JPH119286A - 新規生理活性物質、その製造法および用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】新規生理活性物質、その製造法および用途の提
供。 【解決手段】本発明は、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白
質に対するマウス由来リガンドポリペプチド、及びこれ
をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡおよびその用途に
関する。本発明のポリペプチドまたは該ポリペプチドを
コードするＤＮＡ等は、下垂体機能調節剤、中枢機能調
節剤または膵臓機能調節剤などの医薬として有用であ
り、また、組換え型レセプター蛋白質の発現系を用い
たレセプター結合アッセイ系の開発と医薬品候補化合物
のスクリーニング、下垂体機能調節剤、中枢機能調節
剤または膵臓機能調節剤などの医薬の開発、さらには、
その遺伝子機能を解析するための非ヒト・トランスジ
ェニック動物（特に、有用なノックアウトマウス）の作
製に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規生理活性物
質、その製造法および用途に関する。さらに詳しくは、
Ｇ蛋白質共役型レセプター（受容体と呼ぶこともある）
蛋白質に対するマウス由来リガンドポリペプチド、及び
これをコードするＤＮＡを含有するＤＮＡおよびその用
途に関する。

【０００２】

【従来の技術】多くのホルモンや神経伝達物質は細胞膜
に存在する特異的なレセプターを通じて生体の機能を調
節している。これらのレセプターの多くは共役している
グアニンヌクレオチド結合性蛋白質（guanine nucleoti
de-binding protein、以下、Ｇ蛋白質と略称する場合が
ある）の活性化を通じて細胞内のシグナル伝達を行う。
また、これらのレセプターは、７個の細胞膜貫通領域を
有する共通した構造をもっていることから、Ｇ蛋白質共
役型レセプターあるいは７回膜貫通型レセプター（７Ｔ
ＭＲ）と総称される。このようなホルモンや神経伝達物
質とＧ蛋白質共役型レセプターによる生体の機能を調節
する経路の一つとして視床下部−下垂体系がある。これ
は、視床下部ホルモン（向下垂体性ホルモン）によって
下垂体からの下垂体ホルモンの分泌が調節され、血中に
放出された下垂体ホルモンを介して標的細胞・器官の機
能調節が行われるものである。この経路によって、ホメ
オスタシスの維持や生殖系、個体の発達、代謝、成長な
どの生体にとって重要な機能調節が行われている。下垂
体ホルモンは、視床下部ホルモンと標的内分泌腺より分
泌される末梢ホルモンによる、ポジティブフィードバッ
ク機構またはネガティブフィードバック機構によって分
泌調節されている。下垂体に存在する各種のレセプター
蛋白質は、視床下部−下垂体系を調節する上で中心的な
役割を担っている。また、これらのホルモン、因子およ
びそのレセプターは、視床下部−下垂体系だけに限局し
て存在するのではなく、一般に脳内に広く分布すること
が知られている。このことから、視床下部ホルモンと呼
ばれている物質が、中枢神経系においては神経伝達物質
あるいは神経調節物質として機能していると考えられて
いる。また、視床下部ホルモンと呼ばれている物質は末
梢組織においても同様に分布し、それぞれ重要な機能を
担っていると考えられている。膵臓は消化液を分泌する
他に、グルカゴンやインスリンを分泌することにより糖
代謝に重要な役割を果たしている。インスリンは膵臓の
β細胞から分泌されるが、主としてグルコースにより促
進される。しかし、β細胞には様々なレセプターが存在
しており、グルコース以外の様々な因子、例えばペプチ
ドホルモン（ガラニン、ソマトスタチン、ガストリック
・インヒビトリー・ポリペプチド、グルカゴン、アミリ
ンなど）、糖（マンノースなど）、アミノ酸および神経
伝達物質などにより、インスリンの分泌が制御されてい
ることが知られている。

【０００３】従来、上記Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白
質のうち、それに対するリガンドが未知であるＧ蛋白質
共役型レセプター蛋白質のリガンドを決定する手段とし
ては、リガンドが公知であるＧ蛋白質共役型レセプター
蛋白質との一次構造上の類似性を頼りに、推定する方法
しかなかった。最近、リガンドが不明な、いわゆるオー
ファンＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質の一種であるＬ
Ｃ１３２あるいはＯＲＬ−１をコードするｃＤＮＡをＣ
ＨＯ細胞に導入し、該レセプター細胞内情報伝達系を構
築し、該レセプター蛋白質に対するアゴニストと同様の
細胞内情報伝達シグナルを検出することにより、該レセ
プター蛋白質に対する新規オピオイド・ペプチド・リガ
ンドを探索した例が報告されている（Reinsheid, R. K.
et al. , Science、270巻、792-794頁、1995年；Menul
ar, J.-C., et al. , Nature 377巻、532-535頁、1995
年）。しかし、これらの場合、公知のＧ蛋白質共役型レ
セプター蛋白質との類似性やそのレセプター蛋白質の組
織分布から、それに対するリガンドはオピオイドペプチ
ドのファミリーに属するペプチドリガンドであることが
予測されていた。即ち、オピオイドレセプターを介して
生体に作用する物質についての研究・開発の歴史は長
く、種々のアンタゴニストおよびアゴニストが既に開発
されていた。そこで、人為的に合成した化合物群の中か
らこのＬＣ１３２またはＯＲＬ−１に対するアゴニスト
をスクリーニングし、これをプローブとしてそのアゴニ
ストと同様な細胞内情報伝達系の活性化物質を探索し、
これを精製し、リガンドとしての構造を決定している。
しかし、この例のようにオーファンＧ蛋白質共役型レセ
プター蛋白質のうち、それに対するリガンドがおおよそ
でも推定されるものはほとんどないのが現状である。特
に、公知のレセプター蛋白質ファミリーと類似性が低
い、オーファンＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質の場合
には、それに対するリガンドに関する情報がほとんどな
いために、そのリガンドを特定することは勿論のこと、
推定することすら困難であった。そのようなリガンドが
未知の、オーファンＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質の
一つとして、ｐｈＧＲ３（または ＧＰＲ１０と呼ばれ
ることもある）遺伝子によってコードされるヒト型レセ
プター蛋白質〔ゲノミックス（Genomics），第29巻，第
335頁（1995年）〕、およびそれに対応するラット型レ
セプター蛋白質ＵＨＲ−１〔バイオケミカル・アンド・
バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーション（Bi
ochem. Biophy. Res. Commun.），第209巻，第606頁（1
995年）〕が知られている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】種々の疾患の発生メカ
ニズムを解明し、それに対する治療法を確立するための
一つの手段として、生体内で何らかの生理機能を有して
いると考えられるオーファンＧ蛋白質共役型レセプター
蛋白質に対するリガンドを決定することが重要である。
例えば、下垂体、中枢神経系および膵臓β細胞等で発現
しているオーファンＧ蛋白質共役型レセプターに対する
リガンドは、医薬として有用であると考えられるが、そ
の構造および機能についてはまだ十分に明らかにされて
いない。また、リガンドの機能を解析するには、そのリ
ガンドの遺伝子を過剰発現させた場合またはその遺伝子
産物であるリガンドを機能欠損させた場合を、その遺伝
子発現が正常な場合と比較することが非常に有効な手段
である。この場合、ある特定の遺伝子産物の機能を欠損
させるには、その遺伝子そのものを破壊することが一番
確実な方法である。その方法として、ジーン・ターゲッ
ティングが開発され（Thomas. K. R. et al. Cell, 51,
503-512(1987))、世界中で多くの遺伝子欠損マウスが
作成されている。これは多分化能をもったマウスの胚性
幹細胞（ＥＳ細胞）の特定の染色体遺伝子を相同組換え
により破壊し、そのＥＳ細胞を胚盤胞へ注入してキメラ
マウスを作成した後、遺伝子欠損マウスを得る方法であ
る。現時点ではマウスのみが、種々の疾患の実験モデル
動物として使用可能であり、ある特定の疾患に関与する
と考えられる遺伝子が欠損した、有用な遺伝子欠損マウ
スを作製するためには、対象とするその遺伝子のマウス
由来のゲノムＤＮＡ配列が必要であるが、オーファンＧ
蛋白質共役型レセプター蛋白質であるｐＨＧＲ３（ＧＰ
Ｒ１０）またはＵＨＲ−１については、それに対するマ
ウス由来のリガンドペプチドおよびそのリガンドペプチ
ドをコードする遺伝子（ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）
は知られていない。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、オーファ
ンＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質ｐＨＧＲ３をコード
するｃＤＮＡを発現させた細胞を用い、特異的な細胞刺
激（シグナル伝達）活性の測定等を指標に、該レセプタ
ー蛋白質がリガンドとして認識するウシ由来のポリペプ
チドをスクリーニングし、そのアミノ酸配列およびＤＮ
Ａ配列を決定した。ウシ由来の該ポリペプチドをコード
するＤＮＡをプライマーとして用い、ＰＣＲ（polymera
se chain reaction）法により該ポリペプチドをコード
するウシ、ヒトおよびラット由来のｃＤＮＡを単離し、
そのラット由来のｃＤＮＡ配列を基にプライマーを作製
し、ＰＣＲ法により、マウス由来の該ポリペプチドをコ
ードするｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを単離することに
成功した。さらに、本発明者らは、該リガンドペプチド
を用いることによって、上記レセプター蛋白質との結合
性を変化させる化合物のスクリーニングを行なうことが
可能になり、また、マウス由来リガンドポリペプチドの
ゲノムＤＮＡを用いて非ヒト・トランスジェニック動物
（特に、有用なノックアウトマウス）を作成し、その遺
伝子機能を解析することも可能とした。

【０００６】すなわち、本発明は、（１）配列番号：１
で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の
アミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはそのアミ
ド、エステルもしくはその塩、（２）上記（１）記載の
ポリペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡを含
有するＤＮＡ、（３）配列番号：２または配列番号：３
で表される塩基配列を有する上記（２）記載のＤＮＡ、
（４）上記（２）記載のＤＮＡを含有する組換えベクタ
ー、（５）上記（２）記載のＤＮＡまたは上記（４）記
載の組換えベクターで形質転換された形質転換体、
（６）不活性化された上記（２）記載のＤＮＡを保持す
る非ヒト・ノックアウト動物の作製方法、（７）上記
（２）記載のＤＮＡもしくはその変異体または上記
（４）記載の組換えベクターを保持する非ヒト・トラン
スジェニック動物、（８）不活性化された上記（２）記
載のＤＮＡを保持する非ヒト動物細胞、（９）不活性化
された上記（２）記載のＤＮＡを導入することを特徴と
する上記（８）記載の非ヒト動物細胞の製造法、（１
０）上記（５）記載の形質転換体を培養することを特徴
とする上記（１）記載のポリペプチドまたはそのアミ
ド、エステルもしくはその塩の製造法、（１１）上記
（１）記載のポリペプチドまたはそのアミド、エステル
もしくはその塩を含有してなる医薬、および、（１２）
上記（１）記載のポリペプチドまたはそのアミド、エス
テルもしくはその塩に対する抗体などに関する。

【０００７】さらに、本発明により、（１１）痴呆、鬱
病、多動児（微細脳障害）症候群、意識障害、不安障
害、精神分裂症、恐怖症、成長ホルモン分泌障害、過食
症、多食症、高コレステロール血症、高グリセリド血
症、高脂血症、高プロラクチン血症、糖尿病、癌、膵
炎、腎疾患、ターナー症候群、神経症、リウマチ関節
炎、脊髄損傷、一過性脳虚血発作、筋萎縮性側索硬化
症、急性心筋梗塞、脊髄小脳変性症、骨折、創傷、アト
ピー性皮膚炎、骨粗鬆症、喘息、てんかん、不妊症また
は乳汁分泌不全などの疾病の治療・予防剤である上記
（１１）記載の医薬も提供される。

【０００８】

【発明の実施の形態】本明細書および図面において、塩
基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−
ＩＵＢ Commision on Biochemical Nomenclature によ
る略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくもの
であり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異
性体が存在する場合は、特に明示しなければＬ体を示す
ものとする。 ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸 ｃＤＮＡ ：相補的デオキシリボ核酸 Ａ ：アデニン Ｔ ：チミン Ｇ ：グアニン Ｃ ：シトシン ＲＮＡ ：リボ核酸 ｍＲＮＡ ：メッセンジャーリボ核酸 ｄＡＴＰ ：デオキシアデノシン三リン酸 ｄＴＴＰ ：デオキシチミジン三リン酸 ｄＧＴＰ ：デオキシグアノシン三リン酸 ｄＣＴＰ ：デオキシシチジン三リン酸 ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸 ＥＤＴＡ ：エチレンジアミン四酢酸 ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム ＥＩＡ ：エンザイムイムノアッセイ ＧｌｙまたはＧ ：グリシン ＡｌａまたはＡ ：アラニン ＶａｌまたはＶ ：バリン ＬｅｕまたはＬ ：ロイシン ＩｌｅまたはＩ ：イソロイシン ＳｅｒまたはＳ ：セリン

【０００９】ＴｈｒまたはＴ ：スレオニン ＣｙｓまたはＣ ：システイン ＭｅｔまたはＭ ：メチオニン ＧｌｕまたはＥ ：グルタミン酸 ＡｓｐまたはＤ ：アスパラギン酸 ＬｙｓまたはＫ ：リジン ＡｒｇまたはＲ ：アルギニン ＨｉｓまたはＨ ：ヒスチジン ＰｈｅまたはＦ ：フェニルアラニン ＴｙｒまたはＹ ：チロシン ＴｒｐまたはＷ ：トリプトファン ＰｒｏまたはＰ ：プロリン ＡｓｎまたはＮ ：アスパラギン ＧｌｎまたはＱ ：グルタミン ｐＧｌｕ ：ピログルタミン酸 Ｍｅ ：メチル基 Ｅｔ ：エチル基 Ｂｕ ：ブチル基 Ｐｈ ：フェニル基 ＴＣ ：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキ
サミド基

【００１０】また、本明細書中で繁用される置換基、保
護基および試薬を下記の記号で表記する。 ＢＨＡ：ベンズヒドリルアミン ｐＭＢＨＡ：ｐ−メチルベンズヒドリルアミン Ｔｏｓ：ｐ−トルエンスルフォニル ＣＨＯ：ホルミル ＨＯＮＢ：Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネンー２，３
−ジカルボキシイミド ＯｃＨｅｘ：シクロヘキシルエステル Ｂｚｌ：ベンジル Ｃｌ₂ −Ｂｚｌ：ジクロロベンジル Ｂｏｍ：ベンジルオキシメチル Ｚ：ベンジルオキシカルボニル Ｂｒ−Ｚ：２−ブロモベンジルオキシカルボニル Ｂｏｃ：ｔ−ブチルオキシカルボニル ＤＣＭ：ジクロロメタン ＨＯＢｔ：１−ヒドロキシベンズトリアゾール ＤＣＣ：Ｎ、Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸 ＤＩＥＡ：ジイソプロピルエチルアミン Ｆｍｏｃ：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル ＤＮＰ：ジニトロフェニル Ｂｕｍ：ターシャリーブトキシメチル Ｔｒｔ：トリチル

【００１１】本明細書において、「実質的に同一」と
は、蛋白質の活性、例えば、リガンドと受容体の結合活
性や生理的な特性などが、実質的に同じであることを意
味する。従って、「実質的に同一」のアミノ酸配列と
は、蛋白質の活性、例えば、リガンドと受容体の結合活
性や生理的な特性などが、実質的に同じである（著しい
変化を生じていない）状態が保たれる範囲の変異を有し
ていてもよいアミノ酸配列を意味する。一般に、ポリペ
プチド配列中におけるアミノ酸の置換、欠失あるいは挿
入（付加）などの変異は、そのポリペプチドの生理的な
特性や化学的な特性に大きな（著しい）変化をもたらさ
ないことがしばしばあることは、よく知られた事実であ
る。該置換の例としては、あるアミノ酸が性質（特性）
の似ている他のアミノ酸で置換されたものが挙げられ、
一般的には、特性の類似性が強いアミノ酸相互間で置換
が行われる場合ほど、その置換が置換前の元のポリペプ
チドにおよぼす特性の変化は小さいと考えられている。
アミノ酸は、その特性の類似性を一つの基準にして例え
ば次のようなクラスに分類される。（i）非極性（疎水
性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイ
シン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプト
ファン、メチオニンなどが挙げられる。（ii）極性（中
性）アミノ酸としてはグリシン、セリン、スレオニン、
システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミンなど
が挙げられる。（iii）陽電荷をもつ（塩基性）アミノ
酸としてはアルギニン、リジン、ヒスチジンなどが挙げ
られる。（iv）負電荷をもつ（酸性）アミノ酸として
は、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
本明細書中で対象とするアミノ酸配列中のアミノ酸の
「実質的に同一」な置換物としては、例えばそのアミノ
酸が属するクラスのうち特性の似ている他のアミノ酸類
から選ばれることが多い。本発明においては、元の（無
変異の）ポリペプチドの生理的な特性や化学的な特性に
重大な（著しい）変化をもたらさないような置換、欠失
あるいは挿入等のアミノ酸配列における変異の結果得ら
れるポリペプチド（変異型ポリペプチド）は、そのよう
な変異を有していない元の（無変異の）ポリペプチドと
実質的に同一であると見なされ、またその変異型ポリペ
プチドのアミノ酸配列は、元の（無変異の）ポリペプチ
ドのアミノ酸配列と実質的に同一であると見なされる。

【００１２】本発明によるポリペプチドは、Ｇ蛋白質共
役型レセプター蛋白質に結合することができる成熟型リ
ガンドポリペプチド（配列番号：４で表わされるアミノ
酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有す
るポリペプチド）の前駆体であり、具体的には配列番
号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に
同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその
アミド、エステルもしくはその塩（以下、単にリガンド
ポリペプチドまたはポリペプチドと略称する場合があ
る）などが挙げられる。ただし、本発明におけるポリペ
プチドとしては、配列番号：４で表わされるアミノ酸配
列と同一であるものは除くこととする（以下、同様）。
本発明の該ポリペプチドとしては、ヒトや温血動物（例
えば、モルモット、ラット、マウス、ブタ、ヒツジ、ウ
シ、サルなど）のあらゆる組織（例えば、下垂体、膵
臓、脳、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、
副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管、血管、心臓など）また
は細胞などに由来するポリペプチドであって、配列番
号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的
に同一のアミノ酸配列を含有するものであればよい。例
えば、本発明のリガンドポリペプチドとしては、配列番
号：１で表わされるアミノ酸配列を含有する蛋白質など
の他に、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と約５
０〜９９．９％（好ましくは７０〜９９．９％、より好
ましくは８０〜９９．９％、さらに好ましくは９０〜９
９．９％）の相同性を有するアミノ酸配列を含有し、配
列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含有する蛋白質
と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが挙げられ
る。該活性としては、例えばレセプター結合活性、シグ
ナル伝達活性など、該リガンドポリペプチドが有する活
性が挙げられる。活性が「実質的に同質」とは、該レセ
プター結合活性などの特性が同質であることを示す。従
って、該レセプター結合活性には著しくない程度の強弱
が認められてもよく、また、該リガンドポリペプチドの
分子量における相違は問題ではない。

【００１３】さらに具体的には、本発明のリガンドポリ
ペプチドとしては、配列番号：１で表わされるアミノ酸
配列を含有する、特にマウス由来のポリペプチドなどが
挙げられる。また、本発明のリガンドポリペプチドとし
ては、（i）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列中
の１個以上１５個以下、好ましくは１個以上１０個以
下、より好ましくは１個以上５個以下のアミノ酸が他の
アミノ酸で置換されたアミノ酸配列、（ii）配列番号：
１で表わされるアミノ酸配列中の１個以上１５個以下、
好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以
上５個以下のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ii
i）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列に１個以上
１５個以下、好ましくは１個以上１０個以下、より好ま
しくは１個以上５個以下のアミノ酸が付加した（挿入さ
れた）アミノ酸配列、さらには、（iv）上記（i）,（i
i）または（iii）のポリペプチド中の構成アミノ酸（特
にその側鎖）に修飾を有するアミノ酸配列を含有するポ
リペプチド、またはそのアミド、エステルもしくはその
塩も含まれる。

【００１４】本発明のポリペプチド中の構成アミノ酸に
おける修飾の例としては、例えばＧｌｎのＮ端側が生体
内で切断され、該Ｇｌｎがピログルタミン酸化したもの
などが挙げられる。本明細書においてペプチドの標記
は、その慣例に従い、左端がＮ末端（アミノ末端）、右
端がＣ末端（カルボキシル末端）で記載する。本発明に
おけるポリペプチド、例えば配列番号：１で表されるポ
リペプチドは、Ｃ末端が通常はカルボキシル基（-COO
H）またはカルボキシレート（-COO^-）であるが、Ｃ末端
アミノ酸残基の該カルボキシル基がアミド（-CONH₂）ま
たはエステル（-COOR）であってもよい。 -COOR で表さ
れる該エステルのＲとしては、例えばメチル、エチル、
ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどの
Ｃ_1-6アルキル基、シクロペンチル、シクロヘキシルな
どのＣ_3-8シクロアルキル基、フェニル、α−ナフチル
などのＣ_6-13アリール基、ベンジル、フェネチル、ベン
ズヒドリルなどのフェニル−Ｃ_1-2アルキル、ジフェニ
ル−Ｃ_1-2アルキル、もしくはα−ナフチルメチルなど
のα−ナフチル−Ｃ_1-2アルキルなどのＣ_7-14アラルキ
ル基のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイ
ルオキシメチルエステルなどが挙げられる。また、本発
明におけるポリペプチドが、Ｃ末端以外にカルボキシル
基またはカルボキシレートを有している場合、それらの
基がアミド化またはエステル化されているポリペプチド
も本発明のポリペプチドに含まれる。この場合のエステ
ルとしては、例えば前述のＣ末端のエステルなどと同様
である。本発明のポリペプチドの塩としては、生理学的
に許容される塩基（例えばアルカリ金属など）や酸（有
機酸、無機酸）との塩が挙げられるが、とりわけ生理学
的に許容される酸付加塩が好ましい。このような塩とし
ては例えば無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素
酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ
酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、
酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、シュウ酸、安息香酸、メ
タンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用
いられる。

【００１５】本発明のリガンドポリペプチドまたはその
アミド、エステルもしくはその塩は、（i）ヒトや温血
動物の組織または細胞からポリペプチドを精製する公知
の方法によって製造することができ、また、（ii）公知
のポリペプチド合成法に準じて製造することもできる。
さらにまた、（iii）該ポリペプチドをコードするＤＮ
Ａを含有する形質転換体を培養する方法（後述）によっ
ても製造することもできる。 （i）該リガンドポリペプチドをヒトや温血動物の組織
または細胞から製造する場合は、ヒトや温血動物の組織
または細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出を行
い、該抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換ク
ロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー
などのクロマトグラフィーを組み合わせる方法により精
製単離することができる。

【００１６】（ii）該リガンドポリペプチドは、自体公
知のポリペプチドの合成法に従って製造することもでき
る。ペプチドの合成法としては、例えば固相合成法、液
相合成法のいずれによってもよい。即ち、蛋白質を構成
し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮
合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離す
ることにより目的のペプチドを製造することができる。
この場合の公知の縮合方法や保護基の脱離方法としては
例えば、次の〜に記載された方法が挙げられる。 M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチド シン
セシス (Peptide Synthesis), Interscience Publisher
s, New York (1966年) SchroederおよびLuebke、ザ ペプチド(The Peptid
e), Academic Press, NewYork (1965年) 泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善(株)
（1975年） 矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、 タ
ンパク質の化学IV、 205、(1977年） 矢島治明監修、続医薬品の開発 第14巻 ペプチド合
成 広川書店

【００１７】該リガンドポリペプチドの合成法として具
合的には、例えば次の方法などが挙げられる。該リガン
ドポリペプチドのアミド体を合成するには、アミド形成
に適したペプチド合成用樹脂を用いるとよい。そのよう
な樹脂としては例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシ
メチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル
樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４
−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、PAM樹脂、４−ヒ
ドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹
脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（2',4'-ジメトキシ
フェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−
（2',4'-ジメトキシフェニル−Fmocアミノエチル）フェ
ノキシ樹脂などが挙げられる。このような樹脂を用い、
α−アミノ基と側鎖官能基を公知の適当な保護基で保護
したアミノ酸を、自体公知の各種縮合方法に従い、目的
とするペプチドの配列通りに該樹脂上で縮合させる。反
応の最後に樹脂からペプチドを切り出すとともに各種保
護基を除去し、目的のポリペプチドを取得することがで
きる。 前述の保護されたアミノ酸を縮合させるには、
ペプチド合成に使用できる各種活性化試薬を用いること
ができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジ
イミド類としてはDCC、N,N'-ジイソプロピルカルボジイ
ミド、N-エチル-N'-(3-ジメチルアミノプロリル）カル
ボジイミドなどが挙げられる。これらによる活性化に
は、ラセミ化抑制添加剤（例えば、HOBt)とともに保護
されたアミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、対称酸
無水物またはHOBtエステルあるいはHOOBtエステルとし
てあらかじめ保護されたアミノ酸の活性化を行ったのち
に樹脂に添加することができる。保護されたアミノ酸の
活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、ペプ
チド縮合反応に使用可能な公知の溶媒から適宜選択すれ
ばよい。該溶媒としては、例えばＮ，Ｎ−ジメチルホル
ムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチル
ピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン、クロロホ
ルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノ
ールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどの
スルホキシド類、ピリジンなどの三級アミン類、ジオキ
サン、テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニ
トリル、プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチ
ル、酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜
の混合物などが挙げられる。該縮合反応における反応温
度は、公知のペプチド結合形成反応に使用可能な温度範
囲から適宜選択すればよく、通常約−２０℃〜５０℃の
範囲が挙げられる。該活性化されたアミノ酸誘導体は、
通常１.５〜４倍過剰で用いられる。縮合反応の達成度
は公知のニンヒドリン反応を用いて確認することがで
き、その結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を
行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合
を行うことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が
得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾ
ールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化し、後の反応
に影響をおよぼさないようにすることもできる。

【００１８】該ペプチド合成の際の原料となるアミノ酸
のアミノ基の保護基としては、例えば、Ｚ、Boc、tert
−アミルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボ
ニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Cl-Z、
Br-Z、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロア
セチル、フタリル、ホルミル、２−ニトロフェニルスル
フェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Fmocなどが
挙げられる。カルボキシル基の保護基としては、例えば
前述のＣ_1-6アルキル基、Ｃ_3-8シクロアルキル基、Ｃ
_7-14アラルキル基の他、２−アダマンチル、４−ニトロ
ベンジル、４−メトキシベンジル、４−クロロベンジ
ル、フェナシル基およびベンジルオキシカルボニルヒド
ラジド、tert−ブトキシカルボニルヒドラジド、トリチ
ルヒドラジドなどが挙げられる。セリンおよびスレオニ
ンの水酸基は、例えばエステル化またはエーテル化によ
って保護することができる。このエステル化に適する基
としては例えばアセチル基などの低級（Ｃ_1-6）アルカ
ノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオ
キシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸か
ら誘導される基などが挙げられる。また、エーテル化に
適する基としては、例えばベンジル基、テトラヒドロピ
ラニル基、tert−ブチル基などである。チロシンのフェ
ノール性水酸基の保護基としては、例えばBzl、Cl₂-Bz
l、２−ニトロベンジル、Br-Z、tert−ブチルなどが挙
げられる。ヒスチジンのイミダゾールの保護基として
は、Tos、４-メトキシ-2,3,6-トリメチルベンゼンスル
ホニル、DNP、ベンジルオキシメチル、Bum、Boc、Trt、
Fmocなどが挙げられる。

【００１９】該保護基の除去（脱離）方法としては、例
えば（i）Pd−黒あるいはPd-炭素などの触媒の存在下、
水素気流中での接触還元、（ii）無水フッ化水素、メタ
ンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフ
ルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理、
（iii）ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミ
ン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また
（iv）液体アンモニア中ナトリウムによる還元などが挙
げられる。上記酸処理による脱離反応は一般に−２０℃
〜４０℃の温度で行われるが、酸処理においてはアニソ
ール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、
パラクレゾール、ジメチルスルフィド、1,4-ブタンジチ
オール、1,2-エタンジチオールのようなカチオン捕捉剤
の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール
基の保護基として用いられる2,4-ジニトロフェニル基は
チオフェノール処理により除去され、トリプトファンの
インドール保護基として用いられるホルミル基は上記の
1,2-エタンジチオール、1,4-ブタンジチオールなどの存
在下の酸処理による除去以外に、希水酸化ナトリウム、
希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去さ
れる。該ペプチド合成反応において、原料アミノ酸の反
応に関与しない官能基の保護基の導入およびその保護基
の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の方
法に従って行えばよい。 原料のアミノ酸のカルボキシ
ル基が活性化されたものとしては、例えば対応する酸無
水物、アジド、活性エステル［アルコール（例えば、ペ
ンタクロロフェノール、2,4,5-トリクロロフェノール、
2,4-ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パ
ラニトロフェノール、HONB、N-ヒドロキシスクシミド、
N-ヒドロキシフタルイミド、HOBt）とのエステル］など
が挙げられる。原料のアミノ酸のアミノ基が活性化され
たものとしては、例えば対応するリン酸アミドが挙げら
れる。

【００２０】該ポリペプチドがアミド体である場合、別
の製造方法としては、まず、カルボキシ末端アミノ酸の
α−カルボキシル基をアミド化した後、縮合反応により
アミノ基側にペプチド鎖を所望の鎖長まで延ばし、α−
アミノ基の保護基を除いたカルボキシル末端側ペプチド
と所望のペプチドからカルボキシル末端側を除いたアミ
ノ末端側ペプチドのα−カルボキシル基の保護基のみを
除去し、α−アミノ基や側鎖官能基に前述の適当な保護
基を付けた保護ペプチドをペプチドの合成反応に用いら
れる前述の混合溶媒中で縮合させる。この縮合反応の詳
細については上記と同様である。該縮合反応により得ら
れる保護基を有するポリペプチドを単離精製した後、上
記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗ペプチ
ドを得ることができる。この粗ペプチドは公知の各種精
製方法により精製し、必要により主要画分を凍結乾燥す
ることにより、所望のポリペプチドのアミド体を得るこ
とができる。該ポリペプチドのエステル体を得るにはカ
ルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のア
ルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、ポリペ
プチドのアミド体の場合と同様にして、所望のポリペプ
チドのエステル体を得ることができる。合成反応後のポ
リペプチドは、通常の精製法、例えば溶媒抽出、蒸留、
カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、
再結晶など公知の種々の方法を適宜組み合わせることに
より精製単離することができる。上記方法で得られる該
ポリペプチドが、遊離体である場合は公知の方法によっ
て目的とする塩に変換することができ、逆に塩で得られ
る場合には公知の方法によって遊離体あるいは他の酸に
変換することができる。

【００２１】本発明のリガンドポリペプチドまたはその
アミド、エステルもしくはその塩としては、上記した配
列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質
的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドであれ
ばいずれでもよい。即ち、配列番号：１で表されるアミ
ノ酸配列を有するポリペプチドと同様の生理作用（下垂
体機能調節作用、中枢神経機能調節作用または膵臓機能
調節作用など）を有している限り、そのアミノ酸配列に
変異を有するどのようなポリペプチドであってもよい。
このようなペプチドとしては例えば、 （１）Ser-Arg-Ala-His-Gln-His-Ser-Met-Glu-Thr-Arg-
Thr-Pro-Asp-Ile-Asn-Pro-Ala-Trp-Tyr-Thr-Gly-Arg-Gl
y-Ile-Arg-Pro-Val-Gly-Arg-Phe （配列番号：５） （２）Thr-Pro-Asp-Ile-Asn-Pro-Ala-Trp-Tyr-Thr-Gly-
Arg-Gly-Ile-Arg-Pro-Val-Gly-Arg-Phe （配列番号：
６） 等が好ましい。該リガンドポリペプチドはさらに、抗リ
ガンドポリペプチド抗体の調製のための抗原として用い
ることができる。このような抗原としてのポリペプチド
は上記したリガンドポリペプチドの他に、 （１）Ser-Arg-Ala-His-Gln-His-Ser-Met-Glu （配列
番号：７） （２）Thr-Pro-Asp-Ile-Asn-Pro-Ala-Trp-Tyr （配列
番号：８） （３）Gly-Arg-Gly-Ile-Arg-Pro-Val-Gly-Arg-Phe
（配列番号：９） 等のような該リガンドポリペプチドの部分ペプチドが好
ましく用いられる。該部分ペプチドとしては、抗原決定
部位として機能しうる個々のドメインを個別に含むペプ
チドも用いても、それら複数のドメインを同時に含むペ
プチドを用いてもよい（ただし、該部分ペプチドとして
は、配列番号：４で表わされるアミノ酸配列と同一であ
るものは除く）。

【００２２】本発明におけるリガンドポリペプチドの部
分ペプチドも、Ｃ末端アミノ酸残基のカルボキシル基
が、アミド（-CONH₂）またはエステル（-COOR）であっ
てもよい。該エステル基の例としては、上記したポリペ
プチドの場合と同様である。該部分ペプチドとしては、
Ｃ末端以外、即ちペプチドを構成するアミノ酸の側鎖に
カルボキシル基またはカルボキシレートを有している場
合、それらの基がアミド化またはエステル化されている
ものも含まれる。この場合のエステルとしては、例え
ば、前述のポリペプチドにおけるＣ末端アミノ酸残基の
エステルなど挙げられる。本発明のリガンドポリペプチ
ドの該部分ペプチドの塩としては、前述のポリペプチド
の塩と同様のものが用いられる。本発明のリガンドポリ
ペプチドの該部分ペプチドまたはそのアミド、エステル
もしくはその塩は、前述のポリペプチドの場合と同様の
合成法により製造することができる。また、該リガンド
ポリペプチドを適当なペプチダーゼで切断し断片化する
ことにより製造することもできる。本発明のリガンドポ
リペプチドまたはその部分ペプチドは、さらに、他の蛋
白質（例、機能または性質がよく知られている公知の蛋
白質）との融合蛋白質であってもよい。

