JPH1171397A

JPH1171397A - 新規生理活性ペプチド

Info

Publication number: JPH1171397A
Application number: JP24793197A
Authority: JP
Inventors: Masaaki Yoshikawa; 川正明吉
Original assignee: Nippon Synthetic Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Priority date: 1997-08-27
Filing date: 1997-08-27
Publication date: 1999-03-16

Abstract

(57)【要約】（修正有）【課題】鎮痛活性を示し、毎日連用しても効果が低下
しない鎮痛薬、生化学試薬として有用な新規活性ペプチ
ドを提供する。【解決手段】一般式Ｘ₁−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−
Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｇ
ｌｙ−Ｘ₂なる新規ペプチド。（Ｘ₁＝Ｇｌｎ−Ａｓｎ−
Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ、Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｌ
ｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｒ
ｇ、Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ、Ｌｙｓ−Ａｒｇ、Ａｒｇ
のいずれか１つであり、Ｘ₂はＰｈｅの−ＣＯＯＨを−
ＣＨ_２ＯＨ、−ＣＯＮＨ_２、−ＣＯＯＣＨ_３、−ＣＯＯ
Ｃ_２Ｈ_５、−ＣＯＯ（ｎ−Ｃ_３Ｈ_７）、−ＣＯＯ（ｉｓ
ｏ−Ｃ_３Ｈ_７）のいずれかで置換したアミノ酸を示
す。）

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、鎮痛作用を持つ有
用な新規ペプチドに関するものであり、生化学試薬、医
薬品などに利用可能である。

【０００２】

【従来の技術】手術時やガン末期の疼痛を除去するため
鎮痛麻酔薬が用いられる。モルヒネに代表される麻薬性
鎮痛薬が最もよく用いられるが、毎日同じ量で投与する
と、効果が低下するという耐性形成の問題がある。また
麻薬性鎮痛薬と同じレセプターを介して鎮痛作用するオ
ピオイドペプチドも同様の弱点を有している。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、麻薬性
鎮痛薬に替わる上記の弱点を有する鎮痛薬はいまだに見
いだされず、新たなメカニズムをもつ鎮痛薬が研究させ
ている状況である。近年、オピオイドレセプターに類似
性を有するレセプター遺伝子がクローン化され、その内
因性リガンドとして１７残基からなるペプチドが単離さ
れ、nociceptinと命名された。該ペプチドは痛覚増強作
用を有することが報告されている。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者は、nociceptin
のアンタゴニストが鎮痛性を有するという仮定のもと
に、該ペプチドのアンタゴニストを鋭意探索した結果、
nociceptinの逆の配列をもつレトロnociceptin（ただし
Ｎ−末端のＰｈｅは、Ｐｈｅの誘導体Ｘ₂である必要が
ある）Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｒ
ｇ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｙ
−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｘ₂、更にＸ₁−Ａ
ｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｈ
ｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｘ₂なるペプチドが鎮痛
活性を示すことを見いだし、しかも毎日投与しても効果
の低下が認められない鎮痛薬であることを見出し本発明
を完成した。

【０００５】本発明のペプチドはＸ₁−Ａｌａ−Ｓｅｒ
−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−
Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｘ₂なる配列をもつもので、Ｘ₁として
はＧｌｎ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ、
Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ、Ａｌａ−Ｌ
ｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ、Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ、Ｌｙ
ｓ−Ａｒｇ、Ａｒｇのいずれか１つであり、好ましくは
Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇであ
る。

【０００６】該ペプチドは、ペプチド合成の常套手段を
適用して合成することによって製造することもできる。
上記でいうＧｌｎはグルタミン、Ａｓｎはアスパラギ
ン、Ｌｅｕはロイシン、Ｌｙｓはリジン、Ａｒｇはアル
ギニン、Ａｌａはアラニン、Ｓｅｒはセリン、Ｇｌｙは
グリシン、Ｔｈｒはスレオニン、Ｐｈｅはフェニルアラ
ニン、Ｘ₂は、Ｐｈｅの−ＣＯＯＨを−ＣＨ₂ＯＨ、−Ｃ
ＯＮＨ₂、−ＣＯＯＣＨ₃、−ＣＯＯＣ₂Ｈ₅、−ＣＯＯ
（n-Ｃ₃Ｈ₇）、−ＣＯＯ（iso-Ｃ₃Ｈ₇）いずれかで置換
したアミノ酸を示す。かかるアミノ酸はいずれもＬ−体
である。

【０００７】Ｘ₂として具体的にはphenylalaninol、phe
nylalanineamide、phenylalanine metylester、phenyla
lanine ethylester、phenylalanine n-propylester等が
挙げられるが、好ましくはPhenylalaninolである。

