解し、0.05%ウシ血清アルブミン(BSA)を加えたハンクス
氏液(HBSS)1mlに懸濁し、ペプチド粗画分とした。全長
レセプター蛋白質発現CHO細胞およびｍｏｃｋ ＣＨＯ
細胞を、24well plateに0.5x10⁵cells/wellで播種し、2
4時間培養後、[³H]アラキドン酸を0.25μCi/well とな
るよう添加した。[³H]アラキドン酸添加16時間後、細胞
を0.05%BSAを含むHBSSで洗浄、上述のペプチド粗画分を
400μl/wellで添加した。37℃で30分間インキュベート
した後に、反応液400μl中300μlをシンチレーター4ml
に加え、反応液中に遊離された[³H]アラキドン酸代謝物
の量をシンチレーション・カウンターによりモニターし
た。その結果、30%CH₃CNの溶出画分に全長レセプター蛋
白質発現ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−１９Ｐ２）特異的なアラ
キドン酸代謝物遊離活性が検出された〔図１８〕。

【００７９】

【実施例１２】ウシ視床下部抽出液に含まれるＣＨＯ−
１９Ｐ２細胞株から特異的にアラキドン酸代謝物の遊離
を促進する活性の検出 実施例１１と同様の方法でウシ視床下部を含む脳組織片
360g(10頭分)よりペプチド粗画分を調製した。0.5頭分
由来の乾燥ペプチド標品を40μlのDMSO に溶解し、0.05
%BSAを含む2mlのHBSSに懸濁し、実施例１１と同様の方
法でアラキドン酸代謝物遊離活性の検出を試みた。その
結果、ウシ視床下部ペプチド粗画分のC18カラム30%CH₃C
N溶出画分に、ＣＨＯ−１９Ｐ２細胞株から特異的にア
ラキドン酸代謝物の遊離を促進する活性が検出された
〔図１９〕。

【００８０】

【実施例１３】ウシ視床下部からのＣＨＯ−１９Ｐ２細
胞株から特異的にアラキドン酸代謝物の遊離を促進する
活性物質(ペプチド)の精製 ＣＨＯ−１９Ｐ２細胞株から特異的アラキドン酸代謝物
の遊離を促進する活性物質についてウシ視床下部から精
製した代表例を以下に具体的に述べる。視床下部を含む
凍結脳組織片4.0kg(80頭分)を小片化し、蒸留水8.0L中
で20分間煮沸した。氷上にて急冷した後、終濃度1.0Mと
なるように酢酸540mlを加え、ポリトロン(10,000rpm、1
2min)にてホモジナイズした。ホモジェネートを一晩撹
拌した後、遠心(9,500rpm、20min)にて上清を得た。沈
殿物は1.0M酢酸4.0Lに懸濁し、ポリトロンにてホモジナ
イズし遠心にて再度上清を得た。上清を一つにまとめ、
終濃度0.05%となるようにTFAを加え、ガラス製カラムに
詰めた逆相C18カラム(PrepC18 125Å 160ml:ミリポア)
に添加した。添加後、0.05%TFA/H₂0 320ml でカラムを
洗浄後、10%、30%、50% CH₃CN/0.05%TFA/H₂O で3段階に
溶出した。30% CH₃CN/0.05%TFA/H₂O 溶出画分に２倍量
の 20mM CH₃COONH₄/H₂O を加え、陽イオン交換カラム H
iPrep CM-Sepharose FF (Pharmacia)に添加した。20mM
CH₃COONH₄/10% CH₃CN/H₂O でカラムを洗浄後、100mM、
200mM、500mM、1000mM CH₃COONH₄/10%CH₃CN/H₂O で４段
階に溶出した。200mM CH₃COONH₄ 溶出画分にＣＨＯ−１
９Ｐ２細胞株から特異的にアラキドン酸代謝物の遊離を
促進する活性が見いだされたので、この溶出画分に３倍
量のアセトンを加え、遠心して除タンパク質を行った
後、エバポレーションによる濃縮を行った。濃縮された
画分にTFA(終濃度0.1%)を加えた後さらに 酢酸を加えて
pH4に調製し、逆相カラム RESOURCE RPC 3ml(Pharmaci
a)に添加した。15%-30% CH₃CN 濃度勾配による溶出で、
19%-21% CH₃CN の画分にＣＨＯ−１９Ｐ２細胞株から特
異的にアラキドン酸代謝物の遊離を促進する活性が検出
された。RESOURCE RPC の活性画分を 凍結乾燥後、DMSO
で溶解したのち、50mM MES pH5.0/10% CH₃CN に懸濁
し、陽イオン交換カラム RESOURCE S 1ml(Pharmacia)に
添加した。0M-0.7M NaCl 濃度勾配による溶出で、0.32M
-0.46MNaCl の画分にＣＨＯ−１９Ｐ２細胞株から特異
的にアラキドン酸代謝物の遊離を促進する活性が検出さ
れた。RESOURCE S の活性画分を 凍結乾燥後、DMSOに溶
解したのち、0.1%TFA/H₂O に懸濁し、逆相カラム C18 2
18TP5415(Vydac) に添加した。20%-30% CH₃CN 濃度勾配
による溶出で、22.5%、23%、23.5% CH₃CN の３つの画分
（活性画分をそれぞれP-1、P-2、P-3とする）にそれぞ
れＣＨＯ−１９Ｐ２細胞株から特異的にアラキドン酸代
謝物の遊離を促進する活性が検出された〔図２０〕。３
つに分離した活性のうちの 23.5% CH₃CN の画分（p-3)
を凍結乾燥後、DMSOで溶解したのち、0.1%TFA/H₂O に懸
濁し、逆相カラム diphenyl 219TP5415(Vydac) に添加
した。22%-25% CH₃CN 濃度勾配による溶出で、23% CH₃C
N で溶出される１つのピークにＣＨＯ−１９Ｐ２細胞株
から特異的にアラキドン酸代謝物の遊離を促進する活性
は収束した〔図２１〕。逆相カラムdiphenyl 219TP5415
で活性と一致したピークの画分を凍結乾燥後、0.1%TFA
/H₂O に懸濁し、逆相カラム μRPC C2/C18 SC 2.1/10(P
harmacia) に添加した。22%-23.5% CH₃CN 濃度勾配によ
る溶出で 23.0% と 23.2% CH₃CN で溶出される二つのピ
ークにそれぞれＣＨＯ−１９Ｐ２細胞株から特異的にア
ラキドン酸代謝物の遊離を促進する活性が検出された
〔図２２〕。

【００８１】

【実施例１４】ウシ視床下部から精製したＣＨＯ−１９
Ｐ２細胞株から特異的にアラキドン酸代謝物の遊離を促
進する活性ペプチドのアミノ酸配列決定 実施例１３で精製されたＣＨＯ−１９Ｐ２細胞株から特
異的にアラキドン酸代謝物の遊離を促進する活性ペプチ
ド(P-3)のアミノ酸配列の決定を行った。逆相カラム μ
RPC C2/C18 SC 2.1/10 で活性と一致したピークの画分
を凍結乾燥後、70% CH₃CN 20μl に溶解し、ペプチドシ
ークエンサー(ABI.491) によるアミノ酸配列の分析を行
った。その結果、配列番号：３が得られた。ただし、７
番目と１９番目の配列はアミノ酸配列の分析のみでは決
定されていない。

【００８２】

【実施例１５】ウシ視床下部からのＣＨＯ-１９Ｐ２細
胞株から特異的にアラキドン酸代謝物の遊離を促進する
活性物質（ペプチド）の精製 実施例１３において Vydac Ｃ１８ ２１８ＴＰ５４１５
で分離された３つの活性のうち２３.０％ ＣＨ₃ＣＮの
活性画分（Ｐ-２）のさらなる精製を行った。この活性
画分を凍結乾燥後、DMSOで溶解したのち０.１％ ＴＦＡ
／蒸留水に懸濁し、逆相カラムdiphenyl ２１９ＴＰ５
４１５（Vydac）に添加した。２１.０％−２４.０％ Ｃ
Ｈ₃ＣＮ濃度勾配による溶出で、２１.９％ ＣＨ₃ＣＮで
溶出される一つのピークにＣＨＯ-１９Ｐ２細胞株から
特異的にアラキドン酸代謝物の遊離を促進する活性が検
出された。この画分を凍結乾燥後、DMSOで溶解したのち
０.１％ ＴＦＡ／蒸留水に懸濁し、逆相カラムμＲＰＣ
Ｃ２／Ｃ１８ ＳＣ ２.１／１０（Pharmacia）に添加
した。２１.５％−２３.０％ ＣＨ₃ＣＮ濃度勾配による
溶出で、２２.０％ ＣＨ₃ＣＮで溶出される一つのピー
クにＣＨＯ-１９Ｐ２細胞株から特異的にアラキドン酸
代謝物の遊離を促進する活性が収束した〔図２３〕。

【００８３】

【実施例１６】ウシ視床下部から精製されたＣＨＯ-１
９Ｐ２細胞株から特異的にアラキドン酸代謝物の遊離を
促進するペプチド（Ｐ-２）のアミノ酸配列決定 実施例１５で精製されたＣＨＯ-１９Ｐ２細胞株から特
異的にアラキドン酸代謝物の遊離を促進するペプチド
（Ｐ-２）のアミノ酸配列の決定を行った。逆相カラム
μＲＰＣ Ｃ２／Ｃ１８ ＳＣ ２.１／１０で活性と一致
したピークの画分を凍結乾燥後、７０％ ＣＨ₃ＣＮ ２
０μｌに溶解し、ペプチドシークエンサー（ＡＢＩ，４
９２）によるアミノ酸配列の分析を行った（配列番号：
４）。

【００８４】

【実施例１７】ウシ視床下部からの poly(Ａ)⁺ＲＮＡ画
分の調製およびｃＤＮＡの合成 ウシ１頭分の視床下部より Isogen（ニッポンジーン
社）により total ＲＮＡを調製後、FastTrack（Invitr
ogen社）を用いて poly(Ａ)⁺ＲＮＡ画分を調製した。次
にこの poly(Ａ)⁺ＲＮＡ画分１μｇから、３' ＲＡＣＥ
system（GIBCO BRL）および Marathon cDNA amplifica
tion kit（Clontech）により、マニュアルに従ってｃＤ
ＮＡを合成し、それぞれ２０および１０μｌに溶解し
た。

【００８５】

【実施例１８】実施例１４で明らかとなったアミノ酸配
列部分をコードするｃＤＮＡの取得 実施例１４で明らかとなったアミノ酸配列を含むポリペ
プチドをコードするｃＤＮＡを取得するため、まず配列
番号：１をコードする塩基配列の取得をめざした。そこ
でプライマーＰ５-１（配列番号：３５）、Ｐ３-１（配
列番号：３６）、Ｐ３-２（配列番号：３７）を合成し
た（配列表においてＩはイノシンを示す）。実施例１７
で３' ＲＡＣＥ system を用いて調製したｃＤＮＡ ０.
５μｌを鋳型として、ＤＮＡ polymerase としてＥＸＴ
aq（宝酒造）を用い、添付のバッファー２.５μｌ、ｄ
ＮＴＰ ２００μＭと、プライマーＰ５-１，Ｐ３-１を
それぞれ２００ｎＭとなるように加え水で２５μｌとし
て、９４℃・１分後、９８℃・１０秒、５０℃・３０
秒、６８℃・１０秒のサイクルを３０回繰り返した。こ
の反応液をトリシン・ＥＤＴＡバッファーで５０倍に希
釈したもの２.５μｌを鋳型として、プライマーをＰ５-
１とＰ３-２に組み合わせに換え、その他は同じ条件で
反応を行った。サーマルサイクラーは GeneAmp9600（パ
ーキンエルマー社）を用いた。増幅産物を４％アガロー
ス電気泳動、エチジウムブロマイド染色し約７０ｂｐ
のバンドを切り出し、熱融解、フェノール抽出、エタノ
ール沈殿した。回収したＤＮＡをＴＡクローニングキッ
ト（Invitrogen）のマニュアルに従い、プラスミドベク
ターｐＣＲ^TMIIへサブクローニングした。これを大腸菌
ＪＭ１０９に導入して、得られた形質転換体をアンピシ
リンを含むＬＢ培地で培養後、自動プラスミド抽出器
（クラボウ）でプラスミドを調製した。このプラスミド
を Dye Terminator Cycle Sequencing Kit（ＡＢＩ）で
マニュアルに従い反応し、蛍光自動ＤＮＡシーケンサー
（ＡＢＩ）により解読した。その結果〔図２４〕に示す
配列が得られ、これが配列番号：１をコードする塩基配
列の一部であることを確認した。

【００８６】

【実施例１９】実施例１８で明らかになった配列を用い
てのＲＡＣＥ法による生理活性ポリペプチドｃＤＮＡの
取得 まず５'側の配列を増幅する（５’ＲＡＣＥ）のために
〔図２４〕に示した配列を利用してＰＥ（配列番号：３
８）とＰＤＮ（配列番号：３９）の２本のプライマーを
合成した。実施例１７で Marathon cDNA amplification
kit により調製したｃＤＮＡをトリシン・ＥＤＴＡバ
ッファーで１００倍に希釈したもの２.５μｌを鋳型と
して、実施例２と同様の方法で反応液を調製し、キット
添付のアダプタープライマーＡＰ１とＰＥの組み合わせ
で、９４℃・１分後、９８℃・１０秒、６８℃・５分の
サイクルを３０回繰り返した。さらにこの反応液をトリ
シン・ＥＤＴＡバッファーで５０倍に希釈したもの２.
５μｌを鋳型として、プライマーをＡＰ１とＰＤＮの組
み合わせに換え、９４℃・１分後、９８℃・１０秒、７
２℃・５分のサイクルを４回、９８℃・１０秒、７０℃
・５分のサイクルを４回、９８℃・１０秒、６８℃・５
分のサイクルを２６回繰り返した。増幅産物を１.２％
アガロース電気泳動、エチジウムブロマイド染色し約１
５０ｂｐ のバンドを切り出し、遠心濾過チューブ（ミ
リポア社）で遠心濾過後、フェノール抽出、エタノール
沈殿した。回収したＤＮＡをＴＡクローニングキット
（Invitrogen）のマニュアルに従い、プラスミドベクタ
ーｐＣＲ^TMIIへサブクローニングした。これを大腸菌Ｊ
Ｍ１０９に導入して、得られた形質転換体を実施例１８
と同様の方法で挿入されたｃＤＮＡ断片の配列を解析し
た。その結果、〔図２５〕に示す配列が得られた。さら
にこの配列を基にプライマーＦＢ（配列番号：４０），
ＦＣ（配列番号：４１）を合成し、３'側の配列取得を
行った（３’ＲＡＣＥ）。鋳型は５’ＲＡＣＥと同じも
のを同量用い、キット添付のアダプタープライマーＡＰ
１とＦＣの組み合わせで、９４℃・１分後、９８℃・１
０秒、７２℃・５分のサイクルを５回、９８℃・１０
秒、７０℃・５分のサイクルを５回、９８℃・１０秒、
６８℃・５分のサイクルを２５回繰り返した。さらにこ
の反応液をトリシン・ＥＤＴＡバッファーで５０倍に希
釈したもの２.５μｌを鋳型として、プライマーを、や
はりキット添付のＡＰ２とＦＢの組み合わせに換え、９
４℃・１分後、９８℃・１０秒、７２℃・５分のサイク
ルを４回、９８℃・１０秒、７０℃・５分のサイクルを
４回、９８℃・１０秒、６８℃・５分のサイクルを２７
回繰り返した。増幅産物を１.２％アガロース電気泳
動、エチジウムブロマイド染色し約４００ｂｐ のバン
ドを切り出し、５’ＲＡＣＥのときと同様の方法でＤＮ
Ａを回収した。このＤＮＡ断片をプラスミドベクターｐ
ＣＲ^TMIIへサブクローニング後、大腸菌ＪＭ１０９に導
入して、得られた形質転換体に挿入されたｃＤＮＡ断片
の配列を解析した。５'および３’ＲＡＣＥの結果か
ら、配列番号：１に示した生理活性ポリペプチドの全コ
ード領域をコードするｃＤＮＡ配列〔図２６および図２
７〕を得た。具体的には、図２６および図２７におい
て、第１３４番目の塩基がＧのものであって、第１８４
番目の塩基がＴおよびＣのもの、第２４５番目の塩基が
ＴおよびＣのものが得られた。

【００８７】図２６および図２７に示したｃＤＮＡは９
８アミノ酸からなるポリペプチドをコードしていた。第
１から第２２番目のアミノ酸が疎水的なアミノ酸が集合
していることと実施例１４に示したように活性ペプチド
のＮ末端が第２３番目のSerから始まっていることを考
え合わせると、第１から２２番目のアミノ酸は分泌シグ
ナルの配列であると推定された。一方、ポリペプチドの
第５４番目から５７番目に存在するGlyArgArgArg配列は
生理活性ペプチドが切断される場合に存在する典型的な
アミノ酸配列モチーフであることが分かった。またこの
切断モチーフの場合にはGlyが存在するためしばしば生
成するペプチドのＣ末端はアミド化されることが知られ
ている。実施例１４のP-3のＮ末端配列および実施例１
６のP-2のＮ末端配列情報とこのGlyArgArgArg配列を考
え合わせるとこのｃＤＮＡにコードされるポリペプチド
から切り出されてくる生理活性ペプチドの少なくとも一
部は配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列
番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９
もしくは配列番号：１０であると考えられた。

【００８８】

【実施例２０】ＰＣＲ法によるウシ型生理活性ポリペプ
チドｃＤＮＡの全コード領域を含むＤＮＡ断片の取得 実施例１７で Marathon cDNA amplification kit によ
り調製したｃＤＮＡを鋳型として生理活性ポリペプチド
ｃＤＮＡの全コード領域を含むＤＮＡ断片の取得を行っ
た。まず実施例１９で明らかとなったｃＤＮＡの配列を
基に、配列番号：４２、配列番号：４３で表される塩基
配列を有するプライマーを２本合成した。 ＢＯＶＦ ５'-ＧＴＧＴＣＧＡＣＧＡＡＴＧＡＡＧＧＣＧＧＴＧＧ
ＧＧＧＣＣＴＧＧＣ-３'（配列番号：４２） ＢＯＶＲ（２４ｍｅｒ） ５'-ＡＧＧＣＴＣＣＣＧＣＴＧＴＴＡＴＴＣＣＴＧＧＡ
Ｃ-３'（配列番号：４３） ＢＯＶＦは生理活性ポリペプチドｃＤＮＡのスタートコ
ドンを含み、制限酵素ＳａｌＩ部位を付加した−２〜＋
２２（スタートコドンＡＴＧのＡを＋１とする）に対応
するセンス配列で、ＢＯＶＲは生理活性ポリペプチドｃ
ＤＮＡのストップコドンを含む＋２８５〜＋３０９に対
応するアンチセンス配列である。ＰＣＲ反応は実施例１
７で Marathon cDNA amplification kit により調製し
たｃＤＮＡをトリシン・ＥＤＴＡバッファーで１００倍
に希釈したもの２.５μｌを鋳型として、実施例２と同
様の方法で反応液を調製し、９４℃・１分後、９８℃・
１０秒、７２℃・５分のサイクルを３回、９８℃・１０
秒、７０℃・５分のサイクルを３回、９８℃・１０秒、
６８℃・５分のサイクルを２７回繰り返した。増幅産物
を２％アガロース電気泳動、エチジウムブロマイド染色
し約３２０ｂｐ のバンドを切り出し、実施例３と同様
の方法でＤＮＡを回収、プラスミドベクターｐＣＲ^TMII
へサブクローニングした。これを大腸菌ＪＭ１０９に導
入して、形質転換体エシェリヒア コリ(Escherichia c
oli)ＪＭ１０９／ｐＢＯＶ３を得た。得られた形質転換
体に挿入されたｃＤＮＡ断片の配列を解析した。その結
果このＤＮＡ断片は生理活性ポリペプチドｃＤＮＡの全
コード領域を含む断片であることが確認された。

【００８９】

【実施例２１】Ser-Arg-Ala-His-Gln-His-Ser-Met-Glu-
Ile-Arg-Thr-Pro-Asp-Ile-Asn-Pro-Ala-Trp-Tyr-Ala-Gl
y-Arg-Gly-Ile-Arg-Pro-Val-Gly-Arg-Phe-NH₂（１９Ｐ
２−Ｌ３１）の合成。 １）Ser(Bzl)-Arg(Tos)-Ala-His(Bom)-Gln-His(Bom)-Se
r(Bzl)-Met-Glu(OcHex)-Ile-Arg(Tos)-Thr(Bzl)-Pro-As
p(OcHex)-Ile-Asn-Pro-Ala-Trp(CHO)-Tyr(Br-Z)-Ala-Gl
y-Arg(Tos)-Gly-Ile-Arg(Tos)-Pro-Val-Gly-Arg(Tos)-P
he-pMBHA-resinの合成。 市販ｐ−メチルＢＨＡ樹脂（アプライド バイオシテム
ズ、現パ−キンエルマ−社製）0.71g(0.5 m mole)をペ
プチド合成機（アプライド バイオシテムズ社製４３０
Ａ）の反応器に入れ、ＤＣＭで膨潤させた後、最初のア
ミノ酸Boc-PheをHOBt/DCC法で活性化しｐ−メチルＢＨ
Ａ樹脂に導入した。樹脂を50%ＴＦＡ／ＤＣＭで処理
し、Boc基を除去してアミノ基を遊離させ、DIEAで中和
した。このアミノ基に次のアミノ酸Boc-Arg(Tos)をHOBt
/DCC法で縮合した。未反応アミノ基の有無をニンヒドリ
ンテストで調べ反応完了を確認後同様に、Boc-Gly、Boc-
Val、Boc-Pro、Boc-Arg(Tos)、Boc-Ile、Boc-Gly、Boc-Arg(T
os)、Boc-Gly、Boc-Ala、Boc-Tyr(Br-Z)を順次縮合、ニン
ヒドリンテストで縮合が不十分であると判明したBoc-Al
a、 Boc-Tyr(Br-Z)は再縮合し反応を完了した。樹脂を乾
燥して半量の樹脂を取り出した残りに、Boc-Trp(CHO)、B
oc-Ala、Boc-Pro、Boc-Asn、Boc-Ile、Boc-Asp(OcHex)、Boc-
Pro、Boc-Thr(Bzl)、Boc-Arg(Tos)、Boc-Ile、Boc-Glu(OcHe
x)、Boc-Met、Boc-Ser(Bzl)、Boc-His(Bom)、Boc-Gln、Boc-H
is(Bom)、Boc-Ala、Boc-Arg(Tos)、Boc-Ser(Bzl)を同様に
ニンヒドリンテストで十分な縮合が得られるまで再縮合
をくり返した。１９Ｐ２−Ｌ３１の全配列アミノ酸が導
入され樹脂を50%ＴＦＡ／ＤＣＭで処理し樹脂上のBoc基
を除去後、樹脂を乾燥し1.28gのペプチド樹脂を合成し
た。