【００２３】本発明のリガンドポリペプチドをコードす
るＤＮＡとしては、本発明の配列番号：１で表されるア
ミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列
を含有するポリペプチドをコードする塩基配列を含有す
るものであればいかなるものであってもよい。また、該
リガンドポリペプチドをコードするＤＮＡを含有するＤ
ＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリ
ー、組織もしくは細胞由来のｃＤＮＡ、組織もしくは細
胞由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡ等のいずれ
であってもよい。該ライブラリーに使用するベクターは
バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージ
ミドなどいずれであってもよい。また、リガンドポリペ
プチドまたはその部分ペプチドをコードする該ＤＮＡ
は、組織もしくは細胞よりＲＮＡ画分を調製したものを
用いて直接ＲＴ-ＰＣＲ法（reversetranscription poly
merase chain reaction）によって増幅することもでき
る。配列番号：１のアミノ酸配列を含有するマウス由来
のポリペプチドをコードするＤＮＡを含有するＤＮＡと
して、より具体的には、配列番号：２で表わされる塩基
配列を有するｃＤＮＡまたは配列番号：３で表される塩
基配列を有するゲノムＤＮＡなどが挙げられる。これら
のＤＮＡの中で例えば、６個以上９０個以下（好ましく
は６個以上６０個以下、より好ましくは９個以上３０個
以下、さらに好ましくは１２個以上３０個以下）の部分
塩基配列を含有するＤＮＡ断片は、配列番号：１のアミ
ノ酸配列を含有するマウス由来のポリペプチドをコード
するＤＮＡを検出するためのＤＮＡ検出プローブとして
も好ましく用いられる。

【００２４】本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ
を含有するＤＮＡは以下の遺伝子工学的手法によっても
製造することができる。本発明のポリペプチドまたはそ
の部分ペプチドを完全にコードするＤＮＡのクローニン
グ（クローン化）は、以下の方法に従って行えばよい。
即ち、（１）該ポリペプチドの部分塩基配列を有するＤ
ＮＡを合成し、これをプライマーとしてＰＣＲ法によっ
て該ポリペプチドを完全にコードするＤＮＡを増幅する
か、または、（２）マウス由来のｃＤＮＡもしくはゲノ
ムＤＮＡ、またはそのＤＮＡ断片を適当なベクターに組
み込んで得られるＤＮＡライブラリーを、例えばヒト由
来またはラット由来のリガンドポリペプチドの一部ある
いは全領域を有するＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用
いて標識したものとハイブリダイゼーションを行うこと
により選別すればよい。該ハイブリダイゼーションの方
法は、例えば Molecular Cloning （２nd ed.；J. Sam
brook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 198
9）などに記載の方法に従って行えばよい。また、ＤＮ
Ａライブラリーとして市販のものを使用する場合は、添
付の使用説明書に記載の方法に従って行えばよい。クロ
ーン化された該ポリペプチドをコードするＤＮＡは、そ
のまま使用しても、または所望により制限酵素で消化し
た後もしくはリンカーＤＮＡを付加した後に使用しても
よい。該ＤＮＡは、その５’末端側に翻訳開始コドンと
してのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コド
ンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していても
よい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適
当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもでき
る。

【００２５】該ポリペプチドをコードする塩基配列を有
するＤＮＡを含有する発現ベクターは、例えば、（イ）
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを含有するＤ
ＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、（ロ）この
ＤＮＡ断片を公知の適当な発現ベクター中のプロモータ
ー配列の下流に連結することにより製造することができ
る。該ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド
（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵ
Ｃ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１
０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド
（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバ
クテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイル
ス，バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどが用いら
れる。該プロモーターとしては、目的のポリペプチドを
コードする遺伝子の発現に用いる宿主において、適切に
機能するプロモーターであればいかなるものでもよい。

【００２６】形質転換する際の宿主がエシェリヒア属菌
である場合は、trp プロモーター、lac プロモーター、
recＡプロモーター、λＰＬプロモーター、lpp プロモ
ーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰ
Ｏ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、penＰプロ
モーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロ
モーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、
ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。宿主が動物細胞で
ある場合には、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウ
イルスのプロモーター、メタロチオネインプロモータ
ー、ヒートショックプロモーター、サイトメガロウイル
スプロモーター、ＳＲαプロモーターなどがそれぞれ好
ましく挙げられる。なお、目的のポリペプチドをコード
する遺伝子を効率よく発現させるためには、エンハンサ
ーを使用することが好ましい。また、必要に応じて、宿
主に合ったシグナル配列を、ポリペプチドまたはその部
分ペプチドのＮ端末側に付加する。宿主がエシェリヒア
属菌である場合は、アルカリフォスファターゼ・シグナ
ル配列、ＯmpＡ・シグナル配列などが、宿主がバチルス
属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サ
ブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場
合は、メイテイングファクターα・シグナル配列、イン
ベルターゼ・シグナル配列など、宿主が動物細胞である
場合には、例えばインシュリン・シグナル配列、α−イ
ンターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配
列などがそれぞれ利用できる。このようにして構築され
たポリペプチドまたはその部分ペプチドをコードするＤ
ＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造す
る。

【００２７】形質転換する際の宿主としては、例えば公
知のエシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫、動
物細胞などが挙げられる。該エシェリヒア属菌の具体例
としては、例えばエシェリヒア・コリ（Escherichia co
li）Ｋ１２・ＤＨ１〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・
ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），第
60巻，160頁（1968年)〕，ＪＭ１０３〔ヌクイレック・
アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Research），第9
巻，309頁（1981年）〕，ＪＡ２２１〔ジャーナル・オ
ブ・モレキュラー・バイオロジー（Journal of Molecul
ar Biology）〕，第120巻，517頁（1978年）〕，ＨＢ１
０１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジ
ー，第41巻，459頁（1969年）〕，Ｃ６００〔ジェネテ
ィックス（Genetics），第39巻，440頁（1954年）〕な
どが挙げられる。該バチルス属菌の具体例としては、例
えばバチルス・サチルス（Bacillus subtilis）ＭＩ１
１４〔ジーン（gene），第24巻，255頁（1983年）〕，
２０７−２１〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー
（Journal of Biochemistry），第95巻，87頁（1984
年）〕などが挙げられる。

【００２８】該酵母としては、例えばサッカロマイセス
セレビシエ（Saccaromyces cerevisiae)ＡＨ２２，Ａ
Ｈ２２Ｒ^-，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ
−１２などが挙げられる。該昆虫としては、例えばカイ
コの幼虫などが挙げられる〔前田ら、ネイチャー（Natu
re），第315巻，592頁（1985年）〕。該動物細胞として
は、例えばサル細胞ＣＯＳ−７，Ｖero，チャイニーズ
ハムスター細胞ＣＨＯ，ＤＨＦＲ遺伝子欠損チャイニー
ズハムスター細胞ＣＨＯ（ｄｈｆｒ^-ＣＨＯ細胞），マ
ウスＬ細胞，マウスミエローマ細胞，ヒトＦＬ細胞など
が挙げられる。エシェリヒア属菌を形質転換するには、
例えばプロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエ
ー，第69巻，2110頁（1972年）や ジーン，第17巻，107
頁（1982年）などに記載の方法に従って行なえばよい。
バチルス属菌を形質転換するには、例えばモレキュラー
・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Molecular
＆ General Genetics），第168巻，111頁（1979年）な
どに記載の方法に従って行えばよい。酵母を形質転換す
るには、例えばプロシージングズ・オブ・ザ・ナショナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユ
ーエスエー，第75巻，1929頁（1978年）などに記載の方
法に従って行なえばよい。昆虫細胞を形質転換するに
は、例えばバイオ／テクノロジー（Bio/Technology），
第6巻, 47頁（1988年）などに記載の方法に従って行な
えばよい。動物細胞を形質転換するには、例えばヴィロ
ロジー（Virology），第52巻，456頁（1973年）に記載
の方法に従って行なわれる。このようにして、ポリペプ
チドまたはその部分ペプチドをコードするＤＮＡを含有
する発現ベクターで形質転換された形質転換体を得るこ
とができる。

【００２９】宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌で
ある形質転換体を培養する際の培地としては液体培地が
好ましく、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素
源、窒素源、無機物その他を含有するよう調製される。
該炭素源としては、例えばグルコース、デキストリン、
可溶性澱粉、ショ糖などが、該窒素源としては、例えば
アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカ
ー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイシ
ョ抽出液などの無機または有機物質が、該無機物として
は、例えば塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、
塩化マグネシウムなどが挙げられる。また、該培地中に
は、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを必要
に応じて添加してもよい。該培地のｐＨは形質転換体が
生育するｐＨであればいずれでもよいが、ｐＨは通常約
５〜８が好ましい。

【００３０】エシェリヒア属菌を培養する際の培地とし
ては、例えばグルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地
〔ミラー（Miller），ジャーナル・オブ・エクスペリメ
ンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Journa
l of Experiments in Molecular Genetics），431頁，C
old Spring Harbor Laboratory, New York 1972年〕が
好ましい。必要によりプロモーターを効率よく働かせる
ために、例えば３β−インドリルアクリル酸のような薬
剤を培地に加えて培養してもよい。宿主がエシェリヒア
属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時
間行い、必要により、通気や撹拌を加えることもでき
る。宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４
０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を
加えることもできる。宿主が酵母である形質転換体を培
養する際、培地としては、例えばバークホールダー（Bu
rkholder）最小培地〔Bostian, K. L. ら、プロシージ
ングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サ
イエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl.
Acad. Sci. ＵＳＡ），第77巻，4505頁（1980年）〕や
０.５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Bitter, G. A.
ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエ
ー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），第81巻，5330
頁（1984年）〕が挙げられる。培地のｐＨは約５〜８に
調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５℃で
約２４〜７２時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加え
ることもできる。

【００３１】宿主が昆虫である形質転換体を培養する
際、培地としては、Grace's Insect Medium（Grace, T.
C.C.,ネイチャー（Nature）,第195巻，788頁（1962
頁））に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加
えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６.２〜６.
４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３
〜５日間行い、必要に応じて通気や撹拌を加えることも
できる。宿主が動物細胞である形質転換体を培養する
際、培地としては、例えば約５〜２０％の胎児牛血清を
含むＭＥＭ培地〔サイエンス（Seience），第122巻，50
1頁（1952年）〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジー（Virol
ogy），第８巻，396頁（1959年）〕，ＲＰＭＩ １６４
０培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカ
ル・アソシエーション（The Jounal of the American M
edical Association），第199巻，519頁（1967年）〕，
１９９培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ
・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン（Proceedi
ng of the Society for the Biological Medicine），
第73巻，１頁（1950年）〕などが挙げられる。ｐＨは約
６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０℃〜４０
℃で約１５〜６０時間行い、必要に応じて通気や撹拌を
加えることもできる。

【００３２】上記培養物（培養液および培養菌体あるい
は培養細胞）からポリペプチドを分離精製するには、例
えば下記の方法に従って行なえばよい。該ポリペプチド
が、培養菌体中あるいは培養細胞中に蓄積される場合
は、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、こ
れを適当な緩衝液に懸濁後、公知の超音波処理、リゾチ
ーム処理および／または凍結融解処理などによって菌体
あるいは細胞を破壊した後、公知の遠心分離やろ過など
の操作により、目的のポリペプチドまたはその部分ペプ
チドは、抽出液として得ることができる。該緩衝液の中
には、尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤や、ト
リトンＸ−１００（和光純薬（株）など、登録商標：
以下、ＴＭと省略することがある）などの界面活性剤を
必要に応じて添加して用いてもよい。一方、培養液中に
ポリペプチドが分泌される場合には、培養後、まず培養
菌体あるいは培養細胞と培養上清とを公知の方法により
分離し、培養上清として得ることができる。得られる培
養上清または抽出液中に含まれる、ポリペプチドの精製
は、自体公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行な
うことができる。これらの公知の分離、精製法として
は、（１）塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方
法、（２）透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法およびＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として
分子量の差を利用する方法、（３）イオン交換クロマト
グラフィーなどの荷電の差を利用する方法、（４）アフ
ィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利
用する方法、（５）逆相高速液体クロマトグラフィーな
どの疎水性の差を利用する方法、（６）等電点電気泳動
法やクロマトフォーカシングなどの等電点の差を利用す
る方法などが挙げられる。

【００３３】該ポリペプチドまたはその部分ペプチドが
遊離体で得られる場合には、自体公知の方法あるいはそ
れに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に
塩で得られた場合には自体公知の方法あるいはそれに準
じる方法により、遊離体または他の塩に変換することが
できる。なお、該ポリペプチドまたはその部分ペプチド
の精製前または精製後、これに公知の方法に従い適当な
蛋白質修飾酵素を作用させることにより、該ポリペプチ
ドに任意の修飾を加えたり、該ポリペプチド中の配列を
部分的に除去することもできる。該蛋白質修飾酵素とし
ては、例えばトリプシン、キモトリプシン、アルギニル
エンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダ
ーゼなどが挙げられる。このようにして得られる変異ポ
リペプチドの活性は、レセプターとの結合実験や特異抗
体を用いたエンザイムイムノアッセイ法などにより測定
することができる。

【００３４】本発明のリガンドポリペプチドをコードす
るＤＮＡを含有するＤＮＡ、該リガンドポリペプチド
は、(a)Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質のリガンドペ
プチドの合成、(b)該リガンドポリペプチドの有する生
理作用の探索、(c)合成オリゴヌクレオチド・プローブ
あるいはＰＣＲ法におけるオリゴヌクレオチド・プライ
マーの作成、(d)Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質のリ
ガンドペプチドをコードするＤＮＡの取得、(e)組換え
型レセプター蛋白質の発現系を用いるレセプター結合ア
ッセイ系の開発とそれを用いる医薬品候補化合物のスク
リーニング、(f)Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質のリ
ガンドペプチドに対する抗体および抗血清の取得、(g)
該抗体または抗血清を用いる診断薬の開発、(h)下垂体
機能調節剤、中枢神経機能調節剤あるいは膵臓機能調節
剤などの医薬の開発、(i)遺伝子治療、(j)蛋白質共役型
レセプター蛋白質のリガンドペプチドをコードする遺伝
子に関する非ヒト・トランスジェニック動物の作製等に
用いることができる。特に、本発明のリガンドポリペプ
チドをコードするＤＮＡを含有するＤＮＡは、蛋白質共
役型レセプター蛋白質のリガンドペプチドをコードする
遺伝子に関する非ヒト・トランスジェニック動物、とり
わけ該遺伝子の欠損しているノックアウトマウスの作
製、およびそれを用いる該リガンドポリペプチドの生理
作用や機能の解析に有用である。

【００３５】さらに、上記(h)に関しては、本発明のリ
ガンドポリペプチドは、下垂体、中枢神経系、膵臓β細
胞などで発現しているＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質
がリガンドとして認識するポリペプチドであるため、本
発明のリガンドポリペプチドまたはそれをコードするＤ
ＮＡを含有するＤＮＡは、安全で低毒性な医薬として有
用であると考えられる。Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白
質のリガンドポリペプチドは、下垂体機能調節作用、中
枢神経機能調節作用あるいは膵臓機能調節作用等に関与
していると考えられることから、本発明のリガンドポリ
ペプチドまたはそれらをコードするＤＮＡを含有するＤ
ＮＡは、例えば老人性痴呆、脳血管性痴呆、系統変成型
の退行変成疾患（例：アルツハイマー病、パーキンソン
病、ピック病、ハンチントン病など）に起因する痴呆、
感染性疾患（例：クロイツフェルト−ヤコブ病などの遅
発ウイルス感染症など）に起因する痴呆、内分泌性・代
謝性・中毒性疾患（例：甲状腺機能低下症、ビタミンＢ
１２欠乏症、アルコール中毒、各種薬剤・金属・有機化
合物による中毒など）に起因する痴呆、腫瘍性疾患
（例：脳腫瘍など）に起因する痴呆、外傷性疾患（例：
慢性硬膜下血腫など）に起因する痴呆などの痴呆、鬱
病、多動児（微細脳障害）症候群、意識障害、不安障
害、精神分裂症、恐怖症、成長ホルモン分泌障害（例：
巨人症、末端肥大症など）、過食症、多食症、高コレス
テロール血症、高グリセリド血症、高脂血症、高プロラ
クチン血症、糖尿病性合併症、糖尿病性腎症、糖尿病性
神経障害、糖尿病性網膜症、糖尿病、癌（例：乳癌、リ
ンパ性白血病、膀胱癌、卵巣癌、前立腺癌など）、膵
炎、腎疾患（例：慢性腎不全、腎炎など）、ターナー症
候群、神経症、リウマチ関節炎、脊髄損傷、一過性脳虚
血発作、筋萎縮性側索硬化症、急性心筋梗塞、脊髄小脳
変性症、骨折、創傷、アトピー性皮膚炎、骨粗鬆症、喘
息、てんかん、不妊症または乳汁分泌不全などの疾病の
治療および／または予防剤として用いることができる。
さらに、手術後の栄養状態改善剤、昇圧剤などとしても
用いることもできる。本発明のポリペプチド（またはそ
れをコードするＤＮＡを含有するＤＮＡ）を上述の医薬
として使用する場合は、常套手段に従い実施すればよ
い。例えば、該ポリペプチド（またはそれをコードする
ＤＮＡを含有するＤＮＡ）を、必要に応じて糖衣を施し
た錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル
剤などの剤形として、経口的、または、水もしくはそれ
以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液または懸濁
液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例え
ば、これらの剤形は、該化合物またはその塩を生理学的
に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐
剤、安定剤、結合剤などとともに、通常用いられる製薬
実施における単位用量形態で混和することによって製造
することができる。これら製剤における有効成分量は、
指示された範囲の適当な容量が得られるようにするもの
である。

【００３６】錠剤、カプセル剤などに混和することがで
きる添加剤としては、例えばゼラチン、コーンスター
チ、トラガントガム、アラビアゴムのような結合剤；結
晶性セルロースのような賦形剤；コーンスターチ、ゼラ
チン、アルギン酸などのような膨化剤；ステアリン酸マ
グネシウムのような潤滑剤；ショ糖、乳糖またはサッカ
リンのような甘味剤；ペパーミント、アカモノ油または
チェリーのような香味剤などが挙げられる。調剤単位形
態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさら
に油脂のような液状担体を含有することができる。注射
のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活
性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油な
どを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従っ
て処方することができる。注射用の水性液としては、例
えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等
張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、
塩化ナトリウムなど）などがあげられ、適当な溶解補助
剤、例えばアルコール（例えばエタノール）、ポリアル
コール（例えばプロピレングリコール、ポリエチレング
リコール）、非イオン性界面活性剤（例えばポリソルベ
ート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよ
い。油性液としてはゴマ油、大豆油などがあげられ、溶
解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール
などと併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸
塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例え
ば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安
定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリ
コールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、
フェノールなど）、酸化防止剤などを配合してもよい。
調整された注射液は通常、適当なアンプルに無菌的に充
填される。このようにして得られる製剤は安全で低毒性
であるので、例えばヒトや哺乳動物（例えば、マウス、
ラット、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネ
コ、イヌ、サル、マントヒヒ、チンパンジーなど）に対
して投与することができる。本発明のポリペプチド（ま
たはそれをコードするＤＮＡ）の投与量は、症状などに
より差異はあるが、経口投与する場合、一般的に成人
（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０.１か
ら１００ｍｇ、好ましくは約１．０から５０ｍｇ、より
好ましくは約１．０から２０ｍｇである。非経口的に投
与する場合は、その１回投与量は投与対象、症状、投与
方法などによっても異なるが、例えば注射剤の形では通
常成人（６０ｋｇとして）においては、一日につき約
０．０１から３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１から２
０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１から１０ｍｇ程度
を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物
の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与すること
ができる。

【００３７】本発明のリガンドポリペプチドに対する、
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質としては、ヒトや温血
動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ブタ、ヒ
ツジ、ウシ、サルなど）のあらゆる組織（例えば、下垂
体、膵臓、脳、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、
骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管、血管、心臓な
ど）または細胞などに由来するＧ蛋白質共役型レセプタ
ー蛋白質であって、配列番号：１０，１１，１２，１３
または１４で表わされるアミノ酸配列と同一もしくはこ
れらのアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含
有するものであれば如何なるものであってもよい。即
ち、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質としては、配列番
号：１０，１１，１２，１３または１４で表わされるア
ミノ酸配列を含有する蛋白質などの他に、配列番号：１
０，１１，１２，１３または１４で表わされるアミノ酸
配列と約９０〜９９．９％の相同性を有するアミノ酸配
列を含有し、配列番号：１０，１１，１２，１３または
１４で表わされるアミノ酸配列を含有する蛋白質と実質
的に同質の活性を有する蛋白質などが挙げられる。これ
らの蛋白質が示す活性としては、例えばリガンド結合活
性、シグナル伝達などが挙げられる。実質的に同質と
は、リガンド結合活性などが性質的に同質であることを
示す。従って、リガンド結合活性の強さなどの強弱、レ
セプター蛋白質の分子量などの量的要素は異なっていて
もよい。

【００３８】本発明のリガンドポリペプチドに対する、
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質としてさらに具体的に
は、配列番号：１０または／および配列番号：１１で表
わされるアミノ酸配列を含有するヒト下垂体由来のＧ蛋
白質共役型レセプター蛋白質、配列番号：１３で表わさ
れるアミノ酸配列を含有するマウス膵臓由来のＧ蛋白質
共役型レセプター蛋白質、配列番号：１４で表わされる
アミノ酸配列を含有するマウス膵臓由来のＧ蛋白質共役
型レセプター蛋白質などが挙げられる。そして、配列番
号：１０および配列番号：１１で表わされるアミノ酸配
列を含有するヒト下垂体由来のＧ蛋白質共役型レセプタ
ー蛋白質としては、具体的には配列番号：１２で表わさ
れるアミノ酸配列を含有するヒト下垂体由来のＧ蛋白質
共役型レセプター蛋白質などが挙げられる。ここで、配
列番号：１２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実
質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質は、ヒト下
垂体由来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の全アミノ酸
配列を含有するものである。配列番号：１０または／お
よび配列番号：１１で表されるアミノ酸配列と同一もし
くは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質は、
該配列番号：１２で表されるアミノ酸配列と同一もしく
は実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質の断片
あるいは部分ペプチドである。さらに、配列番号：１３
または配列番号：１４で表されるアミノ酸配列と同一も
しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質
は、マウス膵臓由来のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質
であるが、配列番号：１０または／および配列番号：１
１で表されるアミノ酸配列に非常に高い類似性を示すこ
とから、配列番号：１３または１４で表されるアミノ酸
配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有
する蛋白質も同様に、配列番号：１２で表されるアミノ
酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含
有する蛋白質の断片あるいは部分ペプチドの中に含まれ
る。即ち、上述の配列番号：１２で表されるアミノ酸配
列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有す
る蛋白質もしくは後述する該蛋白質の部分ペプチドまた
はその塩は、配列番号：１０，１１，１２，１３または
１４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同
一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩をも含
むものである。さらに、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白
質には、Ｎ末端のMetが保護基（例えば、ホルミル基、
アセチル基などのＣ_1-6アルカノイル基など）で保護さ
れているもの、ＧｌｕのＮ端側が生体内で切断され、該
Ｇｌｕがピログルタミン酸化したもの、該レセプター蛋
白質の構成アミノ酸の側鎖が適当な保護基（例えば、ホ
ルミル基、アセチル基などのＣ_1-6アルカノイル基な
ど）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したい
わゆる糖蛋白質などの複合蛋白質なども含まれる。

【００３９】Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の塩とし
ては、前述のリガンドポリペプチドにおいて例示した塩
と同様のものが挙げられる。Ｇ蛋白質共役型レセプター
蛋白質もしくは該部分ペプチド、またはそれらの塩は、
ヒトや温血動物の組織または細胞から自体公知の蛋白質
の精製方法によって製造することができ、また前述のポ
リペプチドをコードするＤＮＡを含有する形質転換体を
培養する方法と同様の方法によって製造することもでき
る。また、前述のペプチド合成法に準じて製造すること
もできる。該製造法については、WO96/05302の実施例
３，４，６および１７に詳細に記載されている。

【００４０】Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコード
するＤＮＡとしては、配列番号：１０，１１，１２，１
３または１４のアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同
一のアミノ酸配列を有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋
白質をコードする塩基配列を含有するＤＮＡであればい
かなるものであってもよい。それらは、ゲノムＤＮＡ、
ゲノムＤＮＡライブラリー、組織・細胞由来のｃＤＮ
Ａ、組織・細胞由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮ
Ａのいずれであってもよい。該ゲノムＤＮＡまたはｃＤ
ＮＡのライブラリーに使用するベクターはバクテリオフ
ァージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいず
れであってもよく、また、組織・細胞よりＲＮＡ画分を
調製したものを用いて直接ＲＴ-ＰＣＲ法によって増幅
することもできる。具体的には、配列番号：１０のアミ
ノ酸配列を含有するヒト下垂体由来のＧ蛋白質共役型レ
セプター蛋白質をコードするＤＮＡとしては、配列番
号：１５で表わされる塩基配列を有するＤＮＡなどが挙
げられる。配列番号：１１のアミノ酸配列を含有するヒ
ト下垂体由来のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコー
ドするＤＮＡとしては、配列番号：１６で表わされる塩
基配列を有するＤＮＡなどが挙げられる。配列番号：１
２のアミノ酸配列を含有するヒト下垂体由来のＧ蛋白質
共役型レセプター蛋白質をコードするＤＮＡとしては、
配列番号：１７で表わされる塩基配列を有するＤＮＡな
どが挙げられる。配列番号：１３のアミノ酸配列を含有
するマウス膵臓由来のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質
をコードするＤＮＡとしては、配列番号：１８で表わさ
れる塩基配列を有するＤＮＡなどが挙げられる。配列番
号：１４のアミノ酸配列を含有するマウス膵臓由来のＧ
蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするＤＮＡとし
ては、配列番号：１９で表わされる塩基配列を有するＤ
ＮＡなどが挙げられる。該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋
白質を完全にコードするＤＮＡのクローニングの方法、
用い得るベクター、プロモーター、宿主、形質転換方
法、培養方法、分離精製の方法については前述のリガン
ドポリペプチドの場合と同様である。

【００４１】本発明のリガンドポリペプチドおよびそれ
をコードするＤＮＡおよび該リガンドポリペプチドに対
する抗体等の用途について、以下にさらに具体的に説明
する。 （１）リガンドポリペプチド欠乏症の予防・治療剤 本発明のリガンドポリペプチドをコードするＤＮＡを、
該リガンドポリペプチド欠乏症の予防および／または治
療剤として使用することができる。例えば、生体内にお
いて、該リガンドポリペプチドが減少しているためにリ
ガンドの生理作用（下垂体機能調節作用、中枢神経機能
調節作用あるいは膵臓機能調節作用など）が期待できな
い患者がいる場合、（イ）該リガンドポリペプチドをコ
ードするＤＮＡをその患者に投与し発現させることによ
り、あるいは（ロ）脳細胞などにリガンドポリペプチド
をコードするＤＮＡを挿入し発現させた後に、該脳細胞
を該患者に移植することなどにより、その患者の脳細胞
における該リガンドポリペプチドの量を増加させ、その
作用を充分に発揮させることができる。従って、リガン
ドポリペプチドをコードするＤＮＡは、安全で低毒性な
該リガンドポリペプチド欠乏症の予防および／または治
療剤として用いることができる。上記治療剤として該Ｄ
ＮＡを使用する場合は、該ＤＮＡを単独あるいはレトロ
ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウ
イルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当な
ベクターに挿入した後に、上記と同様に該リガンドポリ
ペプチド欠乏症の予防および／または治療剤として用い
てもよい。

【００４２】（２）リガンドポリペプチドに対するＧ蛋
白質共役型レセプター蛋白質の定量法 本発明のリガンドポリペプチドは、Ｇ蛋白質共役型レセ
プター蛋白質またはその塩や該レセプター蛋白質の部分
ペプチドまたはその塩に対して結合性を有しているの
で、生体内における該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質
もしくはその部分ペプチド、またはそれらの塩の量を高
感度に定量することができる。この定量法は、例えば競
合法と組み合わせて用いることができる。すなわち、被
検体を本発明のリガンドポリペプチドと接触させること
によって被検体中のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質も
しくはその部分ペプチド、またはそれらの塩の量を測定
することができる。具体的には、例えば、以下のまた
はなどに記載の方法あるいはそれに準じる方法に従っ
て用いることができる。 入江寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４
９年発行） 入江寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和
５４年発行）

【００４３】（３）Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質
と、本発明のリガンドポリペプチド、またはそのアミ
ド、エステルもしくはその塩（以下、リガンドまたはリ
ガンドポリペプチドと略称する場合がある。）との結合
性を変化させる化合物のスクリーニング方法 Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその部分ペプ
チド、またはその塩を直接用いるか、またはそれらを組
換え型レセプター蛋白質として発現系を構築し、これに
よる該レセプター結合アッセイ系を用いることによっ
て、リガンドポリペプチドとＧ蛋白質共役型レセプター
蛋白質との結合性を変化させる化合物、即ち該レセプタ
ー蛋白質に対するアゴニストまたはアンタゴニスト（例
えば、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化
合物、発酵生産物など）またはその塩をスクリーニング
することができる。このような化合物には、Ｇ蛋白質共
役型レセプターを介して細胞刺激活性（例えば、アラキ
ドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊離、
細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトー
ルリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸
化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活
性または抑制する活性など）を有する化合物（即ちＧ蛋
白質共役型レセプターアゴニスト）と該細胞刺激活性を
有しない化合物（即ちＧ蛋白質共役型レセプターアンタ
ゴニスト）などが含まれる。「リガンドとの結合性を変
化させる」とは、リガンドとの結合を阻害する場合とリ
ガンドとの結合を促進する場合の両方を包含するもので
ある。該スクリーニング方法は、Ｇ蛋白質共役型レセプ
ター蛋白質もしくはその部分ペプチド、またはそれらの
塩に、（i）本発明のリガンドペプチドを接触させた場
合と、（ii）本発明のリガンドペプチドおよび試験化合
物を接触させた場合の、リガンドとの結合量や、細胞刺
激などの活性変化を比較することを特徴とする該リガン
ドポリペプチドとＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質との
結合性を変化させる化合物またはその塩をスクリーニン
グする方法であり、以下に具体例を挙げる。

【００４４】（ａ）標識した本発明のリガンドポリペプ
チドを、試験化合物の共存下または非共存下において、
該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその部分ペ
プチド、またはそれらの塩に接触させ、該リガンドポリ
ペプチドとの結合量を測定し比較することにより、該試
験化合物の作用を調べる。 （ｂ）標識した本発明のリガンドポリペプチドを、試験
化合物の共存下または非共存下において、Ｇ蛋白質共役
型レセプター蛋白質を含有する細胞または該細胞の膜画
分に接触させ、該リガンドポリペプチドの該細胞または
該膜画分に対する該リガンドポリペプチドの結合量を測
定し比較することにより、該試験化合物の作用を調べ
る。 （ｃ）標識した本発明のリガンドポリペプチドを、試験
化合物の共存下または非共存下において、Ｇ蛋白質共役
型レセプター蛋白質をコードするＤＮＡを含有する形質
転換体を培養することによって細胞膜上に発現した該レ
セプター蛋白質に接触させ、該リガンドポリペプチドの
該細胞または該膜画分に対する該リガンドポリペプチド
の結合量を測定し比較することにより、該試験化合物の
作用を調べる。 （ｄ）Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を活性化する化
合物（例えば、本発明のリガンドポリペプチドなど）
を、試験化合物の共存下または非共存下において、Ｇ蛋
白質共役型レセプター蛋白質を含有する細胞に接触さ
せ、該レセプターを介した細胞刺激活性（例えば、アラ
キドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊
離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシ
トールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリ
ン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進す
る活性または抑制する活性など）を測定し比較すること
により、該試験化合物の作用を調べる。 （ｅ）Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を活性化する化
合物（例えば、本発明のリガンドポリペプチドなど）
を、試験化合物の共存下または非共存下において、Ｇ蛋
白質共役型レセプター蛋白質をコードするＤＮＡを含有
する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現
したＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に接触させ、該レ
セプターを介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸
遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ²⁺遊離、細胞内
ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン
酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ
−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性また
は抑制する活性など）を測定し、比較することにより、
該試験化合物の作用を調べる。

【００４５】Ｇ蛋白質共役型レセプターアゴニストまた
はアンタゴニストをスクリーニングする場合、まずマウ
スやラットなどのＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質を含
む細胞、組織またはその細胞膜画分を用いて候補化合物
を得て（一次スクリーニング）、その後に該候補化合物
が実際にヒトのＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質とリガ
ンドとの結合を阻害するか否かを確認する試験（二次ス
クリーニング）が必要である。しかし、細胞、組織また
は細胞膜画分をそのまま用いれば他のレセプター蛋白質
も混在するために、目的とするレセプター蛋白質に対す
るアゴニストまたはアンタゴニストを実際にスクリーニ
ングすることは困難である。しかしながら、ヒト由来Ｇ
蛋白質共役型レセプター蛋白質を用いることによって、
一次スクリーニングの必要がなくなり、リガンドポリペ
プチドとＧ蛋白質共役型レセプターとの結合性を変化さ
せる化合物を効率良くスクリーニングすることができ
る。さらに、スクリーニングされた化合物がＧ蛋白質共
役型レセプターアゴニストかＧ蛋白質共役型レセプター
アンタゴニストかを評価することができる。該スクリー
ニング方法を、以下に具体的に説明する。まず、該スク
リーニング方法に用いるＧ蛋白質共役型レセプター蛋白
質としては、前述のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質ま
たはその部分ペプチドを含有するものであれば何れのも
のであってもよいが、ヒトや温血動物の臓器の膜画分が
好適である。しかし、特にヒト由来の臓器は入手が極め
て困難なことから、スクリーニングに用いられるものと
しては、組換え体を用いて大量発現させたＧ蛋白質共役
型レセプター蛋白質が適している。Ｇ蛋白質共役型レセ
プター蛋白質を製造するには、前述の方法が用いられ
る。Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有する細胞あ
るいは該細胞膜画分を用いる場合、前述の調製法に従え
ばよい。