【０００８】本発明のペプチドは、ペプチド合成法で取
得でき、ペプチド合成に通常用いられる方法、即ち液相
法または固相法でペプチド結合の任意の位置で二分され
る２種のフラグメントの一方に相当する反応性カルボキ
シル基を有する原料と、他方のフラグメントに相当する
反応性アミノ基を有する原料とを2-(1H-Benzotriazole-
1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophospha
te（ＨＢＴＵ）等の活性エステルを用いた方法、カルボ
ジイミドを用いた方法等を用いて縮合させ、生成する縮
合物が保護基を有する場合、その保護基を除去させるこ
とによっても製造し得る。

【０００９】この反応工程において反応に関与すべきで
ない官能基は、保護基により保護される。アミノ基の保
護基としては、例えばベンジルオキシカルボニル（Ｂ
ｚ）、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ｐ−ビ
フェニルイソプロピロオキシカルボニル、９−フルオレ
ニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）等が挙げられ
る。カルボキシル基の保護基としては例えばアルキルエ
ステル、ベンジルエステル等を形成し得る基が挙げられ
るが固相法の場合は、Ｃ末端のカルボキシル基はクロロ
トリチル樹脂、クロルメチル樹脂、オキシメチル樹脂、
Ｐ−アルコキシベンジルアルコール樹脂等の担体に結合
している。縮合反応は、カルボジイミド等の縮合剤の存
在下にあるいはＮ−保護アミノ酸活性エステルまたはペ
プチド活性エステルを用いて実施する。

【００１０】縮合反応終了後、保護基は除去されるが、
固相法の場合はさらにペプチドのＣ末端と樹脂との結合
を切断する。更に、本発明のペプチドは通常の方法に従
い精製される。例えばイオン交換クロマトグラフィー、
逆相液体クロマトグラフィー、アフィニティークロマト
グラフィー等が挙げられる。合成したペプチドの合成は
エドマン分解法でＣ−末端からアミノ酸配列を読み取る
プロティンシークエンサー、ＧＣ−ＭＳ等で分析され
る。

【００１１】本発明のペプチドは生化学試薬、医薬等に
有用であり、例えば生化学試薬として用いる場合、オピ
オイド、オルファンレセプターの研究開発、あるいは、
該レセプターを使った新規な作用機作をもつ医薬品開発
のためのリード物質として有用である。

【００１２】本発明のペプチドは、作用機作としてはオ
ピオイド、オルファンレセプターを介するものであるこ
とが分かった。以下このレセプターを介していることを
示すレセプターアッセイについて説明する。該レセプタ
ーアッセイはラット脳膜画分と放射標識した[¹²⁵I-Tyr
¹⁴]nociceptinを用いて行った。まず５０ｍＭトリス−
塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）中にて０．３ｎＭ[¹²⁵I-Tyr
¹⁴]nociceptinと試料及びラット脳膜画分を２５℃にて
３０分間インキュベートし、Whatman GF/Cガラスフィル
タ−上にて０℃の同緩衝液にて洗浄後の放射活性をγ−
カウンタ−にて計測した。上記のペプチドは４０μＭの
ＩＣ₅₀値で結合抑制を示したことからオルファンレセプ
ターに結合活性を有するものであった。

【００１３】次に医薬品として用いる場合について説明
する。本発明で使用するペプチドの投与経路としては、
経口投与、非経口投与、直腸内投与のいずれでもよい
が、経口投与が好ましい。本発明のペプチドの投与量は
化合物の種類、投与方法、患者の症状・年令等により異
なるが、通常１回０.００１〜１０００ｍｇ、好ましく
は０．０１〜１０ｍｇを１日当たり１〜３回である。本
発明のペプチドは通常、製剤用担体と混合して調製した
製剤の形で投与される。製剤用担体としては、製剤分野
において常用され、かつ本発明のペプチドと反応しない
物質が用いられる。

【００１４】具体的には、例えば乳糖、ブドウ糖、マン
ニット、デキストリン、シクロデキストリン、デンプ
ン、庶糖、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、合成ケ
イ酸アルミニウム、カルボキシメチルセルロースナトリ
ウム、ヒドロキシプロピルデンプン、カルボキシメチル
セルロースカルシウム、イオン交換樹脂、メチルセルロ
ース、ゼラチン、アラビアゴム、ヒドロキシプロピルセ
ルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリ
ビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、軽質無水ケ
イ酸、ステアリン酸マグネシウム、タルク、トラガン
ト、ベントナイト、ビーガム、酸化チタン、ソルビタン
脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、グリセリ
ン、脂肪酸グリセリンエステル、精製ラノリン、グリセ
ロゼラチン、ポリソルベート、マクロゴール、植物油、
ロウ、流動パラフィン、白色ワセリン、フルオロカーボ
ン、非イオン界面活性剤、プロピレングリコール、水等
が挙げられる。