【００９０】２）Ser-Arg-Ala-His-Gln-His-Ser-Met-Gl
u-Ile-Arg-Thr-Pro-Asp-Ile-Asn-Pro-Ala-Trp-Tyr-Ala-
Gly-Arg-Gly-Ile-Arg-Pro-Val-Gly-Arg-Phe-NH₂（１９
Ｐ２−Ｌ３１）の合成。 １）で得た樹脂をｐ−クレゾール3.8g、1、4-ブタンジチ
オ−ル１ml、弗化水素10mlと共にテフロン製弗化水素反
応装置中で０℃ ６０分間反応した。弗化水素、1、4-ブ
タンジチオ−ル１mlを減圧留去し、残留物にジエチルエ
ーテル100mlを加え撹袢後、グラスフィルター上に濾
取、乾燥した。これを50%酢酸水溶液50ml中に懸濁、撹
袢し、ペプチドを抽出した後樹脂と分離し減圧下に約５
mlまでに濃縮した後、セファデックスG-25（２ｘ９０ｃ
ｍ）のカラムに付し50%酢酸水で展開し114 ml〜181 ml
の画分を集め凍結乾燥し、１９Ｐ２−Ｌ３１を含む白色
粉末290 ｍｇを得た。これをLiChroprep RP-18（ＭＥＲ
ＣＫ社製）を充填した逆相系カラムにつけ0.1% ＴＦＡ
水と0.1% ＴＦＡ含有3０％アセトニトリル水溶液を用
いたグラジエント溶出での精製をくり返し、アセトニト
リル濃度２５％前後に溶出される部分を集め凍結乾燥
し、白色粉末７１ｍｇを得た。 質量分析による（Ｍ＋Ｈ）⁺ ３５７４．６４５ ＨＰＬＣ溶出時間 １８．２分 カラム条件 カラム： Wakosil ５Ｃ１８ （４．６ｘ１００ｍｍ） 溶離液：Ａ液（0.1% ＴＦＡ水） Ｂ液（0.1% ＴＦＡ含有５０％アセトニトリル水）を用い Ａ液からＢ液へ直線型濃度勾配溶出（２５分） 流速： 1.0 ｍｌ／分

【００９１】

【実施例２２】Ser-Arg-Ala-His-Gln-His-Ser-Met(O)-G
lu-Ile-Arg-Thr-Pro-Asp-Ile-Asn-Pro-Ala-Trp-Tyr-Ala
-Gly-Arg-Gly-Ile-Arg-Pro-Val-Gly-Arg-Phe-NH₂（１９
Ｐ２−Ｌ３１（Ｏ））の合成。 合成１９Ｐ２−Ｌ３１ ６ｍｇを５％−酢酸水溶液２０
ｍｌに溶解し３０％−過酸化水素水４０μｌを加えMet
部分のみを酸化し、反応終了後直ちにLiChroprep RP-18
（ＭＥＲＣＫ社製）を充填した逆相系カラムにつけて精
製し目的物 ５．８ｍｇをえた。 質量分析による（Ｍ＋Ｈ）⁺ ３５９０．５３１ ＨＰＬＣ溶出時間 １７．９分 カラム条件 カラム： Wakosil ５Ｃ１８ （４．６ｘ１００ｍｍ） 溶離液：Ａ液（0.1% ＴＦＡ水） Ｂ液（0.1% ＴＦＡ含有５０％アセトニトリル水）を用い Ａ液からＢ液へ直線型濃度勾配溶出（２５分） 流速： 1.0 ｍｌ／分

【００９２】

【実施例２３】Thr-Pro-Asp-Ile-Asn-Pro-Ala-Trp-Tyr-
Ala-Gly-Arg-Gly-Ile-Arg-Pro-Val-Gly-Arg-Phe-NH
₂（１９Ｐ２−Ｌ２０）の合成。 実施例２１の１）でBoc-Tyr(Br-Z)までを縮合した樹脂
にさらにBoc-Trp(CHO)、Boc-Ala、Boc-Pro、Boc-Asn、Boc-I
le、Boc-Asp(OcHex)、Boc-Pro、Boc-Thr(Bzl)を同様に縮合
し、 Boc-Thr(Bzl)-Pro-Asp(OcHex)-Ile-Asn-Pro-Ala-T
rp(CHO)-Tyr(Br-Z)-Ala-Gly-Arg(Tos)-Gly-Ile-Arg(To
s)-Pro-Val-Gly-Arg(Tos)-Phe-pMBHA-resin１．１４ｇ
を得た。これを実施例２１の２）と同様に弗化水素処
理、カラム精製し、白色粉末６０ｍｇを得た。 質量分析による（Ｍ＋Ｈ）⁺ ２２４２．１４９ ＨＰＬＣ溶出時間 １０．４分 カラム条件 カラム： Wakosil ５Ｃ１８ （４．６ｘ１００ｍｍ） 溶離液：Ａ液（0.1% ＴＦＡ含有１５％アセトニトリル水） Ｂ液（0.1% ＴＦＡ含有４５％アセトニトリル水）を用い Ａ液からＢ液へ直線型濃度勾配溶出（１５分） 流速： 1.0 ｍｌ／分

【００９３】

【実施例２４】合成ペプチド（１９Ｐ２−Ｌ３１）によ
るアラキドン酸代謝物遊離活性の測定 実施例１１と同様に、実施例２１で合成されたペプチド
（１９Ｐ２−Ｌ３１）によるＣＨＯ−１９Ｐ２細胞株か
らの特異的なアラキドン酸代謝物の遊離を測定した。合
成ペプチドは、脱気処理した蒸留水に１０^-3Ｍの濃度で
溶解し、０．０５％ＢＳＡを含むＨＢＳＳで希釈して、
それぞれの濃度におけるＣＨＯ−１９Ｐ２細胞株からの
アラキドン酸代謝物の遊離を［³Ｈ］アラキドン酸代謝
物の量を指標に測定した。その結果、１０^-12Ｍ〜１０
^-6Ｍで濃度依存的なアラキドン酸代謝物遊離の活性が検
出された〔図２８〕。さらに、実施例２２で合成された
１９Ｐ２−Ｌ３１のメチオニン酸化体であるペプチド１
９Ｐ２−Ｌ３１（Ｏ）について１９Ｐ２−Ｌ３１とのア
ラキドン酸代謝物遊離活性の比較を行った結果、〔図２
９〕に示すように１９Ｐ２−Ｌ３１（Ｏ）は１９Ｐ２−
Ｌ３１と同等の活性を示すことが分かった。

【００９４】

【実施例２５】合成ペプチド（１９Ｐ２−Ｌ２０）によ
るアラキドン酸代謝物遊離活性の測定 実施例１１と同様に、実施例２３で合成された天然品Ｐ
−２に相当するペプチド（１９Ｐ２−Ｌ２０）によるＣ
ＨＯ−１９Ｐ２細胞株からの特異的なアラキドン酸代謝
物の遊離を測定した。合成ペプチドは、脱気処理した蒸
留水に１０^-3Ｍの濃度で溶解し、０．０５％ＢＳＡを含
むＨＢＳＳで希釈して、それぞれの濃度におけるＣＨＯ
−１９Ｐ２細胞株からのアラキドン酸代謝物の遊離を［
³Ｈ］アラキドン酸代謝物の量を指標に測定した。その
結果、１０^-12〜１０^-6Ｍで濃度依存的なアラキドン酸
代謝物遊離の活性が１９Ｐ２−Ｌ３１とほぼ同程度に検
出された〔図３０〕。

【００９５】

【実施例２６】ウシゲノムＤＮＡにおけるコード領域の
塩基配列の解析 pBOV3を制限酵素EcoRIで消化し、アガロースゲル電気泳
動で分離した後、cDNA断片部分のDNAを回収してプローブ
を調製した。これをマルチプライムＤＮＡラベリングキ
ット（アマシャム社）を用いて³²Ｐ標識した。クローニ
ングベクターEMBL3 SP6/T7を用いて構築したBovine Gen
omic Library (CLONTECH社 BL1015j)の約2.0x10⁶個のフ
ァージを大腸菌K802を宿主としてＬＢ寒天培地プレート
に播種し、一晩培養してプラークを形成させた。これを
ニトロセルロースフィルターに転写し、アルカリ変性、
中和処理を行った後、熱処理（80℃、2時間)によってＤ
ＮＡを固定化した。このフィルターを５０％ホルムアミ
ドを含むハイブリバッファー（50％formamide、5×Denh
ardt's溶液、4×SSPE、0.1mg/ml Salmon spermＤＮＡ、
0.1%SDS)中で標識プローブと４２℃で一晩インキュベー
ションし、ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーシ
ョン後のフィルターを室温で２×SSC、0.1%SDS中で１．
５時間洗浄した後、さらに５５℃の同バッファー中で３
０分間洗浄した。プローブとハイブリダイズするクロー
ンの検出は、コダック社のＸ線フィルム(X-OMAT^TMAR)と
増感スクリーンを用い、−８０℃で４日間の露光によっ
て行った。Ｘ線フィルムを現像した後、フィルムとプレ
ートの位置を対応させながらハイブリダイズしている部
分のファージを回収した。さらに上記の方法によって再
プレーティングとハイブリダイゼーションを繰り返して
行い、ファージのクローン化を行った。クローン化した
ファージをプレートライセート法によって大量に調製
し、ファージＤＮＡを抽出した後、ベクターのクローニ
ングサイトの両端に存在する制限酵素SalIおよびBamHI
切断部位で切断してウシゲノムDNA由来の挿入断片の検
出を１．２％アガロースゲル電気泳動によって行った
〔図３１〕。その結果、BamHI消化では３本の断片がフ
ァージ由来のバンドの他に検出された。また、SalI消化
ではファージ由来のバンドに重なって１本のバンドが検
出された。SalI消化断片が全長を保持していると考え、
この断片をプラスミドベクターにサブクローニングする
ために、SalI消化後にBAP(大腸菌由来のアルカリフォス
フォターゼ）処理したプラスミドベクターpUC18（ファ
ルマシア社）とライゲーション反応を行い、大腸菌JM10
9に導入した。この菌からゲノム由来のSalI断片が挿入
されたプラスミドＤＮＡを大量に調製し、パーキンエル
マー・アプライドバイオシステムズ社の370A蛍光式シー
ケンサーおよび同社のキットを用いてコード領域付近の
塩基配列の解析を行った。その結果、〔図３２〕に示す
ような配列が得られた。ｃＤＮＡのコード領域と比較す
ると、ゲノムＤＮＡ由来であるために472bpのイントロ
ンによってコード領域が２つに分割されている〔図３
３〕および〔図３４〕。〔図３５〕および配列番号：４
４には、このウシのゲノムのコード領域（イントロン部
分を除いたもの）から推定されるアミノ酸配列を示す。

【００９６】

【実施例２７】ラット延髄背側部poly(Ａ)⁺ＲＮＡ画分
の調製およびｃＤＮＡの合成 ラットの延髄背側部よりIsogen（ニッポンジーン社）に
よりtotal ＲＮＡを調製後、FastTrack（Invitrogen
社）を用いてpoly(Ａ)⁺ＲＮＡ画分を調製した。次にこ
のpoly(Ａ)⁺ＲＮＡ ５μｇにプライマーとしてランダム
ＤＮＡヘキサマー（ＢＲＬ社）を加え、モロニーマウス
白血病の逆転写酵素（ＢＲＬ社）により、添付バッファ
ーを用いて相補ＤＮＡを合成した。反応後の産物はエタ
ノール沈殿を行った後、１２μｌの蒸留水に溶解した。
またこのpoly(Ａ)⁺ＲＮＡ １μｇから、Marathon ｃＤ
ＮＡ amplification kit（Clontech）により、マニュア
ルに従ってｃＤＮＡを合成し、１０μｌに溶解した。

【００９７】

【実施例２８】ＲＡＣＥ法によるラット型生理活性ポリ
ペプチドのｃＤＮＡの取得 ラット型生理活性ポリペプチドｃＤＮＡの全コード領域
を取得するため、ウシ型を取得した方法に準じて実験を
行った。まず実施例１８で使用したプライマーＰ５−１
（配列番号：３５）、Ｐ３−１（配列番号：３６）をプ
ライマーとし、鋳型には実施例２７でプライマーとして
ランダムＤＮＡヘキサマー（ＢＲＬ社）を加え、モロニ
ーマウス白血病の逆転写酵素（ＢＲＬ社）により合成し
た相補ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。反応液は鋳
型ｃＤＮＡを１.２５μｌ、ｄＮＴＰ２００μＭ，プラ
イマーを各１μＭ，ＤＮＡ polymeraseとしてExTaq（宝
酒造）を用い、添付のバッファー２.５μｌを加えて、
さらに水で全量を２５μｌとした。反応は９４℃・１分
後、９８℃・１０秒、５０℃・３０秒、７２℃・５秒の
サイクルを４０回繰り返した後、７２℃で２０秒放置し
た。サーマルサイクラーはGeneAmp2400（パーキンエル
マー社）を用いた。増幅産物を４％アガロース電気泳
動、エチジウムブロマイド染色し約８０ｂｐのバンドを
切り出し、実施例１９に示した方法でＤＮＡを回収、プ
ラスミドベクターｐＣＲ^TMIIへサブクローニング、大腸
菌ＪＭ１０９へ導入し挿入されたｃＤＮＡ断片の配列を
解析した。その結果ラット型生理活性ポリペプチドの部
分配列を得ることができた。この配列を基に３' ＲＡＣ
Ｅ用にＲＡ（配列番号：７５），５' ＲＡＣＥ用にＲＣ
（配列番号：７６）の２本のプライマーを合成し、５'
および３' ＲＡＣＥを行った。 ＲＡ：５'−ＣＡＲＣＡＹＴＣＣＡＴＧＧＡＧＡＣＡＡ
ＧＡＡＣＣＣＣ−３'（ここでＲはＡまたはＧ、ＹはＴ
またはＣを示す。）（配列番号：７５） ＲＣ：５'−ＴＡＣＣＡＧＧＣＡＧＧＡＴＴＧＡＴＡＣ
ＡＧＧＧＧ−３'（配列番号：７６） 鋳型は実施例２７でMarathon ｃＤＮＡ amplification
kit（Clontech）により合成したものを添付のトリシン
−ＥＤＴＡバッファーで４０倍に希釈したもの２.５μ
ｌを使用した。プライマーには３' ＲＡＣＥにはＲＡと
キット付属のアダプタープライマーＡＰ１を、また５'
ＲＡＣＥにはＲＣとＡＰ１をそれぞれ用いたほかは上記
と同様に反応液を調製した。反応条件は９４℃・１分
後、９８℃・１０秒、７２℃・４５秒のサイクルを５
回、９８℃・１０秒、７０℃・４５秒のサイクルを３
回、９８℃・１０秒、６８℃・４５秒のサイクルを４０
回繰り返した。その結果３' ＲＡＣＥからは約４００ｂ
ｐ、５' ＲＡＣＥからは約４００ｂｐと２５０ｂｐのバ
ンドが得られた。これらを上記と同様の方法で回収し、
これらを鋳型として反応に用いたプライマーでDye Term
inator Cycle SequencingKit（ＡＢＩ）により反応し配
列を解析した。その結果５'ノンコーディング領域と推
定される部分からpolyＡまでの配列を得ることができ
た。

【００９８】

【実施例２９】ＰＣＲによるラット型生理活性ポリペプ
チドの全長ｃＤＮＡの取得 実施例２８で得られた配列を基に開始コドンを含む領域
にｒＦ（配列番号：７７）、また終止コドンより３'側
にｒＲ（配列番号：７８）の２本のプライマーを合成し
全長ｃＤＮＡを含む断片を増幅することとした。 ｒＦ：５'−ＧＧＣＡＴＣＡＴＣＣＡＧＧＡＡＧＡＣＧ
ＧＡＧＣＡＴ−３'（配列番号：７７） ｒＲ：５'−ＡＧＣＡＧＡＧＧＡＧＡＧＧＧＡＧＧＧＴ
ＡＧＡＧＧＡ−３'（配列番号：７８） 実施例２７でモロニーマウス白血病の逆転写酵素を用い
て調製したｃＤＮＡを鋳型とし、ExTaq（宝酒造）を用
いて、９５℃・３０秒、６８℃・６０秒のサイクルを４
０回繰り返してＰＣＲを行った。増幅産物をアガロース
電気泳動、エチジウムブロマイド染色し約３５０ｂｐの
バンドを切り出し、実施例１９に示した方法でＤＮＡを
回収、プラスミドベクターｐＣＲ^TMIIへサブクローニン
グ、大腸菌ＪＭ１０９へ導入した。生じた形質転換体か
らプラスミドを抽出し、塩基配列を決定した結果、ラッ
ト型生理活性ポリペプチドの全長ｃＤＮＡを保有するE.
coli ＪＭ１０９／ｐＲＡＶ３を得た〔図３６〕。

【００９９】

【実施例３０】ヒト Brain poly(Ａ)⁺ＲＮＡ画分からの
ｃＤＮＡの合成 ヒト Brain poly(Ａ)⁺ＲＮＡ画分（Clontech）１μｇか
ら、Marathon ｃＤＮＡ amplification kit（Clontec
h）により、マニュアルに従ってｃＤＮＡを合成し、１
０μｌに溶解した。また同poly(Ａ)⁺ＲＮＡ画分５μｇ
にプライマーとしてランダムＤＮＡヘキサマー（ＢＲＬ
社）を加え、モロニーマウス白血病の逆転写酵素（ＢＲ
Ｌ社）により、添付バッファーを用いて相補ＤＮＡを合
成した。反応後の産物はエタノール沈殿を行った後、３
０μｌのＴＥに溶解した。

【０１００】

【実施例３１】ＲＡＣＥ法によるヒト型生理活性ポリペ
プチドのｃＤＮＡの取得 実施例２８で明らかになったラット型生理活性ポリペプ
チドのアミノ酸配列から〔図３７〕および〔図３８〕に
示したように特にラット型とウシ型で保存性の高かった
領域を選び以下のＲ１（配列番号：７９）、Ｒ３（配列
番号：８０ ）、Ｒ４（配列番号：８１）の３本のプラ
イマーを合成し、ヒトのｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを
することによりこれらに挟まれた領域の増幅を試みた。
ここで、図３７および図３８においてbovine.aaはウシ
型ポリペプチドのアミノ酸配列、bovine.seqはウシ型ポ
リペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列、rat.seqは
ラット型ポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列を
示す。 Ｒ１：５’−ＡＣＧＴＧＧＣＴＴＣＴＧＴＧＣＴＴＧＣ
ＴＧＣ−３’（配列番号：７９） Ｒ３：５’−ＧＣＣＴＧＡＴＣＣＣＧＣＧＧＣＣＣＧＴ
ＧＴＡＣＣＡ−３’（配列番号：８０） Ｒ４：５’−ＴＴＧＣＣＣＴＴＣＴＣＣＴＧＣＣＧＡＡ
ＧＣＧＧＣＣＣ−３’（配列番号：８１） 実施例３０でMarathon ｃＤＮＡ amplification kit（C
lontech）により調製したｃＤＮＡをトリシン−ＥＤＴ
Ａバッファーで３０倍に希釈したもの２.５μｌを鋳型
として使用した。反応液はｄＮＴＰ２００μＭ，プライ
マーをＲ１とＲ４を各０.２μＭ，Taq Start Antibody
（Clontech）と等量混合したＤＮＡ polymerase ExTaq
（宝酒造）を用い、添付のバッファー２.５μｌを加え
て、さらに水で全量を２５μｌとした。反応は９４℃・
１分後、９８℃・１０秒、６８℃・４０秒のサイクルを
４２回繰り返した後、７２℃で１分間放置した。さらに
この反応液をトリシン−ＥＤＴＡバッファーで１００倍
に希釈したもの１μｌを鋳型として、プライマーの組み
合わせをＲ１とＲ３に変えた以外は上記と同様の反応液
を調製して９４℃・１分後、９８℃・１０秒、６８℃・
４０秒のサイクルを２５回繰り返した。増幅産物を４％
アガロース電気泳動、エチジウムブロマイド染色したと
ころ、期待される約１３０ｂｐのバンドが得られたた
め、これを実施例２８と同様の方法で回収し、その回収
した断片を鋳型として、Dye Terminator Cycle Sequenc
ing Kit（ＡＢＩ）を用いて反応し配列を解析した結
果、ヒト型生理活性ポリペプチドの部分配列を得ること
ができた。そこでこの配列を基に３'ＲＡＣＥ用にプラ
イマーＨＡ（配列番号：８２），ＨＢ（配列番号：８
３）を、５' ＲＡＣＥ用にプライマーＨＥ（配列番号：
８４），ＨＦ（配列番号：８５）を合成し、５'および
３' ＲＡＣＥを行った。