【００４６】本発明のリガンドポリペプチドとＧ蛋白質
共役型レセプターとの結合性を変化させる化合物をスク
リーニングする前記の（ａ）〜（ｃ）を実施するために
は、適当なＧ蛋白質共役型レセプター画分と、標識した
本発明のリガンドポリペプチドが必要である。Ｇ蛋白質
共役型レセプター画分としては、天然型のＧ蛋白質共役
型レセプター画分か、またはそれと同等の活性を有する
組換え型Ｇ蛋白質共役型レセプター画分などが好ましい
（ここで、同等の活性とは、同等のリガンド結合活性な
どを示す）。標識したリガンドとしては、標識したリガ
ンド、標識したリガンドアナログ化合物などが用いられ
る。例えば〔³Ｈ〕、〔¹²⁵Ｉ〕、〔¹⁴Ｃ〕、〔³⁵Ｓ〕な
どで標識されたリガンドなどを利用することができる。
具体的には、リガンドポリペプチドとＧ蛋白質共役型レ
セプター蛋白質との結合性を変化させる化合物のスクリ
ーニングを行うには、まずＧ蛋白質共役型レセプター蛋
白質を含有する細胞または細胞の膜画分を、スクリーニ
ングに適したバッファーに懸濁することによりレセプタ
ー標品を調製する。バッファーには、ｐＨ４〜１０（望
ましくはｐＨ６〜８）のリン酸バッファー、トリス−塩
酸バッファーなどのリガンドとレセプターとの結合を阻
害しないバッファーであればいずれでもよい。また、非
特異的結合を低減させる目的で、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅ
ｎ−８０^TM（花王−アトラス社）、ジギトニン、デオキ
シコレートなどの界面活性剤をバッファーに加えること
もできる。さらに、プロテアーゼによるレセプターやリ
ガンドの分解を抑える目的でＰＭＳＦ、ロイペプチン、
Ｅ−６４（ペプチド研究所製）、ペプスタチンなどのプ
ロテアーゼ阻害剤を添加することもできる。０.０１ml
〜１０ｍｌの該レセプター溶液に、一定量（５０００ｃ
ｐｍ〜５０００００ｃｐｍ）の標識したリガンドを添加
し、同時に１０^-4Ｍ〜１０^-10 Ｍの試験化合物を共存さ
せる。非特異的結合量（ＮＳＢ）を知るために大過剰の
未標識のリガンドを加えた反応チューブも用意する。反
応は０℃から５０℃、望ましくは４℃から３７℃で２０
分から２４時間、望ましくは３０分から３時間行う。反
応後、ガラス繊維濾紙等で濾過し、適量の同バッファー
で洗浄した後、ガラス繊維濾紙に残存する放射活性を液
体シンチレーションカウンターまたはγ−カウンターで
計測する。拮抗する物質がない場合のカウント(Ｂ₀）か
ら非特異的結合量（ＮＳＢ）を引いたカウント（Ｂ₀−
ＮＳＢ）を１００％とした時、特異的結合量（Ｂ−ＮＳ
Ｂ）が例えば５０％以下になる試験化合物を拮抗阻害能
力のある候補物質として選択することができる。

【００４７】本発明のリガンドとＧ蛋白質共役型レセプ
ター蛋白質との結合性を変化させる化合物をスクリーニ
ングする前記の（ｄ）〜（ｅ）の方法を実施するために
は、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を介する細胞刺激
活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊
離、細胞内Ｃａ遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧ
ＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、
細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの
低下などを促進する活性または抑制する活性など）を公
知の方法または市販の測定用キットを用いて測定するこ
とができる。具体的には、まず、Ｇ蛋白質共役型レセプ
ター蛋白質を含有する細胞をマルチウェルプレート等に
培養する。スクリーニングを行なうにあたっては前もっ
て新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッ
ファーに交換し、試験化合物などを添加して一定時間イ
ンキュベートした後、細胞を抽出あるいは上清液を回収
して、生成した産物をそれぞれの方法に従って定量す
る。細胞刺激活性の指標とする物質（例えば、アラキド
ン酸など）の生成が、細胞が含有する分解酵素によって
検定困難な場合は、該分解酵素に対する阻害剤を添加し
てアッセイを行なってもよい。また、ｃＡＭＰ産生抑制
などの活性については、フォルスコリンなどで細胞の基
礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作
用として検出することができる。細胞刺激活性を測定し
てスクリーニングを行なうには、適当なＧ蛋白質共役型
レセプター蛋白質を発現した細胞が必要である。本発明
のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質を発現した細胞とし
ては、天然型の本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白
質を有する細胞株（例えば、マウス膵臓β細胞株ＭＩＮ
６など）、前述の組換え型Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋
白質発現細胞株などが望ましい。試験化合物としては、
例えばペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成
化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組
織抽出液などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物
であってもよいし、公知の化合物であってもよい。

【００４８】本発明のリガンドとＧ蛋白質共役型レセプ
ター蛋白質との結合性を変化させる化合物またはその塩
のスクリーニング用キットは、Ｇ蛋白質共役型レセプタ
ー蛋白質またはその塩、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白
質の部分ペプチドまたはその塩、Ｇ蛋白質共役型レセプ
ター蛋白質を含有する細胞、あるいはＧ蛋白質共役型レ
セプター蛋白質を含有する細胞の膜画分、および本発明
のリガンドポリペプチドを含有するものである。本発明
のスクリーニング用キットの例としては、次のものが挙
げられる。 １．スクリーニング用試薬 測定用緩衝液および洗浄用緩衝液 Hanks' Balanced Salt Solution（ギブコ社製）に、０.
０５％のウシ血清アルブミン（シグマ社製）を加えたも
の。孔径０.４５μｍのフィルターで濾過滅菌し、４℃
で保存するか、あるいは用時調製しても良い。 Ｇ蛋白質共役型レセプター標品 Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を発現させたＣＨＯ細
胞を、１２穴プレートに５×１０⁵個／穴で継代し、３
７℃、５％ＣＯ₂、９５％ａｉｒで２日間培養したも
の。 標識リガンド 市販の〔³Ｈ〕、〔¹²⁵Ｉ〕、〔¹⁴Ｃ〕、〔³⁵Ｓ〕などで
標識したリガンド 適当な溶媒または緩衝液に溶解したものを４℃あるいは
−２０℃にて保存し、用時に測定用緩衝液にて１μＭに
希釈する。 リガンド標準液 リガンドを０.１％ウシ血清アルブミン（シグマ社製）
を含むＰＢＳで１ｍＭとなるように溶解し、−２０℃で
保存する。

【００４９】２．測定法 １２穴組織培養用プレートにて培養したＧ蛋白質共役
型レセプター蛋白質を発現させた細胞を、測定用緩衝液
１ｍｌで２回洗浄した後、４９０μｌの測定用緩衝液を
各穴に加える。 １０^-3〜１０^-10Ｍの試験化合物溶液を５μｌ加えた
後、標識リガンドを５μｌ加え、室温にて１時間反応さ
せる。非特異的結合量を知るためには試験化合物のかわ
りに１０^-3Ｍのリガンドを５μｌ加えておく。 反応液を除去し、１ｍｌの洗浄用緩衝液で３回洗浄す
る。細胞に結合した標識リガンドを０.２Ｎ ＮａＯＨ
−１％ＳＤＳで溶解し、４ｍｌの液体シンチレーターＡ
（和光純薬製）と混合する。 液体シンチレーションカウンター（ベックマン社製）
を用いて放射活性を測定し、Percent Maximum Binding
（ＰＭＢ）を次の式〔数１〕で求める。

【数１】 ＰＭＢ：Percent Maximum Binding Ｂ ：検体を加えた時の値 ＮＳＢ：Non-specific Binding（非特異的結合量） Ｂ₀ ：最大結合量

【００５０】該スクリーニング方法またはスクリーニン
グ用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、本
発明のリガンドポリペプチドとＧ蛋白質共役型レセプタ
ーとの結合を変化させる（結合を阻害あるいは促進す
る）化合物であり、具体的にはＧ蛋白質共役型レセプタ
ーを介して細胞刺激活性を有する化合物またはその塩
（いわゆるＧ蛋白質共役型レセプターアゴニスト）、あ
るいは該刺激活性を有しない化合物（いわゆるＧ蛋白質
共役型レセプターアンタゴニスト）である。該化合物と
しては、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合
成化合物、発酵生産物などが挙げられ、これら化合物は
新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であって
もよい。該Ｇ蛋白質共役型レセプターアゴニストは、Ｇ
蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するリガンドポリペ
プチドが有する生理活性と同様の作用を有しているの
で、該リガンド活性に応じて安全で低毒性な医薬として
有用である。逆に、Ｇ蛋白質共役型レセプターアンタゴ
ニストは、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するリ
ガンドポリペプチドが有する生理活性を抑制することが
できるので、該リガンド活性を抑制する安全で低毒性な
医薬として有用である。Ｇ蛋白質共役型レセプターのリ
ガンドは、下垂体機能調節作用、中枢神経機能調節作用
または膵臓機能調節作用に関与していることから、上記
したアゴニストあるいはアンタゴニストを例えば老人性
痴呆、脳血管性痴呆、系統変成型の退行変成疾患（例：
アルツハイマー病、パーキンソン病、ピック病、ハンチ
ントン病など）に起因する痴呆、感染性疾患（例：クロ
イツフェルト−ヤコブ病などの遅発ウイルス感染症な
ど）に起因する痴呆、内分泌性・代謝性・中毒性疾患
（例：甲状腺機能低下症、ビタミンＢ１２欠乏症、アル
コール中毒、各種薬剤・金属・有機化合物による中毒な
ど）に起因する痴呆、腫瘍性疾患（例：脳腫瘍など）に
起因する痴呆、外傷性疾患（例：慢性硬膜下血腫など）
に起因する痴呆などの痴呆、鬱病、多動児（微細脳障
害）症候群、意識障害、不安障害、精神分裂症、恐怖
症、成長ホルモン分泌障害（例：巨人症、末端肥大症な
ど）、過食症、多食症、高コレステロール血症、高グリ
セリド血症、高脂血症、高プロラクチン血症、低血糖
症、下垂体機能低下症、下垂体性小人症、糖尿病（例：
糖尿病性合併症、糖尿病性腎症、糖尿病性神経障害、糖
尿病性網膜症など）、癌（例：乳癌、リンパ性白血病、
膀胱癌、卵巣癌、前立腺癌など）、膵炎、腎疾患（例：
慢性腎不全、腎炎など）、ターナー症候群、神経症、リ
ウマチ関節炎、脊髄損傷、一過性脳虚血発作、筋萎縮性
側索硬化症、急性心筋梗塞、脊髄小脳変性症、骨折、創
傷、アトピー性皮膚炎、骨粗鬆症、喘息、てんかん、不
妊症または乳汁分泌不全などの疾病の治療・予防剤とし
て用いることができる。さらに催眠鎮静剤、手術後の栄
養状態改善剤、昇圧剤、降圧剤などとしても用いること
ができる。該スクリーニング方法またはスクリーニング
用キットを用いて得られる化合物またはその塩を上述の
医薬として使用する場合、本発明のリガンドポリペプチ
ドを医薬として実施する場合と同様にして実施すること
ができる。

【００５１】（４）本発明のリガンドポリペプチドに対
する抗体または抗血清の製造 本発明のリガンドポリペプチドに対する抗体（例えば、
ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体）または抗血
清は、該リガンドポリペプチドを抗原として用い、自体
公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造すること
ができる。例えば、ポリクローナル抗体またはモノクロ
ーナル抗体は、以下の方法に従って製造することができ
る。 （Ａ）ポリクローナル抗体の作製 抗原としての該リガンドポリペプチドは、キャリアー用
蛋白と結合される。該キャリアー用蛋白としては、例え
ば、牛チログロブリン、牛血清アルブミン、牛ガンマグ
ロブリン、ヘモシアニン、フロインドの完全アジュバン
ト（ディフコ社製）などがあげられる。該抗原としての
リガンドポリペプチドとキャリアー用蛋白との結合に
は、公知の常套手段により実施すればよい。結合に用い
る試薬としては、例えば、グルタールアルデヒド、水溶
性カルボジイミドなどが挙げられる。抗原としての該リ
ガンドポリペプチドとキャリアー用蛋白との使用比は、
約１対１ないし約１対１０が適当であり、反応のｐＨ
は、中性付近、特に約６〜８前後が良好な結果を与える
場合が多い。また、反応に要する時間は、約１〜１２時
間が良い場合が多いが、特に、約２〜６時間が適当であ
る。このようにして作成された複合物は、常套手段で約
０〜１８℃前後で水に対して透析し、凍結して保存して
も良いし、凍結乾燥して保存しても良い。ポリクローナ
ル抗体を製造するためには、上記のようにして製造した
免疫原を温血動物に接種される。該抗体の製造に用いら
れる温血動物としては、例えば、哺乳温血動物（例、ウ
サギ、ヒツジ、ヤギ、ラット、マウス、モルモット、ウ
シ、ウマ、ブタ）、鳥類（例、ニワトリ、ハト、アヒ
ル、ガチョウ、ウズラ）などが挙げられる。免疫原を、
温血動物に接種する方法としては、動物に接種する免疫
原は、抗体産生をする有効な量でよく、例えば、ウサギ
に１回１mgを１mlの生理食塩水およびフロインドの完全
アジュバントで乳化して、背部ならびに後肢掌皮下に４
週間おきに５回接種すると抗体を産生させる場合が多
い。このようにして、温血動物中に形成された抗体を採
取する方法としては、例えばウサギでは、通常最終接種
後７日から１２日の間に耳静脈から採取し、遠心分離し
て血清として得られる。得られた抗血清は、通常、各抗
原ペプチドを保持させた担体を用いるアフィニティクロ
マトグラフィーで吸着した画分を回収することによりポ
リクローナル抗体を精製することができる。

【００５２】（Ｂ）モノクローナル抗体の作製 （ａ）モノクロナール抗体産生細胞の作製 本発明のリガンドポリペプチドは、温血動物に対する投
与により抗体産生が可能な部位に、それ自体あるいは担
体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生
能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全
フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常
２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。用
いられる温血動物としては、例えばサル、ウサギ、イ
ヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワ
トリがあげられるが、マウスおよびラットが好ましく用
いられる。モノクローナル抗体産生細胞の作製に際して
は、抗原で免疫された温血動物、例えばマウスから抗体
価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾
臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生
細胞を同種または異種の温血動物の骨髄腫細胞と融合さ
せることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドー
マを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定
は、例えば後記の標識化ポリペプチドと抗血清とを反応
させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定するこ
とによりなされる。融合操作は既知の方法、例えばケー
ラーとミルスタインの方法〔ネイチャー（Nature)、第2
56巻、495頁（1975年）〕に従い実施できる。融合促進
剤としてはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダ
イウィルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用
いられる。骨髄腫細胞としては例えばＮＳ−１、Ｐ３Ｕ
１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１などがあげられるが、Ｐ３Ｕ
１が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾
臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜
２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ１００
０〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加
され、２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃で１〜１
０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合
を実施できる。抗リガンドポリペプチド抗体産生ハイブ
リドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できる
が、例えばリガンドポリペプチド抗原を直接あるいは担
体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）に
ハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵
素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用
いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン
抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に
結合した抗リガンドポリペプチドモノクローナル抗体を
検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテイン
Ａを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加
し、放射性物質や酵素などで標識したリガンドポリペプ
チドを加え、固相に結合した抗リガンドポリペプチドモ
ノクローナル抗体を検出する方法などがあげられる。抗
リガンドポリペプチドモノクローナル抗体の選別は、自
体公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことが
できる。通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリ
ン、チミジン）を添加した動物細胞用培地で行なわれ
る。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが
生育できるものならばどのような培地を用いても良い。
例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児
血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地、１〜１０％の牛胎
児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））あるい
はハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、
日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度
は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培
養時間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週
間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なわれる。
ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の
抗リガンドポリペプチド抗体価の測定と同様にして測定
できる。

【００５３】（ｂ）モノクロナール抗体の精製 抗リガンドポリペプチドモノクローナル抗体の分離精製
は通常のポリクローナル抗体の分離精製と同様に免疫グ
ロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿
法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、Ｄ
ＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原
結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧな
どの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離さ
せて抗体を得る特異的精製法〕に従って行われる。以上
の（ａ）および（ｂ）の方法に従って製造させる本発明
のリガンドポリペプチドに対する抗体は、リガンドポリ
ペプチドを特異的に認識することができるので、被検液
中のリガンドポリペプチドの定量、特にサンドイッチ免
疫測定法による定量などに使用することができる。すな
わち、本発明は、例えば、（ｉ）本発明のリガンドポリ
ペプチドに対する抗体と、被検液および、標識化リガン
ドポリペプチドとを競合的に反応させ、該抗体に結合し
た標識化リガンドポリペプチドの割合を測定することを
特徴とする被検液中のリガンドポリペプチドの定量法、
（ii）被検液と担体上に不溶化した抗体および標識化さ
れた抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、不
溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする
被検液中のリガンドポリペプチドの定量法において、一
方の抗体が、リガンドポリペプチドのＮ端部を認識する
抗体で、他方の抗体がリガンドポリペプチドのＣ端部に
反応する抗体であることを特徴とする被検液中のリガン
ドポリペプチドの定量法を提供する。

【００５４】本発明のリガンドポリペプチドを認識する
モノクローナル抗体（以下、抗リガンドポリペプチド抗
体と称する場合がある）を用いてリガンドポリペプチド
の測定を行なえるほか、組織染色等による検出を行なう
こともできる。これらの目的には、抗体分子そのものを
用いてもよく、また、抗体分子のＦ(ａｂ')₂ 、Ｆａ
ｂ'、あるいはＦａｂ画分を用いてもよい。本発明の抗
体を用いる測定法は、 特に制限されるべきものではな
く、被測定液中の抗原量（例えばリガンドポリペプチド
量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の
量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知
量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算
出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよ
い。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリッ
ク法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、感
度、特異性の点で、後述するサンドイッチ法を用いるの
が特に好ましい。標識物質を用いる測定法に用いられる
標識剤としては、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発
光物質などが挙げられる。放射性同位元素としては、例
えば〔¹²⁵Ｉ〕、〔¹³¹Ｉ〕、〔³Ｈ〕、〔¹⁴Ｃ〕など
が、上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好
ましく、例えばβ−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダ
ーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、
リンゴ酸脱水素酵素等が、蛍光物質としては、フルオレ
スカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが、
発光物質としては、ルミノール、ルミノール誘導体、ル
シフェリン、ルシゲニンなどがそれぞれ挙げられる。さ
らに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−
アビジン系を用いることもできる。

【００５５】抗原あるいは抗体の不溶化には、公知の物
理吸着による方法を用いてもよく、また、蛋白質または
酵素等を不溶化、固定化するのに通常用いられる公知の
化学結合による方法でもよい。該担体としては、アガロ
ース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、
ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成
樹脂、あるいはガラス等が挙げられる。該サンドイッチ
法においては、不溶化した抗リガンドポリペプチド抗体
に被検液を反応させ（１次反応）、さらに標識化抗リガ
ンドポリペプチド抗体を反応させ（２次反応）たのち、
不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検
液中のリガンドポリペプチド量を定量することができ
る。１次反応と２次反応は逆の順序に行っても、また、
同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよ
い。標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じ
て行えばよい。また、サンドイッチ法による免疫測定法
において、固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる
抗体は必ずしも１種類である必要はなく、測定感度を向
上させる等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いて
もよい。 該サンドイッチ法によるリガンドポリペプチ
ドの測定法においては、１次反応と２次反応に用いられ
る抗リガンドポリペプチド抗体はリガンドポリペプチド
の結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。
即ち、１次反応および２次反応に用いられる抗体は、例
えば、２次反応で用いられる抗体が、リガンドポリペプ
チドのＣ端部を認識する場合、１次反応で用いられる抗
体は、好ましくはＣ端部以外、例えばＮ端部を認識する
抗体が用いられる。

【００５６】本発明のリガンドポリペプチド抗体をサン
ドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イム
ノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いるこ
とができる。競合法では、被検液中の抗原と標識抗原と
を抗体に対して競合的に反応させたのち、未反応の標識
抗原と(Ｆ）と抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離
し（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定し、
被検液中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体とし
て可溶性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコ
ール、前記抗体に対する第２抗体などを用いる液相法、
および、第１抗体として固相化抗体を用いるか、あるい
は、第１抗体は可溶性のものを用い第２抗体として固相
化抗体を用いる固相化法とが用いられる。イムノメトリ
ック法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の
標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離
するか、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗
体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化
抗体を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。
次に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量
を定量する。また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるい
は溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の
量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の
沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用す
るレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。

【００５７】これら個々の免疫学的測定法を本発明の測
定方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の
設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の
条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えてリガ
ンドポリペプチドの測定系を構築すればよい。これらの
一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを
参照することができる〔例えば、「Methods in ENZYMOL
OGY」 Vol. 70(Immunochemical Techniques(Part A))、
同書 Vol. 73(Immunochemical Techniques(Part B))、
同書 Vol. 74(Immunochemical Techniques(Part C))、
同書 Vol. 84(Immunochemical Techniques(Part D:Sele
cted Immunoassays))、 同書 Vol. 92(Immunochemical
Techniques(Part E:Monoclonal Antibodies and Genera
l Immunoassay Methods))、 同書 Vol. 121(Immunochem
ical Techniques(Part I:Hybridoma Technology and Mo
noclonal Antibodies))(以上、アカデミックプレス社発
行)など参照〕。以上のように、本発明のリガンドポリ
ペプチド抗体を用いることによって、該リガンドポリペ
プチドを感度良く定量することができる。

【００５８】（５）非ヒト・トランスジェニック哺乳動
物の作製 本発明のリガンドポリペプチドをコードするＤＮＡを含
有するＤＮＡ、またはその変異ＤＮＡ（以下、本発明の
変異ＤＮＡと略記することもある）を有する非ヒト・ト
ランスジェニック哺乳動物を作成することが可能にな
る。即ち、本発明は、（ａ）本発明のリガンドポリペプ
チドをコードするＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する
非ヒト・トランスジェニック哺乳動物、（ｂ）非ヒト哺
乳動物がゲッ歯動物である上記（ａ)記載の哺乳動物、 （ｃ）ゲッ歯動物がマウスまたはラットである上記
（ｂ）記載の哺乳動物、および（ｄ）本発明のリガンド
ポリペプチドをコードするＤＮＡまたはその変異ＤＮＡ
を含有し、哺乳動物において発現しうる組換えベクタ
ー、および（ｅ）上記（ｄ）記載の組換えベクターを含
有してなる遺伝子治療用医薬などを提供するものであ
る。

【００５９】本発明におけるリガンドポリペプチドをコ
ードするＤＮＡとしては、前述の配列番号：１で表され
るアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸
配列を含有するポリペプチドをコードする塩基配列を有
するＤＮＡを含有するＤＮＡ（以下、本発明ＤＮＡと略
称することもある）であり、例えば配列番号：２または
配列番号：３で表される塩基配列を有するＤＮＡなどが
挙げられる。本発明において、「本発明のリガンドポリ
ペプチドをコードするＤＮＡまたはその変異ＤＮＡ」に
おける「変異ＤＮＡ」は、該リガンドポリペプチドをコ
ードするＤＮＡの塩基配列中に、自然発生的または人為
的に変異、即ち塩基の、置換、欠失（欠損）または挿入
（付加）等の変異を有するＤＮＡを意味し、この変異の
結果、元のＤＮＡ（該リガンドポリペプチドをコードす
る無変異型のＤＮＡ）が正常に機能しなくなる異常ＤＮ
Ａも含まれる。 該異常ＤＮＡとしては、本発明のリ
ガンドペプチドの発現に異常をきたすＤＮＡを意味し、
例えば、本発明のリガンドペプチドの正常な機能を抑制
するタンパク質を発現させるＤＮＡなどが挙げられる。
本発明のＤＮＡに人為的に変異を加えるには、例えば、
公知の遺伝子工学的手法により、該ＤＮＡ配列の一部も
しくは全部の削除、他ＤＮＡの挿入または置換を行えば
よい。これらの変異処理により、例えば、該リガンドポ
リペプチドをコードするＤＮＡのコドンの読み取り枠を
ずらしたり、プロモーターあるいはエキソンの機能を破
壊することができ、その結果、該ゲノムＤＮＡと組換え
を起こさせることにより変異を導入するためのターゲッ
ンティング・ベクターＤＮＡを作製することができる。
本発明のリガンドポリペプチドをコードするＤＮＡまた
はその変異ＤＮＡを有する非ヒト・トランスジェニック
哺乳動物（以下、本発明のトランスジェニック動物と略
記することもある）は、未受精卵、受精卵、精子および
その始原細胞を含む胚芽細胞などに対して、好ましく
は、非ヒト哺乳動物の発生における胚発生の段階（さら
に好ましくは、単細胞または受精卵細胞の段階でかつ一
般に８細胞期以前）に、それぞれ公知のリン酸カルシウ
ム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マ
イクロインジェクション法、パーティクルガン法または
ＤＥＡＥ−デキストラン法などにより、目的とするリガ
ンドポリペプチドをコードするＤＮＡまたはその変異体
（変異型ＤＮＡ）を非ヒト哺乳動物に導入することによ
って作出することができる。また、該ＤＮＡ導入方法に
より、体細胞、生体の臓器、組織細胞などに目的とする
本発明ＤＮＡを導入し、細胞培養、組織培養などに利用
することもでき、さらに、これら細胞を上述の胚芽細胞
と自体公知の細胞融合法により融合させることにより本
発明の非ヒト・トランスジェニック哺乳動物を作出する
こともできる。

【００６０】該非ヒト哺乳動物としては、例えばウシ、
ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモッ
ト、ハムスター、マウスまたはラットなどが挙げられ
る。なかでも、病体哺乳動物モデル系の作成の面から個
体発生および生物サイクルが比較的短く、また、繁殖が
容易なゲッ歯哺乳動物、とりわけマウス（例えば、純系
として、Ｃ５７ＢＬ／６系統，ＤＢＡ２系統など、交雑
系として、Ｂ６Ｃ３Ｆ₁系統，ＢＤＦ₁系統，Ｂ６Ｄ２Ｆ
₁系統，ＢＡＬＢ／ｃ系統，ＩＣＲ系統など）またはラ
ット（例えば、Ｗｉｓｔａｒ，ＳＤなど）などが好まし
く挙げられる。該「哺乳動物において発現しうる組換え
ベクター」における「哺乳動物」としては、上記の非ヒ
ト哺乳動物の他にヒトが挙げられる。本発明の該ＤＮＡ
は、導入対象とする哺乳動物と同種あるいは異種のどち
らの哺乳動物由来のものであってもよい。本発明のＤＮ
Ａを対象哺乳動物に導入するには、該ＤＮＡを哺乳動物
細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合して用い
るのが一般に好ましい。例えば、本発明のマウス由来Ｄ
ＮＡを導入する場合、これと相同性が高い本発明のＤＮ
Ａを有する各種哺乳動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネ
コ、モルモット、ハムスター、ラットなど）由来のＤＮ
Ａを発現させうる各種プロモーターの下流に、本発明の
マウス由来ＤＮＡを結合したもの（ＤＮＡコンストラク
ト；例えばベクターなど）を対象哺乳動物の受精卵、例
えばマウス受精卵へ公知のマイクロインジェクション法
などにより、本発明ＤＮＡを高発現するＤＮＡ導入哺乳
動物を作出することができる。

【００６１】本発明のポリペプチドの発現ベクターとし
ては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミ
ド、酵母由来のプラスミド、λファージなどのバクテリ
オファージ、モロニー白血病ウィルスなどのレトロウィ
ルス、ワクシニアウィルスまたはバキュロウィルスなど
の哺乳動物ウイルスなどが用いられる。なかでも、大腸
菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミドまたは酵
母由来のプラスミドなどが好ましく用いられる。上記の
ＤＮＡの発現調節を行なうプロモーターとしては、例え
ば、ウィルス（例、シミアンウィルス、サイトメガロウ
ィルス、モロニー白血病ウィルス、ＪＣウィルス、乳癌
ウィルス、ポリオウィルスなど）に由来するＤＮＡのプ
ロモーター、各種哺乳動物（ヒト、ウサギ、イヌ、ネ
コ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）お
よび鳥類（ニワトリなど）由来のものとしては、アルブ
ミン、インスリンＩＩ、ウロプラキンＩＩ、エラスター
ゼ、エリスロポエチン、エンドセリン、筋クレアチンキ
ナーゼ、グリア線維性酸性タンパク質ク、グルタチオン
Ｓ−トランスフェラーゼ、血小板由来成長因子β、ケラ
チンＫ１，Ｋ１０およびＫ１４、コラーゲンＩ型および
ＩＩ型、サイクリックＡＭＰ依存タンパク質キナーゼβ
Ｉサブユニット、ジストロフィン、酒石酸抵抗性アルカ
リフォスファターゼ、心房ナトリウム利尿性因子、内皮
レセプターチロシンキナーゼ（一般にＴｉｅ２と略され
る）、ナトリウムカリウムアデノシン３リン酸化酵素
（Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ）、ニューロフィラメント軽
鎖、メタロチオネインＩおよびＩＩＡ、メタロプロティ
ナーゼ１組織インヒビター、ＭＨＣクラスＩ抗原（Ｈ−
２Ｌ）、Ｈ−ｒａｓ、レニン、ドーパミンβ−水酸化酵
素、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）、ポリペプチド
鎖延長因子1α（ＥＦ−１α）、βアクチン、αおよび
βミオシン重鎖、ミオシン軽鎖１および２、ミエリン基
礎タンパク質、チログロブリン、Ｔｈｙ−１、免疫グロ
ブリン、Ｈ鎖可変部（ＶＮＰ）、血清アミロイドＰコン
ポーネント、ミオグロビン、トロポニンＣ、平滑筋αア
クチン、プレプロエンケファリンＡ、バソプレシンなど
のプロモーターなどが用いられるが、好ましくは全身で
高発現することが可能なサイトメガロウィルスプロモー
ター、ヒトポリペプチド鎖延長因子１α（ＥＦ−１α）
のプロモーター、ヒトおよびニワトリβアクチンプロモ
ーターなどを用いることができる。

【００６２】上記ベクターは、ＤＮＡ導入哺乳動物にお
いて目的とするメッセンジャーＲＮＡの転写を終結する
配列（一般にターミネターと呼ばれる）を有しているこ
とが好ましく、例えば、ウィルス由来、各種哺乳動物お
よび鳥類由来の各ＤＮＡの配列を用いることができ、好
ましくは、シミアンウィルスのＳＶ４０ターミネターな
どが用いられる。その他、目的ＤＮＡをさらに高発現さ
せる目的で各ＤＮＡのスプライシングシグナル、エンハ
ンサー領域、真核ＤＮＡのイントロンの一部などをプロ
モーター領域の５´上流、プロモーター領域と翻訳領域
間あるいは翻訳領域の３´下流に、必要に応じて連結す
ることも可能である。本発明のポリペプチドの正常な翻
訳領域は、各種哺乳動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネ
コ、モルモット、ハムスター、ラット、マウス、ヒトな
ど）由来の肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来Ｄ
ＮＡおよび市販の各種ゲノムＤＮＡライブラリーよりゲ
ノムＤＮＡの全てあるいは一部として、または肝臓、腎
臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来ＲＮＡより公知の方法
により調製された相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を原料として
取得することが出来る。また、該異常ＤＮＡを用いれ
ば、上記の細胞または組織より得られる該ポリペプチド
の正常な翻訳領域を、公知の点突然変異誘発法などによ
り変異させた翻訳領域を作製することができる。該翻訳
領域は導入哺乳動物において発現しうるＤＮＡコンスト
ラクトとして、前記のプロモーターの下流および所望に
より転写終結部位の上流に連結させる通常のＤＮＡ工学
的手法により作製することができる。受精卵細胞段階に
おける本発明のＤＮＡの導入は、対象哺乳動物の胚芽細
胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。
ＤＮＡ導入後の作出哺乳動物の胚芽細胞において、本発
明のＤＮＡが存在することは、作出哺乳動物の後代がす
べて、その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明のＤ
ＮＡを保持することを意味する。ＤＮＡを受け継いだこ
の種の哺乳動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞のす
べてに本発明のＤＮＡを有する。

【００６３】本発明の外来性正常ＤＮＡを導入した非ヒ
ト哺乳動物は、交配によりＤＮＡを安定に保持すること
を確認して、該ＤＮＡ保有哺乳動物として通常の飼育環
境で継代飼育することが出来る。受精卵細胞段階におけ
る本発明のＤＮＡの導入は、対象哺乳動物の胚芽細胞お
よび体細胞の全てに過剰に存在するように確保される。
ＤＮＡ導入後の作出哺乳動物の胚芽細胞において本発明
のＤＮＡが過剰に存在することは、作出哺乳動物の子孫
が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明のＤＮ
Ａを過剰に有することを意味する。ＤＮＡを受け継いだ
この種の哺乳動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の
全てに本発明のＤＮＡを過剰に有する。導入ＤＮＡを相
同染色体の両方に持つホモザイゴート哺乳動物を取得
し、この雌雄の哺乳動物を交配することによりすべての
子孫が該ＤＮＡを過剰に有するように繁殖継代すること
ができる。本発明の正常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物
は、本発明の正常ＤＮＡが高発現させられており、内在
性の正常ＤＮＡの機能を促進することにより最終的に本
発明のポリペプチドの機能亢進症を発症することがあ
り、その病態モデル哺乳動物として利用することができ
る。例えば、本発明の正常ＤＮＡ導入哺乳動物を用い
て、本発明のポリペプチドの機能亢進症や、本発明のポ
リペプチドが関連する疾患の病態機序の解明およびこれ
らの疾患の治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、本発明の外来性正常ＤＮＡを導入させた哺乳動物
は、遊離した本発明のポリペプチドの増加症状を有する
ことから、本発明のポリペプチドに関連する疾患に対す
る治療薬のスクリーニング試験にも利用可能である。