【００１５】剤型としては、錠剤、カプセル剤、顆粒
剤、散剤、シロップ剤、懸濁剤、坐剤、軟膏、クリーム
剤、ゲル剤、貼付剤、吸入剤、注射剤等が挙げられる。
これらの製剤は常法に従って調製される。尚、液体製剤
にあっては、用時、水又は他の適当な媒体に溶解又は懸
濁する形であってもよい。また錠剤、顆粒剤は周知の方
法でコーティングしてもよい。注射剤の場合には、本発
明のペプチドを水に溶解させて調製されるが、必要に応
じて生理食塩水あるいはブドウ糖溶液に溶解させてもよ
く、また緩衝剤や保存剤を添加してもよい。

【００１６】これらの製剤は、本発明のペプチドを０．
０１％以上、好ましくは０．５〜７０％の割合で含有す
ることができる。これらの製剤はまた、治療上価値ある
他の成分を含有していてもよい。

【００１７】

【実施例】次に実例を挙げて本発明を更に具体的に説明
する。実施例１〔ペプチドの合成〕市販のPhenylalaninol（Ｐｈｅｏ
ｌ）-2-chlorotrityl樹脂（置換率０．４６ｍｅｑ／
ｇ）〕０．６５ｇをＰＳ３型ペプチド合成機（Protein
Technologies社製）の反応槽に分取し、以下のように合
成を行った。まず、上記の樹脂を反応容器に入れて、１
ｍｍｏｌのＦｍｏｃ−Ｇｌｙと、活性化剤として、１ｍ
ｍｏｌのＨＢＴＵを１０ｍｌの０．４ＭＮ−メチルモ
ルフォリンを含むジメチルフォルムアミドに溶解したも
のを反応槽に加え、室温にて２０分撹拌反応させた。得
られた樹脂を２０重量％ピペリジンを含むジメチルフォ
ルムアミド２０ｍｌ中で、Ｆｍｏｃ基を除去し、ついで
上記のＦｍｏｃ−Ｇｌｙをカップリングさせた方法と同
様にＣ末端から順次Ｆｍｏｃ−アミノ酸をカップルさせ
て、Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ
−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｌａ−
Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅｏｌ
樹脂を得た。該樹脂を１０ｍｌの脱保護液（８２容量％
トリフルオロ酢酸、５容量％チオアニソール、３容量％
エタンジチオール、２容量％エチルメチルスルフィド、
３容量％フェノール、５容量％水）中で室温にて４時間
撹拌し、ペプチドを樹脂から遊離させた。

【００１８】ここに４０ｍｌの冷エーテルを添加し、ペ
プチドを沈殿させ、さらに冷エーテルにて３回洗浄し粗
ペプチドを得た。これをＯＤＳカラム（Ｃｏｓｍｏｓｉ
ｌ５Ｃ₁₈−ＡＲ，２０×２５０ｍｍ）による逆相クロマ
トグラフィーにより０．１重量％トリフルオロ酢酸を含
むアセトニトリルの直線的濃度勾配にて展開、精製し、
Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａ
ｒｇ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌ
ｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅｏｌを得
た。本品をプロテインシーケンサー（アプライドバイ
オシステムズ社製４７７Ａ型）により分析した結果、上
記の組成であることが判明した。

【００１９】イ）鎮痛活性の測定約２０ｇのｄｄｙ系雄性マウスの側脳室内に上記のペプ
チド１００ｎｍｏｌを１０μｌの生理食塩水溶液として
１００μｇ／マウスに投与し、投与５分後、２０分
後に尾部にピンチを挟んで、痛みを感じてピンチに噛み
つくまでの時間を測定して以下の様に評価し、表２に結
果を示した。 ◎・・・６秒以上 ○・・・４秒以上６秒未満 △・・・２秒以上４秒未満 ×・・・２秒未満

【００２０】ロ）毎日投与した際の効果の評価１日目の鎮痛相対活性を１００．０％とし、２、３、
４、５日目の鎮痛活性を表２に相対値で示した。なお鎮
痛相対活性は、縦軸に鎮痛相対活性（上記の如く、痛み
を感じて振り返るまでの時間を縦軸にとり、投与後の時
間を横軸にとった図を作成して、プロットした得られた
曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）の相対値で示した。）