【０１０１】ＨＡ：５'−ＧＧＣＧＧＧＧＧＣＴＧＣＡ
ＡＧＴＣＧＴＡＣＣＣＡＴＣＧ−３'（配列番号：８
２） ＨＢ：５'−ＣＧＧＣＡＣＴＣＣＡＴＧＧＡＧＡＴＣＣ
ＧＣＡＣＣＣＣＴ−３'（配列番号：８３） ＨＥ：５'−ＣＡＧＧＣＡＧＧＡＴＴＧＡＴＧＴＣＡＧ
ＧＧＧＴＧＣＧＧ−３'（配列番号：８４） ＨＦ：５'−ＣＡＴＧＧＡＧＴＧＣＣＧＡＴＧＧＧＴＡ
ＣＧＡＣＴＴＧＣ−３'（配列番号：８５） 鋳型は実施例３０で調製したものをトリシン−ＥＤＴＡ
バッファーで２０倍に希釈したもの２.５μｌを使用し
た。１回目のＰＣＲは３' ＲＡＣＥにはＨＡとアダプタ
ープライマーＡＰ１を、５' ＲＡＣＥにはＨＥとＡＰ１
を用いこれまでと同様に反応液を調製した。反応条件は
９４℃・１分後、９８℃・１０秒、７２℃・３５秒のサ
イクルを５回、９８℃・１０秒、７０℃・３５秒のサイ
クルを５回、９８℃・１０秒、６８℃・３５秒のサイク
ルを４０回繰り返した。さらにこの反応液をトリシン−
ＥＤＴＡバッファーで１００倍に希釈したもの１μｌを
鋳型として、１回目の反応サイクルと同じサイクルで２
回目のＰＣＲを行った。ただし３' ＲＡＣＥはプライマ
ーをＨＢとＡＰ１に、５' ＲＡＣＥはＨＦとＡＰ２に変
え、またＤＮＡ polymeraseとしてKlen Taq(Clontech)
を使用し、添付のバッファーで反応液を調製した。その
結果、３' ＲＡＣＥでは約２５０ｂｐのバンドまた５'
ＲＡＣＥでは約１５０ｂｐのバンドが得られ、これらを
上記と同様の方法で配列を読み、先に得られた部分配列
と併せてヒト型生理活性ポリペプチドの、５'ノンコー
ディング領域と推定される部分からpolyＡまでの配列を
得ることができた。

【０１０２】

【実施例３２】ＰＣＲ法によるヒト型生理活性ポリペプ
チドの全長ｃＤＮＡの取得 実施例３１で得られた配列を基に５Ｈ（配列番号：８
６）と３ＨＮ（配列番号：８７）の２本のプライマーを
合成し全長ｃＤＮＡを含む断片を増幅することとした。 ５Ｈ：５'−ＧＧＣＣＴＣＣＴＣＧＧＡＧＧＡＧＣＣＡ
ＡＧＧＧＡＴＧＡ−３'（配列番号：８６） ３ＨＮ：５'−ＧＧＧＡＡＡＧＧＡＧＣＣＣＧＡＡＧＧ
ＡＧＡＧＧＡＧＡＧ−３'（配列番号：８７） 実施例３０でモロニーマウス白血病の逆転写酵素（ＢＲ
Ｌ社）を用いて調製したｃＤＮＡ２.５μｌを鋳型と
し、Klen Taq ＤＮＡ polymerase（Clontech）を用いた
反応液で、９４℃・１分後、９８℃・１０秒、６８℃・
３０秒のサイクルを４０回繰り返した。得られた約３６
０ｂｐの断片を実施例２９と同様の方法で、回収、サブ
クローニング（ただし、ベクターはｐＣＲ^TM２.１を用
いた。）、プラスミド回収し、塩基配列を決定した結
果、ヒト型生理活性ポリペプチドの全長ｃＤＮＡを保有
するE. coli ＪＭ１０９／ｐＨＯＶ７を得た〔図３
９〕。またこのヒト型生理活性ポリペプチドと実施例２
０に示したウシ型、および実施例２９に示したラット型
の翻訳領域についてアミノ酸配列を比較した〔図４
０〕。

【０１０３】

【実施例３３】 （１）ＵＨＲ−１発現ＣＨＯ細胞の作製 最近、Susan K. Welchらによってラット視交叉上核より
オーファンレセプターであるＵＨＲ−１がクローニング
されている（Biochemical and Biophysical Research C
ommunications, Vol.209, No.2, pp.606-613, 1995）。
本発明者らは、この報告をもとにＵＨＲ−１遺伝子によ
りコードされる蛋白質のアミノ酸配列とｈＧＲ３により
コードされる蛋白質のアミノ酸配列の比較を行った。そ
の結果、両者は３５９アミノ酸にわたり９１.６％のア
イデンティティーを有することから、ＵＨＲ−１はｐｈ
ＧＲ３のホモログであることが推定された。ＵＨＲ−１
によりコードされる蛋白が１９Ｐ２−Ｌ３１のレセプタ
ーとして機能することを確認するために以下に述べるよ
うに、本発明者らはＵＨＲ−１ ｃＤＮＡをクローニン
グし、それをＣＨＯ細胞に導入して安定的な発現細胞株
を作製した。ラットの下垂体前葉からＦａｓｔ Ｔｒａ
ｃｋ^TM ｋｉｔ（Invitrogen社）を用いて抽出した poly
(Ａ)⁺ＲＮＡを調製した。次に、得られた poly(Ａ)⁺Ｒ
ＮＡ０.２μgを鋳型とし、ＴａＫａＲａ ＲＮＡ ＰＣＲ
ｋｉｔ（宝酒造）を用いて全量４０μｌの反応スケー
ルでｃＤＮＡを合成した。反応産物は、フェノール：ク
ロロホルム（１：１）で抽出し、エタノール沈澱を行っ
た後、１０μｌの蒸留水に溶解した。既知のラット・Ｕ
ＨＲ−１ ｃＤＮＡの塩基配列(GenBank, Accession Nu
mber Ｓ７７８６７）をもとに、以下に示す２種の合成
ＤＮＡプライマーを作成した。 （１）５'−ＧＴＴＣＡＣＡＧ（ＧＴＣＧＡＣ）ＡＴＧ
ＡＣＣＴＣＡＣ−３'（括弧内はＳａｌＩ認識配列を示
す） （配列番号：９５） （２）５’−ＣＴＣＡＧＡ（ＧＣＴＡＧＣ）ＡＧＡＧＴ
ＧＴＣＡＴＣＡＧ−３’（括弧内はＮｈｅＩ認識配列を
示す） （配列番号：９６） 上記のプライマー（１）と（２）を一組として用いて、
上述の方法で合成したｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行
った。反応には、調製したｃＤＮＡ溶液を５倍に希釈し
たものを５μｌ、Ex Taq（宝酒造）とTaq Start Antibo
dy（クロンテック）を１：１で混合したものを１μｌ、
Ex Taqに添付の１０×反応バッファーを５μｌおよびｄ
ＮＴＰを４μｌ、５０μＭの濃度に調製したプライマー
を各１μｌ使用し、蒸留水にて液量を５０μｌに調製し
た。

【０１０４】ＰＣＲは、９５℃・２分ののち、９５℃・
３０秒、６５℃・３０秒、７２℃・１分の３ステップを
１サイクルとして２７回繰り返して行い、その後に７２
℃・７分の伸長反応を加えた。反応終了後に、反応液の
一部を用いてアガロースゲル電気泳動を行った。エチジ
ウムブロマイド染色し約１.１ｋｂｐのバンドを切り出
し、遠心濾過チューブ（ミリポア社）で遠心濾過し、フ
ェノール抽出次いでエタノール沈澱を行ってＤＮＡを回
収した。回収したＤＮＡをＴＡクローニングキット（In
vitrogen社）のマニュアルに従い、プラスミドベクター
ｐＣＲ^TMIIへサブクローニングし（以下、ｐＣＲII−Ｕ
ＨＲ−１と称する）、大腸菌ＪＭ１０９に導入し、得ら
れた形質転換体をアンピシリンを含むＬＢ培地で培養
後、自動プラスミド抽出器（クラボウ社）でプラスミド
を得た。このプラスミドをABI PRISM Dye Terminator C
ycle Sequencing kit，FS（パーキンエルマー社）を用
い、マニュアルに従い反応させ、塩基配列を蛍光自動Ｄ
ＮＡシーケンサー（ＡＢＩ社）により解読した。塩基配
列の解析の結果、ＰＣＲによって入手したｃＤＮＡ断片
は１１１６ｂｐから成ることが確認された〔図５７〕お
よび〔図５８〕。〔図５７〕および〔図５８〕は、発現
ベクターｐＡＫＫＯ−ＵＨＲ−１上で構築されたラット
・ＵＨＲ−１の完全なコード領域の塩基配列と、それに
コードされるアミノ酸配列を示す。図中、アンダーライ
ンを付したprimer(1),(2)は、それぞれのプライマー配
列の一部に相当する部分を示す。また、二重線は公知の
塩基配列と異なる部分を示す（６６４番目のＣ、８６５
番目のＧ、８９７番目のＧ）。ここで、公知の塩基配列
はデータバンクGenBank Accession No. Ｓ７７８６７を
引用したものである。

【０１０５】これらの塩基置換のうち、一つは²⁸⁹Ｌｅ
ｕ（ＣＴＣ）→²⁸⁹Ｖａｌ（ＧＴＣ）のアミノ酸置換を
伴うものであった。ＵＨＲ−１発現ベクターの構築は以
下の様にして行った。ｐＣＲII−ＵＨＲ−１を制限酵素
ＮｈｅＩ（宝酒造）およびＳａｌＩ（宝酒造）で切断し
た。切断したサンプルをアガロースゲル電気泳動した後
エチジウムブロマイド染色し、そのバンド部分をカミソ
リで切り出した。このゲル断片をフィルター付き遠心チ
ューブ（ミリポア）に入れ、冷凍庫内で凍結、その後に
室温にて融解させた後、チューブを８０００回転で１分
間遠心して、フィルターの下部にＤＮＡ断片を含む溶液
を溶出させた。この溶液を、定法に従ってフェノール抽
出、フェノール・クロロホルム（１：１）抽出、ジエチ
ルエーテル抽出して不純物を除去した後、エタノール沈
澱によってＤＮＡを沈澱させｃＤＮＡ断片を得た。ｐＡ
ＫＫＯ−１１１Ｈを制限酵素ＮｈｅＩ（宝酒造）および
ＳａｌＩ（宝酒造）で切断した後、上述と同様の方法に
よりベクター部分をアガロースゲルから分離、抽出し
た。こうして得られたｃＤＮＡ断片とｐＡＫＫＯ−１１
１Ｈの制限酵素消化物をライゲーション・システム（宝
酒造）を用い、１６℃で３０分反応させた。ライゲーシ
ョン反応産物の一部を用いて、大腸菌ＪＭ１０９を形質
転換させ、形質転換体Escherichia coli ＪＭ１０９／
ｐＡＫＫＯ−ＵＨＲ−１を得た。得られた形質転換体Es
cherichia coli ＪＭ１０９／ｐＡＫＫＯ−ＵＨＲ−１
をアンピシリン（５０μg/ml）を含むＬＢ培地２ml中で
一晩培養し、プラスミド自動抽出装置（クラボウ社）に
よってプラスミドＤＮＡ（ｐＡＫＫＯ−ＵＨＲ−１）を
調製した。蛍光式シーケンサーを用いて、ｃＤＮＡ断片
とｐＡＫＫＯ−１１１Ｈの連結部位の塩基配列を解析
し、発現ベクターｐＡＫＫＯ−ＵＨＲ−１の構築が完了
したことを確認した。

【０１０６】（２）ＣＨＯｄｈｆｒ^-細胞へのＵＨＲ−
１発現ベクターの導入 直径１０cmの組織培養用シャーレに１×１０⁶個のＣＨ
Ｏｄｈｆｒ^-細胞を播種し、２４時間培養した。（１）
で得られたＵＨＲ−１発現ベクターｐＡＫＫＯ−ＵＨＲ
−１を２０μｇ用い、リポソーム法による遺伝子導入キ
ット（ジーントランスファー、ニッポンジーン社）を用
いて、ＤＮＡ・リポソームの複合体を形成させた。培地
を新鮮なものに交換し、これにＤＮＡ・リポソームの複
合体を添加して一晩インキュベートした。培地を新鮮な
ものと交換してさらに１日間培養した後、形質転換体選
択用の培地に交換して２日間培養した。さらに、トリプ
シン−ＥＤＴＡ処理によってシャーレ内の細胞を回収
し、細胞密度が希薄な状態にて再培養を行うことによっ
て、形質転換体の割合の増加を図った。これにより、Ｕ
ＨＲ−１を安定に高発現する細胞株ＣＨＯ−ＵＨＲ−１
のクローンを得た。

【０１０７】

【実施例３４】１９Ｐ２−Ｌ３１の¹²⁵Ｉによる標識お
よび標識体を用いたレセプター結合実験 １９Ｐ２−Ｌ３１のヨードラベル化は〔¹²⁵Ｉ〕−Bolto
n−Hunter Reagent（NEN/DuPont；NEX-120）を用いて行
った。まず、〔¹²⁵Ｉ〕−Bolton−Hunter Reagent（２
２００Ci/mmol）２００μlを５００μlエッペンドルフ
チューブに移し、窒素ガスにて完全に乾燥させた。アセ
トニトリル２μlにて再溶解し、さらに５０mMリン酸バ
ッファーｐＨ８.０ ４μl、合成１９Ｐ２−Ｌ３１ ３×
１０^-4Ｍ４μlを加え、混和し、室温にて４０分間反応
させた。反応後、１.０Ｍグリシン５μlを加えて反応を
停止し、反応液全量を逆相カラム（TOSO；TSKgel ODS−
80TMCTP）にかけ、〔¹²⁵Ｉ〕標識１９Ｐ２−Ｌ３１（〔
¹²⁵Ｉ〕−１９Ｐ２−Ｌ３１）を分離した。〔¹²⁵Ｉ〕−
１９Ｐ２−Ｌ３１を含む画分は、２倍量の５０mM Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７.５、０.１％ＢＳＡ、０.０５％Ｃ
ＨＡＰＳにて希釈し、少量ずつ分注の後、−２０℃にて
保存した。

【０１０８】レセプター結合実験ではレセプター発現Ｃ
ＨＯ細胞としてＣＨＯ−１９Ｐ２−９、ＣＨＯ−ＵＨＲ
−１およびｍｏｃｋ ＣＨＯを用いた。ＣＨＯ−１９Ｐ
２−９細胞はＣＨＯ−１９Ｐ２細胞を９６穴マイクロプ
レートを用いた限界希釈法により、１９Ｐ２−Ｌ３１に
よるアラキドン酸代謝物の遊離促進反応がより強いクロ
ーンとして選択したものである。ｍｏｃｋ ＣＨＯ細胞
は、発現ベクターｐＡＫＫＯ単独でトランスフォームし
たコントロール細胞である。組織培養用フラスコで培養
したこれらの細胞を５mM ＥＤＴＡ／ＰＢＳにて剥離
し、０.０５％ＢＳＡ、０.０５％ＣＨＡＰＳを含むＨＢ
ＳＳに０.５×１０⁷cells/mlとなるよう再懸濁した。こ
の細胞浮遊液１００μlに、〔¹²⁵Ｉ〕−１９Ｐ２−Ｌ３
１を２００pMとなるように、さらに一部の細胞浮遊液に
はＮＳＢ（non specific binding；非特異的結合）とし
て１９Ｐ２−Ｌ３１を２００nMとなるように追加し、室
温にて２.５時間反応させた。反応後、ガラスフィルタ
ーＧＦ／Ｆ（Wattman）を用いて、Ｂ／Ｆ分離を行い、
フィルターにトラップされたカウントをレセプター結合
量としてγ−カウンターにて測定した。〔図４１〕に
は、生細胞における〔¹²⁵Ｉ〕−１９Ｐ２−Ｌ３１を用
いたレセプター結合実験の結果を示す。細胞浮遊液０.
５×１０⁷cells/ml １００μlに〔¹²⁵Ｉ〕−１９Ｐ２−
Ｌ３１を２００pMとなるように加え、室温２.５時間の
反応でレセプターに結合した〔¹²⁵Ｉ〕−１９Ｐ２−Ｌ
３１の量および非特異的結合量をγ−カウンターで測定
した。実験はtriplicateで行い、その平均値および標準
偏差を示した。ｈＧＲ３とＵＨＲ−１を発現させたＣＨ
Ｏ細胞において、〔¹²⁵Ｉ〕−１９Ｐ２−Ｌ３１の特異
的結合が観察された。これらの結果はｈＧＲ３およびＵ
ＨＲ−１によってコードされる蛋白質が１９Ｐ２−Ｌ３
１の特異的なレセプターとして機能していることを示し
ている。

【０１０９】

【実施例３５】１９Ｐ２−Ｌ３１によるＣＨＯ−１９Ｐ
２−９およびＣＨＯ−ＵＨＲ１からの特異的なアラキド
ン酸代謝物の遊離促進 実施例１１と同様の方法でＣＨＯ−１９Ｐ２−９、ＣＨ
Ｏ−ＵＨＲ１およびｍｏｃｋ ＣＨＯにおける１９Ｐ２
−Ｌ３１によるアラキドン酸代謝物遊離活性を測定し
た。〔図４２〕にはＣＨＯ−１９Ｐ２−９およびＣＨＯ
−ＵＨＲ１における１９Ｐ２−Ｌ３１によるアラキドン
酸代謝物遊離活性の測定結果を示す。実験はduplicate
で行い、その平均値を示した。ＵＨＲ１を発現させたＣ
ＨＯ細胞でも、ＣＨＯ−１９Ｐ２−９と同様の１９Ｐ２
−Ｌ３１によるアラキドン酸代謝物遊離の活性が確認さ
れた。これらの結果はＵＨＲ−１によってコードされる
蛋白質がｈＧＲ３と同様に１９Ｐ２−Ｌ３１の特異的な
レセプターとして機能していることを示している。

【０１１０】

【実施例３６】ＲＴ−ＰＣＲによるラット組織のリガン
ドポリペプチドおよびラット型Ｇ蛋白質共役型レセプタ
ー（ＵＨＲ−１）の発現定量 （１）ラットの組織からの poly(Ａ)⁺ＲＮＡ調製 ８週齢のラット（♂）より各種組織の poly(Ａ)⁺ＲＮＡ
を、Ｉｓｏｇｅｎ（Nippon gene）による total ＲＮＡ
調製に引き続き、オリゴｄＴセルロースカラム（Pharma
cia）を用いて約５〜３０μg調製した。poly(Ａ)⁺ＲＮ
Ａ画分中の genome ＤＮＡを完全に除くため、ＤＮａｓ
ｅＩ（Gibco BRL. amplification grade）を１ユニット
用いて室温でＤＮＡを分解した。２５mM ＥＤＴＡを加
え、６５℃で１０分処理し、ＤＮａｓｅＩを不活性化し
た。水で４０ng/μlに希釈し、その１６０ngから１０ユ
ニットＡＭＶ reverse transcriptase XL（Takara），
２．５μＭ ｒａｎｄｏｍ ９ｍｅｒ（Takara、終濃度
２.５μＭ），１０ｍＭ Tris-HCl（pH 8.3），０．４ｍ
Ｍの各ｄＮＴＰを用いてｃＤＮＡを合成した。合成反応
は３０℃・１０分の後、４２℃・３０分、９９℃・５
分、５℃・５分とした。反応産物をエタノール沈殿しト
リシン−ＥＤＴＡバッファーで４０μlに溶解した（４n
g poly(Ａ)⁺ＲＮＡ/μl）。

【０１１１】（２）ポジティブコントロール用プラスミ
ドベクターの調製 ラットのグリセロールアルデヒド−３−リン酸−脱水素
酵素（Ｇ３ＰＤＨ，GenBank accession number Ｍ１７
７０１）は、ＦａｓｔＴｒａｃｋ（Invitrogen）で調製
したラット下垂体由来細胞株ＧＨ３の poly(Ａ)⁺ＲＮＡ
から、上記（１）と同様の方法で合成したｃＤＮＡを鋳
型として、Clontech社のＧ３ＰＤＨ増幅用プライマーセ
ットを用いてＰＣＲ法で増幅させた。ＵＨＲ−１はやは
りＧＨ３のｃＤＮＡを鋳型として、 ｒＲＥＣＦ：５'−ＣＣＴＧＣＴＧＧＣＣＡＴＴＣＴＣ
ＣＴＧＴＣＴＴＡＣ−３'（配列番号：８８） と、 ｒＲＥＣＲ：５'−ＧＧＧＴＣＣＡＧＧＴＣＣＣＧＣＡ
ＧＡＡＧＧＴＴＧＡ−３'（配列番号：８９） を用いて増幅し、ＴＡクローニングキット(Invitrogen)
のｐＣＲ^TM２.１ベクターへサブクローニングして得
た。これらを大腸菌ＪＭ１０９に導入して形質転換体を
得た。またリガンドペプチドはＪＭ１０９／ｐＲＡＶ３
として寄託したものを用いた。これらの形質転換体はア
ンピシリンを含むＬＢ培地で培養後、Ｑｉａｇｅｎ Ｐ
ｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ ｋｉｔ（QIAGEN）でプラスミ
ドを精製し、吸光度により濃度を定量してポジティブコ
ントロール用プラスミドベクターとした。