【００６４】一方、本発明の異常ＤＮＡを有する非ヒト
哺乳動物は、交配によりＤＮＡを安定に保持することを
確認した後、該異常ＤＮＡ保有哺乳動物として通常の飼
育環境で継代飼育することが出来る。さらに、目的ＤＮ
Ａを前述のプラスミドに組み込んで原科として用いるこ
とができる。プロモーターとのＤＮＡコンストラク卜
は、通常のＤＮＡ工学的手法によって作製することがで
きる。受精卵細胞段階における本発明の異常ＤＮＡの導
入は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに存
在するように確保される。ＤＮＡ導入後の作出哺乳動物
の胚芽細胞において本発明の異常ＤＮＡが存在すること
は、作出哺乳動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細
胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有することを意味す
る。ＤＮＡを受け継いだこの種の哺乳動物の子孫は、そ
の胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを
有する。導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイ
ゴート哺乳動物を取得し、この雌雄の哺乳動物を交配す
ることによりすべての子孫が該ＤＮＡを有するように繁
殖継代することができる。本発明の異常ＤＮＡを有する
非ヒト哺乳動物は、本発明の異常ＤＮＡが高発現させら
れており、内在性の正常ＤＮＡの機能を阻害することに
より最終的に本発明のポリペプチドの機能不活性型不応
症となることがあり、その病態モデル哺乳動物として利
用することができる。例えば、本発明の異常ＤＮＡ導入
哺乳動物を用いて、本発明のポリペプチドの機能不活性
型不応症の病態機序の解明およびこの疾患を治療方法の
検討を行なうことが可能である。また、具体的な利用可
能性としては、本発明の異常ＤＮＡ高発現哺乳動物は、
本発明のポリペプチドの機能不活性型不応症における本
発明の異常ポリペプチドによる正常ポリペプチドの機能
阻害（dominant negative 作用）を解明するモデルとな
る。また、本発明の外来異常ＤＮＡを導入させた哺乳動
物は、遊離した本発明のポリペプチドの増加症状を有す
ることから、本発明のポリペプチドの機能不活性型不応
症に対する治療薬スクリーニング試験にも利用可能であ
る。

【００６５】また、上記２種類の本発明のＤＮＡ導入哺
乳動物のその他の利用可能性として、例えば、 組織培養のための細胞源としての使用、 本発明のＤＮＡ導入哺乳動物の組織中のＤＮＡもしく
はＲＮＡを直接分析するか、またはＤＮＡにより発現さ
れたタンパク質組織を分析することによる、本発明のポ
リペプチドにより特異的に発現あるいは活性化するタン
パク質との関連性についての解析、 ＤＮＡを有する組織の細胞を標準組織培養技術により
培養し、これらを使用して、一般に培養困難な組織から
の細胞の機能の研究、 上記記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高
めるような薬剤のスクリーニング、および 本発明の変異ポリペプチドを単離精製およびその抗体
作製などが考えられる。さらに、本発明のＤＮＡ導入哺
乳動物を用いて、本発明のポリペプチドの機能不活性型
不応症を含む、本発明のポリペプチドに関連する疾患の
臨床症状を調べることができ、また、本発明のポリペプ
チドに関連する疾患モデルの各臓器におけるより詳細な
病理学的所見が得られ、新しい治療方法の開発、さらに
は、該疾患による二次的疾患の研究および治療に貢献す
ることができる。また、本発明のＤＮＡ導入哺乳動物か
ら各臓器を取り出し、細切後、トリプシンなどのタンパ
ク質分解酵素により、遊離したＤＮＡ導入細胞の取得、
その培養またはその培養細胞の系統化を行なうことが可
能である。さらに、本発明のポリペプチド産生細胞の特
定化、アポトーシス、分化あるいは増殖との関連性、ま
たはそれらにおけるシグナル伝達機構を調べ、それらの
異常を調べることなどができ、本発明のポリペプチドお
よびその作用解明のための有効な研究材料となる。さら
に、本発明のＤＮＡ導入哺乳動物を用いて、本発明のポ
リペプチドの機能不活性型不応症を含む、本発明のポリ
ペプチドに関連する疾患の治療薬の開発を行なうため
に、上述の検査法および定量法などを用いて、有効で迅
速な該疾患治療薬のスクリーニング法を提供することが
可能となる。また、本発明のＤＮＡ導入哺乳動物または
本発明の該ＤＮＡ発現ベクターを用いて、本発明のポリ
ペプチドが関連する疾患のＤＮＡ治療法を検討、開発す
ることが可能である。

【００６６】（６）ノックアウト哺乳動物の作製 さらに、本発明は、本発明のリガンドポリペプチドをコ
ードするＤＮＡが不活性化された非ヒト動物（好ましく
は哺乳動物）細胞（好ましくは胚幹細胞）および本発明
ＤＮＡの発現不全非ヒト動物（好ましくは哺乳動物）
（いわゆるノックアウト動物（好ましくは哺乳動物））
を提供する。即ち、本発明は、（ａ）不活性化された本
発明のリガンドポリペプチドをコードするＤＮＡを保持
する非ヒト動物（好ましくは哺乳動物）細胞（好ましく
は胚幹細胞）、（ｂ）大腸菌由来のβ−ガラクトシダー
ゼ遺伝子を有する細胞である上記（ａ）記載の細胞（好
ましくは胚幹細胞）、（ｃ）ネオマイシン耐性である上
記（ａ）記載の細胞（好ましくは胚幹細胞）、（ｄ）非
ヒト動物（好ましくは哺乳動物）がゲッ歯動物である上
記（ａ）記載の細胞（好ましくは胚幹細胞）、（ｅ）ゲ
ッ歯動物がマウスである上記（ｄ）記載の胚幹細胞、
（ｆ）本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト動物（好ましくは
哺乳動物）、（ｇ）レポーター遺伝子が本発明のポリペ
プチドのプロモーターの制御下で発現しうる上記（ｆ）
記載の動物（好ましくは哺乳動物）、（ｈ）レポーター
遺伝子が大腸菌由来β−ガラクトシダーゼ遺伝子である
上記（ｇ）記載の動物（好ましくは哺乳動物）、（ｉ）
非ヒト動物（好ましくは哺乳動物）がゲッ歯哺乳動物で
ある上記（ｆ）記載の動物、（ｊ）ゲッ歯哺乳動物がマ
ウスである上記（ｉ）記載の動物、（ｋ）上記（ｇ）記
載の哺乳動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝
子の発現を検出することを特徴とする本発明のポリペプ
チドのプロモーター活性を促進する化合物またはその塩
のスクリーニング方法、（ｌ）不活性化された本発明の
リガンドポリペプチドをコードするＤＮＡを導入するこ
とを特徴とする上記（ａ）記載の非ヒト動物（好ましく
は哺乳動物）細胞（好ましくは胚幹細胞）および（ｍ）
不活性化された本発明のリガンドポリペプチドをコード
するＤＮＡを導入することを特徴とする上記（ｋ）記載
の非ヒト動物（好ましくは哺乳動物）細胞（好ましくは
胚幹細胞）の製造法を提供する。

【００６７】本発明の該リガンドポリペプチドをコード
するＤＮＡが不活性化された非ヒト動物（好ましくは哺
乳動物）細胞（好ましくは胚幹細胞）とは、該非ヒト哺
乳動物が有する本発明の該ＤＮＡに人為的に変異を加え
ることにより、ＤＮＡの発現能を抑制するか、もしくは
該ＤＮＡがコードしている本発明のポリペプチドの活性
を実質的に喪失させることにより、該ＤＮＡが本発明の
ポリペプチドの発現能を実質的に有さない（以下、本発
明のノックアウトＤＮＡと称することがある）非ヒト動
物（好ましくは哺乳動物）の細胞［好ましくは胚幹細胞
（以下、ＥＳ細胞と略記する）］を意味する。非ヒト哺
乳動物としては、前記と同様のものが挙げられる。本発
明のＤＮＡに人為的に変異を加えるには、例えば、公知
の遺伝子工学的手法により該ＤＮＡ塩基配列の一部また
は全部の削除、他ＤＮＡの挿入または置換を行えばよ
い。これらの変異により、例えば、該リガンドポリペプ
チドをコードするＤＮＡにおけるコドンの読み取り枠を
ずらしたり、プロモーターあるいはエキソンの機能を破
壊することにより本発明のノックアウトＤＮＡを作製で
きる。本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト動物（好
ましくは哺乳動物）細胞（好ましくは胚幹細胞）（以
下、本発明の非ヒト哺乳動物胚幹細胞を本発明のＤＮＡ
不活性化ＥＳ細胞または本発明のノックアウトＥＳ細胞
と略記する）は、具体的には例えば、（１）対象とする
非ヒト動物（好ましくは哺乳動物）が有する本発明のＤ
ＮＡを単離し、そのエキソン部分にネオマイシン耐性遺
伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子を代表とする薬剤耐
性遺伝子、あるいはｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ遺
伝子）、ｃａｔ（クロラムフェニコールアセチルトラン
スフェラーゼ遺伝子）を代表とする公知のレポーター遺
伝子等を挿入することによりエキソンの機能を破壊する
か、あるいは（２）エキソン間のイントロン部分に遺伝
子の転写を終結させるＤＮＡ配列（例えば、polyＡ付加
シグナルなど）を挿入し、完全なメッセンジャーＲＮＡ
を合成できなくすることによって、結果的に本発明の該
リガンドポリペプチドをコードするＤＮＡ（遺伝子）を
破壊するように構築したＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ鎖
（以下、ターゲッティングベクターと略記する）を、例
えば公知の相同組換え法により該動物（好ましくは哺乳
動物）の染色体に導入し、得られたＥＳ細胞について本
発明のＤＮＡ上あるいはその近傍のＤＮＡ配列をプロー
ブとしたサザンハイブリダイゼーション解析あるいはタ
ーゲッティングベクター上のＤＮＡ配列とターゲッティ
ングベクター作製に使用した本発明のＤＮＡ以外の近傍
領域のＤＮＡ配列をプライマーとしたＰＣＲ法により解
析し、選別することにより得ることができる。

【００６８】また、相同組換え法等により本発明のＤＮ
Ａを不活化させる元のＥＳ細胞としては、例えば、前述
の既に樹立された公知のＥＳ細胞を用いてもよく、また
公知の方法〔Robertson, E. T., Teratocarcinomas and
Embryonic Stem Cells: A Practical Approach (ed.
E.J. Robertson), IBL Press, Oxford. など〕に準じて
新しく樹立した細胞でもよい。例えば、マウスのＥＳ細
胞の場合、現在、一般的には１２９系のＥＳ細胞が使用
されているが、免疫学的背景がはっきりしていないの
で、これに代わる純系で免疫学的に遺伝的背景が明らか
なＥＳ細胞を取得するなどの目的で例えば、Ｃ５７ＢＬ
／６マウスやＣ５７ＢＬ／６の採卵数の少なさをＤＢＡ
／２との交雑により改善したＢＤＦ１マウス（Ｃ５７Ｂ
Ｌ／６とＤＢＡ／２とのＦ₁）を用いて樹立した細胞な
ども好ましく用いられる。ＢＤＦ₁マウスは、採卵数が
多く、かつ、卵が丈夫であるという利点に加えて、Ｃ５
７ＢＬ／６マウスを背景に持つので、これを用いて得ら
れるＥＳ細胞は病態モデルマウスを作出したとき、Ｃ５
７ＢＬ／６マウスとバッククロスすることでその遺伝的
背景をＣ５７ＢＬ／６マウスに代えることが可能である
点で有利に用いられる。また、ＥＳ細胞を樹立する場
合、一般には受精後３.５日目の胚盤胞を使用するが、
これ以外に８細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用い
ることにより効率よく多数の初期胚を取得することがで
きる。また、雌雄いずれのＥＳ細胞を用いてもよいが、
通常、雄のＥＳ細胞の方が生殖系列キメラを作出するの
に好ましい。また、煩雑な培養の手間を削減するために
もできるだけ早く雌雄の判別を行なうことが望ましい。
ＥＳ細胞の雌雄の判定方法としては、例えば、公知のＰ
ＣＲ法によりＹ染色体上の性決定領域の遺伝子を増幅、
検出する方法が、その１例として挙げることができる。
この方法を使用すれば、従来、核型分析をするのに約１
０⁶個の細胞数を要していたのに対して、１コロニー程
度のＥＳ細胞数（約５０個）で済むので、培養初期にお
けるＥＳ細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行な
うことが可能であり、早期に雄細胞の選定を可能にする
ことにより培養初期の手間は大幅に削減できる。

【００６９】また、第二次セレクションとしては、例え
ば、公知のＧ−バンディング法による染色体数の確認等
により行うことができる。得られるＥＳ細胞の染色体数
は正常数の１００％が望ましいが、樹立の際の物理的操
作等の関係上困難な場合は、ＥＳ細胞の遺伝子をノック
アウトした後、正常細胞（例えば、マウスでは染色体数
が２ｎ＝４０である細胞）に再びクローニングすること
が好ましい。このようにして得られる胚幹細胞株は、通
常その増殖性は大変良いが、個体発生できる能力を失い
やすいので、注意深く継代培養することが必要である。
例えば、ＳＴＯ繊維芽細胞のような適当なフィーダー細
胞上でＬＩＦ（１−１００００U/ml）存在下に炭酸ガス
培養器内（好ましくは、５％炭酸ガス、９５％空気また
は５％酸素、５％炭酸ガス、９０％空気）で約３７℃で
培養するなどの方法で培養し、継代時には、例えば、ト
リプシン／ＥＤＴＡ溶液（通常０.００１−０.５％トリ
プシン／０.１−５ｍＭ ＥＤＴＡ、好ましくは約０.１
％トリプシン／１ｍＭ ＥＤＴＡ）処理により単細胞化
し、新たに用意したフィーダー細胞上に播種する方法な
どがとられる。このような継代は、通常１−３日毎に行
なうが、この際に細胞の観察を行い、形態的に異常な細
胞が見受けられた場合はその培養細胞は放棄することが
望まれる。ＥＳ細胞は、適当な条件により、高密度に至
るまで単層培養するか、または細胞集塊を形成するまで
浮遊培養することにより、頭頂筋、内臓筋、心筋などの
種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり〔M.
J. Evans及びM. H. Kaufman, ネイチャー（Nature）第
292巻、154頁、1981年；G. R. Martin プロシーディン
グス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエン
ス・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.）
第78巻、7634頁、1981年；T. C. Doetschmanら、ジャー
ナル・オブ・エンブリオロジー・アンド・エクスペリメ
ンタル・モルフォロジー、第87巻、27頁、1985年〕、本
発明のＥＳ細胞を分化させて得られる本発明のＤＮＡ発
現不全細胞は、インビトロにおける本発明のポリペプチ
ドの細胞生物学的検討において有用である。本発明のＤ
ＮＡ発現不全非ヒト動物（好ましくは哺乳動物）は、該
哺乳動物のｍＲＮＡ量を公知方法を用いて測定して間接
的にその発現量を比較することにより、正常哺乳動物と
区別することが可能である。該非ヒト哺乳動物として
は、前記と同様のものが用いられる。

【００７０】本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト動物（好ま
しくは哺乳動物）は、例えば、前述のようにして作製し
たターゲッティングベクターをマウス胚幹細胞またはマ
ウス卵細胞に導入し、導入によりターゲッティングベク
ターの本発明のＤＮＡが不活性化されたＤＮＡ配列が遺
伝子相同組換えにより、マウス胚幹細胞またはマウス卵
細胞の染色体上の本発明のＤＮＡと入れ換わる相同組換
えをさせることにより、本発明のＤＮＡをノックアウト
（機能欠損）させることができる。本発明のＤＮＡがノ
ックアウトされた細胞は、本発明のＤＮＡ上またはその
近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイ
ゼーション解析またはターゲッティングベクター上のＤ
ＮＡ配列と、ターゲッティングベクターに使用したマウ
ス由来の本発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列と
をプライマーとしたＰＣＲ法による解析で判定すること
ができる。非ヒト哺乳動物胚幹細胞を用いた場合は、遺
伝子相同組換えにより、本発明のＤＮＡが不活性化され
た細胞株をクローニングし、その細胞を適当な時期、例
えば、８細胞期の非ヒト哺乳動物胚または胚盤胞に注入
し、作製したキメラ胚を偽妊娠させた該非ヒト哺乳動物
の子宮に移植する。作出された哺乳動物は正常な本発明
のＤＮＡ座をもつ細胞と人為的に変異した本発明のＤＮ
Ａ座をもつ細胞との両者から構成されるキメラ哺乳動物
である。該キメラ哺乳動物の生殖細胞の一部が変異した
本発明のＤＮＡ座をもつ場合、このようなキメラ個体と
正常個体を交配することにより得られた個体群より、全
ての組織が人為的に変異を加えた本発明のＤＮＡ座をも
つ細胞で構成された個体を、例えば、コートカラーの判
定等により選別することにより得られる。このようにし
て得られた個体は、通常、本発明のポリペプチドのヘテ
ロ発現不全個体であり、本発明のポリペプチドのヘテロ
発現不全個体同志を交配し、それらの産仔から本発明の
ポリペプチドのホモ発現不全個体を得ることができる。
卵細胞を使用する場合は、例えば公知のマイクロインジ
ェクション法で、卵細胞核内にＤＮＡ溶液を注入するこ
とによりターゲッティングベクターを染色体内に導入し
たトランスジェニック非ヒト哺乳動物を得ることがで
き、遺伝子相同組換えにより本発明のＤＮＡ座に変異の
あるものを選択できる。

【００７１】このようにして本発明のＤＮＡがノックア
ウトされている個体は、交配により得られた哺乳動物個
体も該ＤＮＡがノックアウトされていることを確認した
後、通常の飼育環境で継代飼育を行なうことができる。
さらに、生殖系列の取得および保持についても常法に従
えばよい。即ち、該不活化ＤＮＡの保有する雌雄の哺乳
動物を交配することにより、該不活化ＤＮＡを相同染色
体の両方に持つホモザイゴート哺乳動物を取得しうる。
得られたホモザイゴート哺乳動物は、母親哺乳動物に対
して、正常個体１，ホモザイゴート複数になるような状
態で飼育することにより効率的に得ることができる。ヘ
テロザイゴート哺乳動物の雌雄を交配することにより、
該不活化ＤＮＡを有するホモザイゴートおよびヘテロザ
イゴート哺乳動物を繁殖継代する。本発明のＤＮＡが不
活性化された非ヒト動物（好ましくは哺乳動物）細胞
（好ましくは胚幹細胞）は、本発明のＤＮＡ発現不全非
ヒト動物（好ましくは哺乳動物）を作出する上で、非常
に有用である。また、本発明のポリペプチド発現不全マ
ウスは、本発明のポリペプチドにより誘導され得る種々
の生物活性を欠失するため、本発明のポリペプチドの生
物活性の不活性化を原因とする疾病のモデルとなり得る
ので、これらの疾病の原因究明及び治療法の検討に有用
である。

【００７２】また、本発明のポリペプチドの構造遺伝子
をレポーター遺伝子で置換された本発明のポリペプチド
発現動物（好ましくは哺乳動物）では、レポーター遺伝
子が本発明のポリペプチドのプロモーターの支配下に存
在するので、レポーター遺伝子がコードする物質の発現
をトレースすることにより、本発明のポリペプチドのプ
ロモーターの活性を検出することができる。例えば、本
発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ領域の一部を大
腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）で
置換している場合、本来、本発明のポリペプチドの発現
する組織で、本発明のポリペプチドの代わりにβ−ガラ
クトシダーゼが発現する。従って、例えば、５−ブロモ
−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシ
ド（Ｘ−ｇａｌ）のようなβ−ガラクトシダーゼの基質
となる試薬を用いて染色することにより、簡便に本発明
のポリペプチドの哺乳動物生体内における発現状態を観
察することができる。具体的には、本発明のポリペプチ
ド欠損マウスまたはその組織切片をグルタルアルデヒド
などで固定し、ダルベッコ・リン酸緩衝生理食塩液（Ｐ
ＢＳ）で洗浄後、Ｘ−ｇａｌを含む染色液で、室温また
は７℃付近で、約３０分ないし１時間反応させた後、組
織標本を１ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳ溶液で洗浄すること
によって、β−ガラクトシダーゼ反応を停止させ、呈色
を観察すればよい。また、常法に従い、ｌａｃＺをコー
ドするｍＲＮＡを検出してもよい。このような本発明の
ポリペプチド発現不全哺乳動物は、本発明のポリペプチ
ドのプロモーターを活性化または不活化する物質をスク
リーニングする上で極めて有用であり、本発明のポリペ
プチド発現不全に起因する各種疾患の原因究明または治
療薬の開発に大きく貢献することができる。

【００７３】本願明細書の配列表の配列番号は、以下の
配列を示す。 〔配列番号：１〕プラスミドｐｍＧＢ３に含まれるマウ
ス由来リガンドポリペプチドの全長アミノ酸配列を示
す。 〔配列番号：２〕マウス由来リガンドポリペプチドのｃ
ＤＮＡの全塩基配列を示す。 〔配列番号：３〕マウス由来リガンドポリペプチドのゲ
ノムＤＮＡの塩基配列を示す。 〔配列番号：４〕プラスミドｐｍＧＢ３に含まれるマウ
ス由来リガンドポリペプチドの成熟体の全長アミノ酸配
列を示す。 〔配列番号：５〕本発明の抗リガンドポリペプチド抗体
の調製のために用いることができる抗原のアミノ酸配列
を示す。 〔配列番号：６〕本発明の抗リガンドポリペプチド抗体
の調製のために用いることができる抗原のアミノ酸配列
を示す。 〔配列番号：７〕本発明の抗リガンドポリペプチド抗体
の調製のために用いることができる抗原のアミノ酸配列
を示す。 〔配列番号：８〕本発明の抗リガンドポリペプチド抗体
の調製のために用いることができる抗原のアミノ酸配列
を示す。 〔配列番号：９〕本発明の抗リガンドポリペプチド抗体
の調製のために用いることができる抗原のアミノ酸配列
を示す。 〔配列番号：１０〕ｐ１９Ｐ２に含まれるヒト下垂体由
来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質ｃＤＮＡ断片にコー
ドされるヒト下垂体由来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白
質の部分アミノ酸配列を示す。 〔配列番号：１１〕ｐ１９Ｐ２に含まれるヒト下垂体由
来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質ｃＤＮＡ断片にコー
ドされるヒト下垂体由来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白
質の部分アミノ酸配列を示す。 〔配列番号：１２〕ｐｈＧＲ３に含まれるヒト下垂体由
来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質ｃＤＮＡにコードさ
れるヒト下垂体由来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の
全アミノ酸配列を示す。 〔配列番号：１３〕ｐＧ３−２およびｐＧ１−１０にそ
れぞれ含まれるマウス膵臓β細胞株ＭＩＮ６由来Ｇ蛋白
質共役型レセプター蛋白質ｃＤＮＡ断片の塩基配列から
導きだした塩基配列（配列番号：１８）を有するマウス
膵臓β細胞株ＭＩＮ６由来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋
白質ｃＤＮＡ断片にコードされるマウス膵臓β細胞株Ｍ
ＩＮ６由来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の部分アミ
ノ酸配列を示す。 〔配列番号：１４〕ｐ５Ｓ３８にコードされるマウス膵
臓β細胞株ＭＩＮ６由来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白
質の部分アミノ酸配列を示す。 〔配列番号：１５〕ｐ１９Ｐ２に含まれるヒト下垂体由
来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質ｃＤＮＡ断片の塩基
配列を示す。 〔配列番号：１６〕ｐ１９Ｐ２に含まれるヒト下垂体由
来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質ｃＤＮＡ断片の塩基
配列を示す。 〔配列番号：１７〕ｐｈＧＲ３に含まれるヒト下垂体由
来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質ｃＤＮＡの全塩基配
列を示す。 〔配列番号：１８〕ｐＧ３−２およびｐＧ１−１０にそ
れぞれ含まれるマウス膵臓β細胞株ＭＩＮ６由来Ｇ蛋白
質共役型レセプター蛋白質ｃＤＮＡ断片の塩基配列をも
とに導き出したマウス膵臓β細胞株ＭＩＮ６由来Ｇ蛋白
質共役型レセプター蛋白質ｃＤＮＡ断片の塩基配列を示
す。 〔配列番号：１９〕ｐ５Ｓ３８に含まれるマウス膵臓β
細胞株ＭＩＮ６由来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質ｃ
ＤＮＡ断片の塩基配列を示す。 〔配列番号：２０〕Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を
コードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成Ｄ
ＮＡ 〔配列番号：２１〕Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を
コードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成Ｄ
ＮＡ 〔配列番号：２２〕Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を
コードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成Ｄ
ＮＡ 〔配列番号：２３〕Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を
コードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成Ｄ
ＮＡ 〔配列番号：２４〕Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を
コードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成Ｄ
ＮＡ 〔配列番号：２５〕Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を
コードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成Ｄ
ＮＡ 〔配列番号：２６〕ウシ視床下部由来リガンドポリペプ
チドを精製し、P-3画分のＮ末端配列分析をした結果得
られたアミノ酸配列を示す。配列番号：１の第２３〜５
１番目のアミノ酸配列に対応している。 〔配列番号：２７〕ウシ視床下部由来リガンドポリペプ
チドを精製、P-2画分のＮ末端配列分析をした結果得ら
れたアミノ酸配列を示す。配列番号：１の第３４〜５２
番目のアミノ酸配列に対応している。 〔配列番号：２８〕ｐＢＯＶ３に含まれるウシ視床下部
由来リガンドポリペプチドの全長アミノ酸配列を示す。 〔配列番号：２９〕本発明のウシ視床下部由来リガンド
ポリペプチドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに
使用した合成ＤＮＡ（Ｐ５−１） 〔配列番号：３０〕本発明のウシ視床下部由来ポリガン
ドリペプチドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに
使用した合成ＤＮＡ（Ｐ３−１） 〔配列番号：３１〕本発明のウシ視床下部由来リガンド
ポリペプチドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに
使用した合成ＤＮＡ（Ｐ３−２） 〔配列番号：３２〕本発明のウシ視床下部由来リガンド
ポリペプチドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに
使用した合成ＤＮＡ（ＰＥ） 〔配列番号：３３〕本発明のウシ視床下部由来リガンド
ポリペプチドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに
使用した合成ＤＮＡ（ＰＤＮ） 〔配列番号：３４〕本発明のウシ視床下部由来リガンド
ポリペプチドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに
使用した合成ＤＮＡ（ＦＢ） 〔配列番号：３５〕本発明のウシ視床下部由来リガンド
ポリペプチドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに
使用した合成ＤＮＡ（ＦＣ） 〔配列番号：３６〕本発明のウシ視床下部由来リガンド
ポリペプチドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに
使用した合成ＤＮＡ（ＢＯＶＦ） 〔配列番号：３７〕本発明のウシ視床下部由来リガンド
ポリペプチドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに
使用した合成ＤＮＡ（ＢＯＶＲ） 〔配列番号：３８〕ウシゲノム由来リガンドポリペプチ
ドの全長アミノ酸配列を示す。 〔配列番号：３９〕ウシ視床下部由来リガンドポリペプ
チドのアミノ酸配列を示す。配列番号：１の第２３〜５
３番目のアミノ酸配列に対応している。 〔配列番号：４０〕ウシ視床下部由来リガンドポリペプ
チドのアミノ酸配列を示す。配列番号：１の第２３〜５
４番目のアミノ酸配列に対応している。 〔配列番号：４１〕ウシ視床下部由来リガンドポリペプ
チドのアミノ酸配列を示す。配列番号：１の第２３〜５
５番目のアミノ酸配列に対応している。 〔配列番号：４２〕ウシ視床下部由来リガンドポリペプ
チドのアミノ酸配列を示す。配列番号：１の第３４〜５
３番目のアミノ酸配列に対応している。 〔配列番号：４３〕ウシ視床下部由来リガンドポリペプ
チドのアミノ酸配列を示す。配列番号：１の第３４〜５
４番目のアミノ酸配列に対応している。 〔配列番号：４４〕ウシ視床下部由来リガンドポリペプ
チドのアミノ酸配列を示す。配列番号：１の第３４〜５
５番目のアミノ酸配列に対応している。 〔配列番号：４５〕本発明のラット型リガンドポリペプ
チドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した
合成ＤＮＡ（ＲＡ） 〔配列番号：４６〕本発明のラット型リガンドポリペプ
チドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した
合成ＤＮＡ（ＲＣ） 〔配列番号：４７〕本発明のラット型リガンドポリペプ
チドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した
合成ＤＮＡ（ｒＦ） 〔配列番号：４８〕本発明のラット型リガンドポリペプ
チドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した
合成ＤＮＡ（ｒＲ） 〔配列番号：４９〕本発明のヒト型リガンドポリペプチ
ドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合
成ＤＮＡ（Ｒ１） 〔配列番号：５０〕本発明のヒト型リガンドポリペプチ
ドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合
成ＤＮＡ（Ｒ３） 〔配列番号：５１〕本発明のヒト型リガンドポリペプチ
ドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合
成ＤＮＡ（Ｒ４） 〔配列番号：５２〕本発明のヒト型リガンドポリペプチ
ドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合
成ＤＮＡ（ＨＡ） 〔配列番号：５３〕本発明のヒト型リガンドポリペプチ
ドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合
成ＤＮＡ（ＨＢ） 〔配列番号：５４〕本発明のヒト型リガンドポリペプチ
ドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合
成ＤＮＡ（ＨＥ） 〔配列番号：５５〕本発明のヒト型リガンドポリペプチ
ドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合
成ＤＮＡ（ＨＦ） 〔配列番号：５６〕本発明のヒト型リガンドポリペプチ
ドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合
成ＤＮＡ（５Ｈ） 〔配列番号：５７〕本発明のヒト型リガンドポリペプチ
ドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合
成ＤＮＡ（３ＨＮ） 〔配列番号：５８〕ウシ視床下部由来リガンドポリペプ
チドｃＤＮＡの全塩基配列を示す。 〔配列番号：５９〕ラット型リガンドポリペプチドｃＤ
ＮＡの全塩基配列を示す。 〔配列番号：６０〕ヒト型リガンドポリペプチドｃＤＮ
Ａの全塩基配列を示す。 〔配列番号：６１〕本発明のマウス型リガンドポリペプ
チドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した
合成ＤＮＡ（ｒＦＢＧ）を示す。 〔配列番号：６２〕本発明のマウス型リガンドポリペプ
チドをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した
合成ＤＮＡ（ｒＲＳＡ）を示す。

【００７４】後述の実施例２で得られた形質転換体エシ
ェリヒア コリ（Escherichia coli) ＩＮＶαＦ’／ｐ
１９Ｐ２および実施例４で得られた形質転換体エシェリ
ヒアコリ（Escherichia coli)ＩＮＶαＦ’／ｐＧ３−
２は、それぞれ平成６年８月９日から通商産業省工業技
術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）にそれぞれ寄
託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４７７６およびＦＥＲＭ ＢＰ
−４７７５として寄託されており、また平成６年８月２
２日から財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）にそれぞれＩＦ
Ｏ １５７３９およびＩＦＯ １５７４０として寄託さ
れている。後述の実施例５で得られた形質転換体エシェ
リヒア コリ（Escherichia coli) ＪＭ１０９／ｐｈＧ
Ｒ３は、平成６年９月２７日から通商産業省工業技術院
生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）に寄託番号ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−４８０７として寄託されており、また平成６
年９月２２日から財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）にＩＦ
Ｏ １５７４８として寄託されている。後述の実施例８
で得られた形質転換体エシェリヒア コリ（Escherichi
a coli) ＪＭ１０９／ｐ５Ｓ３８は、平成６年１０月２
７日から通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所
（ＮＩＢＨ）に寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４８５６とし
て寄託されており、また平成６年１０月２５日から財団
法人発酵研究所（ＩＦＯ）にＩＦＯ １５７５４として
寄託されている。後述の実施例２０で得られた形質転換
体エシェリヒア コリ（Escherichia coli) ＪＭ１０９
／ｐＢＯＶ３は、平成８年２月１３日から通商産業省工
業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）に寄託番
号ＦＥＲＭ ＢＰ−５３９１として寄託されており、ま
た平成８年１月２５日から財団法人発酵研究所（ＩＦ
Ｏ）にＩＦＯ １５９１０として寄託されている。後述
の実施例２９で得られた形質転換体エシェリヒア コリ
（Escherichia coli) ＪＭ１０９／ｐＲＡＶ３は、平成
８年９月１２日から通商産業省工業技術院生命工学工業
技術研究所（ＮＩＢＨ）に寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５
６６５として寄託されており、また平成８年９月３日か
ら財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）にＩＦＯ １６０１２
として寄託されている。後述の実施例３２で得られた形
質転換体エシェリヒア コリ（Escherichia coli) ＪＭ
１０９／ｐＨＯＶ７は、平成８年９月１２日から通商産
業省工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）に
寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５６６６として寄託されてお
り、また平成８年９月５日から財団法人発酵研究所（Ｉ
ＦＯ）にＩＦＯ １６０１３として寄託されている。後
述の実施例３３で得られた形質転換体エシェリヒア コ
リ（Escherichia coli) ＪＭ１０９／ｐｍＧＢ３は、平
成９年３月５日から通商産業省工業技術院生命工学工業
技術研究所（ＮＩＢＨ）に寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５
８５２として寄託されており、また平成９年２月１９日
から財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）にＩＦＯ １６０５
９として寄託されている。後述の実施例３４で得られた
形質転換体エシェリヒア コリ（Escherichia coli) Ｊ
Ｍ１０９／ｐｍＧＦＥ１は、平成１０年３月１８日から
通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢ
Ｈ）に寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６２９８として寄託さ
れている。

【００７５】

【実施例】以下に実施例を示して、本発明をより詳細に
説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものでは
ない。