【００２１】実施例２、３実施例１でＦｍｏｃアミノ酸の添加するステップを減ら
して、ペプチドが１３、１５残基ペプチド樹脂を合成
し、実施例と同様にして表１に示すペプチドを合成し、
プロティンシークエンサーで配列を確認した。実施例１
と同様に評価し、結果を表２に示した。

【００２２】実施例４実施例１においてPhenylalaniol-2-chlorotrityl樹脂
（０．４６ｍｅｑ／ｇ）の替わりにFmoc-NH-polyethyle
neglycole handle樹脂（０．１６ｍｅｑ／ｇ）を用いて
Fmoc-phenylalanineを結合させた後以下同様にＦｍｏｃ
−Ｇｌｙ等のＦｍｏｃ−アミノ酸をＮ−末端から順次結
合させ実施例１と同様にして表１に示すペプチドを合成
し、プロティンシークエンサーで配列を確認した。実施
例１と同様に評価し、結果を表２に示した。

【００２３】実施例５実施例１においてPhenylalaniol-2-chlorotrityl樹脂
（０．４６ｍｅｑ／ｇ）の替わりにFmoc-phenylalanine
-tritylamidomethylester-polyethyleneglycolehandle
樹脂（０．１６ｍｅｑ／ｇ）を用いて実施例１と同様に
して、レトロnociceptinを合成し、プロティンシークエ
ンサーで配列を確認した。本ペプチド１００ｍｇを０．
１Ｍ塩酸を含む無水メタノールに溶解し室温にて一夜放
置後乾燥し、表１に示した、レトロnociceptinメチルエ
ステルを合成した。実施例１と同様に評価し、結果を表
２に示した。

【００２４】

【表１】ペプチド配列実施例1 Gln-Asn-Ala-Leu-Lys-Arg-Arg-Ala-Ser-Lys-Arg -Ala-Gly-Thr-Phe-Gly-Gly-Pheol* 実施例2 Arg-Arg-Ala-Ser-Lys-Arg-Ala-Gly-Thr-Phe-Gly-Gly-Pheol* 実施例3 Leu-Lys-Arg-Arg-Ala-Ser-Lys-Arg-Ala-Gly-Thr-Phe-Gly-Gly-Pheol* 実施例4 Gln-Asn-Ala-Leu-Lys-Arg-Arg-Ala-Ser-Lys-Arg -Ala-Gly-Thr-Phe-Gly-Gly-PheNH₂** 実施例5 Gln-Asn-Ala-Leu-Lys-Arg-Arg-Ala-Ser-Lys-Arg -Ala-Gly-Thr-Phe-Gly-Gly-PheOCH₃*** * Pheol :Ｐｈｅの−ＣＯＯＨが−ＣＨ₂ＯＨに置換されたアミノ酸 ** PheNH₂ :Ｐｈｅの−ＣＯＯＨが−ＣＯＮＨ₂に置換されたアミノ酸 ***PheOCH₃:Ｐｈｅの−ＣＯＯＨが−ＣＯＯＣＨ₃に置換されたアミノ酸

【００２５】

【表２】イ）ロ）１日目２日目３日目４日目５日目実施例１ ◎ ◎ 100.0 125.3 84.8 106.3 100.0 実施例２ ○ ○ 62.0 60.1 56.1 60.2 59.5 実施例３ ◎ ○ 75.3 78.3 73.5 71.2 73.5 実施例４ ◎ ◎ 102.5 96.1 105.1 95.6 103.1実施例５ ◎ ○ 70.5 65.1 71.5 75.9 72.1

【００２６】

【発明の効果】本発明の新規生理活性ペプチドは鎮痛活
性を示し、しかも毎日連用しても効果が低下しない鎮痛
作用をもつもの或いは薬として有用なものである。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記一般式（１）で示される新規生理活
性ペプチド。Ｘ₁−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ− Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｘ₂・・・（１）（但しＸ₁＝Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ
−Ａｒｇ、Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ、
Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ、Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａ
ｒｇ、Ｌｙｓ−Ａｒｇ、Ａｒｇのいずれか１つであり、
Ｘ₂は、Ｐｈｅの−ＣＯＯＨを−ＣＨ₂ＯＨ、−ＣＯＮＨ
₂、−ＣＯＯＣＨ₃、−ＣＯＯＣ₂Ｈ₅、−ＣＯＯ（n-Ｃ₃
Ｈ₇）、−ＣＯＯ（iso-Ｃ₃Ｈ₇）のいずれかで置換した
アミノ酸を示す。）
【請求項２】Ｘ₁がＧｌｎ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｌｅｕ
−Ｌｙｓ−Ａｒｇであることを特徴とする請求項１記載
の新規生理活性ペプチド。