【０１１２】（３）ＲＴ−ＰＣＲ 上記（１）および（２）で調製したｃＤＮＡ溶液および
ポジティブコントロール用プラスミドベクターをそのま
まあるいは適当な濃度に水で希釈して鋳型とした。Ｇ３
ＰＤＨ，ＵＨＲ−１およびリガンドペプチド増幅用プラ
イマーは、それぞれClontech社のＧ３ＰＤＨ増幅用プラ
イマーセット、ｒＲＥＣＦとｒＲＥＣＲ、 ｒ１９Ｆ：５'−ＧＡＡＧＡＣＧＧＡＧＣＡＴＧＧＣＣ
ＣＴＧＡＡＧＡＣ−３'（配列番号：９０） と、 ｒ１９Ｒ：５'−ＧＧＣＡＧＣＴＧＡＧＴＴＧＧＣＣＡ
ＡＧＴＣＣＡＧＴ−３'（配列番号：９１） を終濃度２００nMで使用した。反応液は希釈した鋳型４
μｌ、各２００ｎＭプライマー、ｄＮＴＰ（終濃度各１
００μＭ）、ＤＮＡ polymeraseとしてＫｌｅｎＴａｑ
（Clontech）を用い、KlenTaq添付のバッファーと水で
２５μlとした。反応はＧ３ＰＤＨは９４℃・１分の
後、９８℃・１０秒、６５℃・２０秒、７２℃・４０秒
のサイクルを２６回、ＵＨＲ−１とリガンドペプチドは
９４℃・１分の後、９８℃・１０秒、６８℃・２５秒の
サイクルを３４回繰り返した。増幅産物をあらかじめエ
チジウムブロマイド染色した１.２％あるいは４％のア
ガロースゲルを用いて電気泳動し、得られた泳動図をＣ
ＣＤカメラ（FOTODYNE，Foto/Ecrips）で取り込み、解
析ソフト（Advanced American Biotechnology）でバン
ドの濃さを数値化、定量した。定量値はＧ３ＰＤＨは４
ng poly(Ａ)⁺ＲＮＡあたりのpgで、またＵＨＲ−１とリ
ガンドペプチドは４ng poly(Ａ)⁺ＲＮＡあたりのpgおよ
びその値をＧ３ＰＤＨのpgで割った値として算出した
〔図４３、４４〕。その結果、ＵＨＲ−１とリガンドペ
プチドは調べた組織全てで発現が確認された。ＵＨＲ−
１は下垂体で発現量が多く、脳全体にも広く分布してい
たが、末梢の組織では副腎を除いて発現はあまり高くな
かった。一方、リガンドペプチドは、脳では延髄、視床
下部で発現が高く、下垂体での発現は低かった。末梢組
織においても肺、胸腺、膵臓、腎臓、副腎、精巣などで
比較的高い発現が認められた。これらの結果はＵＨＲ−
１とそのリガンドペプチドが様々な組織においてその機
能調節に重要な役割を果たしていることを示している。

【０１１３】

【実施例３７】１９Ｐ２−Ｌ３１のグルコースによる血
漿インスリン濃度の増加に及ぼす影響 ペントバルビタール（６５mg/kg、腹腔内投与）で麻酔
したWistarラット（８−１０週齢 ♂）に総頸静脈から
一過性にグルコース（８６mg/ラット）を単独で、ある
いは同グルコースと１９Ｐ２−Ｌ３１（ラットあたり各
６７５pmol、２.２５nmol、６.７５nmol、６７.５nmo
l）を同時投与し、投与した反対側の総頸静脈から経時
的に採血し血漿中のインスリン濃度をラジオイムノアッ
セイで測定した。測定にはアマシャム社のインスリンア
ッセイキットを使用した。１９Ｐ２−Ｌ３１は投与量６
７５pmol、２.２５nmol、６.７５nmolでは、グルコース
による投与２分後の急激な第一相目のインスリン濃度の
増加、および投与後６分以降に見られる緩徐な第二相目
の血漿インスリン濃度の増加を部分的に抑制した。６
７.５nmolの１９Ｐ２−Ｌ３１は第一相と第二相両方の
インスリン濃度の増加を完全に抑制した〔図４５〕。

【０１１４】

【実施例３８】マウスの行動量に及ぼすリガンドポリペ
プチドの影響 本発明者らは、１９Ｐ２−Ｌ３１、１９Ｐ２−Ｌ２０の
マウス側脳室内投与が行動量に及ぼす影響を検討した。
成熟ＩＣＲ系雄性マウス（手術時体重：約３５ｇ）をペ
ントバルビタール５０mg/kgの腹腔内投与にて麻酔し、
脳定位固定装置に固定した。頭蓋骨を露出し、一側脳室
にガイドカニューレを埋め込むために歯科用ドリルを用
いて骨に穴を開けた。側脳室内薬液注入用のステンレス
製ガイドカニューレ（２４Ｇ、長さ５mm）の先端をＡ
Ｐ：＋０.６mm（ブレグマより）、Ｌ：左１mm、Ｈ：−
１mm（硬膜より）の位置に挿入した。ガイドカニューレ
は頭蓋骨に接着剤で固定した。術後、マウスは３日以上
飼育して術後の回復を待ってから行動解析実験を行っ
た。マウスの自発運動量の測定には、防音箱内の２４×
３７×３０cmの透明アクリル製の自発運動測定用ケージ
を用いた。マウスを該ケージに一匹ずつ入れ、１２時間
毎の明暗条件（明：６−１８時）で、また、水と餌は自
由に摂取できる条件下で自発運動量と立ち上がり行動量
をそれぞれ測定した。行動量の測定には、Ｓｕｐｅｒｍ
ｅｘ（室町機械）を用いた。薬物あるいはリン酸緩衝生
理食塩水（ＰＢＳ）は午後２：３０±３０分に投与し
た。投与時には、ステンレス製マイクロインジェクショ
ンカニューレ（３０Ｇ、長さ６mm）をガイドカニューレ
に挿入した。マイクロインジェクションカニューレは、
テフロンチューブを用いてマイクロシリンジポンプにつ
なぎ、ＰＢＳあるいはペプチドを溶解したＰＢＳを流速
２μl/分で２分間注入した。注入後は、２分間以上待っ
てからマイクロインジェクションカニューレを外し、行
動量を測定した。

【０１１５】結果は、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．で表し、こ
れらペプチド処置とＰＢＳ処置とが体温に及ぼす影響に
有意差があるか否かの検定は Student's t-testによっ
て行った。判定は、両側検定で危険率（ｐ）が５％以下
を統計的に有意であるとした。〔図４６〕に示すごと
く、１９Ｐ２−Ｌ３１を１０nmol投与した場合、マウス
の自発運動量は投与後７０分後から１０５分後まで、有
意に増加した。立ち上がり行動も同様に有意な変化を示
した。１９Ｐ２−Ｌ３１を１nmol投与した場合、自発運
動量には変化が認められず、立ち上がり行動量が投与１
０５分後で有意な低下を示したのみであった〔図４
７〕。１９Ｐ２−Ｌ３１を０.１nmol投与した場合、自
発運動量は、投与後２５分および４０分、７０分におい
て有意な増加を示した。立ち上がり行動量にも同様の増
加傾向は認められたが有意ではなかった〔図４８〕。ま
た、１９Ｐ２−Ｌ３１を０.０１nmol投与した場合、自
発運動量は、投与後２０分および４０分で有意に増加し
た。立ち上がり行動も同じように増加傾向を示したが有
意な変化は認められなかった〔図４９〕。

【０１１６】

【実施例３９】マウスのレセルピン誘発低体温に及ぼす
リガンドポリペプチドの影響 成熟ＩＣＲ系雄性マウス（手術時体重：約３５ｇ）をペ
ントバルビタール５０mg/kgの腹腔内投与にて麻酔し、
脳定位固定装置に固定した。頭蓋骨を露出し、一側脳室
にガイドカニューレを埋め込むために歯科用ドリルを用
いて骨に穴を開けた。側脳室内薬液注入用のステンレス
製ガイドカニューレ（２４Ｇ、長さ５mm）の先端をＡ
Ｐ：＋０.６mm（ブレグマより）、Ｌ：左１mm、Ｈ：−
１mm（硬膜より）の位置に挿入した。ガイドカニューレ
は頭蓋骨に接着剤で固定した。術後、マウスは３日以上
飼育して術後の回復を待ってから体温測定を行った。レ
セルピン（アポプロン注１mg、第一製薬）３mg/kgを皮
下注射し、その１５時間後にマウスを個別の測定用ケー
ジに移した。ステンレス製マイクロインジェクションカ
ニューレ（３０Ｇ、長さ６mm）をガイドカニューレに挿
入した。マイクロインジェクションカニューレは、テフ
ロンチューブを用いてマイクロシリンジポンプにつな
ぎ、ＰＢＳあるいはペプチドを溶解したＰＢＳを流速２
μl/分で２分間注入した。注入後は、２分間以上待って
からマイクロインジェクションカニューレを外し、直腸
温を測定した。結果は、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．で表し、
これらペプチド処置とＰＢＳ処置とが体温に及ぼす影響
に有意差があるか否かの検定は Student's t-testによ
って行った。判定は、両側検定で危険率（ｐ）が５％以
下を統計的に有意であるとした。〔図５０〕に示すよう
に、１９Ｐ２−Ｌ３１を１０nmol投与した場合、レセル
ピンによって低下していた体温はＰＢＳを投与した対照
群に比し有意に上昇した。この体温の上昇は、１９Ｐ２
−Ｌ３１投与後４５分でピークに達した。一方、１nmol
の１９Ｐ２−Ｌ２０投与群と対照群との間には差が認め
られなかった。

【０１１７】

【実施例４０】リガンドポリペプチドがラットの血圧に
及ぼす影響 本発明者らは、１９Ｐ２−Ｌ３１の延髄最後野への注入
が血圧に及ぼす影響を検討した。成熟Wistar系雄性ラッ
ト（手術時体重：約３００ｇ）をペントバルビタール５
０mg/kgの腹腔内投与にて麻酔し、ラット脳定位固定装
置に固定した。切歯用バーはインターオーラルラインか
ら３.３mm低くした。頭蓋骨を露出し、ガイドカニュー
レを埋め込むために歯科用ドリルを用いて骨に穴を開け
た。また、その周囲の２ケ所にアンカービスを埋めた。
ステンレス製ガイドカニューレ、ＡＧ−１２（内径０.
４mm、外径０.５mm、エイコム社）を、その先端が最後
野の上部に位置するように挿入した。そのために、ガイ
ドカニューレは垂直方向から２０度の角度をつけて前方
より挿入した（〔図５１〕、但し図中にはガイドカニュ
ーレより１.０mm長いマイクロインジェクションカニュ
ーレを示す）。定位座標は、PaxinosとWatson（1986）
のアトラスを参考にしてＡＰ：−０.６mm（インターオ
ーラルラインより）、Ｌ：０.０mm、Ｈ：＋１.５mm（イ
ンターオーラルラインより）とした。ガイドカニューレ
は瞬間接着剤と歯科用セメントおよびアンカービスで頭
蓋骨に固定した。ガイドカニューレにはステンレス製ダ
ミーカニューレ、ＡＤ−１２（外径０.３５mm、エイコ
ム社）を挿入し、キャップナット（エイコム社）で固定
した。その後、ラットは個別のケージで飼育した。

【０１１８】ガイドカニューレを埋め込んでから約１週
間飼育して術後の回復を待ち、無麻酔血圧測定用の手術
を行った。ラットをペントバルビタール５０mg/kgの腹
腔内投与にて麻酔し、解剖用パッドの上に背位に固定し
て左側の大腿動脈を露出させた。ポリエチレンチューブ
ＳＰ３５（内径０.５mm、外径０.９mm、夏目製作所）を
約６０cmの長さに切り、２００単位/mlヘパリン含有生
理食塩水で満たした後、大腿動脈に約２.５cm挿入し固
定した。チューブのもう一端は背側の皮下を通して頸部
（背側）より露出させた。術後一晩待ってからポリエチ
レンチューブをトランスデューサー（Spectramed）に接
続し、血圧を測定した。安定した血圧が測定可能になっ
た後、ラットの頭蓋骨に装着したキャップナットとダミ
ーカニューレを取り外し、代わりにテフロンチューブ
（長さ５０cm、内径０.１mm、外径０.４mm、エイコム
社）につなげたステンレス製マイクロインジェクション
カニューレ、AMI13（内径０.１７mm、外径０.３５mm、
エイコム社）を挿入した。マイクロインジェクションカ
ニューレの長さは、その先端１mmがガイドカニューレか
ら露出するように調節しておいた〔図５１〕。テフロン
チューブの一方をマイクロシリンジポンプにつなぎ、Ｐ
ＢＳまたは１９Ｐ２−Ｌ３１を溶解させたＰＢＳを１.
０μl/分の流速で計２μｌを最後野に注入した。血圧測
定後、１９Ｐ−Ｌ３１を注入したマイクロインジェクシ
ョンカニューレを外し、色素（エバンスブルー）注入用
マイクロインジェクションカニューレに替えた。色素
は、１９Ｐ−Ｌ３１と同様に流速１.０μl/分で２分間
注入した後約３分間待ってからマイクロインジェクショ
ンカニューレを外した。ラットを断頭し、速やかに脳を
摘出し、凍結した。クリオスタットを用いて凍結切片を
作製し、色素の注入位置を確認した。上記実験の結果、
延髄最後野に１９Ｐ２−Ｌ３１を１０nmol注入すると血
圧の上昇が認められた。脈波および平均血圧の典型例を
〔図５２〕に示す。

【０１１９】

【実施例４１】リガンドポリペプチドが血漿中下垂体ホ
ルモン量に及ぼす影響 本発明者らは、１９Ｐ２−Ｌ３１の第三脳室内投与が血
漿中の下垂体ホルモン量に及ぼす影響を検討した。成熟
Wistar系雄性ラット（手術時体重：約２９０〜３５０
ｇ）をペントバルビタール５０mg/kgの腹腔内投与にて
麻酔し、ラット脳定位固定装置に固定した。切歯用バー
はインターオーラルラインから３.３mm低くした。頭蓋
骨を露出し、ガイドカニューレを埋め込むために歯科用
ドリルを用いて骨に穴を開けた。また、その周囲の一ケ
所にアンカービスを埋めた。ステンレス製ガイドカニュ
ーレ、ＡＧ−１２（内径０.４mm、外径０.５mm、エイコ
ム社）を、その先端が第三脳室の上部に位置するように
挿入した。定位座標は、PaxinosとWatson（1986）のア
トラスに従い、ＡＰ：＋７.２mm（インターオーラルラ
インより）、Ｌ：０.０mm、Ｈ：＋２.０mm（インターオ
ーラルラインより）とした。ガイドカニューレは瞬間接
着剤と歯科用セメントおよびアンカービスで頭蓋骨に固
定した。ガイドカニューレにはステンレス製ダミーカニ
ューレ、ＡＤ−１２（外径０.３５mm、エイコム社）を
挿入し、キャップナット（エイコム社）で固定した。術
後、ラットを個別のケージで３日以上飼育し、術後の回
復を待ってから、実験を行った。

【０１２０】上記手術を施したラットをペントバルビタ
ール５０mg/kgの腹腔内投与にて麻酔し、解剖用パッド
の上に背位に固定した。両側の頸静脈を露出させた後、
容量１mlのツベルクリン用注射筒と２４Ｇ注射針（いず
れもテルモ社）を用いて４００μｌの血液を採取した。
血液凝固を防止するため、注射筒には予め２００単位/m
lのヘパリンを含有する生理食塩水を２０μl入れておい
た。ラットの頭蓋骨に装着したキャップナットとダミー
カニューレを取り外し、代わりにテフロンチューブ（長
さ５０cm、内径０.１mm、外径０.４mm、エイコム社）に
つなげたステンレス製マイクロインジェクションカニュ
ーレ、AMI13（内径０.１７mm、外径０.３５mm、エイコ
ム社）を挿入した。マイクロインジェクションカニュー
レの長さは、その先端１mmがガイドカニューレから露出
するように調節しておいた。テフロンチューブの一方を
マイクロシリンジポンプにつなぎ、ＰＢＳまたは１９Ｐ
２−Ｌ３１を溶解させたＰＢＳを２.５μl/分の流速で
計１０μｌを第三脳室に注入した。注入終了後１分間待
ってからマイクロインジェクションカニューレを取り外
し、再びダミーカニューレをキャップナットで固定し
た。脳室内投与を開始する直前、および脳室内投与の開
始時点から１０、２０、３０、４０、６０分後に頸静脈
より４００μlずつ採血した。採取した血液は微量高速
冷却遠心機（MR-150，トミー精工）を用いて遠心（５,
０００rpm、１０分間）し、上清（血漿）を回収した。
血漿中に含まれる下垂体ホルモン（プロラクチン、黄体
形成ホルモン（ＬＨ）、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴ
Ｈ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、成長ホルモン
（ＧＨ））量をそれぞれラジオイムノアッセイを用いて
測定した。結果は、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．で表した。１
９Ｐ２−Ｌ３１を溶解させたＰＢＳ投与群とＰＢＳのみ
を投与した対照群との間に有意差があるか否かの検定に
はStudent's t-testを用いた。判定は、両側検定で危険
率５％以下を統計的に有意であるとした。〔図５３〕に
示すごとく、血漿中成長ホルモン量は、５０nmolの１９
Ｐ２−Ｌ３１を第三脳室に投与後２０分において対照群
に比し有意に減少した。投与後１０、３０、４０分にお
いても減少傾向は認められたが、有意ではなかった。ま
た、投与６０分後では対照群との間に差は認められなか
った。また、血漿中プロラクチン、ＬＨ、ＡＣＴＨ、Ｔ
ＳＨ量は有意な変化を示さなかった。

【０１２１】

【実施例４２】リガンドポリペプチドが自由行動下ラッ
トにおける血漿中成長ホルモン量に及ぼす影響 成熟Wistar系雄性ラットをペントバルビタール５０mg/k
gの腹腔内投与にて麻酔し、実施例４１と同様にステン
レス製ガイドカニューレ、ＡＧ−１２（内径０.４mm、
外径０.５mm、エイコム社）を、その先端が第三脳室の
上部に位置するように固定した。術後、ラットを個別の
ケージで３日以上飼育し、術後の回復を待ってからペン
トバルビタール麻酔下（５０mg/kg、i.p.）でヘパリン
（２００単位/ml）含有生理食塩水を満たしたカニュー
レ（長さ３０cm、内径０.５mm、外径０.９mm、夏目製作
所）を右頸静脈より右心房に挿入した。ラットを一晩飼
育して完全に麻酔から覚醒させた後、透明アクリル製ケ
ージ（３０×３０×３５cm）に移した。容量１mlのツベ
ルクリン用注射筒と２４Ｇ注射針（いずれもテルモ社）
を心房に挿入したカニューレに接続し、３００μｌの血
液を採取した。血液凝固を防止するため、注射筒には予
め２００単位/mlのヘパリンを含有する生理食塩水を２
０μl入れておいた。第三脳室に挿入したガイドカニュ
ーレにテフロンチューブ（長さ５０cm、内径０.１mm、
外径０.４mm、エイコム社）につなげたステンレス製マ
イクロインジェクションカニューレ、AMI13（内径０.１
７mm、外径０.３５mm、エイコム社）を挿入した。マイ
クロインジェクションカニューレの長さは、その先端１
mmがガイドカニューレから露出するように調節しておい
た。テフロンチューブの一方をマイクロシリンジポンプ
につなぎ、ＰＢＳまたは１９Ｐ２−Ｌ３１を溶解させた
ＰＢＳを２.５μl/分の流速で計１０μｌを第三脳室に
注入した。第三脳室内投与開始１０分後に心房に挿入し
たカニューレを通して生理食塩水に溶解させた成長ホル
モン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）を５μg/kg投与した。脳
室内投与を開始する直前、およびＧＨＲＨ投与時点から
１０、２０、３０、４０、６０分後に頸静脈より３００
μlずつ採血した。採取した血液は遠心（５,０００rp
m、１０分間）し、上清（血漿）を回収した。血漿中に
含まれる成長ホルモン（ＧＨ）量はラジオイムノアッセ
イを用いて測定した。結果は、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．で
表した。１９Ｐ２−Ｌ３１を溶解させたＰＢＳ投与群と
ＰＢＳのみを投与した対照群との間に有意差があるか否
かの検定にはStudent's t-testを用いた。判定は、両側
検定で危険率５％以下を統計的に有意であるとした。
〔図５４〕に示すごとく、５μg/kgのＧＨＲＨ投与は血
漿中ＧＨ量を増加させた。しかし、５０nmolの１９Ｐ２
−Ｌ３１を第三脳室に投与するとＧＨＲＨによる血漿中
ＧＨ量の増加は有意に抑制された。

【０１２２】

【実施例４３】ウサギポリクローナル抗体の作製 ウシ１９Ｐ２−Ｌ３１のＮ末端側ペプチド［ペプチド−
I、SRAHQHSMEIRTPDC（配列番号：９２）］、ｃ末端側ペ
プチド［ペプチド−II、CAWYAGRGIRPVGRFNH₂（配列番
号：９３）］および中央部分のペプチド［ペプチド-II
I、CEIRTPDINPAWYAG（配列番号：９４）］を化学合成
し、常法通りKLHと結合した。フロインドの完全アジュ
バント(FCA)と生理食塩水に溶解した上記ペプチド６０
０μｇを混合し、均一なエマルジョンにした後、それぞ
れ３羽ずつのウサギ(NZW、♂、２．５ｋｇ）の背部に皮
下注射した。さらに３週間後追加免疫として、フロイン
ドの不完全アジュバント(FIA)と生理食塩水に溶解した
上記のペプチドとKLHのコンジュゲイトを混合し、均一
なエマルジョンにした後ウサギ背部に皮下注射した。３
週間間隔で計３回追加免疫を行った。抗体価の測定は以
下のように行った。最終免疫の２週間後、ウサギ耳の静
脈から採血し、血液を３７℃で１時間保温後、４℃で１
昼夜放置したのち遠心し、抗血清を得た。抗血清を各濃
度に希釈し、予め、ヤギ抗ウサギIgG(Fc)抗体を固定し
たポリスチレン性９６穴マイクロプレートに１００μｌ
ずつ加え、４℃で１６時間インキュベートした。抗血清
を除去し、洗浄後、HRP標識ペプチド−I、II、IIIを添
加した。室温で４時間インキュベートし、十分にウエル
を洗浄した後、反応基質を加え、呈色反応を行った。酵
素反応停止溶液１００μｌを加えて反応を停止させた
後、マイクロプレート用比色計を用い４５０ｎｍにおけ
る吸光度を測定した。〔図５５〕に示すように免疫後の
血清中に各ペプチドに対する結合活性が検出された。抗
体は以下のようにして調製した。抗血清は硫安塩析によ
りIgG画分を濃縮し、ホウ酸バッファーに溶解後、透析
した。抗ペプチド−IのIgG画分をペプチド−Iセルロフ
ァインカラムに、さらに抗ペプチド−IIおよび抗ペプチ
ド−IIIのIgG画分を１９Ｐ２−Ｌ３１−セファロ−ズ４
Ｂカラムに負荷し、ホウ酸バッファーおよび酢酸バッフ
ァー（１００ｍＭ、ｐＨ４．５）で洗浄後、グリシン塩
酸バッファー（２００ｍＭ、ｐＨ２．０）でそれぞれ溶
出した。溶出液には１Ｍのトリスを加えて中和した後、
精製抗体として使用した。