【００７６】

【参考例１】Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコード
するＤＮＡを増幅させるための合成ＤＮＡプライマーの
製造 公知のヒト由来ＴＲＨレセプター蛋白質（ＨＴＲＨ
Ｒ）、ヒト由来ＲＡＮＴＥＳレセプター蛋白質（Ｌ１０
９１８、ＨＵＭＲＡＮＴＥＳ）、ヒトバーキットリンパ
腫由来リガンド不明レセプター蛋白質（Ｘ６８１４９、
ＨＳＢＬＲ１Ａ）、ヒト由来ソマトスタチンレセプター
蛋白質（Ｌ１４８５６、ＨＵＭＳＯＭＡＴ）、ラット由
来μ−オピオイドレセプター蛋白質（Ｕ０２０８３、Ｒ
ＮＵ０２０８３）、ラット由来κ−オピオイドレセプタ
ー蛋白質（Ｕ００４４２、Ｕ００４４２）、ヒト由来ニ
ューロメジンＢレセプター蛋白質（Ｍ７３４８２、ＨＵ
ＭＮＭＢＲ）、ヒト由来ムスカリン作動性アセチルコリ
ンレセプター蛋白質（Ｘ１５２６６、ＨＳＨＭ４）、ラ
ット由来アドレナリンα₁Ｂレセプター蛋白質（Ｌ０８
６０９、ＲＡＴＡＡＤＲＥ０１）、ヒト由来ソマトスタ
チン３レセプター蛋白質（Ｍ９６７３８、ＨＵＭＳＳＴ
Ｒ３Ｘ）、ヒト由来Ｃ₅ａレセプター蛋白質（ＨＵＭＣ
５ＡＡＲ）、ヒト由来リガンド不明レセプター蛋白質
（ＨＵＭＲＤＣ１Ａ）、ヒト由来リガンド不明レセプタ
ー蛋白質（Ｍ８４６０５、ＨＵＭＯＰＩＯＤＲＥ）およ
びラット由来アドレナリンα₂Ｂ（Ｍ９１４６６、ＲＡ
ＴＡ２ＢＡＲ）の第１膜貫通領域付近のアミノ酸配列を
コードするｃＤＮＡの塩基配列を比較し、類似性の高い
部分を見いだした。

【００７７】また、公知のマウス由来リガンド不明レセ
プター蛋白質（Ｍ８０４８１、ＭＵＳＧＩＲ）、ヒト由
来ボンベジンレセプター蛋白質（Ｌ０８８９３、ＨＵＭ
ＢＯＭＢ３Ｓ）、ヒト由来アデノシンＡ２レセプター蛋
白質（Ｓ４６９５０、Ｓ４６９５０）、マウス由来リガ
ンド不明レセプター蛋白質（Ｄ２１０６１、ＭＵＳＧＰ
ＣＲ）、マウス由来ＴＲＨレセプター蛋白質（Ｓ４３３
８７、Ｓ４３３８７）、ラット由来ニューロメジンＫレ
セプター蛋白質（Ｊ０５１８９、ＲＡＴＮＥＵＲＡ）、
ラット由来アデノシンＡ１レセプター蛋白質（Ｍ６９０
４５、ＲＡＴＡ１ＡＲＡ）、ヒト由来ニューロキニンＡ
レセプター蛋白質（Ｍ５７４１４、ＨＵＭＮＥＫＡ
Ｒ）、ラット由来アデノシンＡ３レセプター蛋白質（Ｍ
９４１５２、ＲＡＴＡＤＥＮＲＥＣ）、ヒト由来ソマト
スタチン１レセプター蛋白質（Ｍ８１８２９、ＨＵＭＳ
ＲＩ１Ａ）、ヒト由来ニューロキニン３レセプター蛋白
質（Ｓ８６３９０、Ｓ８６３７１Ｓ４）、ラット由来リ
ガンド不明レセプター蛋白質（Ｘ６１４９６、ＲＮＣＧ
ＰＣＲ）、ヒト由来ソマトスタチン４レセプター蛋白質
（Ｌ０７０６１、ＨＵＭＳＳＴＲ４Ｚ）およびラット由
来ＧｎＲＨレセプター蛋白質（Ｍ３１６７０、ＲＡＴＧ
ＮＲＨＡ）の第６膜貫通領域付近のアミノ酸配列をコー
ドするｃＤＮＡの塩基配列を比較し、類似性の高い部分
を見いだした。

【００７８】上記の（ ）内の略語はDNASIS Gene/Prot
einシークエンスデータベース（ＣＤ０１９、日立ソフ
トウエアエンジニアリング）を用いて GenBank/EMBL Da
ta Bank を検索した際に示される整理番号であり、それ
ぞれ通常Accession Numberおよびエントリーネームと呼
ばれるものである。ただし、ＨＴＲＨＲは特開平７−３
０４７９７号に記載されている配列である。特に、多く
のレセプター蛋白質をコードするｃＤＮＡで一致する塩
基部分を基準とし、その他の部分においてもなるべく多
くのレセプターｃＤＮＡと配列の一致性を高めるために
混合塩基の導入を計画した。この配列をもとに、共通す
る塩基配列に相補的である配列番号：２０または配列番
号：２１で表わされる塩基配列を有する合成ＤＮＡ２本
を作成した。 〔合成ＤＮＡ〕 ５'−ＣＧＴＧＧ（ＧまたはＣ）Ｃ（ＡまたはＣ）Ｔ（ＧまたはＣ）（Ｇまたは Ｃ）ＴＧＧＧＣＡＡＣ（Ａ、Ｇ、ＣまたはＴ）（ＣまたはＴ）ＣＣＴＧ−３' （配列番号：２０） ５'−ＧＴ（Ａ、Ｇ、ＣまたはＴ）Ｇ（ＡまたはＴ）（ＡまたはＧ）（Ａまたは Ｇ）ＧＧＣＡ（Ａ、Ｇ、ＣまたはＴ）ＣＣＡＧＣＡＧＡ（ＧまたはＴ）ＧＧＣＡ ＡＡ−３' （配列番号：２１） （ ）内は合成時に複数の塩基に混合して合成する。

【００７９】

【実施例１】ヒト下垂体由来ｃＤＮＡを用いたＰＣＲ法
による受容体ｃＤＮＡの増幅 ヒト下垂体由来ｃＤＮＡ（QuickClone、クロンテック
社）を鋳型として用い、参考例１で合成したＤＮＡプラ
イマーを用いてＰＣＲ法による増幅を行った。反応液の
組成は、合成ＤＮＡプライマー（配列：５’プライマー
配列および３’プライマー配列）各１μＭ、鋳型ｃＤＮ
Ａ １ｎｇ、０.２５ｍＭ ｄＮＴＰｓ、Ｔａｑ ＤＮＡ
polymerase １μｌおよび酵素に付属のバッファーで、
総反応溶液量は１００μｌとした。増幅のためのサイク
ルはサーマルサイクラー（パーキン・エルマー社）を用
い、９５℃・１分、５５℃・１分、７２℃・１分のサイ
クルを３０回繰り返した。Ｔａｑ ＤＮＡ polymerase
を添加する前に、残りの反応液を混合し、９５℃・５
分、６５℃・５分の加熱を行った。増幅産物の確認は
１.２％アガロースゲル電気泳動およびエチジウムブロ
マイド染色によって行った。

【００８０】

【実施例２】ＰＣＲ産物のプラスミドベクターへのサブ
クローニングおよび挿入ｃＤＮＡ部分の塩基配列の解読
による新規レセプター蛋白質候補クローンの選択 実施例１で行なったＰＣＲ後の反応産物は０.８％の低
融点アガロースゲルを用いて分離し、バンドの部分をカ
ミソリで切り出した後、熱融解、フェノール抽出、エタ
ノール沈殿を行ってＤＮＡを回収した。ＴＡクローニン
グキット（インビトロゲン社）の処方に従い、回収した
ＤＮＡをプラスミドベクターｐＣＲ^TMII（ＴＭは登録商
標を意味する）へサブクローニングした。これを大腸菌
ＩＮＶαＦ’ competent cell（インビトロゲン社）に
導入して形質転換したのち、ｃＤＮＡ挿入断片を持つク
ローンをアンピシリンおよびＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天
培地中で選択し、白色を呈するクローンのみを滅菌した
つま楊枝を用いて分離し、形質転換体エシェリヒア コ
リ（Escherichia coli) ＩＮＶαＦ’／ｐ１９Ｐ２を得
た。個々のクローンをアンピシリンを含むＬＢ培地で一
晩培養し、自動プラスミド抽出装置（クラボウ社）を用
いてプラスミドＤＮＡを調製した。調製したＤＮＡの一
部を用いてＥｃｏＲＩによる切断を行い、挿入されてい
るｃＤＮＡ断片の大きさを確認した。残りのＤＮＡの一
部をさらにＲＮａｓｅ処理、フェノール・クロロフォル
ム抽出し、エタノール沈殿によって濃縮した。塩基配列
の決定のための反応は DyeDeoxy Terminator Cycle Seq
uencing Kit（ＡＢＩ社）を用いて行い、蛍光式自動シ
ーケンサーを用いて解読し、得られた塩基配列の情報は
ＤＮＡＳＩＳ（日立システムエンジニアリング社）を用
いて行った。下線で示した部分は合成プライマーに相当
する部分である。決定した塩基配列〔配列番号：１５
（図１の塩基配列から下線部分を除いた塩基配列）およ
び配列番号：１６（図２の塩基配列から下線部分を除い
た塩基配列）〕をもとにホモロジー検索を行なった結
果、形質転換体Ｅ. Ｃｏｌｉ ＩＮＶαＦ’／ｐ１９Ｐ
２の保有するプラスミドｐ１９Ｐ２に挿入されたｃＤＮ
Ａ断片が新規Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコード
することが分かった。それをさらに確認するために、Ｄ
ＮＡＳＩＳ（日立システムエンジニアリング社）を用
い、塩基配列をアミノ酸配列に変換した〔配列番号：１
０（図１のアミノ酸配列から下線部分を除いたアミノ酸
配列）および配列番号：１１（図２のアミノ酸配列から
下線部分を除いたアミノ酸配列）〕。疎水性プロット
〔図３および図４〕およびアミノ酸配列に基づくホモロ
ジー検索を行ない、ニューロペプチドＹ受容体等との相
同性を見いだした〔図５〕。

【００８１】

【実施例３】マウス膵臓β細胞株ＭＩＮ６からのpoly
(Ａ)⁺ＲＮＡ画分の調製およびｃＤＮＡの合成 マウス膵β細胞株ＭＩＮ６（Jun-ichi Miyazaki et al.
Endocrinology, Vol.127, No.1, p126-132）よりグア
ニジンイソチオシアネート法により Total ＲＮＡを調
製後（Kaplan B.B. et al., Biochem. J. 183, 181-184
（1979）)、ｍＲＮＡ精製キット（ファルマシア社）を
用いて、 poly(Ａ)⁺ＲＮＡ画分を調製した。次に、poly
(Ａ)⁺ＲＮＡ画分５μｇにプライマーとしてランダムＤ
ＮＡヘキサマー（ＢＲＬ社）を加え、モロニイマウス白
血病ウイルスの逆転写酵素（ＢＲＬ社）により、添付バ
ッファーを用いて相補ＤＮＡを合成した。反応後の産物
はフェノール：クロロホルム（１：１）で抽出し、エタ
ノール沈殿を行った後、３０μｌのＴＥに溶解した。

【００８２】

【実施例４】ＭＩＮ６由来ｃＤＮＡを用いたＰＣＲ法に
よる受容体ｃＤＮＡの増幅と塩基配列の決定 実施例３でマウス膵β細胞株ＭＩＮ６より調製したｃＤ
ＮＡ ５μｌを鋳型として使用し、参考例１で合成した
ＤＮＡプライマーを用いて実施例１と同条件でＰＣＲ法
を行った。得られたＰＣＲ産物は実施例２に記載の方法
と同様にして、プラスミドベクターｐＣＲ^TMIIにサブク
ローニングし、プラスミドｐＧ３−２を得た。このプラ
スミドで大腸菌ＩＮＶαＦ’を形質転換し、形質転換体
エシェリヒア コリ（Escherichia coli)ＩＮＶαＦ’
／ｐＧ３−２を得た。また、マウス膵β細胞株ＭＩＮ６
より調製したｃＤＮＡ ５μｌを鋳型として使用し、Lib
ert, Fら（Science 244:569-572, 1989）に記載されて
いる合成ＤＮＡプライマー、すなわち、 ５'−ＣＴＧＴＧ（ＣまたはＴ）Ｇ（ＣまたはＴ）（ＧまたはＣ）ＡＴ（Ｃまた はＴ）ＧＣＩＩＴ（ＧまたはＴ）ＧＡ（ＣまたはＴ）（ＡまたはＣ）Ｇ（Ｇまた はＣ）ＴＡＣ−３' （配列番号：２２） 〔Ｉはイノシンを示す。〕で表される合成プライマーおよび ５'−Ａ（ＧまたはＴ）Ｇ（ＡまたはＴ）ＡＧ（ＡまたはＴ）ＡＧＧＧＣＡＧＣ ＣＡＧＣＡＧＡＩ（ＧまたはＣ）（ＡまたはＧ）（ＣまたはＴ）ＧＡＡ−３' （配列番号：２３） 〔Ｉをイノシンを示す。〕で表される合成プライマーを
用いて、実施例１と同条件でＰＣＲ法を行った。得られ
たＰＣＲ産物は実施例２に記載の方法と同様にして、プ
ラスミドベクターｐＣＲ^TMIIにサブクローニングし、プ
ラスミドｐＧ１−１０を得た。

【００８３】塩基配列の決定のための反応は DyeDeoxy
Terminator Cycle Sequencing Kit（ＡＢＩ社）を用い
て行い、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読し、得ら
れた塩基配列の情報はＤＮＡＳＩＳ（日立システムエン
ジニアリング社）を用いて行った。ｐＧ３−２およびｐ
Ｇ１−１０の配列をもとにマウス膵β細胞株ＭＩＮ６由
来のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするＤＮ
Ａの塩基配列（配列番号：１８）およびこれにコードさ
れるアミノ酸配列（配列番号：１３）を〔図６〕に示し
た。下線で示した部分は合成プライマーに相当する部分
である。決定した塩基配列〔図６〕をもとにホモロジー
検索を行なった結果、得られたｃＤＮＡ断片が新規Ｇ蛋
白質共役型レセプター蛋白質をコードすることが分かっ
た。それをさらに確認するために、ＤＮＡＳＩＳ（日立
システムエンジニアリング社）を用い、塩基配列をアミ
ノ酸配列に変換した後〔図６〕、疎水性プロットを行な
ったところ、６個の疎水性領域の存在が確認できた〔図
８〕。また、アミノ酸配列を実施例２で得たｐ１９Ｐ２
と比較したところ、〔図７〕に示すとおり高い相同性を
見いだした。その結果、ｐＧ３−２およびｐＧ１−１０
にコードされるマウス膵β細胞株ＭＩＮ６由来Ｇ蛋白質
共役型レセプター蛋白質とヒト下垂体由来ｐ１９Ｐ２に
コードされるＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質は由来す
る動物種は異なるが、同一のリガンドを認識するレセプ
ター蛋白質であることが強く示唆された。

【００８４】

【実施例５】ヒト下垂体由来ｃＤＮＡライブラリーから
のレセプター蛋白質の全コード領域を含むｃＤＮＡのク
ローニング ヒト下垂体由来ｃＤＮＡライブラリーとしては、クロー
ンテック社製のλｇｔ１１ファージベクターを使ったラ
イブラリーを用いた（クローンテック、ＣＬＨＬ１１３
９ｂ）。２×１０⁶ｐｆｕ（プラーク・フォーミング・
ユニット）分のヒト下垂体ｃＤＮＡライブラリーを、硫
酸マグネシウムで処理した大腸菌Ｙ１０９０^-と混ぜ、
３７℃、１５分間インキュベートした後、０.５％アガ
ロース（ファルマシア社）ＬＢを加え、１.５％寒天
（和光純薬社）ＬＢプレート(５０μg/ml Ampicilin含
有）に播いた。プラークのできたプレートにニトロセル
ロースフィルターを置き、フィルター上にプラークを転
写した。このフィルターをアルカリ処理することによっ
て変性させた後、８０℃、３時間の加熱によってＤＮＡ
の固定を行った。このフィルターを、５０％ formamid
e，５×ＳＳＰＥ，５× Denhardt's溶液，０.１％ ＳＤ
Ｓ，１００μg/ml salmon sperm ＤＮＡを含むバッファ
ー中で以下に述べるプローブと４２℃で一晩インキュベ
ートし、ハイブリダイズさせた。プローブとしては、実
施例２で得られたプラスミドｐ１９Ｐ２に挿入されたＤ
ＮＡ断片をＥｃｏＲＩで切断し、回収後、ランダムプラ
イムＤＮＡラベリングキット（アマシャム社）を用いて
〔³²Ｐ〕ｄＣＴＰ（デュポン社）を取り込ませることに
よって標識して用いた。洗浄は、２×ＳＳＣ，０.１％
ＳＤＳで５５℃、１時間行い、その後、−８０℃でオー
トラジオグラフィを行ってハイブリダイズするプラーク
を検出した。

【００８５】このスクリーニングにより、３個の独立し
たプラークにハイブリダイゼーションのシグナルが認め
られた。この３個のクローンからそれぞれＤＮＡを調製
し、ＥｃｏＲＩで消化したものをアガロース電気泳動
後、スクリーニングに用いたものと同じプローブを用い
て、サザンブロットにより解析を行ったところ、各々約
０.７ｋｂ，０.８ｋｂ，２.０ｋｂのところにそれぞれ
ハイブリダイズするバンドを生じ、このうち約２.０ｋ
ｂのバンドを生じるもの（λｈＧＲ３）を選択した。λ
ｈＧＲ３のハイブリダイズするサイズのＥｃｏＲＩ断片
をプラスミドｐＵＣ１８のＥｃｏＲＩサイトにサブクロ
ーニングした後、このプラスミドで大腸菌ＪＭ１０９を
形質転換し、形質転換体 Ｅ.ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐ
ｈＧＲ３を得た。このプラスミドｐｈＧＲ３を、実施例
２で示された塩基配列から予想される制限酵素地図をも
とにして制限酵素地図を作製したところ、実施例２で示
されるレセプター蛋白質をコードするＤＮＡから予想さ
れるレセプター蛋白質の全長をコードするＤＮＡを保持
していることが分かった。

【００８６】

【実施例６】ヒト下垂体由来レセプター蛋白質ｃＤＮＡ
の塩基配列の決定 実施例５で得られたプラスミドｐｈＧＲ３に挿入したＥ
ｃｏＲＩ断片のうち、レセプター蛋白質をコードしてい
ると考えられるＥｃｏＲＩサイトからＮｈｅＩサイトま
での約１３３０ｂｐの塩基配列を決定した。具体的に
は、ＥｃｏＲＩ断片中に存在する制限酵素サイトを利用
して、不必要な部分を除き、または必要な断片をサブク
ローニングし、配列解析のための鋳型プラスミドを調製
した。塩基配列決定のための反応は Dye Deoxy Termina
tor Cycle Sequencing Kit（ＡＢＩ社）を用いて行い、
蛍光式ＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩ社）を用いて解読
し、データー解析にはＤＮＡＳＩＳ（日立ソフトウェア
エンジニアリング社）を使用した。ｐｈＧＲ３のコード
するＥｃｏＲＩサイト直後からＮｈｅＩサイトまでの塩
基配列を〔図９〕に示した。そして、ヒト下垂体由来レ
セプタータンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列は、
〔図９〕の塩基配列の第１１８番目〜第１２２７番目の
塩基配列（配列番号：１７）に対応する。そして、これ
にコードされるレセプター蛋白質のアミノ酸配列は配列
番号：１２で表わされるアミノ酸配列であることが分か
った。

【００８７】

【実施例７】ヒト下垂体由来レセプター蛋白質をコード
するｐｈＧＲ３を用いたノーザンハイブリダイゼーショ
ン 実施例５で得られたプラスミドｐｈＧＲ３にコードされ
るヒト下垂体由来レセプター蛋白質の下垂体での発現を
ｍＲＮＡレベルで検出するため、ノーザンブロットを行
った。ｍＲＮＡとしてはヒト下垂体ｍＲＮＡ（クローン
テック社）２.５μｇを用い、プローブは実施例５で用
いたものと同じものを用いた。また、ノーザンブロット
用のフィルターは、Nylon membrane（Pall Biodyne, U.
S.A.）を用い、ｍＲＮＡの泳動フィルターへの吸い上げ
は Molecular cloning, Cold Spring Harbor Laborator
y Press （1989）の方法に従って作製した。ハイブリダ
イゼーションは、上に述べたフィルターとプローブを５
０％ formamide，５×ＳＳＰＥ，５×Denhardt's溶液，
０.１％ ＳＤＳ，１００μg/ml salmon sperm ＤＮＡを
含むバッファー中で、４２℃一晩インキュベートした。
フィルターの洗浄は０.１×ＳＳＣ，０.１％ＳＤＳで５
０℃にて行い、風乾後３日間−８０℃でＸ線フィルム
（ＸＡＲ５，コダック）に感光させた。その結果を〔図
１０〕に示した。〔図１０〕から、ｐｈＧＲ３がコード
するレセプター遺伝子はヒト下垂体で発現していると考
えられる。

【００８８】

【実施例８】ＭＩＮ６由来ｃＤＮＡを用いたＰＣＲ法に
よる受容体ｃＤＮＡの増幅と塩基配列の決定 実施例３でマウス膵β細胞株ＭＩＮ６より調製したｃＤ
ＮＡ ５μｌを鋳型として使用し、実施例４で合成したL
ibert, F.ら（Science 244:569-572, 1989）に記載され
ている合成ＤＮＡプライマー、すなわち、 ５'−ＣＴＧＴＧ（ＣまたはＴ）Ｇ（ＣまたはＴ）（ＧまたはＣ）ＡＴ（Ｃまた はＴ）ＧＣＩＩＴ（ＧまたはＴ）ＧＡ（ＣまたはＴ）（ＡまたはＣ）Ｇ（Ｇまた はＣ）ＴＡＣ−３' （配列番号：２２） 〔Ｉはイノシンを示す。〕で表される合成プライマーおよび ５'−Ａ（ＧまたはＴ）Ｇ（ＡまたはＴ）ＡＧ（ＡまたはＴ）ＡＧＧＧＣＡＧＣ ＣＡＧＣＡＧＡＩ（ＧまたはＣ）（ＡまたはＧ）（ＣまたはＴ）ＧＡＡ−３' （配列番号：２３） 〔Ｉをイノシンを示す。〕で表される合成プライマーを
用いて、実施例１と同条件でＰＣＲ法を行った。得られ
たＰＣＲ産物は実施例２に記載の方法と同様にして、プ
ラスミドベクターｐＣＲ^TMIIにサブクローニングし、プ
ラスミドｐ５Ｓ３８を得た。このプラスミドで大腸菌Ｊ
Ｍ１０９を形質転換し、形質転換体エシェリヒア コリ
（Escherichia coli)ＪＭ１０９／ｐ５Ｓ３８を得た。

【００８９】塩基配列の決定のための反応は DyeDeoxy
Terminator Cycle Sequencing Kit（ＡＢＩ社）を用い
て行い、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読し、得ら
れた塩基配列の情報はＤＮＡＳＩＳ（日立システムエン
ジニアリング社）を用いて行った。ｐ５Ｓ３８の配列を
もとにマウス膵β細胞株ＭＩＮ６由来のＧ蛋白質共役型
レセプター蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列（配列
番号：１９）およびこれにコードされるアミノ酸配列
（配列番号：１４）を〔図１２〕に示した。下線で示し
た部分は合成プライマーに相当する部分である。決定し
た塩基配列〔図１２〕をもとにホモロジー検索を行なっ
た結果、得られたｃＤＮＡ断片が新規Ｇ蛋白質共役型レ
セプター蛋白質をコードすることが分かった。それをさ
らに確認するために、ＤＮＡＳＩＳ（日立システムエン
ジニアリング社）を用い、塩基配列をアミノ酸配列に変
換した後〔図１２〕、疎水性プロットを行なったとこ
ろ、４個の疎水性領域の存在が確認できた〔図１４〕。
また、アミノ酸配列を実施例２で得たｐ１９Ｐ２および
実施例４で得たｐＧ３−２と比較したところ、〔図１
３〕に示すとおり高い相同性を見いだした。その結果、
ｐ５Ｓ３８にコードされるマウス膵β細胞株ＭＩＮ６由
来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質とｐ１９Ｐ２にコー
ドされるヒト下垂体由来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白
質は、由来する動物種は異なるが、同一のリガンドを認
識するレセプター蛋白質であることが強く示唆された。
また、ｐ５Ｓ３８にコードされるマウス膵β細胞株ＭＩ
Ｎ６由来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質とｐＧ３−２
およびｐＧ１−１０にコードされるマウス膵β細胞株Ｍ
ＩＮ６由来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質は、同一の
リガンドを認識するレセプター蛋白質であり、互いに近
縁なレセプター蛋白質（いわゆる、サブタイプ）である
ことが示唆された。

【００９０】

【実施例９】ｐｈＧＲ３発現ＣＨＯ細胞の作製 ヒト下垂体由来レセプター蛋白質の全長アミノ酸配列を
コードするcDNAを組み込んだプラスミドｐｈＧＲ３（実
施例５）を制限酵素Nco I で切断し、アガロースゲル電
気泳動後に約1kbの断片を回収した。回収した断片の両
端をDNA blunting kit（宝酒造）を用いて平滑化した
後、Sal Iリンカーを付加しさらにSal Iで処理した後、
pUC119のSal I siteに組み込んでプラスミドS10を得
た。S10をSalIおよびSac IIで処理することにより約700
bpの断片（N末端側のコード領域を含む）を調製した。
次にｐｈＧＲ３よりSac II およびNhe I で切り出され
る約700bpの断片（終始コドンを含むＣ末端側コード領
域を含む）を調製した。これらの２つの断片をSal Iお
よびNhe I処理した動物細胞発現用ベクタープラスミド
ｐＡＫＫＯ−１１１Ｈ（Biochim. Biophys. Acta, Hinu
ma, S., et al. 1219巻、251-259頁、1994年記載のpAKK
O1.11Hと同一のベクタープラスミド）に加えてligation
を行い全長レセプター蛋白質発現用プラスミドｐＡＫＫ
Ｏ−１９Ｐ２ を構築した。ｐＡＫＫＯ−１９Ｐ２で形
質転換した大腸菌を培養後、ＱＵＩＡＧＥＮ Maxiによ
って大量にｐＡＫＫＯ−１９Ｐ２のプラスミドＤＮＡを
調製した。そのうち20μｇのプラスミドＤＮＡを1mlの
滅菌ＰＢＳに溶解した後、ジーントランスファー（和光
純薬）のバイアルに入れ、十分にボルテックスを行うこ
とによってリポソームの形成を行わせた。24時間前に直
径10cmシャーレに1×10⁶個ずつ継代し、直前に新鮮な培
地に交換したＣＨＯdhfr^-細胞に125μlのリポソーム溶
液を添加し、一晩培養した。新鮮な培地に交換してさら
に一日培養した後、選択培地に交換して１日間培養し
た。形質転換体を効率良く選別するために、低細胞密度
で継代を行い、選択培地中で増殖してくる細胞のみを選
択し、全長レセプター蛋白質発現CHO細胞株 ＣＨＯ−１
９Ｐ２を樹立した。

【００９１】

【実施例１０】ＣＨＯ−１９Ｐ２細胞株での全長レセプ
ター蛋白質の発現量の転写レベルでの確認 Fast Track kit (Invitrogen社）を用い、キットの処方
にしたがってｐＡＫＫＯ−１９Ｐ２を導入して形質転換
したＣＨＯ細胞とｍｏｃｋ ＣＨＯ細胞からpoly(A)⁺RN
Aを調製した。このpoly(A)⁺RNAを0.02μｇ用い、RNA PC
R Kit (宝酒造）を用いてｃＤＮＡの合成を行った。用
いたプライマーの種類はrandom 9merで、反応液の全容
量は40μlとした。また、ｃＤＮＡ合成のネガティブコ
ントロールとして、リバーストランスクリプターゼを添
加しない反応液も準備した。最初、30℃で10分間のイン
キュベートを行ってプライマーからの伸長反応をある程
度行わせた。その後、42℃で３０分間インキュベートし
て十分に逆転写反応を進行させ、99℃で５分間加熱して
酵素を失活し、さらに5℃で５分間冷却した。逆転写反
応終了後に反応液の一部を回収し、蒸留水で希釈した
後、フェノール／クロロフォルム抽出、ジエチルエーテ
ル抽出を行った。これをエタノール沈殿し、一定量の蒸
留水に溶解したものをｃＤＮＡの試料とした。このｃＤ
ＮＡ溶液およびプラスミドＤＮＡ（ｐＡＫＫＯ−１９Ｐ
２）を段階的に希釈したものを作成し、全長レセプター
蛋白質に特異的なプライマーを用いてＰＣＲを行った。
全長レセプター蛋白質のコード領域の塩基配列に基づい
て作成したプライマーの配列は、５’側がＣＴＧＡＣＴ
ＴＡＴＴＴＴＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＧＣ（配列番号：２
４）、３’側がＡＡＣＡＣＣＧＡＣＡＣＡＴＡＧＡＣＧ
ＧＴＧＡＣＣ（配列番号：２５）である。ＰＣＲ反応
は、プライマー各1μMおよびTaq DNA polymerase (宝酒
造）0.5μl、酵素に添付の反応バッファーおよびdNTPs
と10μlの鋳型ＤＮＡ（ｃＤＮＡあるいはプラスミド溶
液）を用いて全容量100μlで行った。最初に94℃で２分
間熱処理を行って鋳型ＤＮＡの変性を十分に行った後
に、95℃で30秒、65℃で30秒、72℃で60秒のサイクルを
25回行った。反応終了後に10μlの反応液を用いてアガ
ロースゲル電気泳動を行い増幅産物の検出および量的な
比較を行った。その結果全長レセプター蛋白質をコード
するｃＤＮＡの配列から推定される大きさ（400bp）の
ＰＣＲ産物が、検出された〔図１５〕。リバーストラン
スクリプターゼを添加しなかった逆転写反応産物を鋳型
として用いたＰＣＲ反応液のレーンに特異的なバンドは
検出されず、ＣＨＯ細胞のゲノムＤＮＡ由来のＰＣＲ産
物である可能性は除外され、また、ｍｏｃｋ細胞のレー
ンにも特異的なバンドが出現しないことから、ＣＨＯ細
胞にもとから発現しているｍＲＮＡ由来ではないことが
確認された〔図１５〕。

【００９２】

【実施例１１】ラット全脳抽出液に含まれるＣＨＯ−１
９Ｐ２細胞株から特異的にアラキドン酸代謝物の遊離を
促進する活性の検出 ラット全脳よりペプチド粗画分を以下の方法で調整し
た。屠殺後、直ちに摘出したラット全脳を液体窒素にて
凍結、-80℃にて保存した。凍結保存したラット全脳20g
(ラット10匹分)を細かく砕き、蒸留水80mlで10分間煮沸
した。煮沸後、氷上にて急冷し、終濃度 1.0M となるよ
う酢酸を4.7ml加え、ポリトロン(20,000rpm、6min)を用
いてホモジナイズした。ホモジェネートは、一晩撹拌し
た後、遠心(10,000rpm、20min)により上清をとり、沈殿
物を1.0M酢酸40mlでホモジナイズし遠心にて再度上清を
得た。上清をまとめ、3倍量のアセトンを加え、氷上に3
0分間放置した後遠心(10,000rpm、20min)にて上清を回
収した。回収したアセトン上清は、エバポレーションに
て脱アセトン、濃縮を行った。濃縮された脱アセトン上
清に、2倍量の0.05%トリフルオロ酢酸(TFA)/H₂Oを加
え、ガラス製カラムに詰めた逆相C18カラム(Prep C18 1
25Å 10ml：ミリポア)に添加した。上清を添加後、0.05
%TFA/H₂O でカラムを洗浄、10%、20%、30%、40%、50%、
60% CH₃CN/0.05%TFA/H₂O で段階的に溶出し、それぞれ
の画分を10等分して凍結乾燥した。1匹分の全脳由来の
乾燥標品を、ジメチルスルホキシド(DMSO)20μlにて溶
解し、0.05%ウシ血清アルブミン(BSA)を加えたハンクス
氏液(HBSS)1mlに懸濁し、ペプチド粗画分とした。全長
レセプター蛋白質発現CHO細胞およびｍｏｃｋ ＣＨＯ
細胞を、24well plateに0.5x10⁵cells/wellで播種し、2
4時間培養後、[³H]アラキドン酸を0.25μCi/well とな
るよう添加した。[³H]アラキドン酸添加16時間後、細胞
を0.05%BSAを含むHBSSで洗浄、上述のペプチド粗画分を
400μl/wellで添加した。37℃で30分間インキュベート
した後に、反応液400μl中300μlをシンチレーター4ml
に加え、反応液中に遊離された[³H]アラキドン酸代謝物
の量をシンチレーション・カウンターによりモニターし
た。その結果、30%CH₃CNの溶出画分に全長レセプター蛋
白質発現ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−１９Ｐ２）特異的なアラ
キドン酸代謝物遊離活性が検出された〔図１６〕。

【００９３】

【実施例１２】ウシ視床下部抽出液に含まれるＣＨＯ−
１９Ｐ２細胞株から特異的にアラキドン酸代謝物の遊離
を促進する活性の検出 実施例１１と同様の方法でウシ視床下部を含む脳組織片
360g(10頭分)よりペプチド粗画分を調製した。0.5頭分
由来の乾燥ペプチド標品を40μlのDMSO に溶解し、0.05
%BSAを含む2mlのHBSSに懸濁し、実施例１１と同様の方
法でアラキドン酸代謝物遊離活性の検出を試みた。その
結果、ウシ視床下部ペプチド粗画分のC18カラム30%CH₃C
N溶出画分に、ＣＨＯ−１９Ｐ２細胞株から特異的にア
ラキドン酸代謝物の遊離を促進する活性が検出された
〔図１７〕。