【０１２３】

【実施例４４】ウサギポリクローナル抗１９Ｐ２−Ｌ３
１抗体による１９Ｐ２−Ｌ３１の生物活性の中和作用 実施例４３の方法で調製した３種類のIgG抗体の１９Ｐ
２−Ｌ３１に対する中和活性を実施例１１記載のアラキ
ドン酸代謝物放出活性測定系により検討した。すなわ
ち、IgG抗体を各濃度に希釈し、１９Ｐ２−Ｌ３１（５
ｘ１０^-10Ｍ）と室温で１時間インキュベーション後、
残存活性を１９Ｐ２レセプター発現ＣＨＯ細胞を使用し
て測定した〔図５６〕。ペプチド−IIに対するポリクロ
ーナル抗体に最も強い１９Ｐ２−Ｌ３１に対する中和活
性が認められた。

【０１２４】

【実施例４５】マウス・ゲノムＤＮＡからのリガンドポ
リペプチドコード領域を含むＤＮＡの取得及び配列決定 実施例２９で得られたラット由来のリガンドポリペプチ
ドをコードするｃＤＮＡ配列（［図３６］）をもとに以
下の２種のプライマーを合成した。 ｒＦＢＧ： ５’−ＡＧＡＴＴＧＧＣＡＴＣＡＴＣＣＡ
ＧＧＡＡＧＡＣＧＧＡＧＣＡＴ−３’〔配列番号：９
５〕 ｒＲＳＡ： ５’−ＧＴＣＧＡＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣ
ＴＧＴＣＴＴＣＴＣＧＡＧＣＴＧ−３’〔配列番号：９
６〕 この２種のプライマーを用いてマウス・ゲノムＤＮＡ
（Mouse BALB/c genomicDNA） 0.5 ngを鋳型としてＰＣ
Ｒ法による増幅を行った。反応液の組成は、合成ＤＮＡ
プライマー各200nM、鋳型ＤＮＡ0.5ng、0.25mMｄＮＴＰ
ｓ ＥｘＴａｑ polymerase 0.5μlおよび酵素に付属の
バッファーで、総反応溶液は50μlとした。増幅のため
のサイクルはサーマルサイクラー（パーキンエルマー
社）を用い、９５℃ ３０秒、６７℃ ６０秒を３０cycl
e繰り返した。増幅産物の確認は１．２％アガロースゲ
ル電気泳動およびエキジウムブロマイド染色によって行
い、生じた約１ｋｂのバンドを回収後、ＴＡクローニン
グキット（invitrogen社)を用いてサブクローニングし
た。そのライゲーションミクスチャーをE.coli. JM109
にTransformationし、挿入断片をもつクローンをアンピ
シリンおよびＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地中で選択
し、白色を呈するクローンを分離し、形質転換体Escher
ichia coli JM109/pmGB3を得た。このクローンをアンピ
シリンを含むＬＢ培地で一晩培養し、自動プラスミド抽
出装置を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。調製した
ＤＮＡの一部を用いてABI Dye Terminator Cycle Seque
ncing Kit（ＡＢＩ社）を用いて行い、蛍光式自動シー
ケンサーを用いて解読し、得られた塩基配列の情報はＤ
ＮＡＳＩＳ（日立システムエンジニアリング社）を用い
て行った〔図５９〕。下線で示す部分はプライマーの配
列に相当する部分である。決定した塩基配列をもとに配
列番号：２，４６または６０で表わされる配列と比較し
た結果、Escherichia coli JM109/pmGB3の保持するプラ
スミドpmGB3に挿入されたＤＮＡ断片が新規のマウス型
リガンドポリペプチドをコードすることが分かった〔図
６０〕。

【０１２５】

【実施例４６】 下垂体由来細胞株ＲＣ−４Ｂ／Ｃから
のプロラクチン分泌に対する１９Ｐ２−Ｌ３１の影響 ラット下垂体由来細胞株ＲＣ−４Ｂ／Ｃ（Hurbain-Kosm
ath et al. In VitroCell. Dev. Biol. vol.26 431-44
0, (1990)）を１×１０⁵細胞／ウェルの濃度で１２ウェ
ルプレート（住友ベークライト）に播き、２日間培養し
た。培地組成は上記参考文献に従い（ＤＭＥＭ（ニッス
イ）：α−ＭＥＭ（Gibco）＝１：１，１０％ ウシ胎児
血清，１.５g/l グルコース（Wako），０.２mg/ml ＢＳ
Ａ（Sigma），０.５％ 非必須アミノ酸溶液（Flow Labo
latories），１５mM ＨＥＰＥＳ（Wako） ｐＨ７.３，
２.５ng/ml ＥＧＦ（Genzyme），５０ng/ml Gentamicin
（Gibco））、３４℃１０％ＣＯ₂の条件下で培養した。
培養した細胞をインキュベーション・バッファー（ＤＭ
ＥＭ：α−ＭＥＭ＝１：１，０.５g/l グルコース，０.
１％ ＢＳＡ，０.５％ 非必須アミノ酸溶液，１５mM Ｈ
ＥＰＥＳ ｐＨ７.３）で３回洗浄後、同バッファーを加
え、３４℃１０％ＣＯ₂で１５分間プレ・インキュベー
トした。再び、同バッファーで２回洗浄した後、インキ
ュベーション・バッファーで調製したウシ・１９Ｐ２−
Ｌ３１ペプチド（配列番号：５のペプチド）を図６１に
示す各濃度で添加し、３４℃１０％ＣＯ₂で３０分間イ
ンキュベートした。浮遊した細胞を除くため、高速微量
遠心機にて遠心し、上清を−３０℃で保存した。以上の
操作で得られた培養上清サンプル中に含まれるプロラク
チン濃度について、ラット・プロラクチン〔¹²⁵Ｉ〕ア
ッセイシステム（Amersham）を用いて測定した。〔図６
１〕に示したとおり、１９Ｐ２−Ｌ３１の添加によっ
て、濃度依存的にＲＣ−４Ｂ／Ｃ細胞からのプロラクチ
ン分泌量が上昇することが示された。図において＊＊を
付した点は、students' t−testで検討した結果、１９
Ｐ２−Ｌ３１無添加の場合に比べ、危険率０.０１以下
で有意であることを表す。

【０１２６】

【実施例４７】ラット下垂体初代培養細胞からのプロラ
クチン分泌に対する１９Ｐ２−Ｌ３１の影響 ラット下垂体初代培養細胞の調製は塩田らの方法（Acta
Endocrinologica vol.106 71-78 (1984)）に準じた。
哺乳約１１日齢のFischer344/Nメスラット（SLC社）を
断頭・屠殺後、下垂体前葉を採取した。得られた下垂体
片をバッファーＡ（１３７mM ＮａＣｌ（Wako），５mM
ＫＣｌ（Wako），０.７mM Ｎａ₂ＨＰＯ₄（Wako），５０
μg/ml ゲンタマイシン（Gibco））で洗浄後、バッファ
ーＡにて調製した酵素液Ｉ（０.４％コラゲナーゼＡ
（ベーリンガー・マンハイム），１０μg/ml ＤＮａｓ
ｅ（Sigma），０.４％ ＢＳＡ（Sigma），０.２％ グル
コース（Wako））で３７℃、１時間処理した。ピペッテ
ィングで下垂体片を細胞に分散した後、遠心分離して上
清を除き、同じくバッファーＡで調製した酵素液II
（０.２５％ パンクレアチン（Sigma））に懸濁して３
７℃で８分間処理した。ウシ胎児血清添加によって反応
を停止した後、遠心分離して上清を除いた。得られた細
胞をＤＭＥＭ−Ｉ（ＤＭＥＭ： Dulbecco's Minimum Es
sential Medium，１０％ ウシ胎児血清，２０mMＨＥＰ
ＥＳ ｐＨ７.３，５０Ｕ/ml ペニシリン，５０μg/ml
ストレプトマイシン）に懸濁してセル・ストレーナー
（Falcon）に通して混入している細胞塊・繊維等を除い
た後、ＤＭＥＭ−Ｉにて２回洗浄した。得られた細胞を
ＤＭＥＭ−Ｉで希釈し、１.５×１０⁵／ウェルの細胞密
度で播種し、３７℃、５％ＣＯ₂で４日間培養した。

【０１２７】培養３日目に培地を新鮮なものに交換し、
培養４日目に以下の通りに培養上清サンプルを調製し
た。細胞をＤＭＥＭ−II（ＤＭＥＭ，０.２％ ＢＳＡ，
２０mMＨＥＰＥＳ ｐＨ７.３）で３回洗浄した後、ＤＭ
ＥＭ−IIを添加して３７℃、５％ＣＯ₂で１時間プレ・
インキュベートした。ＤＭＥＭ−IIで２回洗浄した後、
ＤＭＥＭ−IIで調製した１９Ｐ２−Ｌ３１ ペプチド
（配列番号：５のペプチド）を図６２に示す各濃度で添
加し、３７℃、５％ＣＯ₂で１時間反応させた。上清を
回収し、遠心分離にて浮遊細胞を除去後、−３０℃で保
存し、上清サンプルとした。培養上清中のプロラクチン
濃度はラット・プロラクチン〔¹²⁵Ｉ〕アッセイシステ
ム（Amersham）を用いて測定した。〔図６２〕に示した
通り、１９Ｐ２−Ｌ３１の添加によって、濃度依存的に
下垂体初代培養細胞からのプロラクチン分泌量が上昇す
ることが示された。図において＊＊を付した点は、stud
ents' t−testで検討した結果、１９Ｐ２−Ｌ３１無添
加の場合に比べ、危険率０.０１以下で有意であること
を表す。また、＊を付した点は、students' t−testで
検討した結果１９Ｐ２−Ｌ３１無添加の場合に比べ、危
険率０.０５以下で有意であることを表す。

【実施例４８】ラット胎盤でのＵＨＲ遺伝子の発現変動 ９週齢交配の Wistar 雌ラットの胎盤を、妊娠１１、１
４、１７、２０日目にそれぞれサンプリングした。これ
らの組織はいったん液体窒素に浸して急速に冷凍し、−
８０℃下で保存した。mＲＮＡを調製するため、冷凍し
ておいた組織を溶解し、その重量の１５倍量の lsogen
液（ニッポンジーン社）を加えてホモジナイズし、マニ
ュアルに従ってまず total ＲＮＡを調製した。さらに
各サンプル１mgの total ＲＮＡから mＲＮＡ Purifica
tion Kit（ファルマシア社）を用いて mＲＮＡを調製し
た。調製した mＲＮＡ １μg をＤＮasel（Amprificat
ion Grade, GIBCO BRL社）で処理後、そのうちの１６０
ngをＲＮＡ ＰＣＲ Kit（宝酒造）により、添付されて
いるランダム９mer のプライマーを用いて、４２℃で３
０分間反応して cＤＮＡを合成した。これらの cＤＮＡ
はＴＥバッファー４０μl に溶解した。ＵＨＲ−１遺伝
子の発現量の定量はABI PPISM ７７００シーケンスデ
ィテクター（パーキンエルマー社）を用いて行った。反
応に使用するプライマーには rＵ１Ｆ（５'−ＡＡＣＣ
ＣＣＴＴＣＡＴＣＴＡＴＧＣＧＴＧＧ−３'：配列番
号：９７）および rＵ１Ｒ（５'−ＡＴＡＴＴＣＴＧＧ
ＣＣＡＴＧＡＧＧＣＡＣ−３'：配列番号：９８）を、
また蛍光標識したプロープには rＵ１Ｐ（５'−ＴＴＣ
ＣＧＡＧＡＧＧＡＧＣＴＡＣＧＣＡＡＧＡＴＧＣＴＴＣ
−３'：配列番号：９９）を使用し、専用の反応試薬キ
ット TaqMan ＰＣＲ Core Reagent Kit（パー金エル
マー社）をもちいてマニュアルに従って反応液を調製し
た。ただしこの際、ＴＥバッファーで４０倍に希釈した
サンプルの cＤＮＡ溶液を４μl 反応液に加えた。定
量のための検量線は、２６０nmの吸光度を測定すること
によりＵＨＲ−１遺伝子の分子数を求めたＤＮＡ断片を
希釈して鋳型とし、サンプルの定量時に同時に反応して
求めた。ＰＣＲ反応は５０℃ ２分と９５℃ １０分の
後、９５℃ １０秒、５５℃ １分３０秒のサイクルを
４０回繰り返した。その結果、ラット胎盤でのＵＨＲ−
１遺伝子発現量は妊娠が進行するに従って大幅に増加し
ていることが明らかになった。

【実施例４９】１９Ｐ２−Ｌ３１によるラットでの血漿
プロラクチン濃度に及ぼす影響 (1)雄性ラットにおける１９Ｐ２−Ｌ３１の作用 本発明者らは、雄性ラットにおいて１９Ｐ２−Ｌ３１の
静脈投与が血漿中のプロラクチン量に及ぼす影響につい
て検討した。成熟Ｆｉｓｃｈｅｒ系雄性ラット（体重：
約１５０〜１８０ｇ）をウレタン1.5 mg/kgの腹腔内投
与にて麻酔し、麻酔20分後に左右の右頚静脈を露出させ
た。手術を行った15分後に、容量１mlのツベルクリン用
注射筒を用いて、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を
含む生理食塩水に溶解した１９Ｐ２−Ｌ３１（５０また
は５００nmol/kg）および対照群として１％BSA含有生理
食塩水を投与した。静脈内投与を開始する直前および投
与時点から、２，５，１０，２０分後に投与側とは逆の
頚静脈より２００μｌの血液を採取した。血液凝固を防
止するため、注射筒には予め１５０単位/ｍｌのヘパリ
ンを含有する生理食塩水を１０μｌ入れておいた。採取
した血液は微量高速冷却遠心機(MR-１５０、トミー精
工)を用いて遠心（１０，０００rpm、１５分間）し、上
清（血漿）を回収した。血漿中に含まれるプロラクチン
量は、ラジオイムノアッセイ（アマーシャム社製）を用
いて測定した。結果は、投与により変動した血中プロラ
クチン濃度の平均±S．E．M．で表し、１９P２−L３１
を溶解させた１％BSA含有生理食塩水投与群と１％BSA含
有生理食塩水投与群のみを投与した対照群との間に有意
差があるか否かの検定にはDunnett検定を用いた。判定
は、危険率（ｐ）が５％以下を統計的に有意であるとし
た。［図６４］に示すように、１９P２−Ｌ３１を５０
０ｎmol/kg投与した場合、血漿プロラクチン濃度は投与
２分後において対照群に比し有意に上昇した。 (２)雌性ラットにおける１９Ｐ２−Ｌ３１の作用 次に、雌性ラットにおける１９Ｐ２−Ｌ３１の静脈投与
が血漿中のプロラクチン量に及ぼす影響について検討し
た。成熟Ｆｉｓｃｈｅｒ系雌性ラット（体重：約１４０
〜１６０ｇ）の手術時の性周期を膣腔検査にて判定後、
上記実施例４９(1)と同様の方法で、１９Ｐ２−Ｌ３１
の静脈投与が血漿中のプロラクチン量に及ぼす影響につ
いて検討した。結果は、投与により変動した血中プロラ
クチン濃度の平均±S．E．M．で表し、１９P２−L３１
（５または５０nmol/kg）を溶解させた１％BSA含有生理
食塩水投与群と１％BSA含有生理食塩水投与群のみを投
与した対照群との間に有意差があるか否かの検定にはDu
nnett検定を用いた。判定は、危険率（ｐ）が５％以下
を統計的に有意であるとした。［図６５］に示すよう
に、１９P２−Ｌ３１を５０ｎmol/kg投与した場合、血
漿プロラクチン濃度は投与５分後において対照群に比し
有意に上昇し、１９P２−Ｌ３１は、雄と比較して雌に
おいて約1/10量で同等またはそれ以上の血漿プロラクチ
ン濃度の上昇がみられた。また、［図６６］に示すよう
に性周期別に比較すると、発情期において顕著な血漿プ
ロラクチン濃度が見られ、性周期により１９P２−Ｌ３
１の反応性が異なることが示唆された。

【０１２８】

【製剤例１】日局注射用蒸留水５０ｍｌに実施例２１で
得られた化合物５０ｍｇを溶解した後、日局注射用蒸留
水を加えて１００ｍｌとした。この溶液を滅菌条件下で
瀘過し、次にこの溶液１ｍｌずつを取り滅菌条件下注射
用バイアルに充填し凍結乾燥し密閉した。

【０１２９】

【製剤例２】日局注射用蒸留水５０ｍｌに実施例２１で
得られた化合物１００ｍｇを溶解した後、日局注射用蒸
留水を加えて１００ｍｌとした。この溶液を滅菌条件下
で瀘過し、次にこの溶液１ｍｌずつを取り滅菌条件下注
射用バイアルに充填し凍結乾燥し密閉した。

【０１３０】

【発明の効果】本発明におけるリガンドポリペプチド
は、プロラクチン分泌の調節作用、つまり、プロラクチ
ン分泌の促進および抑制作用を有する。即ち、本発明に
おけるリガンドポリペプチドは、後述の実施例から明ら
かなように、まずプロラクチン分泌の促進作用を有する
ため、プロラクチン分泌不全に関係する各種疾患の予防
および治療薬に用いることができる。一方、本発明にお
けるリガンドポリペプチドは、そのレセプター蛋白質と
の親和性が強いため、投与量が増えるとプロラクチン分
泌に対し脱感作（desensitization）が起こる結果、プ
ロラクチン分泌を抑制する作用も有する。この場合、プ
ロラクチン過剰分泌に関係する各種疾患の予防および治
療薬に用いることができる。従って、本発明におけるリ
ガンドポリペプチドは、プロラクチン分泌促進剤とし
て、卵巣機能低下症、精嚢発育不全、更年期障害、甲状
腺機能低下などのプロラクチン分泌に関係する各種疾患
の予防および治療薬として有用である。さらに、本発明
におけるリガンドポリペプチドは、プロラクチン分泌促
進に基づき、性欲促進作用（フェロモン的作用）を有す
るために、性欲促進剤としても有用である。また、本発
明におけるリガンドポリペプチドは、プロラクチン分泌
抑制剤として、下垂体腺腫瘍、間脳腫瘍、月経異常、自
己免疫疾患、プロラクチノーマ、不妊症、インポテン
ス、無月経症、乳汁漏症、末端肥大症、キアリ・フロン
メル（Chiari-Frommel）症候群、アルゴンツ・デル・カ
スティロ（Argonz-del Castilo）症候群、フォーベス・
アルブライト（Forbes-Albright）症候群、リンパ腫ま
たはシーハン症候群または精子形成異常などのプロラク
チン分泌に関係する各種疾患の予防および治療薬として
有用である。また、本発明におけるリガンドポリペプチ
ドは、プロラクチン分泌抑制作用に基づいて、避妊薬と
しても有用である。その他、本発明におけるリガンドポ
リペプチドは、プロラクチン分泌機能を調べるための検
査薬としても、また、牛、ヤギ、ブタなどの畜産哺乳動
物の乳汁の分泌促進剤などの動物薬としても有用であ
り、さらには該畜産哺乳動物体内で有用物質を生産さ
せ、これをその乳汁中への分泌することによる有用物質
生産などへの応用も期待される。さらにまた、本発明に
おけるリガンドポリペプチドは、胎盤機能調節作用を有
するため、絨毛癌、胞状奇胎、侵入奇胎、流産、胎児の
発育不全、糖代謝異常、脂質代謝異常または分娩誘発の
予防または治療薬としても有用である。

【０１３１】

【配列表】

【配列番号：１】 配列の長さ：９８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Met Lys Ala Val Gly Ala Trp Leu Leu Cys Leu Leu Leu Leu Gly Leu 1 5 10 15 Ala Leu Gln Gly Ala Ala Ser Arg Ala His Gln His Ser Met Glu Ile 20 25 30 Arg Thr Pro Asp Ile Asn Pro Ala Trp Tyr Ala Gly Arg Gly Ile Arg 35 40 45 Pro Val Gly Arg Phe Gly Arg Arg Arg Ala Ala Pro Gly Asp Gly Pro 50 55 60 Arg Pro Gly Pro Arg Arg Val Pro Ala Cys Phe Arg Leu Glu Gly Gly 65 70 75 80 Ala Glu Pro Ser Arg Ala Leu Pro Gly Arg Leu Thr Ala Gln Leu Val 85 90 95 Gln Glu

【０１３２】

【配列番号：２】 配列の長さ：２９４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 ATGAAGGCGG TGGGGGCCTG GCTCCTCTGC CTGCTGCTGC TGGGCCTGGC CCTGCAGGGG 60 GCTGCCAGCA GAGCCCACCA GCACTCCATG GAGATCCGCA CCCCCGACAT CAACCCTGCC 120 TGGTACGCRG GCCGTGGGAT CCGGCCCGTG GGCCGCTTCG GCCGGCGAAG AGCTGCCCYG 180 GGGGACGGAC CCAGGCCTGG CCCCCGGCGT GTGCCGGCCT GCTTCCGCCT GGAAGGCGGY 240 GCTGAGCCCT CCCGAGCCCT CCCGGGGCGG CTGACGGCCC AGCTGGTCCA GGAA 294