【００９４】

【実施例１３】ウシ視床下部からのＣＨＯ−１９Ｐ２細
胞株から特異的にアラキドン酸代謝物の遊離を促進する
活性物質(ペプチド)の精製 ＣＨＯ−１９Ｐ２細胞株から特異的アラキドン酸代謝物
の遊離を促進する活性物質についてウシ視床下部から精
製した代表例を以下に具体的に述べる。視床下部を含む
凍結脳組織片4.0kg(80頭分)を小片化し、蒸留水8.0L中
で20分間煮沸した。氷上にて急冷した後、終濃度1.0Mと
なるように酢酸540mlを加え、ポリトロン(10,000rpm、1
2min)にてホモジナイズした。ホモジェネートを一晩撹
拌した後、遠心(9,500rpm、20min)にて上清を得た。沈
殿物は1.0M酢酸4.0Lに懸濁し、ポリトロンにてホモジナ
イズし遠心にて再度上清を得た。上清を一つにまとめ、
終濃度0.05%となるようにTFAを加え、ガラス製カラムに
詰めた逆相C18カラム(PrepC18 125Å 160ml:ミリポア)
に添加した。添加後、0.05%TFA/H₂0 320ml でカラムを
洗浄後、10%、30%、50% CH₃CN/0.05%TFA/H₂O で3段階に
溶出した。30% CH₃CN/0.05%TFA/H₂O 溶出画分に２倍量
の 20mM CH₃COONH₄/H₂O を加え、陽イオン交換カラム H
iPrep CM-Sepharose FF (Pharmacia)に添加した。20mM
CH₃COONH₄/10% CH₃CN/H₂O でカラムを洗浄後、100mM、
200mM、500mM、1000mM CH₃COONH₄/10%CH₃CN/H₂O で４段
階に溶出した。200mM CH₃COONH₄ 溶出画分にＣＨＯ−１
９Ｐ２細胞株から特異的にアラキドン酸代謝物の遊離を
促進する活性が見いだされたので、この溶出画分に３倍
量のアセトンを加え、遠心して除タンパク質を行った
後、エバポレーションによる濃縮を行った。濃縮された
画分にTFA(終濃度0.1%)を加えた後さらに 酢酸を加えて
pH4に調製し、逆相カラム RESOURCE RPC 3ml(Pharmaci
a)に添加した。15%-30% CH₃CN 濃度勾配による溶出で、
19%-21% CH₃CN の画分にＣＨＯ−１９Ｐ２細胞株から特
異的にアラキドン酸代謝物の遊離を促進する活性が検出
された。RESOURCE RPC の活性画分を 凍結乾燥後、DMSO
で溶解したのち、50mM MES pH5.0/10% CH₃CN に懸濁
し、陽イオン交換カラム RESOURCE S 1ml(Pharmacia)に
添加した。0M-0.7M NaCl 濃度勾配による溶出で、0.32M
-0.46MNaCl の画分にＣＨＯ−１９Ｐ２細胞株から特異
的にアラキドン酸代謝物の遊離を促進する活性が検出さ
れた。RESOURCE S の活性画分を 凍結乾燥後、DMSOに溶
解したのち、0.1%TFA/H₂O に懸濁し、逆相カラム C18 2
18TP5415(Vydac) に添加した。20%-30% CH₃CN 濃度勾配
による溶出で、22.5%、23%、23.5% CH₃CN の３つの画分
（活性画分をそれぞれP-1、P-2、P-3とする）にそれぞ
れＣＨＯ−１９Ｐ２細胞株から特異的にアラキドン酸代
謝物の遊離を促進する活性が検出された〔図１８〕。３
つに分離した活性のうちの 23.5% CH₃CN の画分（p-3)
を凍結乾燥後、DMSOで溶解したのち、0.1%TFA/H₂O に懸
濁し、逆相カラム diphenyl 219TP5415(Vydac) に添加
した。22%-25% CH₃CN 濃度勾配による溶出で、23% CH₃C
N で溶出される１つのピークにＣＨＯ−１９Ｐ２細胞株
から特異的にアラキドン酸代謝物の遊離を促進する活性
は収束した〔図１９〕。逆相カラムdiphenyl 219TP5415
で活性と一致したピークの画分を凍結乾燥後、0.1%TFA
/H₂O に懸濁し、逆相カラム μRPC C2/C18 SC 2.1/10(P
harmacia) に添加した。22%-23.5% CH₃CN 濃度勾配によ
る溶出で 23.0% と 23.2% CH₃CN で溶出される二つのピ
ークにそれぞれＣＨＯ−１９Ｐ２細胞株から特異的にア
ラキドン酸代謝物の遊離を促進する活性が検出された
〔図２０〕。

【００９５】

【実施例１４】ウシ視床下部から精製したＣＨＯ−１９
Ｐ２細胞株から特異的にアラキドン酸代謝物の遊離を促
進する活性ペプチドのアミノ酸配列決定 実施例１３で精製されたＣＨＯ−１９Ｐ２細胞株から特
異的にアラキドン酸代謝物の遊離を促進する活性ペプチ
ド(P-3)のアミノ酸配列の決定を行った。逆相カラム μ
RPC C2/C18 SC 2.1/10 で活性と一致したピークの画分
を凍結乾燥後、70% CH₃CN 20μl に溶解し、ペプチドシ
ークエンサー(ABI.491) によるアミノ酸配列の分析を行
った。その結果、配列番号：２６が得られた。ただし、
７番目と１９番目の配列はアミノ酸配列の分析のみでは
決定されていない。

【００９６】

【実施例１５】ウシ視床下部からのＣＨＯ-１９Ｐ２細
胞株から特異的にアラキドン酸代謝物の遊離を促進する
活性物質（ペプチド）の精製 実施例１３において Vydac Ｃ１８ ２１８ＴＰ５４１５
で分離された３つの活性のうち２３.０％ ＣＨ₃ＣＮの
活性画分（Ｐ-２）のさらなる精製を行った。この活性
画分を凍結乾燥後、DMSOで溶解したのち０.１％ ＴＦＡ
／蒸留水に懸濁し、逆相カラムdiphenyl ２１９ＴＰ５
４１５（Vydac）に添加した。２１.０％−２４.０％ Ｃ
Ｈ₃ＣＮ濃度勾配による溶出で、２１.９％ ＣＨ₃ＣＮで
溶出される一つのピークにＣＨＯ-１９Ｐ２細胞株から
特異的にアラキドン酸代謝物の遊離を促進する活性が検
出された。この画分を凍結乾燥後、DMSOで溶解したのち
０.１％ ＴＦＡ／蒸留水に懸濁し、逆相カラムμＲＰＣ
Ｃ２／Ｃ１８ ＳＣ ２.１／１０（Pharmacia）に添加
した。２１.５％−２３.０％ ＣＨ₃ＣＮ濃度勾配による
溶出で、２２.０％ ＣＨ₃ＣＮで溶出される一つのピー
クにＣＨＯ-１９Ｐ２細胞株から特異的にアラキドン酸
代謝物の遊離を促進する活性が収束した〔図２１〕。

【００９７】

【実施例１６】ウシ視床下部から精製されたＣＨＯ-１
９Ｐ２細胞株から特異的にアラキドン酸代謝物の遊離を
促進するペプチド（Ｐ-２）のアミノ酸配列決定 実施例１５で精製されたＣＨＯ-１９Ｐ２細胞株から特
異的にアラキドン酸代謝物の遊離を促進するペプチド
（Ｐ-２）のアミノ酸配列の決定を行った。逆相カラム
μＲＰＣ Ｃ２／Ｃ１８ ＳＣ ２.１／１０で活性と一致
したピークの画分を凍結乾燥後、７０％ ＣＨ₃ＣＮ ２
０μｌに溶解し、ペプチドシークエンサー（ＡＢＩ，４
９２）によるアミノ酸配列の分析を行った（配列番号：
２７）。

【００９８】

【実施例１７】ウシ視床下部からの poly(Ａ)⁺ＲＮＡ画
分の調製およびｃＤＮＡの合成 ウシ１頭分の視床下部より Isogen（ニッポンジーン
社）により total ＲＮＡを調製後、FastTrack（Invitr
ogen社）を用いて poly(Ａ)⁺ＲＮＡ画分を調製した。次
にこの poly(Ａ)⁺ＲＮＡ画分１μｇから、３' ＲＡＣＥ
system（GIBCO BRL）および Marathon cDNA amplifica
tion kit（Clontech）により、マニュアルに従ってｃＤ
ＮＡを合成し、それぞれ２０および１０μｌに溶解し
た。

【００９９】

【実施例１８】実施例１４で明らかとなったアミノ酸配
列部分をコードするｃＤＮＡの取得 実施例１４で明らかとなったアミノ酸配列を含むポリペ
プチドをコードするｃＤＮＡを取得するため、まず配列
番号：２８をコードする塩基配列の取得をめざした。そ
こでプライマーＰ５-１（配列番号：２９）、Ｐ３-１
（配列番号：３０）、Ｐ３-２（配列番号：３１）を合
成した（配列表においてＩはイノシンを示す）。実施例
１７で３' ＲＡＣＥ system を用いて調製したｃＤＮＡ
０.５μｌを鋳型として、ＤＮＡ polymerase としてＥ
ＸＴaq（宝酒造）を用い、添付のバッファー２.５μ
ｌ、ｄＮＴＰ ２００μＭと、プライマーＰ５-１，Ｐ３
-１をそれぞれ２００ｎＭとなるように加え水で２５μ
ｌとして、９４℃・１分後、９８℃・１０秒、５０℃・
３０秒、６８℃・１０秒のサイクルを３０回繰り返し
た。この反応液をトリシン・ＥＤＴＡバッファーで５０
倍に希釈したもの２.５μｌを鋳型として、プライマー
をＰ５-１とＰ３-２に組み合わせに換え、その他は同じ
条件で反応を行った。サーマルサイクラーは GeneAmp96
00（パーキンエルマー社）を用いた。増幅産物を４％ア
ガロース電気泳動、エチジウムブロマイド染色し約７０
ｂｐ のバンドを切り出し、熱融解、フェノール抽出、
エタノール沈殿した。回収したＤＮＡをＴＡクローニン
グキット（Invitrogen）のマニュアルに従い、プラスミ
ドベクターｐＣＲ^TMIIへサブクローニングした。これを
大腸菌ＪＭ１０９に導入して、得られた形質転換体をア
ンピシリンを含むＬＢ培地で培養後、自動プラスミド抽
出器（クラボウ）でプラスミドを調製した。このプラス
ミドを Dye Terminator Cycle Sequencing Kit（ＡＢ
Ｉ）でマニュアルに従い反応し、蛍光自動ＤＮＡシーケ
ンサー（ＡＢＩ）により解読した。その結果〔図２２〕
に示す配列が得られ、これが配列番号：２８をコードす
る塩基配列の一部であることを確認した。

【０１００】

【実施例１９】実施例１８で明らかになった配列を用い
てのＲＡＣＥ法による生理活性ポリペプチドｃＤＮＡの
取得 まず５'側の配列を増幅する（５’ＲＡＣＥ）のために
〔図２２〕に示した配列を利用してＰＥ（配列番号：３
２）とＰＤＮ（配列番号：３３）の２本のプライマーを
合成した。実施例１７で Marathon cDNA amplification
kit により調製したｃＤＮＡをトリシン・ＥＤＴＡバ
ッファーで１００倍に希釈したもの２.５μｌを鋳型と
して、実施例２と同様の方法で反応液を調製し、キット
添付のアダプタープライマーＡＰ１とＰＥの組み合わせ
で、９４℃・１分後、９８℃・１０秒、６８℃・５分の
サイクルを３０回繰り返した。さらにこの反応液をトリ
シン・ＥＤＴＡバッファーで５０倍に希釈したもの２.
５μｌを鋳型として、プライマーをＡＰ１とＰＤＮの組
み合わせに換え、９４℃・１分後、９８℃・１０秒、７
２℃・５分のサイクルを４回、９８℃・１０秒、７０℃
・５分のサイクルを４回、９８℃・１０秒、６８℃・５
分のサイクルを２６回繰り返した。増幅産物を１.２％
アガロース電気泳動、エチジウムブロマイド染色し約１
５０ｂｐ のバンドを切り出し、遠心濾過チューブ（ミ
リポア社）で遠心濾過後、フェノール抽出、エタノール
沈殿した。回収したＤＮＡをＴＡクローニングキット
（Invitrogen）のマニュアルに従い、プラスミドベクタ
ーｐＣＲ^TMIIへサブクローニングした。これを大腸菌Ｊ
Ｍ１０９に導入して、得られた形質転換体を実施例１８
と同様の方法で挿入されたｃＤＮＡ断片の配列を解析し
た。その結果、〔図２３〕に示す配列が得られた。さら
にこの配列を基にプライマーＦＢ（配列番号：３４），
ＦＣ（配列番号：３５）を合成し、３'側の配列取得を
行った（３’ＲＡＣＥ）。鋳型は５’ＲＡＣＥと同じも
のを同量用い、キット添付のアダプタープライマーＡＰ
１とＦＣの組み合わせで、９４℃・１分後、９８℃・１
０秒、７２℃・５分のサイクルを５回、９８℃・１０
秒、７０℃・５分のサイクルを５回、９８℃・１０秒、
６８℃・５分のサイクルを２５回繰り返した。さらにこ
の反応液をトリシン・ＥＤＴＡバッファーで５０倍に希
釈したもの２.５μｌを鋳型として、プライマーを、や
はりキット添付のＡＰ２とＦＢの組み合わせに換え、９
４℃・１分後、９８℃・１０秒、７２℃・５分のサイク
ルを４回、９８℃・１０秒、７０℃・５分のサイクルを
４回、９８℃・１０秒、６８℃・５分のサイクルを２７
回繰り返した。増幅産物を１.２％アガロース電気泳
動、エチジウムブロマイド染色し約４００ｂｐ のバン
ドを切り出し、５’ＲＡＣＥのときと同様の方法でＤＮ
Ａを回収した。このＤＮＡ断片をプラスミドベクターｐ
ＣＲ^TMIIへサブクローニング後、大腸菌ＪＭ１０９に導
入して、得られた形質転換体に挿入されたｃＤＮＡ断片
の配列を解析した。５'および３’ＲＡＣＥの結果か
ら、配列番号：２８に示した生理活性ポリペプチドの全
コード領域をコードするｃＤＮＡ配列〔図２４〕を得
た。具体的には、図２４（ａ）および（ｂ）において、
第１３４番目の塩基がＧのものであって、第１８４番目
の塩基がＴおよびＣのもの、第２４５番目の塩基がＴお
よびＣのものが得られた。図２４に示したｃＤＮＡは９
８アミノ酸からなるポリペプチドをコードしていた。第
１から第２２番目のアミノ酸が疎水的なアミノ酸が集合
していることと実施例１４に示したように活性ペプチド
のＮ末端が第２３番目のSerから始まっていることを考
え合わせると、第１から２２番目のアミノ酸は分泌シグ
ナルの配列であると推定された。一方、ポリペプチドの
第５４番目から５７番目に存在するGlyArgArgArg配列は
生理活性ペプチドが切断される場合に存在する典型的な
アミノ酸配列モチーフであることが分かった。またこの
切断モチーフの場合にはGlyが存在するためしばしば生
成するペプチドのＣ末端はアミド化されることが知られ
ている。実施例１４のP-3のＮ末端配列および実施例１
６のP-2のＮ末端配列情報とこのGlyArgArgArg配列を考
え合わせるとこのｃＤＮＡにコードされるポリペプチド
から切り出されてくる生理活性ペプチドの少なくとも一
部は配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：３
９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：４
２、配列番号：４３もしくは配列番号：４４であると考
えられた。

【０１０１】

【実施例２０】ＰＣＲ法によるウシ型生理活性ポリペプ
チドｃＤＮＡの全コード領域を含むＤＮＡ断片の取得 実施例１７で Marathon cDNA amplification kit によ
り調製したｃＤＮＡを鋳型として生理活性ポリペプチド
ｃＤＮＡの全コード領域を含むＤＮＡ断片の取得を行っ
た。まず実施例１９で明らかとなったｃＤＮＡの配列を
基に、配列番号：３６、配列番号：３７で表される塩基
配列を有するプライマーを２本合成した。 ＢＯＶＦ ５'-ＧＴＧＴＣＧＡＣＧＡＡＴＧＡＡＧＧＣＧＧＴＧＧＧＧＧＣＣＴＧＧＣ- ３' （配列番号：３６） ＢＯＶＲ（２４ｍｅｒ） ５'-ＡＧＧＣＴＣＣＣＧＣＴＧＴＴＡＴＴＣＣＴＧＧＡＣ-３' （配列番号：３７） ＢＯＶＦは生理活性ポリペプチドｃＤＮＡのスタートコ
ドンを含み、制限酵素ＳａｌＩ部位を付加した−２〜＋
２２（スタートコドンＡＴＧのＡを＋１とする）に対応
するセンス配列で、ＢＯＶＲは生理活性ポリペプチドｃ
ＤＮＡのストップコドンを含む＋２８５〜＋３０９に対
応するアンチセンス配列である。ＰＣＲ反応は実施例１
７で Marathon cDNA amplification kit により調製し
たｃＤＮＡをトリシン・ＥＤＴＡバッファーで１００倍
に希釈したもの２.５μｌを鋳型として、実施例２と同
様の方法で反応液を調製し、９４℃・１分後、９８℃・
１０秒、７２℃・５分のサイクルを３回、９８℃・１０
秒、７０℃・５分のサイクルを３回、９８℃・１０秒、
６８℃・５分のサイクルを２７回繰り返した。増幅産物
を２％アガロース電気泳動、エチジウムブロマイド染色
し約３２０ｂｐ のバンドを切り出し、実施例３と同様
の方法でＤＮＡを回収、プラスミドベクターｐＣＲ^TMII
へサブクローニングした。これを大腸菌ＪＭ１０９に導
入して、形質転換体エシェリヒア コリ(Escherichia c
oli)ＪＭ１０９／ｐＢＯＶ３を得た。得られた形質転換
体に挿入されたｃＤＮＡ断片の配列を解析した。その結
果このＤＮＡ断片は生理活性ポリペプチドｃＤＮＡの全
コード領域を含む断片であることが確認された。

【０１０２】

【実施例２１】Ser-Arg-Ala-His-Gln-His-Ser-Met-Glu-
Ile-Arg-Thr-Pro-Asp-Ile-Asn-Pro-Ala-Trp-Tyr-Ala-Gl
y-Arg-Gly-Ile-Arg-Pro-Val-Gly-Arg-Phe-NH₂（１９Ｐ
２−Ｌ３１）の合成。 １）Ser(Bzl)-Arg(Tos)-Ala-His(Bom)-Gln-His(Bom)-Se
r(Bzl)-Met-Glu(OcHex)-Ile-Arg(Tos)-Thr(Bzl)-Pro-As
p(OcHex)-Ile-Asn-Pro-Ala-Trp(CHO)-Tyr(Br-Z)-Ala-Gl
y-Arg(Tos)-Gly-Ile-Arg(Tos)-Pro-Val-Gly-Arg(Tos)-P
he-pMBHA-resinの合成。 市販ｐ−メチルＢＨＡ樹脂（アプライド バイオシテム
ズ、現パ−キンエルマ−社製）0.71g(0.5 m mole)をペ
プチド合成機（アプライド バイオシテムズ社製４３０
Ａ）の反応器に入れ、ＤＣＭで膨潤させた後、最初のア
ミノ酸Boc-PheをHOBt/DCC法で活性化しｐ−メチルＢＨ
Ａ樹脂に導入した。樹脂を50%ＴＦＡ／ＤＣＭで処理
し、Boc基を除去してアミノ基を遊離させ、DIEAで中和
した。このアミノ基に次のアミノ酸Boc-Arg(Tos)をHOBt
/DCC法で縮合した。未反応アミノ基の有無をニンヒドリ
ンテストで調べ反応完了を確認後同様に、Boc-Gly、Boc-
Val、Boc-Pro、Boc-Arg(Tos)、Boc-Ile、Boc-Gly、Boc-Arg(T
os)、Boc-Gly、Boc-Ala、Boc-Tyr(Br-Z)を順次縮合、ニン
ヒドリンテストで縮合が不十分であると判明したBoc-Al
a、 Boc-Tyr(Br-Z)は再縮合し反応を完了した。樹脂を乾
燥して半量の樹脂を取り出した残りに、Boc-Trp(CHO)、B
oc-Ala、Boc-Pro、Boc-Asn、Boc-Ile、Boc-Asp(OcHex)、Boc-
Pro、Boc-Thr(Bzl)、Boc-Arg(Tos)、Boc-Ile、Boc-Glu(OcHe
x)、Boc-Met、Boc-Ser(Bzl)、Boc-His(Bom)、Boc-Gln、Boc-H
is(Bom)、Boc-Ala、Boc-Arg(Tos)、Boc-Ser(Bzl)を同様に
ニンヒドリンテストで十分な縮合が得られるまで再縮合
をくり返した。１９Ｐ２−Ｌ３１の全配列アミノ酸が導
入され樹脂を50%ＴＦＡ／ＤＣＭで処理し樹脂上のBoc基
を除去後、樹脂を乾燥し1.28gのペプチド樹脂を合成し
た。 ２）Ser-Arg-Ala-His-Gln-His-Ser-Met-Glu-Ile-Arg-Th
r-Pro-Asp-Ile-Asn-Pro-Ala-Trp-Tyr-Ala-Gly-Arg-Gly-
Ile-Arg-Pro-Val-Gly-Arg-Phe-NH₂（１９Ｐ２−Ｌ３
１）の合成。 １）で得た樹脂をｐ−クレゾール3.8g、1、4-ブタンジチ
オ−ル１ml、弗化水素10mlと共にテフロン製弗化水素反
応装置中で０℃ ６０分間反応した。弗化水素、1、4-ブ
タンジチオ−ル１mlを減圧留去し、残留物にジエチルエ
ーテル100mlを加え撹袢後、グラスフィルター上に濾
取、乾燥した。これを50%酢酸水溶液50ml中に懸濁、撹
袢し、ペプチドを抽出した後樹脂と分離し減圧下に約５
mlまでに濃縮した後、セファデックスG-25（２ｘ９０ｃ
ｍ）のカラムに付し50%酢酸水で展開し114 ml〜181 ml
の画分を集め凍結乾燥し、１９Ｐ２−Ｌ３１を含む白色
粉末290 ｍｇを得た。これをLiChroprep RP-18（ＭＥＲ
ＣＫ社製）を充填した逆相系カラムにつけ0.1% ＴＦＡ
水と0.1% ＴＦＡ含有3０％アセトニトリル水溶液を用
いたグラジエント溶出での精製をくり返し、アセトニト
リル濃度２５％前後に溶出される部分を集め凍結乾燥
し、白色粉末７１ｍｇを得た。 質量分析による（Ｍ＋Ｈ）⁺ ３５７４．６４５ ＨＰＬＣ溶出時間 １８．２分 カラム条件 カラム： Wakosil ５Ｃ１８ （４．６ｘ１００ｍｍ） 溶離液：Ａ液（0.1% ＴＦＡ水） Ｂ液（0.1% ＴＦＡ含有５０％アセトニトリル水）を用い Ａ液からＢ液へ直線型濃度勾配溶出（２５分） 流速： 1.0 ｍｌ／分

【０１０３】

【実施例２２】Ser-Arg-Ala-His-Gln-His-Ser-Met(O)-G
lu-Ile-Arg-Thr-Pro-Asp-Ile-Asn-Pro-Ala-Trp-Tyr-Ala
-Gly-Arg-Gly-Ile-Arg-Pro-Val-Gly-Arg-Phe-NH₂（１９
Ｐ２−Ｌ３１（Ｏ））の合成。 合成１９Ｐ２−Ｌ３１ ６ｍｇを５％−酢酸水溶液２０
ｍｌに溶解し３０％−過酸化水素水４０μｌを加えMet
部分のみを酸化し、反応終了後直ちにLiChroprep RP-18
（ＭＥＲＣＫ社製）を充填した逆相系カラムにつけて精
製し目的物 ５．８ｍｇをえた。 質量分析による（Ｍ＋Ｈ）⁺ ３５９０．５３１ ＨＰＬＣ溶出時間 １７．９分 カラム条件 カラム： Wakosil ５Ｃ１８ （４．６ｘ１００ｍｍ） 溶離液：Ａ液（0.1% ＴＦＡ水） Ｂ液（0.1% ＴＦＡ含有５０％アセトニトリル水）を用い Ａ液からＢ液へ直線型濃度勾配溶出（２５分） 流速： 1.0 ｍｌ／分

【０１０４】

【実施例２３】Thr-Pro-Asp-Ile-Asn-Pro-Ala-Trp-Tyr-
Ala-Gly-Arg-Gly-Ile-Arg-Pro-Val-Gly-Arg-Phe-NH
₂（１９Ｐ２−Ｌ２０）の合成。 実施例２１の１）でBoc-Tyr(Br-Z)までを縮合した樹脂
にさらにBoc-Trp(CHO)、Boc-Ala、Boc-Pro、Boc-Asn、Boc-I
le、Boc-Asp(OcHex)、Boc-Pro、Boc-Thr(Bzl)を同様に縮合
し、 Boc-Thr(Bzl)-Pro-Asp(OcHex)-Ile-Asn-Pro-Ala-T
rp(CHO)-Tyr(Br-Z)-Ala-Gly-Arg(Tos)-Gly-Ile-Arg(To
s)-Pro-Val-Gly-Arg(Tos)-Phe-pMBHA-resin１．１４ｇ
を得た。これを実施例２１の２）と同様に弗化水素処
理、カラム精製し、白色粉末６０ｍｇを得た。 質量分析による（Ｍ＋Ｈ）⁺ ２２４２．１４９ ＨＰＬＣ溶出時間 １０．４分 カラム条件 カラム： Wakosil ５Ｃ１８ （４．６ｘ１００ｍｍ） 溶離液：Ａ液（0.1% ＴＦＡ含有１５％アセトニトリル水） Ｂ液（0.1% ＴＦＡ含有４５％アセトニトリル水）を用い Ａ液からＢ液へ直線型濃度勾配溶出（１５分） 流速： 1.0 ｍｌ／分

【０１０５】

【実施例２４】合成ペプチド（１９Ｐ２−Ｌ３１）によ
るアラキドン酸代謝物遊離活性の測定 実施例１１と同様に、実施例２１で合成されたペプチド
（１９Ｐ２−Ｌ３１）によるＣＨＯ−１９Ｐ２細胞株か
らの特異的なアラキドン酸代謝物の遊離を測定した。合
成ペプチドは、脱気処理した蒸留水に１０^-3Ｍの濃度で
溶解し、０．０５％ＢＳＡを含むＨＢＳＳで希釈して、
それぞれの濃度におけるＣＨＯ−１９Ｐ２細胞株からの
アラキドン酸代謝物の遊離を［³Ｈ］アラキドン酸代謝
物の量を指標に測定した。その結果、１０^-12Ｍ〜１０
^-6Ｍで濃度依存的なアラキドン酸代謝物遊離の活性が検
出された〔図２５〕。さらに、実施例２２で合成された
１９Ｐ２−Ｌ３１のメチオニン酸化体であるペプチド１
９Ｐ２−Ｌ３１（Ｏ）について１９Ｐ２−Ｌ３１とのア
ラキドン酸代謝物遊離活性の比較を行った結果、〔図２
６〕に示すように１９Ｐ２−Ｌ３１（Ｏ）は１９Ｐ２−
Ｌ３１と同等の活性を示すことが分かった。

【０１０６】

【実施例２５】合成ペプチド（１９Ｐ２−Ｌ２０）によ
るアラキドン酸代謝物遊離活性の測定 実施例１１と同様に、実施例２３で合成された天然品Ｐ
−２に相当するペプチド（１９Ｐ２−Ｌ２０）によるＣ
ＨＯ−１９Ｐ２細胞株からの特異的なアラキドン酸代謝
物の遊離を測定した。合成ペプチドは、脱気処理した蒸
留水に１０^-3Ｍの濃度で溶解し、０．０５％ＢＳＡを含
むＨＢＳＳで希釈して、それぞれの濃度におけるＣＨＯ
−１９Ｐ２細胞株からのアラキドン酸代謝物の遊離を［
³Ｈ］アラキドン酸代謝物の量を指標に測定した。その
結果、１０^-12〜１０^-6Ｍで濃度依存的なアラキドン酸
代謝物遊離の活性が１９Ｐ２−Ｌ３１とほぼ同程度に検
出された〔図２７〕。

【０１０７】

【実施例２６】ウシゲノムＤＮＡにおけるコード領域の
塩基配列の解析 pBOV3を制限酵素EcoRIで消化し、アガロースゲル電気泳
動で分離した後、cDNA断片部分のDNAを回収してプローブ
を調製した。これをマルチプライムＤＮＡラベリングキ
ット（アマシャム社）を用いて³²Ｐ標識した。クローニ
ングベクターEMBL3 SP6/T7を用いて構築したBovine Gen
omic Library (CLONTECH社 BL1015j)の約2.0x10⁶個のフ
ァージを大腸菌K802を宿主としてＬＢ寒天培地プレート
に播種し、一晩培養してプラークを形成させた。これを
ニトロセルロースフィルターに転写し、アルカリ変性、
中和処理を行った後、熱処理（80℃、2時間)によってＤ
ＮＡを固定化した。このフィルターを５０％ホルムアミ
ドを含むハイブリバッファー（50％formamide、5 x Den
hardt's溶液、4 x SSPE、0.1mg/ml Salmon spermＤＮ
Ａ、0.1%SDS)中で標識プローブと４２℃で一晩インキュ
ベーションし、ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼ
ーション後のフィルターを室温で2 x SSC、0.1%SDS中で
１．５時間洗浄した後、さらに５５℃の同バッファー中
で３０分間洗浄した。プローブとハイブリダイズするク
ローンの検出は、コダック社のＸ線フィルム(X-OMAT^TMA
R)と増感スクリーンを用い、−８０℃で４日間の露光に
よって行った。Ｘ線フィルムを現像した後、フィルムと
プレートの位置を対応させながらハイブリダイズしてい
る部分のファージを回収した。さらに上記の方法によっ
て再プレーティングとハイブリダイゼーションを繰り返
して行い、ファージのクローン化を行った。クローン化
したファージをプレートライセート法によって大量に調
製し、ファージＤＮＡを抽出した後、ベクターのクロー
ニングサイトの両端に存在する制限酵素SalIおよびBamH
I切断部位で切断してウシゲノムDNA由来の挿入断片の検
出を１．２％アガロースゲル電気泳動によって行った
〔図２８〕。その結果、BamHI消化では３本の断片がフ
ァージ由来のバンドの他に検出された。また、SalI消化
ではファージ由来のバンドに重なって１本のバンドが検
出された。SalI消化断片が全長を保持していると考え、
この断片をプラスミドベクターにサブクローニングする
ために、SalI消化後にBAP(大腸菌由来のアルカリフォス
フォターゼ）処理したプラスミドベクターpUC18（ファ
ルマシア社）とライゲーション反応を行い、大腸菌JM10
9に導入した。この菌からゲノム由来のSalI断片が挿入
されたプラスミドＤＮＡを大量に調製し、パーキンエル
マー・アプライドバイオシステムズ社の370A蛍光式シー
ケンサーおよび同社のキットを用いてコード領域付近の
塩基配列の解析を行った。その結果、〔図２９〕に示す
ような配列が得られた。ｃＤＮＡのコード領域と比較す
ると、ゲノムＤＮＡ由来であるために472bpのイントロ
ンによってコード領域が２つに分割されている〔図３
０〕。〔図３１〕および配列番号：３８には、このウシ
のゲノムのコード領域（イントロン部分を除いたもの）
から推定されるアミノ酸配列を示す。

【０１０８】

【実施例２７】ラット延髄背側部poly(Ａ)⁺ＲＮＡ画分
の調製およびｃＤＮＡの合成 ラットの延髄背側部よりIsogen（ニッポンジーン社）に
よりtotal ＲＮＡを調製後、FastTrack（Invitrogen
社）を用いてpoly(Ａ)⁺ＲＮＡ画分を調製した。次にこ
のpoly(Ａ)⁺ＲＮＡ ５μｇにプライマーとしてランダム
ＤＮＡヘキサマー（ＢＲＬ社）を加え、モロニーマウス
白血病の逆転写酵素（ＢＲＬ社）により、添付バッファ
ーを用いて相補ＤＮＡを合成した。反応後の産物はエタ
ノール沈殿を行った後、１２μｌの蒸留水に溶解した。
またこのpoly(Ａ)⁺ＲＮＡ １μｇから、Marathon ｃＤ
ＮＡ amplification kit（Clontech）により、マニュア
ルに従ってｃＤＮＡを合成し、１０μｌに溶解した。