【０１３３】

【配列番号：３】 配列の長さ：２９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ser Arg Ala His Gln His Ser Met Glu Ile Arg Thr Pro Asp Ile Asn 1 5 10 15 Pro Ala Trp Tyr Ala Gly Arg Gly Ile Arg Pro Val Gly 20 25

【０１３４】

【配列番号：４】 配列の長さ：１９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Pro Asp Ile Asn Pro Ala Trp Tyr Ala Gly Arg Gly Ile Arg Pro 1 5 10 15 Val Gly Arg 19

【０１３５】

【配列番号：５】 配列の長さ：３１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ser Arg Ala His Gln His Ser Met Glu Ile Arg Thr Pro Asp Ile Asn 1 5 10 15 Pro Ala Trp Tyr Ala Gly Arg Gly Ile Arg Pro Val Gly Arg Phe 20 25 30

【０１３６】

【配列番号：６】 配列の長さ：３２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ser Arg Ala His Gln His Ser Met Glu Ile Arg Thr Pro Asp Ile Asn 1 5 10 15 Pro Ala Trp Tyr Ala Gly Arg Gly Ile Arg Pro Val Gly Arg Phe Gly 20 25 30

【０１３７】

【配列番号：７】 配列の長さ：３３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ｓｅｒ Ａｒｇ Ａｌａ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ｇｌｕ
Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ａｓｎ １ ５
１０ １５ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｔｒｐ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｉｌｅ
Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇｌｙ ２０ ２５
３０ Ａｒｇ ３３

【０１３８】

【配列番号：８】 配列の長さ：２０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｔｒｐ Ｔｙｒ
Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｐｒｏ １ ５
１０ １５ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｐｈｅ ２０

【０１３９】

【配列番号：９】 配列の長さ：２１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Pro Asp Ile Asn Pro Ala Trp Tyr Ala Gly Arg Gly Ile Arg Pro 1 5 10 15 Val Gly Arg Phe Gly 20

【０１４０】

【配列番号：１０】 配列の長さ：２２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Pro Asp Ile Asn Pro Ala Trp Tyr Ala Gly Arg Gly Ile Arg Pro 1 5 10 15 Val Gly Arg Phe Gly Arg 20

【０１４１】

【配列番号：１１】 配列の長さ：８７ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 AGCAGAGCCC ACCAGCACTC CATGGAGATC CGCACCCCCG ACATCAACCC TGCCTGGTAC 60 GCRGGCCGTG GGATCCGGCC CGTGGGC 87

【０１４２】

【配列番号：１２】 配列の長さ：５７ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 ACCCCCGACA TCAACCCTGC CTGGTACGCR GGCCGTGGGA TCCGGCCCGT GGGCCGC 57

【０１４３】

【配列番号：１３】 配列の長さ：９３ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 AGCAGAGCCC ACCAGCACTC CATGGAGATC CGCACCCCCG ACATCAACCC TGCCTGGTAC 60 GCRGGCCGTG GGATCCGGCC CGTGGGCCGC TTC 93

【０１４４】

【配列番号：１４】 配列の長さ：９６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 AGCAGAGCCC ACCAGCACTC CATGGAGATC CGCACCCCCG ACATCAACCC TGCCTGGTAC 60 GCRGGCCGTG GGATCCGGCC CGTGGGCCGC TTCGGC 96

【０１４５】

【配列番号：１５】 配列の長さ：９９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 AGCAGAGCCC ACCAGCACTC CATGGAGATC CGCACCCCCG ACATCAACCC TGCCTGGTAC 60 GCRGGCCGTG GGATCCGGCC CGTGGGCCGC TTCGGCCGG 99

【０１４６】

【配列番号：１６】 配列の長さ：６０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 ACCCCCGACA TCAACCCTGC CTGGTACGCR GGCCGTGGGA TCCGGCCCGT GGGCCGCTTC 60

【０１４７】

【配列番号：１７】 配列の長さ：６３ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 ACCCCCGACA TCAACCCTGC CTGGTACGCR GGCCGTGGGA TCCGGCCCGT GGGCCGCTTC 60 GGC 63

【０１４８】

【配列番号：１８】 配列の長さ：６６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 ACCCCCGACA TCAACCCTGC CTGGTACGCR GGCCGTGGGA TCCGGCCCGT GGGCCGCTTC 60 GGCCGG 66

【０１４９】

【配列番号：１９】 配列の長さ：９１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Leu Val Leu Val Ile Ala Arg Val Arg Arg Leu His Asn Val Thr Asn 1 5 10 15 Phe Leu Ile Gly Asn Leu Ala Leu Ser Asp Val Leu Met Cys Thr Ala 20 25 30 Cys Val Pro Leu Thr Leu Ala Tyr Ala Phe Glu Pro Arg Gly Trp Val 35 40 45 Phe Gly Gly Gly Leu Cys His Leu Val Phe Phe Leu Gln Pro Val Thr 50 55 60 Val Tyr Val Ser Val Phe Thr Leu Thr Thr Ile Ala Val Asp Arg Tyr 65 70 75 80 Val Val Leu Val His Pro Leu Arg Arg Arg Ile 85 90

【０１５０】

【配列番号：２０】 配列の長さ：５９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ
Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｌｅｕ １ ５
１０ １５ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｌｅｕ
Ａｒｇ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｇｌｙ ２０ ２５
３０ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ａｌａ Ａｓｐ Ｔｒｐ
Ａｓｐ Ａｒｇ Ａｌａ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒｇ ３５ ４０
４５ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｖａｌ
Ｖａｌ Ｖａｌ ５０ ５５

【０１５１】

【配列番号：２１】 配列の長さ：３７０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ｍｅｔ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｐｒｏ
Ａｒｇ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｓｅｒ １ ５
１０ １５ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ
Ａｌａ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ ２０ ２５
３０ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ａｌａ Ｇｌｙ
Ａｌａ Ａｓｐ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｖａｌ Ｔｈｒ ３５ ４０
４５ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｈｉｓ
Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｖａｌ ５０ ５５
６０ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｖａｌ
Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｃｙｓ Ｌｅｕ ６５ ７０
７５ ８０ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｌａ Ａｒｇ Ｖａｌ Ａｒｇ
Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ａｓｎ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｓｎ ８５
９０ ９５ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｓｅｒ
Ａｓｐ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｌａ １００ １０５
１１０ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｔｙｒ Ａｌａ
Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｖａｌ １１５ １２０
１２５ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｖａｌ
Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｔｈｒ １３０ １３５
１４０ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｔｈｒ
Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｔｙｒ １４５ １５０
１５５ １６０ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｒｇ
Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｓｅｒ １６５
１７０ １７５ Ａｌａ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ａｌａ
Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｌｅｕ １８０ １８５
１９０ Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｌａ Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｈｉｓ Ｖａｌ
Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｖａｌ １９５ ２００
２０５ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｔｒｐ Ｇｌｙ Ｓｅｒ
Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｌｅｕ ２１０ ２１５
２２０ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｔｒｐ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ
Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ ２２５ ２３０
２３５ ２４０ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｓｅｒ
Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｖａｌ ２４５
２５０ ２５５ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｇｌｎ
Ａｌａ Ａｓｐ Ｔｒｐ Ａｓｐ Ａｒｇ Ａｌａ Ａｒｇ ２６０ ２６５
２７０ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ
Ｖａｌ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ａｌａ ２７５ ２８０
２８５ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｐｈｅ
Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｓｐ ２９０ ２９５
３００ Ｐｒｏ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｐｈｅ
Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｃｙｓ ３０５ ３１０
３１５ ３２０ Ｈｉｓ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｃｙｓ
Ｔｙｒ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ａｌａ ３２５
３３０ ３３５ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｇｌｕ
Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｌａ ３４０ ３４５
３５０ Ｔｒｐ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｈｉｓ Ｇｌｙ
Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｖａｌ ３５５ ３６０
３６５ Ｖａｌ Ｉｌｅ ３７０

【０１５２】

【配列番号：２２】 配列の長さ：２０６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Leu Val Leu Val Ile Ala Arg Val Arg Arg Leu Tyr Asn Val Thr Asn 1 5 10 15 Phe Leu Ile Gly Asn Leu Ala Leu Ser Asp Val Leu Met Cys Thr Ala 20 25 30 Cys Val Pro Leu Thr Leu Ala Tyr Ala Phe Glu Pro Arg Gly Trp Val 35 40 45 Phe Gly Gly Gly Leu Cys His Leu Val Phe Phe Leu Gln Ala Val Thr 50 55 60 Val Tyr Val Ser Val Phe Thr Leu Thr Thr Ile Ala Val Asp Arg Tyr 65 70 75 80 Val Val Leu Val His Pro Leu Arg Arg Arg Ile Ser Leu Arg Leu Ser 85 90 95 Ala Tyr Ala Val Leu Ala Ile Trp Val Leu Ser Ala Val Leu Ala Leu 100 105 110 Pro Ala Ala Val His Thr Tyr His Val Glu Leu Lys Pro His Asp Val 115 120 125 Arg Leu Cys Glu Glu Phe Trp Gly Ser Gln Glu Arg Gln Arg Gln Leu 130 135 140 Tyr Ala Trp Gly Leu Leu Leu Val Thr Tyr Leu Leu Pro Leu Leu Val 145 150 155 160 Ile Leu Leu Ser Tyr Ala Arg Val Ser Val Lys Leu Arg Asn Arg Val 165 170 175 Val Pro Gly Arg Val Thr Gln Ser Gln Ala Asp Trp Asp Arg Ala Arg 180 185 190 Arg Arg Arg Thr Phe Cys Leu Leu Val Val Val Val Val Val 195 200 205

【０１５３】

【配列番号：２３】 配列の長さ：１２６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Val Val Leu Val His Pro Leu Arg Arg Arg Ile Ser Leu Arg Leu Ser 1 5 10 15 Ala Tyr Ala Val Leu Gly Ile Trp Ala Leu Ser Ala Val Leu Ala Leu 20 25 30 Pro Ala Ala Val His Thr Tyr His Val Glu Leu Lys Pro His Asp Val 35 40 45 Ser Leu Cys Glu Glu Phe Trp Gly Ser Gln Glu Arg Gln Arg Gln Ile 50 55 60 Tyr Ala Trp Gly Leu Leu Leu Gly Thr Tyr Leu Leu Pro Leu Leu Ala 65 70 75 80 Ile Leu Leu Ser Tyr Val Arg Val Ser Val Lys Leu Arg Asn Arg Val 85 90 95 Val Pro Gly Ser Val Thr Gln Ser Gln Ala Asp Trp Asp Arg Ala Arg 100 105 110 Arg Arg Arg Thr Phe Cys Leu Leu Val Val Val Val Val Val 115 120 125

【０１５４】

【配列番号：２４】 配列の長さ：２７３ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 CTGGTGCTGG TGATCGCGCG GGTGCGCCGG CTGCACAACG TGACGAACTT CCTCATCGGC 60 AACCTGGCCT TGTCCGACGT GCTCATGTGC ACCGCCTGCG TGCCGCTCAC GCTGGCCTAT 120 GCCTTCGAGC CACGCGGCTG GGTGTTCGGC GGCGGCCTGT GCCACCTGGT CTTCTTCCTG 180 CAGCCGGTCA CCGTCTATGT GTCGGTGTTC ACGCTCACCA CCATCGCAGT GGACCGGTAC 240 GTCGTGCTGG TGCACCCGCT GAGGCGGCGC ATC 273

【０１５５】

【配列番号：２５】 配列の長さ：１７７ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 GGCCTGCTGC TGGTCACCTA CCTGCTCCCT CTGCTGGTCA TCCTCCTGTC TTACGTCCGG 60 GTGTCAGTGA AGCTCCGCAA CCGCGTGGTG CCGGGCTGCG TGACCCAGAG CCAGGCCGAC 120 TGGGACCGCG CTCGGCGCCG GCGCACCTTC TGCTTGCTGG TGGTGGTCGT GGTGGTG 177

【０１５６】

【配列番号：２６】 配列の長さ：１１１０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 ATGGCCTCAT CGACCACTCG GGGCCCCAGG GTTTCTGACT TATTTTCTGG GCTGCCGCCG 60 GCGGTCACAA CTCCCGCCAA CCAGAGCGCA GAGGCCTCGG CGGGCAACGG GTCGGTGGCT 120 GGCGCGGACG CTCCAGCCGT CACGCCCTTC CAGAGCCTGC AGCTGGTGCA TCAGCTGAAG 180 GGGCTGATCG TGCTGCTCTA CAGCGTCGTG GTGGTCGTGG GGCTGGTGGG CAACTGCCTG 240 CTGGTGCTGG TGATCGCGCG GGTGCGCCGG CTGCACAACG TGACGAACTT CCTCATCGGC 300 AACCTGGCCT TGTCCGACGT GCTCATGTGC ACCGCCTGCG TGCCGCTCAC GCTGGCCTAT 360 GCCTTCGAGC CACGCGGCTG GGTGTTCGGC GGCGGCCTGT GCCACCTGGT CTTCTTCCTG 420 CAGCCGGTCA CCGTCTATGT GTCGGTGTTC ACGCTCACCA CCATCGCAGT GGACCGCTAC 480 GTCGTGCTGG TGCACCCGCT GAGGCGGCGC ATCTCGCTGC GCCTCAGCGC CTACGCTGTG 540 CTGGCCATCT GGGCGCTGTC CGCGGTGCTG GCGCTGCCCG CCGCCGTGCA CACCTATCAC 600 GTGGAGCTCA AGCCGCACGA CGTGCGCCTC TGCGAGGAGT TCTGGGGCTC CCAGGAGCGC 660 CAGCGCCAGC TCTACGCCTG GGGGCTGCTG CTGGTCACCT ACCTGCTCCC TCTGCTGGTC 720 ATCCTCCTGT CTTACGTCCG GGTGTCAGTG AAGCTCCGCA ACCGCGTGGT GCCGGGCTGC 780 GTGACCCAGA GCCAGGCCGA CTGGGACCGC GCTCGGCGCC GGCGCACCTT CTGCTTGCTG 840 GTGGTGGTCG TGGTGGTGTT CGCCGTCTGC TGGCTGCCGC TGCACGTCTT CAACCTGCTG 900 CGGGACCTCG ACCCCCACGC CATCGACCCT TACGCCTTTG GGCTGGTGCA GCTGCTCTGC 960 CACTGGCTCG CCATGAGTTC GGCCTGCTAC AACCCCTTCA TCTACGCCTG GCTGCACGAC 1020 AGCTTCCGCG AGGAGCTGCG CAAACTGTTG GTCGCTTGGC CCCGCAAGAT AGCCCCCCAT 1080 GGCCAGAATA TGACCGTCAG CGTGGTCATC 1110

【０１５７】

【配列番号：２７】 配列の長さ：６１８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 CTGGTGCTGG TGATCGCGCG GGTGCGCCGG CTGTACAACG TGACGAATTT CCTCATCGGC 60 AACCTGGCCT TGTCCGACGT GCTCATGTGC ACCGCCTGCG TGCCGCTCAC GCTGGCCTAT 120 GCCTTCGAGC CACGCGGCTG GGTGTTCGGC GGCGGCCTGT GCCACCTGGT CTTCTTCCTG 180 CAGGCGGTCA CCGTCTATGT GTCGGTGTTC ACGCTCACCA CCATCGCAGT GGACCGCTAC 240 GTCGTGCTGG TGCACCCGCT GAGGCGGCGC ATCTCGCTGC GCCTCAGCGC CTACGCTGTG 300 CTGGCCATCT GGGTGCTGTC CGCGGTGCTG GCGCTGCCCG CCGCCGTGCA CACCTATCAC 360 GTGGAGCTCA AGCCGCACGA CGTGCGCCTC TGCGAGGAGT TCTGGGGCTC CCAGGAGCGC 420 CAGCGCCAGC TCTACGCCTG GGGGCTGCTG CTGGTCACCT ACCTGCTCCC TCTGCTGGTC 480 ATCCTCCTGT CTTACGCCCG GGTGTCAGTG AAGCTCCGCA ACCGCGTGGT GCCGGGCCGC 540 GTGACCCAGA GCCAGGCCGA CTGGGACCGC GCTCGGCGCC GGCGCACCTT CTGCTTGCTG 600 GTGGTGGTCG TGGTGGTG 618

【０１５８】

【配列番号：２８】 配列の長さ：３７８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 ＧＴＧＧＴＴＣＴＧＧ ＴＧＣＡＣＣＣＧＣＴ ＡＣＧＴＣＧＧＣＧＣ ＡＴＴ
ＴＣＡＣＴＧＡ ＧＧＣＴＣＡＧＣＧＣ ＣＴＡＣＧＣＧＧＴＧ ６０ ＣＴＧＧＧＣＡＴＣＴ ＧＧＧＣＴＣＴＡＴＣ ＴＧＣＡＧＴＧＣＴＧ ＧＣＧ
ＣＴＧＣＣＧＧ ＣＣＧＣＧＧＴＧＣＡ ＣＡＣＣＴＡＣＣＡＴ １２０ ＧＴＧＧＡＧＣＴＣＡ ＡＧＣＣＣＣＡＣＧＡ ＣＧＴＧＡＧＣＣＴＣ ＴＧＣ
ＧＡＧＧＡＧＴ ＴＣＴＧＧＧＧＣＴＣ ＧＣＡＧＧＡＧＣＧＣ １８０ ＣＡＡＣＧＣＣＡＧＡ ＴＣＴＡＣＧＣＣＴＧ ＧＧＧＧＣＴＧＣＴＴ ＣＴＧ
ＧＧＣＡＣＣＴ ＡＴＴＴＧＣＴＣＣＣ ＣＣＴＧＣＴＧＧＣＣ ２４０ ＡＴＣＣＴＣＣＴＧＴ ＣＴＴＡＣＧＴＡＣＧ ＧＧＴＧＴＣＡＧＴＧ ＡＡＧ
ＣＴＧＡＧＧＡ ＡＣＣＧＣＧＴＧＧＴ ＧＣＣＴＧＧＣＡＧＣ ３００ ＧＴＧＡＣＣＣＡＧＡ ＧＴＣＡＡＧＣＴＧＡ ＣＴＧＧＧＡＣＣＧＡ ＧＣＧ
ＣＧＴＣＧＣＣ ＧＣＣＧＣＡＣＴＴＴ ＣＴＧＴＣＴＧＣＴＧ ３６０ ＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧ ＴＧＧＴＡＧＴＧ
３７８

【０１５９】

【配列番号：２９】 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＣＧＴＧＧＳＣＭＴＳ ＳＴＧＧＧＣＡＡＣＮ ＹＣＣ
ＴＧ ２５

【０１６０】

【配列番号：３０】 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列

【０１６１】 GTNGWRRGGC ANCCAGCAGA KGGCAAA 27

【０１６２】

【配列番号：３１】 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＣＴＧＴＧＹＧＹＳＡ ＴＹＧＣＮＮＴＫＧＡ ＹＭＧ
ＳＴＡＣ ２７

【０１６３】

【配列番号：３２】 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＡＫＧＷＡＧＷＡＧＧ ＧＣＡＧＣＣＡＧＣＡ ＧＡＮ
ＳＲＹＧＡＡ ２９

【０１６４】

【配列番号：３３】 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CTGACTTATT TTCTGGGCTG CCGC 24

【０１６５】

【配列番号：３４】 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＡＡＣＡＣＣＧＡＣＡ ＣＡＴＡＧＡＣＧＧＴ ＧＡＣ
Ｃ ２４

【０１６６】

【配列番号：３５】 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＧＣＩＣＡＹＣＡＲＣ ＡＹＴＧＹＡＴＧＧＡ
２０

【０１６７】

【配列番号：３６】 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CCIACGGGIC KDATGCCICK GCCIGC 26

【０１６８】

【配列番号：３７】 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＡＣＧＧＧＣＣＫＤＡ ＴＧＣＣＩＣＫＧＣＣ ＩＧＣ
ＲＴＡ ２６

【０１６９】

【配列番号：３８】 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＣＣＧＧＣＧＴＡＣＣ ＡＧＧＣＡＧＧＧＴＴ
２０

【０１７０】

【配列番号：３９】 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AGGCAGGGTT GATGTCGGGG GTGCGGAT 28

【０１７１】

【配列番号：４０】 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧ ＡＧＣＣＣＡＣＣＡＧ ＣＡＣ
ＴＣＣＡ ２７

【０１７２】

【配列番号：４１】 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＧＴＧＧＧＧＧＣＣＴ ＧＧＣＴＣＣＴＣＴＧ ＣＣＴ
ＧＣＴＧ ２７

【０１７３】

【配列番号：４２】 配列の長さ：３２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GTGTCGACGA ATGAAGGCGG TGGGGGCCTG GC 32

【０１７４】

【配列番号：４３】 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＡＧＧＣＴＣＣＣＧＣ ＴＧＴＴＡＴＴＣＣＴ ＧＧＡ
Ｃ ２４

【０１７５】

【配列番号：４４】 配列の長さ：９８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｌｅｕ
Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｌｅｕ １ ５
１０ １５ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ａｌａ
Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｉｌｅ ２０ ２５
３０ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｔｒｐ
Ｔｙｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ａｒｇ ３５ ４０
４５ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒｇ
Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｐｒｏ ５０ ５５
６０ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｇｌｙ ６５ ７０
７５ ８０ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ
Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｖａｌ ８５
９０ ９５ Ｇｌｎ Ｇｌｕ