【０１０９】

【実施例２８】ＲＡＣＥ法によるラット型生理活性ポリ
ペプチドのｃＤＮＡの取得 ラット型生理活性ポリペプチドｃＤＮＡの全コード領域
を取得するため、ウシ型を取得した方法に準じて実験を
行った。まず実施例１８で使用したプライマーＰ５−１
（配列番号：２９）、Ｐ３−１（配列番号：３０）をプ
ライマーとし、鋳型には実施例２７でプライマーとして
ランダムＤＮＡヘキサマー（ＢＲＬ社）を加え、モロニ
ーマウス白血病の逆転写酵素（ＢＲＬ社）により合成し
た相補ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。反応液は鋳
型ｃＤＮＡを１.２５μｌ、ｄＮＴＰ２００μＭ，プラ
イマーを各１μＭ，ＤＮＡ polymeraseとしてExTaq（宝
酒造）を用い、添付のバッファー２.５μｌを加えて、
さらに水で全量を２５μｌとした。反応は９４℃・１分
後、９８℃・１０秒、５０℃・３０秒、７２℃・５秒の
サイクルを４０回繰り返した後、７２℃で２０秒放置し
た。サーマルサイクラーはGeneAmp2400（パーキンエル
マー社）を用いた。増幅産物を４％アガロース電気泳
動、エチジウムブロマイド染色し約８０ｂｐのバンドを
切り出し、実施例１９に示した方法でＤＮＡを回収、プ
ラスミドベクターｐＣＲ^TMIIへサブクローニング、大腸
菌ＪＭ１０９へ導入し挿入されたｃＤＮＡ断片の配列を
解析した。その結果ラット型生理活性ポリペプチドの部
分配列を得ることができた。この配列を基に３' ＲＡＣ
Ｅ用にＲＡ（配列番号：４５），５' ＲＡＣＥ用にＲＣ
（配列番号：４６）の２本のプライマーを合成し、５'
および３' ＲＡＣＥを行った。 ＲＡ：５'−ＣＡＲＣＡＹＴＣＣＡＴＧＧＡＧＡＣＡＡＧＡＡＣＣＣＣ−３' （ここでＲはＡまたはＧ、ＹはＴまたはＣを示す。）（配列番号：４５） ＲＣ：５'−ＴＡＣＣＡＧＧＣＡＧＧＡＴＴＧＡＴＡＣＡＧＧＧＧ−３' （配列番号：４６） 鋳型は実施例２７でMarathon ｃＤＮＡ amplification
kit（Clontech）により合成したものを添付のトリシン
−ＥＤＴＡバッファーで４０倍に希釈したもの２.５μ
ｌを使用した。プライマーには３' ＲＡＣＥにはＲＡと
キット付属のアダプタープライマーＡＰ１を、また５'
ＲＡＣＥにはＲＣとＡＰ１をそれぞれ用いたほかは上記
と同様に反応液を調製した。反応条件は９４℃・１分
後、９８℃・１０秒、７２℃・４５秒のサイクルを５
回、９８℃・１０秒、７０℃・４５秒のサイクルを３
回、９８℃・１０秒、６８℃・４５秒のサイクルを４０
回繰り返した。その結果３' ＲＡＣＥからは約４００ｂ
ｐ、５' ＲＡＣＥからは約４００ｂｐと２５０ｂｐのバ
ンドが得られた。これらを上記と同様の方法で回収し、
これらを鋳型として反応に用いたプライマーでDye Term
inator Cycle SequencingKit（ＡＢＩ）により反応し配
列を解析した。その結果５'ノンコーディング領域と推
定される部分からpolyＡまでの配列を得ることができ
た。

【０１１０】

【実施例２９】ＰＣＲによるラット型生理活性ポリペプ
チドの全長ｃＤＮＡの取得 実施例２８で得られた配列を基に開始コドンを含む領域
にｒＦ（配列番号：４７）、また終止コドンより３'側
にｒＲ（配列番号：４８）の２本のプライマーを合成し
全長ｃＤＮＡを含む断片を増幅することとした。 ｒＦ：５'−ＧＧＣＡＴＣＡＴＣＣＡＧＧＡＡＧＡＣＧＧＡＧＣＡＴ−３' （配列番号：４７） ｒＲ：５'−ＡＧＣＡＧＡＧＧＡＧＡＧＧＧＡＧＧＧＴＡＧＡＧＧＡ−３' （配列番号：４８） 実施例２７でモロニーマウス白血病の逆転写酵素を用い
て調製したｃＤＮＡを鋳型とし、ExTaq（宝酒造）を用
いて、９５℃・３０秒、６８℃・６０秒のサイクルを４
０回繰り返してＰＣＲを行った。増幅産物をアガロース
電気泳動、エチジウムブロマイド染色し約３５０ｂｐの
バンドを切り出し、実施例１９に示した方法でＤＮＡを
回収、プラスミドベクターｐＣＲ^TMIIへサブクローニン
グ、大腸菌ＪＭ１０９へ導入した。生じた形質転換体か
らプラスミドを抽出し、塩基配列を決定した結果、ラッ
ト型生理活性ポリペプチドの全長ｃＤＮＡを保有するE.
coli ＪＭ１０９／ｐＲＡＶ３を得た〔図３２〕。

【０１１１】

【実施例３０】ヒト Brain poly(Ａ)⁺ＲＮＡ画分からの
ｃＤＮＡの合成 ヒト Brain poly(Ａ)⁺ＲＮＡ画分（Clontech）１μｇか
ら、Marathon ｃＤＮＡ amplification kit（Clontec
h）により、マニュアルに従ってｃＤＮＡを合成し、１
０μｌに溶解した。また同poly(Ａ)⁺ＲＮＡ画分５μｇ
にプライマーとしてランダムＤＮＡヘキサマー（ＢＲＬ
社）を加え、モロニーマウス白血病の逆転写酵素（ＢＲ
Ｌ社）により、添付バッファーを用いて相補ＤＮＡを合
成した。反応後の産物はエタノール沈殿を行った後、３
０μｌのＴＥに溶解した。

【０１１２】

【実施例３１】ＲＡＣＥ法によるヒト型生理活性ポリペ
プチドのｃＤＮＡの取得 実施例２８で明らかになったラット型生理活性ポリペプ
チドのアミノ酸配列から〔図３３〕に示したように特に
ラット型とウシ型で保存性の高かった領域を選び以下の
Ｒ１（配列番号：４９）、Ｒ３（配列番号：５０）、Ｒ
４（配列番号：５１）の３本のプライマーを合成し、ヒ
トのｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲをすることによりこれ
らに挟まれた領域の増幅を試みた。ここで、図３３にお
いてbovine.aaはウシ型ポリペプチドのアミノ酸配列、b
ovine.seqはウシ型ポリペプチドをコードするＤＮＡの
塩基配列、rat.seqはラット型ポリペプチドをコードす
るＤＮＡの塩基配列を示す。 Ｒ１：５’−ＡＣＧＴＧＧＣＴＴＣＴＧＴＧＣＴＴＧＣＴＧＣ−３’ （配列番号：４９） Ｒ３：５’−ＧＣＣＴＧＡＴＣＣＣＧＣＧＧＣＣＣＧＴＧＴＡＣＣＡ−３’ （配列番号：５０） Ｒ４：５’−ＴＴＧＣＣＣＴＴＣＴＣＣＴＧＣＣＧＡＡＧＣＧＧＣＣＣ−３’ （配列番号：５１） 実施例３０でMarathon ｃＤＮＡ amplification kit（C
lontech）により調製したｃＤＮＡをトリシン−ＥＤＴ
Ａバッファーで３０倍に希釈したもの２.５μｌを鋳型
として使用した。反応液はｄＮＴＰ２００μＭ，プライ
マーをＲ１とＲ４を各０.２μＭ，Taq Start Antibody
（Clontech）と等量混合したＤＮＡ polymerase ExTaq
（宝酒造）を用い、添付のバッファー２.５μｌを加え
て、さらに水で全量を２５μｌとした。反応は９４℃・
１分後、９８℃・１０秒、６８℃・４０秒のサイクルを
４２回繰り返した後、７２℃で１分間放置した。さらに
この反応液をトリシン−ＥＤＴＡバッファーで１００倍
に希釈したもの１μｌを鋳型として、プライマーの組み
合わせをＲ１とＲ３に変えた以外は上記と同様の反応液
を調製して９４℃・１分後、９８℃・１０秒、６８℃・
４０秒のサイクルを２５回繰り返した。増幅産物を４％
アガロース電気泳動、エチジウムブロマイド染色したと
ころ、期待される約１３０ｂｐのバンドが得られたた
め、これを実施例２８と同様の方法で回収し、その回収
した断片を鋳型として、Dye Terminator Cycle Sequenc
ing Kit（ＡＢＩ）を用いて反応し配列を解析した結
果、ヒト型生理活性ポリペプチドの部分配列を得ること
ができた。そこでこの配列を基に３'ＲＡＣＥ用にプラ
イマーＨＡ（配列番号：５２），ＨＢ（配列番号：５
３）を、５' ＲＡＣＥ用にプライマーＨＥ（配列番号：
５４），ＨＦ（配列番号：５５）を合成し、５'および
３' ＲＡＣＥを行った。 ＨＡ：５'−ＧＧＣＧＧＧＧＧＣＴＧＣＡＡＧＴＣＧＴＡＣＣＣＡＴＣＧ−３' （配列番号：５２） ＨＢ：５'−ＣＧＧＣＡＣＴＣＣＡＴＧＧＡＧＡＴＣＣＧＣＡＣＣＣＣＴ−３' （配列番号：５３） ＨＥ：５'−ＣＡＧＧＣＡＧＧＡＴＴＧＡＴＧＴＣＡＧＧＧＧＴＧＣＧＧ−３' （配列番号：５４） ＨＦ：５'−ＣＡＴＧＧＡＧＴＧＣＣＧＡＴＧＧＧＴＡＣＧＡＣＴＴＧＣ−３' （配列番号：５５） 鋳型は実施例３０で調製したものをトリシン−ＥＤＴＡ
バッファーで２０倍に希釈したもの２.５μｌを使用し
た。１回目のＰＣＲは３' ＲＡＣＥにはＨＡとアダプタ
ープライマーＡＰ１を、５' ＲＡＣＥにはＨＥとＡＰ１
を用いこれまでと同様に反応液を調製した。反応条件は
９４℃・１分後、９８℃・１０秒、７２℃・３５秒のサ
イクルを５回、９８℃・１０秒、７０℃・３５秒のサイ
クルを５回、９８℃・１０秒、６８℃・３５秒のサイク
ルを４０回繰り返した。さらにこの反応液をトリシン−
ＥＤＴＡバッファーで１００倍に希釈したもの１μｌを
鋳型として、１回目の反応サイクルと同じサイクルで２
回目のＰＣＲを行った。ただし３' ＲＡＣＥはプライマ
ーをＨＢとＡＰ１に、５' ＲＡＣＥはＨＦとＡＰ２に変
え、またＤＮＡ polymeraseとしてKlen Taq(Clontech)
を使用し、添付のバッファーで反応液を調製した。その
結果、３' ＲＡＣＥでは約２５０ｂｐのバンドまた５'
ＲＡＣＥでは約１５０ｂｐのバンドが得られ、これらを
上記と同様の方法で配列を読み、先に得られた部分配列
と併せてヒト型生理活性ポリペプチドの、５'ノンコー
ディング領域と推定される部分からpolyＡまでの配列を
得ることができた。

【０１１３】

【実施例３２】ＰＣＲ法によるヒト型生理活性ポリペプ
チドの全長ｃＤＮＡの取得 実施例３１で得られた配列を基に５Ｈ（配列番号：５
６）と３ＨＮ（配列番号：５７）の２本のプライマーを
合成し全長ｃＤＮＡを含む断片を増幅することとした。 ５Ｈ：５'−ＧＧＣＣＴＣＣＴＣＧＧＡＧＧＡＧＣＣＡＡＧＧＧＡＴＧＡ−３' （配列番号：５６） ３ＨＮ：５'−ＧＧＧＡＡＡＧＧＡＧＣＣＣＧＡＡＧＧＡＧＡＧＧＡＧＡＧ−３' （配列番号：５７） 実施例３０でモロニーマウス白血病の逆転写酵素（ＢＲ
Ｌ社）を用いて調製したｃＤＮＡ２.５μｌを鋳型と
し、Klen Taq ＤＮＡ polymerase（Clontech）を用いた
反応液で、９４℃・１分後、９８℃・１０秒、６８℃・
３０秒のサイクルを４０回繰り返した。得られた約３６
０ｂｐの断片を実施例２９と同様の方法で、回収、サブ
クローニング（ただし、ベクターはｐＣＲ^TM２.１を用
いた。）、プラスミド回収し、塩基配列を決定した結
果、ヒト型生理活性ポリペプチドの全長ｃＤＮＡを保有
するE. coli ＪＭ１０９／ｐＨＯＶ７を得た〔図３
４〕。またこのヒト型生理活性ポリペプチドと実施例２
０に示したウシ型、および実施例２９に示したラット型
の翻訳領域についてアミノ酸配列を比較した〔図３
５〕。

【０１１４】

【実施例３３】マウス・ゲノムＤＮＡからのリガンドポ
リペプチドコード領域を含むＤＮＡの取得及び配列決定 実施例２９で得られたラット由来のリガンドポリペプチ
ドをコードするｃＤＮＡ配列（［図３２］）をもとに以
下の２種のプライマーを合成した。 ｒＦＢＧ： ５’−ＡＧＡＴＴＧＧＣＡＴＣＡＴＣＣＡＧＧＡＡＧＡＣＧＧＡＧ ＣＡＴ−３’〔配列番号：６１〕 ｒＲＳＡ： ５’−ＧＴＣＧＡＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣＴＧＴＣＴＴＣＴＣＧＡ ＧＣＴＧ−３’〔配列番号：６２〕 この２種のプライマーを用いてマウス・ゲノムＤＮＡ
（Mouse BALB/c genomicDNA） 0.5 ngを鋳型としてＰＣ
Ｒ法による増幅を行った。反応液の組成は、合成ＤＮＡ
プライマー各200nM、鋳型ＤＮＡ0.5ng、0.25mMｄＮＴＰ
ｓ ＥｘＴａｑ polymerase 0.5μlおよび酵素に付属の
バッファーで、総反応溶液は50μlとした。増幅のため
のサイクルはサーマルサイクラー（パーキンエルマー
社）を用い、９５℃ ３０秒、６７℃ ６０秒を３０cycl
e繰り返した。増幅産物の確認は１．２％アガロースゲ
ル電気泳動およびエキジウムブロマイド染色によって行
い、生じた約１ｋｂのバンドを回収後、ＴＡクローニン
グキット（invitrogen社)を用いてサブクローニングし
た。そのライゲーションミクスチャーをE.coli. JM109
にTransformationし、挿入断片をもつクローンをアンピ
シリンおよびＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地中で選択
し、白色を呈するクローンを分離し、形質転換体Escher
ichia coli JM109/pmGB3を得た。このクローンをアンピ
シリンを含むＬＢ培地で一晩培養し、自動プラスミド抽
出装置を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。調製した
ＤＮＡの一部を用いてABI Dye Terminator Cycle Seque
ncing Kit（ＡＢＩ社）を用いて行い、蛍光式自動シー
ケンサーを用いて解読し、得られた塩基配列の情報はＤ
ＮＡＳＩＳ（日立システムエンジニアリング社）を用い
て行った〔図３６〕。下線で示す部分はプライマーの配
列に相当する部分である。決定した塩基配列をもとに配
列番号：５８，５９または６０で表わされる配列と比較
した結果、Escherichia coli JM109/pmGB3の保持するプ
ラスミドpmGB3に挿入されたＤＮＡ断片が新規のマウス
型リガンドポリペプチドをコードすることが分かった
〔図３７〕。

【０１１５】

【実施例３４】マウスゲノムＤＮＡからのリガンドポリ
ペプチドコード領域全翻沢領域のＤＮＡの取得及び配列
決定 実施例３３で得られたプラスミドpmGB3の挿入されたＤ
ＮＡ断片を調整し、Genome Systems 社に送付し、この
断片をプローブとして Mouse ＥＳ１２９／ＳuＪのＢＡ
Ｃ library より hybridization screening（catalogue
ＢＡＣ ４９２１）を発注した。Genome Systems 社
より送り返されてきたＢＡＣクローンより、目的とする
リガンドペプチドコード領域を含むＤＮＡ断片をｐＵＣ
１８ Vector のEcoRI 部位にサブクローニングし、ＪＭ
１０９／pmＧＦＥ１を得て、同様にその周辺領域の配列
を決定した。決定された配列は〔図３９〕および〔図４
０〕のものであり、示されるアミノ酸配列をコードして
いた。〔図３９〕および〔図４０〕中（ ）でかこんだ
領域は実施例３３で得られた配列と異なる配列であり、
以前ＰＣＲのプライマーの部分であったが、今回の配列
はアミノ酸で５残基短いものである。

【実施例３５】ノックアウトマウス作製のためのターゲ
ティングベクターの構築 ターゲティングベクターの構築には、実施例３４で得ら
れたpmＧＦＥ１とｐＧＴ−Ｎ２８（ＮＥＢ社）を用いて
行った。ｐＧＴ−Ｎ２８の BamHI 部位と HindIII 部位
の間に pmＧＦＥ１の BamHI 部位と HindIII 部位の Vs
pI 部位を含む断片を導入し（本ペプチド遺伝子の５'上
流域）、次に、 XhoI 部位と NotI 部位の間に pmＧＦ
Ｅ１の HpaI 部位と SaII 部位の断片を（本ペプチド遺
伝子の３'下流域）それぞれ linker ligation により X
hoI、NotI に改変した後導入することによりpmＧＦＥＮ
２８を得た〔図４１〕。

【実施例３６】ＥＳ細胞の相同組換え体の取得 ＥＳ細胞の相同組換え体の取得に関しては Genome Syst
ems 社より購入したＥＳ細胞（ＲＷ−４）とその添付マ
ニュアルにしたがって行った。より具体的には実施例３
５で得られた pmＧＦＥＮ２８を VspI 及び NotI で消
化して生ずる約１３Kbp のＤＮＡ断片をアガロースゲル
電気泳動で回収した後、ＲＷ−４細胞ににバイオラッド
社のジーンパルサーを用いてエレクトロポレーション
（electroporation）を行い組換え体を得た。また同一
のＤＮＡ断片を Genome Systems 社に送付し、エレクト
ロポレーションを依頼し組換え体を得た。つまり〔図４
２〕に示すようにサザン解析で５'側プローブにて１２K
bpと５.５Kbp、３'側プローブにて７.５Kbp、５.５Kbp
のバンドが検出できる。lane１、lane６、lane７に流し
たＤＮＡを抽出したクローン no. ９２ Hinuma、５６Ｆ
Ｆ、８１ＦＦのクローンが求める相同組換え体である。
これらのＥＳのクローンを用いて今後キメラマウスの作
製が可能である。

【０１１６】

【発明の効果】本発明は、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋
白質に対するマウス由来リガンドポリペプチド、及びこ
れをコードするＤＮＡを含有するＤＮＡおよびその用途
に関する。本発明のポリペプチドまたは該ポリペプチド
をコードするＤＮＡ等は、下垂体機能調節剤、中枢機能
調節剤または膵臓機能調節剤などとして有用であり、ま
た、組換え型レセプター蛋白質の発現系を用いたレセ
プター結合アッセイ系の開発と医薬品候補化合物のスク
リーニング、下垂体機能調節剤、中枢機能調節剤また
は膵臓機能調節剤などの医薬の開発、さらには、その
遺伝子機能を解析するための非ヒト・トランスジェニッ
ク動物（特に、有用なノックアウトマウス）の作成に有
用である。

【０１１７】

【配列表】

【配列番号：１】 配列の長さ：８２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ala Pro Arg Thr Trp Leu Leu Cys Leu Leu Leu Leu Gly Leu Val Leu 1 5 10 15 Pro Gly Ala Ser Ser Arg Ala His Gln His Ser Met Glu Thr Arg Thr 20 25 30 Pro Asp Ile Asn Pro Ala Trp Tyr Thr Gly Arg Gly Ile Arg Pro Val 35 40 45 Gly Arg Phe Gly Arg Arg Arg Ala Ala Leu Arg Asp Val Thr Gly Pro 50 55 60 Gly Leu Arg Cys Arg Leu Ser Cys Phe Pro Leu Asp Gly Ser Ala Lys 65 70 75 80 Phe Ser 85

【０１１８】

【配列番号：２】 配列の長さ：２４９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 GGCACCGAGG ACCTGGCTTC TGTGCTTGCT GCTGCTAGGC TTAGTCCTCC CAGGAGCTTC 60 CAGCCGAGCC CACCAGCACT CCATGGAGAC CCGCACCCCT GACATCAATC CTGCCTGGTA 120 CACGGGTCGT GGGATCAGGC CTGTGGGCCG CTTCGGGAGG AGGAGGGCAG CCCTGAGGGA 180 TGTCACCGGA CCTGGCCTGC GGTGCCGGCT AAGCTGCTTC CCACTGGATG GAAGTGCCAA 240 GTTCTCTCA 249

【０１１９】

【配列番号：３】 配列の長さ：８９３ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic ＤＮＡ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 GGCACCGAGG ACCTGGCTTC TGTGCTTGCT GCTGCTAGGC TTAGTCCTCC CAGGAGCTTC 60 CAGCCGAGCC CACCAGCACT CCATGGAGAC CCGCAGTGAG TGCCTGGCAT ATGGAGGACA 120 GCCACTGTCA CCTCCCATCC ATATGCTTCC CAAATGCCTT GAGTACCCAG CCCCTGAATG 180 GGAGGTTAGC CATCTCCTAA GCCAGTGGTT TCCAACCTTC CTAATACAGA ACTTTTAATA 240 CAGATCCTTA TGTTGTGGTG ACCCCCAGCC AGAAAATTAT TGTGATGCTG TTTTCATAGT 300 TGTAAGTTTT GCTACTGTTA TGGATCATAA TGTTAATATC TGAAATGCAG GATGTCTGAT 360 ATGCGCCCTT CCCCCCAAAC AAAAGGGACA CAACCCACAG GTTGAGAGCC TCTGGGATCT 420 AAGCAAAAGC TACCTTACCA TGCAGTCAGT TGGGAGATTG GTCCTGTTAA GATCTCCCCA 480 GAATGGTCCT GTTTCCTGTC CTCATCATTC CCCTAACCCA TCTTTGTGGG GTCCCTTAAG 540 ACTTTGGAGG ATGACAGTCA GACAGGAAGA GAATACTGAT CCTGGCATAT GTCTAAATAA 600 ATTCCCTAAA GCCACACCAC TGCCCAGATA TGCCCAGCCA GTGTAATCAG GGTGGGTGCC 660 AACATGGCCT GGTGCCCAGG TTTCCATCAG CTTAGGGGCT CCCGTGTCCC ATACGCTGCT 720 CTGACTCTTT CCTTTCCAGC CCCTGACATC AATCCTGCCT GGTACACGGG TCGTGGGATC 780 AGGCCTGTGG GCCGCTTCGG GAGGAGGAGG GCAGCCCTGA GGGATGTCAC CGGACCTGGC 840 CTGCGGTGCC GGCTAAGCTG CTTCCCACTG GATGGAAGTG CCAAGTTCTC TCA 893

【０１２０】

【配列番号：４】 配列の長さ：３１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ｓｅｒ Ａｒｇ Ａｌａ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ｇｌｕ
Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ａｓｎ １ ５
１０ １５ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｔｒｐ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｉｌｅ
Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｐｈｅ ２０ ２５
３０

【０１２１】

【配列番号：５】 配列の長さ：３１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ｓｅｒ Ａｒｇ Ａｌａ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ｇｌｕ
Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ａｓｎ １ ５
１０ １５ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｔｒｐ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｉｌｅ
Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｐｈｅ ２０ ２５
３０

【０１２２】

【配列番号：６】 配列の長さ：２０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Pro Asp Ile Asn Pro Ala Trp Tyr Thr Gly Arg Gly Ile Arg Pro 1 5 10 15 Val Gly Arg Phe 20 25 30

【０１２３】

【配列番号：７】 配列の長さ：９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ser Arg Ala His Gln His Ser Met Glu 1 5 10 15

【０１２４】

【配列番号：８】 配列の長さ：９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Pro Asp Ile Asn Pro Ala Trp Tyr 1 5 10 15

【０１２５】

【配列番号：９】 配列の長さ：１０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Gly Arg Gly Ile Arg Pro Val Gly Arg Phe 1 5 10 15

【０１２６】

【配列番号：１０】 配列の長さ：９１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Leu Val Leu Val Ile Ala Arg Val Arg Arg Leu His Asn Val Thr Asn 1 5 10 15 Phe Leu Ile Gly Asn Leu Ala Leu Ser Asp Val Leu Met Cys Thr Ala 20 25 30 Cys Val Pro Leu Thr Leu Ala Tyr Ala Phe Glu Pro Arg Gly Trp Val 35 40 45 Phe Gly Gly Gly Leu Cys His Leu Val Phe Phe Leu Gln Pro Val Thr 50 55 60 Val Tyr Val Ser Val Phe Thr Leu Thr Thr Ile Ala Val Asp Arg Tyr 65 70 75 80 Val Val Leu Val His Pro Leu Arg Arg Arg Ile 85 90

【０１２７】

【配列番号：１１】 配列の長さ：５９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Gly Leu Leu Leu Val Thr Tyr Leu Leu Pro Leu Leu Val Ile Leu Leu 1 5 10 15 Ser Tyr Val Arg Val Ser Val Lys Leu Arg Asn Arg Val Val Pro Gly 20 25 30 Cys Val Thr Gln Ser Gln Ala Asp Trp Asp Arg Ala Arg Arg Arg Arg 35 40 45 Thr Phe Cys Leu Leu Val Val Val Val Val Val 50 55

【０１２８】

【配列番号：１２】 配列の長さ：３７０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Met Ala Ser Ser Thr Thr Arg Gly Pro Arg Val Ser Asp Leu Phe Ser 1 5 10 15 Gly Leu Pro Pro Ala Val Thr Thr Pro Ala Asn Gln Ser Ala Glu Ala 20 25 30 Ser Ala Gly Asn Gly Ser Val Ala Gly Ala Asp Ala Pro Ala Val Thr 35 40 45 Pro Phe Gln Ser Leu Gln Leu Val His Gln Leu Lys Gly Leu Ile Val 50 55 60 Leu Leu Tyr Ser Val Val Val Val Val Gly Leu Val Gly Asn Cys Leu 65 70 75 80 Leu Val Leu Val Ile Ala Arg Val Arg Arg Leu His Asn Val Thr Asn 85 90 95 Phe Leu Ile Gly Asn Leu Ala Leu Ser Asp Val Leu Met Cys Thr Ala 100 105 110 Cys Val Pro Leu Thr Leu Ala Tyr Ala Phe Glu Pro Arg Gly Trp Val 115 120 125 Phe Gly Gly Gly Leu Cys His Leu Val Phe Phe Leu Gln Pro Val Thr 130 135 140 Val Tyr Val Ser Val Phe Thr Leu Thr Thr Ile Ala Val Asp Arg Tyr 145 150 155 160 Val Val Leu Val His Pro Leu Arg Arg Arg Ile Ser Leu Arg Leu Ser 165 170 175 Ala Tyr Ala Val Leu Ala Ile Trp Ala Leu Ser Ala Val Leu Ala Leu 180 185 190 Pro Ala Ala Val His Thr Tyr His Val Glu Leu Lys Pro His Asp Val 195 200 205 Arg Leu Cys Glu Glu Phe Trp Gly Ser Gln Glu Arg Gln Arg Gln Leu 210 215 220 Tyr Ala Trp Gly Leu Leu Leu Val Thr Tyr Leu Leu Pro Leu Leu Val 225 230 235 240 Ile Leu Leu Ser Tyr Val Arg Val Ser Val Lys Leu Arg Asn Arg Val 245 250 255 Val Pro Gly Cys Val Thr Gln Ser Gln Ala Asp Trp Asp Arg Ala Arg 260 265 270 Arg Arg Arg Thr Phe Cys Leu Leu Val Val Val Val Val Val Phe Ala 275 280 285 Val Cys Trp Leu Pro Leu His Val Phe Asn Leu Leu Arg Asp Leu Asp 290 295 300 Pro His Ala Ile Asp Pro Tyr Ala Phe Gly Leu Val Gln Leu Leu Cys 305 310 315 320 His Trp Leu Ala Met Ser Ser Ala Cys Tyr Asn Pro Phe Ile Tyr Ala 325 330 335 Trp Leu His Asp Ser Phe Arg Glu Glu Leu Arg Lys Leu Leu Val Ala 340 345 350 Trp Pro Arg Lys Ile Ala Pro His Gly Gln Asn Met Thr Val Ser Val 355 360 365 Val Ile 370

【０１２９】

【配列番号：１３】 配列の長さ：２０６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Leu Val Leu Val Ile Ala Arg Val Arg Arg Leu Tyr Asn Val Thr Asn 1 5 10 15 Phe Leu Ile Gly Asn Leu Ala Leu Ser Asp Val Leu Met Cys Thr Ala 20 25 30 Cys Val Pro Leu Thr Leu Ala Tyr Ala Phe Glu Pro Arg Gly Trp Val 35 40 45 Phe Gly Gly Gly Leu Cys His Leu Val Phe Phe Leu Gln Ala Val Thr 50 55 60 Val Tyr Val Ser Val Phe Thr Leu Thr Thr Ile Ala Val Asp Arg Tyr 65 70 75 80 Val Val Leu Val His Pro Leu Arg Arg Arg Ile Ser Leu Arg Leu Ser 85 90 95 Ala Tyr Ala Val Leu Ala Ile Trp Val Leu Ser Ala Val Leu Ala Leu 100 105 110 Pro Ala Ala Val His Thr Tyr His Val Glu Leu Lys Pro His Asp Val 115 120 125 Arg Leu Cys Glu Glu Phe Trp Gly Ser Gln Glu Arg Gln Arg Gln Leu 130 135 140 Tyr Ala Trp Gly Leu Leu Leu Val Thr Tyr Leu Leu Pro Leu Leu Val 145 150 155 160 Ile Leu Leu Ser Tyr Ala Arg Val Ser Val Lys Leu Arg Asn Arg Val 165 170 175 Val Pro Gly Arg Val Thr Gln Ser Gln Ala Asp Trp Asp Arg Ala Arg 180 185 190 Arg Arg Arg Thr Phe Cys Leu Leu Val Val Val Val Val Val 195 200 205

【０１３０】

【配列番号：１４】 配列の長さ：１２６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Val Val Leu Val His Pro Leu Arg Arg Arg Ile Ser Leu Arg Leu Ser 1 5 10 15 Ala Tyr Ala Val Leu Gly Ile Trp Ala Leu Ser Ala Val Leu Ala Leu 20 25 30 Pro Ala Ala Val His Thr Tyr His Val Glu Leu Lys Pro His Asp Val 35 40 45 Ser Leu Cys Glu Glu Phe Trp Gly Ser Gln Glu Arg Gln Arg Gln Ile 50 55 60 Tyr Ala Trp Gly Leu Leu Leu Gly Thr Tyr Leu Leu Pro Leu Leu Ala 65 70 75 80 Ile Leu Leu Ser Tyr Val Arg Val Ser Val Lys Leu Arg Asn Arg Val 85 90 95 Val Pro Gly Ser Val Thr Gln Ser Gln Ala Asp Trp Asp Arg Ala Arg 100 105 110 Arg Arg Arg Thr Phe Cys Leu Leu Val Val Val Val Val Val 115 120 125

【０１３１】

【配列番号：１５】 配列の長さ：２７３ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 CTGGTGCTGG TGATCGCGCG GGTGCGCCGG CTGCACAACG TGACGAACTT CCTCATCGGC 60 AACCTGGCCT TGTCCGACGT GCTCATGTGC ACCGCCTGCG TGCCGCTCAC GCTGGCCTAT 120 GCCTTCGAGC CACGCGGCTG GGTGTTCGGC GGCGGCCTGT GCCACCTGGT CTTCTTCCTG 180 CAGCCGGTCA CCGTCTATGT GTCGGTGTTC ACGCTCACCA CCATCGCAGT GGACCGGTAC 240 GTCGTGCTGG TGCACCCGCT GAGGCGGCGC ATC 273

【０１３２】

【配列番号：１６】 配列の長さ：１７７ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 GGCCTGCTGC TGGTCACCTA CCTGCTCCCT CTGCTGGTCA TCCTCCTGTC TTACGTCCGG 60 GTGTCAGTGA AGCTCCGCAA CCGCGTGGTG CCGGGCTGCG TGACCCAGAG CCAGGCCGAC 120 TGGGACCGCG CTCGGCGCCG GCGCACCTTC TGCTTGCTGG TGGTGGTCGT GGTGGTG 177

【０１３３】

【配列番号：１７】 配列の長さ：１１１０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 ATGGCCTCAT CGACCACTCG GGGCCCCAGG GTTTCTGACT TATTTTCTGG GCTGCCGCCG 60 GCGGTCACAA CTCCCGCCAA CCAGAGCGCA GAGGCCTCGG CGGGCAACGG GTCGGTGGCT 120 GGCGCGGACG CTCCAGCCGT CACGCCCTTC CAGAGCCTGC AGCTGGTGCA TCAGCTGAAG 180 GGGCTGATCG TGCTGCTCTA CAGCGTCGTG GTGGTCGTGG GGCTGGTGGG CAACTGCCTG 240 CTGGTGCTGG TGATCGCGCG GGTGCGCCGG CTGCACAACG TGACGAACTT CCTCATCGGC 300 AACCTGGCCT TGTCCGACGT GCTCATGTGC ACCGCCTGCG TGCCGCTCAC GCTGGCCTAT 360 GCCTTCGAGC CACGCGGCTG GGTGTTCGGC GGCGGCCTGT GCCACCTGGT CTTCTTCCTG 420 CAGCCGGTCA CCGTCTATGT GTCGGTGTTC ACGCTCACCA CCATCGCAGT GGACCGCTAC 480 GTCGTGCTGG TGCACCCGCT GAGGCGGCGC ATCTCGCTGC GCCTCAGCGC CTACGCTGTG 540 CTGGCCATCT GGGCGCTGTC CGCGGTGCTG GCGCTGCCCG CCGCCGTGCA CACCTATCAC 600 GTGGAGCTCA AGCCGCACGA CGTGCGCCTC TGCGAGGAGT TCTGGGGCTC CCAGGAGCGC 660 CAGCGCCAGC TCTACGCCTG GGGGCTGCTG CTGGTCACCT ACCTGCTCCC TCTGCTGGTC 720 ATCCTCCTGT CTTACGTCCG GGTGTCAGTG AAGCTCCGCA ACCGCGTGGT GCCGGGCTGC 780 GTGACCCAGA GCCAGGCCGA CTGGGACCGC GCTCGGCGCC GGCGCACCTT CTGCTTGCTG 840 GTGGTGGTCG TGGTGGTGTT CGCCGTCTGC TGGCTGCCGC TGCACGTCTT CAACCTGCTG 900 CGGGACCTCG ACCCCCACGC CATCGACCCT TACGCCTTTG GGCTGGTGCA GCTGCTCTGC 960 CACTGGCTCG CCATGAGTTC GGCCTGCTAC AACCCCTTCA TCTACGCCTG GCTGCACGAC 1020 AGCTTCCGCG AGGAGCTGCG CAAACTGTTG GTCGCTTGGC CCCGCAAGAT AGCCCCCCAT 1080 GGCCAGAATA TGACCGTCAG CGTGGTCATC 1110

【０１３４】

【配列番号：１８】 配列の長さ：６１８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 CTGGTGCTGG TGATCGCGCG GGTGCGCCGG CTGTACAACG TGACGAATTT CCTCATCGGC 60 AACCTGGCCT TGTCCGACGT GCTCATGTGC ACCGCCTGCG TGCCGCTCAC GCTGGCCTAT 120 GCCTTCGAGC CACGCGGCTG GGTGTTCGGC GGCGGCCTGT GCCACCTGGT CTTCTTCCTG 180 CAGGCGGTCA CCGTCTATGT GTCGGTGTTC ACGCTCACCA CCATCGCAGT GGACCGCTAC 240 GTCGTGCTGG TGCACCCGCT GAGGCGGCGC ATCTCGCTGC GCCTCAGCGC CTACGCTGTG 300 CTGGCCATCT GGGTGCTGTC CGCGGTGCTG GCGCTGCCCG CCGCCGTGCA CACCTATCAC 360 GTGGAGCTCA AGCCGCACGA CGTGCGCCTC TGCGAGGAGT TCTGGGGCTC CCAGGAGCGC 420 CAGCGCCAGC TCTACGCCTG GGGGCTGCTG CTGGTCACCT ACCTGCTCCC TCTGCTGGTC 480 ATCCTCCTGT CTTACGCCCG GGTGTCAGTG AAGCTCCGCA ACCGCGTGGT GCCGGGCCGC 540 GTGACCCAGA GCCAGGCCGA CTGGGACCGC GCTCGGCGCC GGCGCACCTT CTGCTTGCTG 600 GTGGTGGTCG TGGTGGTG 618

【０１３５】

【配列番号：１９】 配列の長さ：３７８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 GTGGTTCTGG TGCACCCGCT ACGTCGGCGC ATTTCACTGA GGCTCAGCGC CTACGCGGTG 60 CTGGGCATCT GGGCTCTATC TGCAGTGCTG GCGCTGCCGG CCGCGGTGCA CACCTACCAT 120 GTGGAGCTCA AGCCCCACGA CGTGAGCCTC TGCGAGGAGT TCTGGGGCTC GCAGGAGCGC 180 CAACGCCAGA TCTACGCCTG GGGGCTGCTT CTGGGCACCT ATTTGCTCCC CCTGCTGGCC 240 ATCCTCCTGT CTTACGTACG GGTGTCAGTG AAGCTGAGGA ACCGCGTGGT GCCTGGCAGC 300 GTGACCCAGA GTCAAGCTGA CTGGGACCGA GCGCGTCGCC GCCGCACTTT CTGTCTGCTG 360 GTGGTGGTGG TGGTAGTG 378

【０１３６】

【配列番号：２０】 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CGTGGSCMTS STGGGCAACN YCCTG 25

【０１３７】

【配列番号：２１】 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GTNGWRRGGC ANCCAGCAGA KGGCAAA 27

【０１３８】

【配列番号：２２】 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CTGTGYGYSA TYGCNNTKGA YMGSTAC 27

【０１３９】

【配列番号：２３】 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AKGWAGWAGG GCAGCCAGCA GANSRYGAA 29

【０１４０】

【配列番号：２４】 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CTGACTTATT TTCTGGGCTG CCGC 24

【０１４１】

【配列番号：２５】 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AACACCGACA CATAGACGGT GACC 24

【０１４２】

【配列番号：２６】 配列の長さ：２９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ser Arg Ala His Gln His Ser Met Glu Ile Arg Thr Pro Asp Ile Asn 1 5 10 15 Pro Ala Trp Tyr Ala Gly Arg Gly Ile Arg Pro Val Gly 20 25

【０１４３】

【配列番号：２７】 配列の長さ：１９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Pro Asp Ile Asn Pro Ala Trp Tyr Ala Gly Arg Gly Ile Arg Pro 1 5 10 15 Val Gly Arg 19

【０１４４】

【配列番号：２８】 配列の長さ：９８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Met Lys Ala Val Gly Ala Trp Leu Leu Cys Leu Leu Leu Leu Gly Leu 1 5 10 15 Ala Leu Gln Gly Ala Ala Ser Arg Ala His Gln His Ser Met Glu Ile 20 25 30 Arg Thr Pro Asp Ile Asn Pro Ala Trp Tyr Ala Gly Arg Gly Ile Arg 35 40 45 Pro Val Gly Arg Phe Gly Arg Arg Arg Ala Ala Pro Gly Asp Gly Pro 50 55 60 Arg Pro Gly Pro Arg Arg Val Pro Ala Cys Phe Arg Leu Glu Gly Gly 65 70 75 80 Ala Glu Pro Ser Arg Ala Leu Pro Gly Arg Leu Thr Ala Gln Leu Val 85 90 95 Gln Glu

【０１４５】

【配列番号：２９】 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GCICAYCARC AYTGYATGGA 20

【０１４６】

【配列番号：３０】 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CCIACGGGIC KDATGCCICK GCCIGC 26

【０１４７】

【配列番号：３１】 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ACGGGCCKDA TGCCICKGCC IGCRTA 26

【０１４８】

【配列番号：３２】 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CCGGCGTACC AGGCAGGGTT 20

【０１４９】

【配列番号：３３】 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AGGCAGGGTT GATGTCGGGG GTGCGGAT 28

【０１５０】

【配列番号：３４】 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧ ＡＧＣＣＣＡＣＣＡＧ ＣＡＣ
ＴＣＣＡ ２７

【０１５１】

【配列番号：３５】 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＧＴＧＧＧＧＧＣＣＴ ＧＧＣＴＣＣＴＣＴＧ ＣＣＴ
ＧＣＴＧ ２７

【０１５２】

【配列番号：３６】 配列の長さ：３２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GTGTCGACGA ATGAAGGCGG TGGGGGCCTG GC 32

【０１５３】

【配列番号：３７】 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＡＧＧＣＴＣＣＣＧＣ ＴＧＴＴＡＴＴＣＣＴ ＧＧＡ
Ｃ ２４

【０１５４】

【配列番号：３８】 配列の長さ：９８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｌｅｕ
Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｌｅｕ １ ５
１０ １５ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ａｌａ
Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｉｌｅ ２０ ２５
３０ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｔｒｐ
Ｔｙｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ａｒｇ ３５ ４０
４５ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｒｇ
Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｐｒｏ ５０ ５５
６０ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｇｌｙ ６５ ７０
７５ ８０ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ
Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｖａｌ ８５
９０ ９５ Ｇｌｎ Ｇｌｕ

【０１５５】

【配列番号：３９】 配列の長さ：３１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ser Arg Ala His Gln His Ser Met Glu Ile Arg Thr Pro Asp Ile Asn 1 5 10 15 Pro Ala Trp Tyr Ala Gly Arg Gly Ile Arg Pro Val Gly Arg Phe 20 25 30

【０１５６】

【配列番号：４０】 配列の長さ：３２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ser Arg Ala His Gln His Ser Met Glu Ile Arg Thr Pro Asp Ile Asn 1 5 10 15 Pro Ala Trp Tyr Ala Gly Arg Gly Ile Arg Pro Val Gly Arg Phe Gly 20 25 30

【０１５７】

【配列番号：４１】 配列の長さ：３３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ser Arg Ala His Gln His Ser Met Glu Ile Arg Thr Pro Asp Ile Asn 1 5 10 15 Pro Ala Trp Tyr Ala Gly Arg Gly Ile Arg Pro Val Gly Arg Phe Gly 20 25 30 Arg 33

【０１５８】

【配列番号：４２】 配列の長さ：２０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Pro Asp Ile Asn Pro Ala Trp Tyr Ala Gly Arg Gly Ile Arg Pro 1 5 10 15 Val Gly Arg Phe 20

【０１５９】

【配列番号：４３】 配列の長さ：２１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Pro Asp Ile Asn Pro Ala Trp Tyr Ala Gly Arg Gly Ile Arg Pro 1 5 10 15 Val Gly Arg Phe Gly 20

【０１６０】

【配列番号：４４】 配列の長さ：２２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Pro Asp Ile Asn Pro Ala Trp Tyr Ala Gly Arg Gly Ile Arg Pro 1 5 10 15 Val Gly Arg Phe Gly Arg 20

【０１６１】

【配列番号：４５】 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CARCAYTCCA TGGAGACAAG AACCCC 26

【０１６２】

【配列番号：４６】 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TACCAGGCAG GATTGATACA GGGG 24

【０１６３】

【配列番号：４７】 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＧＧＣＡＴＣＡＴＣＣ ＡＧＧＡＡＧＡＣＧＧ ＡＧＣ
ＡＴ ２５

【０１６４】

【配列番号：４８】 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＡＧＣＡＧＡＧＧＡＧ ＡＧＧＧＡＧＧＧＴＡ ＧＡＧ
ＧＡ ２５

【０１６５】

【配列番号：４９】 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ACGTGGCTTC TGTGCTTGCT GC 22

【０１６６】

【配列番号：５０】 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＧＣＣＴＧＡＴＣＣＣ ＧＣＧＧＣＣＣＧＴＧ ＴＡＣ
ＣＡ ２５

【０１６７】

【配列番号：５１】 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＴＴＧＣＣＣＴＴＣＴ ＣＣＴＧＣＣＧＡＡＧ ＣＧＧ
ＣＣＣ ２６

【０１６８】

【配列番号：５２】 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GGCGGGGGCT GCAAGTCGTA CCCATCG 27

【０１６９】

【配列番号：５３】 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＣＧＧＣＡＣＴＣＣＡ ＴＧＧＡＧＡＴＣＣＧ ＣＡＣ
ＣＣＣＴ ２７

【０１７０】

【配列番号：５４】 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＣＡＧＧＣＡＧＧＡＴ ＴＧＡＴＧＴＣＡＧＧ ＧＧＴ
ＧＣＧＧ ２７

【０１７１】

【配列番号：５５】 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CATGGAGTGC CGATGGGTAC GACTTGC 27

【０１７２】

【配列番号：５６】 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＧＧＣＣＴＣＣＴＣＧ ＧＡＧＧＡＧＣＣＡＡ ＧＧＧ
ＡＴＧＡ ２７

【０１７３】

【配列番号：５７】 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＧＧＧＡＡＡＧＧＡＧ ＣＣＣＧＡＡＧＧＡＧ ＡＧＧ
ＡＧＡＧ ２７

【０１７４】

【配列番号：５８】 配列の長さ：２９４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 ATGAAGGCGG TGGGGGCCTG GCTCCTCTGC CTGCTGCTGC TGGGCCTGGC CCTGCAGGGG 60 GCTGCCAGCA GAGCCCACCA GCACTCCATG GAGATCCGCA CCCCCGACAT CAACCCTGCC 120 TGGTACGCRG GCCGTGGGAT CCGGCCCGTG GGCCGCTTCG GCCGGCGAAG AGCTGCCCYG 180 GGGGACGGAC CCAGGCCTGG CCCCCGGCGT GTGCCGGCCT GCTTCCGCCT GGAAGGCGGY 240 GCTGAGCCCT CCCGAGCCCT CCCGGGGCGG CTGACGGCCC AGCTGGTCCA GGAA 294

【０１７５】

【配列番号：５９】 配列の長さ：２４９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 ATGGCCCTGA AGACGTGGCT TCTGTGCTTG CTGCTGCTAA GCTTGGTCCT CCCAGGGGCT 60 TCCAGCCGAG CCCACCAGCA CTCCATGGAG ACAAGAACCC CTGATATCAA TCCTGCCTGG 120 TACACGGGCC GCGGGATCAG GCCTGTGGGC CGCTTCGGCA GGAGAAGGGC AACCCCGAGG 180 GATGTCACTG GACTTGGCCA ACTCAGCTGC CTCCCACTGG ATGGACGCAC CAAGTTCTCT 240 CAGCGTGGA 249

【０１７６】

【配列番号：６０】 配列の長さ：２６１ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 ATGAAGGTGC TGAGGGCCTG GCTCCTGTGC CTGCTGATGC TGGGCCTGGC CCTGCGGGGA 60 GCTGCAAGTC GTACCCATCG GCACTCCATG GAGATCCGCA CCCCTGACAT CAATCCTGCC 120 TGGTACGCCA GTCGCGGGAT CAGGCCTGTG GGCCGCTTCG GTCGGAGGAG GGCAACCCTG 180 GGGGACGTCC CCAAGCCTGG CCTGCGACCC CGGCTGACCT GCTTCCCCCT GGAAGGCGGT 240 GCTATGTCGT CCCAGGATGG C 261

【０１７７】

【配列番号：６１】 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AGATTGGCAT CATCCAGGAA GACGGAGCAT 30

【０１７８】

【配列番号：６２】 配列の長さ：３１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GTCGACTCAG CAGCACTGTC TTCTCGAGCT G 31

【０１７９】

【図面の簡単な説明】

【図１】ヒト下垂体由来ｃＤＮＡを用いてＰＣＲ法によ
って単離したｃＤＮＡクローンｐ１９Ｐ２に含まれるヒ
ト下垂体由来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質ｃＤＮＡ
断片の塩基配列およびそれにコードされるアミノ酸配列
を示す。配列決定に用いたプライマーは−２１Ｍ１３で
ある。下線で示した部分は合成プライマーに相当する部
分である。

【図２】ヒト下垂体由来ｃＤＮＡを用いてＰＣＲ法によ
って単離したｃＤＮＡクローンｐ１９Ｐ２に含まれるヒ
ト下垂体由来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質ｃＤＮＡ
断片の塩基配列およびそれにコードされるアミノ酸配列
を示す。配列決定に用いたプライマーはＭ１３ＲＶ-Ｎ
（タカラ）である。下線で示した部分は合成プライマー
に相当する部分である。

【図３】図１に示したアミノ酸配列をもとに作成した、
ｐ１９Ｐ２に含まれるヒト下垂体由来Ｇ蛋白質共役型レ
セプター蛋白質ｃＤＮＡ断片にコードされる蛋白質の部
分疎水性プロットを示す。

【図４】図２に示したアミノ酸配列をもとに作成した、
ｐ１９Ｐ２に含まれるヒト下垂体由来Ｇ蛋白質共役型レ
セプター蛋白質ｃＤＮＡ断片にコードされる蛋白質の部
分疎水性プロットを示す。

【図５】図１および図２に示したｐ１９Ｐ２に含まれる
ヒト下垂体由来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質ｃＤＮ
Ａ断片にコードされる蛋白質の部分アミノ酸配列を、公
知のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質であるＳ１２８６
３と比較した図を示す。黒く塗った部分は一致している
部分を示す。ｐ１９Ｐ２の第１番目〜第９９番目のアミ
ノ酸配列は図１の第１番目〜第９９番目のアミノ酸配列
に対応し、第１５６番目〜第２３０番目のアミノ酸配列
は図２の第１番目〜第６８番目のアミノ酸配列に対応す
る。

【図６】ＭＩＮ６由来ｃＤＮＡを用いてＰＣＲ法によっ
て単離したｃＤＮＡクローンｐＧ３−２およびｐＧ１−
１０にそれぞれ含まれるＭＩＮ６由来のＧ蛋白質共役型
レセプター蛋白質ｃＤＮＡ断片の塩基配列に基づいて導
き出したＭＩＮ６由来のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白
質ｃＤＮＡ断片の塩基配列およびそれにコードされるア
ミノ酸配列を示す。下線で示した部分は合成プライマー
に相当する部分である。

【図７】図６に示したＭＩＮ６由来のＧ蛋白質共役型レ
セプター蛋白質の部分アミノ酸配列（ｐＧ３−２／ｐＧ
１−１０）を、図１および図２に示したｐ１９Ｐ２にコ
ードされる蛋白質の部分アミノ酸配列と比較した図を示
す。黒塗りの部分は配列が一致している部分を示す。ｐ
１９Ｐ２の第１番目〜第９９番目のアミノ酸配列は図１
の第１番目〜第９９番目のアミノ酸配列に対応し、第１
５６番目〜第２２３番目のアミノ酸配列は図２の第１番
目〜第６８番目のアミノ酸配列に対応する。ｐＧ３−２
／ｐＧ１−１０の第１番目〜第２２３番目のアミノ酸配
列は図６の第１番目〜第２２３番目のアミノ酸配列に対
応する。

【図８】図６に示した部分アミノ酸配列をもとに作成し
た、ＭＩＮ６由来のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質の
部分疎水性プロットを示す。

【図９】ｐ１９Ｐ２に挿入されているＤＮＡ断片をプロ
ーブとして用いて、ヒト下垂体由来ｃＤＮＡライブラリ
ーよりプラークハイブリダイゼーション法によって単離
したｃＤＮＡクローンｐｈＧＲ３に含まれるヒト下垂体
由来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質ｃＤＮＡの全塩基
配列およびそれにコードされるアミノ酸配列を示す。

【図１０】ヒト下垂体由来のｃＤＮＡクローンｐｈＧＲ
３がコードするレセプター遺伝子のヒト下垂体ｍＲＮＡ
に対するノーザンブロットの結果を示す。

【図１１】図９に示したアミノ酸配列をもとに作成し
た、ｐｈＧＲ３に含まれるヒト下垂体由来Ｇ蛋白質共役
型レセプター蛋白質ｃＤＮＡにコードされる蛋白質の疎
水性プロットを示す。

【図１２】ＭＩＮ６由来ｃＤＮＡを用いてＰＣＲ法によ
って単離したｃＤＮＡクローンｐ５Ｓ３８に含まれるＭ
ＩＮ６由来のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質ｃＤＮＡ
断片の塩基配列およびそれにコードされるアミノ酸配列
を示す。下線で示した部分は合成プライマーに相当する
部分である。

【図１３】図１２に示したＭＩＮ６由来のＧ蛋白質共役
型レセプター蛋白質の部分アミノ酸配列（ｐ５Ｓ３８）
を、図１および図２に示したｐ１９Ｐ２に含まれるｃＤ
ＮＡ断片にコードされるＧ蛋白質共役型レセプター蛋白
質の部分アミノ酸配列、および図６に示したｐＧ３−２
ならびにｐＧ１−１０にそれぞれ含まれるｃＤＮＡ断片
の塩基配列から導きだした塩基配列にコードされるＧ蛋
白質共役型レセプター蛋白質の部分アミノ酸配列と比較
した図を示す。黒塗りの部分は配列が一致している部分
を示す。ｐ５Ｓ３８の第１番目〜第１４４番目のアミノ
酸配列は図１２の第１番目〜第１４４番目のアミノ酸配
列に対応する。ｐ１９Ｐ２の第１番目〜第９９番目のア
ミノ酸配列は図１の第１番目〜第９９番目のアミノ酸配
列に対応し、第１５６番目〜第２２３番目のアミノ酸配
列は図２の第１番目〜第６８番目のアミノ酸配列に対応
する。ｐＧ３−２／ｐＧ１−１０の第１番目〜第２２３
番目のアミノ酸配列は図６の第１番目〜第２２３番目の
アミノ酸配列に対応する。

【図１４】図１２に示した部分アミノ酸配列をもとに作
成した、ｐ５Ｓ３８に含まれるＭＩＮ６由来Ｇ蛋白質共
役型レセプター蛋白質ｃＤＮＡ断片にコードされる蛋白
質の部分疎水性プロットを示す。

【図１５】pAKKO-19P2を導入したCHO細胞でmRNAが発現
していることを確認するためにRT-PCRを行った。レーン
１から７は比較のためにpAKKO-19P2を段階的に希釈して
PCRを行ったもので、10μg/μlのプラスミドをそれぞれ
原液（レーン１）、1/2希釈（レーン２）、1/4希釈（レ
ーン３）、1/64希釈（レーン４）、１／２５６希釈（レ
ーン５）、１／１０２４希釈（レーン６）、１/4096希
釈（レーン７）した鋳型を使ってPCRを行ったものにつ
いて1.2％アガロースゲル電気泳動により解析した結果
である。レーン８から11はCHO-19P2細胞株から調製した
cDNAをそれぞれ1/10希釈（レーン８）、1/100希釈（レ
ーン９）、1/1000希釈（レーン10）したものを鋳型とし
てPCRを行ったものを電気泳動した。レーン11はcDNA の
合成をreverse transcriptaseなしで行ったものを鋳型
としてPCRを行ったものを電気泳動した。レーン12およ
び13はそれぞれmock CHO細胞からreverse transcriptas
e添加および無添加で調製したcDNAを鋳型としてPCRを行
ったものを電気泳動した。MはDNAのサイズマーカーであ
り両端のレーンはλ/Sty I digest（ニッポンジーン）
を右から２番目はφχ174/Hinc II digest（ニッポンジ
ーン）をそれぞれ1μgを電気泳動した。矢印は約400bp
のPCRにより増幅されたバンドの位置を示している。

【図１６】ラット全脳から抽出した粗リガンドペプチド
画分についてCHO-19P2細胞株からのアラキドン酸代謝物
の遊離を促進する活性を測定した。アラキドン酸代謝物
の遊離促進活性は0.05%BSAを含むHBSSを加えた時に遊離
された〔³Ｈ〕アラキドン酸代謝物の量を100％として、
リガンドペプチド粗画分を加えた時に放出されるアラキ
ドン酸代謝物の量を％として表した。30% CH₃CN の画分
にCHO-19P2細胞株からアラキドン酸代謝物の遊離を促進
する活性が認められた。

【図１７】ウシ視床下部から抽出した粗リガンドペプチ
ド画分についてCHO-19P2細胞株からのアラキドン酸代謝
物の遊離を促進する活性を測定した。アラキドン酸代謝
物の遊離を促進する活性は0.05%BSAを含むHBSSを加えた
時に遊離された〔³Ｈ〕アラキドン酸代謝物の量を100％
として、リガンドペプチド粗画分を加えた時に放出され
るアラキドン酸代謝物の量を％として表した。ラット全
脳から抽出した粗リガンドペプチド画分と同様に30% CH
₃CN の画分にCHO-19P2細胞株からアラキドン酸代謝物の
遊離を促進する活性が認められた。

【図１８】逆相カラム C18 218TP5415 で精製した画分
についてCHO-19P2細胞株に特異的なアラキドン酸代謝物
の遊離を促進する活性を測定した。RESOURCE Sの活性画
分を C18 218TP5415 で分離した。流速 1ml/min、20%-3
0% CH₃CN/0.1%TFA/H₂O の濃度勾配でクロマトグラフィ
ーを行い、溶出液を1ml ずつ分取し、凍結乾燥後、各フ
ラクションに含まれるCHO-19P2細胞株に特異的なアラキ
ドン酸代謝物遊離促進活性を測定した。その結果、活性
は、３つ(溶出順にそれぞれP-1、P-2、P-3と呼ぶ)に分
離した。

【図１９】逆相カラム diphenyl 219TP5415 で精製した
画分についてCHO-19P2細胞株に特異的なアラキドン酸代
謝物の遊離を促進する活性を測定した。C18 218TP5415
のP-3活性画分を diphenyl 219TP5415 で分離した。流
速 1ml/min、22%-25% CH₃CN/0.1%TFA/H₂O の濃度勾配で
クロマトグラフィーを行い、溶出液を1mlずつ分取し、
凍結乾燥後、各フラクションに含まれるCHO-19P2細胞株
に特異的なアラキドン酸代謝物遊離促進活性を測定し
た。その結果、活性は１つのピークに収束した。

【図２０】逆相カラム μRPC C2/C18 SC 2.1/10 で精製
した画分についてCHO-19P2細胞株に特異的なアラキドン
酸代謝物の遊離を促進する活性を測定した。diphenyl 2
19TP5415 で活性と一致したピークの画分を μRPC C2/C
18 SC 2.1/10 で分離した。流速 100μl/min、22%-23.5
% CH₃CN/0.1%TFA/H₂O の濃度勾配でクロマトグラフィー
を行い、溶出液を100μl ずつ分取し、凍結乾燥後、各
フラクションに含まれるCHO-19P2細胞株に特異的なアラ
キドン酸代謝物遊離促進活性を測定した。その結果、活
性は単一の物質(ペプチド)と思われる二つのピークに一
致した。

【図２１】逆相カラムμＲＰＣ Ｃ２／Ｃ１８ ＳＣ ２.
１／１０で精製したＰ-２画分についてＣＨＯ-１９Ｐ２
細胞株から特異的にアラキドン酸代謝物の遊離を促進す
る活性を測定した。流速１００μl/min、２１.５％−２
３.０％ ＣＨ₃ＣＮ／０.１％ ＴＦＡ／蒸留水の濃度勾
配でクロマトグラフィーを行い、溶出液を１００μｌず
つ分取し、凍結乾燥後、各フラクションに含まれるＣＨ
Ｏ-１９Ｐ２細胞株から特異的にアラキドン酸代謝物の
遊離を促進する活性を測定した。その結果、活性は、単
一のペプチドと思われるペプチドのピークに一致した。

【図２２】ウシ視床下部由来ｃＤＮＡを用いてＰＣＲ法
によって単離したｃＤＮＡクローンに含まれるウシ視床
下部由来のＣＨＯ−１９Ｐ２細胞株から特異的にアラキ
ドン酸代謝物の遊離を促進するリガンドポリペプチドｃ
ＤＮＡ断片の塩基配列に基づいて導き出した該ウシ視床
下部由来リガンドポリペプチドｃＤＮＡ断片の塩基配列
およびそれにコードされるアミノ酸配列を示す。矢印で
示した部分は合成プライマーに相当する部分である。

【図２３】ウシ視床下部由来ｃＤＮＡを用いてＰＣＲ法
によって単離したｃＤＮＡクローンに含まれるウシ視床
下部由来のＣＨＯ−１９Ｐ２細胞株から特異的にアラキ
ドン酸代謝物の遊離を促進するリガンドポリペプチドｃ
ＤＮＡ断片の塩基配列に基づいて導き出した該ウシ視床
下部由来リガンドポリペプチドｃＤＮＡ断片の塩基配列
およびそれにコードされるアミノ酸配列を示す。矢印で
示した部分は合成プライマーに相当する部分である。

【図２４】ウシ視床下部由来のＣＨＯ−１９Ｐ２細胞株
から特異的にアラキドン酸代謝物の遊離を促進するリガ
ンドポリペプチドのアミノ酸配列（ａ），（ｂ）および
配列番号：１、配列番号４４に示したリガンドポリペプ
チドの全コード領域をコードするｃＤＮＡ配列である。

【図２５】合成リガンドポリペプチド（１９Ｐ２−Ｌ３
１）についてＣＨＯ−１９Ｐ２細胞株からの特異的なア
ラキドン酸代謝物遊離活性を濃度依存的に測定した。合
成ペプチドは、脱気処理した蒸留水に１０^-3Ｍの濃度で
溶解し、０．０５％ＢＳＡを含むＨＢＳＳで１０^-12Ｍ
〜１０^-6Ｍの濃度に希釈した。アラキドン酸代謝物遊離
活性は、希釈液を細胞に添加した時に上清に遊離される
〔³Ｈ〕アラキドン酸代謝物の実測放射線量で表した。
その結果、１９Ｐ２−Ｌ３１によるＣＨＯ−１９Ｐ２細
胞株に特異的なアラキドン酸代謝物遊離活性が濃度依存
的に認められた。

【図２６】合成リガンドポリペプチド（１９Ｐ２−Ｌ３
１（Ｏ））についてＣＨＯ−１９Ｐ２細胞株からの特異
的なアラキドン酸代謝物遊離活性を濃度依存的に測定し
た。合成リガンドポリペプチドは、脱気処理した蒸留水
に１０^-3Ｍの濃度で溶解し、０．０５％ＢＳＡを含むＨ
ＢＳＳで１０^-12Ｍ〜１０^-6Ｍの濃度に希釈した。アラ
キドン酸代謝物遊離活性は、希釈液を細胞に添加した時
に上清に遊離される〔³Ｈ〕アラキドン酸代謝物の実測
放射線量で表した。その結果、１９Ｐ２−Ｌ３１（Ｏ）
によるＣＨＯ−１９Ｐ２細胞株に特異的なアラキドン酸
代謝物遊離活性が濃度依存的に認められた。

【図２７】合成リガンドポリペプチド１９Ｐ２−Ｌ２０
についてＣＨＯ−１９Ｐ２細胞株からの特異的なアラキ
ドン酸代謝物遊離活性を濃度依存的に測定した。合成ペ
プチドは、脱気処理した蒸留水に１０^-3Ｍの濃度で溶解
し、０．０５％ＢＳＡを含むＨＢＳＳで１０^-12Ｍ〜１
０^-6Ｍの濃度に希釈した。アラキドン酸代謝物遊離活性
は、希釈液を細胞に添加した時に上清に遊離される〔³
Ｈ〕アラキドン酸代謝物の実測放射線量で表した。その
結果、１９Ｐ２−Ｌ２０によるＣＨＯ−１９Ｐ２細胞株
に特異的なアラキドン酸代謝物遊離活性が濃度依存的に
認められた。

【図２８】ウシゲノムライブラリーよりクローン化した
ファージのＤＮＡを制限酵素BamHI（Ｂ）およびSalI
（Ｓ）で切断し、１．２％アガロースゲル電気泳動を行
ったパターンを示す。ＤＮＡのサイズマーカー（Ｍ）に
はλファージＤＮＡのStyI消化物を用いた。Ｂのレーン
ではマーカーの１番目（19,329bp)と２番目(7,743bp)の
バンドの間に相当する位置にベクター由来の２本のバン
ドが検出され、その他に３番目(6,223bp)から５番目(3,
472bp)の間に挿入断片由来の３本のバンドが検出され
た。Ｓのレーンでは同じくベクター由来の２本のバンド
が検出されているが、挿入断片由来のバンドが重なって
いるために上側のバンドがＢのレーンに比べて太くなっ
ている。

【図２９】ウシゲノムＤＮＡから解読したコード領域付
近の塩基配列を示す。１〜３番目の塩基（ＡＴＧ）が翻
訳開始コドンに相当し、７６７〜７６９番目の塩基（Ｔ
ＡＡ）が翻訳終止コドンに相当する。

【図３０】ウシゲノムＤＮＡから解読したコード領域付
近の塩基配列(genome)をＰＣＲ法によってクローニング
したウシｃＤＮＡの塩基配列(cDNA)と比較した結果を示
す。配列の一致している部分は網掛けで示した。１０１
番目〜５７２番目の部分はｃＤＮＡの塩基配列には相当
する部分が無く、イントロンであることが判明した。

【図３１】ウシゲノムＤＮＡから解読したコード領域付
近の塩基配列からイントロン部分を除き、コードされる
アミノ酸配列に翻訳した結果を示す。

【図３２】ラット型リガンドポリペプチドの全長アミノ
酸配列および全コード領域をコードするｃＤＮＡ配列で
ある。

【図３３】ウシ型リガンドポリペプチドのアミノ酸配列
およびウシ型ポリペプチド、ラット型ポリペプチドをコ
ードするＤＮＡの塩基配列を示す。矢印で示した部分は
合成プライマーに相当する部分である。

【図３４】ヒト型リガンドポリペプチドの全長アミノ酸
配列および全コード領域をコードするｃＤＮＡ配列であ
る。

【図３５】ウシ型リガンドポリペプチド、ラット型リガ
ンドポリペプチドおよびヒト型リガンドポリペプチドの
翻訳領域についてアミノ酸配列を比較したものである。

【図３６】プラスミドpmGB3の挿入断片の塩基配列を示
す。→はプライマーに相当する部分である。

【図３７】プラスミドpmGB3の塩基配列をもとに予測さ
れるcDNAと翻訳蛋白質を予想したものである。→はプラ
イマーに相当する部分である。↓↓に挟まれた部分はイ
ントロンと予想される配列である。

【図３８】本発明のリガンドポリペプチドの制限酵素地
図を示す。

【図３９】実施例３４で得られたリガンドポリペプチド
領域およびその周辺領域のＤＮＡ配列（第１番目〜第１
０２６番目）と翻訳コードされるリガンドポリペプチド
のアミノ酸配列を示す（図４０に続く）。

【図４０】実施例３４で得られたリガンドポリペプチド
領域およびその周辺領域のＤＮＡ配列（第１０２７番目
〜第１５７４番目）と翻訳コードされるリガンドポリペ
プチドのアミノ酸配列を示す（図３９に続く）。

【図４１】実施例３５で得られたターゲティングベクタ
ー pmＧＦＥＮ２８の構築図を示す。

【図４２】実施例３６で行われたアガロースゲル電気泳
動の結果および野生型と組換え型（ノックアウト）の遺
伝子の比較図を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 16/18 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 5/10 33/577 Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＡＢ 33/577 ＡＤＰ // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同
   一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリ
   ペプチドまたはそのアミド、エステルもしくはその塩。
2. 【請求項２】請求項１記載のポリペプチドをコードする
   塩基配列を有するＤＮＡを含有するＤＮＡ。
3. 【請求項３】配列番号：２または配列番号：３で表され
   る塩基配列を有する請求項２記載のＤＮＡ。
4. 【請求項４】請求項２記載のＤＮＡを含有する組換えベ
   クター。
5. 【請求項５】請求項２記載のＤＮＡまたは請求項４記載
   の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
6. 【請求項６】不活性化された請求項２記載のＤＮＡを保
   持する非ヒト・ノックアウト動物の作製方法。
7. 【請求項７】請求項２記載のＤＮＡもしくはその変異体
   または請求項４記載の組換えベクターを保持する非ヒト
   ・トランスジェニック動物。
8. 【請求項８】不活性化された請求項２記載のＤＮＡを保
   持する非ヒト動物細胞。
9. 【請求項９】不活性化された請求項２記載のＤＮＡを導
   入することを特徴とする請求項８記載の非ヒト動物細胞
   の製造法。
10. 【請求項１０】請求項５記載の形質転換体を培養するこ
    とを特徴とする請求項１記載のポリペプチドまたはその
    アミド、エステルもしくはその塩の製造法。
11. 【請求項１１】請求項１記載のポリペプチドまたはその
    アミド、エステルもしくはその塩を含有してなる医薬。
12. 【請求項１２】請求項１記載のポリペプチドまたはその
    アミド、エステルもしくはその塩に対する抗体。