【０１７６】

【配列番号：４５】 配列の長さ：８３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Met Ala Leu Lys Thr Trp Leu Leu Cys Leu Leu Leu Leu Ser Leu Val 1 5 10 15 Leu Pro Gly Ala Ser Ser Arg Ala His Gln His Ser Met Glu Thr Arg 20 25 30 Thr Pro Asp Ile Asn Pro Ala Trp Tyr Thr Gly Arg Gly Ile Arg Pro 35 40 45 Val Gly Arg Phe Gly Arg Arg Arg Ala Thr Pro Arg Asp Val Thr Gly 50 55 60 Leu Gly Gln Leu Ser Cys Leu Pro Leu Asp Gly Arg Thr Lys Phe Ser 65 70 75 80 Gln Arg Gly

【０１７７】

【配列番号：４６】 配列の長さ：２４９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 ATGGCCCTGA AGACGTGGCT TCTGTGCTTG CTGCTGCTAA GCTTGGTCCT CCCAGGGGCT 60 TCCAGCCGAG CCCACCAGCA CTCCATGGAG ACAAGAACCC CTGATATCAA TCCTGCCTGG 120 TACACGGGCC GCGGGATCAG GCCTGTGGGC CGCTTCGGCA GGAGAAGGGC AACCCCGAGG 180 GATGTCACTG GACTTGGCCA ACTCAGCTGC CTCCCACTGG ATGGACGCAC CAAGTTCTCT 240 CAGCGTGGA 249

【０１７８】

【配列番号：４７】 配列の長さ：３１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ser Arg Ala His Gln His Ser Met Glu Thr Arg Thr Pro Asp Ile Asn 1 5 10 15 Pro Ala Trp Tyr Thr Gly Arg Gly Ile Arg Pro Val Gly Arg Phe 20 25 30

【０１７９】

【配列番号：４８】 配列の長さ：３２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ser Arg Ala His Gln His Ser Met Glu Thr Arg Thr Pro Asp Ile Asn 1 5 10 15 Pro Ala Trp Tyr Thr Gly Arg Gly Ile Arg Pro Val Gly Arg Phe Gly 20 25 30

【０１８０】

【配列番号：４９】 配列の長さ：３３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ｓｅｒ Ａｒｇ Ａｌａ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ｇｌｕ
Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ａｓｎ １ ５
１０ １５ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｔｒｐ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｉｌｅ
Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇｌｙ ２０ ２５
３０ Ａｒｇ

【０１８１】

【配列番号：５０】 配列の長さ：２０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｔｒｐ Ｔｙｒ
Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｐｒｏ １ ５
１０ １５ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｐｈｅ ２０

【０１８２】

【配列番号：５１】 配列の長さ：２１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Pro Asp Ile Asn Pro Ala Trp Tyr Thr Gly Arg Gly Ile Arg Pro 1 5 10 15 Val Gly Arg Phe Gly 20

【０１８３】

【配列番号：５２】 配列の長さ：２２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Pro Asp Ile Asn Pro Ala Trp Tyr Thr Gly Arg Gly Ile Arg Pro 1 5 10 15 Val Gly Arg Phe Gly Arg 20

【０１８４】

【配列番号：５３】 配列の長さ：９３ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 AGCCGAGCCC ACCAGCACTC CATGGAGACA AGAACCCCTG ATATCAATCC TGCCTGGTAC 60 ACGGGCCGCG GGATCAGGCC TGTGGGCCGC TTC 93

【０１８５】

【配列番号：５４】 配列の長さ：９６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 AGCCGAGCCC ACCAGCACTC CATGGAGACA AGAACCCCTG ATATCAATCC TGCCTGGTAC 60 ACGGGCCGCG GGATCAGGCC TGTGGGCCGC TTCGGC 96

【０１８６】

【配列番号：５５】 配列の長さ：９９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 AGCCGAGCCC ACCAGCACTC CATGGAGACA AGAACCCCTG ATATCAATCC TGCCTGGTAC 60 ACGGGCCGCG GGATCAGGCC TGTGGGCCGC TTCGGCAGG 99

【０１８７】

【配列番号：５６】 配列の長さ：６０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 ACCCCTGATA TCAATCCTGC CTGGTACACG GGCCGCGGGA TCAGGCCTGT GGGCCGCTTC 60

【０１８８】

【配列番号：５７】 配列の長さ：６３ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 ＡＣＣＣＣＴＧＡＴＡ ＴＣＡＡＴＣＣＴＧＣ ＣＴＧＧＴＡＣＡＣＧ ＧＧＣ
ＣＧＣＧＧＧＡ ＴＣＡＧＧＣＣＴＧＴ ＧＧＧＣＣＧＣＴＴＣ ６０ ＧＧＣ
６３

【０１８９】

【配列番号：５８】 配列の長さ：６６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 ＡＣＣＣＣＴＧＡＴＡ ＴＣＡＡＴＣＣＴＧＣ ＣＴＧＧＴＡＣＡＣＧ ＧＧＣ
ＣＧＣＧＧＧＡ ＴＣＡＧＧＣＣＴＧＴ ＧＧＧＣＣＧＣＴＴＣ ６０ ＧＧＣＡＧＧ
６６

【０１９０】

【配列番号：５９】 配列の長さ：８７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Met Lys Val Leu Arg Ala Trp Leu Leu Cys Leu Leu Met Leu Gly Leu 1 5 10 15 Ala Leu Arg Gly Ala Ala Ser Arg Thr His Arg His Ser Met Glu Ile 20 25 30 Arg Thr Pro Asp Ile Asn Pro Ala Trp Tyr Ala Ser Arg Gly Ile Arg 35 40 45 Pro Val Gly Arg Phe Gly Arg Arg Arg Ala Thr Leu Gly Asp Val Pro 50 55 60 Lys Pro Gly Leu Arg Pro Arg Leu Thr Cys Phe Pro Leu Glu Gly Gly 65 70 75 80 Ala Met Ser Ser Gln Asp Gly 85

【０１９１】

【配列番号：６０】 配列の長さ：２６１ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 ATGAAGGTGC TGAGGGCCTG GCTCCTGTGC CTGCTGATGC TGGGCCTGGC CCTGCGGGGA 60 GCTGCAAGTC GTACCCATCG GCACTCCATG GAGATCCGCA CCCCTGACAT CAATCCTGCC 120 TGGTACGCCA GTCGCGGGAT CAGGCCTGTG GGCCGCTTCG GTCGGAGGAG GGCAACCCTG 180 GGGGACGTCC CCAAGCCTGG CCTGCGACCC CGGCTGACCT GCTTCCCCCT GGAAGGCGGT 240 GCTATGTCGT CCCAGGATGG C 261

【０１９２】

【配列番号：６１】 配列の長さ：３１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ser Arg Thr His Arg His Ser Met Glu Ile Arg Thr Pro Asp Ile Asn 1 5 10 15 Pro Ala Trp Tyr Ala Ser Arg Gly Ile Arg Pro Val Gly Arg Phe 20 25 30

【０１９３】

【配列番号：６２】 配列の長さ：３２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ser Arg Thr His Arg His Ser Met Glu Ile Arg Thr Pro Asp Ile Asn 1 5 10 15 Pro Ala Trp Tyr Ala Ser Arg Gly Ile Arg Pro Val Gly Arg Phe Gly 20 25 30

【０１９４】

【配列番号：６３】 配列の長さ：３３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ser Arg Thr His Arg His Ser Met Glu Ile Arg Thr Pro Asp Ile Asn 1 5 10 15 Pro Ala Trp Tyr Ala Ser Arg Gly Ile Arg Pro Val Gly Arg Phe Gly 20 25 30 Arg

【０１９５】

【配列番号：６４】 配列の長さ：２０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Pro Asp Ile Asn Pro Ala Trp Tyr Ala Ser Arg Gly Ile Arg Pro 1 5 10 15 Val Gly Arg Phe 20

【０１９６】

【配列番号：６５】 配列の長さ：２１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Pro Asp Ile Asn Pro Ala Trp Tyr Ala Ser Arg Gly Ile Arg Pro 1 5 10 15 Val Gly Arg Phe Gly 20

【０１９７】

【配列番号：６６】 配列の長さ：２２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Pro Asp Ile Asn Pro Ala Trp Tyr Ala Ser Arg Gly Ile Arg Pro 1 5 10 15 Val Gly Arg Phe Gly Arg 20

【０１９８】

【配列番号：６７】 配列の長さ：９３ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 AGTCGTACCC ATCGGCACTC CATGGAGATC CGCACCCCTG ACATCAATCC TGCCTGGTAC 60 GCCAGTCGCG GGATCAGGCC TGTGGGCCGC TTC 93

【０１９９】

【配列番号：６８】 配列の長さ：９６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 AGTCGTACCC ATCGGCACTC CATGGAGATC CGCACCCCTG ACATCAATCC TGCCTGGTAC 60 GCCAGTCGCG GGATCAGGCC TGTGGGCCGC TTCGGT 96

【０２００】

【配列番号：６９】 配列の長さ：９９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 ＡＧＴＣＧＴＡＣＣＣ ＡＴＣＧＧＣＡＣＴＣ ＣＡＴＧＧＡＧＡＴＣ ＣＧＣ
ＡＣＣＣＣＴＧ ＡＣＡＴＣＡＡＴＣＣ ＴＧＣＣＴＧＧＴＡＣ ６０ ＧＣＣＡＧＴＣＧＣＧ ＧＧＡＴＣＡＧＧＣＣ ＴＧＴＧＧＧＣＣＧＣ ＴＴＣ
ＧＧＴＣＧＧ ９９

【０２０１】

【配列番号：７０】 配列の長さ：６０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 ＡＣＣＣＣＴＧＡＣＡ ＴＣＡＡＴＣＣＴＧＣ ＣＴＧＧＴＡＣＧＣＣ ＡＧＴ
ＣＧＣＧＧＧＡ ＴＣＡＧＧＣＣＴＧＴ ＧＧＧＣＣＧＣＴＴＣ ６０

【０２０２】

【配列番号：７１】 配列の長さ：６３ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 ACCCCTGACA TCAATCCTGC CTGGTACGCC AGTCGCGGGA TCAGGCCTGT GGGCCGCTTC 60 GGT 63

【０２０３】

【配列番号：７２】 配列の長さ：６６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 ACCCCTGACA TCAATCCTGC CTGGTACGCC AGTCGCGGGA TCAGGCCTGT GGGCCGCTTC 60 GGTCGG 66

【０２０４】

【配列番号：７３】 配列の長さ：２１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴：第１０番目のXaaはAlaもしくはThr、第１
１番目のXaaはGlyもしくはSer、第２１番目のXaaはH、G
lyもしくはGlyArgを示す。 配列 Thr Pro Asp Ile Asn Pro Ala Trp Tyr Xaa Xaa Arg Gly Ile Arg Pro 1 5 10 15 Val Gly Arg Phe Xaa 20

【０２０５】

【配列番号：７４】 配列の長さ：１１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴：第３番目のXaaはAlaもしくはThr、第５番
目のXaaはGlnもしくはArg、第１０番目のXaaはIleもし
くはThrを示す。 配列 Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｘａａ Ｈｉｓ Ｘａａ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ｇｌｕ
Ｘａａ Ａｒｇ １ ５
１０

【０２０６】

【配列番号：７５】 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＣＡＲＣＡＹＴＣＣＡ ＴＧＧＡＧＡＣＡＡＧ ＡＡＣ
ＣＣＣ ２６

【０２０７】

【配列番号：７６】 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TACCAGGCAG GATTGATACA GGGG 24

【０２０８】

【配列番号：７７】 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＧＧＣＡＴＣＡＴＣＣ ＡＧＧＡＡＧＡＣＧＧ ＡＧＣ
ＡＴ ２５

【０２０９】

【配列番号：７８】 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＡＧＣＡＧＡＧＧＡＧ ＡＧＧＧＡＧＧＧＴＡ ＧＡＧ
ＧＡ ２５

【０２１０】

【配列番号：７９】 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ACGTGGCTTC TGTGCTTGCT GC 22

【０２１１】

【配列番号：８０】 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＧＣＣＴＧＡＴＣＣＣ ＧＣＧＧＣＣＣＧＴＧ ＴＡＣ
ＣＡ ２５

【０２１２】

【配列番号：８１】 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＴＴＧＣＣＣＴＴＣＴ ＣＣＴＧＣＣＧＡＡＧ ＣＧＧ
ＣＣＣ ２６

【０２１３】

【配列番号：８２】 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GGCGGGGGCT GCAAGTCGTA CCCATCG 27

【０２１４】

【配列番号：８３】 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＣＧＧＣＡＣＴＣＣＡ ＴＧＧＡＧＡＴＣＣＧ ＣＡＣ
ＣＣＣＴ ２７

【０２１５】

【配列番号：８４】 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＣＡＧＧＣＡＧＧＡＴ ＴＧＡＴＧＴＣＡＧＧ ＧＧＴ
ＧＣＧＧ ２７

【０２１６】

【配列番号：８５】 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CATGGAGTGC CGATGGGTAC GACTTGC 27

【０２１７】

【配列番号：８６】 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＧＧＣＣＴＣＣＴＣＧ ＧＡＧＧＡＧＣＣＡＡ ＧＧＧ
ＡＴＧＡ ２７

【０２１８】

【配列番号：８７】 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＧＧＧＡＡＡＧＧＡＧ ＣＣＣＧＡＡＧＧＡＧ ＡＧＧ
ＡＧＡＧ ２７

【０２１９】

【配列番号：８８】 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CCTGCTGGCC ATTCTCCTGT CTTAC 25

【０２２０】

【配列番号：８９】 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＧＧＧＴＣＣＡＧＧＴ ＣＣＣＧＣＡＧＡＡＧ ＧＴＴ
ＧＡ ２５

【０２２１】

【配列番号：９０】 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＧＡＡＧＡＣＧＧＡＧ ＣＡＴＧＧＣＣＣＴＧ ＡＡＧ
ＡＣ ２５

【０２２２】

【配列番号：９１】 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GGCAGCTGAG TTGGCCAAGT CCAGT 25

【０２２３】

【配列番号：９２】 配列の長さ：１５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ｓｅｒ Ａｒｇ Ａｌａ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ｇｌｕ
Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｃｙｓ １ ５
１０ １５

【０２２４】

【配列番号：９３】 配列の長さ：１５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ｃｙｓ Ａｌａ Ｔｒｐ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｉｌｅ
Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｐｈｅ １ ５
１０ １５

【０２２５】

【配列番号：９４】 配列の長さ：１５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Cys Glu Ile Arg Thr Pro Asp Ile Asn Pro Ala Trp Tyr Ala Gly 1 5 10 15

【０２２６】

【配列番号：９５】 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＡＧＡＴＴＧＧＣＡＴ ＣＡＴＣＣＡＧＧＡＡ ＧＡＣ
ＧＧＡＧＣＡＴ ３０

【０２２７】

【配列番号：９６】 配列の長さ：３１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＧＣＴＧＡＣＴＣＧＡ ＣＡＧＣＡＣＴＧＴＣ ＴＴＣ
ＴＣＧＡＧＣＴ Ｇ ３１

【配列番号：９７】 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AACCCCTTCA TCTATGCGTG G 21

【配列番号：９８】 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ATATTCTGGC CATGAGGCAC 20

【配列番号：９９】 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TTCCGAGAGG AGCTACGCAA GATGCTTC 28

【０２２８】

【図面の簡単な説明】

【図１】ヒト下垂体由来ｃＤＮＡを用いてＰＣＲ法によ
って単離したｃＤＮＡクローンｐ１９Ｐ２に含まれるヒ
ト下垂体由来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質ｃＤＮＡ
断片の塩基配列およびそれにコードされるアミノ酸配列
を示す。配列決定に用いたプライマーは−２１Ｍ１３で
ある。下線で示した部分は合成プライマーに相当する部
分である。

【図２】ヒト下垂体由来ｃＤＮＡを用いてＰＣＲ法によ
って単離したｃＤＮＡクローンｐ１９Ｐ２に含まれるヒ
ト下垂体由来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質ｃＤＮＡ
断片の塩基配列およびそれにコードされるアミノ酸配列
を示す。配列決定に用いたプライマーはＭ１３ＲＶ-Ｎ
（タカラ）である。下線で示した部分は合成プライマー
に相当する部分である。

【図３】図１に示したアミノ酸配列をもとに作成した、
ｐ１９Ｐ２に含まれるヒト下垂体由来Ｇ蛋白質共役型レ
セプター蛋白質ｃＤＮＡ断片にコードされる蛋白質の部
分疎水性プロットを示す。

【図４】図２に示したアミノ酸配列をもとに作成した、
ｐ１９Ｐ２に含まれるヒト下垂体由来Ｇ蛋白質共役型レ
セプター蛋白質ｃＤＮＡ断片にコードされる蛋白質の部
分疎水性プロットを示す。

【図５】図１および図２に示したｐ１９Ｐ２に含まれる
ヒト下垂体由来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質ｃＤＮ
Ａ断片にコードされる蛋白質の部分アミノ酸配列を、公
知のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質であるＳ１２８６
３と比較した図を示す。黒く塗った部分は一致している
部分を示す。ｐ１９Ｐ２の第１番目〜第９９番目のアミ
ノ酸配列は図１の第１番目〜第９９番目のアミノ酸配列
に対応し、第１５６番目〜第２３０番目のアミノ酸配列
は図２の第１番目〜第６８番目のアミノ酸配列に対応す
る。

【図６】ＭＩＮ６由来ｃＤＮＡを用いてＰＣＲ法によっ
て単離したｃＤＮＡクローンｐＧ３−２およびｐＧ１−
１０にそれぞれ含まれるＭＩＮ６由来のＧ蛋白質共役型
レセプター蛋白質ｃＤＮＡ断片の塩基配列に基づいて導
き出したＭＩＮ６由来のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白
質ｃＤＮＡ断片の塩基配列およびそれにコードされるア
ミノ酸配列の前半部（第1番〜第324番目の塩基配列およ
びそれにコードされるアミノ酸配列）を示す。下線で示
した部分は合成プライマーに相当する部分である。

【図７】ＭＩＮ６由来ｃＤＮＡを用いてＰＣＲ法によっ
て単離したｃＤＮＡクローンｐＧ３−２およびｐＧ１−
１０にそれぞれ含まれるＭＩＮ６由来のＧ蛋白質共役型
レセプター蛋白質ｃＤＮＡ断片の塩基配列に基づいて導
き出したＭＩＮ６由来のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白
質ｃＤＮＡ断片の塩基配列およびそれにコードされるア
ミノ酸配列の後半部（第325番〜第669番目の塩基配列お
よびそれにコードされるアミノ酸配列）を示す。下線で
示した部分は合成プライマーに相当する部分である。

【図８】図６および図７に示したＭＩＮ６由来のＧ蛋白
質共役型レセプター蛋白質の部分アミノ酸配列（ｐＧ３
−２／ｐＧ１−１０）を、図１および図２に示したｐ１
９Ｐ２にコードされる蛋白質の部分アミノ酸配列と比較
した図を示す。黒塗りの部分は配列が一致している部分
を示す。ｐ１９Ｐ２の第１番目〜第９９番目のアミノ酸
配列は図１の第１番目〜第９９番目のアミノ酸配列に対
応し、第１５６番目〜第２２３番目のアミノ酸配列は図
２の第１番目〜第６８番目のアミノ酸配列に対応する。
ｐＧ３−２／ｐＧ１−１０の第１番目〜第２２３番目の
アミノ酸配列は図６の第１番目〜第２２３番目のアミノ
酸配列に対応する。

【図９】図６および図７に示した部分アミノ酸配列をも
とに作成した、ＭＩＮ６由来のＧ蛋白質共役型レセプタ
ー蛋白質の部分疎水性プロットを示す。

【図１０】ｐ１９Ｐ２に挿入されているＤＮＡ断片をプ
ローブとして用いて、ヒト下垂体由来ｃＤＮＡライブラ
リーよりプラークハイブリダイゼーション法によって単
離したｃＤＮＡクローンｐｈＧＲ３に含まれるヒト下垂
体由来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質ｃＤＮＡの全塩
基配列およびそれにコードされるアミノ酸配列の前半部
分（塩基配列については第１〜720番目、アミノ酸配列
については第1〜201番目）を示す。

【図１１】ｐ１９Ｐ２に挿入されているＤＮＡ断片をプ
ローブとして用いて、ヒト下垂体由来ｃＤＮＡライブラ
リーよりプラークハイブリダイゼーション法によって単
離したｃＤＮＡクローンｐｈＧＲ３に含まれるヒト下垂
体由来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質ｃＤＮＡの全塩
基配列およびそれにコードされるアミノ酸配列の後半部
分（塩基配列については第721〜1331番目、アミノ酸配
列については第202〜371番目）を示す。

【図１２】ヒト下垂体由来のｃＤＮＡクローンｐｈＧＲ
３がコードするレセプター遺伝子のヒト下垂体ｍＲＮＡ
に対するノーザンブロットの結果を示す。

【図１３】図１０および図１１に示したアミノ酸配列を
もとに作成した、ｐｈＧＲ３に含まれるヒト下垂体由来
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質ｃＤＮＡにコードされ
る蛋白質の疎水性プロットを示す。

【図１４】ＭＩＮ６由来ｃＤＮＡを用いてＰＣＲ法によ
って単離したｃＤＮＡクローンｐ５Ｓ３８に含まれるＭ
ＩＮ６由来のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質ｃＤＮＡ
断片の塩基配列およびそれにコードされるアミノ酸配列
を示す。下線で示した部分は合成プライマーに相当する
部分である。

【図１５】図１４に示したＭＩＮ６由来のＧ蛋白質共役
型レセプター蛋白質の部分アミノ酸配列（ｐ５Ｓ３８）
を、図１および図２に示したｐ１９Ｐ２に含まれるｃＤ
ＮＡ断片にコードされるＧ蛋白質共役型レセプター蛋白
質の部分アミノ酸配列、および図６および図７に示した
ｐＧ３−２ならびにｐＧ１−１０にそれぞれ含まれるｃ
ＤＮＡ断片の塩基配列から導きだした塩基配列にコード
されるＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質の部分アミノ酸
配列と比較した図を示す。黒塗りの部分は配列が一致し
ている部分を示す。ｐ５Ｓ３８の第１番目〜第１４４番
目のアミノ酸配列は図１４の第１番目〜第１４４番目の
アミノ酸配列に対応する。ｐ１９Ｐ２の第１番目〜第９
９番目のアミノ酸配列は図１の第１番目〜第９９番目の
アミノ酸配列に対応し、第１５６番目〜第２２３番目の
アミノ酸配列は図２の第１番目〜第６８番目のアミノ酸
配列に対応する。ｐＧ３−２／ｐＧ１−１０の第１番目
〜第２２３番目のアミノ酸配列は図６および図７の第１
番目〜第２２３番目のアミノ酸配列に対応する。

【図１６】図１４に示した部分アミノ酸配列をもとに作
成した、ｐ５Ｓ３８に含まれるＭＩＮ６由来Ｇ蛋白質共
役型レセプター蛋白質ｃＤＮＡ断片にコードされる蛋白
質の部分疎水性プロットを示す。

【図１７】pAKKO-19P2を導入したCHO細胞でmRNAが発現
していることを確認するためにRT-PCRを行った。レーン
１から７は比較のためにpAKKO-19P2を段階的に希釈して
PCRを行ったもので、10μg/μlのプラスミドをそれぞれ
原液（レーン１）、1/2希釈（レーン２）、1/4希釈（レ
ーン３）、1/64希釈（レーン４）、1/256希釈（レーン
５）、1/1024希釈（レーン６）、１/4096希釈（レーン
７）した鋳型を使ってPCRを行ったものについて1.2％ア
ガロースゲル電気泳動により解析した結果である。レー
ン８から11はCHO-19P2細胞株から調製したcDNAをそれぞ
れ1/10希釈（レーン８）、1/100希釈（レーン９）、1/1
000希釈（レーン10）したものを鋳型としてPCRを行った
ものを電気泳動した。レーン11はcDNA の合成をreverse
transcriptaseなしで行ったものを鋳型としてPCRを行
ったものを電気泳動した。レーン12および13はそれぞれ
mock CHO細胞からreverse transcriptase添加および無
添加で調製したcDNAを鋳型としてPCRを行ったものを電
気泳動した。MはDNAのサイズマーカーであり両端のレー
ンはλ/Sty I digest（ニッポンジーン）を右から２番
目はφχ174/Hinc II digest（ニッポンジーン）をそれ
ぞれ1μgを電気泳動した。矢印は約400bpのPCRにより増
幅されたバンドの位置を示している。

【図１８】ラット全脳から抽出した粗リガンドペプチド
画分についてCHO-19P2細胞株からのアラキドン酸代謝物
の遊離を促進する活性を測定した。アラキドン酸代謝物
の遊離促進活性は0.05%BSAを含むHBSSを加えた時に遊離
された[³H]アラキドン酸代謝物の量を100％として、リ
ガンドペプチド粗画分を加えた時に放出されるアラキド
ン酸代謝物の量を％として表した。30% CH₃CN の画分に
CHO-19P2細胞株からアラキドン酸代謝物の遊離を促進す
る活性が認められた。

【図１９】ウシ視床下部から抽出した粗リガンドペプチ
ド画分についてCHO-19P2細胞株からのアラキドン酸代謝
物の遊離を促進する活性を測定した。アラキドン酸代謝
物の遊離を促進する活性は0.05%BSAを含むHBSSを加えた
時に遊離された[³H]アラキドン酸代謝物の量を100％と
して、リガンドペプチド粗画分を加えた時に放出される
アラキドン酸代謝物の量を％として表した。ラット全脳
から抽出した粗リガンドペプチド画分と同様に30% CH₃C
N の画分にCHO-19P2細胞株からアラキドン酸代謝物の遊
離を促進する活性が認められた。

【図２０】逆相カラム C18 218TP5415 で精製した画分
についてCHO-19P2細胞株に特異的なアラキドン酸代謝物
の遊離を促進する活性を測定した。RESOURCE Sの活性画
分を C18 218TP5415 で分離した。流速 1ml/min、20%-3
0% CH₃CN/0.1%TFA/H₂O の濃度勾配でクロマトグラフィ
ーを行い、溶出液を1ml ずつ分取し、凍結乾燥後、各フ
ラクションに含まれるCHO-19P2細胞株に特異的なアラキ
ドン酸代謝物遊離促進活性を測定した。その結果、活性
は、３つ(溶出順にそれぞれP-1、P-2、P-3と呼ぶ)に分
離した。

【図２１】逆相カラム diphenyl 219TP5415 で精製した
画分についてCHO-19P2細胞株に特異的なアラキドン酸代
謝物の遊離を促進する活性を測定した。C18 218TP5415
のP-3活性画分を diphenyl 219TP5415 で分離した。流
速 1ml/min、22%-25% CH₃CN/0.1%TFA/H₂O の濃度勾配で
クロマトグラフィーを行い、溶出液を1mlずつ分取し、
凍結乾燥後、各フラクションに含まれるCHO-19P2細胞株
に特異的なアラキドン酸代謝物遊離促進活性を測定し
た。その結果、活性は１つのピークに収束した。

【図２２】逆相カラム μRPC C2/C18 SC 2.1/10 で精製
した画分についてCHO-19P2細胞株に特異的なアラキドン
酸代謝物の遊離を促進する活性を測定した。diphenyl 2
19TP5415 で活性と一致したピークの画分を μRPC C2/C
18 SC 2.1/10 で分離した。流速 100μl/min、22%-23.5
% CH₃CN/0.1%TFA/H₂O の濃度勾配でクロマトグラフィー
を行い、溶出液を100μl ずつ分取し、凍結乾燥後、各
フラクションに含まれるCHO-19P2細胞株に特異的なアラ
キドン酸代謝物遊離促進活性を測定した。その結果、活
性は単一の物質(ペプチド)と思われる二つのピークに一
致した。

【図２３】逆相カラムμＲＰＣ Ｃ２／Ｃ１８ ＳＣ ２.
１／１０で精製したＰ-２画分についてＣＨＯ-１９Ｐ２
細胞株から特異的にアラキドン酸代謝物の遊離を促進す
る活性を測定した。流速１００μl/min、２１.５％−２
３.０％ ＣＨ₃ＣＮ／０.１％ ＴＦＡ／蒸留水の濃度勾
配でクロマトグラフィーを行い、溶出液を１００μｌず
つ分取し、凍結乾燥後、各フラクションに含まれるＣＨ
Ｏ-１９Ｐ２細胞株から特異的にアラキドン酸代謝物の
遊離を促進する活性を測定した。その結果、活性は、単
一のペプチドと思われるペプチドのピークに一致した。

【図２４】ウシ視床下部由来ｃＤＮＡを用いてＰＣＲ法
によって単離したｃＤＮＡクローンに含まれるウシ視床
下部由来のＣＨＯ−１９Ｐ２細胞株から特異的にアラキ
ドン酸代謝物の遊離を促進するリガンドポリペプチドｃ
ＤＮＡ断片の塩基配列に基づいて導き出した該ウシ視床
下部由来リガンドポリペプチドｃＤＮＡ断片の塩基配列
およびそれにコードされるアミノ酸配列を示す。矢印で
示した部分は合成プライマーに相当する部分である。

【図２５】ウシ視床下部由来ｃＤＮＡを用いてＰＣＲ法
によって単離したｃＤＮＡクローンに含まれるウシ視床
下部由来のＣＨＯ−１９Ｐ２細胞株から特異的にアラキ
ドン酸代謝物の遊離を促進するリガンドポリペプチドｃ
ＤＮＡ断片の塩基配列に基づいて導き出した該ウシ視床
下部由来リガンドポリペプチドｃＤＮＡ断片の塩基配列
およびそれにコードされるアミノ酸配列を示す。矢印で
示した部分は合成プライマーに相当する部分である。

【図２６】ウシ視床下部由来のＣＨＯ−１９Ｐ２細胞株
から特異的にアラキドン酸代謝物の遊離を促進するリガ
ンドポリペプチドのアミノ酸配列および配列番号：１、
配列番号４４に示したリガンドポリペプチドの全コード
領域をコードするｃＤＮＡ配列である。

【図２７】ウシ視床下部由来のＣＨＯ−１９Ｐ２細胞株
から特異的にアラキドン酸代謝物の遊離を促進するリガ
ンドポリペプチドのアミノ酸配列および配列番号：１、
配列番号４４に示したリガンドポリペプチドの全コード
領域をコードするｃＤＮＡ配列である。

【図２８】合成リガンドポリペプチド（１９Ｐ２−Ｌ３
１）についてＣＨＯ−１９Ｐ２細胞株からの特異的なア
ラキドン酸代謝物遊離活性を濃度依存的に測定した。合
成ペプチドは、脱気処理した蒸留水に１０^-3Ｍの濃度で
溶解し、０．０５％ＢＳＡを含むＨＢＳＳで１０^-12Ｍ
〜１０^-6Ｍの濃度に希釈した。アラキドン酸代謝物遊離
活性は、希釈液を細胞に添加した時に上清に遊離される
［³Ｈ］アラキドン酸代謝物の実測放射線量で表した。
その結果、１９Ｐ２−Ｌ３１によるＣＨＯ−１９Ｐ２細
胞株に特異的なアラキドン酸代謝物遊離活性が濃度依存
的に認められた。

【図２９】合成リガンドポリペプチド（１９Ｐ２−Ｌ３
１（Ｏ））についてＣＨＯ−１９Ｐ２細胞株からの特異
的なアラキドン酸代謝物遊離活性を濃度依存的に測定し
た。合成リガンドポリペプチドは、脱気処理した蒸留水
に１０^-3Ｍの濃度で溶解し、０．０５％ＢＳＡを含むＨ
ＢＳＳで１０^-12Ｍ〜１０^-6Ｍの濃度に希釈した。アラ
キドン酸代謝物遊離活性は、希釈液を細胞に添加した時
に上清に遊離される［³Ｈ］アラキドン酸代謝物の実測
放射線量で表した。その結果、１９Ｐ２−Ｌ３１（Ｏ）
によるＣＨＯ−１９Ｐ２細胞株に特異的なアラキドン酸
代謝物遊離活性が濃度依存的に認められた。

【図３０】合成リガンドポリペプチド１９Ｐ２−Ｌ２０
についてＣＨＯ−１９Ｐ２細胞株からの特異的なアラキ
ドン酸代謝物遊離活性を濃度依存的に測定した。合成ペ
プチドは、脱気処理した蒸留水に１０^-3Ｍの濃度で溶解
し、０．０５％ＢＳＡを含むＨＢＳＳで１０^-12Ｍ〜１
０^-6Ｍの濃度に希釈した。アラキドン酸代謝物遊離活性
は、希釈液を細胞に添加した時に上清に遊離される［³
Ｈ］アラキドン酸代謝物の実測放射線量で表した。その
結果、１９Ｐ２−Ｌ２０によるＣＨＯ−１９Ｐ２細胞株
に特異的なアラキドン酸代謝物遊離活性が濃度依存的に
認められた。

【図３１】ウシゲノムライブラリーよりクローン化した
ファージのＤＮＡを制限酵素BamHI（Ｂ）およびSalI
（Ｓ）で切断し、１．２％アガロースゲル電気泳動を行
ったパターンを示す。ＤＮＡのサイズマーカー（Ｍ）に
はλファージＤＮＡのStyI消化物を用いた。Ｂのレーン
ではマーカーの１番目（19,329bp)と２番目(7,743bp)の
バンドの間に相当する位置にベクター由来の２本のバン
ドが検出され、その他に３番目(6,223bp)から５番目(3,
472bp)の間に挿入断片由来の３本のバンドが検出され
た。Ｓのレーンでは同じくベクター由来の２本のバンド
が検出されているが、挿入断片由来のバンドが重なって
いるために上側のバンドがＢのレーンに比べて太くなっ
ている。

【図３２】ウシゲノムＤＮＡから解読したコード領域付
近の塩基配列を示す。１〜３番目の塩基（ＡＴＧ）が翻
訳開始コドンに相当し、７６７〜７６９番目の塩基（Ｔ
ＡＡ）が翻訳終止コドンに相当する。

【図３３】ウシゲノムＤＮＡから解読したコード領域付
近の塩基配列(genome)をＰＣＲ法によってクローニング
したウシｃＤＮＡの塩基配列(cDNA)と比較した結果の前
半部を示す（図３４へ続く）。配列の一致している部分
は網掛けで示した。１０１番目〜５７２番目の部分はｃ
ＤＮＡの塩基配列には相当する部分が無く、イントロン
であることが判明した。

【図３４】ウシゲノムＤＮＡから解読したコード領域付
近の塩基配列(genome)をＰＣＲ法によってクローニング
したウシｃＤＮＡの塩基配列(cDNA)と比較した結果の後
半部を示す（図３３の続き）。配列の一致している部分
は網掛けで示した。１０１番目〜５７２番目の部分はｃ
ＤＮＡの塩基配列には相当する部分が無く、イントロン
であることが判明した。

【図３５】ウシゲノムＤＮＡから解読したコード領域付
近の塩基配列からイントロン部分を除き、コードされる
アミノ酸配列に翻訳した結果を示す。

【図３６】ラット型リガンドポリペプチドの全長アミノ
酸配列および全コード領域をコードするｃＤＮＡ配列で
ある。

【図３７】ウシ型リガンドポリペプチドのアミノ酸配列
の前半部（図３８に続く）およびウシ型ポリペプチド、
ラット型ポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列の
前半部（図３８に続く）を示す。矢印で示した部分は合
成プライマーに相当する部分である。

【図３８】ウシ型リガンドポリペプチドのアミノ酸配列
の後半部（図３７の続き）およびウシ型ポリペプチド、
ラット型ポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列の
後半部（図３７の続き）を示す。矢印で示した部分は合
成プライマーに相当する部分である。

【図３９】ヒト型リガンドポリペプチドの全長アミノ酸
配列および全コード領域をコードするｃＤＮＡ配列であ
る。

【図４０】ウシ型リガンドポリペプチド、ラット型リガ
ンドポリペプチドおよびヒト型リガンドポリペプチドの
翻訳領域についてアミノ酸配列を比較したものである。

【図４１】生細胞におけるヨードラベル化リガンドポリ
ペプチドを用いたレセプター結合実験の結果を示す。

【図４２】ＣＨＯ−１９Ｐ２−９およびＣＨＯ−ＵＨＲ
１におけるリガンドポリペプチドによるアラキドン酸代
謝物遊離活性の測定結果を示す。

【図４３】ラット組織におけるＵＨＲ−１のＲＴ−ＰＣ
Ｒによる定量結果を示す。定量値は３回のＰＣＲの平均
値S.E.M.で表した。

【図４４】ラット組織におけるリガンドポリペプチドの
ＲＴ−ＰＣＲによる発現定量結果を示す。定量値は３回
のＰＣＲの平均値S.E.M.で表した。

【図４５】リガンドポリペプチドのグルコースによる血
漿インスリン濃度の増加をラジオイムノアッセイで測定
した結果を示す。

【図４６】リガンドポリペプチド１０nmolをマウスに投
与したときの行動量の測定結果を示す。図（ａ）は自発
運動量、図（ｂ）は立ち上がり行動量の測定結果を示
す。

【図４７】リガンドポリペプチド１nmolをマウスに投与
したときの行動量の測定結果を示す。図（ａ）は自発運
動量、図（ｂ）は立ち上がり行動量の測定結果を示す。

【図４８】リガンドポリペプチド０．１nmolをマウスに
投与したときの行動量の測定結果を示す。図（ａ）は自
発運動量、図（ｂ）は立ち上がり行動量の測定結果を示
す。

【図４９】リガンドポリペプチド０．０１nmolをマウス
に投与したときの行動量の測定結果を示す。図（ａ）は
自発運動量、図（ｂ）は立ち上がり行動量の測定結果を
示す。

【図５０】３mg/kgのレセルピンを皮下投与した１５時
間後のマウスにリガンドポリペプチドを脳室内投与した
ときの体温変化を測定した結果を示す。図中、一つの星
印は危険率：p<0.05、二つの星印はp<0.01を示す。

【図５１】延髄最後野（area postrema: AP）に角度２
０度でマイクロインジェクションカニューレを刺した場
合の模式図を示す。

【図５２】リガンドポリペプチドを延髄最後野に注入し
たときの脈波および平均血圧の典型例を示す。ラットの
延髄最後野にリガンドポリペプチドを１０nmol（流速１
μｌ／ｍｉｎ）注入し、無麻酔下で測定したものであ
る。

【図５３】ペントバルビタール麻酔下ラットの第三脳室
に５０nmolのリガンドポリペプチドを投与したときの血
漿中のＧＨ量を測定した結果を示す。

【図５４】第三脳室へのリガンドポリペプチドの投与に
よる血漿中成長ホルモン量の変化を示す。自由行動下の
ラットに５μｇ／ｋｇのGHRHを静脈下投与し、１０分後
に第三脳室へリガンドポリペプチドまたはＰＢＳを投与
した。ペプチドを投与した時間を０分とした。図中、一
つの星印は危険率：p<0.05、二つの星印はp<0.01を示
す。

【図５５】リガンドポリペプチド抗血清と吸光度の関係
を示す。

【図５６】抗リガンドポリペプチドポリクローナル抗体
によるアラキドン酸代謝物放出活性の測定結果を示す。

【図５７】発現ベクターｐＡＫＫＯ−ＵＨＲ−１上で構
築されたラットＵＨＲ−１の完全なコード領域の塩基配
列の前半部（図５８に続く）と、それにコードされるア
ミノ酸配列の前半部（図５８に続く）を示す。

【図５８】発現ベクターｐＡＫＫＯ−ＵＨＲ−１上で構
築されたラットＵＨＲ−１の完全なコード領域の塩基配
列の後半部（図５７の続き）と、それにコードされるア
ミノ酸配列の後半部（図５７の続き）を示す。

【図５９】プラスミドpmGB3の挿入断片の塩基配列を示
す。→はプライマーに相当する部分である。

【図６０】プラスミドpmGB3の塩基配列をもとに予測さ
れるcDNAと翻訳蛋白質を予想したものである。→はプラ
イマーに相当する部分である。↓↓に挟まれた部分はイ
ントロンと予想される配列である。

【図６１】リガンドポリペプチド１９Ｐ２−Ｌ３１の添
加による、ラット下垂体由来細胞ＲＣ−４Ｂ／Ｃからの
プロラクチン分泌量の変化を示す。

【図６２】リガンドポリペプチド１９Ｐ２−Ｌ３１の添
加による、ラット下垂体初代培養細胞からのプロラクチ
ン分泌量の変化を示す。

【図６３】実施例４８で行われたラット胎盤でのＵＨＲ
−１遺伝子の発現量を表す図を示す。

【図６４】実施例４９で確認された雄性ラットにおける
１９Ｐ２−Ｌ３１の血漿プロラクチン濃度上昇作用を表
す図を示す。

【図６５】実施例４９で確認された雌性ラットにおける
１９Ｐ２−Ｌ３１の血漿プロラクチン濃度上昇作用を表
す図を示す。

【図６６】実施例４９で確認された雌性ラットの各性周
期における１９Ｐ２−Ｌ３１の血漿プロラクチン濃度上
昇作用を表す図を示す。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＤＵ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＪ ＡＥＧ ＡＣＶ ＡＥＸ ＡＤＴ ＡＧＺ ＡＤＵ Ｃ０７Ｋ 7/08 ＺＮＡ ＡＥＧ 14/705 ＡＥＸ // Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ ＡＧＺ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 松本 寛和 茨城県つくば市春日１丁目７番地９ 武田 春日ハイツ1204号

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】Ｇ蛋白共役型レセプター蛋白質に対するリ
   ガンドペプチドまたはその塩を含有するプロラクチン分
   泌調節剤。
2. 【請求項２】Ｇ蛋白共役型レセプター蛋白質に対するリ
   ガンドペプチドまたはその塩が、配列番号：７３で表さ
   れるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ
   酸配列を含有するポリペプチドまたはそのアミド、エス
   テルもしくはその塩である請求項１記載のプロラクチン
   分泌調節剤。
3. 【請求項３】配列番号：７３で表されるアミノ酸配列
   が、配列番号：５、８、４７、５０、６１または６４で
   ある請求項２記載のプロラクチン分泌調節剤。
4. 【請求項４】プロラクチン分泌促進剤である請求項１記
   載のプロラクチン分泌調節剤。
5. 【請求項５】プロラクチン分泌抑制剤である請求項１記
   載のプロラクチン分泌調節剤。
6. 【請求項６】卵巣機能低下症、精嚢発育不全、更年期障
   害または甲状腺機能低下の予防または治療薬である請求
   項４記載のプロラクチン分泌促進剤。
7. 【請求項７】下垂体腺腫瘍、間脳腫瘍、月経異常、自己
   免疫疾患、プロラクチノーマ、不妊症、インポテンス、
   無月経症、乳汁漏症、末端肥大症、キアリ・フロンメル
   症候群、アルゴンツ・デル・カスティロ症候群、フォー
   ベス・アルブライト症候群、リンパ腫、シーハン症候群
   または精子形成異常の予防または治療薬である請求項５
   記載のプロラクチン分泌抑制剤。
8. 【請求項８】Ｇ蛋白共役型レセプター蛋白質に対するリ
   ガンドペプチドまたはその塩を含有する胎盤機能調節
   剤。
9. 【請求項９】繊毛癌、胞状奇胎、侵入奇胎、流産、胎児
   の発育不全、糖代謝異常、脂質代謝異常または分娩誘発
   の予防または治療薬である請求項８記載の胎盤機能調節
   剤。
10. 【請求項１０】畜産哺乳動物の乳汁の分泌促進剤である
    請求項４記載のプロラクチン分泌促進剤。
11. 【請求項１１】プロラクチン分泌機能の検査薬である請
    求項１記載のプロラクチン分泌調節剤。
12. 【請求項１２】性欲促進剤である請求項４記載のプロラ
    クチン分泌促進剤。